BIOQUIMICA BIOTECNOLOGIA CINETICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO INTRODUCCION El crecimiento microbiano hace referencia al aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo y no al aumento de tamaño de un microorganismo. El aumento del número de microorganismos permite la formación de colonias o de poblaciones. Es por eso que en microbiología el crecimiento se estudia por poblaciones y no en microorganismos individuales. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria. El resultado de la fisión binaria son dos células hijas por cada célula madre, así, una célula se divide en dos, dos en cuatro y cuatro en ocho y así sucesivamente. Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso. (Prescott y col .,1999). La microbiología predictiva está relacionada con la compleja dinámica del comportamiento de la población microbiana , tal como fue observado por monod (1949), “ el crecimiento de los cultivos bacterianos a pesar de la inmensa complejidad del fenómeno ,generalmente obedece a leyes relativamente sencillas, las cuales hacen posible definir ciertas características cuantitativas del ciclo del crecimiento, esencialmente las tres constantes del crecimiento: crecimiento total ,tasa del crecimiento exponencial y crecimiento latente. Estas definiciones no son puramente arbitrarias y corresponden a elementos fisiológicos distintos del ciclo de crecimiento” (McMeekin y ros, 2002) CURVA DE CRECIMIENTO La curva de crecimiento de un cultivo microbiano puede ser subdividida en cuatro partes distintas denominadas fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. De las cuatro fases de la curva de crecimiento, habitualmente la fase de crecimiento exponencial o logarítmico es la que presenta mayor interés por ser la fase en la que el incremento del número de microorganismos es máximo. Durante esta fase el tiempo de generación (g) de los microorganismos (el tiempo que la población de microorganismo necesita para duplicar su número) se mantiene constante. Grafico 1: curva de crecimiento microbiano Fase de latencia La fase de latencia, es el periodo de ajuste que las células experimentan al ser transferidas de un medio al otro antes de iniciar su crecimiento. En esta fase se producen las enzimas necesarias para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En esta fase no hay incremento en el número de células, pero hay gran actividad metabólica, aumento en el tamaño individual de las células, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las células.(Penfold ,1914). Fase exponencial o fase logarítmica la fase exponencial o logarítmica es aquella durante la cual los microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo posible, en función de su potencial genético ,tipo de medio y condiciones en que crece .en este periodo hay una relación lineal entre el logaritmo del número de células (o cualquier otra propiedad medible de la población) y el tiempo .los microorganismos se dividen y duplican en número en intervalos regulares .como cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar discretos saltos.(Robinson y col .,1998) Fase estacionaria La fase estacionaria es resultado del agotamiento de los nutrientes disponibles o del efecto de acumulación de productos tóxicos de metabolismo que tienen como consecuencia la disminución de la velocidad del crecimiento .la transición entre la fase exponencial y la fase estacionaria se caracteriza por un crecimiento desequilibrado, durante el cual los diversos componentes celulares son sintetizados a diferentes velocidades (Buchanan y Solberg ., 1972). Fase de muerte La fase de muerte es consecuencia de diversos factores: uno importante es el agotamiento de las reservas celulares de energía. Al igual que el crecimiento, la muerte también asume una fusión exponencial que puede ser