Trabajo de Diploma de Pierre Dramou DEPARTAMENTO DE FARMACIA TESIS PARA OPTAR POR EL TITULO DE LICENCIADO EN CIENCIAS FARMACEUTICAS Establecimiento de la monografía analítica para el control de la calidad del sólido pulverulento obtenido a partir de las semillas de Cucúrbita moschata Duch. AUTOR: Pierre Dramou TUTORES: MSc. Elisa Jorge Rodríguez MSc. Yanelis Saucedo Hernández “Año de la Revolución energética en Cuba” Curso 2005-2006 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Exergo “No hay más nobleza que la que el hombre con sus hechos logra” José Marti Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Dedicatoria El sabio no dice nunca todo lo que piensa, pero siempre piensa todo lo que dice... Dedico este trabajo A Dios por alumbrar mi camino y cuidarme por todos estos tiempos. A mis padres, por su eterno amor, entrega y dedicación. A todos los que de una forma u otra han contribuido algo particularmente en en mi mi modesta estancia en vida, esta Isla y en la realización de este sueño. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Agradecimientos Con este trabajo culmino una etapa importante de mi vida, el momento insta a la reflexión y en mi memoria, se dibujan las imágenes de todos aquellos que contribuyeron de una manera u otra en mi educación y me ayudaron a alcanzar una meta tan deseada como esta. No quisiera mencionar sus nombres, pues la lista seria interminable y cometería la grave injusticia de olvidar alguno y eso seria imperdonable. De esta forma les expreso toda mi gratitud a ustedes, al que me cuido en la niñez, al que me enseñó poniendo en mi su esperanza, a aquel que en algún momento amargó me hizo sonreír, al que me escucho y supo dar sabios consejos, al que me brindo una frase de apoyo que me dio aliento para poder seguir adelante, a todos aquellos que ayudaron a mi formación como un verdadero profesional y sacrificaron deliciosas horas de sueños, a todo aquel que sin su cooperación este trabajo hubiese sido imposible, a todos aquellos que me enseñaron como ser un dirigente, saber compartir, ayudar sin esperar nada de vuelto, a todos mis compañeros de aula, y todos los estudiantes de otras Nacionalidades, por fin a esta institución y a esta Revolución al frente Trabajo de Diploma de Pierre Dramou nuestro Comandante en Jefe Fidel Castro Ruz gracias por su aporte en mi vida. En verdad, nunca sabré como corresponder a tantas atenciones recibidas. El ser humano no es perfecto, por tanto es un momento oportuno para mi de pedir les también excusas por mis errores. En fin gracias a todos y por todo, por darme un espacio de su tiempo, un pedacito de sus vidas, su amor, por trasmitirme sus experiencias y conocimientos, porque cualquier orientación y ayuda, sea pequeña, será recordado ya que mis pensamientos para ustedes nunca van a faltar. ¡Muchas Gracias! Trabajo de Diploma de Pierre Dramou RESUMEN Las semillas de Cucurbita moschata Duch han sido empleadas, en diversos países, en el tratamiento de la helmintiasis, en Cuba la guía de fitofármacos y Apifármacos propone comercializar papelillos que contienen el polvo. Esta formulación carece de fundamentación científica y no posee una monografía analítica para su control de calidad. El presente trabajo refiere la evaluación de los diferentes ensayos que podrían conformar dicha monografía, teniendo en cuenta las metodologías propuestas en los farmacopeas vigentes, para ingredientes activos de origen vegetal, y usando como referencia el polvo obtenido en el departamento de Farmacia de la UCLV que posee características similares al autorizado a comercializar. Como ensayo de identificación fueron evaluados: el análisis macroscópico y microscópico, dos reacciones colorimétricas dirigidas a identificar los componentes mayoritarios en el polvo, aminoácidos y proteínas y la Cromatografía en capa delgada que permite identificar los aminoácidos de interés en el polvo. Como pruebas o ensayos específicos fueron evaluadas la pérdida por desecación, las cenizas totales y las cenizas insolubles en Ácido Clorhídrico, se determinaron en cada caso el límite superior de especificación y los resultados resultaron adecuados para un producto vegetal. Como ensayo cuantitativo se propone la Espectrofotometría UV-VIS, con previa derivatización usando la reacción de Ninhidrina y realizando la lectura de la absorbancia a 320nm. La técnica fue validada, incluyendo para el control de la calidad el cumplimiento de las parámetros de Linealidad, Precisión, Especificidad y Sensibilidad, resultando ser lineal en el rango de concentraciones de 2-10 ppm; precisa, con coeficientes de variación en el rango establecido para la repetibilidad y la precisión intermedia; específica para determinar el total de aminoácidos, en base Asparagina y sensible para el rango de concentraciones seleccionado. Los resultados obtenidos permitieron conformar la monografía analítica para el control de calidad del polvo, ingrediente activo, obtenido a partir de las semillas de Cucurbita moschata Duch Trabajo de Diploma de Pierre Dramou INDICE. INTRODUCCION 1 Capitulo I. REVISION BIBLIOGRAFICA 4 1.1. Estudios analíticos en plantas medicinales. 4 1.1.1. Consideraciones generales acerca de los constituyentes de las plantas medicinales. 4 1.1.2. Aspectos analíticos en plantas medicinales 5 1.1.2. Las Semillas de Cucurbita spp. Su uso en el campo farmacéutico. 15 1.2.1. Características botánicas y usos de la planta. 15 1.2.2. Estudios fotoquímicos de las semillas de Cucurbita. 17 1.2.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas de la de Cucurbita spp. 20 1.2.4. Estudios analíticos aplicados a la Cucurbitina. 23 Capitulo II. MATERIALES Y METODOS. 27 2.1.- Material Vegetal, equipos y reactivos. 27 2.1.1. Material vegetal. 27 2.1.2. Materiales utensilios y equipos de medición. 27 2.1.3. Reactivos. 28 2.2. Estudios analíticos para establecer la monografía de control de calidad del sólido pulverulento. 28 2.2.1. Ensayos cualitativos de identificación. 29 2.2.2. Ensayos específicos. Determinación de los límites de especificación. 29 2.2.3. Definición de las condiciones experimentales para las técnicas analíticas utilizadas en la monografía propuesta. 32 2.2.4. Validación de la técnica espectrofotométrica para su uso como ensayo cuantitativo en la monografía analítica. 35 Capitulo III. RESULTADOS Y DISCUSION. 40 3.1. Estudios analíticos para establecer la monografía de control de calidad del sólido pulverulento obtenidos a partir de las semillas de Cucurbita moschata Duch. 40 3.1.1. Ensayos cualitativos de identificación. 40 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 3.1.2. Determinación de los límites de especificación de las pruebas específicas. 42 3.1.3. Establecimiento de condiciones de la CCD y la Espectrofotometría UV-VIS. 46 3.1.4. Validación de la técnica espectrofotométrica para su uso como ensayo cuantitativo en la monografía analítica. 57 3.2. Descripción de la monografía de control de calidad para el polvo de Cucurbita spp. 63 3.3. Comparación del sólido pulverulento, obtenido en el presente trabajo, y el polvo registrado en la guía de Fitofármacos y Apifármacos del Ministerio de salud pública de Cuba (MINSAP). 67 CONCLUSIONES 70 RECOMENDACIONES 71 ANEXOS 72 BIBLIOGRAFIA 88 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou INTRODUCCION La flora constituye una de las fuentes naturales de productos que resultan ser de importancia capital en la terapia humana. En función de sus variedades existen varias sustancias constituyentes que pueden tener efectos deseables o indeseables dentro del organismo humano. Con este fin desde la antigüedad, se ha ido utilizando productos de origen vegetal con fines terapéutico. (García 2002) El avance científico-técnico alcanzado en nuestros días ha permitido el desarrollo y obtención de fármacos cada vez superiores, que contribuyen a alargar la esperanza de vida de la humanidad. Esto no ha restado importancia a la medicina tradicional, por el contrario, ha cobrado auge hoy día. En las actuales condiciones económicas en que vive el mundo, se deben enfrentar fuertes limitaciones en la importación de medicamentos y materias primas para su producción. Para que no falte una respuesta rápida a las enfermedades, el desarrollo de productos a partir de plantas medicinales constituye una vía alternativa en este contexto. (Abreu. 2001). Por otra parte, la clínica y la experimentación farmacológica han demostrado que la acción de una planta no se puede explicar por la de uno de sus principios activos; es entonces cuando hablamos de fitocomplejos en los cuales están los principios activos, otras moléculas aparentemente inactivas, las sustancias coadyuvantes, etc. El principio activo purificado es una molécula muerta que no puede disfrutar de la sinergia farmacocinética que tiene la droga entera y, a su vez, se puede deducir que ésta tiene una acción más suave y más activa que el principio activo de mayor efecto por interacción con las moléculas consideradas “inertes”, que en realidad ejercen una labor terapéutica de indudable valor, pero de alcance aún desconocido en su sentido más amplio. (Fitoterapia, Vademécum de prescripción, 2003). En muchos casos es asumido que el extracto de planta, como un todo, es la parte activa, ya que es frecuentemente difícil identificar los Trabajo de Diploma de Pierre Dramou componentes individuales responsables de la actividad farmacológica y aún más difícil señalar la sinergia entre varios componentes, (Werterhoff K., 2002). En Cuba el uso de las plantas medicinales como recursos terapéuticos adquiere en estos momentos una relevancia fundamental por su probada efectividad e inocuidad, ya que constituyen la base para la elaboración de sistemas de medicinas alternativa, como fuentes de materias primas para la industria farmacéutica, en la sustitución de materia prima de importación para la elaboración de medicamentos y como arma terapéutica en los sistemas fitoterapeuticos tradicionales. (Álvarez T.1987) Estos productos deben ser registrados y tener normas de calidades reportados para el mejor éxito en la terapia, por eso que existen fuentes de bases de datos para facilitar y guiar los procedimientos de análisis entre los que se puede citar los diferentes tipos de Farmacopeas que contienen generalmente la monografía de varios de los productos ya conocidos y de uso frecuente. La no existencia de monografías en los productos autorizados a su utilización en la terapéutica obliga a realizar diferentes estudios analíticos hasta elaborar una monografía completa y exacta que permita su control de calidad. Las semillas de Cucurbita moschata Duch forma parte de los productos autorizados por el Ministerio de Salud Pública de Cuba para su uso en la terapéutica, por su probada acción antihelmíntica (Fang .1961), por lo que aparece registrado en la Guía de Fitofármacos y Apifármacos, 1992. Sin embargo no se dispone de ensayos que permitan su Control de Calidad. Por esta razón en el Departamento de Farmacia de la Universidad Central de las Villas se trabaja, en la obtención y estandarización de un sólido pulverulento obtenido de esta planta medicinal, lo que incluye la elaboración de la monografía, analítica, como un requerimiento necesario e imprescindible para realizar su control de calidad. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Atendiendo a lo anteriormente expuesto, el presente trabajo se propone los siguientes objetivos: Objetivo general: Proponer los ensayos que conformarían la Monografía analítica de Control de la calidad del sólido pulverulento. Objetivos específicos: Determinar los límites de especificaciones de las pruebas específicas incluidas en la Monografía. Identificar los aminoácidos presentas en el polvo, usando la Cromatografía en Capa Delgada. Seleccionar las condiciones óptimas para el uso de la reacción con Ninhidrina en el ensayo cuantitativo de la Monografía. Validar la técnica espectrofotométrica para su uso como ensayo cuantitativo de la Monografía. Comparar el sólido pulverulento y el polvo registrado a través de los ensayos específicos incluidos en la Monografía propuesta. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Capítulo I. REVISION BIBLIOGRAFICA I.1. Estudios analíticos en plantas medicinales. 1.1.1. Consideraciones generales acerca de los constituyentes de las plantas medicinales Las plantas han sido desde el comienzo de la humanidad una fuente inagotable de recursos en la búsqueda de remedios para curar o aliviar enfermedades y han servido a los farmacéuticos como base para elaborar medicamentos. El devenir de los tiempos, con el consecuente desarrollo de la química, desvió la obtención de medicamentos hacia la síntesis artificial aunque siempre con la vista puesta en la naturaleza, ya fuese para la obtención de materias primas o para copiar las estructuras que las plantas por sí solas habían alcanzado mediante el proceso de selección natural. Siendo así como los constituyentes más importantes en las plantas medicinales se citan los siguientes: (Evans, 2000). ¾ Agua, carbono, Oxígeno, Hidrógeno y el Nitrógeno ¾ Materias minerales: -Metaloides: Cloro, Fósforo, Azufre y trazas de Boro, Fluoro, Iodo, Bromo, Arsénico. -Metales : Calcio , Potasio , Sodio , Magnesio , y trazas de Aluminio , Hierro , Zinc , Cobre , Titanio , Molibdeno , Rubidio , Cesio , Cromo , Litio , Vanadio , Níquel y Cobalto . La utilización de estos elementos por la planta, no es paralela a la cantidad que el mismo posea. Hay elementos que aún estando solo presentes en la forma de trazas, intervienen en gran manera en el desarrollo de la planta. Los elementos indispensables , exceptuando el C , H , O y N , son : P , S, K , Ca , Mg , Na . A excepción de las Algas, y de algunas plantas halofitas, la tenencia en Sodio, es escasa. Estos elementos están en la planta bajo formas de sales disueltas, sales cristalizadas, o combinaciones orgánicas. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ¾ Constituyentes orgánicos: Son los compuestos de Carbono, siempre asociados al Hidrógeno. Los vegetales clorofilados, pueden realizar innumerables síntesis a partir de Anhídrido Carbónico CO2 y del agua, con la luz como fuente de energía (Fotosíntesis). Entre ellos citaremos: Sustancias binarias: Carburos Sustancias ternarias: Alcoholes, Fenoles, Aldehídos, Cetonas, Quinonas, Ácidos, Esteres, Lactosas, Lignanos, Terpenoides, Carotenoides, Esteroides, Compuestos heterocíclicos oxigenados, Glúcidos, Lípidos y aminoácidos. Sustancias cuaternarias: Prótidos, Compuestos Nitrogenados, Alcaloides. Sustancias diversas: Vitaminas, Enzimas, Sustancias con acción hormonal, Antibióticos. Sustancias complejas: Tanoides, Aceites esenciales. Resinas y productos semejantes. De los constituyentes citados son de mayor interés para el presente trabajo los aminoácidos. En vegetales, hay una veintena de estos compuestos, detectados en estados libres o provenientes de la hidrólisis de las proteínas. Alifáticos: Alanina, valina, leucina, isoleucina, serina , treonina, cisterina Sustancias cuaternaria: metionina, acido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, ornitina. Aromáticos: Felilalanina, tirosina. Heterocíclicos: Prolina e isoprolina, triptofano e histidina. I.1.2. Aspectos analíticos en plantas medicinales Es conocido que los métodos analíticos, constituyen herramientas imprescindibles para el desarrollo del control de la calidad, estudios de estabilidad y biofarmacéuticos de los ingredientes activos, y de las diferentes formas Trabajo de Diploma de Pierre Dramou farmacéuticas diseñadas a partir de ellos. En el caso particular de los estudios analíticos aplicados a los productos farmacéuticos de origen vegetal, se requiere de técnicas muy específicas y sensibles para su implementación, debido a la alta complejidad de las muestras; que presentan gran variedad en sus composiciones y las bajas concentraciones de los metabolitos presentes. Si observamos las monografías analíticas, de plantas medicinales y preparados fitofarmacéuticos, descritas en las farmacopeas actualizadas, tales como, la United States Pharmacopoeia (USP), British Pharmacopoeia (BP) and European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). Ver ejemplos de monografías (Anexo A y B), donde se puede constatar que aunque la estructura metodológica de la monografía es similar a la de los productos sintéticos, los procedimientos analíticos se conciben de manera diferente. En la tabla 1.1, se ejemplifican algunas de las particularidades de estos procedimientos, donde las técnicas analíticas de cuantificación están referidas a la determinación del porcentaje total de un tipo de metabolito, expresado en base a uno de los metabolitos conocido presente en la planta. Lo anterior está en total correspondencia con la Norma de Control de Calidad establecida por la European Medicines Agency (EMEA) que plantea que en el caso de los ingredientes activos de plantas medicinales y sus preparaciones, la cuantificación será dada como un rango correspondiente a una cantidad definida de constituyentes con actividad terapéutica conocida, EMEA, 2005. Estas monografías analíticas presentan sus especificaciones para los ingredientes activos y para las formas farmacéuticas, por ejemplo la naturaleza y composición de los ingredientes activos (droga vegetal; aceite volátil; bálsamo, resina y goma; almidón y tintura o extracto) exigen ensayos propios que caracterizan cada monografía. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 1.1. Principales particularidades del análisis cuantitativo de algunos preparados fitoterapéuticos, según sus monografías analíticas, Farmacopea Británica, 2004. PLANTA O PREPARADO Barbado y Cape Aloes (hojas) y extracto seco Belladona (hojas y polvo) Birch (hojas), Caléndula (Flores) Cáscara (corteza, extracto seco) Digitalis (hojas) Elder (flores) Focus Ajo (polvo) Hypericum (extracto seco) GRUPO DE METABOLITO Derivados hidroxiantracénicos expresado como Barbaloína Alcaloides expresado como Hyosciamina Flavonoides como Hyperósido Glicósidos Antracénicos como Cascarosido Glicósidos cardenólidos como Digoxina Flavonoides como Isoquercitosido Lodo Alicina en base al extracto seco Hipericinas como hipericina TÉCNICA ANALÍTICA Espectrofotometría (512 nm) UV-VIS Volumetría (Neutralización) Espectrofotometría (425 nm) Espectrofotometría (515 nm) UV-VIS UV-VIS Espectrofotometría UV-VIS (540 nm) Espectrofotometría UV-VIS (425 nm) Volumetría Redox Cromatografía Líquida de Alta Resolución Espectrofotometría UV-VIS ( nm) Vlietinck, 1999, describe los aspectos más generales que son incluidos en cada uno de los ensayos de las monografías de los ingredientes activos: 9 Nomenclatura: Usualmente se refiere el nombre botánico de la planta, el género, y la especie, seguido de datos particulares en cada tipo de ingrediente. 9 Definición: Se describe la parte usada de la planta y la forma en que se presenta, así como, el contenido de ingredientes activos expresado como límites de aceptabilidad. En los aceites volátiles; bálsamos; almidones y tinturas se le agregan los métodos de obtención. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 9 Características: Se describen las diferentes características y criterios que pudieran ser aplicados con propósitos de identificación; características organolépticas, características botánicas microscópicas y macroscópicas, así como, algún criterio existente en cuanto a solubilidad, miscibilidad y estado físico. 9 Identificación: En el caso particular de las drogas vegetales y los bálsamos, resinas y gomas, incluye las características botánicas macroscópicas y microscópicas, seguidas de análisis por cromatografía en capa delgada y de reacciones químicas de identificación, mientras que los aceites volátiles y las tinturas y extractos sólo incluyen estas últimas y los almidones poseen varios ensayos específicos. 9 Ensayos Específicos: De forma general en la mayoría de los ingredientes se describen métodos cromatográficos cualitativos y cuantitativos, seguidos de ensayos específicos generales como son la pérdida por desecación, las cenizas totales, las cenizas insolubles en Ácido Clorhídrico, contaminación microbiológica, residuos minerales y pesticidas, en las drogas vegetales; la rotación óptica, densidad relativa, índice de refracción, etc., en los aceites volátiles; el índice de hinchazón, viscosidad, densidad relativa y tiempo de flujo en los bálsamos y gomas, por sólo citar algunos ejemplos. 9 Ensayo cuantitativo: Constituye una parte esencial de toda monografía y cada método propuesto debe ser validado previamente. Como se observa en la tabla 1.1, los métodos analíticos que más se refieren en las farmacopeas, con este objetivo, suelen ser la volumetría, la espectrofotometría y las técnicas cromatográficas. 9 Almacenamiento: No tiene requerimientos oficiales y sólo es necesario garantizar, durante el almacenamiento, la calidad de la droga incluida en la farmacopea. Los principales aspectos que se tienen en cuenta son: la protección de la luz y la garantía de un buen sellado de los recipientes. Los estudios analíticos en plantas medicinales aparecen muy bien representados en la literatura especializada, fundamentalmente, dirigidos a la evaluación y validación de técnicas que pueden ser utilizadas para el control de la calidad, Trabajo de Diploma de Pierre Dramou estudios tecnológicos y biofarmacéuticos. Las técnicas analíticas cromatográficas son las más referidas debido a su principal ventaja, permiten separar las sustancias o aislarlas de un medio más o menos complejo y han sido utilizadas tanto en el análisis cualitativo como cuantitativo, Skoog, 2000. La gran variedad estructural de los metabolitos presentes en las plantas medicinales explica el amplio espectro que describe la literatura de condiciones cromatográficas estudiadas en este campo. A la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography) le corresponde el mayor porciento de publicaciones, siendo las condiciones propias de la cromatografía en fase reversa las más representada. El lugar cimero lo alcanzan los investigadores chinos, los cuales refieren, fundamentalmente, la validación de esta técnica para la determinación de diferentes metabolitos presentes en preparados fitofarmacéuticos, Como ejemplos Shi, JL., 2005. Y Liu, C., 2004, realizaron un estudio encaminado a mejorar la resolución de los cromatogramas HPLC con detección ultravioleta, obtenida en la determinación cuantitativa de constituyentes hidrofílicos de la Valeriana y Psoralen en la raíz de Picus hidra, respectivamente. Por su parte, Liang, C., 2004, estableció la técnica para determinar el Alfacyperone en los rizomas del aceite de Cyperi con resultados muy satisfactorios en su validación, mientras que He, J., 2004, y Hu, B.Q, 2002, la validaron para determinar Quercetina en Pinellia pedatisecta y derivados de Stilbeno en Shengfa, respectivamente. Como muestra del uso universal de la técnica se presentan los trabajos realizados por Abourashed E.A., 2000 en los cuales se valida la HPLC para determinar la lactona sesquiterpénica Partenolide, presente en el Tanacetum parthenium y los de Wurglics M., 2001 que la utilizan para determinar los contenidos de Hiperforin e Hypericina presentes en los productos de St. John`s Word. Otras técnicas con uso significativo en este campo es la cromatografía en capa delgada (CCD) y su similar optimizado la Cromatografía en Capa Delgada de Alta resolución (HPTLC, del inglés High Performance thin Layer Chromatography). La CCD es utilizada para la determinación cualitativa de los metabolitos activos Trabajo de Diploma de Pierre Dramou presentes en plantas y fitomedicamentos, constituyendo un método oficial presente en la mayoría de las monografías de productos naturales y, además, referida en múltiples trabajos. Lan, Y.Y., 2003 estableció y validó esta técnica, combinada con HPLC, para realizar el control de calidad de las cápsulas Qianliebeixir, donde se determinó por esta vía la presencia y el contenido de Quercetina y Kaempferol. Por otra parte, Agrawal, H., 2004 desarrolló y validó el método HPTLC para determinar estéreoisomeros de Gugulsterona, agente hipolipemiante presente en la Commiphora mukul, con resultados satisfactorios, mientras que Srisvastava, A. 2004 usó la misma técnica para determinar Andrografolido y Neoandrofolido, metabolitos presentes en extractos acuosos, clorofórmicos y de hexano de la planta Andrographis paniculada. Por su parte, las técnicas espectrofotométricas y volumétricas en el análisis cuantitativo de metabolitos en plantas medicinales y fitofármacos, tiene su uso restringido al control de la calidad de estos, que aparece reflejado en las farmacopeas. Dentro de los grupos de metabolitos que posibilitan el uso de estas técnicas están los alcaloides y los aminoácidos. Teniendo en cuenta que las semillas de Cucurbita moschata Duch constituyen el objeto de estudio del presente trabajo y que en ese material vegetal los aminoácidos son los responsables de la acción antihelmíntica, a continuación se expone un resumen de los aspectos más importantes referidos en la literatura sobre la determinación de estos metabolitos presentes en plantas medicinales, y que fueron considerados para el desarrollo de las técnicas analíticas validadas en esta investigación. La técnica de cromatografía en capa delgada resulta de las más antiguas en el análisis de aminoácidos, sin embargo, no por ello ha perdido su vigencia, al contrario su sencillez, rapidez, y selectividad, así como, las grandes ventajas que posee, tales como, la posibilidad de analizar múltiples muestras simultáneamente, el corto tiempo requerido y la baja detección avalan su uso en la determinación cualitativa de estos compuestos en plantas medicinales, por ejemplo, en el trabajo realizado por (Shiao,1962) se utilizó esta técnica en la separación e identificación Trabajo de Diploma de Pierre Dramou de aminoácidos de extractos de las plantas Bilboa, Gingko y Helix, usando la reacción de Ninhidrina como revelador. Por su parte, la Cromatografía Líquida de Alta Resolución constituye el método más utilizado hasta el momento en la determinación de aminoácidos en plantas medicinales. Sin embargo, la débil absorción de estos compuestos obliga a realizar previos procesos de derivatización, lo que dificulta el análisis y encarece el método. Según referencias bibliografías recientes, los agentes derivantizantes más utilizados han sido: el fenilisotiosanato (PICT), presente en múltiples trabajos, destacándose los realizados por González, 1997, Sendel, 1992 y Calulll, 1990, quienes aplicaron esta técnica para la determinación de aminoácidos en granos, en tomates y en vinos rojos, y el O-phtaldehido (OPA) para la determinación de aminoácidos en manzanas, con resultados muy satisfactorios, Blanco Gómez, 1990. Es importante destacar que de forma general estos métodos consumen tiempo (20-40 min. por muestra) y requieren equipamiento especializado. La técnica espectrofotométrica indirecta, usando la reacción de Ninhidrina, fue propuesta por Moore and Stein, 1954, para el análisis cuantitativo de aminoácidos, y mantiene su vigencia, aunque con pequeñas modificaciones, Fukuda, 1996; Macchi, 2000; Rahman, 2003; Taha, 2003, por sólo citar unos ejemplos. Por su parte, Jones, 2002, comparó esta técnica con la determinación fluorimétrica de aminoácidos libres en muestras de tierra, usando O-phtaldehido y β-mercaptoethanol como reactivo fluorescente, obteniendo resultados satisfactorios en ambas, aunque se demuestra la mayor sensibilidad de esta última. La reacción de Ninhidrina, con grupos amino primario, ha sido ampliamente usada en la determinación manual, automatizada y como reactivo spray en el análisis en la caracterización de aminoácidos en múltiples campos, siendo considerada, por algunos investigadores, como la reacción orgánica más estudiada desde que fue descubierta por Siegfried Ruhemann en 1910. Desde entonces cientos de trabajos aparecen publicados abordando la química y el mecanismo de la reacción, la estequiometría y estabilidad de la coloración, la absorción del compuesto formado y la variación de la coloración para diferentes aminoácidos. Mendel Friedman, Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 2004, publica bajo el titulo de “Aplicaciones de la reacción de Ninhidrina para el análisis de aminoácidos, proteínas y péptidos, para la agricultura, y las Ciencias Biomédicas¨ un amplio trabajo que resume los principales aspectos de esta reacción. Según su valoración el mecanismo de la reacción de Ninhidrina produce, con la mayoría de los aminoácidos, un cromóforo coloreado llamado Ruhemann´s purple (RP) con una longitud de onda máxima de 570nm, cuyo mecanismo incluye la oxidación del grupo amino, liberándose amonio, el cual se condensa con la Ninhidrina reducida y con otra molécula de Ninhidrina para producir un aducto púrpura (Figura 1) Figura 1:. Mecanismo de reacción de la reacción de Ninhidrina con α-aminoácidos para formar el complejo Ruhemann´s purple (RP). Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Sin embargo, Friedman confirma que hay muchos compuestos que producen color con la Ninhidrina sin producir RP, tal es el caso de los pirrolidínicos o aminoácidos (Prolina, que aminoácidos Hidroxiprolina y Ácido pipecolíco), los aminoácidos polifuncionales (Arginina, Asparagina, y la Cisteina) y otros aminoácidos específicos como la Lisina y el Triptófano; de forma general todos ofrecen tonalidades que van del amarillo al pardo. Estas reacciones son llamadas reacciones no clásicas de la Ninhidrina y en su totalidad han sido estudiadas precisando las estructuras de los derivados formados, a continuación se citan los que poseen mayor interés para el presente trabajo, Arginina (Takahashi, 1976), Asparagina (Sheng, 1993, Hurst, 1995), Cisteina (Prota, 1973), Lisina (Hsieh, 1995), Ácido Pipecolico (Moullin, 2002), Prolina (Magne, 1992), Triptofano (Kabir, 1999; Shonberg, 1978), Anión radical de Ninhidrina (Schertz, 2001, Yuferov, 1970). La figura 2 muestra las estructuras específicas para los aminoácidos citados. En esta búsqueda bibliográfica se evidencia que la reacción de Ninhidrina ha sido ampliamente estudiada para la determinación de aminoácidos en diversas matrices, desde que fue propuesta por Moore and Stein, 1954, esto se debe, fundamentalmente, a la elevada sensibilidad, el bajo costo, la simplicidad y la rapidez de los análisis. Múltiples ejemplos confirman lo anterior; las farmacopeas vigentes citan dicha reacción como el revelador adecuado para la detección cualitativa de aminoácidos por CCD y como reacción colorimétrica en los ensayos de identificación de dichos compuestos formando parte de materias primas farmacéuticas y medicamentos. También se refiere un amplio uso en la determinación de aminoácidos en plantas con diferentes fines, tales como agente derivatizante en la HPLC, Jones, 2002; Moulin, 2002., Macchi, 2000, revelador en la CCD, Laskar, 2001, etc. como Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Figura 2: Estructura de los derivados de Ninhidrina obtenidos al reaccionar con aminoácidos que no forman el complejo RP. Teniendo en cuenta que, la planta objeto del presente trabajo es la Cucurbita Moschata Duch, específicamente sus semillas, a continuación se expondrán los estudios más importantes realizados en diferentes líneas de trabajo referidos con la misma. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 1.2. Las Semillas de Cucurbita spp. Su uso en el campo farmacéutico. Las semillas de Cucurbita spp son clasificadas como dicotiledóneas, se componen de una almendra aceitosa, rodeada de una testa protectora. El tamaño es aproximadamente de un centímetro, tienen forma de óvalo y color beige, una cubierta seminal de color amarillo pálido, reticulada, con presencia de pelos. La almendra posee un embrión, recubierto por endospermo y perispermo (almendra con albumen) y su uso en el campo farmacéutico ha sido muy amplio, sobre todo en el tratamiento de enfermedades parasitarias. 1.2.1. Características botánicas y usos de la planta. Juan Tomás Roig, 1972, en su libro “Plantas Medicinales y Aromáticas”, refiere los siguientes aspectos generales de la planta: Nombre Científico: Cucurbita moschata Duch Familia: Cucurbitáceas. Nombre Común usado en Cuba: Calabaza. Otros nombres comunes: Calabaza amarilla, calabaza moscada, calabacín, pumpkin, jiromon. Descripción botánica: Herbácea anual, rastrera o ascendente de tallos ligeramente angulosos. Zarcillos simples o ramificados. Hojas pubescentes, dentadas, con tres a cinco lóbulos agudos u obtusos. Con flores axilares, solitarias, corola anaranjada de seis a ocho centímetros. Fruto globoso, a veces cilíndrico, periforme o cónico, amarillento o anaranjado (Robineau, 1995). Distribución Geográfica: Regiones tropicales y subtropicales (cultivada y subespontánea), originaria de América tropical (Robineau, 1995). Usos populares significativos: 1. Se emplean las semillas trituradas y en forma de horchata o emulsión para hacer expulsar las lombrices intestinales. 2. En horchata se prescribe en la nefritis y en las inflamaciones de la vejiga y la uretra. 3. En el ardor y ulceraciones de la vejiga. 4. Posee acción gastroprotectiva. 5. Contra la tenia mediocanellata y especies afines. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou El Vademécum de Prescripción de Fitoterapia, 2003, documento oficial para la comercialización de plantas medicinales en España, describe una ficha con información contrastada que incluye los siguientes aspectos: Nombre común: Calabaza Nombre Científico: Cucurbita pepo L., (Cucurbita máxima Duch) Principios activos: Cucurbitina (0.5-2%), de estructura similar al ácido Kaínico; peponósido, peporresina, ácido cucúrbico, leucina, tirosina, vitaminas, ácidos grasos insaturados: oléico, linoléico. Acción farmacológica: Antihelmíntico nematocida (áscaris, oxiuros), diurético, emoliente, ligeramente sedante. Indicaciones: Teniasis ascaridiasis, cistitis, prostatitis, insomnio. Formas galénicas-Posología: 9 Semillas: 50-100 g por día en adultos, 20-40 g por día en niños. 