Determinación de bioindicadores

Código: NA
Versión: 01
Fecha: Febrero de
INSTRUCTIVO PARA ALISTAMIENTO DE MATERIAL 2014
Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA
EL PROYECTO DE FORMACIÓN.
Servicio Nacional de Aprendizaje SENA
Centro de Gestión Industrial
Sistema Integrado de
Mejora Continua
CÓDIGO ENSAYO
PROGRAMA
TECNOLOGÍA EN CONTROL AMBIENTAL
NORMA
DE APLICAR
MICROORGANISMOS
EN
COMPETENCIA
DESCONTAMINACIÓN AMBIENTAL
PROCESOS
DE
RESULTADO DE ESTABLECER BIOINDICADORES DE CONTAMINACIÓN DE AGUA,
APRENDIZAJE
SUELO Y AIRE
1. Discusión general
El crecimiento de la población a nivel mundial ha incrementado los niveles de
contaminación. Esta contaminación esta· relacionada con el vertido de agua o suelo de
desecho de origen doméstico e industrial a los cuerpos diferentes ecosistemas. En el
caso de los residuos de origen doméstico, la carga contaminante esta· representada por
altos porcentajes de materia orgánica y microorganismos de origen fecal. El control de
la calidad microbiológica del agua de consumo y de desecho, requiere de análisis
dirigidos a determinar la presencia de microorganismos patógenos; los agentes
involucrados en la transmisión hídrica son las bacterias, virus y protozoos, que pueden
causar enfermedades con diferentes niveles de gravedad, desde gastroenteritis simple
hasta casos fatales de diarrea, disentería, hepatitis o fiebre tifoidea. El diagnóstico de
estos microorganismos, requiere laboratorios especializados y representa varios días
de análisis y costos elevados. Como alternativa a estos inconvenientes, se ha propuesto
el uso de indicadores microbianos que se puedan identificar mediante el uso de métodos
sencillos, rápidos y económicos. (1)
El diagnóstico y posterior recuperación de las fuentes de agua y suelo naturales
contaminadas, debe hacerse además, teniendo en cuenta las implicaciones que en
términos ecológicos y sanitarios representa la degradación del recurso.
Las bacterias totales son aquellas que nos indican calidad higiénica de algún producto
o del agua o suelo. Estos microorganismos crecen a temperaturas de 35 °C y dentro de
su grupo podemos encontrar muchos microorganismos como bacterias que pueden ser
usadas no solo como indicadores sino como posibles alternativas de los procesos de
biorremediación. (2)
Los coliformes termotolerantes (fecales), totales y E.coli indican la presencia de materia
orgánica dentro de un cuerpo de agua y una contaminación fecal. Aunque a estos
microorganismos son atribuidas enfermedades diarreicas, algunos de ellos se están
investigando por su eficiente metabolismo para remediar contaminantes dentro del
ambiente. (3)
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Los hongos y levaduras suelen ser indicadores de contaminación de aire, sin embargo
también pueden indicarnos la calidad higiénica de una muestra.
Su uso en procesos de biorremediación es muy importante debido a que muchos de los
hongos miceliales y algunas levaduras pueden integrar en su metabolismo compuesto
tóxicos dando como resultado menos contaminación de las aguas, suelo o aire.
2. Materiales e instrumentos (por grupo proyecto)
3 pipetas de 1 ml estériles
1 pipeta de 10 mililitro estéril (solo para los grupos que tienen muestra de agua)
1 espátula (solo para los grupos que tienen muestras sólidas o lodos)
1 gradilla plástica
3 espátulas de Digralsky
Pipeteador de pera o regla
3. Reactivos
9 cajas vacías estériles
3 cajas con agar plate count
3 cajas con agar papa dextrosa agar (PDA)
3 cajas con agar ChromoCult®
2 tubos con 9 ml de agua peptonada estéril
1 frasco con 90 ml de agua peptonada estéril
9 tubos con 10 ml de caldo LMX
4. Equipos
- Incubadora a 35 °C para bacterias
- Incubadora a 25 ° C para hongos
- Contador de colonia
- Baño termostatado
5. Elementos de Protección Personal (EPP) y dispositivos de seguridad
Para la realización de esta práctica es necesario el uso de los siguientes EPP y dispositivos de
seguridad:
a. Cabina de flujo laminar.
b. Gafas de seguridad.
c. Tapa oídos de copa
d. Guantes de látex o nitrilo
e. Tapabocas
f. Cofia


El marcador de vidrio, encendedor, toallas y jabón de manos deberá ser suministrado por
el grupo proyecto y es de obligatoriedad para realizar los montajes.
Así mismo deberán traer su muestra a analizar en las condiciones requeridas y solicitadas.
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6. Condiciones de seguridad
a. Use las gafas de seguridad, tapabocas y guantes para realizar todos los procedimientos del
laboratorio
b. Manipule las cajas de Petri, tomándolas siempre desde la base. Si la toma de la tapa las
puede destapar accidentalmente.
c. Use la cofia y bata mientras permanece dentro del laboratorio.
d. Use protección auditiva cuando este procesando muestras bajo cabina de flujo laminar.
e. Manipule siempre las muestras y cultivos con guantes.
f. Use guantes y tapabocas para llevar o sacar cultivos de incubadora o nevera.
g. Use guantes de nitrilo, gafas de seguridad, tapabocas y cofia para transportar y disponer los
residuos.
