Tesis Doctoral Romina Glisoni - 2012

Universidad de Buenos Aires
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Departamento de Tecnología Farmacéutica
“ESTUDIOS DE AGREGACIÓN Y COMPLEJACIÓN
DE NUEVOS FÁRMACOS A BASE DE TIOSEMICARBAZONAS
PARA LA EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD BIOLÓGICA”
Farm. Romina Julieta Glisoni
Director: Prof. Dr. Alejandro Sosnik
Co-Directora: Prof. Dra. Albertina Moglioni
Lugar de Trabajo: Cátedras de Tecnología Farmacéutica I, Tecnología Farmacéutica
II y Química Medicinal (Departamento de Tecnología Farmacéutica y Farmacología.
Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires).
2012
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Este trabajo de tesis doctoral dió lugar a la redacción de los siguientes
artículos científicos publicados, enviados para su evaluación o en preparación
en revistas internacionales del área de las ciencias farmacéuticas:
Artículo Científico I.
Romina J. Glisoni, Diego A. Chiappetta, Liliana M. Finkielsztein, Albertina G. Moglioni,
Alejandro Sosnik. Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone drug
candidates with potential antiviral activity. New Journal of Chemistry. 2010; 34,
2047-2058. Calificado como “Hot article” por el Editor-In-Chief por el alto impacto en el
área. Factor de Impacto: 2.631.
Artículo Científico II.
Romina J. Glisoni, Diego A. Chiappetta, Albertina G. Moglioni, Alejandro Sosnik.
Novel 1-indanone thiosemicarbazone antiviral candidates: Aqueous solubilization
and physical stabilization by means of cyclodextrins. Pharmaceutical Research,
Octubre 2011; 1-17. DOI :10.1007/s11095-011-0599-y. Factor de impacto: 4.456.
Artículo Científico III.
Romina J. Glisoni, María L. Cuestas, Verónica L. Mathet, José R. Oubiña, Albertina G.
Moglioni, Alejandro Sosnik. Novel 1-indanone thiosemicarbazones and their inclusion
complexes with hydroxypropyl-β cyclodextrin: Antiviral activity against the
hepatitis C virus (HCV). Enviado para su consideración a Pharmaceutical Research, Enero
2012. Factor de impacto: 4.456.
Artículo Científico IV.
Romina J. Glisoni, María J. García-Fernández, Marylú Pino, Gabriel Gutkind, Albertina G.
Moglioni, Carmen Alvarez-Lorenzo, Angel Concheiro, Alejandro Sosnik. Contact lenses of
poly(2-hydroxyethylmethacrylate)-co-β-cyclodextrin for the delivery of a novel
antimicrobial thiosemicarbazone in the treatment of ocular infections. Manuscrito en
preparación 2012.
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AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quisiera expresar mi más sincero agradecimiento al Prof. Dr. Alejandro
Sosnik y Prof. Dra. Albertina Moglioni, como Director y co-Directora de esta Tesis de
Doctorado, por haberme permitido realizar esta tesis, por transmitirme sus enormes
conocimientos y experiencia, por confiar en mi capacidad para desarrollar este trabajo y
darme el aliento necesario para continuar día a día. A ambos muchas gracias por la
dedicación, el trabajo en equipo y el apoyo durante todos estos años de trabajo.
Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, por otorgarme dos becas,
Postgrado Tipo I y II, que me permitieron desarrollar este trabajo con dedicación
exclusiva.
Al Prof. Dr. Carlos Bregni como Director del Departamento de Tecnología Farmacéutica
por haberme permitido desinteresadamente realizar esta tesis en el Departamento a su
cargo.
Al Prof. Dr. Diego Chiappetta, por haberme brindado abiertamente un espacio físico para
desarrollar parte de esta tesis de doctorado en la Cátedra de Farmacotecnia I. Por los
consejos dados que aún sigo poniendo en práctica.
A todo el equipo de las Cátedras de Farmacotecnia I y II, Química Medicinal y Orgánica,
entre ellos especialmente a Ricardo Pasquali, Alicia, Claudia, Ángeles, Adriana F,
Eugenia, Adri Murua, Roberto, Lidia, Ariel Galante, Eze, Seba, Juan P, Viviana Mouriño,
Adriana Carlucci, Luis, Lili, Bety, Graciela y Silvita, gracias a todos por el enorme cariño,
la calidad humana y la ayuda continua.
A Esteban Gergic y Mariana Langenheim, quienes me asistieron para la obtención de
muestras de ciclodextrinas. Muchísimas gracias por su buena predisposición.
Mis agradecimientos a la Dra. Gloria Bonetto de la Universidad Nacional de Córdoba, al
Dr. Daniel Vega del Departamento Física de la Materia Condensada de la Comisión
Nacional de Energía Atómica de Buenos Aires, a la Prof. Dra. Ana Lea Cukierman y al Dr.
Pablo Bonelli del Departamento de Industrias (PINMATE) de la Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires, al Dr. Martín Desimone y a las
Dras. Silvia Lucangioli y Valeria Tripodi del Departamento de Química Analítica de la
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires; por el análisis RMN,
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difracción de rayos-X, utilización del equipamiento ATR-FT-IR y por la asistencia en el
análisis por GC y HPLC, respectivamente.
A mis queridos amigos de Química Medicinal: Lucas, Matias y Natalia, quienes me
soportaron día y noche, con mis hipótesis y contra-hipótesis. Gracias por compartir
conmigo tantos buenos momentos, ayudarme siempre y seguir siendo las grandes personas
que conocí, allá no tan lejos año 2004.
A mis compañeros de BIONIMED: Katia, Julieta, Marcela, Cecilia y Gustavo. Gracias por
colaborar y dejar que colabore con ustedes desde mi más sincero y desinteresado deseo.
A mi amiga, Dra. María Luján Cuestas, quien codo a codo luchó conmigo en los estudios
biológicos que motivaron esta tesis, por nuestro intercambio de conocimientos, por
nuestras largas horas de trabajo dentro del flujo laminar y posterior charlas en la puerta
de Junín 956. Por el compromiso que asumió en este proyecto, a pesar de sus
circunstancias personales. Te quiero mucho.
En este contexto mis más sincero agradecimiento a todo el Laboratorio de Hepatitis
Virales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires, especialmente al
Prof. Dr. José Oubiña y Dra. Verónica Mathet, por abrirme las puertas de su laboratorio
sin compromiso alguno.
También, a la Dra. Lucía Cavallaro y a la Bioqca. Eliana Castro del Departamento de
Virología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires, por
todo el asesoramiento y colaboraciones realizadas en el tema.
Mi agradecimiento al Programa Iberoamericano CYTED por financiar mi estancia de
investigación en la Universidad de Santiago de Compostela (España), durante los meses de
Octubre y Noviembre de 2011, en el marco de la “RED IBEROAMERICANA DE NUEVOS
MATERIALES PARA EL DISEÑO DE SISTEMAS AVANZADOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS EN
ENFERMEDADES DE ALTO IMPACTO SOCIOECONÓMICO” (RIMADEL).
Dentro del mismo marco, agradezco a la Prof. Dra. Carmen Alvarez-Lorenzo y al Prof Dr.
Angel Concheiro, por darme la oportunidad magnífica de haber trabajado en su
Laboratorio de Ciclodextrinas.
Tampoco podría dejar de nombrar a mis compañeros de Santiago de Compostela: Mariajo,
Lidia, Luis, Alvaro, Bárbara, Clara, Fernando, Patricia, Isabel, Elena, María, Ana, Andreza
y Susana, quienes compartieron conmigo este último capítulo de tesis doctoral, y con
quienes me reí hasta el cansancio.
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Ya fuera del campo profesional, me gustaría darle las gracias a mis grandes amigas de
toda la vida: May, Naty, Marie, Vero, Marty, Miru, Sabri y Lau, a mis cuñadas Ceci y Rocío,
a los padres de Martín, Cristina y Lito, quienes siempre se llenaron de orgullo y me
apoyaron fuertemente en esta decisión de dedicarme a la investigación.
A mi familia, tíos y primos, siempre presentes, transmitiendo cariño y fuerza en el
momento justo.
Finalmente, con todo mi corazón, a mis padres, Ana y Rudy; a mi hermano, Leandro; a mi
Nona; y a mi gran compañero de vida, Martín; quienes desde su incondicional amor, me
trasmitieron toda la energía para trabajar duro y con constancia, siempre, pase lo que
pase. ¡Muchas gracias! Los amo.
Romina Julieta Glisoni
Febrero, 2012.
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RESUMEN
El virus de la hepatitis C (VHC) es el agente etiológico de una de las infecciones
más extendidas en el mundo y cumple un rol clave en el desarrollo del cáncer de
hígado. El tratamiento farmacológico actual es eficaz en un número limitado de
pacientes y su costo elevado compromete la asequibilidad al mismo. En este
contexto, urge hallar compuestos antivirales más eficaces.
Las tiosemicarbazonas (TSCs) son ampliamente conocidas por desplegar actividad
frente a un variado espectro de virus del tipo ADN y ARN. En este contexto, el
grupo de investigación de la Cátedra de Química Medicinal (Facultad de Farmacia
y Bioquimica, Universidad de Buenos Aires) liderado por la Prof. Dra. Albertina
Moglioni, emprendió hace unos años el diseño, la síntesis y la caracterización de
nuevas TSCs derivadas de 1-indanonas, que han demostrado actividad biológica in
vitro frente a diversos patógenos, entre ellos algunos virus del tipo ARN de cadena
sencilla, bacterias, hongos, parásitos y algunos tipos de leucemias. La mayor
desventaja demostrada para estas TSCs es la extremadamente baja solubilidad
intrínseca en medio acuoso, la cual limita de manera dramática los ensayos
biológicos. La máxima concentración de TSC alcanzada en el medio de cultivo
durante el estudio está condicionada por la citotoxicidad del dimetilsulfóxido en
cada línea celular que fluctúa entre 0,5% y 2,0% v/v.
Las TSCs derivadas de 1-indanonas combinan un resto aromático altamente
hidrofóbico con un grupo funcional tiosemicarzona de carácter hidrofílico. Esto les
confiere una estructura de tipo anfifílica, sugiriendo que la conocida baja
solubilidad acuosa de estos derivados podría estar asociada a fenómenos de
autoagregación. Esto ha conducido a resultados de actividad biológica erráticos y
poco reproducibles.
Por los motivos señalados, en el presente trabajo de tesis resultó de interés
investigar en profundidad los fenómenos de autoagregación de las TSCs derivadas
de 1-indanonas en diferentes medios acuosos y a través de herramientas de
nanotecnología farmacéutica prevenir o disminuir los mismos, para permitir
desarrollar estudios biológicos in vitro reproducibles y confiables.
Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos macrocíclicos naturales que combinan
una nano-cavidad hidrofóbica con una superficie hidrofílica. Así, las CDs se utilizan
actualmente en la industria farmacéutica para aumentar la solubilidad de drogas
activas poco solubles en agua. Las moléculas del principio activo se incluyen en la
cavidad, de forma total o parcial, y pueden ser transportadas por la CD hasta el
9
lugar de su acción, donde deben ser liberadas para ejercer su actividad. La
tendencia de ciertas sustancias a la autoagregación en medio acuoso puede
prevenirse o disminuirse mediante la complejación con CDs.
En este trabajo de tesis doctoral se caracterizaron exhaustivamente la estabilidad
fisicoquímica y las propiedades de agregación de novedosas tiosemicarbazonas
derivadas de 1-indanonas con potencial actividad antimicrobiana, previamente a
la vehiculización de las mismas en un nanotransportador eficaz. Este tipo de
estudio no había sido conducido previamente para compuestos conteniendo la
agrupación TSC, a pesar de que algunos otros derivados de TSCs se encuentren
desde hace años en estudios clínicos y en vías de convertirse en auténticos
fármacos. La posibilidad del uso de CDs, como vehículo para mejorar la solubilidad
y prevenir la autoagregación de moléculas de TSC en medio acuoso fue
exhaustivamente investigada. Es así, como la solubilidad de las TSCs complejadas
con CDs en medio acuoso fue incrementada hasta 215 veces en relación a su
solubilidad intrínseca en agua y se mantuvo estable en solución durante 7 días.
El conocimiento del comportamiento en medio acuoso de TSCs y de complejos
TSC/CD ha permitido evaluar la actividad anti-VHC de dos novedosas TSCs
derivadas de la 5,6-dimetoxi-1-indanona y de sus complejos de inclusión con
hidroxipropilβ-CD en sistemas de replicón FL (genoma completo) y SG
(subgenómico) del VHC de genotipo 1b. Se observó una potente supresión de los
niveles totales de ARN viral en ambas líneas celulares tanto para las TSCs libres
como para las complejadas con CDs.
Por otra parte, basados en el extenso conocimiento previo sobre TSCs como
potenciales agentes quimioterápicos y sobre la capacidad de las CDs para
encapsular dichas moléculas, se extrapoló esta característica a la preparación de
lentes de contacto blandas (SCLs) funcionalizadas con CDs que sirvieron para la
incorporación de TSCs. Se evaluó cómo la velocidad de liberación de la TSC,
incluida en la CD y anclada en el entramado polimérico se ve afectada, en
comparación con el comportamiento de los complejos TSC/CD en solución. Se
evaluó microbiológicamente la capacidad de liberación de TSC desde los discos de
hidrogel y la inhibición del crecimiento de una serie de microorganismos de
interés en patologías oculares.
El trabajo desarrollado en esta tesis doctoral sienta las bases para que moléculas
conteniendo el grupo TSC en su estructura, poco solubles en agua y con alta
tendencia a la autoagregación en medios acuosos, puedan ser estabilizadas
10
utilizando ciclodextrinas, con el objeto de optimizar la evaluación de su actividad
biológica.
Palabras Clave: tiosemicarbazonas de 1-indanonas, autoagregación, complejos de
inclusión, ciclodextrinas nativas y químicamente modificadas, actividad antiviral,
virus de la hepatitis C (VHC), sistemas de replicón de genoma completo (FL) y
subgenómico (SG) del VHC, lentes de contacto blandas medicadas, 2hidroxietilmetacrilato.
11
12
ÍNDICE
PRINCIPALES ABREVIATURAS, SIGLAS Y SÍMBOLOS……………….………….…...…19
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS…….……………………………………………………...…...23
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
I. 1. TIOSEMICARBAZONAS (TSCs)
I. 1. 1. Historia y actividad biológica…......………………………………………….……......29
I. 1. 2. Diseño de tiosemicarbazonas derivadas de 1-indanonas como potenciales
agentes quimioterápicos………………………………………………………........….…....….31
I. 1. 3. Ventajas terapéuticas versus limitaciones fisicoquímicas…………………………....32
I. 1. 4. Autoagregación de fármacos en medio acuoso…………………………….…….…..33
I. 1. 5. Tiosemicarbazonas y el virus de la hepatitis C - Antecedentes…………………….34
I. 2. CICLODEXTRINAS (CDs)
I. 2. 1. Historia y generalidades……………………………………………………...………...35
I. 2. 2. Propiedades fisicoquímicas………………………………………………………….....38
I. 2. 3. Aplicaciones (bio)farmacéuticas y beneficios del uso de CDs……………………....38
I. 2. 4. Complejación de principios activos hidrofóbicos utilizando CDs…………............40
I. 2. 5. Métodos de formación de complejos de inclusión fármaco/complejante….……...43
I. 2. 6. Autoagregación de CDs y complejos de inclusión huésped/CD……….……….….44
1. 2. 7. Modificación del perfil de liberación de fármacos utilizando CDs…....……...........45
I. 2. 8. Consideraciones toxicológicas………………………………………………….………46
I. 2. 9. Ciclodextrinas y efecto antiviral - Antecedentes………………………….………….47
I. 2. 10. Otras aplicaciones tecnológicas de CDs de interés (bio)farmacéutico………….....47
I. 2. 10. 1. Hidrogeles a base de CDs en el desarrollo de lentes de contacto blandas
medicadas e implantes de liberación controlada de fármacos en ojo…….…………...……48
I. 3. VIRUS de la HEPATITIS C (VHC)
I. 3. 1. Generalidades: Prevalencia, incidencia e impacto socioeconómico…………….…..51
I. 3. 2. Estructura genómica del virus………………………………………………….………51
I. 3. 3. Terapia antiviral en la actualidad………………………………………………...…….53
13
I. 3. 4. Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas………………………………...……...54
I. 3. 5. Limitaciones en el estudio y control de los mecanismos de infección, replicación y
patogenicidad…………………………………………………………………………………....56
CAPÍTULO II. OBJETIVOS
II. 1. HIPÓTESIS DE LA TESIS DOCTORAL
II. 1. 1. Objetivos Generales…………………………………………………………………….61
II. 1. 2. Objetivos Específicos…………………………………………………………………...61
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
III. 1. TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS
Artículo científico I. Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone drug
candidates with potential antiviral activity.
III. 1. 1. Síntesis, purificación y caracterización fisicoquímica de TSCs de 1indanonas……………………………………………………….………………………………..65
III. 1. 2. Investigación de los posibles fenómenos y mecanismos de autoagregación de las
TSCs en medio acuoso……………………………………………………………………….….68
III. 2. COMPLEJACIÓN DE TIOSEMICARBAZONAS CON CICLODEXTRINAS
NATIVAS Y QUÍMICAMENTE MODIFICADAS PARA SU ESTABILIZACIÓN
FISICOQUÍMICA
Artículo científico II. Novel 1-indanone thiosemicarbazone antiviral candidates: Aqueous
solubilization and physical stabilization by means of cyclodextrins.
III. 2. 1. Estudio de la solubilización de las TSCs en medio acuoso mediante el uso de
CDs….................................................................................................................................…...…..71
III. 2. 2. Caracterización de los complejos TSC/CD y estudio de la interacción
fármaco/complejante……………………………………………………………………….…..72
III. 2. 3. Evaluación de la estabilidad fisicoquímica de los complejos TSC/CD en distintas
condiciones de almacenamiento……………………………………………...…………..……76
III.
3.
EVALUACIÓN
DE
LA
ACTIVIDAD
ANTI-VHC
DE
LAS
TIOSEMICARBAZONAS VEHICULIZADAS USANDO CICLODEXTRINAS
Artículo científico III. Novel 1-indanone thiosemicarbazones and their inclusion complexes
with hydroxypropyl-β cyclodextrin: Antiviral activity against the hepatitis C virus (HCV).
14
III. 3. 1. Líneas celulares……………………………………………………………….……….77
III. 3. 2. Preparación de las soluciones de TSCs y de los complejos TSC/CD para la
evaluación de la solubilidad y la agregación en medio de cultivo, la citotoxicidad y la
actividad antiviral……………………………………………………………......……...…......78
III. 3. 3. Estudios de la solubilidad y la agregación de las TSCs y de los complejos TSC/
CD en medio de cultivo…………………………………………………………….……….....80
III. 3. 4. Citotoxicidad por apoptosis de las TSCs y de los complejos TSC/CD…….……81
III. 3. 5. Estudios de la actividad anti-VHC de las TSCs libres y de los complejos
TSC/CD….………………………………………………………………………………….…...82
III.
4. EVALUACIÓN DE LOS COMPLEJOS TSC/CD COMO PLATAFORMA
TECNOLÓGICA PARA EL DISEÑO DE SISTEMAS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS
EN EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES OCULARES
Artículo científico IV. Contact lenses
of
poly(2-hydroxyethylmethacrylate)-co-β-
cyclodextrin for the delivery of a novel antimicrobial thiosemicarbazone in the treatment
of ocular infections.
III. 4. 1. Síntesis de (2,3-di-O-metacrilato-6-metacrilato)-β-CD............................................84
III. 4. 2. Síntesis de hidrogeles a base poli(2-hidroxietilmetacrilato)-co-β-CD...................84
III. 4. 3. Síntesis de hidrogeles super-hidrofílicos a base de hidroxipropil-β-CD
e hidroxipropil-β-CD/hidroxipropilmetilcelulosa ……………………………..…..…….....86
III. 4. 4. Caracterización de hidrogeles a base de poli(2-hidroxietilmetacrilato)-co-βCD………………………………………………………………………………………………...86
III. 4. 5. Carga y liberación de TSC en medio de fluido lacrimal artificial……..........…….86
III. 4. 6. Evaluación del grado de hinchamiento de hidrogeles a base de poli(2hidroxietilmetacrilato)-co-β-CD,
hidroxipropil-β-CD
y
hidroxipropil-β-CD/
hidroxipropilmetilcelulosa……………………………………………………..........………....87
III. 4. 7. Evaluación de la actividad antimicrobiana de hidrogeles a base de poli(2hidroxietilmetacrilato)-co-β-CD,
hidroxipropil-β-CD
y
hidroxipropil-β-CD/
hidroxipropilmetilcelulosa cargados con TSC………………...……………………………...88
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV. 1. TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS
Artículo científico I. Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone drug
candidates with potential antiviral activity.
15
IV. 1. 1. Síntesis, purificación y caracterización fisicoquímica de TSCs de 1indanonas………………...……………………………………………....……………...……….93
IV. 1. 2. Estabilidad fisicoquímica de las TSCs en medio acuoso….…………...……........104
IV. 1. 3. Investigación de los posibles fenómenos y mecanismos de autoagregación de las
TSCs en medio acuoso………………………………….……….…………………………......106
IV. 2. COMPLEJACIÓN DE TIOSEMICARBAZONAS CON CICLODEXTRINAS
NATIVAS Y QUÍMICAMENTE MODIFICADAS PARA SU ESTABILIZACIÓN
FISICOQUÍMICA
Artículo científico II. Novel 1-indanone thiosemicarbazone antiviral candidates: Aqueous
solubilization and physical stabilization by means of cyclodextrins.
IV. 2. 1. Estudio de la solubilización de las TSCs en medio acuoso mediante el uso de
CDs…......………………………………………………………………………………………..113
IV. 2. 2. Caracterización de los complejos TSC/CD y estudio de la interacción
fármaco/complejante………….……………………………………………………………...121
IV. 2. 3. Evaluación de la estabilidad fisicoquímica de los complejos TSC/CD en
distintas condiciones de almacenamiento………………………………….........................138
IV.
3.
EVALUACIÓN
DE
LA
ACTIVIDAD
ANTI-VHC
DE
LAS
TIOSEMICARBAZONAS VEHICULIZADAS USANDO CICLODEXTRINAS
Artículo científico III.
Novel 1-indanone thiosemicarbazones and their inclusion
complexes with hydroxypropyl-β cyclodextrin: Antiviral activity against the hepatitis C
virus (HCV).
IV. 3. 1. Estudio de la solubilidad y la agregación de las TSCs y de los complejos
TSC/CD en medio de cultivo……………..………………………………………….............146
IV. 3. 2. Citotoxicidad por apoptosis de las TSCs y de los complejos TSC/CD...........…147
IV. 3. 3. Estudios de la actividad anti-VHC de las TSCs libres y complejos
TSC/CD…………………………………………………………………………………...…...152
IV. 4. EVALUACIÓN DE LOS COMPLEJOS TSC/CD COMO PLATAFORMA
TECNOLÓGICA PARA EL DISEÑO DE SISTEMAS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS
EN EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES OCULARES
Artículo
científico
IV. Contact lenses of poly(2-hydroxyethylmethacrylate)-co-β-
cyclodextrin for the delivery of a novel antimicrobial thiosemicarbazone in the treatment
of ocular infections.
