Facultad de Veterinaria. Grado en Veterinaria. Campus Terra. Materia: Bioquímica (1º curso) Alumna: Paula Sobral Domínguez DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE LOWRY En esta práctica vamos a realizar la determinación de la concentración de proteínas en dos muestras: extracto de hepatopancreas de mejillón preparado en la práctica anterior y leche. Principio del método El método de Lowry es un método colorimétrico. A las muestras se les añaden dos reactivos que formarán un complejo coloreado con las proteínas, así, la intensidad del color será proporcional a la concentración de proteínas (según la ley de Lambert-Beer). En el procedimiento se añaden dos reactivos: a) El primero (Reactivo A) contiene iones Cu2+ que, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando un complejo Cu2+-proteína de color azul claro. b) El segundo (Reactivo B) se reduce por la presencia en las proteínas de grupos fenólicos de la tirosina, también en medio básico. El reactivo B es de color amarillo pero al ser reducido cambia a azul oscuro. Procedimiento Existe una relación entre la concentración de proteínas de una sustancia y su absorbancia, por la Ley de Lambert-Beer que se resume con la ecuación: De este modo, cuanto más coloreada sea la muestra, mayor será su absorbancia y mayor será la concentración de proteínas. Tanto la absorbancia como la absortividad molar dependen de la longitud de onda en la que se realicen las mediciones. Por ello, hay que realizar el espectro de absorción de la sustancia previamente y elegir el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima. En esta práctica será 620 nm. Así, para determinar la concentración de proteínas en nuestras muestras problema construímos una curva patrón a partir de una solución de concentración conocida (BSA: Seroalbúmina, 1mg/ml). La curva patrón nos permitirá saber la relación existente entre la absorbancia de la muestra y la concentración de proteínas y así, conociendo la absorbancia de nuestras muestras podremos interpolar los datos para obtener su concentración de proteínas. Paso 1. Determinación de la curva patrón. 1. Preparación de un blanco y 4 diluciones de BSA (1mg/ml). Muestra Tubos Muestra (ml) Agua destilada (ml) Reactivo A (ml) Agitar y Reactivo esperar B (ml) 10 minutos Proteína patrón Seroalbúmina (BSA) 1mg/ml Blanco 0 1 5 0.5 1 2 0.1 0.2 0.9 0.8 5 5 0.5 0.5 3 4 0.3 0.4 0.7 0.6 5 5 0.5 0.5 Agitar y esperar 5 - 10 minutos Paso 2. Se miden las absorbacias en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 620 nm (para el color azul de la muestra). 1. Para realizar esta medición hay que realizar un blanco con una dilución sin proteínas para ajustar el valor de la absorbancia a 0. Este blanco será el tubo “blanco”. 2. Después se miden el resto de las diluciones por orden, y deberían dar 4 valores de absorbancias con valores ascendentes. Es decir, el tubo 2 tendrá una absorbancia mayor que el tubo 1. Los resultados obtenidos fueron Tubos Blanco 1 2 3 4 Absorbancia 0 0.184 0.296 0.421 0.59 mg de proteína 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Paso 3. Se representa en EXCEL los valores de absorbancia (y) frente a los mg de proteína (BSA) (x). Se obtiene también la ecuación de la recta patrón. Una vez obtenida la recta patrón podemos interpolar los valores de absorbancia de las muestras problema. Paso 3. Determinación de las absorbancias de las muestras problema 1. Se realizan las diluciones y se determinan las absorbancias Es importante tener en cuenta que las muestras de partida están previamente diluías a 1:10. Partiendo de 50 μL de extracto de hepatopáncreas, se le añaden 450 μL de agua destilada. A 50 μL de leche comercial se le añaden 450 μL de agua destilada. Muestras Tubos Muestra Agua (ml) destilada (ml) Extracto de E1 hepatopáncreas E2 diluido 1:10 con agua destilada 0.1 0.1 0.9 0.9 Reactivo Agitar y A (ml) esperar 10 minutos 5 5 Leche comercial L1 diluida 1:10 con L2 agua destilada 0.1 0.1 0.9 0.9 5 5 Reactivo Agitar y Absorbancia B (ml) esperar 5-10 minutos 0.5 0.435 0.5 0.411 0.5 0.5 0.482 0.497 Una vez medidas las absorbancias se procede a la interpolación de los resultados obtenidos. La media de los valores de absorbancia del extracto es 0.423. La media de los valores de absorbancia de la leche es 0.4895. 2. Utilizando la ecuación de la recta de la curva patrón podemos despejar los mg de proteínas que hay en las diluciones de las muestras A = 1.42x + 0.0148 a. Concentración de proteínas en el extracto de hepatopáncreas 0.423 = 1.42x + 0.0148. Despejando x = 0.2875 mg de proteína/0.1 ml de dilución. Es decir, 2.875 mg de proteínas/ml de dilución. Como la dilución medida era 1/10, aplicando el factor de dilución (x10), obtenemos que la concentración real de mg de proteínas en el hepatopancreas de mejillón es de 28.75 mg proteína/ml. Que es igual que: 2.875 g de proteína/100ml. b. Concentración de proteínas en la leche comercial 0.4895 = 1.42x + 0.0148. X = 0.3343 mg proteína/0.1 ml de dilución. Es decir, 3.343 mg proteína/mL. Aplicando el mismo factor de dilución (porque la dilución es la misma) la concentración real de proteínas en la leche comercial sin diluir es de 33,43 mg proteína / ml. O, de otra forma, 3.343 g / 100 mL.