9 Semillas (Antihelmíntico): 30-40 g de semillas, descascarilladas trituradas Por su parte, la Guía Terapéutica Dispensarial de Fitofármacos y Apifármacos, 1992, documento oficial para la comercialización de plantas medicinales en Cuba, publicado por el Ministerio de Salud Pública, describe los Papelillos de Calabaza como uno de sus formulaciones y la información publicada sobre los mismos incluye los siguientes aspectos: Formulación: Triturar a polvo fino y tamizar las semillas de la calabaza y elaborar papelillos dosificados a 600 mg. Almacenamiento: Temperatura ambiente. Envase: Papelillos Garantía: 30 días. Posología: un papelillo en ayunas durante 10 días, descansar 10 días y repetir el tratamiento. Acción farmacológica; Vermífugo (uso tradicional) Vía de administración: Oral. Contraindicaciones: Desconocidas. Advertencias: Desconocidas: Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 1.2.2. Estudios fitoquímicos de las semillas de Cucurbita. Los estudios fitoquímicos de la Cucurbita moschata abarcan desde la década del 60 hasta nuestros días. En este aspecto se han desarrollado estudios farmacognósticos y químicos que permiten no sólo determinar sustancias químicas de interés, sino aislar distintos metabolitos entre ellos el responsable de la acción antihelmíntica. Entre los compuestos aislados de las semillas de Cucurbita spp., está la Cucurbitina que fue caracterizada por investigadores chinos, Sun, 1961, quienes, además, propusieron su síntesis química. Estructuralmente este compuesto es tanto un α-aminoácido, como un β-aminoácido cíclico (Dunill, 1965). Este aminoácido, que parece estar limitado al género Cucurbita, es el responsable de la actividad antihelmíntica, Fang, 1961. Figura 3: Estructura química de la Cucurbitita. Hasta el momento el patrón de este compuesto no se comercializa, es por esto que los investigadores que han trabajado el tema siempre incluyen la síntesis de su sal hidrobromada en forma racémica, de acuerdo a métodos descritos por Sun, 1961; Monteiro, 1973; William, 1992, cuyos estudios sirvieron de base para que Andre y col., 1997, patentaran, junto al aislamiento de su fuente natural, la síntesis de este compuesto. Dicho procedimiento incluye tres etapas, en la primera se obtiene el 3 amino-1- bencil-3-cianopirrolidina, en la segunda este primer compuesto es transformado en el 1-bencilcucurbitina, el cual finalmente por Trabajo de Diploma de Pierre Dramou hidrólisis en medio ácido aporta la Cucurbitina. La identidad del compuesto sintetizado fue comprobada mediante la determinación del punto de descomposición (286 oC) y el espectro RMN- C13, además, su reacción con ninhidrina da una coloración amarillo-pardo similar a la prolina e hidroxiprolina, pero diferente al resto de los aminoácidos. Esta síntesis es, sin embargo, complicada y necesita un gran número de pasos. La cucurbitina se encuentra en la pulpa y semillas de las Cucurbitaceae, especialmente de las especies Cucurbita pepo L., Cucurbita máxima Duch. y Cucurbita moschata Duch. Según publicaciones de la FAO, Robineau, 1995, describe la composición fitoquímica de la semilla de Cucurbita Moschata Duch es agua, proteínas, aminoácidos, grasas, carbohidratos, calcio, fósforo, hierro, tiaminas, riboflavinas, niacina y se reportan datos de valores energéticos. Tienen hasta un 50% de un aceite graso. La planta entera contiene ácido cítrico, fumárico, succínico, málico, alcohol, P-hidroxibenzoico, vitamina C y Xylitol: 96,5 mg/100 g de planta seca. Matus, Molnar y Szabo, 1993, estudiaron los principales caratenoides presentes en la cucúrbita pepo usando cromatografía de columna con los adsorbentes: óxido de magnesio, celite y carbonato de calcio con hexano. La separación de los segmentos se hizo por HPLC y se reveló la presencia de Violaxthin, loteoxanthin, aurozanthin, luteinepoxide y flavoxanthin en pequeñas cantidades. Recientemente se ha retomado el estudio de estos carotenoides, en un estudio realizado en la variedad moschata, llegando a identificarse fundamentalmente α,β carotenos, así como derivados de estos, las semillas frescas aportaron un valor de 432 µg/100gr de semilla, lo cual es indicativo de que las semillas son una fuente importante de vitamina A., González, 2001. Shavenberg y Paris, 1972, incluyeron a la Cucurbita pepo y máxima dentro del grupo de plantas que contienen alcaloides y plantean que el germen de la semilla contiene una sustancia isoprenoide (la cucurbitacina), cuya acción antiinflamatoria es notable. También es capaz de bloquear la división celular en la estadía de metafase y debería ser probada como anticancerígeno en hipertrofia de próstata. Las cucurbitacinas tienen interés debido a sus propiedades citotóxicas y antitumorales. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Entre el 35 y el 50% del peso de las semillas de Cucurbita corresponde a un aceite que ha sido ampliamente estudiado con fines terapéuticos por la composición química que posee el mismo. Este aceite contiene una apreciable cantidad de ácidos grasos insaturados (78%), siendo mayoritarios el palmítico, el esteárico, el oleico y el linoleico. Estudios realizados por Murkovic M, 1996 confirman además que el contenido de Vitamina E, especialmente gammatocoferoles, es muy alto. Posteriormente Yoinis, 2000 y El-Adawy, 2001 reafirman lo anterior y añaden que las semillas poseen además del aceite un 38% de proteínas, un 37% de carbohidratos y 3mg/100gr de alfatocoferoles. Se puede resumir, entonces, que los estudios fitoquímicos reportados demuestran, coincidentemente, la presencia de aminoácidos, proteínas, carbohidratos y aceite como componentes mayoritarios, y destacan la existencia de la Cucurbitita y las cucurbitacinas con los ácidos grasos, como los compuestos responsables de las acciones farmacológicas más importantes atribuidas a las semillas; antihelmíntica y antinflamatoria prostática, respectivamente. Los estudios fitoquímicos de las semillas se mantienen en nuestros días. Recientemente Koile y col., 2005 aislaron y caracterizaron cinco glicósidos fenólicos, a partir de las semillas de Cucurbita moschata, llamándole cucurbitoside A-E. 1.2.3. Propiedades farmacológicas y toxicológicas de la de Cucurbita spp.. A través de los años se han realizado numerosas investigaciones acerca de la actividad farmacológica y toxicológica de varias especies de Cucurbita, desde que fue usado un infuso de semillas de calabazas en pacientes infectados con Taenia saginata y Taenia solium, obteniendo un 70,6% de efectividad con un solo tratamiento, Duvían, 1953, también estudió el tratamiento del parasitismo intestinal con semillas de calabaza, las cuales según él, tienen propiedades vermicidas. Por su parte Esteban, 1954, estudió las características botánicas de Cucurbita pepo, la morfología e histología de las semillas; su composición química y su farmacología, dando especial atención a su uso antihelmíntico. Los primeros estudios in vitro sobre Ascoris lumbricoides, Fasciola hepática y Lumbricus terrestris fueron realizados por Mackie y Stewart, 1955, se estudió la Trabajo de Diploma de Pierre Dramou efectividad de los extractos etéreos, clorofórmicos, en alcohol 95% y en ácido clorhídrico 5%, siendo el extracto más efectivo como antihelmíntico el de ácido clorhídrico. Shiao y col en 1962 demostraron la actividad protectiva de la Cucurbitina presente en las semillas de calabaza contra la infección producida experimentales en ratones con schistosoma japonicum, mientras que Bailenger y Seguin, 1966, reportaron que las semillas de Cucurbita pepo que creció bajo condiciones controladas contienen la actividad antihelmíntica en sus cubiertas. Se extrajeron dos fracciones, las cuales matan a hymenolepsis nana y dirocvelium dendriticum in vitro e in vivo, controlan efectivamente a h. nana en ratones y perros, y Taenia saginata en el hombre. Se ha demostrado que los extractos acuosos y alcohólicos de las semillas de Cucurbita máxima poseen propiedades antihelmínticas. Se determinó la acción farmacodinámica general de estos extractos sobre preparaciones de corazón aislado de rana, la presión sanguínea y la respiración de perros anestesiados, íleon aislado de conejo, útero aislado de rata, intestino intacto de perros y preparaciones del músculo rectus abdominis de rana. El extracto acuoso causó una reducción marcada de la amplitud de las contracciones y de la velocidad del corazón de rana, este efecto no fue bloqueado por atropina. El tono del músculo intestinal del conejo aumentó con los extractos proporcionalmente a la dosis. Dichos extractos no surtieron efecto sobre el músculo esqueletal y útero de rata, Rivastava y Tewari, 1967. Desde que Fang, 1961, aislaron de las semillas de Cucurbita moschata Duch al aminoácido llamado Cucurbitita y comprobaron que inhibía el crecimiento de shistosoma japonicum se le adjudicó a este compuesto la acción antihelmintica, lo cual fue confirmado por estudios realizados por investigadores rusos, quienes demostraron dicha acción y realizaron pruebas clínica en pacientes infestados con Cestodiasis con resultados satisfactorios. Estos resultados aparecen reflejados en los trabajos de Shiao, 1962. Por otra parte González, 1974, realizó un estudio farmacológico de la Cucurbitina, aislada de la Cucurbita máxima Duch, en lombriz de tierra y en intestino aislado de Trabajo de Diploma de Pierre Dramou conejo, demostrándose un efecto de parálisis del verme proporcional a la concentración y al tiempo de contacto, y un efecto contráctil sobre el intestino dependiente de la dosis. Posteriormente Chen, 1980, observaron que, veinte minutos después de la inyección intravenosa de Cucurbitina, marcada con 14 C, a ratones, la radioactividad estaba altamente localizada en el hígado, riñones, ganglios de la raíz dorsal, cartílago traqueal y páncreas. La intensa actividad persistió por 24 horas en estos tejidos, excepto para el páncreas, que mostró una disminución de la concentración con el tiempo. Se observó, también, un nivel moderado de radioactividad en el epitelio nasal, mucosa gastrointestinal, esófago, glándulas salivales, timo, médula ósea y glándulas haeder. Después de tres días, la mayor concentración estaba en los cartílagos, debido a la semejanza estructural de la Cucurbitina con la prolina e hidroxiprolina, la retención de Cucurbitina en el cartílago puede involucrar su incorporación a la proteína, la localización en el ganglio de la raíz dorsal puede estar relacionada con la alteración de la actividad motora vista después de altas dosis de Cucurbitina. Estudios más recientes comprobaron una vez más en estudios in vivo en ratones, la acción antihelmíntica de cuatro plantas del género cucurbitaceae entre las cuales estuvo la Cucurbita máxima duch, contra hymenolepsis nana y Aspicularis tetraptera, se usó la piperazina como sustancia de referencia. Los extractos etanólicos de las semillas de esta especie exhibieron una potente actividad contra la h. nana comparable con el efecto de la piperazina y una actividad menos acentuada contra el otro parásito tratado, Elisha, E., 1997, mientras que Díaz O, 2004 realizaron estudios preclínicos y con ellos demostraron, una vez más, la actividad antiparasitaria de las semillas. Queiroz, 1994, realizaron una evaluación toxicológica de extractos acuosos de semillas de Cucurbita máxima que fueron administrados por vía oral a ratas y cerdos en dosis simples durante 4 semanas. El extracto no produce cambios en la glucosa, urea, creatinina, proteína total, ácido úrico, GOT, GPT, LDH y conteo sanguíneo, lo anterior fue determinado en sangre, muestras que el análisis de orina tampoco arrojó anomalías en urea, ácido úrico, creatinina, proteína total, Na Trabajo de Diploma de Pierre Dramou y K. Estos resultados son indicativos de que las semillas de Cucurbita máxima no resultaron tóxicas para ratas y cerdos. Lo expuesto, anteriormente, muestra que las semillas son reconocidas, en la fitoterapia, por su acción antihelmíntica, sin embargo, la variedad de metabolitos activos ha posibilitado realizar estudios en diferentes campos. De-Amorim, 1992, investigaron la actividad antimalárica de plantas de la familia cucurbitaceas obteniendo que el extracto etanólico de semillas secas de Cucurbita máxima presenta fuerte actividad antimalárica por administración oral (250 y 500 mg / kg.), reduciendo al 50% el nivel de parasitemia en ratones infectados con plasmodium berghet. Trease and Evans, 2000, señaló que las almendras fragmentadas de Cucurbita pepo, al igual que las de otros miembros de la familia cucurbitaceae, están en el arsenal herborístico para el tratamiento de la diabetes. Este mismo autor planteó que la cucurbitacina E, triterpeno tetracíclico presente en la mayoría de las especies de esta familia posee actividad anticancerosa. En 1997, un instituto francés de cosmetología patentó, Patente WO 92/15563, varías preparaciones cosméticas, específicamente cremas con acción antialérgica, con la Cucurbitita como ingrediente activo. Previamente fue demostrado que este aminoácido es capaz de actuar sobre la enzima histidina descarboxilasa (HDC) que transforma la histidina en histamina. El extracto acuoso de semilla de Cucurbita moschata exhibió una actividad gastroprotectiva que se incrementa, directamente proporcional, con la dosis en ratas con lesiones gástricas inducidas por etanol, Imaoka,1994, este mismo extracto manifestó, además, efecto hepatoprotector en un estudio realizado recientemente donde se usa la rata como animal de experimentación, los ensayos complementarios necesarios para la comprobación de dicha acción avalan la no toxicidad que posee el extracto estudiado, Hase.,1996. Por otra parte el aceite, presente en las semillas, ha sido usado como antiinflamatorio prostático en la hiperplasia prostática benigna, lo que propicia la existencia en el mercado europeo de varias formulaciones que lo incluyen como uno de los ingredientes activos. El Vademécum de prescripción, 2003 reporta que el aceite de las semillas de calabaza posee un alto contenido en prótidos ricos Trabajo de Diploma de Pierre Dramou a su vez en aminoácidos esenciales (hasta un 50%). Sin embargo, su importancia en dietética se debe especialmente a la presencia de un componente, la cucurbitacina, de interesantes propiedades a nivel prostático. Estudiada de forma aislada, la cucurbitacina podría intervenir en el bloqueo de la división de las células glandulares (acción antimitótica) ejerciendo además un efecto antiinflamatorio. Gracias a esta propiedad, también podría ser utilizado en el tratamiento de la inflamación de la vejiga. 1.2.4. Estudios analíticos aplicados a la Cucurbitina. Numerosos estudios han sido reportados desde la década del 60, por diferentes autores, acerca del contenido aminoacídico y proteico de la familia cucurbitaceae. Generalmente, las semillas han sido examinadas con preferencia a otros órganos vegetativos, ya que su composición suele ser menos afectada por variaciones de factores ambientales, durante el crecimiento de la planta. En 1965, Dunill y Fowden realizaron un estudio de la distribución de aminoácidos presentes en las semillas de diferentes especies de esta familia, usando la cromatografía en capa delgada con corrida bidimensional que con la ninhidrina como agente cromogénico y los sistemas de solventes butanol - ácido acético agua y fenol - amoníaco permitió separar e identificar veinticinco aminoácidos en total. Un resultado significativo en este trabajo es haber obtenido en los cromatogramas que la cucurbitina constituía el componente predominante en las especies Cucurbita Moschata y Curcubita Máxima. Bravo y col., 1974, realizaron un estudio de los aminoácidos presentes en el infuso de semillas de Cucurbita Máxima Duch, especie chilena. Para la preparación del infuso siguieron la técnica descrita por Mihranian y Abou-Chaar, 1968, con algunas modificaciones. De los métodos cromatográficos descritos en este trabajo (Cromatografía en papel ascendente y descendente; cromatografía en capa fina) para la identificación de la Cucurbitina a partir del infuso, los mejores resultados se obtuvieron con la Cromatografía bidimensional en papel, debido a que con esta se evita la superposición de los aminoácidos. Se comprobó que el infuso tenía 13 aminoácidos libres, usando como fases móviles butanol / ácido acético / agua (80:20:20), fenol al 75% y Ninhidrina como revelador, donde se Trabajo de Diploma de Pierre Dramou determinó que la Cucurbitina estaba en mayor proporción y su extracción y purificación resultó efectiva mediante resinas de intercambio iónico, pero muy lenta ya que la malla de la resina es muy fina, y la columna muy larga. En 1988, Duez y col., realizaron extracciones de Cucurbitina en agua a partir del género Cucurbita. Reducidas éstas a un polvo seco que fue posteriormente desengrasado. Seguido a esto se le aplicó una cromatografía de intercambio iónico sobre la resina de amberlite IR-120 (forma H+). Las determinaciones se llevaron a cabo a través de dos métodos analíticos: HPTLC y HPLC. En HPTLC la Cucurbitina apareció como una mancha carmelita luego de haber usado los siguientes condiciones cromatográficas; placas de silicagel 60, solvente metanol / cloroformo / amoníaco 25% y ácido acético (80:10:8,5:1,5 v/v) y como revelador la Ninhidrina. Los valores medios fueron calculados por integración de nueve manchas (λ=320 nm) correspondientes a tres concentraciones diferentes de patrones, cada una analizadas dos veces y tres manchas de la solución de concentración desconocida. Como resultado se obtuvo que el extracto analizado poseía un 0,3% de Cucurbitina, aproximadamente, en las especies Cucurbita pepo y moschata. Por su parte la HPLC se usó con una columna Ciano como fase estacionaria y como fase móvil acetonitrilo- buffer PH–2,5 en diferentes proporciones acorde con el tiempo. Las muestras fueron previamente derivatizadas con una mezcla fenilisotiocianato / piridina / agua (1,3:60:40). Los resultados obtenidos con el desarrollo de esta técnica son muy similares a la anterior. Una determinación estereoselectiva de Cucurbitina en semillas de Cucurbita spp fue realizada usando la cromatografía gaseosa y la cromatografía gaseosa espectrofotometría