Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Medicina y Psicología Código L3-IT-014 Revisión 3 Referencia MGC Sección 7.5.1 IT – Manejo del Cepario Página 1 de 5 1. Objetivo: Definir la metodología para la obtención, identificación, conservación, microbiológicas que integran el cepario del Laboratorio 3. uso y manejode cepas 2. Alcance: Aplica al personal involucrado en las actividades del área de Microbiología, así como al coordinador, el auxiliar y al personal docente del laboratorio. 3. Definiciones: Cultivos de referencia: Término colectivo que se refiere a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo. CRC: Cepas de referencia certificadas con certificado biológico CPC: Cepas DE PROOVEDORES COMERCIALES. CAC: Cepas de aislamientos de cultivos previamente identificadas. CC y V: Control de calidad y viabilidad. IT: Instrucción de trabajo. RPBI: Residuos peligrosos Biológico Infecciosos. 4. Instrucción: 4.1. Medios de cultivo: Infusión cerebro corazón, agar soya tripticasa, agar Sangre, agar Chocolate. 4.2. Materiales y reactivos: Sistema MicroScan Identificación bacteriana (Incluye paneles y reactivos), glicerol y otros agentes crió preservadores, materiales para manipulación de cultivos y/o sistema de identificación manual. 4.3. Equipo: Incubadora, campana Flujo laminar, refrigerador, congelador, sistema Microscan Dade. TABLA DE CAMBIOS REVISIÓN FECHA Elaboró/Modificó: QFB Ma. Luz Ibarra Arias/MC Martha Rosales Aguilar Revisó: Autorizó: DESCRIPCION ELABORÓ/MODIFICÓ 4.4. Introducción: El laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de referencia. Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para: a. Mantener cepas microbiológicas que se utilizan en prácticas de laboratorio. b. Evaluar la calidad de los medios de cultivo y reactivos. c. Aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayo y validación de métodos microbiológicos. La obtención de cepas microbiológicas que se utilizan en prácticas de laboratorio pueden ser de diferente procedencia: a. Cepas de una colección nacional o internacional de cultivo de referencia reconocida (Ej.ATCC) b. Cepas de proveedores comerciales que comercialicen repiques de cepas de referencia.(CPC) c. Cepas que provienen de aislamientos, previamente probadas y que mantengan su viabilidad y sus caracteres bioquímicas.(CAC) A partir de las cepas de referencia (STOCK) se obtendrán las cepas de reserva (SEMISTOCK) y las cepas de trabajo. 4.5. Observaciones importantes: a. Para prevenir mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de las cepas el número de repiques a partir de la cepa de referencia debe ser limitado (En general es aceptado hasta 5 repiques a partir de la cepa de referencia ATCC) b. Se debe realizar pruebas control de pureza y viabilidad a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ QUE HAGA UN REPIQUE. c. En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva No deben volver a congelarse. d. El crió vial vencido se elimina del cepario y se registra. e. Cuando se fracciona alícuotas en glicerol, leche u otros agentes crioprotectores, se usan, se descongelan y NO se pueden volver a congelar ni a usar. f. Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden volver a usar. g. La edad del cultivo antes de ser expuesto a bajas temperaturas recomendado para bacterias es 24 hrs. A 37C. h. Atemperar medios de cultivo y cepas antes de su uso. i. Disponga apropiadamente los RPBI. 4.6. Cepas de referencia de una colección nacional e internacional reconocida. (CRC o CPC) Al ingreso de una cepa de colección Nacional o internacional. (Generalmente el 3er o 4 repique) Obtenga el certificado de origen donde conste el número de repique y el origen, entre otros (Véase anexos) y archive apropiadamente. 4.6.1. Procedimiento para reconstituir cepas de referencia. (CRC o CPC) a. Al recibir las Cepas de referencia almacene a T entre 2-8 º C . b. Las cepas liofilizadas requeridas para las prácticas deberán ser preparadas. Abra el paquete en la campana de flujo laminar y coloque el hisopo de con la cepa en caldo BHI o agua peptonada y deje incubando 24Hrs, si es de las cepas fastidiosas o requiere camara de incubacion de CO2 y deje de 48 a 72 hrs y se observe desarrollo bacteriano. c. De las cepas preparadas en medio liquido realizar el pase a medios sólidos; cada cepa deberá de inocularse en medios de cultivo nutritivos y/o selectivos de acuerdo a las condiciones de cada Cepa. d. Inocule por DUPLICADO (1) (2) los medios de cultivo e identifique (Genero y especie del microorganismo. tipo (cepa de referencia) y Nº de colección. GC-FR-002 Rev4 Universidad Autónoma de Baja California Facultad de Medicina y Psicología IT – Manejo del Cepario e. f. g. Código L3-IT-014 Revisión 3 Referencia MGC Sección 7.5.1 Página 3 de 5 Incube por 24 hrs., en el ambiente apropiado de acuerdo al microorganismo y las condiciones especificadas en el certificado de origen. ( Ej. 37C ambiente Co2) (Véase anexos) Después del desarrollo bacteriano utilice cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (características de las colonias, reacción Gram. y pruebas bioquímicas que apliquen) Registre resultados en el formato L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) Utilice cultivo 2 para inocular los medios de cultivo de reserva o stock. 