BIOENSAYOS

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BIOENSAYOS
INTRODUCCION
Es una prueba de toxicidad para determinar la dosis o concentración de un toxico
que provoca una cierta respuestas en una colección de organismos.
Los bioensayos permiten evaluar el grado de afectación que una sustancia química
tiene en cuenta a los
organismos vivos, se usa un tejido vivo,
o grupo de
organismos, como reactivo para evaluar los efectos de cualquier sustancia
fisiológicamente activa. Recientemente se han instrumentado bioensayos rápidos
con el empleo de plantas como organismos de prueba, los que funcionan como
buenas herramientas de pesquisa inicial. Los bioensayos in vitro han ganado
aceptación en las estrategias de biomonitoreo, fundamentalmente porque
suministran resultados confiables, son costo-efectivos, simples y rápidos. Estos
bioensayos pueden auxiliar en la evaluación de los efectos a la salud (toxicidad
humana y animal) y de los efectos ecológicos de millares de sustancias químicas
tóxicas que son introducidas por varias vías en el ambiente y permiten su aplicación
en programas de monitoreo en la evaluación de la toxicidad.
Se señalan las ventajas que tienen las plantas para ser incorporadas en baterías de
ensayo para medir alarma de peligro ambiental. Se destaca la importancia del
empleo de bioensayos con plantas en la detección y control de los contaminantes
tóxicos ambientales. Se hace referencia a dos de los bioensayos con plantas que
pueden resultar disponibles y de utilidad en la evaluación toxicológica de muestras
ambientales
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INDICE
BIOENSAYO EN PLANTAS MEDICINALES
I.
DEFINICION
II.
TIPOS DE BIOENSAYO.
2.1. Por el lugar de desarrollo.
a. Bioensayos en laboratorio
b. Bioensayos in situ:
2.2. Por el tiempo de duración.
a. Bioensayos de corta duración:
b. Bioensayos de duración intermedia:
c. Bioensayos de larga duración
2.3. Por sus efectos.
a. Ensayos de toxicidad aguda
b. Ensayos de toxicidad crónica
2.4. Por la aplicación en sus tratamientos.
a. Bioensayos estáticos
b. Bioensayos con renovación periódica
c. Bioensayos de flujo continuo
III.
REALIZACION DE BIOENSAYOS.
IV.
REFERENCIA BIBLIOGRAFIA
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BIOENSAYO EN PLANTAS MEDICINALES
I.
DEFINICION
Son pruebas en las que se usan organismos vivos para detectar o medir la
presencia y efectos de una o más substancias tóxicas, así como determinar
el límite de tolerancia de dichas substancias con respecto a los organismos.
II. TIPOS DE BIOENSAYO.
El efecto se puede evaluar a diferentes niveles (subcelular, enzimático,
morfológico, fisiológico, histológico, sistémico, poblacional o de la
comunidad) y clasificarse en cuantal (cantidad de organismos afectados) o
gradual (grado de alteración).
2.1. Por el lugar de desarrollo.
a. Bioensayos en laboratorio:
Los bioensayos se pueden realizar en el laboratorio bajo
condiciones controladas o en el campo, es decir, directamente en
el medio natural.
Los
bioensayos
multiespecíficos.
de
laboratorio
pueden
ser
mono
o
Los monoespecíficos están diseñados para
obtener información acerca de los efectos de la calidad de agua
sobre la supervivencia y aspectos de la estructura y dinámica de
una población dada.
Los multiespecíficos pueden ofrecer información sobre el impacto a
nivel de una comunidad determinada. Se pueden efectuar las
siguientes pruebas:
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 Mortalidad
 Proporción de crecimiento
 Biomasa
 Reproducción
 Estimulación
o
inhibición
de
sistemas
metabólicos
enzimáticos
 Cambios de conducta
 Histopatológica 106
 Nutrición
b. Bioensayos in situ:
Los
bioensayos
de
campo
consisten en la exposición de una
o más poblaciones a la acción
directa; para ello se utilizan
contenedores
que
permiten
mantener la población en estudio
en un espacio adecuado, sin
afectar su relación con el medio.