Manipulación del etanol: los mesones de trabajo deberán ser limpiados con alcohol al iniciar
y finalizar la práctica. Sustancia utilizada para desinfección de mesones
● Sustancia altamente inflamable.
▪ Evite las llamas y las fuentes de calor.
▪ Manipule y almacene separado de agentes oxidantes fuertes.
7. Procedimiento
7.1 Preparación de las diluciones seriadas 10-1, 10-2, 10-3
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Marque el frasco con los 90 ml como dilución 10-1 y 2 tubos con las posteriores diluciones
El trabajo de las muestras debe iniciarse lo antes posible después de su recolección,
sino se puede, se deben mantener en refrigeración sin exceder de 24 horas.
En muestras líquidas la dilución 10-1 se prepara midiendo 10 mL de la muestra en un
frasco de dilución que contenga 90 mL de agua peptonada, sosteniendo la pipeta en un
ángulo de 45 grados sobre la parte interior del cuello del frasco
Para muestras sólidas pesar 10 g del total de la muestra y llevar a un frasco de dilución
que contenga 90 ml de agua peptonada, tratando de tomar de la superficie e interior de
la muestra. Utilice utensilios estériles.
Agitar el frasco vigorosamente, dejar en reposo de 2 a 5 minutos. Transferir 1 mililitro
de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 mL del diluyente para obtener la dilución
10-2. Con otra pipeta o purgando la misma pipeta, mezclar cuidadosamente la dilución
por agitación, transferir un mililitro a otro tubo que contenga 9 mL del diluyente para
obtener la dilución 10-3.
Repetir estos pasos hasta obtener el número de diluciones deseadas, cada dilución
sucesiva disminuirá 10 veces la concentración.
Guardar una contramuestra para eventuales verificaciones, en condiciones de
refrigeración, congelación o medio ambiente de acuerdo a las características de
almacenamiento del producto.
7.2 Recuento en superficie de hongos y levaduras
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Hacer diluciones en base 10 de la muestra de acuerdo al numeral 4.1.
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Adicionar de 15-20 mL de agar OGY (el cual debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45oC) a las cajas de Petri estériles.
Marque las cajas de Petri ya gelificadas cada una con las diluciones a sembrar
Tomar de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 un volumen de 0.1 ml con la pipeta de 1 ml estéril
y sembrar en superficie
Distribuir él inoculo sobre la caja con el bastón de vidrio (espátula de Digralsky)
haciendo movimientos circulares
Dejar secar
Incubar a 25 +/- 2oC durante 5 días.
7.3 Recuento en superficie de bacterias totales
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Hacer diluciones en base 10 de la muestra de acuerdo al numeral 4.1.
Adicionar de 15-20 mL de agar nutritivo (el cual debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45oC) a las cajas de Petri estériles.
Marque las cajas de Petri ya gelificadas cada una con las diluciones a sembrar
Tomar de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 un volumen de 0.1 ml con la pipeta de 1 ml
estéril y sembrar en superficie
Distribuir él inoculo sobre la caja con el bastón de vidrio (espátula de Digralsky)
haciendo movimientos circulares
Dejar secar
Incubar a 37 +/- 2oC durante 2 días.
7.4 Recuento por la técnica de NMP de coliformes totales y termotolerantes
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Realizar las diluciones de la muestra 10-1, 10-2 y 10-3 de acuerdo a las indicaciones en
el numeral 4.1
Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones de homogenizado de la muestra en tubos
con caldo LMX utilizando tres tubos por cada dilución.
Agitar suavemente los tubos e incubarlos a 35°C +/-2°C por 24-48 horas
Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas, que se observa
por el desplazamiento del medio en el tubo de Durham y turbidez. Si a las 24 horas
todos los tubos muestran producción de gas, continuar con la prueba confirmativa.
Para la prueba confirmatoria necesitará tubos con LMX de acuerdo con los tubos que
hayan dado positivo en la prueba anterior.
7.5 Recuento de Escherichia coli
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Mantenga el agar en el baño termostatado a una temperatura de 60° C hasta su
posterior uso para evitar que se gelifique en el frasco.
Hacer diluciones en base 10 10-1, 10-2 y 10-3 de la muestra de acuerdo al numeral 4.1.
Sembrar en profundidad 1 mL de cada una de las diluciones seleccionadas, siempre
trabaje tres diluciones sucesivas.
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Adicionar de 15-20 mL de agar Chromocult (el cual debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45oC), el tiempo transcurrido entre la adición de la muestra a las cajas
de Petri y la adición de agar no debe sobrepasar los 20 minutos (preferiblemente, 10
min)
Mezclar inmediatamente las cajas con el medio de acuerdo a los siguientes
movimientos (cada uno de estos movimientos se debe hacer mínimo 5 veces)
Dejar solidificar
Incubar a 35 +/- 2oC durante 48 horas
8. Disposición de residuos
a)
En caso que algún medio de cultivo quede mal elaborado, espere hasta que se gelifique
y descártelo en la bolsa verde.
9. Bibliografía
(1) Pontificia Universidad Javeriana. 2010. Manual de procedimientos del laboratorio de
alimentos.
(2) Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales
(2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.
(3) Icontec, NTC 4070.2003. Basado en el “Bacterial Analytical Manual” Chapter 3, la norma
ISO 4833
(4) Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
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