16
IV. 4. 1. Síntesis y caracterización de hidrogeles a base de poli(2-hidroxietilmetacrilato)co-β-CD, hidroxipropil-β-CD y hidroxipropil-β-CD/ hidroxipropilmetilcelulosa ….....158
IV. 4. 2. Carga y liberación de TSC en medio fluido lacrimal artificial…………......……161
IV. 4. 3. Evaluación del grado de hinchamiento de hidrogeles a base de poli(2hidroxietilmetacrilato)-co-β-CD,
hidroxipropil-β-CD
y
hidroxipropil-β-CD/
hidroxipropilmetilcelulosa ………………………………………………………...……........163
IV. 4. 4. Evaluación de la actividad antimicrobiana de hidrogeles a base de poli(2hidroxietilmetacrilato)-co-β-CD,
hidroxipropil-β-CD
y
hidroxipropil-β-CD/
hidroxipropilmetilcelulosa cargados con TSC…………………………………..…………..164
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
169
CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA
173
17
18
PRINCIPALES ABREVIATURAS, SIGLAS Y SÍMBOLOS
A
ACN
Acetonitrilo
ADN
Ácido desoxirribonucleico
AFM
Microscopía de fuerza atómica
AIBN
2,2’-Azo-bis-isobutironitrilo
AmB
Anfotericina B
ARN
Ácido ribonucleico
ATR/FT-IR
Reflectancia Atenuada Total/FT-IR (Attenuated Total Reflectance/
Fourier Transform-Infrared Spectroscopy)
AV
Anexina V
CAC
Concentración de agregación crítica
CD/CDs
Ciclodextrina/s
CHC
Carcinoma hepatocelular primario
CHCl3
Cloroformo
CH2Cl2
Diclorometano
CI50
Concentración inhibitoria 50
Da
Daltons
DAA
Agentes anti-VHC de acción directa (Direct-acting anti-VHC agents)
DCR
Derivada de la tasa de cuentas por segundo (Derived Count Rate)
Dh
Diámetro hidrodinámico
DMEM
Medio de cultivo modificado (Dulbecco´s modified Eagle´s medium)
DMF
Dimetilformamida
DMSO
Dimetilsulfóxido
DLS
Dispersión dinámica de luz (Dynamic Light Scattering)
DP
Después de la polimerización
D20
Agua deuterada
δ
Desplazamiento químico
EC
Eficacia de complejación
EEUU
Estados Unidos
EGDE
Etilenglicoldigliciléter
EGMA
Etilenglicoldimetacrilato
EtOH
Etanol
C
D
E
19
F
FACS
Citometría de flujo (Fluorescent Activated Cell Sorting)
FDA
Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos
FITC
Isocianato de fluoresceína
FL
Genoma completo (Full Length)
FLA
Fluido lacrimal artificial
FT-IR
Espectroscopia de infrarrojo por Transformada de Fourier
GC
Cromatografía de gases
GMA
Glicolmetacrilato
h
Hora
HCC
Hepatitis C crónica
HEMA
2-Hidroxietilmetacrilato
HPβ-CD
2-Hidroxipropil-betaCD
HPLC
Cromatografía líquida de alta resolución (High-performance liquid
G
H
chromatography)
I
IFN-α
Interferón-alfa
IM
Intramuscular
IP
Yoduro de propidio
IV
Intravenosa
K1:1
Constante de complejación o estabilidad aparente 1:1
log K
Logaritmo del factor de capacidad
log Kwater
Logaritmo del factor de capacidad (0% solvente orgánico como fase
K
L
móvil en HPLC)
log P
Logaritmo del coeficiente de partición octanol:agua
MeOH
Metanol
min
Minutos
MS
Grado de sustitución molar
Mw
Peso molecular
NIH
National Institutes of Health de los Estados Unidos
NS
No estructural
M
N
20
O
-OCH3
Grupo funcional metoxilo
-OH
Grupo funcional hidroxilo
OMS
Organización Mundial de la Salud
ORF
Marco de lectura abierto (Open Reading Frame)
PBS
Solución de buffer fosfato
PDI
Índice de polidispersión
PEG
Polietilenglicol
PM
Mezcla física
PP
Posterior a la polimerización
PS
Fosfatidilserina
p/p
Peso en peso
p/v
Peso en volumen
RBV
Ribavirina
RDR
Ribonucleótido difosfato reductasa
RdRp
ARN-polimerasa dependiente de ARN
RI
Índice de refracción
RMN
Resonancia magnética nuclear
rpm
Revoluciones por minuto
RT-PCR
Real time-polymerase chain reaction
RVS
Respuesta virológica sostenida
R2
Coeficiente de correlación
s
Segundos
sc
Solución
SC
Subcutánea
SCL/SLCs
Lente/s de contacto blanda/s (Soft contact lens/es)
SEM
Microscopía electrónica de barrido
SFB
Suero fetal bovino (Fetal Calf Serum)
SG
Subgenómico
TEM
Microscopía electrónica de transmisión
TGO
Transaminasa glutámico oxoloacética
TGP
Transaminasa glutámico pirúvica
TSC/TSCs
Tiosemicarbazona/s
P
R
S
T
21
TS
Tensión superficial
UV-Vis
Espectroscopía ultravioleta-visible
UTR
Regiones no traducidas (Untranslated region)
VDVB
Virus de la diarrea viral bovina
VHB
Virus de la hepatitis B
VHC
Virus de la hepatitis C
VIH
Virus de la inmunoinsuficiencia humana
VJUN
Virus Junín
v/v
Volumen en volumen
XRD
Difracción de rayos X
Z-pot
Potencial zeta
U
V
X
Z
22
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS
CAPÍTULO I
CAPÍTULO I. 1.
Figura I. 1. 1. Estructura química de las TSCs aprobadas actualmente por la FDA o
evaluadas en ensayos clínicos avanzados……………………………………………………………………………30
Figura I. 1. 2. Estructura química de las TSCs derivadas de 1-indanonas [28]…………………31
CAPÍTULO I. 2.
Figura I. 2. 1. Representación de la estructura química general y de las regiones
hidrofílicas/hidrofóbicas de las CDs naturales y modificadas químicamente actualmente
disponibles en el mercado farmacéutico [46,47]……………………………………………………………….36
Figura I. 2. 2. Diagrama teóricos de solubilidad de fases [52]………………………………………….42
Tabla I. 2. 1. Características de CDs naturales y químicamente modificadas más utilizadas
con la industria farmacéutica…………………………………………………………….………………………..…….37
Tabla I. 2. 2. CDs y tipo de formulaciones fármaco/CD más relevantes del mercado
farmacéutico mundial…………………………………………………………………………………………………….……40
Tabla I. 2. 3. Ventajas y desventajas de la SCLs para la liberación de fármacos en
ojo…………………………………………………………………………………………………………………………………………50
CAPÍTULO I. 3.
Figura I. 3. 1. Microfotografía TEM del VHC por [82]………………………………………………………..52
Figura I. 3. 2. Representación esquemática del genoma completo del VHC [84]….…………52
CAPÍTULO IV
CAPÍTULO IV. 1.
Figura IV. 1. 1. Espectros 1H-RMN de (A) TCS3 y (B) TSC4, en DMSO-d6……………………………97
Figura IV. 1. 2. Espectro UV-Vis característico de una solución TSC3 75µM en agua:DMSO
en función del tiempo……………………………………………………………………………………………………….…99
Figura IV. 1. 3. Log K versus acetonitrilo % para las TSC1-4……………………………………………101
Figura IV. 1. 4. Correlación entre el log Kwater y valores de log P calculados con los
softwares (A) ChemDraw Ultra 7.0 y (B) Spartan ´02…………………………….…………………………104
Figura IV. 1. 5. Solubilidad de las TSC1-4 en soluciones de DMSO 100% durante 30 días, a
25º C……………………………………………………………………………………………………………………………………105
Figura IV. 1. 6. Solubilidad de las TSC1-4 en soluciones de agua:DMSO (98:2) durante 30
días, a 25º C……………………………………………………………………………………………………………………….106
23
Figura IV. 1. 7. Diámetro hidrodinámico (Dh) de los agregados de las TSC1-4 generados en
agua:DMSO (98:2) medidos por DLS, durante 30 días……………………………………………………….108
Figura IV. 1. 8. Micrografías TEM de nano y microagregados de una solución 7,5µM de
TSC3 en agua:DMSO (98:2)………………………………………………………………………………………….…….112
Figura IV. 1. 9. Tensión Superficial (mN/m) por el método del anillo de Du-Noüy en
función de la concentración de TSC3……………………………………………………………………………….112
Tabla IV. 1. 1. Propiedades químicas y térmicas de las TSC1-4………………………………….……94
Tabla IV. 1. 2. Valores de log Kwater y log P determinados para las diferentes TSCs……….102
Tabla IV. 1. 3. Índices de polidispersión (PDI) de los agregados de las TSC1-4 generados
en medio agua:DMSO (98:2), medidos por DLS durante 30 días…………….…………………………110
Tabla IV. 1. 4. Potencial zeta (Z-pot) de agregados de las TSC1-4 (7,5-75,0µM) en
agua:DMSO (98:2), medidos por DLS durante 30 días…………………………………………………….…111
CAPÍTULO IV. 2.
Figura IV. 2. 1. Diagramas de solubilidad de fases de complejos de inclusión
TSC/CD……………………………………………………………………………………………………………………………….117
Figura IV. 2. 2. Tamaño promedio y distribución de tamaños por intensidad (%) de un
complejo de inclusión TSC3/Mβ-CD (15% p/v) en agua, a día 0…………………………………….…126
Figura IV. 2. 3. Distribución de tamaño por intensidad (%) de una solución de complejo de
inclusión TSC3/γ-CD por DLS…………………………………………………………………………………………....126
Figura IV. 2. 4. Potencial zeta (Z-pot) representativo de complejos de inclusión
TSC3/HPβ-CD en función de concentraciones de HPβ-CD……………………………………….…….…128
Figura IV. 2. 5. Microfotografías TEM representativas de complejos de inclusión
TSC3/CD…………………………………………………………………………………………………………………………….129
Figura IV. 2. 6. Microfotografía AFM por el modo de contacto de un film de TSC3/HPβCD…………………………………………………………………………………………………………………………………….…130
Figura IV. 2. 7. Microfotografías SEM representativas de (A) TSC3 pura no liofilizada, y
productos liofilizados: (B) TSC3 (C) HPβ-CD y (D) TSC3/HPβ-CD…………………………………….131
Figura IV. 2. 8. Difractogramas de XRD de muestras prístinas y liofilizadas (**) de TSC3,
Mβ-CD, HPβ-CD, HPγ-CD, γ-CD y de los respectivos complejos TSC3/CD…………………………133
Figura IV. 2. 9. Espectros ATR/FT-IR representativos de (A) HPβ-CD, (B) TSC3, (C)
complejo TSC3/HPβ-CD (D) TSC3/HPβ-CD PM…………………………………………………………...……135
Figura IV. 2. 10. Estabilidad física de soluciones de complejos de inclusión TSC/CD
estimada a los largo de 7 días por UV-Vis, a 25° C……………………………………….….………………139
Figura IV. 2. 11. Estabilidad física de soluciones de los complejos de inclusión TSC/CD
estimada a los largo de 7 días por DLS, a 25° C………………………………………………………….……142
24
Tabla IV. 2. 1. Constantes de estabilidad aparente (K1:1), eficiencia de complejación (EC),
y factores de solubilidad (F3% y FMax) de complejos TSC/CD………………………….….………………115
Tabla IV. 2. 2. Concentración de agregación crítica (CAC) en agua Milli-Q y Dh de
agregados de CDs nativas y modificadas medidos por DLS, a 25º C…………………………………122
Tabla IV. 2. 3. Diámetro hidrodinámico (Dh) de complejos de inclusión TSC/CD con CDs
nativas y modificadas, a día 0, medidas por DLS……………………………………………………………..124
Tabla IV. 2. 4. Solubilidad y diámetro hidrodinámico (Dh) de TSC3/HPβ-CD durante 7 días,
a 37º C……………………………………………………………………………………………………………….…………….…127
Tabla IV. 2. 5. Desplazamientos químicos 1H-RMN δ (ppm) de Mβ-CD, HPβ-CD y γ-CD
liofilizadas antes y después de la complejación de TSC en D2O, a 25° C………………………..137
CAPÍTULO IV. 3.
Figura IV. 3. 1. Estabilidad física de las TSCs libres, HPβ-CD libre de TSC y complejos de
inclusión TSC/HPβ-CD en medio de cultivo estimada por UV-Vis durante 24 h, a 37°
C…………………………………………………………………………………………………………………………………………147
Figura IV. 3. 2. Fotografías de microscopía óptica de células Huh 7.5 FL-VHC tratadas
con: (A) TSC3/HPβ-CD 1% (B) TSC3/HPβ-CD 0,5% (C) control negativo (D) control positivo
y (E-F) TSC3/HPβ-CD 3%. (A-D) 96 h; (E y F) 24 h y 48 h, respectivamente.................148
Figura IV. 3. 3. Citotoxicidad de las TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos de inclusión
TSC/HPβ-CD determinadas por citometría de flujo………………………………………………………….150
Figura IV. 3. 4. Análisis por citometría de flujo de la apoptosis celular mediante doble
marcación AV-FTIC/IP en células Huh 7.5 FL……………………………………………………………………151
Figura IV. 3. 5 Disminución de los niveles totales de ARN viral luego de la exposición a
TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos durante 96 h…………………………………………………………154
Tabla IV. 3. 1. Relación TGO/TGP en los sobrenadantes de células Huh 7.5 de replicón de
genoma completo (FL) y subgenómico (SG) del VHC de subgenotipo 1b, después de 96 h de
incubación con TSCs libres, HPβ-CD libre de TSC y complejos de inclusión TSC/HPβCD…………………………………………………………………………………………………………………………………….…152
Tabla IV. 3. 2. Disminución de los niveles totales de ARN viral luego de la exposición a
TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos durante 96 h…………………………………………………………153
CAPÍTULO IV. 4.
Figura IV. 4. 1. Perfiles de liberación de TSC4 en FLA expresada en µg a partir de
hidrogeles preparados con distintas proporciones de monómero metacrilato-β-CD (A-C) e
hidrogeles a base de HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC (D), durante 14 días, a 25° C………………….162
Figura IV. 4. 2. (A) Perfil de hinchamiento en FLA de los hidrogeles a base de pHEMA-coβCD y (B) hidrogeles HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC………………………………………………………………….163
25
Figura IV. 4. 3. Zonas de inhibición contra (A-B) Staphylococcus aureus y (C-D)
Pseudomona aeruginosa después de 24 h de incubación sobre placas de ágar Müller-Hinton
con TSC4 y discos impregnados con TSC4………………………………..………………………………………165
Figura IV. 4. 4. Figura representativa de SLCs sobre placas de agar Müller-Hinton….……166
Tabla IV. 4. 1. Señales químicas de los hidrogeles a base de pHEMA-co-βCD cargados con
TSC4 DP y PP, analizadas por ATR/FT-IR acoplado a microscopio óptico………….……………160
26
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
27
28
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
“La felicidad no está en hacer lo que
uno quiere sino en querer lo que uno
hace”. Jean-Paul Sartre.
I. 1. TIOSEMICARBAZONAS (TSCs)
I. 1. 1. Historia y actividad biológica
Las primeras investigaciones sobre el uso potencial de TSCs como agentes
terapéuticos surgen en 1946, cuando Domagk y colaboradores describen por
primera vez la actividad in vitro frente al Mycobacterium tuberculosis,
confirmada posteriormente in vivo [1]. Desde entonces, se reseñaron distintas
TSCs con actividades tales como antineoplásica [2], antibacteriana [3],
antifúngica [4], antiprotozooaria [5], antimalárica [6] y antiviral [7-9]. Algunas de
estas TSCs, han demostrado actividad in vitro frente al virus del herpes simple,
basados en la inactivación de la enzima viral ribonucleótido difosfato reductasa
(RDR) [8], enzima clave en la síntesis de precursores de ADN. Tal como sucede en
el Rous sarcoma virus y en el VIH de tipo-1, ambos pertenecientes a la familia
Retroviridae, la inactivación por parte de las TSC puede ocurrir sobre la ADN
polimerasa dependiente de ARN provocando la inhibición in vitro de la síntesis de
proteínas estructurales del virus [9,10].
La actividad biológica de muchos de estos derivados está relacionada con la
presencia de anillos aromáticos y heterocíclicos en la molécula, y a la capacidad
de coordinación del resto TSC para formar complejos metálicos con iones
multivalentes [11]. En algunos casos, la actividad biológica de los complejos
metálicos es mayor que la de las TSCs sin coordinar.
A pesar de haberse realizado estudios exhaustivos de las potenciales aplicaciones
terapéuticas de estos derivados por más de 60 años, sólo unas pocas TSCs han sido
aprobadas por la FDA y su uso se ha implementado en la clínica. Entre ellas, el
antiséptico
oral
1,4-benzoquinona
(ambazona,
Ambasept®)
[12]
y
guanilhidrazona
el
agente
de
antiviral
tiosemicarbazona
N-metil-isatin-β-
tiosemicarbazona (metisazona, Marboran®) efectivo como agente anti-poxvirus
(adenovirus
de
la
viruela)
[13].
La
3-aminopiridin-2-carboxaldehído
tiosemicarbazona (3-AP, Triapina®) se encuentra en etapa de estudio clínico de
fase I y II como potente inhibidor de la RDR en pacientes con tumores sólidos
29
avanzados y metástasis [11,14], mientras que la p-acetamidobenzaldehído
tiosemicarbazona (tiacetazona) es utilizada en la actualidad sólo como
coadyuvante de isoniazida en algunas pautas de recomendación de la OMS en la
quimioterapia antituberculosa prolongada, por su extremado bajo costo [15].
Numerosos integrantes de la familia de las TSCs han resultado altamente activos
como antitumorales, entre ellos los derivados de 2-acetilpiridina, dipiridilcetonas,
3-acetilindol y citronelal, pero ninguno de ellos se encuentra aún en etapa de
evaluación clínica [16-19].
La estructura química de las TSCs aprobadas por la FDA o evaluadas en ensayos
clínicos avanzados se resumen en la Figura I. 1. 1, donde se indica el resto TSC
común.
O
NH2
N
N
H3C
C
CH3
NH2
N
NH2
O
H
H
N
N
N
NH
NH
C
S
NH2
N
NH
C
NH2
N
C
NH2
N
S
S
S
NH
C
NH2
Ambazona
3-AP (Triapina®)
Metisazona
Tiacetazona
Figura I. 1. 1. Estructura química de las TSCs aprobadas actualmente por la FDA o
evaluadas en ensayos clínicos avanzados.
La pobre solubilidad en agua de las TSCs, como la de muchos otros compuestos en
actual evaluación biológica, y la elevada toxicidad de algunos de estos derivados,
es la gran limitación para que los mismos sean auténticos candidatos a fármacos
[20].
30
I. 1. 2. Diseño de tiosemicarbazonas derivadas de 1-indanonas como posibles
agentes quimioterápicos
Basados en los antecedentes mencionados en el Capítulo I. 1. 1 que “compuestos
que presentan en su estructura molecular un grupo funcional TSC, han
demostrado un amplio espectro de actividades farmacológicas” [1-19], el grupo
de investigación de la Cátedra de Química Medicinal (Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires) liderado por la Prof. Dra. Albertina
Moglioni, emprendió hace unos años el diseño, la síntesis y la caracterización de
nuevas TSCs derivadas de 1-indanonas, que han demostrado actividad biológica in
vitro [21-27]. En base a dicho resultados, la estructura molecular base de los
derivados de los que trata puntualmente la presente tesis doctoral se representa
en la Figura I. 1. 2.
NHR4
N
Porción
hidrofóbica
NH
C
Porción
hidrofílica
S
R6'
TSC 1
TSC 2
TSC 3
TSC 4
R5'
R4,5',6' = H
R4,5' = H R6' = OCH3
R5',R6' = OCH3 R4 = H
R5',R6' = OCH3 R4 = CH2-CH=CH2
Figura I. 1. 2. Estructura química de las TSCs derivadas de 1-indanonas [28].
Como se señaló, algunas TSCs derivadas de 1-indanonas han demostrado potente
actividad in vitro frente a diversos patógenos, entre ellos algunos virus del tipo
ARN de cadena sencilla, bacterias, hongos, parásitos y algunos tipos de leucemias:
(i)
Virus Junín (VJUN), agente causante de la Fiebre Hemorrágica Argentina.
TSC1 mostró valores de CI50 de 44,8µM y TSC2 de 38,4µM [21]. El mecanismo de
acción antiviral propuesto fue la inhibición de procesos tardíos del ciclo de
replicación del VJUN, tales como la maduración de las partículas virales.
(ii)
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB) tipo-1, modelo subrrogante del
virus de la hepatitis C (VHC) de difícil replicación in vitro. Las TSC1-3 fueron
seleccionadas para la evaluación de la actividad antiviral sobre la replicación de
31
VDVB tipo-1, en la línea celular MDBK (Madin-Darby bovine kidney cells) evaluando
la reducción del efecto citopático. TSC3 ha demostrado la mayor actividad, con
una CI50 de 1,75µM [22-24], aproximadamente un orden de magnitud y un índice
de selectividad (SI = 80,29) 7-8 veces superior a RBV (SI = 11,64), única alternativa
quimioterápica aprobada para el tratamiento de VHC junto a IFN [29]. El VHC es
una infección que actualmente padecen 175 millones de personas en el mundo, es
la mayor causa de cirrosis y hepatocarcinomas primarios y la principal causa de
transplante hepático. El mecanismo de acción antiviral propuesto fue la inhibición
de proteínas no estructurales del virus a través de la inhibición de la VDVB RdRp
[23].
(iii)
Aspergillus niger y Candida albicans [25].
(iv)
Bacterias Gram positivas y Gram negativas [25].
(v)
Trypanosoma cruzi, agente causante de la enfermedad de Chagas. TSCs
derivadas de 1-indanonas han demostrado ser inhibidores de la cruzipaína, la
cisteín-proteasa principal del tripanosoma, sugiriendo esta enzima como receptor
blanco para el mecanismo de acción propuesto [26].
(vi)
Leucemias. Complejos metálicos de TSCs de 1-indanonas (TSC1 y TSC3) han
demostrado inducción de la apoptosis celular en ensayos in vitro sobre la línea
celular U-937, modelo de leucemia promonocítica humana comúnmente utilizada
para la evaluación de nuevos agentes antileucémicos, y mayor selectividad por
células neoplásicas que sobre células normales [27].
I. 1. 3. Ventajas terapéuticas versus limitaciones fisicoquímicas
Como fuera mencionado previamente, la mayor desventaja demostrada por estos
derivados de TSCs es la solubilidad intrínseca en medio acuoso extremadamente
baja (1,5-13,0 µg/ml), la cual limita de manera dramática los ensayos biológicos.
Los estudios preliminares de actividad biológica realizados hasta el momento [2127] fueron llevados a cabo mediante la solubilización inicial de las TSCs en DMSO y
la posterior dilución en medio de cultivo. La máxima concentración de TSC
alcanzada en el medio de cultivo durante el estudio está condicionada por la
citotoxicidad del DMSO en cada línea celular que fluctúa entre 0,5% y 2,0% v/v.
Por otro lado, las TSCs derivadas de 1-indanonas tienden a precipitar rápidamente
en el medio acuoso formando cristales de tamaño nano, micro y macroscópico por
lo que las concentraciones efectivas en solución son desconocidas. Esto conduce a
32
resultados de actividad biológica erráticos y poco reproducibles y donde la
actividad evaluada es posiblemente subestimada.