4.6.2. Cepas que provienen de aislamientos de cultivos (CAC) (Cepas previamente seleccionadas que pueden ser utilizadas en prácticas de laboratorio) a. Seleccione y prepare el o los medios de cultivo de acuerdo a la Cepa. b. Inocule por DUPLICADO (1) (2) los medios de cultivo e identifique (Genero y especie del microorganismo y su procedencia. (ej. sec. herida, otico etc.) c. Incube por 24 hrs., en el ambiente apropiado de acuerdo al microorganismo. d. Después del desarrollo bacteriano utilice cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (características de las colonias, reacción Gram. y pruebas bioquímicas que apliquen) e. Registre resultados en el Formato L3-FR-005, (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) f. Utilice cultivo (2) para inocular los medios de cultivo de reserva (stock) 4.7. Procedimiento para obtención de cepas de reserva (stock) a. Prepare medio de cultivo de acuerdo a la cepa. ( BHI, Agua peptonada) b. Inocule la cepa (caja 2) e incube a 37C por 24hrs. c. Identifique apropiadamente. d. Transfiera la cepa(s) en medios de cultivo en tubo con BHI o agua peptonada (2.0 ml/ tubo) hasta alcanzar la turbidez similar al tubo 3 del Nefelómetro de MacFarland. e. Obtenga un mínimo de 4 tubos por cepa y etiquete apropiadamente. f. Adicione agente crioprotector: glicerol (Relación 1 inoculo por 1 de glicerol) u otros agentes. g. Selle apropiadamente cada uno de los tubos. h. Almacene en congelación ( entre -20C y -70C ) i. Registre como cepa de reserva stock en el formato L3-FR-003 (Catalogo de Cepas Microbiológicas) 5.3. Procedimiento para obtención de cepas semistock. a. Las cepas semistock se preparan a partir de las cepas congeladas. b. Seleccione y atempere uno de los tubos de cepa stock. c. Registre la baja en el formato L3-FR-003 (Catalogo cepas microbiológicas) d. Inocule por duplicado (1) (2) en medio(s) de cultivo apropiado (BHI, AST distribuido en tubo inclinado, Agar chocolate, Agar sangre ) e. Incube a T 37 C en el ambiente apropiado ( aerobio, CO2) f. Uutilicé cultivo (1) para realizar las pruebas de pureza y viabilidad ( características de las colonias, reacción Gram. y pruebas bioquímicas que apliquen) g. Registre resultados en el Formato L3-FR-005, (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) h. Utilice cultivo (2) para preparar tubos semistock (un mínimo de 4) i. Etiquete apropiadamente cada uno de los tubos (anexo 1) j. Añada agente crioprotector a los cultivos (con excepciones) y Almacene en Refrigeración 2-8 C. k. A partir de estos cultivos prepare las cepas de trabajo. GC-FR-002 Rev4 Universidad Autónoma de Baja California Código L3-IT-014 Facultad de Medicina y Psicología Revisión 3 Referencia MGC Sección 7.5.1 IT – Manejo del Cepario Página 4 de 5 5.4. Procedimiento para obtención de cepas de trabajo. a. Introducción: Para la preparación de cepas de trabajo destinadas a prácticas de laboratorio deberá de considerarse el número, selección, evaluación y preparación de las cepas de acuerdo al calendario de prácticas y a las indicaciones del coordinador del laboratorio 3. b. Las cepas de trabajo se preparan a partir de las cepas semistock refrigeradas (2-8 C) c. Seleccione uno de los tubos de cepa semistock. d. Registre la baja en el formato L3-FR-004 (Control de manejo de cepas) e. Inocule en medio de cultivo apropiado (BHI, AST, Agar chocolate, Agar sangre), de acuerdo a las especificaciones del Manual de prácticas de Laboratorio de Microbiología Medica (L3MN3-002) f. Identifique e incube a T 37 C en el ambiente apropiado (aerobio, CO2) por 24 Hrs. g. Utilicé uno de los cultivos para realizar las pruebas de pureza y viabilidad (características de las colonias, reacción Gram. y pruebas bioquímicas que apliquen) l. Registre resultados en el Formato L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) h. Prepare la cantidad de cepas necesarias de acuerdo al manual de prácticas de microbiología médica (L3-ML-002 y) y/o a la solicitud del coordinador de laboratorio. 5. Registros. IDENTIFICACIÓN ALMACENAMIENTO Y PROTECCIÓN RECUPERACIÓN TIEMPO DE RETENCIÓN DISPOSICIÓN. L3-FR-003 (Catalogo de cepas microbiológicas) Archivero del responsable de laboratorio Por Código y fecha en archivo 1 año Destrucción mecánica L3-FR-004 (Control de manejo de cepas) Archivero del responsable de laboratorio Por Código y fecha en archivo 1 año Destrucción mecánica L3-FR-005 (Registro de control de calidad, pureza y viabilidad de cepas) Archivero del responsable de laboratorio Por Código y fecha en archivo 1 año Destrucción mecánica 6. Referencias. a. b. c. d. e. L3-ML-003. Manual de laboratorio de microbiología básica AD-PR-004. Procedimiento de prevención y gestión integral de los residuos. MGC sección 7.5.1. Control de la producción y de la prestación del servicio NOM-087-ECOL-SSA1-2002 Norma ISO 17025 7. Anexos. a. Datos para el Registro e Identificación de cepas de referencia Género y especie del microorganismo TIPO y Nº de colección. Nº de lote. GC-FR-002 Rev4 Universidad Autónoma de Baja California Código L3-IT-014 Facultad de Medicina y Psicología Revisión 3 Referencia MGC Sección 7.5.1 IT – Manejo del Cepario Página 5 de 5 Fecha de recepción. Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable b. c. d. CEPA DE REFERENCIA Reconstitución (Sólo se acepta un único repique) * OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA * CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS (Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.) Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento Se subcultiva una sola vez. Descongelación / reconstitución * CEPAS DE TRABAJO (Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD GC-FR-002 Rev4
