Método cuantitativo medios líquidos: En la norma se describen 3 tipos de análisis cuantitativo para medios líquidos: 1. Para medios de enriquecimiento selectivos, no selectivos, medios de enumeración (NMP) (DILUCIÓN HASTA EXTINCIÓN) (pag 32-33, norma) 2. Para Medios diluyentes (pag 35-36) 3. Para Medios de transporte (36-37) 1 DILUCION HASTA EXTINCIÓN: Preparación de las diluciones: Preparar el inóculo (asada de cepa de trabajo en APT, incubación con tiempos y a t° de acuerdo al microorganismo (fase estacionaria), luego a partir de ésta incubación, realizar diluciones seriadas (pueden ser diluciones decimales, 1/5 o 1/2). Si es medio selectivo, debe realizarse el ensayo con microorganismo objetivo para evaluar productividad y microorganismos no objetivo para ensayo de selectividad, serían dos series de diluciones a realizar. La cantidad de diluciones a preparar deben ser tal, que en la última dilución no se observe crecimiento bacteriano (por ejemplo desde la 10-1 a la 10 -10). Estas diluciones preparadas deben utilizarse dentro de un tiempo determinado (Página 22 Norma) por ejemplo de hasta 2 horas a temperatura ambiente o antes de 24 horas si se conservan a una temperatura de 5°C ± 3°C. Se transfiere un volumen conocido, generalmente 0,1ml de cada dilución preparada, sobre una placa de agar no selectivo (Ejemplo TSA) y se incuba a temperatura y tiempo de acuerdo al microorganismo correspondiente. Luego de la incubación, contar desde placa de la dilución más baja que contenga hasta 150 colonias hasta las diluciones superiores a ésta, y registrar el recuento obtenido. Generalmente para microorganismos objetivo es suficiente entre 10¯⁵ a 10¯⁸ y para microorganismos no objetivo entre 10¯¹ a 10¯⁴. Procedimiento del medio a evaluar: La misma cantidad de tubos de dilución que se utilizarán para el ensayo, es la cantidad de tubos de medio a evaluar que se utilizan. Utilizando los tubos de dilución escogidos, y comenzando por la dilución mayor, se inocula un volumen conocido (generalmente 0,1ml) a un tubo del medio a evaluar, cada tubo de dilución que se utiliza se siembra en un correspondiente tubo del medio a evaluar. Los tubos se incuban bajo condiciones de tiempo y temperatura según la norma establecida. Una vez incubados los tubos a evaluar, utilizando asa de 10μl (diferente para cada tubo de medio incubado), se siembra en un agar no selectivo. Las placas sembradas se incuban bajo condiciones de tiempo y temperatura según la norma establecida. Luego de la incubación se evalúa la presencia o ausencia de crecimiento. Interpretación de resultados: La productividad del medio es satisfactoria si se observa en la placa crecimiento de un mínimo de 10 UFC (procedente del asa de 10μl con la que se sembró agar) para la dilución que contiene menos de 100UFC. Para el cálculo de Selectividad, debe calcularse el FS (factor de selectividad). Se resta la dilución más alta del microorganismo no objetivo que muestra buen crecimiento en el medio de referencia no selectivo (TSA) (mínimo 10UFC) el cual se denominará D₀ menos la dilución máxima del medio líquido selectivo inoculado en TSA que no muestra crecimiento (o menos de 10 UFC) que se denominará Ds . Las diluciones deben expresarse en unidades logarítmicas con base 10. El resultado de esta diferencia debe ser como mínimo de 2. FS= D₀ - Ds Ejemplo D₀ 10-4 Log10 es 4 Ds 10-3 Log10 es 3 FS= 4-3 FS=1 2 METODO PARA DILUYENTES Se inocula 1ml de suspensión del microorganismo objetivo que contenga aproximadamente 104UFC/ml objetivo en 9ml del diluyente, una vez inoculado, se mezcla y se siembran 0,1 ml de esa suspensión en el medio de referencia y se incuba (Temperaturas y tiempos indicadas en la norma de acuerdo al microorganismo objetivo utilizado)(agar no selectivo, por ejemplo TSA) (esta incubación se llamará t0 ) . Luego, dejar la suspensión preparada 45 minutos a temperatura ambiente, mezclar y sembrar nuevamente 0,1ml en el medio de referencia (esta incubación se llamará t1 ). Luego de la incubación, se cuentan las colonias de las placas t0 y t1 Los resultados se interpretan de la siguiente manera: El número de colonias obtenidas en el recuento de t1 debe estar dentro del 30% de el recuento obtenido en t0