I. 1. 4. Autoagregación de fármacos en medio acuoso
La autoagregación de moléculas de fármaco en medio acuoso es el fenómeno por
el cual una molécula anfifílica (molécula con propiedades tanto hidrofílicas como
hidrofóbicas) y pobremente soluble en agua, se asocia a otras moléculas idénticas
de
manera
espontánea
por
encima
de
una
concentración
denominada
concentración de agregación crítica (CAC), para formar dímeros, poliagregados
y/o micelas de tamaño nano o micrométrico [30]. Los fenómenos de
autoagregación de fármacos de naturaleza anfifílica han sido reportados
previamente para AmB [31], penicilinas [32], anti-inflamatorios no esteroides
[33], antidepresivos tricíclicos [34], antipsicóticos del tipo de las fenotiazinas
[35], nuevos candidatos a antirretrovirales del tipo de los inhibidores nonucleosídicos de la transcriptasa inversa [36], ftalocianinas [37] y (E)-resveratrol
[38]. El mayor problema resultante de la autoagregación en medios biológicos es
la disminución de la actividad como consecuencia de la pérdida de la capacidad
del fármaco para atravesar barreras biológicas [39]. A su vez, algunos de estos
agregados moleculares resultan ser tóxicos in vivo, dependiendo del estado de
agregación de las moléculas (agregación del tipo monomérica, dimérica o
poliagregación), como es el caso de los agregados nefrotóxicos de AmB [31].
Los
agregados
formados
por
este
fenómeno
pueden
ser
caracterizados
principalmente por: (i) estudios de tamaño de partícula y distribución de tamaño,
(ii) carga superficial de las partículas por determinación del Z-pot (iii) morfología
de las partículas mediante técnicas de microscopía electrónica complementarias,
(iv) aparición de nuevos picos de absorción en el espectro UV-Vis, que no cumplen
con la ley de Lambert-Beer, (v) RMN bidimensional y (vi) medición de la CAC en
medio acuoso.
Las TSCs derivadas de 1-indanonas combinan un resto aromático altamente
hidrofóbico con un grupo funcional tiosemicarzona de carácter hidrofílico (Figura
I. 1. 2). Esto les confiere una estructura de tipo anfifílica, sugiriendo que la
conocida baja solubilidad acuosa de estos derivados podría estar asociada a
fenómenos de autoagregación. Dichos fenómenos no habían sido estudiados para
este tipo de moléculas con anterioridad. Por los motivos señalados, en el presente
trabajo de tesis resultó de interés investigar en profundidad los fenómenos de
autoagregación de las TSCs de 1-indanonas en diferentes medios y a través de
33
herramientas de nanotecnología farmacéutica prevenir o disminuir los mismos
para permitir desarrollar estudios biológicos in vitro reproducibles y confiables.
I. 1. 5. Tiosemicarbazonas y virus de la hepatitis C – Antecedentes
Como fuera mencionado previamente, las TSCs han demostrado actividad antiviral
frente a un variado espectro de virus del tipo ADN y ARN [7-9]. Hasta el momento,
no se ha encontrado bibliografía disponible que demostrara la actividad de las
TSCs contra el VHC. Cabe mencionar que estudios recientes, empleando derivados
de vitamina A (agentes retinoides) y de aldehídos aromáticos han demostrado
potente actividad in vitro en una nueva línea de VHC de replicón subgenómico
Huh7 ET (luc-ubi-neo/ET). Sin embargo, aún no se ha propuesto ningún mecanismo
de acción para esta probada actividad [40]. Los estudios de actividad anti-VHC de
TSCs de 1-indanonas descriptos en la presente tesis y el artículo mencionado [40]
constituyen los hallazgos más recientes en relación a la actividad anti-VHC por
parte de TSCs.
34
I. 2. CICLODEXTRINAS (CDs)
I. 2. 1. Historia y generalidades
La posibilidad de controlar o manipular la estructura de los materiales a nivel
molecular mediante técnicas de nanotecnología, ha abierto un sinnúmero de
alternativas en el campo (bio)farmacéutico. Esta área emergente se ha
capitalizado para la resolución de problemas en la formulación de fármacos poco
solubles y/o inestables. Una de las estrategias nanotecnológicas más ampliamente
investigadas
para
solubilizar
y
estabilizar
fisicoquímicamente
compuestos
liposolubles es su complejación con CDs [41,42].
Las CDs son oligosacáridos cíclicos naturales formados por 6, 7 u 8 unidades de
D(+)-glucopiranosa (referidas como CDs α, β y γ, respectivamente), unidas a través
de enlaces α-(1,4) glucosídicos [43]. Las mismas fueron aisladas por primera vez
por Villiers en 1891 a partir de productos de degradación enzimática del almidón
[43].
La estructura química general de una CD natural y una químicamente modificada
se representa en la Figura I. 2. 1. Las CDs poseen una estructura tridimensional
de cono anular truncado; los grupos -OH están orientados hacia el exterior,
formando un revestimiento altamente hidrofílico que las hace solubles en agua,
mientras que la cavidad de tamaño nanoscópico es hidrofóbica, y es la
responsable de la inclusión parcial o total de moléculas lipofílicas dando lugar a
complejos de inclusión (Figura I. 2. 1) [44]. La capacidad de inclusión estará
gobernada por el tamaño de la cavidad y el de la molécula a incluir así como
también por las interacciones químicas entre los grupos funcionales de ambos
componentes
del
complejo.
Dicho concepto
de
“complejo
de
inclusión
molécula/ciclodextrina” fue introducido por Pringsheim en 1932 [44].
La primera patente relacionada con CDs se introdujo en 1953 por Freudenberg,
Cramer y Plieninger y se tituló: “Método para la preparación de complejos de
inclusión de compuestos orgánicos fisiológicamente activos” [45]. Veinte años
más tarde, en 1976, se introdujo en el mercado japonés el primer producto
farmacéutico mundial que contuvo CDs [45]. Se trató de una presentación de
comprimidos sublinguales a base de complejos de inclusión de prostaglandina E2
con β-CD (Prostarmon E®; Ono, Japón), como inductivo del parto.
35
Región hidrofílica
Cavidad hidrofóbica
Región hidrofóbica
R’, R’’ = H para CDs nativas
R’, R’’ = CH3 para metil-CDs
R’, R’’ = CH2-CH-(OH)CH3 para 2-hidroxipropil-CDs
n = 1,2,3 (alfa, beta, gamma-CD respectivamente)
Figura I. 2. 1. Representación de la estructura química general y de las regiones
hidrofílicas/hidrofóbicas de las CDs naturales y modificadas químicamente actualmente
disponibles en el mercado farmacéutico [46,47].
No fue hasta 12 años más tarde, cuando comprimidos a base de complejos de
piroxicam/β-CD (Brexin®; Chiesi, Italia) fueron comercializados en Italia para el
tratamiento de la artritis rematoidea [45]. Además de las CDs naturales,
actualmente
existen
derivados
modificados
químicamente
que
han
sido
desarrollados para mejorar la solubilidad acuosa, la capacidad complejante y
reducir la toxicidad de las CDs nativas. Entre los derivados más ampliamente
utilizados se encuentran los parcialmente metilados e hidroxi-alquilados ya que
poseen una solubilidad acuosa hasta 100 veces superior a la de la CD nativa
correspondiente [41]. Por ejemplo, 2-hidroxipropilβ-CD (HPβ-CD) es obtenida por
tratamiento de una solución de β-CD con óxido de propileno, resultando en un
sistema isomérico que tiene una solubilidad en agua mayor al 60% p/v. Recién en
el año 1997, fue aprobado el primer producto farmacéutico en el mercado de los
EEUU a base de HPβ-CD, conteniendo itraconazol como principio activo
(Sporanox®; Janssen-Cilag, EEUU) [45]. Esta formulación es actualmente utilizada
en nuestro país en el ámbito de farmacia hospitalaria. Se encuentra disponible en
36
formas farmacéuticas para administración oral (cápsulas y jarabe), y se utiliza en
el tratamiento de las micosis severas, como la candiasis oral y/o esofágica en
pacientes inmunocomprometidos por VIH u otras etiologías. Las diferentes CDs
nativas y químicamente modificadas comercialmente disponibles se resumen en la
Tabla I. 2. 1.
Tabla I. 2. 1. Características de CDs naturales y químicamente modificadas más utilizadas
en la industria farmacéutica
CDa
Unidades
de glucosa
6
Diámetro
de cavidad
(Å)
4,7 – 5,3
Volumen
de cavidad
(Å3)
174
Grado de
sustitución
molarb
-
Peso
molecular
(Da)
972
Solubilidad
en aguac
(g/100 ml)
14,5
α-CD
β-CD
7
6,0 – 6,5
262
-
1135
1,85
HPβ
β-CD
7
6,0 – 6,5
262
0,50
~1400
>150
Mβ
β-CD
7
6,0 – 6,5
262
1,80
~1310
>150
SBEβ
β-CD
7
6,0 – 6,5
262
0,90
~2163
>150
γ-CD
8
7,5 – 8,3
427
-
1297
23,2
HPγγ-CD
8
7,5 – 8,3
427
0,60
~1574
>200
a
alfa-ciclodextrina (α-CD) beta-ciclodextrina (β-CD), gama-ciclodextrina (γ-CD), 2-hidroxipropil-βciclodextrina (HPβ-CD), metil-β-ciclodextrina (Mβ-CD), sulfobutiléter-β-ciclodextrina (SBEβ-CD), 2hidroxipropil-γ-ciclodextrina (HPγ-CD).
b
Grado de sustitución molar: Promedio del número de sustituyentes por unidad de glucopiranosa.
c
Solubilidad en agua ultrapura a 25°C.
Así, las CDs encuentran actualmente múltiples aplicaciones en la industria
farmacéutica. Dos tipos de complejos pueden coexistir en solución: (i) complejos
de inclusión y (ii) complejos de no-inclusión [45,48]. En el primer caso, las
moléculas del principio activo se incorporan a la cavidad, de forma total o parcial,
mientras que en el segundo, la interacción del fármaco ocurre con grupos
funcionales presentes en la superficie hidrofílica de la CD. En ambos casos, el
fármaco debe ser liberado para ejercer su actividad. Por otro lado, las CDs
protegen a los fármacos del oxígeno, la radiación UV y de agentes de degradación
en el entorno biológico como por ejemplo enzimas y las liberan uniformemente
durante un tiempo más o menos prolongado que dependerá de la afinidad
fármaco/CD. Cabe mencionar, aunque no será tema de desarrollo en esta tesis
doctoral, que las CDs son además ampliamente utilizadas en la industria
alimenticia, cosmética, agroquímica (en la encapsulación de sabores, fragancias, y
pesticidas tóxicos) y en métodos analíticos de separación quiral por electroforesis
37
capilar, HPLC, GC, entre otras (principalmente en la resolución de enantiómeros)
[43].
Nuevas tecnologías basadas en CDs se encuentran en constante desarrollo. Cien
años más tarde del descubrimiento de las mismas, aún son reconocidas como
excipientes novedosos con gran potencial para ser explotado.
I. 2. 2. Propiedades fisicoquímicas
Una de las propiedades fisicoquímicas más importantes de las CDs es la solubilidad
acuosa relativamente elevada. En general, son materiales solubles en agua y en
solventes polares apróticos como DMSO y DMF y prácticamente insolubles en
solventes orgánicos tales como: acetona, CH2Cl2, MeOH, etc. Sin embargo, las CDs
modificadas químicamente son solubles además en MeOH, EtOH y piridina,
permitiendo formar complejos de inclusión con diversas drogas poco solubles en
agua, mediante la utilización de mezclas de solventes orgánicos adecuados [43].
La β-CD posee solubilidad acuosa limitada (~1,85% p/v, Tabla I. 2. 1) debido a la
formación de enlaces puente hidrógeno entre los grupos –OH secundarios, los
cuales generan un cinturón rígido, estable y difícil de hidratar. En α-CD y γ-CD
este cinturón se encuentra distorsionado por razones geométricas, por lo que la
solubilidad se ve altamente incrementada, en relación a la β-CD nativa, con
concentraciones máximas que llegan hasta 14,5% y 23,2%, respectivamente (Tabla
I. 2. 1). La sustitución de los grupos -OH, como en el caso de las β-CDs
modificadas químicamente, dificulta la formación de uniones intramoleculares y
aumenta la solubilidad en agua (Tabla I. 2. 1) [49].
La diferencia de tamaños de la cavidad determina que las mismas pueden formar
complejos de inclusión con moléculas de tamaños muy diversos (Tabla I. 2. 1). Es
así, que α-CD formará complejos de inclusión con compuestos de bajo peso
molecular, β-CD lo podrá hacer con compuestos aromáticos y heterocíclicos, y γCD con moléculas de mayor tamaño como compuestos macrocíclicos y esteroides.
I. 2. 3. Aplicaciones (bio)farmacéuticas y beneficios del uso de CDs
El uso de CDs ha sido implementado en una serie muy extensa de aplicaciones
(bio)farmacéuticas. Entre ellas, cabe mencionarse las siguientes:
(i) Incremento de la biodisponibilidad oral, sublingual, parenteral, tópica y
oftálmica de drogas poco solubles en agua
38
(ii) Incremento de la intensidad o la duración de la acción terapéutica de
diversas drogas
(iii) Incremento de la estabilidad química de fármacos inestables a pH gástrico
(iv) Enmascaramiento de sabores y olores de ciertos fármacos, haciendo las
formulaciones más aceptables por parte de los pacientes
(v) Estabilización químicamente de fármacos inestables a la luz, radiaciones UV,
temperatura, oxidación y/o hidrólisis
(vi) Disminución de la toxicidad de drogas
(vii) Reducción de la irritación dermal, ocular y gastrointestinal de drogas
(viii) Prevención de la autoagregación de fármacos, proteínas y péptidos
lipofílicos en medio acuoso
(ix) Prevención de interacciones droga-excipiente
(x) Conversión de sustancias líquidas en polvos microcristalinos
(xi) Crio/lioprotección en procesos de congelamiento/liofilización
(xii) Vehiculización de nuevos fármacos de baja solubilidad acuosa, para la
evaluación de su actividad biológica en ensayos celulares in vitro
Además, la buena biocompatibilidad de las CDs permite su implementación en el
desarrollo de medicamentos que son administrados por diferentes vías:
(i) Oral y sublingual
(ii) Parenteral
(iii) Oftálmica
(iv) Nasal
(v) Dérmica y Transdérmica
(vi) Rectal
(vii) Pulmonar
Algunas formulaciones relevantes fármaco/CD que se encuentran disponibles en el
mercado farmacéutico mundial y sus principales vías de administración/forma
farmacéutica se resumen en la Tabla I. 2. 2 [41,45].
Es importante destacar que debido a la toxicidad parenteral de β-CD, la misma no
se encuentra disponible en formulaciones IV e IM (Tabla I. 2. 2).
39
Tabla I. 2. 2. CDs y tipo de formulaciones fármaco/CD más relevantes del mercado
farmacéutico mundial
Complejos fármaco/CD
CD
Fármaco
Formulación
(vía de administración/forma farmacéutica)
α-CD
Cefotiam hexetil HCl
Oral/comprimidos
Alprostadilo (PGE1)
Parenteral/sc e infusión IV
Piroxicam, omeprazol
Oral/comprimidos
Cetirizina
Oral/comprimidos para mascaticar
Iodo
Oral/Tópico bucal-gargarismos
β-CD
Nicotina, PGE2, nitroglicerina
Oral/comprimidos sublinguales
Dexametasona
Dérmica/ungüento
Meloxicam
Rectal/supositorios
Itraconazol
Oral/sc líquida, jarabe y cápsulasa
Itraconazol, diclofenac
Parenteral/sc IV
Mitomicina
Parenteral/infusión IV
HPβ
β-CD
Indometacina
Oftálmica/sc-colirios
Cisaprida
Rectal/supositorios
Cloranfenicol
Oftálmica/sc-colirios
Mβ
β-CD
Nasal/spray
17β-Estradiol, insulina
Voriconazol
Oral/comprimidos recubiertos
Voriconazol
Parenteral/infusión IVa,b
SBEβ
β-CD
Ziprasidona mesilato
Parenteral/IMb
Diclofenac sódico
Oftálmica/sc-colirios
HPγγ-CD
a
Formulaciones de uso hospitalario en Argentina
b
Polvo liofilizado para su reconstitución
I. 2. 4. Complejación de principios activos hidrofóbicos utilizando CDs
Las características estéricas y la polaridad del principio activo no sólo
determinarán la factibilidad de inclusión del mismo en cada tipo de CD, sino que
también condicionarán la orientación dentro de la cavidad [43]. Las interacciones
que se establecen en los complejos de inclusión fármaco/CD son de carácter no
covalente y de distinta naturaleza: fuerzas hidrofóbicas, de Van der Waals, puente
hidrógeno, interacciones electrostáticas, transferencia de carga, etc [50]. El
proceso de asociación/disociación es dinámico, por lo que coexisten en solución
las distintas especies al mismo tiempo: (i) el complejo fármaco/CD, (ii) las formas
libres de CD y (iii) las formas libres de fármaco [51]. Cuando se produce la
complejación se generan cambios en las propiedades fisicoquímicas del fármaco y
de la CD que pueden ponerse de manifiesto utilizando diversas técnicas. Los
métodos más usuales se basan en la determinación de la variación que sufre el
fármaco, cuando se encuentra complejado, en relación a la solubilidad y la
estabilidad química en medio acuoso, las modificaciones en el espectro de
absorción en la región UV-Vis, el tiempo de retención en una columna
cromatográfica, las propiedades cristalinas, la temperatura y la entalpía de
fusión, las señales características en espectroscopía infrarroja y las diferencias del
40
desplazamiento químico “para el fármaco y/o la CD”, en las señales de los
espectros de 1H-RMN, entre otros [52]. Una aproximación de gran uso es la
construcción de los diagramas de solubilidad de fases (Figura 1. 2. 2), que
consiste en el estudio de la influencia de la concentración de una CD determinada
sobre la solubilidad del fármaco en estudio. Los resultados se expresan en
diagramas que pueden ser de tipo A o B, y que son conocidos como diagramas de
solubilidad de fases de Higuchi y Connors (Figura I. 2. 2) [53]. Los diagramas
pueden adoptar las siguientes formas [41,53]:
A) Tipo A: La solubilidad del fármaco aumenta con el aumento de la
concentración de CD. Este incremento puede dar lugar a 3 tipos de
comportamiento:
-AL: La dependencia es lineal; se asume que la estequiometría del complejo
fármaco/CD es una relación molar 1:1 (fármaco:CD). Si la pendiente es
mayor a 1, se asume la formación de complejos de mayor orden, aunque
pendientes menores a la unidad no excluyen la formación de los mismos
[41].
-Ap: Se observa una desviación positiva de la linealidad; la estequiometría
del complejo fármaco/CD es una relación molar 1:1 en la porción lineal
inicial y 1:2 o mayor a concentraciones mayores de CD.
-AN: Se produce una desviación negativa de la linealidad, debido a una
disminución en la solubilidad del complejo. Una explicación es la formación
de estructuras macromoleculares como consecuencia de la asociación
parcial de varias unidades de CD, dando lugar a agregados supramoleculares
[54].
B) Tipo B: El incremento de la solubilidad del fármaco no es dependiente de la
concentración de CD (dependencia no lineal), dando lugar a complejos de
inclusión de solubilidad limitada.
-Bs: Formación de complejos de baja solubilidad, como en el caso de
complejos formados por compuestos y β-CD nativa, ambos de limitada
solubilidad en agua.
-Bi: Formación de complejos insolubles.
41
Solubilidad
del huésped
Concentración de ciclodextrina
Figura I. 2. 2. Diagramas teóricos de solubilidad de fases [53].
Las constantes de complejación o de estabilidad aparente de los complejos 1:1
(K1:1) se estiman a partir de la pendiente obtenida de los diagramas de fases del
tipo A, en la región lineal de los mismos, mediante la siguiente ecuación 1 [41]
K1:1= pendiente / [S0*(1-pendiente)] (1)
Donde S0, es la solubilidad intrínseca en agua del fármaco en estudio, tratado bajo
idénticas condiciones en ausencia de CD.
La K1:1 se considera óptima si se halla entre los valores de 50–2000M-1 [41,54,55].
Valores menores a 50M-1 indican una débil interacción fármaco/CD y posiblemente
una baja capacidad de solubilización, mientras que valores superiores a 2000M-1
revelan una interacción fármaco/CD fuerte que dificulta la liberación del fármaco
desde el reservorio. Por otro lado, la EC se encuentra definida como el producto
de la solubilidad intrínseca del fármaco y la constante de estabilidad aparente del
complejo, mediante la ecuación 2 [56]
EC = [D x CD]/[CD]= S0 x K1 :1 = pendiente/(1-pendiente) (2)
donde [D x CD] es la concentración soluble del complejo fármaco/CD y [CD] es la
concentración de ciclodextrina soluble libre de fármaco [57]. El empleo de los
42
valores de EC es más conveniente que el de los de K1:1, debido a que en ellos se
considera el dato de solubilidad aparente en agua del fármaco en estudio [56].
Es importante destacar que si bien los diagramas de solubilidad de fases son de
gran utilidad, por sí solos no confirman la formación de un complejo fármaco/CD.
Únicamente ponen de manifiesto el incremento de la solubilidad de una droga en
presencia de una determinada CD. Es por eso, que es necesario complementar
estos estudios de solubilidad de fases con otros que aporten información directa o
indirecta acerca de las interacciones que tienen lugar en el sistema, como
estudios espectroscópicos de RMN, FT-IR, XDR, DLS, DSC, entre otros.
I. 2. 5. Métodos de formación de complejos de inclusión fármaco/complejante
Se han evaluado diferentes métodos para la preparación de complejos de inclusión
utilizando CDs [43]. La eficiencia del proceso dependerá de la naturaleza de la
droga en estudio y de la CD utilizada. Los métodos comúnmente utilizados son los
siguientes [43]:
A) Disolución: Este método consiste en adicionar un exceso de fármaco a una
solución acuosa de CD, bajo agitación constante en un sistema cerrado y a
temperatura ambiente. El tiempo del proceso varía según el fármaco a complejar
y se extiende hasta alcanzar el equilibrio de saturación del compuesto.
Seguidamente, el sistema es filtrado o centrifugado para separar el compuesto no
soluble. La eliminación de agua puede realizarse por evaporación o liofilización
(esta última metodología se utiliza especialmente en el caso de huéspedes
volátiles o lábiles a temperaturas elevadas).
B) Co-precipitación: El método consiste en gotear una solución de fármaco a
complejar sobre una solución de CD en agua, bajo agitación magnética. El
precipitado se recoge por decantación, filtración o centrifugación.
C) Método de evaporación del solvente (cosolvente): El método consiste en la
solubilización de la CD y el huésped pobremente soluble en agua, en algún
solvente orgánico volátil adecuado, que posteriormente pueda ser fácilmente
eliminado por evaporación en rotavapor, obteniendo los complejos sólidos.
D) Atomización: Se prepara una solución del fármaco y la CD utilizando un
solvente orgánico adecuado y se elimina el mismo por atomización formando
partículas sólidas de complejo de tamaño controlado. Es un método ideal para el
control de la agregación de partículas, pero no es adecuado para huéspedes
volátiles o lábiles a la temperatura.
43
E) Método del amasado en mortero: El método consiste en formar una pasta
homogénea entre la CD y el fármaco utilizando una mínima cantidad de agua o
mezcla hidroalcohólica. El tiempo requerido en el amasado dependerá del
huésped a complejar. Luego se procede al secado.
F) Mezcla física: El método consiste en realizar una mezcla física de la droga y CD
en proporciones estequiométricas del complejo de inclusión a formar, mediante la
simple mezcla de los sólidos.
En general, los procedimientos E) y F) proporcionan rendimientos bajos de
encapsulación.
De acuerdo a las propiedades del fármaco y la CD en estudio se debe seleccionar
la metodología a utilizar para optimizar la complejación [50]. Por otro lado, la
predicción del método óptimo de complejación es dificultosa. En casos
particulares también es necesario combinar varias metodologías para optimizar
resultados. En este contexto, el diseño del proceso de preparación constituye una
etapa crucial y en muchos casos demanda no sólo esfuerzos experimentales sino
también la implementación de estrategias innovadoras.