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o
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2.2.
Por el tiempo de duración.
Las pruebas pueden durar varios periodos de tiempo, pero las de
96 horas son las más comunes. Los individuos son expuestos a
concentraciones crecientes del tóxico para determinar cambios en el
organismo. En general la muerte es el criterio más utilizado en la
prueba de 96 horas.
a. Bioensayos de corta duración:
Estas pruebas pueden ser estáticas, de renovación o flujo
continuo, dependiendo de los organismos de prueba, los objetivos,
el equipo, el agua suministrada y el tóxico. Estas pruebas se usan
para dar una idea de la toxicidad de efluentes, desechos o
materiales para organismos acuáticos específicos. Sirven de base
para la selección de concentraciones del efluente o material de
desecho que se usará en bioensayos a largo plazo.
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b. Bioensayos de duración intermedia:
Estos bioensayos también pueden ser estáticos
o de flujo continuo, con duración de 15 a 90 días.
Estas pruebas pueden tener una duración de 24
hrs. con efluentes de baja toxicidad o que son de
actividad lenta, pero se pueden continuar hasta
30 días, que es la duración general.
c. Bioensayos de larga duración
Estas
pruebas
son
con
amplia
exposición sobre todos los estadios del
ciclo de vida que sea posible, para
determinar la máxima concentración
del efluente, desecho material que no
produce
efectos
dañinos
con
exposición continua.
Este tipo de pruebas se utilizan para determinar efectos sobre
crecimiento, reproducción, desarrollo de productos sexuales,
maduración, logro de la nidada, crecimiento y supervivencia de
diferentes estados de vida, conducta y bioacumulación.
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2.3. Por sus efectos.
a. Ensayos de toxicidad aguda
Los ensayos de toxicidad aguda son pruebas donde la exposición
se realiza en un periodo corto. Por lo general, el periodo corto es de
24 a 48 horas, no obstante, puede variar dependiendo de la especie
evaluada, puesto que para un vertebrado 72 horas siguen siendo
un tiempo mucho menor que el de su ciclo de vida normal, a
diferencia de organismos como bacterias, protistas, quienes
pueden completar su ciclo de vida o reproducirse en menos de 24
horas.
Imagen n° 1 Daphnia magna. usadas en ciertos ambientes para
probar los efectos de toxinas en el ecosistema, convirtiéndolas
en especies indicadoras, particularmente útiles en el área, debido
a su corto ciclo de vida y capacidades reproductivas.
Pero la característica más interesante es su sensibilidad a los tóxicos,
ya que es capaz de acusar la presencia de, por ejemplo, 0,005 mg. del
peligroso mercurio en el agua, y aún menores concentraciones de
numerosos pesticidas y residuos industriales. Con Daphnia magna se
hacen, generalmente, dos tipos de bioensayos: de toxicidad aguda y de
toxicidad crónica. En los de toxicidad aguda se evalúa la concentración
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del tóxico (conocido o desconocido) que es capaz de matar o inmovilizar
el 50 % de la población (CL50 o CE50) en 48 horas. Si un test de
toxicidad aguda no detecta efecto alguno de mortandad o inmovilización
esto no siempre significa que el agua analizada no contenga sustancia
alguna capaz de producir otro tipo de daño. Para estos casos se utilizan
los tests de toxicidad crónica en los que la evaluación se basa en la
capacidad reproductiva o el crecimiento de los individuos. Es posible,
entonces, con estas técnicas, dar en pocas horas una respuesta sobre
la incidencia de efluentes industriales en un ambiente acuático.