representada por una disminución lineal del número de las células viables a loa largo del tiempo (Madigan y col ., 1999) El objetivo de esta practica es obtener la ecuación cinética del crecimiento del microorganismo (levadura), en las diferentes concentraciones con respecto al tiempo MATERIALES Y METODOS Materiales 1 matraz erlenmeyer de 250ml con 100ml de medio de cultivo 1 matraz erlenmeyer de 100ml con 35 ml d medio de cultivo esteril Micropipetas, tips Cámara de Neubauer 20 tubos de 16X100mm esteriles o viales Pipetas de 2,5 ml y 10ml Propipetas Cubetas de lectura Gradilla Mechero 12 ubos eppendorf REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO Solución fisiológica Medio de cultivo YEPD o caldo sabouraud o caldo patata dextrosa Solución de azul de metileno EQUIPOS Espectrofotómetro Autoclave Incubadora a 30°C Centrifugadora Estufa a 80°C Balanza analítica Baño termostatizado CEPA Sacharomyces cerevisiae DESARROLLO EXPERIMENTAL Para determinar la tasa de crecimiento celular de un cultivo habitualmente se comienza con un RESULTADOS TABLA 1. Cinética de crecimiento de Saccharomyces cerevisae Tubo DO Cel/mL Peso (g) 1 1.486 42137,7315 0.022 2 1.013 28725,1157 0.0122 3 0.701 19877,8935 0.0087 4 0.544 15425,9259 0.0069 5 0.450 12760,4167 0.0057 6 0.413 11711,2269 0.0065 7 0.295 8365,16204 0.0049 8 0.262 7429,39815 0.0055 9 0.309 8762,15278 0.0039 DETERMINACION DE LA DENSIDAD CELULAR N lev/mL Viables % 610000 570000 93 Muertas % 40000 7 Tabla 2 relacion de consumo de glucosa en relación a la DO glucosa DO-blanco g/L 0,96 1,664 0,85 1,467 0,76 1,296 0,54 0,898 0,46 0,754 0,41 0,666 0,27 0,408 0,08 0,061 Grafica 1. Curva de calibración de la relación de C de glucosa/DO glucosa vs densidad optica 1,8 y = 1,8207x - 0,0837 R² = 1 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Grafica 2. Relación entre desarrollo celular y DO Tabla 3 desarrollo celular en relación a la DO DO Nºcell/ml vs DO 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10000 20000 30000 40000 50000 Nºcell/ml Grafica 3. Relación entre desarrollo celular y el peso Tabla 4 desarrollo celular en relación al peso Nºcell/ml vs peso Nº cell/ml peso 42137,7315 0,022 28725,1157 0,0122 19877,8935 0,0087 15425,9259 0,0069 12760,4167 0,0057 11711,2269 0,0065 8365,16204 0,0049 7429,39815 0,0055 8762,15278 0,0039 50000 Nºcell/ml 40000 30000 20000 10000 0 0 2 1,5 DO 0,01 0,015 0,02 Tabla 5 de peso seco en relación a la DO Peso seco vs DO 1 0,5 0 0,005 0,005 peso Grafica 4. Relación entre el peso seco y la DO 0 Nº cell/ml DO 42137,7315 1,486 28725,1157 1,013 19877,8935 0,701 15425,9259 0,544 12760,4167 0,45 11711,2269 0,413 8365,16204 0,295 7429,39815 0,262 8762,15278 0,309 0,01 0,015 peso 0,02 0,025 peso DO 0,022 1,486 0,0122 1,013 0,0087 0,701 0,0069 0,544 0,0057 0,45 0,0065 0,413 0,0049 0,295 0,0055 0,262 0,0039 0,309 0,025 Grafica 5. Del crecimiento celular en relación al tiempo Tabla 6 crecimiento celular en relación al tiempo crecimiento celular en relacion al tiempo Tiempo/hrs DO 0 0,088 2 0,135 13 0,589 15 1,576 17 2,211 19 2,286 21 3,5 23 4,186 5 DO 4 3 2 1 0 0 5 20 25 Tabla 7 consumo de glucosa en relación al tiempo consumo de glucosa en relacion al tiempo 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 5 15 Tiempo/hrs Grafica 5. Del consumo de glucosa en relación al tiempo 0 10 10 15 20 25 Tiempo/hrs glucosa g/L 0 0,96 2 0,85 13 0,76 15 0,54 17 0,46 19 0,41 21 0,27 23 0,08 DISCUSIONES Establece el valor de velocidad máxima de crecimiento para la Saccharomyces cerevisiae 0,45 h-1, el valor encontrado es menor a comparación de este resultando 0,0023 h-1. (BU¨LOCK, 1987) Determino un valor para la constante de saturación (Ks) para la Saccharomyces cerevisiae de 25 mg/l (0,025g/l) resultando nuestro valor muy superior de lo encontrado por Marison resultando 36g/l. (Marison, 1996) CONLUSIONES