I. 2. 6. Autoagregación de CDs y complejos de inclusión huésped/CD
La autoagregación de CDs en medio acuoso, como la de sus complejos con
moléculas de distinta naturaleza, fue un fenómeno desconocido durante décadas
[47,54,58]. No obstante, se ha descripto la formación de agregados de CDs de
tamaño nanoscópico (< 20 nm), los cuales no alteraron las propiedades ópticas de
las soluciones que permancieron transparentes [41]. En otros casos, se observó el
crecimiento de los agregados hasta alcanzar tamaños que pudieron ser
visualizados microscópicamente [41]. La observación general, es que las CDs
nativas α-CD, β-CD y γ-CD tienden a autoagregarse y estos agregados aumentan su
tamaño a medida que aumenta la concentración de CD en el medio [54,58]. En
general, la tendencia a agregarse de una determinada CD aumenta con la
disminución de su solubilidad acuosa. Los agregados de mayor tamaño han sido
observados para β-CD, los cuales han llegado a alcanzar varios micrómetros [54].
La baja solubilidad en agua de β-CD, como ha sido mencionado anteriormente,
justifica este comportamiento anómalo.
Los grupos –OH de las CDs nativas juegan un rol de gran importancia en la
autoagregación y es por este motivo que las CDs modificadas químicamente tienen
una menor tendencia a la misma [54,58].
44
Asimismo, los agregados de complejos de inclusión huésped/CD son reconocidos
por ser buenos solubilizadores del huésped por formación de complejos de noinclusión o estructuras de tipo micelar [48]. Actualmente, es bien sabido, que la
autoagregación de los complejos de inclusión puede estar influenciada por la
naturaleza del propio huésped, sobre todo si este tiende a la autoagregación (ver
Capítulo I. 1. 4) [54]. Por otro lado, la complejación de este tipo de huésped con
CDs puede prevenir la autoagregación del mismo y la posterior formación de una
red cristalina y precipitación en medio acuoso [38,59,60]. En otras palabras, si
bien la autoagregación de los complejos fármaco/CD provoca un aumento del
tamaño, su naturaleza es diferente a la del fármaco puro autoagregado ya que se
previene la formación de uniones soluto-soluto fuertes las cuales son responsables
de la pobre solubilidad intrínseca del fármaco en agua.
I. 2. 7. Modificación del perfil de liberación de fármacos utilizando CDs
Como fuera mencionado previamente, cuando un complejo de inclusión
fármaco/CD es solubilizado en un medio acuoso, dos pasos fundamentales estarán
involucrados en la liberación del huésped: (i) la disolución del complejo y (ii) la
liberación del huésped al ser reemplazado por moléculas de agua. Así, se
establece un equilibrio dinámico entre la forma libre y la forma complejada del
fármaco y la CD. Otros dos factores claves en la liberación del huésped son: el
tipo de CD utilizada en la formación del complejo y la afinidad de la molécula a
complejar con dicha CD. Es así, como ciertas CDs tendrán un perfil de liberación
característico para un determinado tipo de molécula. A continuación se detallan
los diferentes perfiles de liberación que se pueden alcanzar mediante la
complejación de fármacos con CDs [41]:
A) Liberación inmediata: Se favorece el aumento de la disolución y absorción de
drogas de baja solubilidad en medio acuoso, utilizando CDs químicamente
modificadas del tipo hidrofílicas como HPβ-CD, Mβ-CD y SBβ-CD.
B) Liberación prolongada: Se favorece la liberación prolongada de drogas con alta
solubilidad en medio acuoso, utilizando CDs químicamente modificadas del tipo
hidrofóbicas como etilβ-CDs y acilβ-CDs.
C) Liberación modificada: Favorece un aumento de la biodisponibilidad oral del
fármaco con prolongación del efecto terapéutico, mediante el uso simultáneo de
diferentes CDs y otros excipientes como materiales poliméricos.
45
D) Liberación retardada: Estos sistemas consisten en retardar la liberación de un
fármaco a través de la modificación del tiempo de liberación (liberación pHdendiente) o del direccionamiento mediante el empleo de un derivado químico
hacia un tipo particular de célula blanco (liberación sitio-específica).
-Liberación pH-dependiente: Protección de drogas susceptibles a la hidrólisis a
pH gástrico, utilizando carboximetil- y carboxietil-β-CD (CM y CEβ-CD). La
liberación del fármaco complejado se logra cuando dichas CDs se ionizan en el
intestino (medio alcalino) y posteriormente se produce la absorción del mismo.
-Liberación sitio-específica: Direccionamiento de fármacos a una localización
biológica determinada utilizando conjugados droga-CD unidos covalentemente
mediante enlaces del tipo amida o éster (pro-droga) (bio)reversibles, a través de
una degradación del tipo enzimática a nivel del sitio específico. Un ejemplo
característico, es el direccionamiento pasivo al colon utilizando conjugados
fármaco-CD que atraviesan inalterados el tracto gastrointestinal y que son
degradados por enzimas de la microflora natural en el intestino grueso para ser
liberados en el colon.
I. 2. 8. Consideraciones toxicológicas
Las CDs se consideran seguras para administración por vía oral ya que su absorción
gastrointestinal es prácticamente nula. A pesar de que se ha demostrado la
inocuidad oral de la β-CD, esta CD extrae el colesterol presente en los rafts
lipídicos de la membrana celular provocando citotoxicidad. En caso de la
administración IV, los complejos colesterol/β-CD pueden precipitar en sangre y
pueden llevar al colapso del sistema cardiovascular [61]. Es por ello, que la β-CD
no puede ser administrada por la vía IV. Para sistemas parenterales de liberación
de fármacos resultaron de gran utilidad HPβ-CD y SBEβ-CD. Existen formulaciones
en el mercado farmacéutico como Sporanox® y Vfend® (Pfizer, Europa y EEUU), de
administración IV, que contienen HPβ-CD y SBEβ-CD en concentraciones del 40 y
16% p/v, respectivamente [41,50]. Por otra parte, las CDs son potencialmente
útiles en formulaciones para la liberación ocular de fármacos (por ejemplo HPγ-CD
y Mβ-CD), ya que no irritan el epitelio de la córnea ni la conjuntiva ocular [62].
También son utilizadas en sistemas de liberación nasal (por ejemplo Mβ-CD)
mostrando inocuidad y seguridad para su uso; las CDs actúan como promotores de
la absorción de péptidos y proteínas sin dañar el funcionamiento mucociliar [49].
46
I. 2. 9. Ciclodextrinas y efecto antiviral - Antecedentes
Es un hecho conocido que las β-CD y β-CD modificadas como Mβ-CD y HPβ-CD (ésta
última en menor medida) son capaces de depletar el colesterol de las membranas
lipídicas de aquellos virus que la posean. Así, se han formulado preparaciones
farmacéuticas tópicas que han sido diseñadas para la prevención y el tratamiento
del Herpes labialis y genitalis [63]. En los últimos 10 años, dicho efecto fue
evaluado en otros tipos de virus de mayor relevancia en clínica, como el VIH, VHB
y VHC [64-66]. En el caso de VHC, se ha comprobado que no sólo se ha logrado
disminuir la tasa de replicación del virus por depleción del colesterol y ciertos
fosfolípidos de membrana, sino también por otro mecanismo asociado, la
disminución en la infectividad a través de la depleción de receptores de tipo
CD81, proteína integral de membrana de la familia de las tetranspaninas del
hepatocito, que colabora junto a otros receptores en la entrada del virus a la
célula mediada por la interacción con las glicoproteínas de la envoltura del VHC
(ver Capítulo I. 3. 2) [67].
Diversas formulaciones a base de complejos de inclusión de CDs con antivirales
como RBV [68], aciclovir [69], ganciclovir [70] y cosalano [71], han sido evaluadas
in vitro e in vivo y han demostrado ventajas significativas tanto en la mejora de la
biodisponibilidad de dichos fármacos en ciertos reservorios virales (por ejemplo,
sistema nervioso central), como en la actividad antiviral en relación a la de los
fármacos sin complejar.
La posibilidad de mejorar los perfiles de actividad antiviral de fármacos
actualmente en uso clínico y de nuevos fármacos mediante el empleo de CDs
resulta ser un área emergente de potencial desarrollo y gran interés.
I. 2. 10. Otras aplicaciones tecnológicas de CDs de interés (bio)farmacéutico
Los colirios, soluciones o suspensiones acuosas u oleosas a ser instiladas en el
fondo del saco conjuntival del ojo, representan el 90% de todas las formulaciones
oftálmicas, aunque poseen grandes limitaciones en la biodisponibilidad de los
fármacos comúnmente incluidos en ellas y pueden llevar a serios efectos adversos
por absorción sistémica inadecuada [72]. El fármaco aplicado de forma tópica en
el ojo sufre un proceso de absorción principalmente a través de la córnea, un
proceso de distribución a los tejidos oculares y un proceso de metabolismo y
excreción [72]. La aplicación tópica de un fármaco en el ojo normalmente
47
conlleva una pérdida cercana al 95% de la dosis administrada, lo que significa que
su biodisponibilidad es extremadamente baja [72].
El desarrollo de sistemas oculares de liberación de fármacos tiene como objetivos
principales aumentar la permeabilidad y absorción del fármaco a través de la
córnea y prolongar su tiempo de vida media en el ojo, para reducir la dosis
requerida, minimizar la absorción sistémica y mejorar así la eficacia del
tratamiento. En este contexto, el número de formulaciones oculares conteniendo
CDs ha aumentado notablemente en los últimos años [41,45]. El aumento de la
adherencia a los regímenes terapéuticos es siempre un objetivo de importancia en
el diseño de una formulación farmacéutica, el cual puede ser alcanzado mediante
el desarrollo de sistemas que reducen la frecuencia de administración y que
disminuyen los efectos adversos [73]. Es así, que nuevas plataformas tecnológicas
como por ejemplo las lentes de contacto blandas (SLCs) o hidrogeles conteniendo
CDs para la liberación de fármacos en el ojo, resulten atractivas y se encuentren
en constante desarrollo.
I. 2. 10. 1. Hidrogeles a base de CDs en el desarrollo de lentes de contacto
blandas medicadas e implantes de liberación controlada de fármacos en el ojo
Desde un punto de vista estructural, las SCLs son hidrogeles. Los hidrogeles son
materiales poliméricos entramados en forma de red tridimensional de origen
natural o sintético, que se hinchan en contacto con una fase acuosa formando
materiales blandos y elásticos, y que retienen una fracción significativa de agua
manteniendo íntegra su estructura [42,73,74]. Las uniones de entrecruzamiento
en los hidrogeles son de naturaleza covalente por lo cual son insolubles en agua.
Desde que los hidrogeles se introdujeron en el campo de la biomedicina, ha
quedado asentado que poseen un gran potencial como biomateriales, debido a su
elevada biocompatibilidad [42]. Esta característica se debe a que las propiedades
físicas, reológicas y mecánicas de los mismos (contenido en agua relativamente
alto, consistencia blanda y elástica y baja tensión superficial) los asemejan a
tejidos blandos [42].
La posibilidad de abordar simultáneamente dos problemáticas: (i) la corrección de
una perturbación visual y (ii) el tratamiento farmacológico de una patología
ocular, tiene un atractivo interesante, pero es necesario que el fármaco sea
incorporado en la cantidad suficiente y que se libere posteriormente a la
velocidad adecuada para mantener concentraciones dentro de la ventana
48
terapéutica. La dificultad que encierra dotar a las lentes de estas dos
funcionalidades
constituyó
un
obstáculo
durante
muchos
años,
pero
recientemente se han puesto a punto aproximaciones novedosas que han abierto
perspectivas interesantes para que el uso de las lentes de contacto medicadas
pueda llegar a ser clínicamente viable. Una de dichas aproximaciones constituye
el anclaje de CDs a hidrogeles preformados [74].
La incorporación de CDs a los hidrogeles de calidad oftálmica (SCLs o implantes de
liberación
controlada)
tiene
por
objetivo
fundamental
incrementar
la
incorporación de un determinado tipo de fármaco para su posterior liberación
controlada en el ojo y se realiza principalmente por la unión de las mismas a
esqueletos poliméricos preformados. Es así, como a través de la preparación de
hidrogeles a base de monómeros derivados del ácido acrílico, como el HEMA y
GMA, en diferentes proporciones se puedan anclar CDs colgantes. El injerto de CDs
en la cadena lateral se produce por ejemplo, a través de la reacción de los grupos
glicidilo del GMA con los grupos -OH de la CDs nativas en medio alcalino [74-76].
Cuando las SLCs se sumergen en una disolución concentrada de fármaco, pueden
captarlo en pequeñas cantidades, alojándolo en la fase acuosa del hidrogel o
incorporándolo al entramado polimérico mediante adsorción inespecífica [73,74].
La facilidad de uso y el bajo costo de los procesos de fabricación hacen que las
SCLs resulten muy atractivas como sistemas de liberación ocular de fármacos.
Aunque se requiere profundizar en la investigación, especialmente en los ensayos
in vivo, los avances recientes permiten predecir que en un futuro no muy lejano
pueden convertirse en un instrumento muy útil para prolongar la permanencia de
los fármacos en el área precorneal, reduciendo su absorción sistémica y
mejorando el cumplimiento de las pautas posológicas. Las ventajas y desventajas
del uso de SCLs impregnadas para la liberación ocular de fármacos se resumen en
la Tabla I. 2. 3.
49
Tabla I. 2. 3. Ventajas y desventajas de la SCLs para la liberación de fármacos en ojo.
Ventajas
Desventajas
La liberación del fármaco en el ojo es gradual
Existen dificultades para dotar a las SLCs de dos
funcionalidades de manera adecuada y
simultánea: corrección de un problema de visión
y tratamiento farmacológico de una patología
ocular
La incorporación del fármaco a las SCLs se
realiza por parte del paciente en el momento de
la aplicación y consiste en la inmersión de las
mismas en una solución o suspensión del
fármaco de interés
La permanencia del fármaco en el área
precorneal
es
más
prolongada
y
la
concentración de fármaco que difunde hacia la
superficie corneal es 5 veces superior a la que
se libera al fluido lacrimal externo
La penetración del fármaco es más eficaz
Poca aceptación por parte del paciente en el
uso de SLCs
Se logra una dosificación del fármaco más
ajustada
Mejor cumplimiento del régimen terapéutico ya
que no hay que administrar el medicamento de
forma repetida y continuada como en caso de
los colirios y las pomadas oftálmicas
No existe rechazo del fármaco por parte del ojo
como en el caso de los colirios y pomadas, dado
que la lente se halla adherida a la superficie del
globo ocular
--
--
--
Independientemente de los desafíos planteados para el diseño de sistemas de
liberación ocular que aborden las dos problemáticas, el empleo de SCLs que sólo
permitan la administración de fármacos presenta ventajas notables frente a otras
formulaciones oftálmicas convencionales.
50
I. 3. VIRUS de la HEPATITIS C (VHC)
I. 3. 1. Generalidades: Prevalencia, incidencia e impacto socioeconómico
A partir de la caracterización molecular del VHC en 1989 [77], se lograron
establecer las bases para el control de una de las enfermedades infecciosas de
mayor trascendencia sanitaria a escala mundial, causada por un agente vírico
productor de una enfermedad crónica conocida como HCC. Según la OMS se estima
una prevalencia global del 3%, lo que representa aproximadamente 175 millones
de personas portadoras de VHC en todo el mundo [78], aproximadamente cinco
veces más que el número de infectados por el VIH de tipo I [78]. Actualmente, la
aparición de nuevos casos de infección por VHC es de 3 a 4 millones por año [78].
Se calculan 370 mil infectados residentes en nuestro país, lo que indica que
alrededor de 1 de cada 100 donantes de sangre se encontraría infectado con el
virus. Asimismo, por tratarse de una enfermedad asintomática durante un período
prolongado, una gran cifra de personas infectadas es desconocida. La primera
característica de la infección por el VHC es su elevada tasa de evolución a la
cronicidad.
Es
la
primera
causa
de
enfermedad
hepática
crónica,
descompensación hepática, HCH y transplante hepático [79]. En un 80 % de los
casos no se logra superar la infección aguda, de modo que ésta persiste, dando
lugar a las complicaciones mencionadas con el transcurso de los años [80].
Una estimación del impacto socioeconómico de la HCC revela un gasto de 1 billón
de dólares anuales en los EEUU en cuidado médico y pérdida de ingresos
relacionados [79,81]. Se ha calculado que entre los años 2010–2019, el VHC podrá
causar una pérdida cercana a 1,83 millones de años de vida útil, previéndose una
pérdida aproximada de 54 billones de dólares [81].
Además, el VHC no solo infectaría hepatocitos, sino también
podría infectar
células del sistema inmune (monocitos, macrófagos, células dendríticas, entre
otras), epiteliales y células que se encuentran en sitios inmunológicamente
privilegiados como el sistema nervioso, con lo que podría asociarse a la génesis de
linfomas B, siendo una causa importante de enfermedades autoinmunes y
dermatosis diversas [79].
I. 3. 2. Estructura genómica del virus
El VHC es un virus envuelto, con genoma ARN monocatenario de polaridad
positiva, de aproximadamente 9.600 nucleótidos, que posee un diámetro
aproximado de 50 nm (Figura I. 3. 1) [79,82]. El VHC es el único miembro del
51
género Hepacivirus perteneciente a la familia Flaviviridae [78]. Comparte esta
familia, con miembros del género Flavivirus, al que corresponden los virus del
dengue y de la fiebre amarilla, y con miembros del género Pestivirus, como el
VDVB-1, el VDVB-2 y el virus clásico de la fiebre porcina.
50 nm
Figura I. 3. 1. Microfotografía TEM del VHC por [82]. Un nanómetro es la billonésima
parte de un metro. Si se agruparan 200.000 partículas virales del VHC, una al lado de la
otra, esto equivaldría tan sólo a un centímetro de largo.
Todos los miembros de la familia Flaviviridae presentan características similares
en la estructura del virión y en la organización genómica que incluyen: la
expresión de los genes virales a partir de un único marco de lectura abierto
ininterrumpido
(ORF),
flanqueado
por
regiones
no
traducidas
altamente
conservadas, y el procesamiento post-traduccional de la poliproteína viral, de
aproximadamente 3000 aminoácidos, mediante una combinación de proteasas
celulares y del propio virus para generar 4 productos génicos estructurales: (i) el
core (C), (ii) las proteínas de envoltura E1 y E2, (iii) el péptido p7 y (iv) 6
productos génicos de naturaleza no estructural o NS: las proteínas NS2, NS3, NS4A,
NS4B, NS5A, y NS5B [83]. El genoma completo del VHC es esquematizado en la
Figura I. 3. 2.
5’UTR
3’UTR
C
E1
E2
p7
NS2
NS3
NS4A
NS4B
NS5A
NS5B
Figura I. 3. 2. Representación esquemática del genoma completo del VHC [84]. En las
regiones 3’ y 5’ se localizan dos regiones no traducidas (UTR) altamente conservadas.
52
Una de las características propias de los virus de ARN, entre los que se encuentra
el VHC, es la ausencia de capacidad de lectura a prueba de errores (proofreading)
de su ARN polimerasa dependiente de ARN, lo que origina la producción continua
de variantes virales (variabilidad intragenoma responsable de la cuasiespecies
víricas) [85]. La heterogeneidad genética intergenómica generada durante la
replicación del VHC ha dado lugar a por lo menos 6 genotipos mayores y más de 80
subtipos (designados como a, b, c, etc) [86], los cuales presentan múltiples
características evolutivas, patogénicas y de respuesta al tratamiento antiviral. Los
subgenotipos 1a y 1b representan el 60% de las infecciones en el mundo.
I. 3. 3. Terapia antiviral en la actualidad
Las opciones terapéuticas disponibles a nivel mundial para el tratamiento de la
HCC en adultos son limitadas, especialmente para el genotipo 1 del virus. El
tratamiento farmacológico estándar actual consiste en la combinación de RBV
(Copegus®, Roche; Rebetol®, Merck), un análogo de purina-nucleosídico [87], con
el inmunomodulador IFN-α clásico o interferones conjugados con moléculas de
PEG (PEGilados) de distintos pesos moleculares y arquitecturas como por ejemplo
PEG-interferón-α-2a
(Pegasys®,
Roche)
y
PEG-interferón-α-2b
(Peg-Intron®,
Merck), cuyos restos de PEG poseen pesos moleculares de 40 y 12 kDa,
respectivamente [88]. Estos productos se administran, gracias a su vida media
más prolongada, por vía SC una vez a la semana durante 24-48 semanas, en
función del genotipo viral. Se ha comprobado que un tratamiento prolongado con
IFN-RBV lleva a una respuesta virológica transitoria y está asociado a efectos
adversos, en general hematológicos tales como: neutropenia, trombocitopenia y
anemia hemolítica [79].
El tratamiento por vía oral sólo con RBV no resultó ser eficaz para tratar la
infección por el VHC, pero cuando se la combina con IFN, los índices de
erradicación viral son más satisfactorios que aquellos logrados solamente con IFN
[87,88].
El
número
de
pacientes
que
responde
al
tratamiento
es
aproximadamente el 50% para los genotipos 2 y 3 que no se encuentran
coinfectados con VIH y conduce a una RVS en el 70-80% de los pacientes. Por el
contrario, la eficacia es menor para el genotipo 1 con tasas de RVS de 40-50%;
este genotipo se conoce como el de mayor dificultad para la erradicación del virus
[87,88].
53
Según el NIH, en uno de sus últimos consensos, el mejor indicador de un
tratamiento anti-VHC eficaz está definido por la RVS, es decir, por la ausencia de
ARN viral detectable en suero o con un límite inferior de detección de 50 UI/ml
luego de 24 semanas de finalizado el tratamiento antiviral [80].
A pesar que la proporción de cura del VHC ha mejorado notablemente con la
terapia combinada IFN-RBV y ciertas pautas de administración, aún no se dispone
de una terapia totalmente eficaz existiendo, no obstante, un elevado porcentaje
de pacientes que no responde a este tipo de tratamiento. Si asimismo se tienen en
cuenta los costos del tratamiento disponible y los efectos adversos del mismo, es
comprensible el por qué del exhaustivo empeño en el diseño de nuevas estrategias
terapéuticas.
I. 3. 4. Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas
El VHC es altamente variable y de evolución rápida, por lo que su erradicación es
un objetivo de difícil alcance para el propio sistema inmune del individuo
infectado y para el diseño de posibles vacunas y nuevas drogas. La caracterización
de gran parte del genoma del VHC ha servido tanto para mejorar la eficacia
terapéutica existente como para el diseño de nuevas estrategias terapéuticas.
El ARN viral codifica para una única poliproteína que es procesada por proteasas
virales y celulares para generar proteínas estructurales y no estructurales. Estas
últimas resultan ser dianas para el diseño de potenciales agentes anti-VHC. Entre
las proteínas no estructurales, la proteína NS5A ha recibido la mayor atención,
debido a su aparente efecto modulador de la respuesta al IFN-α y su importante
papel en la regulación de la replicación del virus [89]. Aunque hasta el momento
la función in vivo de dicha proteína no ha sido revelada por completo, se ha
confirmado la relación entre la heterogeneidad genética de la NS5A y el tipo de
respuesta obtenida en los tratamientos antivirales [90].
Por otro lado, en los últimos años, la investigación sobre la enzima NS5B RdRp
[91] y el estudio exhaustivo de las actividades de la proteína no estructural del
tipo salvaje NS3 resultaron en dianas prometedoras para el desarrollo de nuevos
fármacos [92].
