Prueba de citrato Alumno: Braulio Durán Oliver Profesora: Claudia Montalvo Paquini Principio: Determinar si un M.O. es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento con alcalinidad resultante. Objetivo: El citrato es parte del grupo de pruebas IMViC. Para la identificación de la familia Enterobacteriaceae, de microorganismos Gram negativos relacionados y de bacterias no fermentadoras. Bioquímica: La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico, por la utilización del citrato como única fuente de carbono, mismas que utilizan como fuente de nitrógeno a las sales de amonio. En condiciones normales, el metabolismo del citrato involucra una condensación de acetilo con coenzima A y oxalacetato para ingresar al Ciclo de Krebs. Citrato Oxalacetato + acetato Piruvato + CO2 Los productos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio; a un pH alcalino, se producen más acetato y formato, y disminuye la producción de lactato y CO2. A un pH por encima de 7.0 no existe producción de lactato y los productos son: citrato - ácido fórmico + + 2 ácido acético + CO2 A un pH ácido, los principales productos del metabolismo del citrato son acetilmetilcarbinol (acetoína) y lactato. Sin tener en cuenta los productos finales producidos, el primer paso metabólico en la fermentación del citrato produce piruvato. La degradación del piruvato depende entonces del pH del medio: pH Alcalino : piruvato acetato + formato pH ácido : 2 piruvato acetato + lactato + CO2 2 piruvato Acetoína + 2 CO2 Medios y Metodología Agar Citrato de Simmons (pH 6.9 +- 0.2) 1.- Ingredientes: Sulfato de Magnesio, MgSO4 . 7H2O 0.2 g Fosfato monoamónico, NH4H2PO 1g 4 Fosfato dipotásico, K2HPO4 1g Citrato de Sodio, Na3C6H5O7 . 2 H2O 2g Cloruro de sodio, NaCl 5g Agar Azul de bromotimol (BTB) Agua desionizada 15 – 20 g 0.8 g 1000 ml 2.-Indicador de pH : Azul de Bromotimol 3.-Metodo de preparación: a) Pesar la cantidad con precisión como se indica en el rotulo. b)Rehidratar con agua destilada o desmineralizada. c)Calentar suavemente la solución d)Distribuir en tubos alrededor de 4.0 -5.0 ml en cada tubo (pico de flauta largo, extremo inferior corto) 4.-Método de esterilización: autoclave, 121ºC, 15 lb, 15 min. 5.-Dejar que el medio solidifique en posición inclinada. 6.-Enfriar ante de su uso y conservar en refrigerador (4 – 10 ºC) 7.- Inoculación: a)Crecimiento a partir de un cultivo puro de 18 a 24 h en agar con hierro de Kliger (KIA) u otro medio adecuado; no se recomiendan las suspensiones en caldo. b)Llevar los medios a temperatura ambiente antes de la inoculación. c)Inóculos livianos; se recomienda una aguja de inoculación. d)Estriar sólo en el pico de la flauta (estriado simple) 8.-Incubaciòn: Con las tapas flojas (la reacción requiere oxígeno), 35ºC, 24 – 48 h (puede requerirse una incubación prolongada de hasta 4 días) Interpretación de resultados A. Medio de citrato de Simmons 1.-Positivo (+) : Crecimiento con un intenso color azul en el pico de la flauta. 2.-Negativo (-) : ausencia de crecimiento y ningún cambio en el color (verde) Referencias:
