Tema 7: Fijación y reducción de CO2 Ciclo de Calvin Síntesis de sacarosa y almidón Metabolismo C4 Metabolismo CAM Fijación de dióxido de carbono - INTRODUCCIÓN Desde hace 62 años una organización independiente americana mide diariamente la concentración de CO2 en la atmósfera. En 1955 se situaba en 315 ppm. En 2015 se rompió la barrera de las 400 ppm y en febrero de 2017 alcanzó un valor de 406,42 ppm. Es decir, en los últimos 62 años, la concentración de CO2 en la atmósfera ha aumentado un 30%. (datos tomados de https://www.CO2.org y https://www.co2.earth) Atmospheric CO2 February 2019 411.75 Alto contenido vapor agua Baja [CO2] El CO2 de la atmósfera penetra en la planta por estomas. La apertura y cierre de estomas es un proceso muy regulado. Excepto en plantas CAM los estomas se abren al amanecer y se cierran cuando anochece. H2O CO2 La fijación de CO2 genera el gradiente necesario para que siga entrando pasivamente. Fijación de dióxido de carbono Tres grupos de plantas según la forma de fijar CO2: - CO2 (atm) 1. Plantas C3 (metabolismo C3): 95% de las especies. * El CO2 penetra por los estomas y se fija en el Ciclo de Calvin que normalmente ocurre en las células del mesófilo foliar. INTRODUCCIÓN Ciclo Calvin C reducido 2. Plantas C4 (metabolismo C4): 3% de las especies. * Dos tipos de células fotosintéticas: mesófilo y vaina del haz. Mesófilo: CO2 (atm) + fosfoenolpiruvato (PEP) Vaina del haz: Compuesto de 4C Compuesto de 4C PEP + CO2 Ciclo Calvin C reducido 3. Plantas CAM (metabolismo CAM). En Cactaceas y familias próximas. Semejante a las C4. C reducido vacuola * Un tipo de célula fotosintética. Ciclo Noche Calvin CO (atm) + PEP Compuesto de 4C Día Compuesto de 4C PEP + CO2 Fijación de dióxido de carbono - PGA: 3-fosfoglicerato GAP: 3-fosfogliceraldehído Características ciclo de Calvin • Proceso de fijación de CO2 Principal consumidor ATP/NADPH del estroma. INTRODUCCIÓN de • Es un proceso cíclico por que la fijación conlleva destrucción del azúcar fijador que por tanto debe regenerarse utilizando una parte del carbono fijado. Ribulosa 1,5bifosfato (x3) CO2 (x3) Carboxilación 3-PGA (x6) Regeneración Reducción • El carbono entra como CO2 y (carbono oxidado) y sale como triosas-fosfato reducidas (fosfogliceraldehído – GAP). • Consta 13 reacciones catalizadas por 11 enzimas y agrupadas en 3 fases: carboxilación, reducción y regeneración. Entrada de C GAP (x5) 3-GAP (x6) GAP €(x1) Salida de C Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN PGA: 3-fosfoglicerato GAP: 3-fosfogliceraldehído Fases ciclo de Calvin 1. CARBOXILACIÓN: Ribulosa 1,5bifosfato (x3) (RuBP) CO2 + Ribulosabifosfato (RuBP) → 2 Fosfoglicerato (PGA) Entrada de C CO2 (x3) 2. REDUCCIÓN: Carboxilación 2.a. Activación de PGA: PGA + ATP → Bifosfoglicerato (BPGA) + ADP 3-PGA (x6) PGA (glicerato-3-fosfato) Regeneración 2.b. Reducción de BPGA: Reducción BPGA + NAPH → Gliceraldehídofosfato (GAP)+ NADP+ 3. REGENERACIÓN DE RuBP: BPGA (bifosfoglicerato) GAP (x5) 3-GAP (x6) - Una parte de GAP se utiliza en regenerar RuBP: GAP → RuBP - La otra parte de GAP sale al citosol y sintetiza sacarosa: GAP → sacarosa GAP €(x1) Salida de C Fijación de dióxido de carbono 1. - CICLO DE CALVIN Carboxilación: Substrato fijador: ribulosa-1,5-bifosfato (RuBP). Intermediario: 3-ceto-2-carboxi-arabinitol-bifosfato (CAB). Enzima: ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasa-oxigenasa (rubisco) Producto liberado: 2 moléculas de ácido 3-fosfoglicérico (PGA). P C P C C C P C C C P Ribulosa-1,5-bifosfato RuBP C P 3-ceto-2-carboxiarabinitol-bifosfato (CAB) Ac. 3-fosfoglicérico (x2) P Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Ribulosa-1,5-bifosfato-carboxilasaoxigenasa (rubisco): • Es la proteína más abundante del planeta (aprox. 50% de la proteína total del cloroplasto). Es clave para la producción de biomasa a partir del CO2 . • Localización: exclusivamente en estroma del cloroplasto. Inmunolocalización de rubisco: Una sección transversal de hoja (Atriplex hastata) es tratada con IgG anti-rubisco e IgG secundaria unida a un fluorocromo. Se observa que la fluorescencia se restringe al estroma. • Existen 2 tipos principales de rubisco que difieren en estructura, distribución y sensibilidad al O2: Tipo I (en la mayoría de bacterias autótrofas y quimiótrofas y plantas superiores): 8 subunidades grandes (55 kDa) y 8 pequeñas (14 kDa). Tipo II (en algunas bacterias autótrofas y ciertos dinoflagelados): 2 sub. de 50 kDa. Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Estructura de rubisco tipo I (560 KDa): 16 subunidades (8 grandes y 8 pequeñas), 208 hélices, 248 láminas β y 456 giros, todo ello estabilizado por 2.992 puentes de H2. * 8 subunidades grandes (56 kDa) con un centro activo cada una (8 por molécula) y codificadas por DNA cloroplástico * 8 subunidades pequeñas (14 kDa) codificadas por DNA nuclear. Estructura cuaternaria de la rubisco. Con 8 subunidades grandes (azul claro y oscuro) y 8 subunidades pequeñas (rojo). •reaction mechanism: http://www.biologie.uni-hamburg.de/lehre/bza/1rxo/e1rxom.htm •Structure: http://www.biologie.uni-hamburg.de/lehre/bza/1rxo/ereact.htm Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Iizquierda: RuBisCo tipo I (plantas y algas) formada por 8 subunidades grandes y 8 subunidades pequeñas. Derecha: RuBisCo tipo II (bacterias) formada por 2 subunidades grandes. Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Subunidades grandes de la rubisco (56 KDa): ● Muy conservadas (idénticas en un 90% en plantas de cultivo agrícola). RuBP ● Contiene 475 aminoácidos y es codificada por DNA del cloroplasto. ● La rubisco tiene 4 dímeros (8 subunidades) de la subunidad grande agrupados en forma de barril: - Las otras 8 subunidades pequeñas se disponen en los extremos de dicho barril. Dímero de subunidades grandes con centros activos. ● En el dominio carboxiterminal, cerca de la zona de unión de las dos subunidades del dímero, se encuentran los centros activos (8 por molécula de rubisco). Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Subunidades pequeñas de la rubisco (14k Da): ● Menos conservadas que las subunidades grandes (idénticas en un 70% en plantas con interés agrícola). ● Función : estabilizar los 4 dímeros de subunidades grandes. ● Contiene 123 aminoácidos y es codificada por DNA del nucleo. subunidad pequeña Subunidades grande (azul) y pequeña (verde) de rubisco de Nicotiana tabaccum. Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO La rubisco tiene un bajo turnover: elevada vida media. La actividad rubisco se regula postraducionalmente activación/desactivación dependiente de la luz: mediante Día: activa Noche: inactiva De esta forma se acopla el ciclo de Calvin con el suministro de ATP y NADPH. activación Luz Tilacoides H2O O2 Rubisco Estroma CO2 CH2O un sistema de Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO Mecanismo de activación: 1. Carbamilación: unión de un CO2 (diferente al que se fija) a un NH2 de una lisina de una subunidad grande (Lys-201). Aparece una carga negativa superficial. Carbamilación de la rubisco 2. Unión de ión Mg2+ a la carga negativa generada en el primer paso. El ión Mg2+ es indispensable en la reacción de carboxilación. Mg2+ + CO2 H H+ Rubisco Rubisco Rubisco Rubisco Lys Lys Lys NH NH3+ NH2 NH COO- COO- Mg2+ Inactiva Lys Activa Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO 1. Carbamilación. El CO2 se une al grupo amino de la Lys201 del centro activo de la rubisco 2. Unión de Mg a los aminoácidos Lys201, Asp202, Asp203, Glu204 del centro activo de la rubisco. Rubisco Mg CO2 2 1 Lys201 3. Unión de RuBP a Mg a través de los dos oxígenos de C2 y C3. RuBP 3 Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO La activación de rubisco necesita de la actividad previa de la enzima rubisco activasa: • El substrato RuBP permanece unido al centro activo de rubisco e impide que se active por carbamilación y unión de Mg2+. • Rubisco activasa promueve la liberación de RuBP en una reacción dependiente de ATP. • Rubisco activasa depende de luz (necesita ATP) y se activa por ferredoxina-tioredoxina (lamina 32) ATP ADP + Pi RuBP Rubisco CO2 RuBP Mg2+ RuBP Activasa Rubisco Rubisco Rubisco Activasa Lys Lys NH3+ NH3+ Activasa Lys 2 H+ NH3+ Lys NH COO- Inactiva Activa Mg2+ Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO Efecto de la luz en la activación de la rubisco: ● Activación de rubisco activasa por ferredoxina tiorredoxina. ● Síntesis de ATP necesario para la actividad rubisco activasa ● Generación en el estroma de las dos condiciones necesarias para la activación de rubisco (pH alcalino y alta [Mg 2+]). Estroma H+ Lumen tilacoidal H+ Lumen: Estroma: ↑ pH ↑ Mg2+ ↓ pH Mg2+ Condiciones necesarias para activar rubisco Fijación de dióxido de carbono - ACTIVACIÓN DE RUBISCO Conceptos previos: tautomería ceto-enólica. * Se da en aldehídos y cetonas con hidrógenos en α. * Es un tipo de isomería de función, donde los isómeros coexisten en equilibrio químico. ceto enol ceto enol * El C2 de la RuBP puede adoptar una de dos posibles configuraciones ceto o enol. El tautómero más estable en solución es el ceto (forma predominante). Fijación de dióxido de carbono - MECANISMO DE LA REACCIÓN CARBOXILATIVA Mecanismo de la carboxilación de RuBP: CO2 1. Unión y enolización de RuBP: ● La forma activa de rubisco estabiliza en su centro activo la forma dienólica del sustrato (RuBP) Ribulosa Intermediario 1,5-bifosfato enediólico Ribulosa 1,5-bifosfato Intermediario enediólico 2-carboxi-3-ceto-Darabinitol-1,5-bifosfato 2. Carboxilación de RuBP: ● EL Mg del centro activo polariza el CO2 y permite que ejerza un ataque electrofílico al C2 del enediol. ● El enlace covalente entre CO2 y RuBP resulta en la formación de un azúcar ramificado de 6C. Fijación de dióxido de carbono - MECANISMO DE LA REACCIÓN CARBOXILATIVA 3. Hidratación del intermediario de 6C: una molécula de agua pierde un hidrógeno y el oxígeno del hidroxilo resultante ataca al C3 del intermediario, hidratándose el intermediario de 6C. H2O 4. Ruptura del enlace C2-C3: Se forma una molécula de 3-Dfosfoglicerato, que se libera de la enzima, y un carbanión que permanece unido. Carbanión Intermediario hidratado 5. Protonación de C2 del carbanión. Resulta en la formación de otra molécula de 3-fosfoglicerato. Esta reacción también es estereoespecífica (solo se forma D-3-fosfoglicerato). 3-PGA H+ Carbanión 3-PGA Fijación de dióxido de carbono - MECANISMO DE LA REACCIÓN CARBOXILATIVA Resumen de la carboxilación de RuBP: * Unión de los substratos, CO2 y RuBP, a través de un átomo de Mg. Se estabiliza la forma dienólica de RuBP. * Carboxilación: formación de un enlace C-C el CO2 y la RuBP. El intermediario de 6C (CAB) es inestable. * Escisión del intermediario CAB en dos moléculas iguales (fosfoglicerato -PGA-) que se liberan de la enzima. Enolización Ribulosa bifosfato (Ceto) Carboxilación Ribulosa bifosfato (Enediol) Hidratación 3-ceto-2-carboxi arabinitol-bifosfato (CAB) Ruptura Ac. 3-fosfoglicérico (x2) Fijación de dióxido de carbono - MECANISMO DE LA REACCIÓN CARBOXILATIVA Rubisco tiene actividad carboxilasa y oxigenasa: CO2 y O2 compiten para reaccionar con RuBP. ● Carboxilasa: incorporación de CO2 al C2 de la ribulosa bifosfato originando un intermediario de 6C que se rompe y forma 2 moléculas de 3-PGA. ● Oxigenasa: incorporación de O2 al C2 de la ribulosa bifosfato originando un intermediario de 5C que se rompe y forma una molécula de fosfoglicolato y otra de fosfoglicerato. ● Proporción de actividad carboxilasa y oxigenasa de rubisco: RuBP (enediol) Intermediario hidroperóxido - La unión de CO2 ó O2 es sobre RuBP que ya está unido al centro al centro activo de rubisco. - La proporción entre carboxilación y oxigenación depende sobre todo de la proporción [CO2/O2] y de la temperatura. - Para un cociente [CO2/O2] = 1: la actividad carboxilasa es 80 veces mayor que la oxigenasa. - Para un cociente [CO2/O2] = 0,0416: (solución acuosa en equilibrio con aire) actividad carboxilasa es 3 veces mayor que la oxigenasa. 3-ceto-2-carboxi-arabini tol-bifosfato (CAB) Fijación de dióxido de carbono - MECANISMO DE LA REACCIÓN CARBOXILATIVA La planta reintroduce en el ciclo de Calvin el carbono que salió de él en forma de fosfoglicolato debido a la actividad oxigenasa de la rubisco. La ruta del glicolato convirte 2 fosfoglicolatos (4C) en un fosfoglicerato y un CO2. Actividad carboxilasa: RuBP + CO2 Actividad oxigenasa: RuBP + O2 2 fosfoglicerato fosfoglicerato+ fosfoglicolato 2-fosfoglicolato Triosas fosfato O2 Ciclo de Calvin CO2 Ganancia de carbono Ribulosa 1,5 -bifosfato 3-fosfoglicerato Ruta del glicolato CO2 Pérdida de carbono Fijación de dióxido de carbono - Actividad oxigenasa de Rubisco La ruta del glicolato convierte 2 moléculas de fosfoglicolato en una de 3-fosfoglicerato y un CO2, reintroduciendo en el ciclo de Calvin parte del carbono liberado por la actividad oxigenasa de la rubisco. CH2O P -O C X 2 O Fosfoglicolato O2 HO CO2 ATP RuBP CH2O P H O H+ 2 C OOC=O HC OH CH2O P Intermediario hidroperóxido ruta del glicolato ADP COOHC OH CH2O P Ciclo de Calvin 3-Fosfoglicerato ● La ruta del glicolato reintroduce en el ciclo de Calvin el carbono que ha salido en forma de fosfoglicolato Fijación de dióxido de carbono - FOTORRESPIRACIÓN Fotorrespiración: ● Proceso metabólico asociado a la fijación de CO2 que consume O2 por actividad oxigenasa de la rubisco y forma CO2 en la ruta del glicolato ● La ruta del glicolato se desarrolla en tres orgánulos: cloroplastos, peroxisomas y mitocondrias. . Fijación de dióxido de carbono - FOTORRESPIRACIÓN De forma global: • Coste energético: * La fotorrespiración consume una parte del carbono fijado y reducido y supone un gasto de ATP y NADPH: - Una vuelta al Ciclo Calvin: fija 1 CO2 y consume 3ATP y 2NADPH - Un ciclo completo de fotorrespiración pierde 1 CO2 y consume 2 ATP y 2.5 NADPH * La relación entre carboxilación y oxigenación de rubisco depende sobre todo de la relación O2/CO2 * La temperatura afecta a la fotorrespiración: ↑ Tra→ ↑ O2/CO2 * Las plantas C4 y CAM no fotorrespiran debido a un mecanismo que acumula CO2 en el entorno de la rubisco. ● El significado fisiológico de la fotorrespiración es dudoso: ¿disipación de ATP/NADPH en condiciones de alta iluminación y baja [CO2] ? Fijación de dióxido de carbono - FOTORRESPIRACIÓN La fotorrespiración no tiene un significado fisiológico claro: una planta dispondría de más carbono reducido para crecer si no fotorrespirara. • La unión de CO2 ó O2 se produce cuando la RuBP ya se ha unido al centro activo de la rubisco. • Cualquier modificación del centro activo de rubisco que reduzca la oxigenación también reduce la carboxilación. • Hay otras formas de disminuir la fotorrespiración: - In vivo: acumulación de CO2 en el entorno de rubisco: * Algas: mediante bombas iónicas acumuladoras de HCO3−acopladas a actividad anhidrasa carbónica que convierte HCO3− en CO2. * Plantas C4 y CAM: descarboxilación temporalmente (entorno de rubisco) / carboxilación separadas espacial o - In vitro: manipulación de la composición gaseosa de la atmósfera que rodea la planta. * Es menos costoso el aumento de [CO2] en el aire (0.04% a 0.12%), que se hace en algunos invernaderos, que la reducción del [O2]. Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN La fase de reducción transcurre en dos pasos: 1. Activación de PGA: reacción con ATP para formar bifosfoglicerato (BPG). PGA-quinasa * PGA-quinasa se activa con ATP, Mg2+ y PGA * Las condiciones de activación de PGA-quinasa se dan en el estroma cuando los cloroplastos reciben luz. GAP-deshidrogenasa 2. Reducción de BPG a 3-fosfogliceraldehído (GAP): * Reacción catalizada por GAP-deshidrogenasa, única enzima del ciclo consume NADPH. * GAP-deshidrogenasa, se activa por ferredoxina-tiorredoxina (LUZ). que Fijación de dióxido de carbono 1. Activación de PGA: reacción con ATP para formar bifosfoglicerato (BPG). CO2 Luz RuBP Activación Rubisco ↑[ATP]-↑[Mg2+]-↑[PGA Activación PGA-quinasa - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono 2. Reducción de BPG a 3-fosfogliceraldehío (GAP): Luz ferredoxinatiorredoxina Activación GAP-deshidrogenasa - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono [Fe2S2]+ eS-S Tiorredoxinas: proteínas con una centro activo formado por -Trp-Cis-GliPro-Cis- que contiene un puente disulfuro capaz de oxidarse y/o reducirse: S-S 2SH CICLO DE CALVIN Estructura del centro activo de la ferredoxina Ferredoxinas: proteínas sulfo-férricas que median la transferencia de electrones en gran variedad de reacciones metabólicas. Las ferredoxinas de plantas (tipo cloroplástico) tienen un centro activo con un