La polimerasa viral específica es fundamental, junto a otras polimerasas celulares,
para la síntesis de la cadena replicativa intermediaria complementaria del ARN. La
proteína NS3 es una proteína no estructural multifuncional la cual posee dos
dominios funcionales esenciales para el ciclo de replicación del virus: (i) un
54
dominio carboxilo terminal con actividad nucleósido trifosfatasa (NTPasa) y ARNhelicasa (NS3hel, 69-72 kDa), la cual permite el desenrollamiento del genoma; y
(ii) un dominio amino terminal con actividad proteasa dependiente de serina, que
escinde las poliproteínas en los distintos componentes virales [92]. La interacción
entre las proteínas NS3-NS5B resulta de gran importancia para la replicación y
traducción viral de algunos virus [93], pero poco se sabe en la actualidad sobre
dicha interacción y cómo afecta la misma a la replicación del VHC.
Por último, cabe mencionar otra enzima de gran importancia en la replicación del
VHC, la inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa (IMPDH). RBV, única alternativa
hasta el momento junto al IFN-α para el tratamiento de esta infección, resultaría
principalmente inhibidora de la IMPDH y de la NS5B RdRp, aunque al menos otros
tres mecanismos de acción han sido propuestos [87,94]: (i) mutaciones en el
genoma ARN del VHC e inducción de “error del tipo catástrofe”, (ii)
favorecimiento de la vía de señalización del IFN y (iii) acción inmuno-modulativa
sobre células-T.
Aunque la mayoría de los mecanismos expuestos han sido propuestos en base a
estudios que utilizan como modelo in vitro la línea celular Huh-7 de hepatoma
humano, la única alternativa disponible con una replicación robusta del VHC en los
últimos años, las concentraciones efectivas de RBV en dichos ensayos estuvieron
entre 50 y 1000µM, resultando ser mucho mayores que las realmente efectivas en
clínica (5-14µM) [87,94]. Ningún grupo de investigación ha logrado clarificar el
mecanismo de acción de RBV a concentraciones clínicamente útiles, en este
sistema celular. Recientemente, la utilización de nuevos sistemas in vitro, por
ejemplo, línea celular de hepatoma humano Li23 y sus derivados, permitieron
confirmar que RBV desplegaría su efecto antiviral preferentemente inhibiendo a
IMPDH [94]. Estos sistemas celulares, a diferencia de Huh-7, parecen ser mucho
más sensibles como biosensores de RBV y más robustos desde el punto de vista
replicativo, con lo que resultarían muy prometedores a la hora de diseñar y
estudiar nuevas estrategias terapéuticas en fases preliminares.
En base a las proteínas virales que intervienen en la replicación del VHC, algunas
de las dianas más estudiadas y las moléculas que han resultado efectivas sobre
dichos blancos terapéuticos pueden resumirse de la siguiente manera [95,96]:
A) Serin-proteasa NS3: Telaprevir (Vx-950, Vertex/Janssen) y boceprevir (SCH503034, Merck), peptidomiméticos inhibidores reversibles de la serin-proteasa NS3
55
del VHC, han superado los ensayos clínicos de Fase III y se encuentran en la fase
de aprobación para su uso extendido. Demostraron que añadidos a la terapia
estándar con PEG-IFN-α y RBV mejoran la eficacia, aumentando la probabilidad de
lograr una RVS tanto en personas que tratan la infección por primera vez como en
aquéllas que no obtuvieron éxito con la terapia convencional. Por otro lado, estos
inhibidores activarían la respuesta inmune innata. En los pacientes sin tratamiento
previo, boceprevir logra tasas de respuesta en el genotipo 1 del virus VHC que
duplican a las de las terapias disponibles (aproximadamente un 70%).
B) NS5B-polimerasa ARN dependiente: Inhibidores de la proteína NS5B del tipo
nucleosídicos como valopicitabina (NM-283, Idenix-Novartis), R1626 (Roche), entre
otras moléculas, se encuentran en estudios clínicos de Fase III. Estos compuestos
utilizados en forma sinérgica con PEG IFN-α y RBV podrían llegar a tasas del 60%
de RVS, mostrando actividad frente a todos los genotipos de VHC. También se
encuentran actualmente en desarrollo potenciales inhibidores de NS5B RdRp, del
tipo no-nucleosídicos.
C) Inosina 5’-monofosfato deshidrogenasa: Nuevos inhibidores de la IMPDH se
encuentran en desarrollo con el objetivo de disminuir uno de los efectos adversos
más importantes en la terapia a largo plazo con RBV, la anemia hemolítica. Entre
ellos, encontramos al análogo y pro-droga de la RBV, la viramidina (taribavirin,
ICN 3142, ICN Pharmaceuticals), que se encuentra en estudio clínico de Fase III, y
es convertida in vivo en RBV, a través de la adenosina deaminasa.
Es así que, las últimas tendencias en terapias anti-VHC resultarían en tratamientos
combinados con inhibidores de proteasa y antivirales con mecanismos de acción y
perfiles de resistencia diferentes, a la terapia convencional utilizando IFN-RBV.
I. 3. 5. Limitaciones en el estudio y control de los mecanismos de infección,
replicación y patogenicidad
La ausencia de sistemas in vitro e in vivo capaces de mantener la replicación del
virus, y que por lo tanto, permitan el estudio de sus mecanismos de infección,
replicación, patogenicidad así como de todas aquellas estrategias terapéuticas
investigadas hasta el momento, ha resultado en uno de los principales
inconvenientes para alcanzar progresos notables en la profilaxis y el tratamiento
de la infección por el VHC.
El modelo subrrogante in vitro del VHC, BVDV, fue utilizado hasta el momento
para (i) la evaluación de nuevos compuestos con potencial actividad antiviral y (ii)
56
el estudio molecular de proteínas virales, replicación y patogenia [97]. Como ya
se ha mencionado, BVDV comparte con VHC la familia taxonómica a la cual
pertenecen (Flaviviridae), pero no el género. La organización genómica de un
Pestivirus es cercana a la del VHC, por esto ha permitido la utilización de BVDV
como sistema subrrogante en cultivo celular in vitro [97].
Por otro lado, el modelo animal murino, sería el ideal a ser utilizado en estudios
sobre VHC, pero dicho virus no infecta a los roedores. Con la excepción de los
chimpancés, la infección con el VHC no se ha logrado establecer en ningún otro
primate de manera satisfactoria [98,99]. A pesar de ser un modelo animal con
características histopatológicas y de respuesta inmune humoral y celular similares
al humano, cuestiones éticas, costo económico y la baja factibilidad para ser
manipulado por laboratorios especializados en este campo, son sus mayores
desventajas [98,99]. Sin embargo, durante los últimos años se han llevado
adelante diversos intentos para obtener ratones transgénicos como modelos
murinos para estudios de patogenicidad [99]. Cabe mencionar, que se encuentran
en estudio novedosos modelos de Tupaia belangeri (mamífero de origen asiático
de la familia de los tupaidos) susceptibles a la infección por VHC [100]. Debido a
los costos, dichos modelos no resultan accesibles para ser utilizados por la
mayoría de los países.
Asimismo, se dispone de sistemas celulares in vitro con capacidad para mantener
la replicación de genomas completos del virus, como así también es de destacar la
disponibilidad de replicones subgenómicos del VHC [101-103], lo cual representa
una gran alternativa para el avance del estudio del ciclo viral, de la
patogenicidad, de la resistencia del VHC a diversas terapias existentes, como para
el desarrollo de posibles vacunas y la búsqueda y optimización de nuevos fármacos
específicos con actividad antiviral. Estos replicones del VHC no inducen ningún
efecto citopático en las células que replican, ni alteran la tasa de crecimiento de
las mismas, lo cual apoya la teoría que el mayor daño celular producido durante
una infección natural por VHC se debe a una acción directa sobre la respuesta
inmune del propio individuo infectado [91].
La introducción de mutaciones específicas en las secuencias de los replicones y el
análisis de las mutaciones adaptativas que los mismos adquieran en diferentes
condiciones de cultivo, han permitido aumentar de manera considerable los
conocimientos actuales sobre los mecanismos de acción del VHC y de esta manera
alcanzar nuevas estrategias terapéuticas más efectivas [94,103].
57
La producción de auténticas partículas infecciosas del VHC de prácticamente
cualquier genotipo, sin las mutaciones adaptativas asociadas a sistemas de
replicación in vitro, representa un nuevo paradigma que permitirá descifrar los
requisitos necesarios para el ensamblado, liberación e ingreso de partículas virales
de aquellos genotipos del VHC de mayor implicancia en clínica [104].
58
CAPÍTULO II
OBJETIVOS
59
60
CAPÍTULO II. OBJETIVOS
II. 1. HIPÓTESIS DE LA TESIS DOCTORAL
La hipótesis de trabajo de la presente tesis doctoral es que “la complejación de
TSCs derivadas de 1-indanonas con CDs permitirá minimizar los fenómenos de
autoagregación molecular; mejorar sustancialmente la solubilidad acuosa de
las mismas y aumentar la estabilidad fisicoquímica de las soluciones en los
estudios de actividad biológica in vitro; entre otras la evaluación del efecto
antiviral sobre el VHC”.
II. 1. 1. Objetivos Generales
El principal objetivo de la presente tesis doctoral ha sido el empleo de estrategias
de
nanotecnología
farmacéutica
para
la
solubilización
y
estabilización
fisicoquímica de TSCs de 1-indanonas que han demostrado actividad biológica in
vitro frente a agentes causales de enfermedades infecciosas de alto impacto
socioeconómico, con el fin de asegurar la continuidad de los estudios de actividad
quimioterápica, inicialmente in vitro y posteriormente in vivo.
La investigación llevada a cabo durante la misma se ha sustentado en cuatro
pilares complementarios e interrelacionados, que se encuentran detallados en los
objetivos específicos de la tesis (ver Capítulo II. 1. 2): (i) Síntesis, caracterización
y evaluación de la autoagregación molecular de TSCs derivadas de 1-indanonas
(A,B); (ii) complejación y caracterización fisicoquímica de los complejos de
inclusión TSC/CD (C-E); (iii) evaluación in vitro de la actividad antiviral (F) y (iv)
exploración
de
otras
aplicaciones
tecnológicas
de
relevancia
e
interés
(bio)farmacéutico (G).
Dentro de los Capítulos III y IV de la tesis doctoral se abordarán estos pilares de
forma tal que cada uno se encuentre representado por un artículo científico
publicado, enviado para su evaluación o en preparación para su publicación.
II. 1. 2. Objetivos Específicos
A) Síntesis, purificación y caracterización química de TSCs derivadas de 1indanonas.
B) Investigación de los posibles fenómenos de autoagregación de las TSCs en agua.
C) Evaluación de la capacidad de solubilización de las TSCs por parte de CDs
nativas y químicamente modificadas.
61
D) Caracterización de los complejos de inclusión TSC/CD y estudio de la
interacción fármaco/complejante.
E) Evaluación de la estabilidad fisicoquímica de los complejos de inclusión TSC/CD
en distintas condiciones de almacenamiento.
F) Estudios de la actividad anti-VHC de las TSCs como ligandos libres y de los
complejos de inclusión TSC/CD.
G) Evaluación de los complejos TSC/CD como plataforma tecnológica para el
diseño de sistemas de liberación de fármacos de administración ocular.
Esta trabajo presentó un alto carácter multidisciplinario que nace de la estrecha
colaboración entre las Cátedras de Química Medicinal (Departamento de
Farmacología) y las Cátedras de Tecnología Farmacéutica I y II (Departamento de
Tecnología Farmacéutica) de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la
Universidad de Buenos Aires, el Centro para el Estudio de las Hepatitis Virales
(Departamento de Microbiología, Inmunología y Parasitología de la Facultad de
Medicina, Universidad de Buenos Aires) y el Laboratorio de Ciclodextrinas
(Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad de Santiago de Compostela, España).
Esta tesis doctoral ha sido planificada con el objetivo de estudiar exhaustivamente
los fenómenos de autoagregación de TSCs derivadas de 1-indanonas en diferentes
medios acuosos y los parámetros que los rigen, y a partir de allí diseñar una
plataforma nanotecnológica que permita optimizar, entre otras, la evaluación de
la actividad antiviral en constructos celulares robustos y desarrollar sistemas de
administración de estos nuevos fármacos con potencial relevancia clínica.
62
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
63
64
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
"El investigador no debe descansar jamás
pues, como dijo el poeta, la luciérnaga sólo
brilla cuando vuela, y como ella la mente
humana
se
apaga
cuando
descansa."
Bernardo A. Houssay.
El planteamiento experimental para abordar el cumplimiento de los objetivos
específicos de esta tesis doctoral implicó la utilización secuencial y cronológica de
las siguientes metodologías de trabajo que junto a los Resultados y Discusión
presentados en el Capítulo IV forman parte de dos artículos científicos publicados
en revistas internacionales, un artículo enviado para su evaluación y un artículo en
preparación.
III. 1. TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS
Artículo Científico I. Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone
drug candidates with potential antiviral activity.
New Journal of Chemistry. 2010; 34, 2047-2058. Referencia 29 de la presente
tesis doctoral.
III.1.1. Síntesis, purificación y caracterización fisicoquímica de TSCs de 1indanonas
A) Síntesis y purificación: La síntesis de TSCs (TSC1-4) (Figura I. 1. 2) fue
optimizada a partir de la técnica general descripta por Martins Alho et al [105].
La misma consistió en calentar a reflujo 1-indanona, 6-metoxi-1-indanona y 5,6dimetoxi-1-indanona (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) y tiosemicarbazida
(Sigma-Aldrich, 10% de exceso), en un volumen de EtOH adecuado. La síntesis de
TSC4 fue descripta por primera vez dentro del marco de esta tesis. Para esto
último, 5,6-dimetoxi-1-indanona (1,00 g; 5,20 mmol) fue calentada a reflujo junto
a N4-alil-tiosemicarbazida (1,00 g; 8,38 mmol) en una mezcla agua:EtOH (1:1)
agitada magnéticamente. Luego de la disolución total de la mezcla, se agregaron
5-6 gotas de ácido acético glacial como catalizador, y se calentó a reflujo durante
10 horas. Pasado ese tiempo, la mezcla de reacción se mantuvo a una
temperatura de 4° C para favorecer la precipitación del producto. El sólido
65
obtenido fue filtrado, lavado con una mezcla agua:EtOH (1:1) en frío y finalmente
recristalizado. El rendimiento de las reacciones de obtención de las distintas TSCs
osciló entre el 60-80%, según el derivado del que se trate. La técnica de
purificación originalmente descripta [22,105] fue modificada, debido a que se
encontraron trazas de los reactivos de síntesis derivados de las 1-indanonas y de
las tiosemicarbazidas de partida en los espectros de 1H-RMN, lo cual evidenció una
recristalización poco efectiva. Para ello, el producto de la primera precipitación
(1 g) se solubilizó en DMSO (100 ml) frío de alta pureza, y se precipitó agregando
de a poco una cantidad suficiente de agua ultra-pura (500 ml). Luego, se filtró y
secó a temperatura ambiente. Todos los solventes utilizados fueron de grado
analítico.
B) Caracterización: Una vez que los productos fueron sintetizados y purificados,
se prosiguió con la caracterización de los mismos utilizando diferentes técnicas.
En una primera etapa, se realizó la caracterización química mediante resonancia
magnética nuclear de protones y carbono (1H-RMN y
13
C-RMN), utilizando
espectrómetros de resonancia magnética nuclear Bruker® Ultrashield 400 Avance II
y Bruker® MSL300 (Bruker BioSpin GMBH, Karlsruhe, Alemania), para realizar los
espectros de 1H-RMN y un espectrómetro Varian Mercury-200 (Oxford, Reino
Unido), para realizar los espectros de
13
C-RMN, utilizando como solvente
deuterado DMSO-d6 (Sigma-Aldrich). La multiplicidad de las señales se informó
como: s, singlete; sa, singlete ancho; d, doblete; dd, doble doblete; t, triplete;
m, multiplete, y los valores de las constantes de acoplamiento (J) fueron
expresados en Hz.
Los espectros de infrarrojo (FT-IR) fueron realizados utilizando un espectrómetro
infrarrojo Perkin-Elmer One (Waltham, MA, EEUU; pastillas de bromuro de potasio,
KBr) y la posición de las señales se expresó en cm-1. Los pesos moleculares se
determinaron por espectrometría de masa de alta resolución (HR-MS) usando un
equipo MicrOTOF-QII (Bruker Daltonics, Karlsruhe, Alemania) utilizando ionización
por electrospray (ESI) como método de ionización. El análisis de todos los datos
obtenidos permitió confirmar las estructuras químicas correspondientes.
En una segunda etapa, se determinaron las longitudes de onda de máxima
absorción (λmax) de las TSCs en soluciones de DMSO y en una mezcla agua-DMSO
(98:2), a 25º C, por espectrofotometría de UV-Vis (CARY [1E] UV-Visible
Spectrophotometer Varian, Palo Alto, CA, EEUU). Asimismo, se obtuvieron los
respectivos coeficientes de extinción molar (ε) en DMSO de acuerdo a la Ley de
66
Lambert-Beer a partir de los gráficos de absorbancia en función de la
concentración.
El análisis de las propiedades térmicas se realizó por calorimetría diferencial de
barrido (DSC, Mettler TA-400 DSC, Columbus, OH, EEUU) usando una rampa de
calentamiento entre 25 y 350º C (10º C/min). Las muestras (5-7 mg) fueron
selladas en portamuestras de aluminio (40 µl) y analizadas. Todas las
determinaciones de análisis térmico se realizaron por duplicado y fueron
expresados como la media de ambas determinaciones.
Por último, se caracterizó experimentalmente la lipofilicidad de las diferentes
TSCs utilizando los valores del logaritmo del factor de capacidad (log K) obtenidos
por HPLC de fase reversa en un equipo Waters 590 HPLC puma (Waters Corp.,
Milford, MA, EEUU) con detector UV-Vis Jasco-975 UV-vis 320-336 nm y software
WinPcChrom XY (Jasco, Inc, Easton, MD, EEUU), empleando una columna Sunfire®
C18; 5,0 µm; 4,6 x 150 mm (Waters Corp.) mediante la utilización de la ecuación
3 [106,107]
log K = log [(tr – t0)/t0] (3)
Donde tr y t0 son el tiempo de retención de TSC y el tiempo muerto (DMSO),
respectivamente.
Las soluciones de inyección (10 µl) fueron preparadas solubilizando cada TSC en
DMSO puro (3,5 µg/ml) y las composiciones de fase móvil ACN:buffer fosfato pH
7,0 (29mM) fueron preparadas con diferentes relaciones de volumen: 20:80, 25:75,
30:70, 40:60, 45:55, 50:50 y 55:45. La velocidad de flujo fue de 1,0 ml/minuto.
Los solventes utilizados para el estudio de lipofilicidad fueron de grado HPLC.
Curvas de log K versus el porcentaje de ACN (%) en la fase móvil fueron
construidas y los valores de log Kwater fueron extrapolados de los valores de 0% de
ACN (equivalente a 100% de buffer fosfato).
Los valores de log Kwater fueron comparados con los valores de lipofilicidad
calculados utilizando
dos
softwares
diferentes:
(i)
Chemdraw
Ultra 7.0
(CambridgeSoft, Cambridge, MA, EEUU) y (ii) Spartan´02 (Ghose-Crippen method,
Wavefunction. Inc., Irvine, CA, EEUU) [108]. Por otro lado también fueron
comparados con los valores de log P calculados utilizando la metodología de
fragmentación de Hansch-Fujita, basado en la suma algebraica de las constantes
de Hansch de los sustituyentes (π ) [109-111]. Los valores de log P base de 167
indanona y 6-metoxi-1-indanona para el cálculo de fragmentación, fueron
obtenidos de Pubchem (National Center for Biotechnology Information, Bethesda,
MD, EEUU). Para correlacionar los valores calculados con los experimentales, se
construyeron curvas de log P versus log Kwater. Todos los ensayos se realizaron por
triplicado y fueron expresados como la media ± S.D.
III. 1. 2. Investigación de los posibles fenómenos y mecanismos de
autoagregación de las TSCs en medio acuoso
A) Estabilidad fisicoquímica: El estudio de los fenómenos de autoagregación fue
antecedido por estudios de estabilidad química de los diferentes compuestos. La
estabilidad química de las diferentes TSCs se estudió por 1H-RMN. Se realizaron los
espectros tanto de los reactivos de síntesis como de los productos en DMSO-d6 y se
descartaron procesos de oxidación y/o hidrólisis durante la síntesis y/o
purificación.
La estabilidad física de las soluciones de TSC1-4 se estudió en dos medios
diferentes: uno orgánico (DMSO, 100%) y uno acuoso (agua:DMSO, 98:2), durante
30 días a 25º C. La eventual caída de título de TSC en función del tiempo se
corroboró por espectrofotometría UV-Vis. En ambos casos, se prepararon
soluciones madre (75µM) y se diluyeron de forma consecutiva con los solventes
correspondientes hasta obtener las siguientes concentraciones finales: 7,5; 15,0;
22,6 y 37,5µM. Las estabilidades finalmente se graficaron como la concentración
de TSC (µM), en función del tiempo (días). Las concentraciones se determinaron
empleando curvas de calibración de cada TSC en DMSO puro o agua:DMSO (98:2)
en un rango de concentración entre 7,5 y 75,0µM cuyos R2 estuvieron entre
0,9923–1,0000. Para los ensayos de estabilidad física en medio acuoso se empleó
agua milliQ (Simplicity UV Water Purification System, Millipore, Bedford, MA,
EEUU). Todos los ensayos se realizaron por triplicado y fueron expresados como la
media ± S.D.
La solubilidad intrínseca (S0) de TSC1-4 fue definida como la máxima
concentración de TSC que permance disuelta en alguna de las soluciones
ensayadas al día 30.
B) Autoagregación: Los fenómenos de autoagregación de las diferentes TSCs se
evaluaron utilizando las siguientes metodologías: (i) RMN convencional (1H-RMN,
1D-DOSY) y RMN bidimensional (2D-ROESY y 2D-DOSY), (ii) DLS y (iii) TEM y (iv)
tensión superficial,
68
En un ensayo preliminar, se estudió la solubilidad de TSC3 en función del tiempo
en una solución en D20:DMSO-d6 (34:66) por medio de 1H-RMN. La concentración
de TSC3 utilizada en este ensayo fue de 2500µM y resultó la mínima que permitió
una adecuada detección de la TSC por 1H-RMN. Sistemas con mayor contenido de
agua no permitieron alcanzar dicha concentración de TSC. Los estudios de
agregación por 1H-RMN de protones 1D-DOSY, 2D-ROESY y 2D-DOSY en medio
D20:DMSO-d6 (34:66) se realizaron en colaboración con la Dra. Gloria Bonetto
(Facultad de Química, Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba, Argentina)
utilizando un espectrómetro 400 MHz de alta resolución Bruker® Avance II (Bruker
BioSpin GMBH, Alemania).
El tamaño, la distribución de tamaños y el PDI de los agregados (PDI es una
medida de distribución de tamaño y homogeneidad de la muestra) se
determinaron por DLS a lo largo de 30 días, utilizando un equipo de difracción de
luz láser Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido),
utilizando un ángulo de 173º y una posición de medición de 4,65 mm. El equipo
dispone de una fuente de luz láser de He-Ne de 4 mW que opera a 633 nm, un
correlador digital ZEN3600 y una tecnología no invasiva de dispersión (NIBS®). Se
trabajó con valores de RI entre 1,3344 y 1,3354 obtenidos a 25º C con un
refractómetro Oficien Galileo Nº51986 (Campi Bisenzio, Italia). Las muestras
fueron filtradas utilizando filtros clarificantes de nitrato de celulosa de 0,45 µm
de poro (Osmonics Inc., Minnesota, MN, EEUU) previo al análisis.