Algunos autores proponen que los ensayos en organismos
unicelulares, con exposiciones de 24 a 48 horas, estarían mejor
clasificados como crónicos, ya que abarcan gran parte del ciclo de
vida, especialmente la fase reproductiva. Sin embargo, es común
categorizar un ensayo por su duración sin importar la especie
modelo empleada.
b. Ensayos de toxicidad crónica
Los ensayos de toxicidad crónica son pruebas que se realizan
durante un periodo largo, por un tiempo en el que la exposición es
considerada continua o repetida. Este tipo de bioensayo se lleva a
cabo especialmente para determinar la dosis máxima que no
presenta efectos tóxicos fuertes a exposiciones constantes y para
reconocer los mecanismos de toxicidad acumulativos, que
complementan o contrastan, con los observados para ensayos de
toxicidad aguda.
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2.4. Por la aplicación en sus tratamientos.
a. Bioensayos estáticos
Se
efectúa
sin
la
renovación
continua del flujo constante de las
diluciones sometidas al ensayo. Son
pruebas dirigidas en laboratorio para
determinar los efectos de toxicidad
sobre
algunas
especies
de
organismos acuáticos, sometiendo
los
ejemplares
de
prueba
a
condiciones más o menos arbitrarias; la toxicidad evaluada no está
asociada con la demanda de oxígeno y es debida a sustancias
relativamente estables. Los bioensayos estáticos se usan para
organismos de prueba de fitoplancton, zooplancton y peces,
porque no es necesario renovar su solución a prueba antes de 96
hrs.
b. Bioensayos con renovación periódica
Los especímenes se someten a una preparación fresca de la
misma concentración inicialmente empleada, periódicamente
(generalmente cada 24 horas). Los bioensayos a corto plazo de
renovación o flujo continuo son usados con macro invertebrados
y peces. Pueden realizarse con organismos en diferentes estados
de su ciclo de vida. Determinan la toxicidad comparativa de
diferentes desechos o efluentes, así como la sensibilidad de los
organismos a un material dado, determinan también los
requerimientos en corto plazo de oxígeno, pH, temperatura y otros
factores ambientales.
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c. Bioensayos de flujo continuo
Circula continuamente una corriente de sustancia de prueba nueva
en contacto con los individuos experimentales. Se realizan con
la renovación continua o casi continua de las diluciones
sometidas al ensayo, con el fin de mantener casi constantes las
concentraciones de las sustancias tóxicas activas
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III.
REALIZACION DE BIOENSAYOS.
En todo laboratorio de bioensayos, cada vez que se inicia un estudio de
toxicidad se deben preparar un cronograma de actividades y un listado
general del tipo de pruebas.
Estos dos procedimientos permitirán hacer una revisión rápida de cada
proyecto.
 Bioacumulación
Son las sustancias que se acumulan en las plantas, las grandes
concentraciones de sustancias tóxicas en los tejidos pueden causar la
muerte, pero el organismo es capaz de acumular durante algún tiempo
cantidades menores sin sufrir daño.
Los bioensayos permiten, mediante el uso de las sustancias tóxicas,
evaluar el grado de afectación de los organismos el cual se produce como
un
efecto
acumulativo;
aunque
no
se
mide
directamente
la
bioacumulación, sí podemos determinar mediante el CL50 el intervalo de
concentración que los afecta.
EJEMPLOS 1.
Artemia salina Leach
Se comprueba la existencia de actividad biológica con este bioensayo, "cuando el
valor de LC 50 de los extractos expresado en
g/ml es inferior a 1,000.
El valor de I-C 50 para los extractos acuosos y etanólicos de las especies de Bidens,
indican que los extractos acuosos poseen menor actividad que los etanólicos y entre
estos los de Bidens pilosa L. mayor actividad. Los resultados se observan en los
Cuadros N.º 2 y 3, que nos llevan a afirmar que este bioensayo debe ser utilizado
como soporte de la información etnobotánica, ya que reduce al mínimo la
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probabilidad de que especies vegetales sin propiedades bioactivas en el organismo
humano se colecten para estudios farmacológicos y químicos.