de masa. Fue usada la columna capilar Chirasil-L-Val como fase estacionaria quiral, mientras que la D, L - Cucurbitina fue previamente transformada en los ésteres derivados de N - trifluoroacético correspondientes a través de la reacción con diferentes alcoholes y el anhídrido trifluoroacético. La influencia de la esterificación con alcohol en la resolución y los tiempos de retención fueron aspectos analizados comparándose con diferentes aminoácidos proteicos. Se usó como estándar interno el metil pentadecanoato. Este estudio Trabajo de Diploma de Pierre Dramou concluyó que el metil éster es el derivado que ofrece mejor resolución y menor tiempo de retención y se recomienda el uso del método descrito por su alta sensibilidad, precisión y selectividad para realizar determinaciones de Cucurbitina en extractos acuosos de semillas de Cucurbita spp. Las muestras analizadas eran correspondientes a la especie cucurbita pepo y se determinó que ésta poseía 0,4 %, aproximadamente, de Cucurbitina, Schenkel, 1992. Es de destacar que para el desarrollo de las tres técnicas cromatográficas descritas anteriormente los autores se vieron obligados a realizar previamente la síntesis del patrón Cucurbitina siguiendo la metodología de Sun, 1961, además, si se comparan los resultados obtenidos se observa gran similitud a pesar de haber usado especies diferentes. De la búsqueda bibliográfica realizada en este apartado, se puede deducir que las probadas acciones antihelmínticas y antiinflamatorias, presentes en las semillas de la Cucurbita spp. permiten su uso en la elaboración de formas farmacéuticas para estos fines, sin embargo hasta el momento no se han publicado trabajos que refieran la existencia de un ingrediente activo obtenido de esta especie vegetal que pueda ser utilizado en la elaboración de formulaciones con las acciones citadas, esto constituirá un aporte importante de este trabajo. Los estudios fitoquímicos y analíticos encontrados en la literatura son una valiosa fuente de información para alcanzar este objetivo. Particularmente, los estudios analíticos para la determinación cuantitativa de la Cucurbitina, en las semillas de Cucurbita spp. aportan informaciones valiosas que fueron tomadas en consideración en el presente trabajo, especialmente las condiciones cromatográficas usadas en la CCD. Sin embargo, la HPLC de fase reversa ofrece ventajas, con respecto a la referida en la bibliografía, ya que mejora la especificidad y disminuye el tiempo de desarrollo de la técnica. Con respecto a los estudios analíticos, se precisa que: (A) la metodología analítica para desarrollar el control de la calidad de los productos de origen natural presenta particularidades, referidas en las normas internacionales y farmacopeas, que deben ser tomadas en consideración en los estudios que se desarrollen en esta temática; (B) las técnicas cromatográficas poseen las mayores ventajas para la Trabajo de Diploma de Pierre Dramou determinación de metabolitos en plantas medicinales, dada la complejidad de estas muestras y (C) la reacción de Ninhidrina ofrece grandes posibilidades para la determinación cualitativa y cuantitativa de los aminoácidos presentes en las plantas. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Capitulo II. MATERIALES Y METODOS. 2.1.- Material Vegetal, equipos y reactivos. 2.1.1. Material vegetal Para la obtención del extracto seco se utilizaron las semillas secas de cucurbita moschata Duch suministrada por la empresa de semillas varias del MINAGRI, en Villa Clara. En su composición están presentes alcaloides, compuestos grasos, triterpenos, esteroides, aminoácidos, azúcares reductores, fenoles, flavonoides, quinonas, taninos y resinas; posee además, aceite secante fijo. Esta caracterización fitoquímica fue realizada, en el Departamento de Farmacia de la Universidad Central de las Villas, por Saucedo y Col., 1995, mientras que especialistas del Centro Provincial de Sanidad Vegetal comprobaron que dichas semillas respondían adecuadamente al control fitosanitario establecido para garantizar una óptima calidad de las mismas. 2.1.2. Materiales utensilios y equipos de medición: Balanza digital Sartorius. Error 0,1mg. Baño de agua BWS 17 SEIWA RIKO CO.LTD. Baño ultrasónico BRASON 1510 Agitador magnético, Agimatic-N con calefacción. Centrifuga Hettich, Universal 16 A. Rotoevaporador, Buchi R-200. Espectrofotómetro UV-VIS, Genesys 10UV Microplatina, Modelo IA- 9100. Mufla SELECTA-HORN. Estufa SELECTA-HORN Cristalería de laboratorio 2.1.3. Reactivos Metanol, Lichrosolv, Merck Ninhidrina, Merck. Cloroformo, Lichrosolv, Merck Amoníaco, Scharlau AMO249. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Acido acético, CH3COOH PM60.05 Acetona, CH3COCH3 PM58,08 2.2. Estudios analíticos para establecer la monografía de control de calidad del sólido pulverulento Las monografías analíticas de un producto farmacéutico (ingrediente activo) se estructuran, generalmente, con ensayos de identificación, específicos y de cuantificación, exigiendo, los dos últimos, respaldo estadístico para su evaluación. En todos los casos se sigue un formato para su documentación, incluyendo los siguientes acápites previos: A. Noticias generales: Acción y uso. B. Definición: Se describe la forma de obtención del sólido pulverulento. C. Características. Se describen las características organolépticas del sólido pulverulento. 2.2.1. Ensayos cualitativos de identificación a. Descripción macroscópica: Fueron realizados los ensayos preliminares descritos por Trease y Evans, 2000, Pág. 544, para la descripción de drogas en polvo, que incluyen color, olor, sabor, detección de aceites y solubilidad en agua b. Descripción microscópica del polvo: Según técnica descrita, en Trease y Evans, 2000, Pág. 544, para determinar la presencia de almidón, lignanos, tricomonas epidérmicos entre otros aspectos que pudieran estar presentes en la célula vegetal. c. Reacción de Foling: Se pesan 0,05 gramos de extracto y se añade 1,0 mililitro de solución reactivo de Foling (1:3) y 2,5 mililitros de NaOH 0,5 M. Un ensayo positivo estará indicado por una coloración azul intensa. d. Reacción con Ninhidrina: Se pesan 0,05 gramos del extracto en 1,0 mililitro de Ninhidrina y se calienta en baño de María hasta la aparición de un color azul violáceo. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 2.2.2. Ensayos específicos. Determinación de los límites de especificación En todos los ensayos fue usado el método estadístico de Bowker para el cálculo de las especificaciones, el cual tiene la ventaja de que puede ser aplicado tanto para tamaños de muestras pequeñas como grandes, siendo, además, poco laborioso. En este caso fueron procesadas 25 muestras, en cada caso, y se determinó el límite unilateral para cada prueba, siguiendo la metodología de cálculo descrita por Arce 1994. Pérdida por desecación PROCEDIMIENTO: De la muestra de ensayo se pesan 1,0 gramo con un error máximo de 0,5 miligramos, se transfieren a un pesafiltro, previamente tarado y se deseca a 105 oC durante dos horas. El pesafiltro se coloca en una desecadora, donde se deja enfriar hasta la temperatura ambiente y se pesa, colocándose nuevamente en la estufa durante dos horas; se repite esta operación hasta obtener una masa constante. El ensayo se realiza por triplicado y los resultados se determinan a través de la siguiente expresión: Ps = (Pf + M sd ) − (Pf + M d ) ⋅100 (Pf + M sd ) − Pf Donde: Ps: Pérdida por desecación, en % Pf: Masa del pesafiltro, en g Md: Masa de muestra desecada, en g Msd: Masa muestra sin desecar, en g Cenizas totales. PROCEDIMIENTO: De la muestra de ensayo se pesan, con exactitud, 1 gramo en el crisol que previamente ha sido tarado, como se describe en la operación anterior. Se calienta la sustancia hasta que esté totalmente carbonizada, y se deja enfriar. Se humedece el residuo con 1,0 mililitro de ácido sulfúrico y se calienta levemente hasta que no se observen humos densos blancos. Se incinera a 800 ºC, durante dos horas en una mufla. Se colocan los crisoles en una desecadora Trabajo de Diploma de Pierre Dramou sobre sílicagel hasta que se enfríe (temperatura ambiente). Pesándolos al día siguiente e introduciéndolos nuevamente en la mufla durante 30 minutos y repita este procedimiento hasta que la diferencia entre dos pesadas consecutivas no sea mayor a 0,5 miligramos. El ensayo se realiza por triplicado y el cálculo de los residuos de ignición, según la siguiente expresión: Ri = (M f - M i ) ⋅ 100 MM Donde: Ri: Residuos de ignición, en % Mi: Masa inicial del crisol, en g. Mf: Masa final del crisol, en g. MM: Masa de muestra, en g. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico PROCEDIMIENTO: Las cenizas insolubles en ácido clorhídrico (HCL) se obtienen al tratar el residuo de las cenizas totales o sulfatadas con este ácido y se expresan con respecto a 100,0 gramos del producto analizado. En el crisol, añadir al residuo obtenido en la determinación de cenizas sulfúricas o totales y 10,0 mililitros de HCL. Cubrir con un vidrio de reloj hervir suavemente durante 5 minutos y dejar enfriar. Filtrar el residuo con un filtro sin cenizas y lavar con agua caliente hasta que el filtrado sea neutro. Desecar, calcinar al rojo oscuro, dejar enfriar en el desecador y pesar. Repetir la calcinación hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no sea superior a 1,0 miligramo. Para el cálculo del límite superior de especificación fue usada la siguiente metodología (Método de Bowker) La expresión para determinar el límite unilateral de máximo es: _ ~ LSE = X + K σ Donde: − X = Media aritmética Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ~ σ = Desviación típica estimada Para el cálculo de K se usa la expresión: K= ZP + C a Donde: a = 1− Zα 2(n − 1) b = Z P2 − Z α2 n c = Z P2 − ab Los valores de a, b y c solo se utilizan para realizar el cálculo de K. 2.2.3. Definición de las condiciones experimentales para las técnicas analíticas utilizadas en la monografía propuesta. Cromatografía en Capa Delgada (CCD) La CCD, en este caso, tiene como objetivo detectar las sustancias, presentes en la muestra, que reaccionan con la Ninhidrina, especialmente los aminoácidos que no forman el Complejo RP con este reactivo. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS: Fase estacionaria: Placa de gel de sílice GF para cromatografía en capa fina. Fase móvil: Metanol-Cloroformo-Amoníaco al 25%-Ácido Acético Glacial (80:10:8,5:1,5). PROCEDIMIENTOS: Muestra problema: Disolver 1,0 gramo del sólido pulverulento en 40,0 mililitros de agua, agitar durante 30 minutos a 500C, centrifugar durante 30 minutos y colectar el sobrenadante. Repetir el procedimiento, añadiendo por la segunda extracción 20,0 mililitros de agua al extracto residuo, juntar los sobrenadantes y añadir 20,0 mililitros de metanol, colocar en refrigeración por 12 horas, centrifugar de nuevo 30 minutos para eliminar las proteínas, filtrar. Rotoevaporar el solvente, redisolver en 2,0 mililitros de una mezcla Metanol: Agua (1:1) y filtrar. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Muestra referencia (patrón): Disolver 10,0 miligramos de los patrones en 2,0 mililitros de Metanol: Agua (1:1). Aplicación: 2,0 μl para muestra referencia una vez, 2,0 μl para muestra problema dos veces. Desarrollo: Aplicar por separado a la placa 2,0 μl de muestra problema y 4,0 μl de cada disolución de muestra patrón. Dejar secar la placa al aire. Desarrollar hasta una distancia de 10,0 centímetros Secado: Al aire durante 15 minutos. Detección: Asperjar con la disolución de Ninhidrina al 2%, disuelta en una mezcla Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), Calentar de 40 °C a 60 °C durante 5 minutos. Resultados: La mancha principal en el cromatograma obtenido con la disolución problema es similar en posición y tamaño a las manchas principales de las disoluciones de referencia probadas. Esta técnica CCD fue aplicada a los siguientes 21 aminoácidos: Histidina, Glicina, Serina, Cysteina, Leucina, Treonina, Prolina, Hidroxiprolina, Cucurbitina, Arginina, Ácido Aspártico, Ácido Glutámico, L-fenilamina, Valina, LTirosina, Triptófano, Alanina, Cystina, L-Lisina, Metionina, Asparagina. Espectrofotometría UV-VIS. Teniendo en cuenta, que múltiples trabajos que estudian la reacción de Ninhidrina, afirman, que la misma requiere del establecimiento de algunos factores que influyen de forma directa en la estabilidad del cromóforo formado y por ende en la coloración y absorción del producto (Friedman, 1974; 1990; 2004). En el presente trabajo se realizaron estudios que permitieron establecer las condiciones óptimas para desarrollar la técnica espectrofotométrica usando la reacción citada. Este estudio se realizó mediante un diseño factorial 23 con una repetición. Se estudiaron como variables independientes la temperatura, el tiempo de calentamiento y el porciento de Ninhidrina en la mezcla Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2). Cuyos niveles máximos fueron 70 0C, 30 minutos y 0,5%., respectivamente y los niveles mínimos fueron 50 0 C, 10 minutos y 0,25%, Trabajo de Diploma de Pierre Dramou respectivamente. En la tabla 2.1, ANEXO C, se muestra la matriz definida para este diseño. Se evaluó la incidencia de estas variables sobre los valores de absorbancia. La evaluación de los resultados del diseño se realizó usando el paquete estadístico Statgraphics, versión 6.0. PROCEDIMIENTOS: Muestra problema: Se pesan 2,0 gramos del sólido pulverulento, se añaden 20,0 mililitros de Agua destilada y se agita durante 30 minutos a 50 0C. Se centrifuga a 6000 r.p.m durante 30 minutos y se separa el sobrenadante. Se repite el procedimiento y se juntan los sobrenadantes. Se añade 40,0 mililitros de metanol y se mantiene en refrigeración durante 12 horas. Se centrifuga a 6000 r.p.m durante 15 minutos y se separa el sobrenadante. Se rotoevapora a sequedad y se redisuelve el residuo en 2,0 mililitros de Metanol: Agua (1:1) Muestra referencia: Diluir 5,0 miligramos de Asparagina en una mezcla Metanol: Agua (1:1) hasta completar 10, 0 mililitros (Solución A). Transferir 200 µL de la solución A a un volumétrico de 10 y completar volumen con el mismo solvente. Derivatización de la muestra patrón: Se toman 1mL de la solución patrón, se le adiciona 0,5 mililitros de Ninhidrina (Solución preparada al 0,5% en una mezcla de Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), se calienta a 40 0C por 40 minutos y se enrasa a 2,0 mililitros con solución Metanol: Agua (1:1) Derivatización de la muestra problema: Se toman 0,25 µL de la muestra disuelta en Metanol: Agua (1:1) y de la muestra referencia (b), se adiciona 0,5 mililitros de Ninhidrina (Solución preparada al 0,5% en una mezcla de Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), se calienta a 60 0C por 40 minutos y se enrasa a 2,0 mililitros con solución Metanol: Agua (1:1) Método operativo: Medir la absorbancia de la muestra por comparación con la disolución de referencia a 320nm, frente a la solución de Ninhidrina como blanco. Calcular el contenido en porcentaje de aminoácidos, calculado en base a Asparagina, a partir de la siguiente expresión: CM = C P ⋅ A M ⋅16 ⋅100 AP ⋅ M M Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Donde: CM: Concentración de la muestra problema, en % CP: Concentración de la muestra patrón, en mg/ml AM: Absorbancia de la muestra problema AP: Absorbancia de la muestra patrón MM: Masa de la muestra problema, en mg Esta técnica cuantitativa fue sometida a un proceso de validación, según la metodología de las Normas ICH, 1996. Los resultados fueron expresados como valores de absorbancia y para su análisis estadístico fue usado el Microsoft Office Excel, 2003, se seleccionó 5% como nivel de significación. 