Para evaluar la carga superficial de los agregados se determinó el Z-pot en
soluciones preparadas en agua Milli-Q empleando el Zetasizer Nano-ZS.
La morfología de los agregados obtenidos a partir de una solución de TSC3 7,5µM
en agua:DMSO (98:2) a los días 0 y 30 se visualizó por TEM, empleando ácido
fosfotúngstico (2% p/v, 5 µl) como agente de tinción (Philips CM-12 TEM, FEI
Company, Eindhoven, Holanda). La morfología de los agregados obtenidos a partir
de una solución concentrada de TSC3 (150µM) en agua:DMSO (98:2) se visualizaron
por microscopía óptica (Arcano XSZ-107 E, Shanghai, China).
La tensión superficial (TS) de soluciones acuosas (0-75µM) de las diferentes TSCs
en agua:DMSO (98:2) se determinó a 25º C empleando la metodología del anillo de
Du-Noüy (Tensiómetro Fernández Berlusconi y Rocca SRL, Buenos Aires,
Argentina).
Finalmente, se llevaron a cabo estudios exhaustivos del comportamiento de las
TSCs en medio acuoso utilizando espectrofotometría UV-Vis. En este contexto, se
69
estimó la tendencia de agregación de las TSC1-4 calculando la relación entre la
intensidad de un nuevo pico de absorción que aparece en medio acuoso a λ 233
nm para TSC1-3 y 239 nm para TSC4, y la intensidad del pico de absorción λmax
característico de TSCs en el rango 312-330 nm (I233/Iλmax) en agua:DMSO (98:2), al
día 30.
70
III. 2. COMPLEJACIÓN DE TIOSEMICARBAZONAS CON CICLODEXTRINAS NATIVAS Y
QUÍMICAMENTE MODIFICADAS
Artículo
científico
II.
Novel
1-indanone
thiosemicarbazone
antiviral
candidates: Aqueous solubilization and physical stabilization by means of
cyclodextrins.
Pharmaceutical
Research,
Octubre
2011;
1-17;
DOI:10.1007/s11095-011-0599-y. Referencia 46 de la presente tesis doctoral.
III. 2. 1. Estudio de la solubilización de las TSCs en medio acuoso mediante el
uso de CDs
La capacidad de complejación de las diferentes TSCs se evaluó utilizando las
siguientes CDs: α-CD (Cavamax® W6), γ-CD (Cavamax® W8), HPβ-CD (Cavasol® W7
HP; MS por unidad de glucosa 0,65; Mw 1400 Da), HPγ-CD (Cavasol® W8 HP; MS
0,60; Mw 1575 Da) y Mβ-CD (Cavasol® W7 M; MS 1,75; Mw 1310 Da). Todas las CDs
utilizadas fueron de Wacker-Chemie GMBH (Burghausen, Alemania), obsequiadas
gentilmente por SAFER S.A.C.I.F e ISP Technologies (Buenos Aires, Argentina). Las
estructuras químicas de las CDs estudiadas en la presente tesis se encuentran
representadas en el Capítulo I. 2. 1.
Los complejos de inclusión TSC/CD fueron preparados por el método del cosolvente (ver Capítulo I. 2. 5) [43,46]. Las diferentes TSCs en un leve exceso se
solubilizaron en mezclas de CHCl3:acetona (1:1) para la TSC3 o MeOH:acetona
(1:1) para las TSC1, TSC2 y TSC4 y se mezclaron con una solución de CD en MeOH
(HP-βCD, Mβ-CD y HPγ-CD) o en un mínimo volumen de agua ultrapura (α-CD y γCD) utilizando agitación magnética durante 15 min. Luego, el solvente se evaporó
hasta sequedad bajo vacío (15 min, 70-90 ºC, rotavapor Fbr®, Decalab S.R.L,
Buenos Aires, Argentina). Se evaluaron diferentes solventes orgánicos de grado
analítico y se estableció cuál permitía la óptima complejación y la menor
concentración de residuos detectables por GC en los complejos finales (ver abajo,
Capítulo III. 2. 2). El sólido blanco obtenido se resuspendió mediante el uso de
agitación magnética (15-30 min, 25º C) en el volumen de agua Milli-Q requerido
para la obtención de una concentración final definida de CD. La fracción de
fármaco insoluble se eliminó por filtración clarificante (0,45 µm, ésteres mixtos
de nitrocelulosa, Osmonics Inc.). La concentración de TSC en solución se
determinó por espectrofotometría UV-Vis (ver Capítulos III. 1. 1 y III. 1. 2). Los
sistemas TSC/CD que resultaron opalescentes, como por ejemplo aquellos con α71
CD y γ-CD, fueron convenientemente diluidos en DMSO para permitir la lectura de
la absorbancia en el espectrofotómetro UV-Vis. Los complejos se prepararon
utilizando al menos 6 concentraciones de CD crecientes y con vistas a los ensayos
biológicos posteriores se determinó el pH de cada complejo TSC/CD. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado y fueron expresados como la media ± S.D.
Luego, se construyeron los diagramas de fases según Higuchi y Connors (ver
ecuaciones 1 y 2; Capítulo I. 2. 4). Dichos diagramas permitieron establecer el
perfil de complejación de cada complejo. El factor de solubilidad (F) para cada
complejo se calculó a través de la ecuación 4 [46]
F = SCD/S0 (4)
Donde SCD y S0 representan la solubilidad de TSC cuando se halla complejada con
CD y la solubilidad de TSC en agua ultrapura a 25° C, respectivamente. Los
parámetros F3% y Fmax fueron definidos como los valores de F obtenidos en (i) 3%
p/v de CD y (ii) un sistema de concentración máxima de CD. Mientras el primero
representa concentraciones de CD cito y biocompatibles, el segundo indica la
máxima solubilidad de TSC alcanzada con una CD específica y podría ser relevante
para el desarrollo de una formulación farmacéutica.
III. 2. 2. Caracterización de los complejos TSC/CD y estudio de la interacción
fármaco/complejante
Los complejos TSC/CD filtrados se congelaron a -80° C (24 h) y se liofilizaron (24–
48 h) utilizando un liofilizador con cámara (Liofilizador L05, F.i.c, Scientific
Instrumetal Manufacturing, Buenos Aires, Argentina). Las temperaturas del
condensador y de la cámara fueron -40° y 14º C, respectivamente, y la presión 30
µbar. Las mezclas físicas TSC/CD (PMs, controles) fueron preparadas por mezcla
directa de las CDs liofilizadas y de las TSCs prístinas en idénticas proporciones a
las que se determinaron para cada uno de los complejos.
Para ajustar las condiciones experimentales, y asegurar la completa remoción del
solvente orgánico durante la evaporación en rotavapor, HPβ-CD pura (sin TSC) fue
procesada como se describió previamente para la preparación de los complejos
(ver Capítulo III. 2. 1); en este caso, la etapa de incorporación de TSC fue
omitida. Después de la evaporación del solvente orgánico en rotaevapor, la HPβ-
72
CD seca (0,6 g) fue resuspendida en CH2Cl2 (7 ml) y almacenada durante 12 h a 25º
C con el objeto de permitir la extracción de las trazas de solvente orgánico que
pudieran haber quedado luego de la evaporación; HPβ-CD es insoluble en CH2Cl2.
Las muestras fueron centrifugadas (10 min, 5000 rpm), y filtradas (0,45 µm) para
remover la CD. El sobrenadante orgánico (1 µl) fue analizado por GC (Shimadzu
GC-9A con detección FID, ionización de llama, Tokio, Japón). La separación se
llevó a cabo en una columna capilar Heliflex AT-1 (longitud: 60 m, i.d.: 0,25 mm,
espesor de la película: 0,25 µm, Alltech Associates Inc., Deerfield, IL, EEUU) con
He como gas conductor a un flujo de 1 Kg/cm2. La temperatura del inyector y del
horno fue de 250 y 40° C, respectivamente. Una mezcla de CH2Cl2:MeOH (1 µl) fue
inyectada para verificar la resolución de los dos picos de elución (0,81 y 0,70
minutos, respectivamente). Dado que el MeOH presenta el punto de ebullición
más alto de todos los solventes orgánicos empleados en la preparación de los
complejos, el contenido de solventes residuales se expresó como MeOH residual
total. Se construyó una curva de calibración de MeOH en CH2Cl2 en un rango de
concentraciones entre 0,5 y 3,0% v/v y conteniendo ciclohexano como estándar
interno fijo (tiempo de retención del ciclohexano: 1,33 min). Los análisis se
realizaron por triplicado. Los cromatogramas fueron analizados empleando el
sofware Win PCChromXY (Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de
Buenos Aires, Argentina).
Las soluciones acuosas filtradas de los complejos TSC/CD fueron estudiadas por
DLS para establecer el tamaño, la distribución de tamaños, la PDI y el Z-pot (ver
Capítulo III. 1. 3). El último parámetro permitió evaluar cómo la complejación de
las TSCs afecta las propiedades superficiales de las partículas. Para dichas
mediciones se trabajó con valores de viscosidad, η, entre 0,8902 y 1,1441 cP a 25º
C y entre 0,6895 y 0,9232 cP a 37º C. Los valores de RI del dispersante fueron
1,3301–1,3416.
Las propiedades de agregación de las CD prístinas se evaluaron por DLS mediante
la determinación de la CAC. Este ensayo permitió establecer el efecto de la TSC
complejada sobre el complejante. Para ello, se prepararon soluciones acuosas
para cada CD y la intensidad de luz dispersa expresada como la derivada de la tasa
de cuentas por segundo (DCR; kilo cuentas por segundo, Kcps) determinada a 25º
C fue graficada en función de la concentración de cada CD (mM). La intersección
entre ambas rectas fue establecida como la CAC.
73
La morfología de los diferentes complejos TSC/CD fue estudiada por tres técnicas
microscópicas complementarias: (i) TEM (Philips CM-12), (ii) AFM (Nanoscope IIIa
Multimode-AFM, Quadrex, Digital Instruments, Veeco Metrology, Santa Barbara,
CA, EEUU) y (iii) SEM (Zeiss SupraTM 40 series ultra high resolution Field Emission
Gun Scanning Electron Microscope, FEG-SEM, Carl Zeiss NTS GmbH, Oberkochen,
Alemania). Los ensayos de TEM y AFM se realizaron sobre soluciones acuosas
TSC/CD recientemente preparadas, mientras que para SEM se emplearon los
productos secos (prístinos y liofilizados). Para el análisis TEM, soluciones acuosas
(5 µl) de TSC3/HPβ-CD (117,7µM/107,1mM) y TSC3/γ-CD (29,2µM/12,0mM y
153,0µM/115,7mM)
frescas
fueron
colocadas
sobre
soportes
de
Formvar
recubiertos de Cu y el exceso eliminado con papel de filtro después de 30 s.
Luego, las muestras fueron teñidas negativamente con una solución de acetato de
uranilo (UO2Ac, 2% p/v, 30 s), lavadas con agua (5 µl) y, finalmente, secadas en un
recipiente cerrado con gel de sílice. Para AFM, se empleó el modo de barrido de
contacto constante sobre la superficie de la muestra. Antes del análisis, la
solución TSC/CD se diluyó 50 veces con agua ultrapura (de 15,0% a 0,3% p/v de
concentración final). La muestra diluida (2 µl, 2,35µM/2,14mM; TSC3/HPβ-CD,
respectivamente) fue depositada sobre una superficie de mica recién cortada y
secada con nitrógeno seco. La imagen topográfica de AFM a escala nanométrica se
registró a 25° C, con una punta de silicio MPP-11100 de radio de curvatura <10
nm, frecuencia de resonancia de 300 kHz, y constante de resorte de 40 N/m
(nanodispositivos, Digital Instruments, Veeco Metrology). Las muestras se
visualizaron en un área de 1 µm x 1 µm con una velocidad de barrido de 2 Hz
utilizando WSxM 4.0 Beta 3.1 AFM software (Nanotec Elect SL, Centro Empresarial
Euronova, Madrid, España). Para SEM, se emplearon las siguientes muestras
liofilizadas y no-liofilizadas: (i) HPβ-CD prístina, (ii) TSC3 purificada y (iii)
TSC3/HPβ-CD (117,7µM/107,1mM). Las muestras fueron montadas en soportes de
metal, recubiertos con una película de oro (50-100 Ǻ). Las imágenes SEM se
obtuvieron utilizando un voltaje de excitación de 3,00 kV y una magnificación de
5000 x. Para desagregar aglomerados antes del análisis y facilitar la visualización,
las muestras liofilizadas fueron llevadas con cuidado a polvos finos empleando un
mortero.
Para confirmar de manera complementaria la formación de los complejos, las
muestras fueron analizadas por XDR (X’ Pert X-ray diffractometer, Philips
74
Electronics NV, Eindhoven, Holanda). El difractómetro cuenta con una unidad
PW3710, un sistema de rendijas soller, recepción monocromática y un generador
de rayos-X (Philips, tipo PW1830), con tubos de rayos-X de ánodo de Cu. La
tensión y la corriente de trabajo fueron 35 Kv y 20 mA, respectivamente. Los
difractogramas fueron obtenidos entre 2°< 2theta < 40°, con un ángulo de paso de
0,02° en 2theta y tiempo de corrida de 2 s por paso. Estos estudios fueron
realizados en colaboración con el Dr. Daniel Vega (Departamento de Física de la
Materia Condensada, Comisión Nacional de Energía Atómica, Buenos Aires,
Argentina).
Para establecer las propiedades térmicas de las TSCs en los complejos, muestras
obtenidos (3-13 mg) de TSC prístinas y complejos TSC/CD se analizaron por DSC.
La metodología empleada fue la misma que la descripta previamente para el
análisis de TSCs puras (ver Capítulo III. 1. 1).
La presencia del nuevo pico de absorción observado para las TSC libres en medio
acuoso (λ 233-239 nm) se determinó por espectrofotometría UV-Vis, (Capítulo III.
1. 1).
La
interacción
TSC/CD
en
complejos
liofilizados
fue
investigada
por
espectroscopía infrarroja (ATR-FTIR, Elmer Spectrum BX FTIR Spectrometer,
Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, EEUU) en un rango de lectura entre 4000 y 500
cm-1 (15 barridos, resolución espectral de 4,0 cm-1). Los espectros de FT-IR fueron
obtenidos usando el software v.5.3.1. (Perkin Elmer Inc.). PMs conteniendo
proporciones TSC/CD p/p idénticas a las de los complejos fueron preparadas para
evaluar la sensibilidad intrínseca de la técnica en la detección de la presencia de
TSC.
Para establecer eventuales cambios en los desplazamientos de las señales
características del fármaco y de la CD correspondiente, como consecuencia de la
complejación, diferentes muestras de complejos en D2O fueron analizadas por
RMN (1H-RMN, 1D-DOSY, 2D-ROESY, 2D-DOSY y estudios selectivos 1D-ROESY,
selrogp-1D-ROESY) utilizando pulsos entre las determinaciones de 600-250mseg
(400 MHz Bruker®) a 25° C. Los espectros de los diferentes complejos fueron
comparados con los de la TSC y la CD libres correspondientes. Los cambios en los
desplazamientos de cada señal se calcularon utilizando la ecuación 5 [112]
∆δ = δTSC/CD complejo – δCD (5)
75
Donde δTSC/CD complejo es el desplazamiento químico de los átomos hidrógeno (ppm)
de la CD cuando se halla formando parte del complejo con la TSC, y δCD es el
desplazamiento del mismo átomo de hidrógeno (ppm) de la CD libre de fármaco.
Los signos positivos y negativos indican que los desplazamientos fueron hacia
campos magnéticos bajos y altos, respectivamente.
También se evaluó la eventual ausencia de alguna de las señales carácterísticas de
la TSC, o la aparición de alguna señal nueva debida a su inclusión en la CD. Los
espectros de 1H-RMN fueron obtenidos utilizando el programa Bruker TOPSPIN 2.1
(Bruker BioSpin GMBH). Estos estudios fueron realizados en colaboración con la
Dra. Gloria Bonetto.
III. 2. 3. Evaluación de la estabilidad fisicoquímica de los complejos TSC/CD en
distintas condiciones de almacenamiento
Para evaluar la estabilidad física de los sistemas, las soluciones acuosas de los
diferentes complejos TSC/CD fueron almacenadas a 25 y 37 ºC durante 7 días y los
cambios macro, micro y nanoscópicos fueron monitoreados por observación visual,
microscopía óptica (cristales de tamaño mayor a 1µm) y DLS (tamaño, distribución
de tamaños y Z-pot). Asimismo, la concentración de TSC en solución se cuantificó
cada 24 h mediante espectroscopía UV-Vis (Capítulos III. 1. 1 y III. 1. 2). Todos los
ensayos se realizaron por triplicado y fueron expresados como la media ± S.D.
El análisis estadístico fue realizado utilizando ANOVA de un solo factor (5% de
nivel de significancia, valores P mayores que 0,05 fueron considerados
estadísticamente significativos), combinado con un test de comparación múltiple
Dunnett o t-test (5% de nivel de significancia, valores P mayores que 0,05 fueron
considerados estadísticamente significativos). El software usado fue GraphPad
Prism version 5.00 para Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EEUU).
76
III. 3. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-VHC DE LAS TIOSEMICARBAZONAS
VEHICULIZADAS USANDO CICLODEXTRINAS
Artículo científico III. Novel 1-indanone thiosemicarbazones and their
inclusion complexes with hydroxypropyl-β cyclodextrin: Antiviral activity
against the hepatitis C virus (HCV). Enviado para su consideración a
Pharmaceutical Research. Referencia 84 de la presente tesis doctoral.
Los ensayos de citotoxicidad y la evaluación de la actividad antiviral de las TSC3 y
TSC4 y sus respectivos complejos con HPβ-CD se llevaron a cabo en un sistema de
replicación in vitro para el VHC. Se utilizó un protocolo reportado previamente
[113]. La citotoxicidad fue evaluada mediante la determinación de inducción de
apoptosis y los niveles de transaminasas en los sobrenadantes celulares de células
expuestas a las diferentes TSC durante 96 h (ver Capítulo III. 3. 4). Asimismo, la
actividad antiviral se estudió determinando los niveles de ARN viral en dichos
sobrenadantes (ver Capítulo III. 3. 5). Cabe destacar que las TSC3 y TSC4 fueron
seleccionadas para la evaluación de la actividad anti-VHC en base a los resultados
previos que demostraron actividad antiviral de la TSC3 sobre el modelo
subrrogante de VHC, el VDVB [22-24].
Los siguientes estudios fueron llevados a cabo en colaboración con el Centro para
el Estudio de las Hepatitis Virales, Departamento de Microbiología, Inmunología y
Parasitología de la Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
III. 3. 1. Líneas Celulares
En el estudio de actividad antiviral llevado a cabo, se utilizaron dos sistemas de
replicón obtenidos a través de la transfección estable de células de hepatoma
humano Huh7.5 con replicones del VHC. Estos sistemas fueron donados
generosamente por el Dr. Charles M. Rice (Rockefeller University, New York, NY,
EEUU) [114].
A) VHC-FL: Cultivos celulares de estirpe hepatocitaria Huh-7.5 (APC50, Apath LLC,
New York City, NY, EEUU) transfectados establemente con un replicón de genoma
completo del VHC de subgenotipo 1b [pCon1/FL-Neo (I)].
B) VHC-SG: Cultivos celulares de estirpe hepatocitaria Huh-7.5 transfectados
establemente con un replicón subgenómico del VHC de subgenotipo 1b [pCon1 SGNeo (I), NS3-NS5B].
77
Dichos sistemas de replicón fueron mantenidos en medio DMEM (Life Technologies
Corp., Carlsbad CA, EEUU) suplementado con 10% de SFB, inactivado por calor
(Life Technologies Corp.) y 750 µg/ml de geneticina (G418, Life Technologies
Corp.), a 37° C en atmósfera de CO2 al 5%. Durante los sucesivos pasajes, las
células fueron lavadas con PBS (pH 7,4) 1X y tratadas con tripsina (TrypLE
®
Express, Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU). El número de celulas viables fue
determinado por trypan blue (Life Technologies Corp.).
III. 3. 2. Preparación de las soluciones de TSCs y de los complejos TSC/CD para
la evaluación de la solubilidad y la agregación en medio de cultivo, la
citotoxicidad y la actividad antiviral
A continuación se describen las muestras que fueron utilizadas en los
tratamientos, las cuales fueron preparadas utilizando los mismos materiales
descriptos en el Capítulo III. 2. 1. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y
fueron expresados como la media ± S.D.
A) TSC3 15,0 µg/mL (57,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se preparó una
solución madre de TSC3 (1,5 mg/ml) en DMSO 100% y se diluyeron 300 µl de dicha
solución en 10 ml de PBS hasta una concentración final de 45,0 µg/ml. La solución
se filtró por filtro esterilizante (0,22 µm, Millipore Ireland B.V., Carrigtwohill, Co.
Cork, Ireland) en área de flujo laminar y se diluyó (1:2) utilizando medio de
cultivo DMEM con 5% SFB y sin G418.
B) TSC3 6,0 µg/mL (23,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se empleó el mismo
protocolo que en A), pero la solución madre de TSC3 en DMSO tuvo una
concentración de 0,6 mg/ml.
C) TSC3 3,5 µg/mL (13,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se empleó el mismo
protocolo que en A), pero la solución madre de TSC3 en DMSO tuvo una
concentración de 0,35 mg/ml.
D) TSC4 17,3 µg/mL (57,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se preparó una
solución madre de TSC4 (1,73 mg/ml) en DMSO 100% y se diluyeron 300 µl de
dicha solución en 10 ml de PBS hasta una concentración final de 51,9 µg/ml. La
solución se filtró por filtro estéril (0,22 µm) en área de flujo laminar y se diluyó
(1:2) utilizando medio de cultivo DMEM con 5% SFB y sin G418.
78
E) TSC4 6,9 µg/mL (23,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se empleó el mismo
protocolo que en D), pero la solución madre de TSC4 en DMSO tuvo una
concentración de 0,69 mg/ml.
F) TSC4 4,0 µg/mL (13,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1): Se empleó el mismo
protocolo que en D), pero la solución madre de TSC4 en DMSO tuvo una
concentración de 0,40 mg/ml.
G)
Complejos
de
inclusión
TSC3/HPβ
β -CD
(13,0µ
µM/0,5%,
23,0µ
µM/0,5%,
57,0µ
µM/0,5%, 13,0µ
µM/0,25% y 13,0µ
µM/0,125% p/v) en PBS:DMEM (1:1): Los
complejos de inclusión TSC3/HPβ-CD (13,0µM/0,5%, 23,0µM/0,5%, 13,0µM/0,25% y
13,0µM/0,125% p/v) en PBS:DMEM (1:1) fueron preparados de la siguiente manera.
Inicialmente, HPβ-CD (12,5-50,0 mg) se solubilizó en un volumen adecuado de
MeOH. Luego, se agregó mediante agitación magnética una solución de TSC3 0,2
mg/ml en CHCl3:acetona (1:1); los volúmenes de solución de TSC3 fueron 200 y
500 µl para obtener concentraciones finales de 13,0 y 23,0µM, respectivamente.
La mezcla fue secada por evaporación del solvente en rotavapor (70° C). Una vez
secos, los complejos fueron resuspendidos en 5 ml de PBS conteniendo entre 0,25
y 1,0% p/v CD. Por último, las soluciones fueron filtradas por filtro esterilizante
(0,22 µm) y diluídas (1:1) utilizando medio de cultivo DMEM con 5 % SFB y sin
G418. Así, las concentraciones finales de CD en los complejos fueron 0,125-0,5%
p/v.