1. Ensayo de citotoxicidad en Artemia salina Leach
Se evalúa la actividad tóxica de los extractos frente a las larvas de Artemia salina
(crustáceo conocido como camarón de mar) que es un identificador de la
actividad biológica de los extractos crudos o compuestos puros aislados de
plantas superiores.
El resultado de mortalidad de las larvas significa la existencia de grupos de
compuestos potencialmente activos.
2. Actividad antiulcerosa
Para este ensayo se utilizó ratas Winstar de peso entre 200-410 g, las cuales
fueron sometidas a ayuno por 24 horas.
Se distribuyeron en cinco grupos al azar.
A tres grupos se les administró por vía per oral los extractos de las drogas en
estudio 200 mg/kg de peso. El cuarto grupo recibió bismuto coloidal 70 mg/kg de
peso y el último recibió el solvente; una hora después se les administró a todos
indometacina, por la misma vía 70 mg/kg, para inducir úlceras en la mucosa
gástrica, luego se realizó el estudio fisiopatológico de la mucosa gástrica para
evaluar el índice de ulceración considerando el N.º total de úlceras, coloración de
la mucosa, edema, hemorragia y úlcera con erosiones menores de 1 min y
úlceras perforadas.
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EJEMPLO 2
BIOENSAYO DE SANGRE DE GRADO (CROTON LECHLERI)
Sangre de Grago es el nombre que recibe popularmente
el látex exudado al rasgar la corteza de algunas especies
vegetales tropicales. Es un líquido viscoso de color rojo
sangre y sabor astringente.
1. Composición química
Los componentes mayoritarios aislados de la sangre de drago de Croton lechleri,
son: catequina, epicatequina, galocatequina, epigalocatequina (monómeros de
flavan-3-oles) y proantocianidinas de diferentes tamaños. El SP-303 es un
oligómero proantocianidínico heterogéneo, aislado del látex de C. lechleri, cuyos
componentes básicos son (+)-catequina, (+)-galocatequina, (-)-epicatequina y
galoepicatequina, siendo predominantes (+)-galocatequina y (epigalocatequina.
Entre los compuestos minoritarios, se encuentran el alcaloide taspina, un lignano
denominado dimetilcedrusina, y diterpenos como ácido hardwickiico, bicantriol,
crolequinol, ácido crolequínico, korberina A y korberina B. Además están
presentes
β-sitosterol
trimetoxibenceno,
y
β-sitosterol-3-O-β-D-glucopiranósido,1,3,5-
2,4,6-trimetroxifenol,
3,4-dimetoxifenol,
alcohol
dimetoxibenzílico y alcohol 4-hidroxifenetílico.
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3,4-
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2. Potencial terapéutico
ACTIVIDAD CICATRIZANTE
Una de las actividades más conocidas, y de las primeras estudiadas, de sangre
de drago es la cicatrizante, y en ella está involucrado más de un principio activo.
El sangre de Grado estimula la contracción de la herida, ayuda en la formación
de la costra y regenera rápidamente la piel ayudando a la formación de
colágeno. A esta acción contribuyen la taspina, la 3'-4-O-dimetilcedrusina y los
polifenole (catequinas y proantocianidinas), y se ha demostrado que el látex
total es más activo que sus componentes aislados.
La sangre de grado mezclada con óxido de zinc puede ser utilizada en el
tratamiento de la alveolitis seca dolorosa, ya que induce la formación del tejido
de granulación de los alveolos secos, elimina el dolor y el mal olor presente en
esta enfermedad en períodos que fluctúan entre 24 horas y 4 días posteriores
al tratamiento.