2.2.4. Validación de la técnica espectrofotométrica para su uso como ensayo cuantitativo en la monografía analítica. Procedimiento de validación: Linealidad Se construyeron tres curvas de calibración en el rango de concentraciones de 2ppm, 4ppm, 6ppm, 8ppm y 10ppm Para esto se pesó 5.0 mg de Asparagina y se transfirió a un matraz aforado de 10 mL; se disuelve y se completa a volumen con metanol: agua (1:1). A partir de esta solución se realizaron diluciones de 200 µL en 10mL, a partir de esta solución fueron preparadas las concentraciones señaladas. El tratamiento estadístico de los resultados tiene en cuenta los términos; coeficiente de correlación (r), coeficiente de variación de los factores respuesta (CVf), desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel %) y los límites de confianza del intercepto (i). Se calculan según las expresiones siguientes: r= Factores de respuesta: ∑ XY − (∑ X ) ⎛ ⎜ X2 − ⎜∑ ⎝ fi = ∑ X ∗ ∑Y 2 n Y X n 2 ⎞ ⎞ ⎛ ⎟ ∗ ⎜ Y 2 − (∑ Y ) ⎟ ∑ ⎟ ⎜ n ⎟ ⎠ ⎠ ⎝ Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Media de fi: f = ∑f i n ∑( f Sf = Desviación estándar de f: n −1 CVf = Coeficiente de variación de f: − f )2 i Sf − 100 f Sbrel (%) = Desviación estándar relativa de la pendiente: S Y2, X Sb 2 = Sb × 100 b S Y2, X = (∑ X ) 2 ∑X − ∑( X − X ) n 2 Siendo “S Y,X” la varianza del error experimental total, varianza residual o varianza __ 2 2 de regresión de “y” sobre “x”. El valor de “S2Y,X” se obtiene mediante las ecuaciones siguientes: − 2 S Y2, X = ∑ (Y − Y ) (1 − r 2 ) n−2 Los límites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresión: b ± t ∗ Sb Siendo t el valor de Student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida (generalmente p = 0.05). Otro test estadístico de b se deduce de la expresión: t exp = b Sb En la tabla de t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad. Hipótesis nula: b = 0. Si t exp > t tab significa que la probabilidad de ser b ≠ 0 es muy elevada. Intervalo de confianza del intercepto: La varianza del término independiente se calcula según: Sa = Sb 2 2 ∑X ∗ n 2 = S Y2, X ∑ (X − X ) 2 ∑X ∗ n 2 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou La desviación o error estándar es: Sa = Sa 2 La desviación estándar relativa del término independiente es: Sarel (%) = Sa ∗ 100 a Los límites de confianza del término independiente son: a ± t ∗ Sa Siendo t el valor de la distribución de Student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida (generalmente p = 0.05). Criterios: r ≥0.99 CVf≤5% Sbrel≤2% a−tSa<0>a+tSa Precisión Este parámetro incluyó la repetibilidad y la reproducibilidad, en el primer caso se procesaron cinco muestras con la concentración intermedia de la curva, por un mismo analista y en un mismo día, mientras que la reproducibilidad consistió en un procedimiento similar realizado por diferentes analistas y días. En ambos casos fue determinado el coeficiente de variación de los resultados. Repetibilidad: Realizar seis réplicas de la muestra problema en condiciones homogéneas y calcular el coeficiente de variación (CV) de los seis resultados de contenido de aminoácidos, en base Asparagina, presentes en el extracto seco de Cucurbita spp Criterio: CV ≤ 2.0 % Precisión intermedia: Realizar el experimento anterior, dos días y por dos analistas diferentes, calcular el coeficiente de variación del total de resultados. Criterio: Trabajo de Diploma de Pierre Dramou CV ≤ 3.0 % Especificidad PROCEDIMIENTO: Para evaluar este parámetro se llevó a cabo un estudio de las repuestas de los aminoácidos, detectados en la muestra por CCD, como interferencias potenciales en las técnicas. Para ello fueron preparadas soluciones patrón de los aminoácidos: Asparagina, Lisina, Prolina, Hidroxiprolina, Arginina, Histidina, y de forma similar, se procedió a realizar la reacción de derivatización a la muestra problema. Se estudió el comportamiento de absorción en la zona de 300 a 400nm y la respuesta cromatográfica en la técnica HPLC. Sensibilidad PROCEDIMIENTO: Se aplicó el método, siguiendo el procedimiento de preparación y derivatización de la muestra, descrito al inicio de este capítulo. Se realizaron cinco determinaciones. El parámetro fue evaluado a través del cálculo del límite de detección y de cuantificación. En todos los casos se calcularon los límites de detección (LD) como la concentración de analito que produce una señal igual a tres veces la desviación estándar del blanco (criterio 3σ de la IUPAC) (Thompson, 1995A y 1999; ICH, 1995) bajo las condiciones experimentales óptimas. Se tomó como límite de cuantificación (LC) la concentración de analito que produce una señal igual a diez veces la desviación estándar del blanco (Thompson, 1995A y 1999; ICH, 1995; Eurachem, 1998) bajo las condiciones experimentales óptimas. Una vez establecidos todos los ensayos que formaban parte de la monografía se realizó una comparación del sólido pulverulento, obtenido en el presente trabajo, y el polvo registrado en la guía de Fitofármacos y Apifármacos del Ministerio de salud pública de Cuba (MINSAP) usado como ingrediente activo en los papelillos que se comercializan en Cuba. Fueron usados como criterios los ensayos específicos evaluados, se procesaron 10 muestras y los resultados obtenidos fueron comparados a través de la prueba t-Student, usando el paquete estadístico SPSS/PC. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Capítulo III. RESULTADOS Y DISCUSION. 3.1. Estudios analíticos para establecer la monografía de control de calidad del sólido pulverulento obtenidos a partir de las semillas de Cucurbita moschata Duch. Se propone que la monografía analítica del sólido pulverulento posea la siguiente información en los acápites iniciales: 9 NOTICIAS GENERALES: Antiparasitario, Antihelmíntico. 9 PREPARACIÓN: Polvo obtenido a partir de las semillas de Cucurbita spp después de un proceso de desengrase, por compresión, pulverización y posterior tamizado. 9 DEFINICIÓN: El sólido pulverulento de Cucurbita spp, es preparado a partir de las semillas de esta planta, después de ser sometidas a procesos de desengrase, pulverización y tamizado. El polvo contiene no menos del 1.05% y no más del 1.5% de aminoácidos totales expresado en base al contenido de Asparagina y calculado con referencia al polvo. 9 CARACTERÍSTICAS. Polvo amarillo pálido, con un ligero olor característico. Sus características macroscópicas y microscópicas aparecen descritas en las pruebas de identificación A y B. 3.1.1. Ensayos cualitativos de identificación 9 IDENTIFICACIÓN a. Descripción Macroscópica. Las semillas de Cucurbita spp son clasificadas como dicotiledóneas, se componen de una almendra aceitosa, rodeada de una testa protectora. El tamaño es aproximado de un cm., tienen forma de óvalo y color beige. Presencia de funículo. Cubierta seminal de color amarillo pálido, reticulada, con presencia de pelos. La almendra posee un embrión, recubierto por endospermo y perispermo. (almendra con albumen). b. Descripción Microscópica del polvo. Presencia de parénquima lignificado, gránulos de almidón en forma anisotrópica al examinar a la luz polarizada. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou c. Reacción Colorimétrica de Foling: Según se reporta esta reacción brinda la posibilidad de determinar el contenido proteínico de una muestra con alta sensibilidad (Lowry, 1951). La concentración ensayada para 50mg resultó ser positiva apareciendo un color azul intenso instantáneo que demora en desaparecer, lo que demuestra la presencia de proteínas en el polvo. d. Reacción Colorimétrica de Ninhidrina): : Esta reacción permite la detección de α-aminoácidos en cualquier muestra ofreciendo como evidencia positiva la aparición, al calentar, de un color azul-violáceo persistente producto de la formación del cromógeno llamado Ruhemann´s purple (RP) (Friedman, 2004). La concentración ensayada para 50mg resultó ser positiva apareciendo un color azul violáceo intenso a los dos minutos de calentamiento, este color demora en desaparecer. Con esta reacción se demuestra la presencia en el polvo de α-aminoácidos. e. Cromatografía en Capa Delgada. (CCD). El cromatograma obtenido al aplicar la muestra describe la aparición de cinco manchas con valores de Rf = 0.21, 0.35, 0.48, 0.58, y 0.75. Estas coinciden con las manchas que aparecen en el cromatograma de las soluciones de referencia, correspondiente a cada una. La aparición de la mancha con valor de Rf = 0.21 correspondiente a la Cucurbitina resulta la de mayor interés. Estos resultados son discutidos en el epígrafe 3.1.3. 3.1.2. Determinación de los límites de especificación de las pruebas específicas. La determinación de los límites de especificación permite disponer de valores establecidos y confiables que formaran parte de la monografía de control de la calidad del polvo. En cada ensayo fueron procesadas 25 muestras, y los resultados aparecen en las tablas 3.1; 3.2, 3.3. Los cálculos estadísticos, usando el método de Bowker, permitieron determinar el límite superior de especificación. Los valores obtenidos, en cada caso, se muestran en la tabla 3.4. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.1: Resultados obtenidos al aplicar el método de Bowker para determinar el límite de especificación en el ensayo de pérdida por desecación. Pesafiltro Pesaf.+polvo 2horas 4horas vacio M2-M1(Final- Humedad Inicial) residual (%) 22.8413 23.8416 23.7796 23.776 0.0656 6.55803259 22.2827 23.2855 23.2228 23.2218 0.0637 6.352213801 23.5954 24.5954 24.5328 24.5318 0.0636 6.36000000 23.3877 24.4106 24.3471 24.3446 0.066 6.452243621 23.3892 24.3898 24.329 24.3275 0.0623 6.226264241 23.8225 24.8259 24.7653 24.7628 0.0631 6.288618696 23.1373 24.1381 24.077 24.0746 0.0635 6.344924061 23.4125 24.4135 24.3535 24.3509 0.0626 6.253746254 23.0339 24.0499 23.9882 23.9862 0.0637 6.269685039 22.4313 23.4416 23.3803 23.3782 0.0634 6.275363753 21.9266 22.9264 22.866 22.864 0.0624 6.24124825 23.3153 24.3245 24.2637 24.2613 0.0632 6.262386048 22.6514 23.724 23.66 23.6621 0.0619 6.137219909 22.8423 23.7447 23.6815 23.6808 0.0639 6.257344301 23.6247 24.6892 24.6251 24.6283 0.0609 6.087564974 23.4358 24.5111 24.4576 24.4491 0.062 6.12769322 23.496 24.5576 24.497 24.4934 0.0642 6.413586414 23.8136 24.8855 24.8298 24.8221 0.0634 6.300934208 231063 24.195 24.1325 24.1309 0.0641 6.246345742 23.5823 24.656 24.5946 24.5935 0.0625 6.174059073 23.0056 24.0759 24.0148 24.0112 0.0647 6.411018629 22.4936 23.5575 23.4962 23.4957 0.0618 6.18866413 22.1635 23.3831 23.3287 23.3222 0.0609 6.080271565 23.2854 24.3831 24.3218 24.3207 0.0624 6.020841374 22.4569 23.524 Media (X) : 6,2575 Desv.Standard(S): 0,1273 23.4636 23.4625 K = 3,1848 a = 0,9656 b = 6,5757 c = 0,5053 0.0615 6.109676137 LSE (Límite superior) LSE = X + KS LSE = 6.25+ 0,4054 LSE = 6,6631 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.2: Resultados obtenidos al aplicar el método de Bowker para determinar el límite de especificación en el ensayo de Cenizas totales. Pi Pf Pt Pf-Pi (Pf-Pi)100 (Pf-Pi)100/Pt 17,487 17,5545 1,0007 0,0675 6,75 6,74527831 17,727 17,7846 1 0,0576 5,76 5,76 18,7239 18,7916 1,0005 0,0677 6,77 6,76661669 22,0314 25,6408 22,0997 25,7006 1,0001 1,0004 0,0683 0,0598 6,83 5,98 6,82931707 5,97760896 15,7205 15,7881 1 0,0676 6,76 6,76 22,2423 22,3102 1,0004 0,0679 6,79 6,78728509 16,1753 16,2427 1,0002 0,0674 6,74 6,73865227 18,56 18,6255 1,0001 0,0655 6,55 6,54934507 19,3458 18,7564 19,41132 18,8249 1,0005 0,06552 1,00004 0,0685 6,552 6,85 6,54872564 6,84972601 17,502 17,569 1,0004 0,067 6,7 6,69732107 22,05 22,1149 1,0007 0,0649 6,49 6,48546018 18,7256 18,7908 1 0,0652 6,52 6,52 25,6256 25,6923 1,0001 0,0667 6,67 6,66933307 22,2923 15,7045 22,358 15,764 1,0005 1,0008 0,0657 0,0595 6,57 5,95 6,56671664 5,9452438 22,0892 22,1527 1 0,0635 6,35 6,35 16,1798 16,2463 1,0005 0,0665 6,65 6,64667666 17,4947 17,5612 1,0002 0,0665 6,65 6,64867027 18,528 18,5935 1 0,0655 6,55 6,55 19,2987 17,3967 19,3632 17,4645 1,0003 0,9987 0,0645 0,0678 6,45 6,78 6,44806558 6,78882547 16,2876 16,3512 1,0006 0,0636 6,36 6,35618629 17,487 17,5545 1,0007 0,0675 6,75 6,74527831 Media (X) : 6,54104392 Desv.Standard(S): 0,28815798 K= 3,1848 a = 0,9656 b = 6,5757 c = 0,5053 LSE (Límite superior) LSE = X + KS LSE = 6.54+ 0,9175 LSE = 7,4587 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.3: Resultados obtenidos al aplicar el método de Bowker para determinar el límite de especificación en el ensayo de Cenizas insolubles en Acido Clorhídrico. Pi Pf Pt Pf-Pi (Pf-Pi)100 (Pf-Pi)100/Pt 17,487 17,5073 1,0007 0,0203 2,03 2,02857999 17,727 17,7472 1 0,0202 2,02 2,02 18,7239 18,7477 1,0005 0,0238 2,38 2,37881059 22,0314 22,0484 1,0001 0,017 1,7 1,69983002 15,7205 15,7358 1 0,0153 1,53 1,53 22,2423 22,2664 1,0004 0,0241 2,41 2,40903639 16,1753 16,2027 1,0002 0,0274 2,74 2,73945211 16,6785 16,7019 1,0004 0,0234 2,34 2,33906437 9,6683 9,6875 1,0004 0,0192 1,92 1,91923231 9,1196 9,1454 1,0005 0,0258 2,58 2,57871064 16,7407 16,7639 1,0005 0,0232 2,32 2,31884058 16,5288 16,5487 1,0009 0,0199 1,99 1,98821061 21,1116 21,1388 1,0001 0,0272 2,72 2,71972803 17,6777 17,6996 1,0008 0,0219 2,19 2,1882494 18,5258 18,5525 1,0009 0,0267 2,67 2,66759916 9,4617 9,4898 1 0,0281 2,81 2,81 15,6934 15,7188 1,0004 0,0254 2,54 2,53898441 16,2354 16,2593 1,0002 0,0239 2,39 2,3895221 9,1167 9,1403 0,989 0,0236 2,36 2,38624874 21,1094 21,135 1,0007 0,0256 2,56 2,55820925 18,6835 18,7051 1 0,0216 2,16 2,16 22,0722 22,092 1 0,0198 1,98 1,98 15,691 15,7119 1,0004 0,0209 2,09 2,08916433 22,2145 22,2321 1,0008 0,0176 1,76 1,75859313 16,1545 16,1801 1,0005 0,0256 2,56 2,55872064 Media (X) : 2,27019 Desv.Standard(S): 0,345541 K = 3,1848 a = 0,9656 b = 6,5757 c = 0,5053 LSE (Límite superior) LSE = X + KS LSE = 2,27019+1,1003 LSE = 3,3704 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Al comparar los mismos con los valores registrados para ingredientes activos, de origen natural, reportados en las farmacopeas vigentes se puede afirmar que, hay total correspondencia. La tabla 3.5, ANEXO E, contiene valores registrados por la Farmacopea Europea, 2003 y la Farmacopea Británica, 2004 para ingredientes activos (polvos) que provienen de diferentes partes de la planta medicinal de la cual se obtienen. Dichos valores difieren significativamente de los ingredientes activos sintéticos lo que se explica, fundamentalmente, por la composición variada que poseen los de origen natural que incluye en su generalidad compuestos orgánicos e inorgánicos. Tabla 3.4. Resultados obtenidos en la determinación de los límites de especificación para los ensayos específicos que formaran parte de la monografía de control de la calidad del polvo. Parámetro X±SD LSE Pérdida por desecación 6,2575 ± 0,1273 6,6631 Cenizas Totales 7,4587 6,5410 ± 0,2881 Cenizas insolubles en 0,27019 ± 0,345541 3,3704 HCL X: Media; SD: Desviación Standard; LSE: Limite superior de especificación. 3.1.3. Establecimiento de condiciones de la CCD y la Espectrofotometría UVVIS. Teniendo en cuenta que los aminoácidos constituyen los metabolitos de mayor interés presentes en el polvo objeto de estudio y además el amplio uso que posee la reacción de Ninhidrina para la detección de estos compuestos a continuación se presentan estudios analíticos que permitieron establecer las condiciones idóneas para aplicar esta reacción en la identificación y cuantificación de aminoácidos presentes en el polvo Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Cromatografía en Capa Delgada. Con el objetivo de identificar que aminoácidos estaban presentes en el sólido pulverulento obtenido de las semillas de Cucurbita moschata Duch fue evaluada la metodología usada por Duez, 1992, lo que se explica porque la misma permite determinar la presencia de Cucurbitina en el extracto, aportando valores de Rf que sirven como datos de referencia muy valiosos ante la carencia de este producto como patrón comercializable. De los 21 patrones de aminoácidos evaluados, incluyendo la Cucurbitina, se realizó una selección teniendo como criterios fundamentales los valores de Rf de los patrones coincidentes o no con los valores obtenidos para las manchas de la muestra. De esta forma fueron eliminados los aminoácidos Cisteina, Metionina, Arginina, Histidina, AcidoGlutámico, L-fenilamina, Valina, y L-Tirosina ya que los mismos ofrecieron valores de Rf que difieren significativamente de los obtenidos para la muestra. Por otra parte fue valorada la formación o no del complejo Ruhemann´s purple (RP) al reaccionar con la Ninhidrina, ya que según la literatura consultada los aminoácidos con características estructurales y químicas similar a la Cucurbitina (Prolina, Hidroxiprolina, Asparagina, Arginina e Histidina, entre otros) no forman dicho complejo ofreciendo coloraciones que van del amarillo al pardo. De los 12 valorados Friedman, 2004, reporta que la Glicina, Alanina, Leucina, Serina y treonina forman el complejo azul violeta, mientras el resto (Asparagina, Lisina, Prolina, Hidroxiprolina y la Cucurbitina no lo forman, existiendo de derivados específicos caracterizados para cada caso (Figura 1, Anexo D). Teniendo en cuenta que la Cucurbitina es un aminoácido pirrolidínico similar a la Prolina y la Hidroxiprolina se puede deducir la no formación del complejo por parte de este aminoácido, ya que depende del tiempo de calentamiento y la Temperatura por lo que la coloración obtenida en algunos casos puede que no sea la definitiva. En este sentido se destaca la coloración pardusca de los aminoácidos pirrolidínicos (Prolina, Hidroxiprolina y Cucurbitina) y amarilla de la Lisina y Asparagina, aminoácidos definidos por Friedman, 2004 entre los que reaccionan con la Ninhidrina pero no ofrecen la coloración azul violeta característica del complejo RP. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.6. Valores de Rf obtenidos para los patrones de aminoácidos evaluados utilizando las condiciones cromatográficas Amino ácido RF Asparagina 0.47 Glicina 0.47 Alanina 0.57 Leucina 0.74 Serina 0.49 L-Lisina 0.16 Prolina 0.46 Triptofano 0.75 Hidroxiprolina 0.5 Treonina 0.58 Cucurbitina 0.21 Muestra 0.21; 0.35; 0.48; 0,58; 0.75 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou A B M: Muestra Cu. Cucurbitina Li: Lisina G: Glicina M: Muestra S: Serina P: Prolina M: Muestra H: Hidroxiprolina Tre: Treonina M: Muestra As: Asparagina Al: Alanina M: Muestra Le: Leucina M: Muestra Tri: Triptófano Figura 2: Placas de CCD que muestran las manchas correspondientes de los patrones de aminoácidos y de la muestra. A: Foto tomada; B: Foto con color ajustado. Al observar la figura 3 se pueden realizar algunas observaciones para hacer las asignaciones correspondientes a las manchas detectadas en la muestra problema, para lo cual se tiene en cuenta también los valores Rf calculados para cada patrón de aminoácido y para cada mancha de la muestra y que aparecen descritos en la tabla 3.6. E n la figura 3-A la primera mancha es asignada a la Cucurbitina ya que su valor se corresponde con el reportado por Duez, 1992 y que fue confirmado por Renimel, 1998. De los aminoácidos estudiados la Lisina aparece en la misma Trabajo de Diploma de Pierre Dramou zona con valor de Rf muy cercano, esto representa una alerta como posible interferencia aunque la diferencia en la coloración de la mancha que poseen ambos aminoácidos nos permite corroborar la existencia de la Cucurbitina. Las figuras 3-B, 3-C y 3-D por su parte nos permite observar las posibles asignaciones de la tercera mancha que constituye la de mayor coincidencia en valores Rf Glicina, Serina, Prolina, Hidroxiprolina y Asparagina constituyen los aminoácidos candidatos a estar presentes en el extracto ya sea aislado o en mezcla, esto tendrá que ser definido en estudios posteriores usando esta misma técnica. La Figura 3-D y 3-E representan las manchas correspondientes a los patrones de los aminoácidos Treonina y Alanina las cuales poseen valores de Rf similares a la cuarta mancha de la muestra, mientras que la Figura 3-F muestra las manchas de los patrones Leucina y Triptófano como posibles candidatos de corresponderle la última mancha encontrado bajo las condiciones cromatográficas utilizadas. Es importante destacar que la segunda mancha no posee asignación de aminoácidos, pero su nitidez permite suponer que se trata de un compuesto nitrogenado capaz de reaccionar con la ninhidrina, dentro de los cuales se encuentran algunas aminas aromáticas, análogos policíclicos como la guanosina, Citosina y Citidina, etc. por solo citar algunos compuestos que pueden ofrecer esta reacción. Lo anterior ha sido demostrado por múltiples autores entre los que se destaca el trabajo publicado por Samejima, K, 1972 y mas recientemente los estudios realizados por Kaupp, G, 2002 que demuestra el amplio espectro que posee esta reacción. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Lis. 3-A: Mue. Cuc. 3-D: Tre. Mue. Asp. 3-A Lis. Lisina Mue. Muestra Cuc. Cucurbitina 3-B Gli. Glicina Mue. Muestra Ser. Serina 3-B: Mue. Ser. Gli. 3-E: Ala. 3-C Pro. Prolina Mue. Muestra Hid. Hidroxiprolina Mue. 3-D Tre. Treonina Mue. Muestra Asp. Asparagina Pro. 3-C: Mue. 3F: Leu. Mue. 3-E Ala. Alanina Mue. Muestra Hid. Tri. 3-F Leu. Leucina Mue. Muestra Tri. Triptófano Figura 3. Placas de CCD que muestran las manchas correspondientes de los patrones de aminoácidos y de la muestra. La identificación de la Cucurbitina en la muestra resulta de gran importancia si se considera que este aminoácido es el responsable de la acción antihelmíntica, mientras que la presencia de la Prolina, Hidroxiprolina, y Asparagina, con Trabajo de Diploma de Pierre Dramou características estructurales similares a la Cucurbitina, ofrecen la posibilidad de usar estos aminoácidos como patrones analíticos en la determinación del contenido total de aminoácidos en el polvo. Espectrofotometría UV-VIS. Esta técnica fue usada para la cuantificación de los aminoácidos totales presentes en el polvo, en unidades de Asparagina. La selección de este aminoácido como patrón obedece a varias razones: La Cucurbitina , metabolito responsable de la acción antihelmíntica, no se comercializa lo que dificulta su uso como patrón analítico; La Asparagina fue valorado dentro de los aminoácidos presentes en el polvo por CCD y manifestó características de absorción similares a la muestra bajo las condiciones estudiadas, además, posee similitud estructural y química con la Cucurbitina. La técnica espectrofotométrica incluyó una derivatización previa de los aminoácidos usando la Ninhidrina como agente cromogénico. Fue aprovechado la diferencia en la coloración que aporta esta reacción para un pequeño grupo de aminoácidos, incluidos los pirrolidínicos, lo que permite realizar la determinación a 320 nm. Esto último incrementa la especificidad para estos aminoácidos si se tiene en cuenta que la Ninhidrina ofrece una coloración, con el resto de los aminoácidos, azul intensa cuyo máximo de absorción es a 570nm. Establecimiento de las condiciones experimentales de la técnica Según la literatura consultada la reacción de Ninhidrina se ve afectada por varios factores que provocan variaciones en la intensidad y estabilidad del cromógeno formado, tales como la temperatura, el tiempo de calentamiento y la concentración de Ninhidrina, Friedman, 2004, Jones, et al.,2002 y Moulin et al. 2002, entre otros. Esto justificó el desarrollo de un diseño factorial 23 con vistas a precisar las condiciones óptimas para desarrollar dicha reacción. Previo al diseño y con vistas a precisar los niveles máximos y mínimos del mismo se realizaron algunas valoraciones de resultados experimentales obtenidos al aplicar la técnica. A). El Comportamiento de absorción de la muestra al variar la Temperatura aparece reflejado en la figura 4. Como se puede observar bajas temperaturas, por Trabajo de Diploma de Pierre Dramou debajo de 40 y altas, por encima de 60 producen cambios significativos en la absorción, obteniéndose una meseta en el intervalo comprendido entre estas dos temperaturas. (Datos tomados de la tabla 3.7, Anexo E). Reaccion de la muestra (agua)y la Ninhidrina a diferentes Tempeturas Absorbancia 1 0,8 0,6 Serie1 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Temperatura Figura 4. Reacción de la muestra y la Ninhidrina a diferentes Temperaturas. B). El comportamiento de la Absorbancia de la muestra al variar el tiempo de calentamiento aparece descrito en la figura 5 (Datos tomados de la tabla 3.8, Anexo E). El estudio fue realizado para el rango de Temperatura obtenido en el ensayo anterior como más estable (Desde 40 a ’700C) realizando las lecturas a los 5 minutos después de terminada la reacción. De la gráfica se pueden realizar las siguientes observaciones: El tiempo de calentamiento necesario para lograr los valores más altos de absorbancia va disminuyendo con el aumento de la temperatura por lo que el menor tiempo es requerido para la temperatura 700C. Por su parte los valores de absorbancia aumentan con la temperatura hasta 600C, mientras que a 700C comienzan una ligera disminución que se acentúa a medida que aumenta la temperatura. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou comportamiento de la absorbancia al variar el tiempo de calentamiento. 0,6 Absorbancia 0,5 Temperatura 40 0,4 Temperatura 50 0,3 Temperatura 60" 0,2 temperatura 70 0,1 0 0 20 40 60 80 tiempo Figura 5. Comportamiento de los valores de absorbancia al aumentar el tiempo de calentamiento para las diferentes temperaturas evaluadas. C) Con vistas a evaluar la estabilidad del color obtenido en la reacción de Ninhidrina fueron realizadas mediciones durante 90 minutos con un intervalo de 10 minutos. Como se observa en la tabla 3.9, Anexo E produce ligeras variaciones en los valores de absorbancia lo que se observa en la figura 6 Absorbancia Comportamiento de la absorbancia al aumentar el tiempo de lectura 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Serie1 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tiempo Figura 6. Comportamiento de la absorción de la muestra al variar el tiempo de calentamiento a las temperaturas evaluadas. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Finalmente se realizó un análisis de los aminoácidos evaluados en la Cromatografía en Capa Delgada con vistas a la selección de uno de ellos para su uso como patrón analítico. De los aminoácidos estudiados fueron tomados en consideración aquellos que reaccionaban de forma similar a la Cucurbitina, ante la reacción de Ninhidrina, es decir no formaban el complejo RP; en este caso se encontraba la Prolina, Hidroxiprolina, Lisina, y la Asparagina El análisis consistió en valorar el espectro de absorción que presentaban estos aminoácidos , en el rango de 300 a 400nm, con vistas a compararlo con la muestra, teniendo en cuenta que el espectro de la misma aporta una λmáx de 320. La figura 12 muestra dichos espectros (Datos tomados de la tabla 3.10, Anexo E), como se observa la Prolina e Hidroxiprolina presentan una λmáx aproximado de 350, mientras que la Lisina muestra un espectro con una λmáx difícil de definir entre 320 y 340. Por su parte la Asparagina posee un espectro muy parecido a la Cucurbitina y a la muestra coincidiendo con su λmáx de 320. Teniendo en cuenta la no disponibilidad de la Cucurbitina como patrón Todo lo anterior permite la selección de este aminoácido como patrón analítico en la determinación cuantitativa de los aminoácidos del polvo. Espectro UV de los aa(valorados para patrón ) y la muestra Absorbancia 1 0,8 Asparagina 0,6 "Lisina" 0,4 Prolina Hidroxiprolina 0,2 Cucurbitina Muestra 0 -0,2 300 320 340 360 380 400 Longitud de onda Figura 7. Espectros de absorción de la muestra y los aminoácidos Asparagina, Lisina, Prolina, Hidroxiprolina y Cucurbitina en la zona de 300 a 400 nm. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Los estudios preliminares realizados para el establecimiento de las condiciones de la técnica Espectrofotométrica ayudaron a la selección de los niveles en cada uno de las variables que fueron incluidas en el diseño de experimentos con vistas a establecer las condiciones óptimas para el desarrollo de la técnica. La temperatura incluyó el rango entre 40 y 600C teniendo en cuenta que a temperaturas menores y mayores ocurren disminuciones en los valores de absorbancia. Por su parte el tiempo de calentamiento no debe ser menor de 10 minutos ni mayor de 50, mientras que el tiempo de lectura debe realizarse entre el primer minuto de haber desarrollado la reacción y los 15 minutos posteriores. Estos valores permitieron desarrollar un diseño experimento 23 usando la matriz descrita en la tabla 3.11, Anexo E, en la cual aparecen los resultados obtenidos en la variable respuesta utilizando, la absorbancia. La información ofrecida por el diseño, al procesar dichos resultados usando el paquete estadístico Statgraphics 6.1, se recoge en la tabla 3.12 del Anexo C. el análisis de varianza muestra que 4 de los efectos poseen valores de probabilidad menor que 0,05, indicando que ellos son significativamente diferentes a cero para un nivel de significación del 95%. El valor obtenido para r resultó ser muy bueno ya que el modelo obtenido explica el 99,29 de las variabilidades de la absorbancia., mientras que el test de Durbin-Watson aportó un valor superior a 1,4 lo que indica que no hay serios autocorrelaciones en los residuales. Para la optimización del modelo fue usado el método ascendente y los resultados muestran que los valores óptimos de trabajo para desarrollar la reacción de Ninhidrina, con vistas a su uso en la técnica espectrofotométrica, son: Temperatura 600C, tiempo de calentamiento 10,15 minutos y tiempo de lectura 1 minuto. 3.1.4. Validación de la técnica espectrofotométrica para su uso como ensayo cuantitativo en la monografía analítica Una vez que el método fue puesto a punto se procedió a su validación para lo cual fue usada la metodología descrita por las normas ICH, 1996, las cuales sugieren la evaluación de los parámetros linealidad, precisión, exactitud y sensibilidad. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Linealidad La figura 8 muestra la curva de calibración obtenida al evaluar el parámetro linealidad en la técnica espectrofotométrica usada para la determinación de los aminoácidos en el polvo, en base a Asparagina. Los criterios estadísticos utilizados para evaluar el parámetro aparecen en la tabla 3.13. Si se comparan los valores obtenidos en cada parámetro con los criterios establecidos por las normas ICH, 1996, se puede afirmar que en todos los casos se encuentran dentro de un rango especificado. Fue obtenida Abs= 0,1002Conc - 0,0327 con coeficiente de correlación superior a 0.99 y el coeficiente de variación de los factores respuesta inferior al 5%. La fiabilidad de la ecuación fue evaluada, además, a través del error típico cuyo valor es muy inferior a la desviación Standard de la variable Y, a través de la desviación standard de la pendiente que es menor que el 2% y los límites del término independiente que incluyen al cero. De todos estos criterios se deduce que la técnica cumple con los requisitos establecidos para el ensayo de linealidad en el rango de concentraciones de 20 ppm a 100ppm; es decir, el método es “lineal¨. Curva de calibración para evaluar linealidad A b s o rb a n c ia 1,2 y = 0,1002x - 0,0327 R2 = 0,9987 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentración (ppm) Figura 8. Curva de calibración para la determinación de aminoácidos por espectrofotometría UV.VIS. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.13. Resultados de los criterios estadísticos obtenidos al evaluar la linealidad en la técnica espectrofotométrica. Concentración Valores de absorbancia del patrón Ecuación de la recta Curva 1 Curva 2 Curva 3 (ppm) Y = 0,1002 X - 0,0327 2 0,177 0,185 0,16 42 0,355 0,372 0,365 6 0,567 0,564 0,564 8 0,772 0,762 0,750 10 0,986 0,981 0,964 Estadística de la regresión Coeficiente de correlación múltiple 0,999360 C.V.F (%) R2 ajustado 0,998721 Grados de libertad Regresión Residuos Total 1 13 14 Error típico 0,01088 4,9910 Análisis de varianza Suma de Promedio de cuadrados los cuadrados 1,204003333 1,204003333 0,0015416 0,000118585 1,205544933 Análisis del Intercepto Coeficientes Error típico -0,032733333 0,006594014 0,100166667 0,000994085 Sbrel % a ± tSa 0,016257 -0.032 + 0.011 F 10153,11581 Valor crítico de F 3,39617E-20 Estadístico t Probabilidad Intercepción -4,96409796 0,000258887 Variable X 1 100,7626707 3,39617E-20 Criterios establecidos: ri;Coeficiente de correlación ri ≥ 0,99 ; C.V.F: Coeficiente de variación de los factores de respuestas C.V.F ≤ 5% Sbrel %: Desviación estándar relativa de la pendiente. Sbrel %≤ 2% b ± tSb: Límites de confianza del intercepto (Incluir el cero) Error típico (0 ≤ error típico ≤ Sy (Sy desviación Standard de Y) Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Precisión: Este parámetro incluye los términos repetibilidad y precisión intermedia. Para el primer caso la técnica fue repetida sin alterar las condiciones, mientras que en el segundo la técnica fue desarrollada por diferentes analistas y en diferentes días. La Tabla 3.14 muestra los resultados estadísticos obtenidos al evaluar ambos parámetros. El coeficiente de variación obtenido para la repetibilidad resultó ser menor que el establecido para este ensayo cuando es realizado a materias primas farmacéuticas (1,5%) lo que indica que la técnica posee buena repetibilidad. Por su parte en la precisión intermedia se obtuvo también un coeficiente de variación inferior al establecido (3%), además en este parámetro fueron evaluadas otros parámetros estadísticos que garantizan la veracidad de los resultados y cuyos stadígrafos aparecen también reflejados en la tabla 3.14. La prueba Fischer muestra resultados satisfactorios al obtenerse una Fcal < FCritica, La prueba Cochrans también aportó resultados positivos al obtenerse una Ccal < CCritica . Finalmente al analizar el Coeficiente de variación entre los grupos (días) este resultó ser menor que el valor obtenido para el estadígrafo del Test de Horwitz ratificando con esto la veracidad del resto de las pruebas. Los resultados obtenidos en ambos parámetros permiten asegurar que la técnica espectrofotométrica para la determinación de aminoácidos, en base Asparagina, en el polvo de Cucurbita moschata Duch es “precisa”. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.14. Resultados estadísticos obtenidos al evaluar el parámetro precisión en la técnica espectrofotométrica. REPETIBILIDAD Réplica 1 Réplica 2 Parámetros estadísticos 0,453 0,451 Media 0,446 0,436 0,451 S = 0,006 0,438 0,439 CV(%) = 1,44 0,451 0,443 Horwitz = 4,52 0,45 0,452 0,439 0,448 PRECISIÓN INTERMEDIA Día 1 Día 1 Día 2 (Analista Día 2 2) (Analista 1) (Analista 1) (Analista 2) 0,463 0,451 0,446 0,438 0,436 0,451 0,45 0,442 Media 0,445 0,439 0,438 0,435 0,436 S= 0,009 0,443 0,451 0,439 0,439 CV(%) = 2,10 0,439 0,467 0,432 0,45 Horwitz = 4,52 0,448 0,432 0,453 0,456 Análisis de varianza de un factor RESUMEN Grupos Cuenta Columna 1 6 Columna 2 6 Columna 3 6 Columna 4 6 Origen de Entre Dentro de Total Suma de 9,78333E-05 0,001916667 0,0020145 Suma Promedio Varianza 2,687 0,447833333 0,000218967 2,671 0,445166667 3,13667E-05 2,655 0,4425 7,15E-05 2,661 0,4435 6,15E-05 Análisis de varianza Grados Promedio de F Probabilidad Valor crítico 3 3,26111E-05 0,340289855 0,79642432 3,098391224 20 9,58333E-05 23 Dentro de los Grupos S =0,010% ; CV(%) =2,201 Entre los Grupos S = 0,004% ; CV(%) = 0,94 Cochrans (C calculada) 0,571217391 Cochrans (C crítica) 0,59 Horwitz 4.52 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Especificidad La especificidad fue evaluada a través de un estudio de interferencias, usando la Cromatografía en Capa Delgada (CCD) como técnica auxiliar. Fue valorado el comportamiento en la absorción de los patrones de aminoácidos, detectados en la muestra, en la zona del espectro donde se realiza la determinación (Figura 7). De los 12 aminoácidos valorados por CCD con posibilidades de estar presentes en la muestra solo 5 presentan máximos de absorción en la zona de interés del espectro, el resto forma el complejo RP y por tanto presentan su máximo en el rango de 500-600nm. Los restantes 5 (Prolina, Hidroxiprolina, Cucurbitia, Lisina y Asparagina presenta todos absorción aunque en diferentes magnitudes. Este hecho experimental demuestra la especificidad del método de cuantificación si se tiene en consideración que la técnica esta dirigida a la determinación de la cantidad total de aminoácidos, en base a uno de ellos, la Asparagina. Sensibilidad. Límite de detección (LD) y de cuantificación (LC). Los resultados del LD y LC se recogen también en la Tabla 3.15, como se puede apreciar ambos límites se encuentran por debajo del valor más bajo de concentración evaluado en la técnica, lo que ofrece garantía de que el rango evaluado es fiable. Tabla 3.15. Resultados estadísticos obtenidos al evaluar el parámetro sensibilidad en la técnica espectrofotométrica. Limite de Limite de detección cuantificación Resp. Desv Blanco Media Standard Pendiente (LD) (LC) 0,023 0,0225 0,001080123 0,1005 0,03546674 0,10747497 0,023 0,022 0,022 0,024 0,023 0,02 0,023 0,023 0,022 Después de comprobar que la técnica espectrofotométrica evaluada para determinar el contenido de aminoácidos, en base a Asparagina, cumple con los parámetros Linealidad, Precisión, Especificidad y Sensibilidad con resultados muy Trabajo de Diploma de Pierre Dramou satisfactorios en todos los casos, se decidió no evaluar el parámetro exactitud teniendo en cuenta que las normas ICH, 1996 sugieren que se puede inferir que la técnica es exacta cuando han sido evaluados los cuatro parámetros restantes. 