Los complejos TSC3/HPβ-CD (57,0µM/0,5% p/v) fueron preparados solubilizando
25,0 mg de CD en MeOH y agregando 500 µl de solución de TSC3 0,2 mg/ml en
CHCl3:acetona (1:1). Las mezclas fueron secadas y posteriormente solubilizadas
directamente con DMEM (5 ml). Como último paso, los complejos fueron filtrados
por filtros esterilizantes (0,22 µm).
H)
Complejos
de
inclusión
TSC4/HPβ
β -CD
(13,0µ
µM/0,5%;
23,0µ
µM/0,5%;
57,0µ
µM/3,0%; 13,0µ
µM/0,25% y 13,0µ
µM/0,125% p/v) en PBS:DMEM (1:1 o 1:2):
Los complejos de inclusión TSC4/HPβ-CD (23,0µM/0,5%; 13,0µM/0,25% y
13,0µM/0,125% p/v) en PBS:DMEM (1:1) fueron preparados de manera idéntica a
los complejos de TSC3/CD para las mismas concentraciones (a excepción del
solvente orgánico utilizado que resultó MeOH:acetona, 1:1). Los complejos
TSC4/CD (13,0µM/0,5% p/v) fueron preparados solubilizando 75,0 mg de CD en
MeOH y agregando 500 µl de solución de TSC4 0,2 mg/ml en MeOH:acetona (1:1).
Una vez secos, los complejos de inclusión fueron resuspendidos en 5 ml de PBS
79
conteniendo 1,5% p/v de CD. Por último, las muestras fueron filtradas por filtro
esterilizante (0,22 µm) y diluídas (1:2) utilizando medio de cultivo DMEM con 5 %
SFB y sin G418. Los complejos TSC4/CD (57,0µM/3,0% p/v) fueron preparados
solubilizando 150,0 mg de CD en MeOH y mezclándolos con 500 µl de solución de
TSC4 0,2 mg/ml en MeOH:acetona (1:1). En este caso, las muestras secas fueron
solubilizadas directamente con DMEM (5 ml) y filtradas por filtro esterilizante
(0,22 µm).
III. 3. 3. Estudio de la solubilidad y la agregación de las TSCs y de los complejos
TSC/CD en medio de cultivo
Como fuera mencionado previamente, en medio acuoso, las TSCs tienden a
autoagregarse y a precipitar. Para evaluar este comportamiento en condiciones
idénticas a las de los ensayos de citotoxicidad y actividad antiviral y asegurar
concentraciones de TSC constantes en el tiempo se realizaron estudios de
estabilidad física de soluciones de TSC3 y TSC4 libres y de complejos TSC/CD en
DMEM. Las TSC3 y TSC4 en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1) y los complejos TSC3/HPβ-CD
(13,0µM/0,5%; 23,0µM/0,5%; 57,0µM/0,5%; 13,0µM/0,25% y 13,0µM/0,125% p/v) y
TSC4/HPβ-CD
(13,0µM/0,5%;
23,0µM/0,5%;
57,0µM/3,0%;
13,0µM/0,25%
y
13,0µM/0,125% p/v) preparados según lo descripto anteriormente en Capítulo III.
3. 2, fueron monitoreados por espectrofotometría UV-Vis (λmax de 329 y 330 nm
para TSC3 y TSC4, respectivamente) durante 24 h. Dicho tiempo coincidió con el
de recambio de medio de cultivo que se realiza en los ensayos in vitro. Las
concentraciones de TSC en solución fueron calculadas por interpolación en una
curva de calibración construida para ambos compuestos en el rango de
concentraciones entre 7,5 y 75,0µM en agua:DMSO (98:2). DMEM:PBS:DMSO
(66:33:1), PBS:DMEM (1:1 o 1:2) fueron utilizados como blanco. Por otro lado,
soluciones de TSC3 y TSC4 en agua:DMSO (99:1) y los complejos respectivos con
HPβ-CD fueron monitoreados por DLS a tiempo 0 y 24 h, a 37º C. Se llevaron a cabo
determinaciones de tamaño de partículas en muestras de DMEM fresco para
verificar que los tamaños y la distribución de tamaños observados en las muestras
de TSC y TSC/CD no provenían de estructuras presentes en el medio de cultivo
utilizado para su preparación. Para dichas mediciones se trabajó con valores de
viscosidad (η) de 0,6885–0,6904 cP y de RI = 1,3301. Todos estos ensayos se
realizaron a 37º C.
80
III. 3. 4. Citotoxicidad por apoptosis de las TSCs y de los complejos TSC/CD
El programa apoptótico normal desplegado por la célula está caracterizado por
ciertos cambios morfológicos que incluyen la pérdida de la asimetría de la
membrana plasmática, la condensación del citoplasma y el núcleo, y el clivaje
internucleosomal del ADN [115]. En las células apoptóticas, el fosfolípido de
membrana PS es traslocado a la parte externa de la membrana plasmática. La AV
es una proteína que se une a fosfolípidos y que posee gran afinidad por PS. Debido
a que la externalización de la PS ocurre en los primeros estadios de la apoptosis,
la marcación con AV-FITC permite identificar la apoptosis en una etapa anterior a
la fragmentación del ADN, aún antes de la pérdida de la integridad de la
membrana celular que ocurre en los últimos estadios de la muerte celular, ya sea
como resultado de un proceso apoptótico o necrótico. Es por esta razón que la
marcación con AV se usa en conjunción con el colorante vital IP para identificar (i)
células viables (AV negativas, IP negativas), (ii) células apoptóticas tempranas (AV
positivas, IP negativas), y (iii) células apoptóticas tardías o necróticas (AV
positivas, IP positivas).
Para el ensayo de citotoxicidad y evaluación de la actividad antiviral, se
sembraron 3,5 x 105 células VHC-FL o VHC-SG en placas de 6-pocillos (10 cm2) con
medio DMEM suplementado con 5% SFB y sin antibióticos. Transcurridas 24 h y
cuando la monocapa celular evidenció un 70% de confluencia, se procedió a
tratarlas con 2 ml de muestra de: (i) TSC3 y TSC4 (13,0; 23,0 y 57,0µM) en
DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), (ii) HPβ-CD (0,125%; 0,25%; 0,5%; 1,0% y 3,0% p/v) en
PBS:DMEM (1:1), (iii) TSC3/HPβ-CD (13,0µM/0,5%; 23,0µM/0,5%; 57,0µM/0,5%;
13,0µM/0,25% y 13,0µM/0,125% p/v) en DMEM o PBS:DMEM (1:1) y TSC4/HPβ-CD
(13,0µM/0,5%; 23,0µM/0,5%; 57,0µM/3,0%; 13,0µM/0,25% y 13,0µM/0,125% p/v)
en DMEM o PBS:DMEM (1:1 o 1:2), suplementado con 5% de SFB y sin G418. En
todos los casos, se utilizaron células FL y SG sin tratamiento como control. Cada
24 h, y durante un período de 3 días, se removió el sobrenadante de los cultivos
celulares y se lo reemplazó con muestras frescas de TSC, HPβ-CD, o TSC/HPβ-CD
en las distintas concentraciones ensayadas. El ensayo de citotoxicidad y
evaluación de la actividad antiviral se llevó a cabo por un período total de 96 h.
El estudio de citotoxicidad se realizó empleando la técnica de AV-FITC/IP (FITC
Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Pharmigen®, Becton Dickinson Biosciences,
Franklin Lakes, NJ, EEUU) a las 96 h. Las células fueron cosechadas por
81
tratamiento con tripsina y resuspendidas en DMEM con 5% de SFB y sin G418. Las
muestras se centrifugaron (1.000 rpm, 5 min) y el sedimento celular fue lavado 2
veces con PBS 1X. Se resuspendió el sedimento celular con “binding buffer” 1X
(10mM HEPES/NaOH pH 7,4; 140mM NaCl, 2,5mM CaCl2) llevándolo a una
concentración celular de 2 x 106 células/ml. Luego, se adicionaron 3 µl de AV-FITC
y 3 µl de IP a 100 µl de la suspensión de células y se incubaron por 15 min en
oscuridad. Finalmente, se adicionaron 200 µl de “binding buffer” 1X y las
muestras fueron analizadas, dentro de la hora subsiguiente, mediante citometría
de flujo (FACScan Becton Dickinson Biosciences) evaluando un mínimo de 10.000
eventos. La población celular a estudiar fue seleccionada a partir de los gráficos
de granulación celular (side scatter, SSC o dispersión lateral) en función del
tamaño (forward scatter, FSC o dispersión frontal) para excluir los detritos
celulares. El análisis de las poblaciones celulares en apoptosis temprana y
apoptosis tardía/necrosis se realizó a partir de los gráficos de la fluorescencia
emitida por IP en función de la fluorescencia emitida por AV-FITC, utilizando el
programa winMDI 2.9.
Las muestras que resultaron ser no citotóxicas fueron aquellas seleccionadas para
la evaluación de la actividad antiviral (ver Capítulo III. 3. 5). Así, la actividad de
complejos que contenían concentraciones citotóxicas de CD no fue evaluada.
Asimismo, se estimó la hepatotoxicidad de las diferentes muestras mediante la
determinación de los niveles de las transaminasas TGO y TGP en el sobrenadante
de los cultivos por el método cinético IFCC (método comercial, Laboratorio
especializado en biología molecular, Biolab, Buenos Aires, Argentina). Se
establecieron las relaciones TGO/TGP posteriores a los tratamientos y se las
comparó con los controles sin tratamiento, en sistemas de replicón. Todos los
ensayos se realizaron por triplicado y fueron expresados como la media ± S.D.
III. 3. 5. Estudios de la actividad anti-VHC de las TSCs libres y de los complejos
TSC/CD
La actividad antiviral se evaluó para soluciones de las TSC3 y TSC4 libres en
DMEM:PBS:DMSO (66:33:1) y para aquellas muestras de HPβ-CD y de complejos
TSC/CD en PBS:DMEM (1:1) que no demostraron citotoxicidad a las 96 h, a saber:
(i) TSC3 y TSC4 (13,0; 23,0 y 57,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), (ii) HPβ-CD
(0,125-0,5% p/v) en PBS:DMEM (1:1), y (iii) TSC3/HPβ-CD (13,0µM/0,5%;
82
23,0µM/0,5%; 57,0µM/0,5%; 13,0µM/0,25% y 13,0µM/0,125% p/v) y TSC4/HPβ-CD
(13,0µM/0,125% p/v) en DMEM y PBS:DMEM (1:1), suplementado con 5% de SFB y
sin G418.
La actividad antiviral de las diferentes muestras se estimó cuantificando la
concentración de ARN viral en los sobrenadantes (expresado como logaritmo del
número de copias de ARN/ml), para ambos sistemas de replicón, utilizando RTPCR (COBAS® AmpliPrep/COBAS® Taq Man® HCV, Roche, Branchburg, NJ, EEUU) y
calculando el % de disminución de los niveles virales totales en relación a los
controles sin tratamiento. Se utilizaron primers y sondas de hibridación
específicas para un segmento de la región 5’ no codificante del genoma de VHC
(realizado en la Sección de Biología Molecular, Laboratorio Central, Hospital
Italiano, Buenos Aires, Argentina). En todos los casos, se determinó la
concentración del ARN viral de los respectivos controles de células sin
tratamiento. Todos los ensayos de actividad antiviral se realizaron por triplicado y
fueron expresados como la media ± S.D.
El análisis estadístico fue realizado utilizando ANOVA de un solo factor (5% de
nivel de significancia, valores P mayores que 0,05 fueron considerados
estadísticamente significativos), combinado con un test de comparación múltiple
Bonferroni´s post test (5% de nivel de significancia, valores P mayores que 0,05
fueron considerados estadísticamente significativos). El software usado fue el
GraphPad Prism version 5.00 para Windows (GraphPad Software Inc.).
83
III.
4.
EVALUACIÓN
DE
LOS
COMPLEJOS
TSC/CD
COMO
PLATAFORMA
TECNOLÓGICA PARA EL DISEÑO DE SISTEMAS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS EN
EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES OCULARES
Artículo científico IV. Contact Lenses of poly(2-hydroxypropylmthacrylate)co-β -cyclodextrin for the delivery of a novel antimicrobial thiosemicarbazone
in the treatment of ocular infections. Manuscrito en preparación 2012.
El siguiente desarrollo experimental fue llevado a cabo en colaboración con el
Laboratorio
de
Ciclodextrinas,
Departamento
de
Farmacia
y
Tecnología
Farmacéutica de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de
Compostela (España) y con el Laboratorio de Resistencia Bacteriana (Cepario de la
Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina).
III. 4. 1. Síntesis de (2,3-di-O-metacrilato-6-metacrilato)-β
β-CD
La síntesis del monómero metacrilato-β-CD fue llevada a cabo por la metodología
de polimerización descripta previamente por Saito y Yamaguchi, y debidamente
puesta a punto por Rosa dos Santos et al [116,117]. Se secó β-CD (8,0 g;
Roquette-Laisa, Valencia, España) en una balanza termostatizada a 105° C,
durante 24 h. Butilhidroxitolueno (40,0 mg; Sigma-Aldrich) y β-CD fueron
solubilizados en piridina (36 ml) y posteriormente fue agregado el metacrilato de
metilo (19,84 g; Merck, Chemicals Int., Darmstadt, Alemania). La mezcla fue
agitada en dos condiciones diferentes: (i) temperatura ambiente (2 h), y (ii)
calentamiento a reflujo, a 50 °C (5 h). Luego de pasado este tiempo, el crudo de
reacción fue vertido en agua destilada fría (300 ml), y se matuvo a 4° C durante
12 h para promover la precipitación del monómero. El precipitado obtenido se
filtró (0,22 µM, membrana de nylon, Teknokroma, Sant Cugat del Vallés, España) y
se purificó por solubilización en MeOH (20 ml) y posterior re-precipitación en agua
destilada fría (300 ml, 3 veces). El sólido blanco obtenido fue secado en desecador
utilizando vacío (5 días). Los solventes utilizados fueron de calidad analítica.
III. 4. 2. Síntesis de hidrogeles de pHEMA-co-β
β -CD
Para la obtención de hidrogeles de pHEMA-co-β-CD, se pesaron diferentes
cantidades del monómero metacrilato-β-CD sintetizado anteriormente (0; 0,6 y
1,2 g), y se solubilizaron en 6 ml de HEMA de calidad oftálmica (Merck, Alemania)
84
bajo agitación magnética (30 min). Estas concentraciones de monómero en HEMA
resultaron ser 0, 100 y 200 mg/ml (0, 10 y 20% p/v), respectivamente. Luego, se
agregó el agente entrecruzante EGMA (10 µl, 8mM, grado técnico 98%, SigmaAldrich) y el iniciador radicalario AIBN (9,84 mg, 10mM, AIBN); ambos reactivos se
agregaron a cada sistema en la misma concentración. Simultáneamente, se
prepararon hidrogeles (0, 10 y 20% p/v) conteniendo TSC4. Para ello, la TSC4 (6
mg) se solubilizó en HEMA (6 ml), y posteriormente se agregaron las mismas
cantidades de EGMA y AIBN previamente descriptas. La concentración final de
TSC4 en el hidrogel fue de 1 mg/ml o de 1mg/g de hidrogel seco. En ambos casos,
las mezclas fueron agitadas (10 min) y posteriormente inyectadas cuidadosamente
en moldes formados por dos láminas de vidrio (10 x 10 cm). Los moldes fueron
pincelados previamente (24 h antes) con diclorodimetilsilano (Sigma, Aldrich) con
el fin de evitar la posterior adhesión del hidrogel al vidrio, lavados con abundante
agua y acetona y secados bajo campana (2 h). Por último, los moldes fueron
sujetados con pinzas y espaciadores adecuados de silicona de 0,4 mm de espesor.
Una vez que los moldes fueron montados con las mezclas de polimerización (3
moldes sin carga de TSC4 y 3 moldes cargados con TSC4 de 0, 10 y 20% p/v del
monómero metacrilato-β-CD), se colocaron en estufa a 50° C (12 h), y
posteriormente en estufa a 70° C (24 h). Pasado el tiempo mencionado, se
desarmaron los vidrios montados y cada lámina de hidrogel fue lavada con agua
destilada hirviendo (15 min, 1 L) para eliminar residuos de monómero metacrilatoβ-CD que no reaccionaron y se cortaron en forma de discos utilizando un
sacabocados de 10 mm de diámetro. En el caso de las muestras cargadas con
TSC4, se constató la pérdida de fármaco tras el lavado con agua hirviendo por
espectofotometría UV-Vis. Los discos fueron sumergidos en NaCl 10mM (0,585 g/L)
durante 24 h, para extraer los restos de monómeros que no reaccionaron y que no
fueron eliminados en la etapa de lavado con agua hirviendo. Luego, las muestras
se lavaron en agua milliQ durante 3 días, con cambios de agua de lavado cada 12
h. La ausencia de restos monoméricos fue confirmada por espectofotometría UVVis. Por último, los discos se secaron en estufa a 40-50º C (3 días), hasta peso
constante.
85
III. 4. 3. Síntesis de hidrogeles super-hidrofílicos a base de HPβ
β-CD y HPβ
βCD/HPMC
Para la síntesis de hidrogeles super-hidrofílicos a base de HPβ-CD 20% p/v, se
mezclaron HPβ-CD (4,8 g; Roquette-Laisa), NaOH 0,2M (16 ml; 0,8 g NaOH/100 ml
agua milliQ), y el agente reticulante EGDE (8 ml, grado técnico 50%, SigmaAldrich). A la mitad de la preparación (12 ml finales) se le adicionó HPMC
hidroxipropilmetilcelulosa K4M (0,12 g, HPMC K4M, Sigma-Aldrich), que rindió una
concentración final de HPMC de 1% p/v. Las mezclas fueron agitadas hasta
obtener una composición homogénea (15 min) y fueron divididas en tubos de
ensayo de vidrio fino. Los tubos conteniendo las mezclas fueron secados en estufa
a 50° C (12 h) para completar la reacción. Los geles se obtuvieron por la rotura de
los tubos de vidrio y fueron lavados con la siguiente secuencia: (i) agua destilada
(12 h); (ii) HCl 10mM (12 h) para neutralizar el medio básico, y (iii) agua destilada
(24 h) y fueron cortados en discos de 5 mm de espesor con un bisturí y secados en
estufa a 40° C (24 h).
III. 4. 4. Caracterización de hidrogeles de pHEMA-co-β
βCD
La caracterización de los hidrogeles se realizó mediante espectroscopía ATR/FT-IR
con microscopio acoplado (Varian 670-IR, Inc., Santa Clara, CA, EEUU; accesorio
PIKE GladiATR de diamante) directamente sobre los discos secos a base de pHEMAco-βCD sin carga (compuestos de 0, 100 y 200 mg/ml de monómero metacrilato-βCD), con carga de TSC4 (posterior y durante la polimerización; compuestos de 0,
100 y 200 mg/ml de monómero), y monómero metacrilato-β-CD y TSC4, ambos en
forma sólida pura. Se evaluaron las diferencias entre los espectros infrarrojos para
las distintas muestras (%Transmitancia vs número de onda). Para el análisis y la
superposición de los espectros se utilizó el software Agilent Resolutions Pro
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EEUU).
III. 4. 5. Carga y liberación de TSC en medio de fluido lacrimal artificial
Para cargar los hidrogeles secos con TSC4, se preparó una suspensión de TSC4 en
agua ultrapura (250 µg/ml) a 25° C, la cual fue sonicada (30 min, Ultrasonicador
de baño 3510 Branson, Danbury, CT, EEUU) utilizando calor (45° C) y agitada (24
h) antes de la carga. El agua ultrapura (resistividad > 18,2 MΩcm) fue obtenida por
ósmosis inversa (MilliQ®, Millipore). Cada disco se dejó bajo agitación mecánica
86
(24 y 96 h) en la suspensión de TSC4. También se evaluó la incorporación de TSC4
a los discos mediante un tratamiento inicial en autoclave (121° C, 20 min) y la
posterior incubación en oscuridad por 4 días a 25° C [117].
Los discos cargados con la TSC4 se enjuagaron con agua y se sumergieron en FLA
(10 ml) para evaluar los perfiles de liberación, a 25º C (composición de FLA 6,78
g/L de NaCl; 2,18 g/L de NaHCO3; 1,38 g/L de KCl; y 0,084 g/L de CaCl2.2H2O; pH
8,0). La liberación de TSC4 fue monitoreada por espectrofotometría UV-Vis (λabs
de 330 nm) durante 15 días, a 25º C. Para la cuantificación de TSC4 en FLA, se
preparó una curva de calibración promedio de TSC4 en FLA en el rango de
concentraciones entre 1,0 y 7,0 µg/ml (coeficientes de correlación R2 = 0,99730,9992). Una vez efectuada la medición, cada muestra fue reintegrada a los viales
para proseguir con el ensayo. El volumen de FLA utilizado fue suficiente para
mantener las condiciones sink durante el ensayo de liberación, evitando de esa
forma la saturación del medio de liberación con la TSC4. Las condiciones sink
hacen referencia a mantener el volumen del medio de liberación 10 veces superior
al volumen requerido para la saturación del fármaco en dicho medio, o lo que es
lo mismo, mantener la concentración de fármaco una vez finalizado el proceso de
liberación en una concentración que sea inferior a la décima parte de la
concentración de saturación.
Los perfiles de liberación fueron graficados en cada caso como la cantidad de
TSC4 liberada en el FLA (expresada en µg por g de hidrogel) en función del tiempo
(h). Todos los ensayos se realizaron por triplicado y fueron expresados como la
media ± S.D.
III. 4. 6. Evaluación del grado de hinchamiento de hidrogeles a base de pHEMAco-β
βCD, HPβ
β-CD y HPβ
β-CD/HPMC
Hidrogeles a base de pHEMA-co-βCD, HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC de peso conocido
previamente secados en estufa a 50° C (hasta 48 h), se sumergieron en FLA (10
ml) a 25° C. A tiempos t preestablecidos (48 h), los discos fueron retirados de los
viales y después de secar cuidadosamente la superficie de los mismos con papel
tissue, fueron pesados. El grado de hinchamiento, Qt (%), se determinó utilizando
la ecuación 6 [118]
Qt (%) = 100 x [(Wt – W0)/ W0] (6)
87
Donde W0 y Wt son el peso de la muestra seca y de la muestra hinchada a tiempo
cero y a un tiempo t, respectivamente. Los perfiles de hinchamiento fueron
graficados en cada caso como Qt (%) en función del tiempo (h).
III. 4. 7. Evaluación de la actividad antimicrobiana de hidrogeles a base de
pHEMA-co-β
βCD, HPβ
β -CD y HPβ
β-CD/HPMC cargados con TSC
La evaluación de la actividad antimicrobiana de la TSC4 y de los hidrogeles
cargados con TSC4 a base de pHEMA-co-βCD, HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC fue llevada
a cabo tomando de referencia protocolos reportados previamente [118]. Para el
mismo, se utilizó el método de difusión en agar Müller-Hinton (pH 7,2–7,4 a 25° C;
altura del agar 4 mm) según las normas del Instituto de Estándares Clínicos y de
Laboratorio (CLSI, Wayne, PA, EEUU). El hisopado se preparó con una densidad
idéntica a una turbidez estándar de 0,5 en la escala de McFarland de un cultivo
fresco y puro, con una incubación a 35,0–37,0° C (16–24 h). La turbidez estándar
de 0,5 en la escala de McFarland se usa para ajustar la turbidez del inóculo para la
prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
Se ensayaron dos microorganismos que dan lugar a infecciones de alta incidencia
en ojo: (i) Pseudomona aeruginosa (cepa 9027) y (ii) Staphylococcus aureus (cepa
6538P).