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La taspina promueve las fases tempranas de la curación de una herida y su
mecanismo de acción podría estar relacionado con la estimulación de la
quimiotaxis de fibroblastos. Sin embargo, no se ha encontrado actividad en
ensayos específicos sobre la quimiotaxis de macrófagos, estimuladora de
neutrófilos o de la proliferación de fibroblastos. La taspina actúa en el inicio del
proceso de cicatrización in vivo en ratón durante las primeras 60 horas,
transcurrido este período de tiempo no se observa ninguna diferencia
significativa con el proceso normal de cicatrización. Este alcaloide muestra un
efecto cicatrizante dosis-dependiente (DE50 = 0,375 mg/Kg) en pruebas in vivo
en ratones. Además, se ha estudiado el efecto de la taspina en el tratamiento
de la úlcera gástrica aguda inducida por indometacina en rata. La taspina reduce
los índices de ulceración, aumenta el espesor y la consistencia de la capa de
mucus gástrico.
El lignano 3'-4-O-dimetilcedrusina también interviene en la acción de curación
de heridas con sangre de drago. Sin embargo, el látex es cuatro veces más
efectivo en la curación de heridas que la dimetrilcedrusina o la taspina aisladas.
Sangre de drago facilita la curación úlceras gástricas, reduciendo la actividad
mieloperoxidasa, el tamaño de la úlcera y la sepsis. Los polifenoles juegan un
papel importante en la acción cicatrizante del látex, probablemente debido a la
acción secuestradora de radicales libres. Las proantocianidinas estimulan la
contracción de la herida y la formación de una costra oscura que recubre la
herida. De hecho, muestras de látex que no presentaron 3'-4-Odimetilcedrusina
y contienen muy baja proporción de taspina han mostrado actividad cicatrizante.
ACTIVIDADES ANTIMICROBIANA Y ANTIVIRAL
Numerosos estudios avalan la actividad antimicrobiana y antiviral de sangre de
drago, y principalmente del SP-303. Esta proantocianidina inhibe diferentes
virus DNA y RNA, incluyendo el virus herpes (HSV tipos 1 y 2), el virus de la
hepatitis (A y B), el virus de la influenza A (FLU-A) y el virus de la parainfluenza.
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También es efectivo contra el virus RSV (virus sincitial respiratorio). La actividad
viral contra los dos tipos de virus herpes simple, incluye también el tipo I
timidinaquinasa deficiente, ya que impide la penetración del virus en la célula.
Sin embargo, es inactivo frente el citomegalovirus humano. En ensayos
vaginales en ratón, reduce significativamente la formación de la lesión cuando
se aplica tópicamente al 5-10%. EL SP-303 se encuentra en fase clínica como
tratamiento tópico de pacientes de SIDA con lesiones recurrentes por herpes
genital, y como terapia de diarreas en enfermos de SIDA. Además se ha
demostrado su eficacia en el tratamiento de las producidas por la toxina colérica.
La sangre de drago de C. lechleri es poco activa frente a Bacillus subtilis y
Escherichia coli. El 1,3,5-trimetoxibenceno y el 2,4,6-trimetoxifenol son muy
activos frente a B. subtilis, más potentes que la penicilina y el cloranfenicol.
ACTIVIDAD INMUNOMODULADORA
Sangre de drago ha demostrado actividad inmunomoduladora in vitro.
Observaciones clínicas, de un grupo de médicos del CEIA, han apuntado sobre
el posible interés de la sangre de drago de C. lechleri como adyuvante en el
tratamiento de una serie de enfermedades, que tienen en común un importante
componente inmunológico (autoinmunes, cancerosas, neurológicas y virales).
Sangre de drago presenta una potente actividad inhibidora sobre las vías clásica
y alternativa del sistema del complemento e inhibe la proliferación de células T
estimuladas. Muestra una acción dual en la modulación de la producción de
especies reactivas de oxígeno (actividad antioxidante/prooxidante) y de la
fagocitosis
(inhibición/estimulación),
dependiendo
de
la
concentración
ensayada.
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IV. REFERENCIA BIBLIOGRAFIA
 Dr. Orlando A. Abreu Guirado. Revista Cubana de Plantas
Medicinales.publicado 24 de julio de 2008. [internet] [citado 04 de julio del
2015]. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S102847962008000300009 .
 Claudia Kuklinski. Farmacognosia. 1ra Edició. Editorial Omega. 2003.
España, CAP VI
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