nucleo [Fe2-S2] unido a 4 S de 4 cisteinas. Uno de los átomos de hierro puede oxidarse o reducirse (transporta solo un electrón). - [Fe2S2]2+ Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Mecanismo de activación enzimática dependiente de la luz Activa enzimas con alta proporción de aminoácidos azufrados: GAP-deshidro-genasa, sedoheptulosa bifosfatasa, fructosa bifosfatasa y fosforibulosaquinasa. Desde 1999 la rubisco activasa es otra enzima activada por este sistema. Fotosistema I Ferredoxina oxidada Ferredoxina reducida Ferredoxintiorredoxin reductasa Los electrones de PSI reducen los puentes disulfuro de estos enzimas a través de ferredoxina y tiorredoxina. Al quedar libres los grupos tiólicos las enzimas se desagregan y exponen los centros activos. Tiorredoxina reducida Tiorredoxina oxidada Enzima oxidada Enzima reducida Inactiva Activa Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN El destino del carbono, fijado y reducido, al cloroplasto ó al citoplasma, se decide en dos niveles: 1. Transportador fosfato: localizado en la membrana interna de la cubierta del cloroplasto. Intercámbia triosas fosfato del estroma por fosfato libre del citoplasma: GAP ó DHAP estroma • • Pi GAP ó DHAP Pi citoplasma Evita el agotamiento de fosfato libre en el estroma. Se regula por [Pi] en el estroma: se activa cuando ↓ [Pi]estroma 2. Fructosas bifosfatasas estromática y citosólica: catalizan la eliminación de uno de los dos fosfatos de fructosa-bifosfato (FBP) en una reacción irreversible. Fijación de dióxido de carbono Ciclo de Calvin Reacción irreversible - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Resúmen de la fase de regeneración: Inicio • Objetivo: • Convertir compuestos de 3 carbonos en compuestos de 5 carbonos. • Reglas: • El tamaño de los intermediarios debe ser lo mas pequeño posible • Utilizar el menor número posible de pasos • No se puede pasar por compuestos de un solo carbono Final Fijación de dióxido de carbono - Aldolasa: 1 y 4 Transcetolasa (I): 2 y 3 Transcetolasa (II):5 y 6 Inicio Final 3 6 1 2 4 5 CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Final Inicio Isomerasa Aldolasa Aldolasa Isomerasa Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Las triosas-fosfato reducidas (GAP/DHAP) que permanecen en el cloroplasto forman ribulosa 1,5-BP. 1. Establecimiento de un equilibrio entre fosfogliceraldehído (GAP) y su isómero dihidroxiacetonafosfato (DHAP) catalizado por la enzima triosafosfato isomerasa. Triosa-fosfato isomerasa 2. Condensación de GAP y DHAP en fructosa bifosfato (FBP) por actividad de la enzima aldolasa. 3. Eliminación de un fosfato de FBP (reacción irreversible) por la enzima fructosa bifosfatasa (isoforma del estroma regulada por ferredo-xinatiorredoxina. GAP Dihidroxiacetona fosfato Fructosa-1,6bifosfatasa Dihidroxiacetona fosfato Fructosa 6fosfato Fructosa 1,6-bifosfato Fijación de dióxido de carbono Fructosa 1,6bifosfatasa Dihidroxiacetonafosfato-fosfato Fructosa 6fosfato Fructosa 1,6bifosfato - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Las aldolasas añaden el carbono α de un aldehído o cetona al carbono carbonilo de otra: carbono carbonilo carbono α Las dos aldolasas del ciclo de Calvin catalizan la adicción reversible de dihidroxiacetona-P (DHAP) a gliceraldehido-3-fosfato y eritrosa-4-P para fromar fructosa-1,6-bifosfato y sedoheptulosa-1,7-bifosfato respectivamente. Fijación de dióxido de carbono 4. Transferencia de fragmentos de 2C (glicoaldehido) desde fructosa-6-P a gliceraldehído-3-P para formar xilulosa-5-P y eritrosa-4-P por actividad de la enzima transcetolasa. 5. Establecimiento de un equilibrio entre los isómeros xilulosa-5-P y ribulosa-5-P por actividad de la enzima X5P-isomerasa. 6. Transferencia de un fosfato del ATP a ribulosa-5-P para formar ribulosa 1,5-bifosfato por actividad de la enzima fosforibulosa quinasa. - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono Transcetolasa (glicoaldeído transferasa): • Muy conservada durante la evolución de los organismos. • En la mayoría de los casos en que ha sido purificada se ha comprobado que su estructura está formada por un homodímero de 70 KDa. - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono 7. Condensación de gliceraldehído-3-P (GAP) y eritrosa-4-P (E4P) para formar sedoheptulosa-bifosfato (SBP). por actividad de la enzima aldolasa (paso 2). 8. 9. Eliminación de un fosfato de SBP (reacción irreversible) para formar sedoheptulosa-7-P por la enzima sedo-heptulosa bifosfatasa (reacción irreversible y regulada por ferredoxina-tiorredoxina). Transerencia de glicoaldehído (C2) desde sedoheptulosa-7-P (S7P) a gliceraldehído-3-P (GAP) para formar xilulosa-5-P y ribosa-5-P por la enzima transcetolása. Conversión de xilulosa-5-P en ribulosa 1,5- bifosfato (pasos 5 y 6) - CICLO DE CALVIN Fijación de dióxido de carbono 10. Isomerización de ribosa-5-P a ribulosa-5-P por actividad de la enzima fosfopentosa isomerasa. La ribulosa-5-P se convierte en ribulosa-1,5-bifosfato (paso 6). - CICLO DE CALVIN Fosfopentosa isomerasa Ribosa-5-P Ribulosa-5-P Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Consumo de ATP / NADPH: 6 ADP+Pi ● La fijación de 6 CO2 requiere: * 18 ATP (12 ATP para reducir 12 PGA y 6 ATP para fosforilar 6 R5P) 6 ATP 12 ATP 12 ADP+Pi 12 NADPH 12 NADP+ * 12 NADPH para reducir 12 BPGA ● Gasto energético por vuelta: 3 ATP y 2 NADPH (ATP/NADPH = 1,5) Manteniendo constante la concentración de RuBP, por cada 6 vueltas del ciclo entran 6 CO2 y se forma una hexosa, Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN En condiciones naturales el ciclo de Calvin está limitado por uno de los tres factores limitantes: • Dióxido de carbono: * El acceso del CO2 al mesófilo por los estomas está afectado por Ψsuelo • Temperatura: * • La actividad de los enzimas depende de la temperatura Luz. El ciclo de Calvin no funciona en oscuridad: * * Síntesis de ATP/NADPH Activación de enzimas por la luz Tipos de control: 1. Genético: intensidad de síntesis de enzimas. 2. Bioquímico: activación de enzimas e intensidad de las reacciones enzimáticas. Fijación de dióxido de carbono CICLO DE CALVIN La representación de la intensidad de fotosíntesis frente a uno de los factores limitantes da curvas del tipo: • El factor representado en el eje de abscisas limita la fotosíntesis siempre que un aumento de su intensidad cause una mayor fotosíntesis. • Si al aumentar el factor en abscisas la intensidad fotosintética se mantiene constante (flechas) no está limitada por este factor sino por otro diferente. Intensidad de fotosíntesis - densidad de flujo fotónico Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN El ciclo de Calvin se acelera o frena frente a variaciones de densidad de flujo fotónico (DFF) y composición espectral: • Las variaciones de la densidad de flujo fotónico pueden estar motivadas por: * Día/noche * Zona de la planta y otras plantas (sombras) * Nubosidad • Las variaciones de la composición espectral: * Día/noche * Zona de la planta * Zona de la planta y otras plantas (sombra) * Profundidad del agua (algas) Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Efecto de la luz sobre el ciclo de Calvin: suministro de ATP/NADPH y enzimas regulados. LUZ Canal fotosintético transportador de electrones (CFTE) Síntesis de NADPH Bombeo de H+ al lumen Síntesis de ATP 3-GAP deshidrogenasa Estroma: pH ≈ 8 ↑ Mg++ Ferredoxina / tioredoxina ↑ rubisco activasa ↑F-1,6-BPasa ↑ 3-PGA-quinasa ↑ Ru5P-quinasa ↑S-1,7-BPasa ↑ rubisco ↑ 3-GAP deshidrogenasa ↑ Ru5P-quinasa Fijación de dióxido de carbono - CICLO DE CALVIN Efecto de la luz sobre el ciclo de Calvin: control global del ciclo. Para una temperatura y [CO2]atm determinadas, un aumento de la DFF de luz PAR provoca: Activación de rubisco ↑ Velocidad de carboxilación ↓ RuBP RuBP constante Enzimas dependientes de ATP/NADPH ↑ [GAP] ↑[Pi]estr. ↓[Pi]estr. Enzimas activadas por ferredoxina/tiorredoxina ↑ Velocidad de regeneración Triosas-P en cloropl. Triosas-P al citosol ↑ RuBP 1. Al amanecer se activan enzimas del ciclo de Calvin y desciende (transitoriamente) [RuBP]. Vcarboxilación=Vregeneración Sacarosa 2. Después de un tiempo en oscuridad el nivel de Pi estromático es alto y las triosas-P permanecen en el estroma (síntesis de RuBP). 3. Ranscurrido un periodo de luz [Pi] estromático desciende debido a fotofosforilación y las triosas-P salen al citosol para formar sacarosa. Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE SACAROSA La síntesis de sacrosa tiene lugar en el citoplasma y comienza por la actividad del translocador fosfato situado en la membrana interna del cloroplasto: • Intercambia triosas-P reducidas y no empleadas en la regeneración de RuBP, por Pi del citosol, evitando que se agote el Pi. Ruta biosintética de sacarosa (resumen): GAP + DHAP Aldolasa Fructosabifosfatasa → FBP → Fosfogluco isomerasa F6P Fosfogluco mutasa → G6P → UDP-glucosa pirofosforilasa G1P + UTP → UDPG Sacarosa 6-P-sintasa GAP: 3-fosfogliceraldehído G6P: glucosa-6-fosfato DHAP: dihidroxiacetona UTP uridintrifosfato FBP: fructosa-1,6-bifosfato UDPG: uridindifosfoglucosa Sac-P Sacarosa-6-P-fosfatasa → Sac + P Fijación de dióxido de carbono 2 Fructosa 1,6-bifosfato - SÍNTESIS DE SACAROSA 3 Fructosa 6-fosfato Glucosa 6-fosfato 1. Aldolasa condensa GAP y DHAP y forma fructosa bifosfato (FBP). 2. Fructosa-bifosfatasa:(FBPasa) citoplasmática elimina un fosfato de FBP y forma Fru-6-P. Reacción irreversible. 3. Glucosa-6-P-isomerasa: forma Glu-6-P a partir de Fru-6-P. Fijación de dióxido de carbono 4 Glucosa 6-fosfato + UTP - SÍNTESIS DE SACAROSA 5 Glucosa 1-fosfato UDP-glucosa 4. Fosfoglucomutasa: convierte glucosa-6-P en glucosa-1-P. 5. UDP-glucosa pirofosforilasa: acepta glucosa1-P y UTP y libera UDP-glucosa y Pi. Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE SACAROSA Fructosa 6-P UDP-glucosa Sacarosa 6fosfato sintasa Pi 6. Sacarosa 6-P-sintasa (SPS) forma sacarosa-P a partir de UDPG y fructosa-6-P. Sacarosa 6-P Sacarosa 6-P fosfatasa Pi Sacarosa 7. Sacarosa-6-P-fosfatasa (SPP) elimina el grupo fosfato de sacarosa-P. Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE SACAROSA ● FBPasa citoplasmática acopla la actividad del ciclo de Calvin con el destino citoplasmático del carbono fijado mientras que SPS acopla el ciclo de Calvin con la síntesis de sacarosa. Fructosa 6-P UDP-glucosa Sacarosa 6fosfato sintasa (SPS) Pi ● FBPasa se regula por Fru-2,6-BP del citosol disminuye su concentración si aumenta la de Fru-1,6-BP,) m (ientras que SPS se inhiben por Pi: ↑ Triosas Fosfatocitosol Sacarosa 6-P Sacarosa 6-P fosfatasa (SPP) ↓ Picitosol ↓ Fru-2,6-BPcitosol Pi ↑ SPS y SPP Sacarosa ↑ Fru-1,6-BPcitosol ↑ FBPasa Síntesis de sacarosa Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE ALMIDÓN El almidón es una mezcla de dos polímeros: • Amilosa: α(1-4)-glucano lineal (1). • Amilopectina: eje central α(1-4)-glucano con ramificaciones α(1-6)-glucano en C6 (2). α(1-6) α(1-4) Amilosa Es la principal forma de almacenamiento de carbono reducido en plantas. Amilopectina Fijación de dióxido de carbono Día: síntesis a partir del exceso de carbono reducido que permanece en el cloroplasto y no se utiliza en regenerar RuBP. - SÍNTESIS DE ALMIDÓN Ciclo de Calvin glucosa Noche: hidrólisis para mantener niveles basales de intermediarios del ciclo de Calvin cuando decae la fotosíntesis. Noche Día Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE ALMIDÓN La síntesis de almidón comienza cuando F6P se convierte primero en G6P y luego en G1P mediante actividad fosfoglucoisomerasa (1) y fosfoglucomutasa (2) respectivamente. fosfoglucoisomerasa Frutosa-6-P fosfoglucomutasa Glucosa-6-P Glucosa-1-P G1P se activa al reaccionar con adenosintrifosfato (ATP): G1P + ATP ADP-glu pirofosforilasa ADP-glucosa Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE ALMIDÓN 3. Formación de ADP-glu a partir de ATP y glu-1-P mediante actividad ADP-glu pirofosforilasa (ADPG) que libera pirofosfato. Se inhiben al ↑ Pi. 4. Almidón sintasa (AS) cataliza la formación de enlace α-1,4 entre el extremo no reductor de un glucano preexistente y el resto glucosilo de ADP-glu liberando ADP. ADPG AS Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE ALMIDÓN 5. Finalmente la enzima ramificante (ER) forma las uniones α-1,6 de las ramificaciones en dos pasos: * Hidrólisis de un enlace α-1,4 de la cadena. * Formación de otro enlace α-1,6 entre el extremo reductor del glucano roto y otro resto de glucosa. ER Fijación de dióxido de carbono - SÍNTESIS DE ALMIDÓN ADP-glucosa pirofosforilasa regula la síntesis de almidón: se activa con triosas fosfato y se inhibe con fosfato, con lo que la formación de almidón ocurre con luz. Luz Activación rubisco y ferred-tiored Síntesis de ATP/NADPH ↑ Triosas-P (estroma) ↓ Piestroma ↑ ADP-glu pirofosforilasa ↑ Almidón Fijación de dióxido de carbono - METABOLISMO C4 Anatomía foliar en corona: dos tipos de células fotosintéticas: ● Células del mesófilo (no realizan el ciclo de Calvin): 1. Asimilan CO2 en forma de ion bicarbonato sobre fosfoenolpiruvato y forman oxalacetato. 