3.2. Descripción de la monografía de control de calidad para el polvo de Cucurbita spp. Una vez seleccionados los ensayos cualitativos que formarían parte de la identificación de los componentes del polvo, se establecieron los límites de especificación de los ensayos específicos y se validó la técnica espectrofotométrica, como ensayo cuantitativo, se procedió a redactar la monografía de control de la calidad del sólido pulverulento obtenido a partir de las semillas de Cucurbita moschata Duch, la cual fue estructurada siguiendo la metodología de las farmacopeas vigentes. A continuación se describe dicha monografía. Semillas de Cucurbita, polvo. DEFINICIÓN El sólido pulverulento de Cucurbita moschata Duch, es preparado a partir de las semillas de esta planta, después de ser sometidas a procesos de desengrase, molinado y tamizado. El polvo contiene no menos del de aminoácidos totales expresado en base al contenido de Asparagina y calculado con referencia a la almendra de las semillas. CARACTERÍSTICAS Polvo amarillo pardusco, con un ligero olor aceitoso, muy característico. Sus características y microscópicas aparecen descritas en la prueba de identificación A. IDENTIFICACIÓN A. Análisis Microscópico: El polvo es amarillo pálido. Al examinar al microscopio, utilizando disolución de hidrato de cloral R, el polvo presenta los elementos siguientes: Parénquima lignificado y gránulos de almidón en forma anisotrópica (examinado con luz polarizada). Trabajo de Diploma de Pierre Dramou B. Reacción de Foling: Se pesan 0.05 g de extracto y se añade 1 mL de solución reactivo de Foling (1:3) y 2.5 mL de NaOH 0.5 M. Un ensayo positivo estará indicado por una coloración azul intensa. C. Reacción con Ninhidrina: Se pesan 0.05 g del extracto en 1 mL de Ninhidrina y se calienta en baño María (a partir de 600). Aparece una coloración azul violáceo a los 2 minutos de calentamiento. D. Cromatografía en capa Delgada La CCD, en este caso, tiene como objetivo detectar las sustancias, presentes en la muestra, que reaccionan con la Ninhidrina, especialmente los aminoácidos que no forman el Complejo RP con este reactivo. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS: Fase estacionaria: Placa de gel de sílice GF para cromatografía en capa fina. Fase móvil: Metanol-Cloroformo-Amoníaco al 25%-Ácido Acético Glacial (80:10:8,5:1,5). PROCEDIMIENTOS: Muestra problema: Disolver 1,0 gramo del sólido pulverulento en 40,0 mililitros de agua, agitar durante 30 minutos a 500C, centrifugar durante 30 minutos y colectar el sobrenadante. Repetir el procedimiento, añadiendo por la segunda extracción 20,0 mililitros de agua al extracto residuo, juntar los sobrenadantes y añadir 20,0 mililitros de metanol, colocar en refrigeración por 12 horas, centrifugar de nuevo 30 minutos para eliminar las proteínas, filtrar. Rotoevaporar el solvente, redisolver en 2,0 mililitros de una mezcla Metanol: Agua (1:1) y filtrar. Muestra referencia (patrón): Disolver 10,0 miligramos de los patrones en 2,0 mililitros de Metanol: Agua (1:1). Aplicación: 2,0 μl para muestra referencia una vez, 2,0 μl para muestra problema dos veces. Desarrollo: Aplicar por separado a la placa 2,0 μl de muestra problema y 4,0 μl de cada disolución de muestra patrón. Dejar secar la placa al aire. Desarrollar hasta una distancia de 10,0 centímetros Secado: Al aire durante 15 minutos. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Detección: Asperjar con la disolución de Ninhidrina al 2%, disuelta en una mezcla Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), Calentar de 40 °C a 60 °C durante 5 minutos. Resultados: Las manchas principales en el cromatograma obtenido con la disolución problema son similares en posición y tamaño a las manchas principales de las disoluciones de referencia probadas. ENSAYOS ESPECIFICOS Cenizas Totales. El contenido de cenizas totales no es superior al 6,0 por ciento, determinada en 1 gr. Cenizas insolubles en ácido Clorhídrico. El contenido en cenizas insolubles en ácido sulfúrico no es superior al 3 por ciento, determinada en 1 gr. Pérdida por desecación. No más del 7,0 por ciento, determinada en 0,5 g de la droga por desecación en estufa a 100-105 ºC durante 2 horas. VALORACIÓN Muestra problema: Se pesan 2,0 gramos del sólido pulverulento, se añaden 20,0 mililitros de Agua destilada y se agita durante 30 minutos a 50 0C. Se centrifuga a 6000 r.p.m durante 30 minutos y se separa el sobrenadante. Se repite el procedimiento y se juntan los sobrenadantes. Se añade 40,0 mililitros de metanol y se mantiene en refrigeración durante 12 horas. Se centrifuga a 6000 r.p.m durante 15 minutos y se separa el sobrenadante. Se rotoevapora a sequedad y se redisuelve el residuo en 2,0 mililitros de Metanol: Agua (1:1) Muestra referencia: Diluir 5,0 miligramos de Asparagina en una mezcla Metanol: Agua (1:1) hasta completar 10, 0 mililitros (Solución A). Transferir 200 µL de la solución A a un volumétrico de 10 y completar volumen con el mismo solvente. Derivatización de la muestra patrón: Se toman 1, mL de la solución patrón, se le adiciona 0,5 mililitros de Ninhidrina (Solución preparada al 0,5% en una mezcla de Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), se calienta a 40 0C por 40 minutos y se enrasa a 2,0 mililitros con solución Metanol: Agua (1:1) Derivatización de la muestra problema: Se toman 0,25 µL de la muestra disuelta en Metanol: Agua (1:1) y de la muestra referencia (b), se adiciona 0,5 mililitros de Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Ninhidrina (Solución preparada al 0,5% en una mezcla de Acetona: Agua: Ácido Acético (80:18:2), se calienta a 60 0C por 40 minutos y se enrasa a 2,0 mililitros con solución Metanol: Agua (1:1) Método operativo: Medir la absorbancia de la muestra por comparación con la disolución de referencia a 320nm, frente a la solución de Ninhidrina como blanco. Calcular el contenido en porcentaje de aminoácidos, calculado en base a Asparagina, a partir de la siguiente expresión: CM = C P ⋅ A M ⋅1.6 ⋅100 AP ⋅ M M Donde: CM: Concentración de la muestra problema, en % CP: Concentración de la muestra patrón, en mg/ml AM: Absorbancia de la muestra problema AP: Absorbancia de la muestra patrón MM: Masa de la muestra problema, en mg CONSERVACIÓN En envase hermético. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou 3.3. Comparación del sólido pulverulento, obtenido en el presente trabajo, y el polvo registrado en la guía de Fitofármacos y Apifármacos del Ministerio de salud pública de Cuba (MINSAP) Finalmente se realizó una comparación del sólido pulverulento, obtenido en el presente trabajo, y el polvo registrado en la guía de Fitofármacos y Apifármacos del Ministerio de salud pública de Cuba (MINSAP) usado como ingrediente activo en los papelillos que se comercializan en Cuba usando los ensayos específicos validados. Los resultados obtenidos aparecen descritos en la tabla 3.16. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.16: Comparación de los resultados obtenidos en los ensayos específicos del sólido pulverulento y el polvo registrado en la guía de fitofármacos y apifármacos. Perdida por desecación Cenizas Totales Cenizas Insolubles Polvo polvo Polvo polvo Registrado obtenido Registrado obtenido 6,2966 6,8293 8,4878 6,7452 6,1783 6,76 8,7054 5,76 6,2991 6,7872 8,6988 6,7666 6,27 6,5487 8,2 6,8293 6,3166 6,8497 8,1984 5,9776 6,1375 6,6973 8,5555 6,76 6,2258 6,4854 8,5561 6,7872 6,0891 6,6693 8,4172 6,7386 6,03 6,7396 8,4078 6,4512 6,2575 6,52 8,7239 6,2351 Media Media Media Media Polvo Registrado 3,7485 1,6493 2,3593 3,878 2,1189 2,9797 2,1582 2,4477 2,82 2,3526 polvo obtenido 3,0278 2,02 2,3788 2,6998 1,535 2,409 2,7388 1,963 2,0654 2,0056 Media Media 6,41005± 0,03714403 2,65122± 0,03652778 2,28432± 0,09195 6,68865± 0,14882756 5,49509± 0,51016522 6,50508± 0,201845851 Resultados de la Prueba t aplicada a cada ensayo. Perdida por desecación Observaciones : 10 Diferencia hipotética de las medias; 0 Grados de libertad: 11 Estadístico t: -1,964391124 P: 0,037624342 Valor crítico de t : ,795884814 Cenizas Totales Observaciones: 10 Diferencia hipotética de las medias: 0 Grados de libertad: 13 Estadístico t: -7,406171634 Valor de P: 2,57418E-06 Valor crítico de t: 1,770933383 Cenizas Insolubles Observaciones: 10 Diferencia hipotética de las medias: 0 Grados de libertad: 15 Estadístico t: 1,3750052 Valor de P: 0,09466059 Valor crítico de t: 1,75305033 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Los resultados estadísticos muestran que para los ensayos Pérdida por desecación y Cenizas insolubles no hay diferencias significativas con valores de probabilidad por encima de 0.05, Sin embargo las cenizas totales si presentan diferencias entre ambos polvos lo que pudiera estar dado porque el polvo registrado no es sometido a proceso de desengrase. Este proceso se realiza para separar el aceite presente en las semillas pero con el mismo son eliminados una gran cantidad de componentes solubles entre los cuales pudieran estar compuestos inorgánicos presentes en las semillas, lo que propiciaría los valores más bajos que posee el polvo obtenido en el presente trabajo con respecto al polvo registrado. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou CONCLUSIONES Se determinaron los límites de especificaciones de las pruebas específicas, que formaran parte de la monografía analítica del polvo, obteniéndose valores adecuados para un ingrediente activo de origen natural. Fueron identificados, usando la Cromatografía en Capa Delgada, .los aminoácidos de mayor interés presentes en el polvo: Cucurbitina, Prolina, Hidroxiprolina, Asparagina y Lisina. Fueron seleccionados como condiciones óptimas para el uso de la reacción con Ninhidrina en el ensayo cuantitativo de la Monografía: Temperatura 600C, tiempo de calentamiento 20 minutos y tiempo de lectura 1 minuto. La técnica espectrofotométrica cumple con los parámetros establecidos para ser incluida como ensayo cuantitativo de la Monografía. El sólido pulverulento y el polvo registrado poseen resultados similares en los ensayos Perdida por desecación y Cenizas insolubles pero muestran diferencias en las Cenizas totales. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou RECOMENDACIONES Proponer a los laboratorios fitofarmacéuticos del país la monografía obtenida, con vistas a su uso en el control de calidad del polvo de la Cucurbita moschata Duch, ingrediente activo de los papelillos elaborados en dichos laboratorios y usados por su acción antihelmíntica. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ANEXOS ANEXO A MONOGRAFIA, ejemplo 1 BELLADONA, POLVO NORMALIZADO DE Belladonnae pulvis normatus DEFINICIÓN El polvo normalizado de belladona se obtiene a partir de la hoja de belladona pulverizada, ajustado, si es necesario, con lactosa en polvo o un polvo de hoja de belladona de bajo contenido en alcaloides, a un valor del 0,28 al 0,32 por ciento de alcaloides totales expresados en Hiosciamina (Mr 289,4) y referidos a la droga seca. CARACTERÍSTICAS El polvo normalizado de belladona tiene un olor ligeramente fétido IDENTIFICACIÓN A. El polvo es verde oscuro. Examinar al microscopio utilizando disolución de hidrato de cloral R. El polvo presenta los elementos siguientes: fragmentos de limbo formado por células epidérmicas con paredes sinuosas, con cutícula estriada y numerosos estomas, sobre todo en la epidermis inferior (anisocíticos y también algunos anomocíticos); pelos tectores pluricelulares, uniseriados, con paredes lisas y finas y pelos secretores con cabeza unicelular y base pluricelular, uniseriada, o con cabeza pluricelular y base unicelular; células del parénquima entre las que se encuentran células redondeadas con microcristales arenáceos de oxalato de calcio; vasos gruesos anulares y espiralados. La droga pulverizada puede presentar igualmente: vasos gruesos reticulados y fibras procedentes de los tallos; granos de polen subesféricos de un diámetro de 40 μm a 50 μm, con tres poros germinativos, tres surcos y exina provista de numerosas perforaciones; fragmentos de corola con epidermis papilosa o provista de numerosos pelos tectores o secretores de los tipos descritos anteriormente; fragmentos de semillas, Trabajo de Diploma de Pierre Dramou pardo-amarillentas, que contienen células del tegumento irregularmente esclerificadas y perforadas. B. Agitar 1 g de la droga pulverizada con 10 ml de ácido sulfúrico 0,05 M durante 2 min. y filtrar. Añadir al filtrado 1 ml de amoníaco concentrado y 5 ml de agua. Agitar con 15 ml de éter, con precaución para evitar la formación de emulsión. Separar la fase etérea y desecarla sobre sulfato de sodio anhidro. Filtrar y evaporar el éter en una cápsula de porcelana. Añadir 0,5 ml de ácido nítrico fumante y evaporar a sequedad en baño de agua. Añadir 10 ml de acetona y, gota a gota, una disolución de 30 g/l de hidróxido de potasio en alcohol. Aparece una intensa coloración violeta. C. Examinar el cromatograma obtenido en el ensayo “Cromatografía”. Las bandas principales de los cromatogramas obtenidos con la disolución problema son semejantes, en posición, coloración y dimensiones, a las bandas principales de los cromatogramas obtenidos con el mismo volumen de la disolución de referencia. ENSAYOS Cromatografía. Examinar por cromatografía en capa fina (2.2.27), utilizando gel de sílice GF. Disolución problema. A 0,6 g de la droga pulverizada (180), añadir 15 ml de ácido sulfúrico 0,05 M. Agitar durante 15 min. y filtrar. Lavar el filtro con ácido sulfúrico 0,05 M hasta obtener 20 ml de filtrado. Añadir al filtrado 1 ml de amoníaco concentrado y agitar inmediatamente dos veces con 10 ml cada vez de éter exento de peróxidos. Separar las fases, por centrifugación si es necesario. Reunir las fases etéreas y desecarlas sobre sulfato de sodio anhidro. Filtrar y evaporar la disolución hasta sequedad en baño de agua. Disolver el residuo en 0,5 ml de metanol. Disolución de referencia. Disolver 50 mg de sulfato de Hiosciamina en 9 ml de metanol R. Disolver 15 mg de Hidrobromuro de Escopolamina en 10 ml de metanol R. A 8 ml de la disolución de sulfato de Hiosciamina, añadir 1,8 ml de la Trabajo de Diploma de Pierre Dramou disolución de Hidrobromuro de Escopolamina. Aplicar por separado en la placa, a una distancia de 10 mm, 10 μl y 20 μl de cada disolución, en bandas de 20 mm por 3 mm. Proceder a un desarrollo de 10 cm con una mezcla de 3 volúmenes de amoníaco concentrado, 7 volúmenes de agua R y 90 volúmenes de acetona. Secar la placa a 100-105 ºC durante 15 min. y dejar que se enfríe. Pulverizar aproximadamente 10 ml de disolución de iodobismutato de potasio, para una placa de 200 mm de lado, hasta que aparezcan bandas anaranjadas o pardas sobre fondo amarillo. Las bandas de los cromatogramas obtenidos con la disolución problema son semejantes, en posición (Hiosciamina en el tercio inferior y Escopolamina en el tercio superior de los cromatogramas) y coloración, a las de los cromatogramas obtenidos con la disolución de referencia. El tamaño de las bandas de los cromatogramas obtenidos con la disolución problema no es inferior al de las bandas correspondientes en el cromatograma obtenido con el mismo volumen de la disolución de referencia. Pueden aparecer bandas secundarias débiles, particularmente en el centro del cromatograma obtenido con 20 μl de la disolución problema, o cerca del punto de partida en el cromatograma obtenido con 10 μl de la disolución problema. Pulverizar después disolución de nitrito de sodio sobre los cromatogramas hasta que la capa llegue a ser transparente. Examinar al cabo de 15 min. La coloración de las bandas correspondientes a la Hiosciamina en los cromatogramas obtenidos con la disolución de referencia y en los cromatogramas obtenidos con la disolución problema vira del pardo al pardorojizo, pero no al azul grisáceo (atropina), y las eventuales bandas secundarias desaparecen. Elementos extraños. No contiene más del 3% % de tallos de diámetro superior a 5mm. Cenizas totales. El contenido de cenizas totales no es superior al 16%. Cenizas insolubles en ácido clorhídrico. El contenido en cenizas insolubles en ácido clorhídrico no es superior al 4%. Pérdida por desecación. No más del 5%, determinada en estufa a 100-105 ºC a partir de 1000 g de la droga. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou VALORACIÓN a) Determinar la pérdida por desecación, en estufa a 100-105 °C, a partir de 2000 g de droga pulverizada. b) Embeber 10 g de droga pulverizada con una mezcla de 5 ml de amoníaco, 10 ml de alcohol y 30ml de éter exento de peróxidos. Mezclar cuidadosamente. Introducir la mezcla en un percolador, si es necesario con ayuda de la mezcla de extracción. Dejar macerar durante 4 horas. Lixiviar con una mezcla de 1 volumen de cloroformo y 3 volúmenes de éter exento de peróxidos, hasta extracción completa de los alcaloides. Evaporar a sequedad unos pocos mililitros del líquido eluido del percolador, disolver el residuo en ácido sulfúrico 0,25 M y comprobar la ausencia de alcaloides con disolución de tetraiodomercurato de potasio. Reducir el volumen del percolado a 50 ml aproximadamente por destilación en un baño de agua e introducirlo en un embudo de decantación, enjuagando con éter exento de peróxidos. Al líquido obtenido, añadir al menos 2,1 veces su volumen de éter exento de peróxidos con el fin de obtener una fase de densidad claramente más baja que la del agua. Agitar al menos 3 veces con 20 ml de ácido sulfúrico 0,25 M cada vez. Separar las fases, por centrifugación si es necesario, y transferir las fracciones ácidas a un segundo embudo de decantación. Alcalinizar las disoluciones ácidas reunidas con amoníaco R y agitar 3 veces con 30 ml de cloroformo cada vez. Reunir las capas clorofórmicas. Añadir 4 g de sulfato de sodio anhidro y dejar en contacto durante 30 min, agitando de vez en cuando. Decantar el cloroformo y lavar el sulfato de sodio 3 veces con 10 ml de cloroformo cada vez. Reunir las fases clorofórmicas, evaporarlas hasta sequedad en baño de agua y calentar el residuo en una estufa a 100-105 ºC durante 15 min. Disolver este residuo en unos pocos mililitros de cloroformo. Añadir 20,0 ml de ácido sulfúrico 0,01 M y eliminar el cloroformo por evaporación en baño de agua. Valorar el exceso de ácido con hidróxido de sodio 0,02 M en presencia de indicador mixto de rojo de metilo.. Calcular, en tanto por ciento, el contenido en alcaloides totales, expresado en Hiosciamina, mediante la expresión: Trabajo de Diploma de Pierre Dramou d = pérdida por desecación expresada en tanto por ciento, n = número de mililitros de hidróxido de sodio 0,02 M utilizados, m =masa de la muestra en gramos. CONSERVACIÓN En envase hermético y protegido de la luz. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ANEXO B MONOGRAFIA, ejemplo 2 CÁSCARA SAGRADA (Rhamni purshianae cortex) DEFINICIÓN La cáscara sagrada consiste en la corteza desecada, entera o fragmentada, de Rhamnus purshianus DC. [Frangula prusiana (DC.) A. Gray ex J.C. Cooper]. Contiene no menos del 8,0 %de heterósidos hidroxiantracénicos, de los cuales no menos del 60 %está formado por cascarósidos, ambos expresados como cascarósido A (C27H32O14; Mr 580,5) y calculados respecto a la droga desecada. CARACTERÍSTICAS Presenta los caracteres macroscópicos y microscópicos descritos en los ensayos de identificación A y B. IDENTIFICACIÓN A. La corteza se presenta en fragmentos ligeramente surcados o casi lisos, generalmente de 1 mm a 5 mm de grosor y habitualmente de longitud y anchura muy variables. La cara externa es gris o pardo grisácea oscura y presenta ocasionalmente lenticelas orientadas transversalmente. Se encuentra habitualmente más o menos recubierta de líquenes blanquecinos, musgos epífitos y hepáticas foliosas. La cara interna es de amarilla a pardo-rojiza o casi negra, con estrías longitudinales finas; se vuelve roja cuando se trata con álcalis. La fractura amarilla es limpia y granulosa en la cara externa y algo fibrosa en la cara interna. B. Reducir a polvo. El polvo es pardo amarillento. Examinar al microscopio utilizando disolución de hidrato de cloral. El polvo muestra: haces de fibras del floema parcialmente lignificadas, acompañados de vainas cristalinas que contienen prismas de oxalato de calcio; grupos de esclereidas acompañados de vainas cristalinas; maclas de oxalato de calcio; algunas células parenquimatosas que contienen una sustancia amarilla que vira a rojo intenso cuando se trata con álcalis; células suberosas y, a menudo, epífitos; estos últimos pueden ser Trabajo de Diploma de Pierre Dramou hepáticas, enteras o fragmentadas, con lámina monostromática de células isodiamétricas, sin nervio medio, o bien, filidios de musgos, con lámina monostromática de células alargadas, y con nervio medio constituido por varias células de grosor. C. Examinar los cromatogramas obtenidos en el ensayo para ‘otras especies de Rhamnus; antronas’ después de pulverizar con una disolución de 50 g/l de hidróxido de potasio en alcohol al 50 %V/V y calentar. El cromatograma obtenido con la disolución problema presenta varias manchas pardo-rojizas de diferentes intensidades: hay cuatro manchas pálidas, tres están situadas aproximadamente en la mitad del cromatograma y una en el tercio inferior, y hay una mancha intensa en el tercio superior del cromatograma. Examinar con luz ultravioleta a 365 nm. El cromatograma obtenido con la disolución problema presenta varias manchas con la misma fluorescencia, situadas por encima y sobre todo por debajo (cascarósidos) de la correspondiente a la Barbaloína en el cromatograma obtenido con la disolución de referencia. D. Calentar 0,2 g de droga pulverizada (180) con 50 ml de agua en un baño de agua durante 15 min. Dejar enfriar y filtrar. A 10 ml de filtrado añadir 20 ml de ácido clorhídrico y calentar en baño de agua durante 15 min. Dejar enfriar, llevar a una ampolla de decantación y agitar tres veces con 20 ml de éter cada vez. Conservar la capa acuosa (disolución A). (a) Reunir los tres extractos etéreos y agitar con 10 ml de amoníaco diluido. La capa acuosa vira a violeta rojizo. (b) Llevar la disolución A a un matraz pequeño, añadir 5 g de cloruro de hierro (III) y calentar en baño de agua durante 30 min. Dejar enfriar, llevar a una ampolla de decantación y agitar con 15 ml de éter. Lavar la capa etérea con 10 ml de agua, eliminar el agua y agitar la capa etérea con 5 ml de amoníaco diluido. Se desarrolla una coloración roja en la capa acuosa. ENSAYOS Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Otras especies de Rhamnus; antronas. Examinar por cromatografía en capa fina, utilizando un gel de sílice adecuado. Disolución problema. A 0,5 g de la droga pulverizada (180) añadir 5 ml de alcohol al 70% V/V y calentar a ebullición. Enfriar y centrifugar. Decantar inmediatamente la disolución sobrenadante y utilizar en los 30 min siguientes. Disolución de referencia. Disolver 20 mg de Barbaloína R en alcohol al 70% V/V R y diluir hasta 10 ml con el mismo disolvente. Aplicar por separado a la placa, en bandas, 10 μl de cada disolución. Desarrollar hasta una distancia de 10 cm utilizando una mezcla de 13 volúmenes de agua, 17 volúmenes de metanol y 100 volúmenes de acetato de etilo. Dejar secar la placa durante 5 min, pulverizar con unos 10 ml de una disolución de hidróxido de potasio de 50 g/l en alcohol al 50 %V/V y calentar entre 100°C y 105°C durante 15 min. Examinar los cromatogramas inmediatamente después de calentar. El cromatograma obtenido con la disolución de referencia presenta, en la parte central, una banda pardorojiza correspondiente a la Barbaloína. Examinar con luz ultravioleta a 365 nm. La banda correspondiente a la Barbaloína presenta fluorescencia pardo-amarillenta intensa. En el cromatograma obtenido con la disolución problema no se observa banda de fluorescencia pardo-anaranjada entre la banda de la Barbaloína y las bandas de los cascarósidos. Aplicar a otra placa, en bandas, 10 μl de la disolución problema y desarrollar como se describe anteriormente. Dejar secar la placa durante 5 min como máximo y pulverizar inmediatamente con una disolución de azul de nitrotetrazolio de 5 g/l en metanol R. Examinar inmediatamente el cromatograma. No aparece ninguna banda violeta o azul grisáceo. Elementos extraños. No más del 1 por ciento. Pérdida por desecación. No más del 10%, determinada en 1000 g de droga pulverizada, mediante desecación en una estufa de 100°C C a 105 °C durante 2 horas. Cenizas totales. No más del 7%. VALORACIÓN Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Realizar la valoración protegida de la luz intensa y en un mismo día. Agitar 1,00 g de droga pulverizada (180) en 100 ml de agua a ebullición y mantener la ebullición y la agitación durante 5 min. Dejar enfriar, diluir hasta 100,0 ml con agua, agitar, filtrar y eliminar los primeros 20 ml de filtrado. Llevar 10,0 ml de filtrado a una ampolla de decantación, añadir 0,1 ml de ácido clorhídrico 1 M y agitar dos veces con 20 ml de una mezcla de 1 volumen de éter y 3 volúmenes de hexano cada vez. Lavar los extractos orgánicos combinados con 5 ml de agua, eliminar la capa orgánica y añadir los líquidos de lavado a la capa acuosa. Agitar las capas acuosas juntas cuatro veces con 30 ml, cada vez, de acetato de etilo recién saturado de agua (a 150 ml de acetato de etilo, añadir 15 ml de agua, agitar durante 3 min y dejar en reposo) en cada ocasión, dejando que la separación tenga lugar hasta que la capa orgánica esté límpida. Reunir los extractos de acetato de etilo. Utilizar la capa acuosa para la valoración de los cascarósidos y la capa orgánica para la valoración de los heterósidos hidroxiantracénicos distintos de los cascarósidos. Heterósidos hidroxiantracénicos distintos de los cascarósidos. Llevar la capa orgánica a un matraz adecuado y eliminar el disolvente por destilación, evaporando casi a sequedad. Disolver el residuo en 0,3 ml a 0,5 ml de metanol y llevar a un matraz aforado, lavando el primer matraz con agua caliente y añadiendo los líquidos de lavado a la disolución metanólica. Dejar enfriar y diluir hasta 50,0 ml con agua . Llevar 20,0 ml de la disolución a un matraz de fondo redondo con boca esmerilada de 100 ml que contiene 2 g de cloruro de hierro(III) y 12 ml de ácido clorhídrico. Adaptar un refrigerante de reflujo, colocar el matraz en un baño de agua de manera que el nivel del agua esté por encima del nivel del líquido del matraz y calentar durante 4 h. Dejar enfriar, llevar la disolución a una ampolla de decantación y lavar sucesivamente el matraz con 3 ml a 4 ml de hidróxido de sodio 1 M y 3 ml a 4 ml de agua, añadiendo los líquidos de lavado a la ampolla de decantación. Agitar el contenido de la ampolla de decantación tres veces con 30 ml de una mezcla de 1 volumen de éter y 3 volúmenes de hexano cada vez. Lavar las capas orgánicas combinadas dos veces, con 10 ml de agua cada vez, y desechar los líquidos de lavado. Diluir la capa orgánica hasta 100,0 ml Trabajo de Diploma de Pierre Dramou con la mezcla de éter y hexano. Tomar 20,0 ml, evaporar cuidadosamente a sequedad en baño de agua y disolver el residuo en 10,0 ml de una disolución de 5 g/l de acetato de magnesio en metanol . Medir la absorbancia (2.2.25) a 515 nm utilizando metanol como líquido de compensación. Calcular el contenido en porcentaje de heterósidos hidroxiantracénicos, expresados como cascarósido A según la expresión: Tomando 180 como absorbancia específica. A = absorbancia a 515 nm, m =masa de la sustancia a examinar en gramos. Medir la absorbancia de la disolución problema a 440 nm. Si la relación entre la absorbancia a 515 nm y la de a 440 nm es inferior a 2,4, la valoración no es válida y debe repetirse. Cascarósidos. Diluir la fase acuosa reservada para esta valoración hasta 50,0 ml con agua. Tratar 20,0 ml de la disolución como se describió anteriormente en la valoración de los heterósidos hidroxiantracénicos distintos de los cascarósidos. Calcular el contenido en porcentaje de heterósidos hidroxiantracénicos, expresados como cascarósido A según la expresión: Tomando 180 como absorbancia específica. A = absorbancia a 515 nm, m =masa de la sustancia a examinar en gramos. Medir la absorbancia de la disolución problema a 440 nm. Si la relación entre la absorbancia medida a 515 nm y la medida a 440 nm es inferior a 2,7, la valoración no es válida y debe repetirse. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou CONSERVACIÓN Protegida de la luz. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ANEXO C Tabla 3.12. Matriz del diseño factorial para la búsqueda de condiciones óptimas en la reacción de Ninhidrina. N0 de x1 x2 x3 Respuesta Combinaciones (Temperatura) (Tiempo de (Tiempo (Absorbancia) calentamiento) de lectura) 1 50 10 2 2 60 10 2 3 50 30 10 4 60 30 2 5 50 10 10 6 60 10 10 7 50 30 10 8 60 30 10 9 50 10 2 10 60 10 2 11 50 30 10 12 60 30 2 13 50 10 10 14 60 10 10 15 50 30 10 16 60 30 10 0.21 0.16 0.43 0.18 0.33 0.24 0.39 0.37 0.22 0.18 0.44 0.19 0.35 0.21 0.39 0.36 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ANEXO D Tabla 3.5: Valores de los ensayos específicos reportados en la Farmacopea Europea, 2003. para productos farmacéuticos obtenidos de plantas medicinales. Cenizas Pérdida por Cenizas insolubles en Planta (Parte utilizada) desecación Totales HCL Plantago psyllium L(Semillas) 14% 4% ------- Trigonella foenum-graecum L (Semillas) 12% 5% -------- P. ispaghula Roxb (Semillas) 15% 1,8% ------- Cyamopsis tetragonolobus (L.)(semillas) Atropa belladonna L(Hojas y fruto) ----------------- 16% 4% (Corteza) 10% 7% ------- Hyoscyamus niger L (Hojas y flores) ------ 30 12 Eucalyptus globulus L (Hojas) 10% 6% ------- Allium sativum L (Bulbos) 7% 5% ------- Rhamnus purshianus D. C y A. Gray ex J. C. (Cáscara) Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Figura 3.1: Derivados obtenidos de la reacción de Ninhidrina con aminoácidos y compuestos afines que han sido caracterizados. Trabajo de Diploma de Pierre Dramou ANEXO E Tabla 3.7. Valores de absorbancia obtenidos al variar la temperatura en la técnica Espectrofotométrica UV-VIS. Temperatura X±SD 30 40 50 60 70 80 0,38 0,56 0,635 0,633 0,58 0,45 Tabla 3.8. Valores de absorbancia obtenidos al variar la temperatura en la técnica Espectrofotométrica UV-VIS. tiempo T= 40 T= 50 T= 60 T=70 10 0,093 0,288 0,259 0,123 20 0,102 0,282 0,4 0,532 30 0,12 0,285 0,57 0,369 40 0,158 0,369 0,4 0,327 50 0,213 0,297 0,344 0,389 60 0,2 0,379 0,436 0,492 Tabla 3.9. Estudio de la influencia del tiempo de lectura en la absorbancia. (Realizado a 600C 20 minutos). Tiempo/Rep 1 2 3 4 5 Media Desv. Standard 5 0,543 0,569 0,54 0,51 0,506 0,5336 0,025986535 0,564 0,575 0,544 0,515 0,501 10 0,5398 0,031475387 0,488 0,479 0,468 0,488 0,466 20 0,4778 0,010545141 0,465 0,454 0,445 0,457 0,452 30 0,4546 0,007300685 0,448 0,426 0,414 0,434 0,437 40 0,4318 0,012696456 0,397 0,354 0,387 0,379 0,388 50 0,381 0,01638597 0,35 0,366 0,362 0,392 0,32 60 0,358 0,026191602 0,342 0,351 0,325 0,331 0,307 70 0,3312 0,016828547 0,244 0,268 0,269 0,252 0,251 80 0,2568 0,01112205 0,208 0,204 0,208 0,226 0,209 90 0,211 0,008602325 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.10. Valores de absorbancia obtenidos para los aminoácidos en estudio y la muestra en el rango entre 300 a 400nm, aplicando la Espectrofotometria UVVIS. λ Lisina 300 303 306 309 312 315 318 321 324 327 330 333 336 339 342 345 348 351 354 357 360 363 366 369 372 375 378 381 384 387 390 393 0 0 0,202 0,388 0,589 0,649 0,713 0,78 0,808 0,78 0,778 0,815 0,829 0,775 0,687 0,583 0,492 0,397 0,331 0,294 0,278 0,265 0,253 0,243 0,233 0,225 0,224 0,214 0,207 0,205 0,204 0,2 Asparagina Prolina Hidroxiprolina Cucurbitina Muestra 0,016 0 0 0,0276 0,047 0,016 0 0 0,0516 0,195 0,08 0 0 0,066 0,443 0,236 0 0,06 0,22 0,545 0,377 0,032 0,03 0,313 0,623 0,421 0,038 0,049 0,414 0,678 0,466 0,069 0,103 0,444 0,705 0,489 0,118 0,217 0,471 0,725 0,471 0,367 0,295 0,437 0,671 0,45 0,51 0,344 0,419 0,637 0,421 0,647 0,392 0,411 0,609 0,406 0,739 0,423 0,384 0,579 0,397 0,8 0,468 0,354 0,548 0,389 0,844 0,499 0,334 0,528 0,389 0,874 0,525 0,317 0,481 0,384 0,91 0,543 0,301 0,463 0,382 0,938 0,554 0,29 0,442 0,377 0,922 0,564 0,281 0,419 0,375 0,815 0,557 0,275 0,402 0,369 0,645 0,511 0,272 0,389 0,366 0,488 0,449 0,267 0,371 0,359 0,37 0,386 0,27 0,358 0,349 0,266 0,322 0,265 0,35 0,342 0,158 0,241 0,262 0,338 0,321 0,077 0,175 0,26 0,335 0,3 0,011 0,111 0,252 0,325 0,285 0,01 0,073 0,255 0,322 0,267 0,009 0,041 0,248 0,327 0,245 0 0,029 0,249 0,335 0,236 0 0,027 0,247 0,3 0,231 0 0,024 0,249 0,3 0,218 0 0,015 0,249 0,3 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou Tabla 3.11. Resultados del diseño de experimentos aplicado para la búsqueda de condiciones ANALISIS DE VARIANZA DE LA ABSORBANCIA Fuente A: Suma de 0,13924 Df Media de 0,13924 F 1060,88 Valor de P 0,0000 1 B: tiempo de 0.000056 1 0.00056 0.43 0.5311 C:tiempo de 0.00529 1 0.0059 40.30 0.0002 AB 0.006006 1 0.006006 45.76 0.0001 AC 0.002256 1 0.002256 17.19 0.0032 BC 0.000156 1 0.000156 1.19 0.3070 grupo 0.000056 1 0.000056 0.43 0.53 Total del error 0.00105 8 0.000131 R-cuadrado = 99,2995 % R-cuadrado ajustada(ajustada por D.f.) = 98,8325 % Error Standard de Est. = 0,0114564 ECUACIÓN AJUSTADA DEL MODELO Absorbancia = -0,437976 + 0,0150655*Temperatura + 0,00634524*tiempo de calentamiento + 0,00485119*tiempo de lectura - 0,000129167*Temperatura*tiempo de calentamiento 0,000169643*Temperatura*tiempo de lectura + 0,0000297619*tiempo de calentamiento*tiempo de lectura Respuesta Optimizada Meta: máxima absorbancia Valor optima= 0,446659 Factor Bajo Alto Optimo Temperatura 40,0 60,0 60,0 tiempo de 10,0 50,0 10,1558 tiempo de lectura 1,0 15,0 1,00042 Trabajo de Diploma de Pierre Dramou BIBLIOGRAFIA: 1. 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