Según los resultados obtenidos en la práctica los valores determinados tanto para la u max y la constante de saturación en el primer caso el valor de la velocidad de crecimiento es muy inferior a lo encontrado por la bibliografía consultada y en el segundo caso el valor de la constante de saturación (Ks) resulto muy elevado o podemos afirmar que el valor determinado por Marison es igual a 25g/l valor que es cercano al calculado. Los resultados obtenidos para cada muestra se calcularon sus respectivas ecuaciones para determinar la biomasa en función al tiempo y la biomasa inicial. De la misma forma para cada concentración se le realizo su respectiva curva de crecimiento microbiano observándose que para cada concentración existía un crecimiento de biomasa más que las otras concentraciones. CUESTIONARIO 1. Porque es necesario hacer una curva de crecimiento? Mencione 3 aplicaciones En la investigación, a menudo es fundamental para conocer el número de bacterias en una muestra, por lo que el experimento puede repetirse, si fuera necesario, con los mismos números exactos. Por ejemplo, durante los experimentos en que se agregan inoculantes bacterianos a una parcela de tierra, un mínimo de 104 UFC deben añadirse por gramo de suelo para conseguir el efecto deseado, como mayor biodegradación de contaminantes tóxicos de suelo orgánico. - Otro ejemplo es el caso de inoculantes rizobios producidos comercialmente, donde el conocido número de rizobios (bacterias que entran en relaciones simbióticas con las raíces de las plantas) está impregnado en un medio a base de turba de carbón. El medio se utiliza para inocular semillas de leguminosas para mejorar la fijación biológica del nitrógeno (es decir, la conversión de nitrógeno molecular en formas orgánicas que puede ser utilizado por organismos como nutrientes). - También es útil para evaluar si particular cepas de bacterias están adaptadas para metabolizar ciertos sustratos, como desechos industriales o contaminación de aceite. Las bacterias que están genéticamente diseñadas para limpiar derrames de petróleo, por ejemplo, se pueden cultivar en presencia de complejos hidrocarburos para asegurar que su crecimiento no sería ser reprimido por los efectos tóxicos del petróleo. Del mismo modo, la pendiente y la forma de las curvas de crecimiento producido a partir de bacterias cultivadas con mezclas de residuos industriales pueden informar a los científicos si las bacterias pueden metabolizar la sustancia particular, y cuántas fuentes de energía potencial para las bacterias que pueden encontrarse en la mezcla de residuos. 2. Brevemente describa 2 técnicas para obtener cultivos sincrónicos Los principales métodos de obtención de cultivos sincrónicos se basan en seleccionar, a partir de un cultivo estándar no sincrónico, aquellas células que o bien son del mismo tamaño, o bien son de la misma edad. Las técnicas principales son: - selección por tamaños: se suele recurrir a gradientes de densidad, sobre todo los formados por mezclas de agua normal y agua deuterada (H2O/D2O). - selección por edades: el método más empleado es la selección por filtración (técnica de Helmstetter-Cummings), aunque sólo se puede aplicar a ciertas cepas (en E. coli ) REFERENCIA BIBLIOGRAFICA C.G.Sinclair, 1987 department of chemical engineering, university of Manchester institute of science and technology. PO Box 88 Jhon bu’lock, 1987. Biotecnología básica. Editorial Acribia, S.A Crecimiento Microbiano (Prescott y col ., 1999). (McMeekin y ros, 2002). Curva de Crecimiento ; Microbiología ((Penfold ,1914),(Buchanan y Solberg ., 1972) Tiempo de Latencia(Swinnen y col ., 2004),(Montville , 2000), (Swinnen y col. ,2004). Tiempo de Generación (Según Stanier y col., 1989) ( Madigan y col .,1997). Velocidad de Crecimiento(Madigan y col .,1999),( Stanier y col., 1989)