2. Reducen OAA a malato y lo envían a las células de la vaina del haz. ● Células de la vaina del haz (también tienen cloroplastos): Vaina del haz Floema Mesófilo Corte transversal de hoja de planta C4 1. Descarboxilan el compuesto formado en las células del mesófilo y lo incorporan al ciclo de Calvin. 2. La descarboxilación del malato es oxidativa y acoplada a la formación de NADPH. Fijación de dióxido de carbono Metabolismo C4: resumen Célula del mesófilo Célula de la vaina del haz - METABOLISMO C4 Fijación de dióxido de carbono CO2aire Célula del mesófilo ↑ Demanda de NADPH Célula del mesófilo ↑ Flujo acíclico de e↑ Proporción de grana ↑ Formación de O2 ● Cloroplastos v. del haz: Oxidan el malato Forman NADPH ↓ Demanda de NADPH NADPH METABOLISMO C4 El metabolismo C4 disminuye la tasa de fotorrespiración al acumular CO2 y disminuir O2 en el entorno de la rubisco: ● Cloroplastos Mesófilo: Reducen el OAA NADPH - ↓Grana Pared celular ↑ O2 ↓ O2 Célula de la vaina del haz ↓ Formación O2 Célula de la vaina del haz Las plantas C4 también economizan agua al abrir menos los estomas para tomar la misma cantidad de CO2. Fijación de dióxido de carbono Noche Incorporación y fijación de CO2, acidificación foliar Día Los estomas CO2 abiertos permiten atmosférico la entrada de CO2 y la salida de H2O Descarboxilación del malato almmacenado y refijación del CO2 interno: alcalinización - METABOLISMO CAM Los estomas cerrados impiden la pérdida de H2O y la entrada de CO2 Las plantas CAM solo tienen un tipo de célula fotosintética. La separación entre la carboxilación de PEP (noche) y la descarboxilación de malato (día) es temporal. Fijación de dióxido de carbono Noche Incorporación y fijación de CO2, acidificación foliar CO2 atmosférico Los estomas abiertos permiten la entrada de CO2 y la salida de H2O ● Degradación de almidón fosfoenolpiruvato (PEP) - METABOLISMO CAM y formación de ● Estomas abiertos. ● Caraboxilación de PEP por PEP-carboxilasa formación de oxalacetato (OAA). ● Reducción de OAA a malato con c onsumo NADPH. ● Entrada a la vacuola del malato. y Fijación de dióxido de carbono Día Descarboxilación del malato almmacenado y refijación del CO2 interno: alcalinización - METABOLISMO CAM Los estomas cerrados impiden la pérdida de H2O y la entrada de CO2 ● Salida del malato de la vacuola y descarboxilación en el citoplasma. Hay varias formas por las que se puede descarboxilar el malato, dando lugar a varios subtipos de metabolismo CAM. ● La descarboxilación es oxidativa y está acoplada a la formación de NADPH (o NADH). ● El CO2 de la descarboxilación entra en el ciclo de Calvin y el piruvato se utiliza en la síntesis de almidón. ● Estomas cerrados. Fijación de dióxido de carbono Mas activa PEPcarboxilasa quinasa Luz Oscuridad Menos activa (Luz) Ser Fosfatasa METABOLISMO CAM Regulación de PEP carboxilasa: PEPcarboxilasa quinasa Menos activa PEP carboxilasa - PEP carboxilasa Mas activa (Oscuridad) • Enzima clave en el metabolismo CAM. Se activa con luz. • Se regula por PEP carboxilasa quinasa y fosfatasa.: PEP - Luz: PEP carboxilasa quinasa es más activa y fosforila un resto serina de PEP carboxilasa lo cual resulta en una enzima más activa. - Oscuridad: PEP carboxilasa quinasa es menos activa. Además una fosfatasa elimina el fosfato de PEP carboxilasa. Ser Fijación de dióxido de carbono Noche - METABOLISMO CAM Ventajas: • Disminución de la tasa de fotorrespiración al acumular CO2 en el entorno de rubisco. • Economía de agua: - El ciclo de Calvin transurra con los estomas cerrados - El CO2 entra durante la noche (tra. baja). Día