Se preparó una solución madre de TSC4 (20 mg/ml) en DMSO puro. Discos de papel
(6 mm) fueron cargados con 10 µl de dicha sc madre de TSC4 (200 µg), secados en
cabina de flujo laminar y estufa a 37° C para eliminar trazas del solvente que
pudieran afectar los resultados de inhibición microbiana. Al mismo tiempo se
cargaron discos de papel con 10 µl de DMSO puro y se prosiguió en las mismas
condiciones (control).
Por otro lado, hidrogeles secos fueron inmersos en 10 ml de una suspensión de la
TSC4 en agua ultrapura (250 µg/ml) a 25° C, preparada como se describió
anteriormente. Los discos se agitaron en dicha suspensión durante 24 h (tiempo
elegido como óptimo para la carga de los mismos en base a los ensayos
anteriores). Los discos fueron retirados con una pinza estéril y se eliminó el
exceso de líquido de inmersión utilizando una gasa estéril para minimizar posibles
contaminaciones ambientales. Se emplearon discogramas control (Bacilo Gram
negativo, BGN 1; Britania Discograma®, Laboratorios Britannia, Buenos Aires,
Argentina)
impregnados con
distintos antimicrobianos,
88
conforme con las
recomendaciones de la OMS (composición de los discos: imipenem, 10 µg;
gentamicina, 10 µg; ceftazidima, 30 µg; ampicilina/sulbactam, 10/10 µg;
cefotaxima, 30 µg; y trimetoprima/sulfametoxazol, 1,25/23,75 µg). Se hisoparon
las placas de Petri con los distintos microorganismos, se colocaron las muestras de
manera centrada, y se evaluó la zona de inhibición después de 24 h de incubación,
a 37° C. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
89
90
CAPÍTULO IV
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
91
92
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
“Tengamos ideales elevados y pensemos en alcanzar
grandes cosas, porque como la vida rebaja siempre y
no se logra sino una parte de lo que se ansía, soñando
muy alto alcanzaremos mucho más. Para una voluntad
firme, nada es imposible, no hay fácil ni difícil; fácil
es lo que ya sabemos hacer, difícil, lo que aún no
hemos aprendido a
hacer bien”. Bernardo. A.
Houssay.
IV. 1. TIOSEMICARBAZONAS DERIVADAS DE 1-INDANONAS
Artículo Científico I. Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone
drug candidates with potential antiviral activity.
New Journal of Chemistry. 2010; 34, 2047-2058. Referencia 28 de la presente
tesis doctoral.
A pesar de que los derivados de TSC fueron calificados en la literatura científica
como “pobremente solubles en agua”, no se encuentran en ella determinaciones
cuantitativas de la solubilidad intrínseca en medio acuoso [119,120]. Las
determinaciones de CI50 realizadas hasta el momento con TSCs derivadas de 1indanonas no han considerado la alta tendencia de estos compuestos a
autoagregarse en medio acuoso para formar estructuras de tamaño submicrónico,
invisibles al ojo humano [22,23,26,27]. Además, la generación de estas
estructuras en el medio de cultivo utilizado en los ensayos biológicos compromete
la reproducibilidad y la confiabilidad de los resultados de actividad obtenidos. A
pesar de ello, no existen estudios previos que describan la autoagregación de TSCs
en medio acuoso. En este contexto, la primera etapa de la presente tesis doctoral
abordó por primera vez el estudio exhaustivo de dichos fenómenos.
IV.1.1. Síntesis, purificación y caracterización química de TSCs de indanonas
Luego de la síntesis y la purificación de los derivados de las TSC1-4 (ver Capítulo
III. 1. 1), se prosiguió con la caracterización de los mismos. En las Tabla IV. 1. 1
se detallan las propiedades químicas y térmicas más relevantes de las TSC1-4 en
estudio. Como preámbulo de los estudios de estabilidad fisicoquímica y de
agregación en medio acuoso, se caracterizaron exhaustivamente las diferentes
93
TSCs mediante técnicas espectroscópicas y espectrofotométricas. Asimismo, se
determinó la lipofilicidad de las diferentes TSCs y se comparó con los valores
calculados mediante diferentes métodos de cálculo.
Tabla IV. 1. 1. Propiedades químicas y térmicas de las TSC1-4.
TSC
TSC1
TSC2
TSC3
TSC4
MWa (m/z)
[M + H+]
εb
(M cm-1)
x 104
206,0746
2,73
236,0852
266,0957
306,1270
λ (nm)
-1
S 0e
(µM)
Iλnuevo/Iλmaxf
Tmg (ºC)
DMSO
agua:DMSO
(98:2)
332,320c
294,283
324,312c
290,280,
233d
67,8
0,385
185
345,330c
306,295
337,324c
299,289,
233d
31,1
0,654
229
3,47
348,334c
299,288
343,329c
293,283,
233d
11,8
4,630
258
4,00
352,336c
299,288
345,330c
294,284,
239d
18,8
0,323
199
2,81
a
Peso molecular obtenido por espectrometría de masa de alta resolución (HR-MS); bCoeficiente de
extinción molar (ε) en DMSO; cλmax utilizado en los estudios de solubilidad, estabilidad física y
HPLC; dNuevo λ de absorción encontrado en soluciones de TSC en agua:DMSO (98:2) que aparecen a
tiempo 0 y que no cumplen con la ley de Lambert-Beer; eSolubilidad intrínseca en agua de las
TSC1-4 expresada en µM; fIλnuevo/Iλmax a 30 días; gTm determinado por DSC.
En una primera etapa, las TSCs de 1-indanonas se caracterizaron químicamente
mediante distintas técnicas espectroscópicas (ver Capítulo III. 1. 1). El análisis
espectroscópico de la TSC4 se profundizó en relación al de las TSC1-3 debido a
que este nuevo derivado se sintetizó por primera vez durante el desarrollo de esta
tesis con el objeto de explorar el efecto de nuevas modificaciones químicas sobre
la cadena lateral del resto TSC (N4) en las propiedades fisicoquímicas, de
agregación, de complejación con CDs y de actividad antiviral. La motivación de
esta nueva modificación reside en que la sustitución en el grupo –NH2 hidrofílico
del resto TSC alteraría la solubilidad acuosa y eventualmente su actividad
biológica. Los desplazamientos encontrados en los espectros de 1H-RMN y
13
C-RMN
para las cuatro TSCs fueron los siguientes.
TSC1. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2.82 (m, 2H, CH2); 3.20 (m, 2H, CH2);
7.25-7.72 (m, 4H, ArH); 7.90 (sa, 1H, NH o SH); 8.17 (sa, 1H, NH o SH); 10.21 (sa,
94
1H, NH).
13
C-RMN (50 MHz, DMSO-d6) señales principales (ppm): 27.3; 28,4; 157,1;
178.7; entre otras.
TSC2. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 2.88 (m, 2H, CH2); 2.96 (m, 2H, CH2);
3.77 (s, 3H, OCH3); 6.92-7.48 (varias señales, 3H, ArH); 8.07 (sa, 1H, NH o SH);
8.23 (sa, 1H, NH o SH); 10.25 (sa, 1H, NH).
13
C-RMN (50 MHz, DMSO-d6) señales
principales (ppm): 27.5; 27,9; 156,9; 178.5; entre otras.
La presencia de tres singletes anchos para los átomos de hidrógenos unidos a
heteroátomos permite inferir el carácter de doble enlace de la unión C(3)N(4) del
resto TSC. Esto lleva a que ambos átomos de hidrógeno del resto -NH2 se vean a
diferentes δ por el carácter de isómero geométrico que dicha estructura poseería
o directamente por dar lugar a la existencia de un tautómero con los átomos de
hidrógeno distribuidos de la siguiente forma: -N(3)H, -N(4)H y -SH.
El espectro 1H-RMN de la TSC4 fue similar al de la TSC3 aunque en el compuesto
4 se evidenciaron los protones correspondientes al grupo alilo (CH2-CH=CH2) y la
partición de la señal perteneciente al extremo terminal del grupo -NH-, acoplado
al grupo metileno del resto alilo. En la Figura IV. 1. 1 se representan los espectros
de 1H-RMN de las TSC3 y TSC4 que fueron los de mayor relevancia en el desarrollo
de la presente tesis doctoral. Las principales diferencias entre ambos espectros se
deben a la presencia del grupo alilo en la TSC4, entre 4.0-6.0 ppm.
A su vez, el espectro
13
C-RMN de la TSC3, presentó las siguientes señales (ppm):
28.1; 28,5; 56.1; 56.2; 104.3; 108.3; 130.0; 142.8; 149.3; 152.4; 158,5; 178.3.
Mientras que el espectro
13
C-RMN de la TSC4 mostró señales similares a las de la
TSC3 (ppm): 28.4; 28.7; 46.4; 56.3; 56.5; 104.7; 108.5; 116.1; 130.2; 136.1; 142.9
149.4; 152.6; 158.3; 178.2. Debe destacarse la aparición de las señales
correspondientes a los átomos de carbono del grupo alilo en (ppm): 46.4 (CH2CH=CH2), 116.1 (CH2-CH=CH2) y 136.1 (CH2-CH=CH2).
El análisis del espectro de FT-IR también resultó de gran utilidad ya que permitió
confirmar la entidad química de las TSCs (Capítulo III. 1. 1). Las bandas
características expresadas en cm-1 fueron las siguientes:
TSC1. 3423.8 ν (NH st); 3262.6 ν (NH st); 1587.3 ν (C=N st); 1513.3 ν {C(S)-N st};
1481.7 ν (C=S st).
TSC2. 3402.0 ν (NH st); 3236.1 ν (NH st); 1590.6 ν (C=N st); 1513.6 ν {C(S)-N st};
1489.9 ν (C=S st).
95
TSC3. 3371.4 ν (NH st); 3259.4 ν (NH st); 1594.5 ν (C=N st); 1516.1 ν {C(S)-N st};
1496.3 ν (C=S st).
TSC4. 3354.8 ν (NH st); 3205.9 ν (NH st); 1604.3 ν (C=N st); 1527.2 ν {C(S)-N st};
1490.9 ν (C=S st). En este caso, las bandas características del grupo alilo fueron
observadas en 1644.5; 958.4 y 922.5 ν (CH2-CH=CH2 st).
96
Hh
A
Ha
N
NHc
Hg
Hb
1
C
He
Hd
Hh
Hh
Hf
Hg
Hb
Ha
Hc
N
S
Hh3CO
Hd
Hd
Hh3CO
He
He
Hf
DMSO-d6
/agua
H-RMN (δ, ppm)
2.87 (m, 2H)
2.98 (m, 2H)
3.78 (s, 3H)
3.79 (s, 3H)
6.94 (s, 1H)
7.43 (s, 1H)
7.98 (s, 1H)
8.12 (s, 1H)
10.09 (s, 1H)
DMSO-d6
f
Hg H
Hc
HdHe
Ha Hb
10. 0
9. 0
8. 0
7. 0
6. 0
5. 0
( p p m)
4. 0
3. 0
2. 0
1. 0
1
B
Ha
Hc
C
NHe
f
NH
Hi
C
C
Hb
C
Hd
Hd
N
S
Hk3CO
DMSO-d6 Hh
/agua Hg
Hk
Hk
Hd
Ha,Hb
Hk
Hc
Hj
Hi
He
Hg
Hg
Hk3CO
Hh
Hh
Hj
Hf
H-RMN (δ, ppm)
2.86 (m, 2H)
2.96 (m, 2H)
3.78 (s, 3H)
3.79 (s, 3H)
4.24 (t, 2H,J=5.64Hz)
5.10-5.17 (ac, 2H)
5.91 (dt, 1H,J= 5.13
Hz y 17.15 Hz)
6.94 (s, 1H)
7.35 (s, 1H)
8.56 (dd, 1H,J=5.64
Hz y 6.16 Hz)
10.16 (s, 1H)
DMSO-d6
Hi Hj
Hf
e
H
10. 0
9. 0
c
Hb Ha
Hd
HgHh
H
8. 0
7. 0
6. 0
5. 0
( p p m)
4. 0
3. 0
2. 0
Figura IV. 1. 1. Espectros 1H-RMN de (A) TSC3 y (B) TSC4, en DMSO-d6.
97
1. 0
0. 0
El peso molecular experimental (m/z) de las diferentes TSCs se determinó por HRMS (Capítulo III. 1. 1). Los datos se resumen en la Tabla IV. 1. 1.
Los análisis espectroscópicos realizados confirman las estructuras químicas
correspondientes.
El análisis espectrofotométrico UV-Vis se llevó cabo para explorar la posibilidad de
cuantificar las diferentes TSCs mediante una técnica sencilla, económica y rápida.
Los espectros mostraron la aparición de nuevos lambdas de absorción entre 233239 nm, que no cumplieron con la Ley de Lambert-Beer (Tabla IV. 1. 1.). La
intensidad de dicha señal aumentó a medida que disminuyó la concentración de la
TSC disuelta en medio agua:DMSO (98:2) en función del tiempo y se hizo más
evidente a mayor concentración de la TSC en estudio (7,5-75µM). Es decir, la
aparición de este nuevo pico de absorción se encontró ligada a la pérdida de
solubilidad de los derivados de 1-indanonas en medio acuoso. Este fenómeno
constituyó la primera evidencia que estos compuestos podrían autoagregarse y
formar estructuras nanoscópicas en agua. Un comportamiento similar fue
reportado para otras sustancias como la AmB, antibiótico poliénico de primera
elección en candidiasis [31]; la autoagregación de Amb está estrechamente
relacionada con su efecto nefrotóxico [31]. En la Figura IV. 1. 2 se presenta el
espectro de absorción de una solución de TSC3 (75µM) en medio agua:DMSO
(98:2). La aparición de la nueva señal se observa a 233 nm. En base a ello se
estableció un parámetro espectrofotométrico, I233/Iλmax, para evaluar la tendencia
de cada TSC a agregarse. En general, la agregación fue acompañada por un
aumento gradual de la intensidad de la relación I233/Iλmax en función del tiempo.
Por ejemplo los valores de I233/Iλmax para TSC3 fueron 0,450; 2,530 y 4,630 a día 0,
15 y 30, respectivamente. Los datos de Inuevoλ/Iλmax para las cuatro TSCs a día 30 se
resumen en la Tabla IV. 1. 1. En base a los resultados observados TSC3 apareció
como la TSC con mayor tendencia agregarse. Como se verá en la descripción de
los resultados del análisis térmico, este comportamiento coincidió con el aumento
de la Tm.
98
Pico de Cuantificación
(329 nm)
A
I233/Iλmax = 0,450
Nuevo pico de
absorción (233 nm)
I233/Iλmax = 2,530
B
Nuevo pico de
absorción (233 nm)
Pico de Cuantificación
(329 nm)
I233/Iλmax = 4,630
C
Nuevo pico de absorción
(233 nm)
Pico de Cuantificación
(329 nm)
Figura IV. 1. 2. Espectro UV-Vis característico de de una solución TSC3 75µM en
agua:DMSO (98:2) en función del tiempo: (A) día 0, (B) día 15, (C) día 30. Se evidencia la
aparición de un nuevo pico de absorción a 233 nm. La agregación es acompañada por un
aumento gradual en la relación de intensidad de I233/Iλmax de 0,450 a 4,630.
99
La solubilidad ideal de una molécula está gobernada por la Tm; el aumento de Tm
está íntimamente asociado al aumento de las fuerzas intermoleculares solutosoluto. Las Tm para las TSC1, TSC2, TSC3 y TSC4 fueron 185, 229, 258 y 199º C,
respectivamente (Tabla IV. 1. 1).
Los procesos de solubilización dependen de la generación de fuerzas de atracción
soluto-solvente suficientemente fuertes que permitan superar a las generadas
entre moléculas de soluto. Así, a mayor Tm (y mayor fuerza soluto-soluto), menor
la solubilidad encontrada. La S0 de las TSCs fue definida como la máxima
concentración soluble a día 30. La TSC3 resultó el derivado con menor solubilidad
intrínseca en agua:DMSO (98:2), con un valor de S0 = 11,8µM (Tabla IV. 1. 1). Este
comportamiento coincidió con la mayor Tm (258º C) y la mayor tendencia a
agregación (I233/Iλmax = 4,630) para este compuesto con respecto a todas las TSCs
estudiadas. Por el contrario, la TSC1 resultó el derivado más soluble con S0 =
67,8µM. Las TSC2 y TSC4 mostraron valores intermedios de S0 de 31,1 y 18,8µM,
respectivamente. En el caso de las TSCs, la existencia de interacciones
hidrofóbicas fuertes entre los restos aromáticos podría explicar la solubilidad
experimental extremadamente pobre y la tendencia relativamente elevada a la
autoagregación en medio acuoso. Además, la introducción de uno y dos grupos
funcionales metoxilo (–OCH3) en el anillo aromático incrementó gradualmente la
Tm de 185º C (TSC1) a 229º C (TSC2) y a 258º C (TSC3) (Tabla IV. 1. 1). Estos
resultados sugirieron que los grupos –OCH3 juegan un rol fundamental en la
consolidación de las asociaciones soluto-soluto de los derivados de TSC de 1indanona. Por otro lado, la presencia del resto alilo en la TSC4 produjo la
disminución de la Tm a 199º C y el aumento de la S0 a 18,8µM, en relación a su
contraparte no-alilada (TSC3), sugiriendo que la N-alilación distorsiona, al menos
parcialmente, la formación de enlaces de H en el extremo –NH2 del resto TSC y
debilita la existencia de interacciones soluto-soluto fuertes. La tendencia de
agregación de la TSC4 a día 30, estimada mediante el parámetro I239/Iλmax no fue
la misma que la observada para los otros derivados; a pesar de ser un derivado de
muy baja solubilidad acuosa. Por otro lado, se debe tener en cuenta que el nuevo
lambda de absorción (239 nm) no fue idéntico al de las otras tres TSCs (Tabla IV.
1. 1).
100
La solubilidad en agua de un fármaco también está condicionada por la lipofilia
del mismo. En este contexto, cambios pequeños en la estructura química pueden
resultar en cambios pronunciados en la solubilidad. Para estudiar la lipofilicidad
de las diferentes TSCs, inicialmente se calcularon los valores de log P “teóricos”
utilizando dos softwares diferentes [107], y la metodología de aditividad de
constantes de sustituyentes (π) de Hansch y Fujita [109-111]. Los valores se
presentan en la Tabla IV. 1. 2. Por otro lado, se determinaron los valores log K
para estimar experimentalmente la lipofilia (log Kwater) de las TSCs (Figura IV. 1.
3).
3
3
TSC 1
log k w
TSC 2
log k w
2
log k
log k
2
2
R = 0,9938
1
2
R = 0,9942
1
0
0
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
3
log k w
30
40
50
60
Acetonitrilo %
Acetonitrilo %
TSC 3 log k w
3
TSC 4
2
log k
log k
2
R2 = 0,9977
R2 = 0,9918
1
1
0
0
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
40
50
60
Acetonitrilo %
Acetonitrilo %
Figura IV. 1. 3. Log K versus acetonitrilo % para las TSC1-4. La ordenada al origen
corresponde al log Kwater que es logaritmo del factor de capacidad en 0% de ACN como
fase móvil.
101
Tabla IV. 1. 2. Valores de log Kwater y log P determinados para las diferentes TSCs
TSC
log
Kwa
log Pa
b
Log Pb
c
Constantes de sustituyentes
hidrofóbicos π
Hansch-Fujita
log P Pubchem
log Pcd
(CID 6735) 1,70
O
TSC1
1,95
1,79
NH
1,49
NH
N
C
SH
(CID 334036) 1,60
O
TSC2
2,03
1,66
1,36
NH
H3CO
NH
N
C
SH
(CID 334036) 1,60
O
TSC3
1,79
1,54
1,24
NH
NH
H3CO
N
C
SH
(CID 334036) 1,60
O
TSC4
2,83
2,75
2,59
N
NH
H3CO
N
C
a
SH
log P = {[(1,70; 1-indanona) –
(-1,21; C=O)] + [(-0,84x2; C=N-) +
(-1,19; -NH-) + (0,39; -SH)]} =0,43
log P = {[(1,60; 6-metoxi-1indanona) – (-1,21; C=O)] +
[(-0,84x2; C=N-) +
(-1,19; -NH-) + (0,39;-SH)]} =0,33
log P = {[(1,60; 6-metoxi-1indanona) – (0; Ar-H) +
(-0,02; Ar-OCH3) – (-1,21; C=O)] +
[(-0,84x2; C=N-) + (-1,19; -NH-) +
(0,39; -SH)]} =0,31
log P = {[(1,60; 6-metoxi-1indanona) – (0; Ar-H) + (-0,02; ArOCH3) – (-1,21; C=O)] +
[(-0,84x2; C=N-) + (-1,19; -NH) +
(0,39; -SH) + (0,50; -CH2) + (0,70;
CH=CH2)]} =1,51
log Kwater calculado por RP-HPLC. blog Pa calculado por Spartan ´02 software (Ghose-Crippen method). clog Pb calculado por Chemdraw
Ultra 7.0 software. dlog Pc calculado por el método de fragamentación de Hansch-Fujita.
102
Los resultados obtenidos indicaron que los valores de lipofilicidad determinados
experimentalmente fueron mayores a los calculados por cualquiera de las
metodologías (Tabla IV. 1. 2.). Es importante destacar que de acuerdo a los
valores de log P calculados por la metodología de fragmentación, la incorporación
de un grupo funcional –OCH3 en la molécula de TSC debería disminuir levemente la
lipofilia en relación a su derivado sin sustituir. Así, los valores de log P calculados
por dicha metodología disminuyen de 0,43 para TSC1, a 0,33 para TSC2 y a 0,31
para TSC3 (Tabla IV. 1. 2.). Sin embargo, el valor experimental obtenido por
HPLC evidencia lo contrario, coincidiendo con los resultados de solubilidad y de
tendencia de agregación, los cuales fueron sustentados por el análisis térmico que
han demostrado que la incorporación sucesiva de dos grupos –OCH3 provoca una
caída concominante de la solubilidad acuosa. A su vez, TSC4 demostró la mayor
lipofilia calculada y experimental, lo cual se debe a la incorporación de un resto
alilo altamente hidrofóbico en la cadena lateral hidrofílica (Tabla IV. 1. 2.). Pese
a ello, TSC3 demostró la mayor tendencia a agregación, la mayor Tm y la menor S0.
Es interesante destacar que en base a los ensayos de lipofilicidad, TSC3 hubiera
sido la mejor candidata de todas las TSCs estudiadas para poseer a priori la mayor
solubilidad de los compuestos en agua. Sin embargo, estos resultados no
coincidieron con su comportamiento experimental en medio acuoso. Pese a que la
incorporación de un grupo funcional –OCH3 que convierte a TSC2 en un derivado
más hidrofílico que TSC1 de acuerdo a los valores calculados, la TSC2 demostró un
valor de log Kwater mayor (2,03) que el de la TSC1 (1,95), indicando que es más
hidrofóbica. Estos resultados coicidieron con los observados por análisis térmico,
solubilidad y tendencia de agregación. En la Figura IV. 1. 4 se muestra la buena
correlación entre los valores de log Kwater y log P calculados a través de métodos
computacionales. De todas maneras, los resultados presentados hasta aquí
remarcan la complejidad del análisis de los parámetros que gobiernan los procesos
de disolución y destacan la necesidad de estudiar y entender de manera profunda
los mismos en las etapas iniciales del desarrollo.
103
3
3
B
log P
log P
A
2
2
2
R = 0,9705
R2 = 0,9719
1
1
1
2
3
1
log kw
2
3
log kw
log
Kwater
log Kwater
Figura IV. 1. 4. Correlación entre el log Kwater y valores de log P calculados con los
softwares (A) ChemDraw Ultra 7.0 y (B) Spartan ’02.
IV. 1. 2. Estabilidad fisicoquímica de las TSCs en medio acuoso
En general, durante la evaluación de estos compuestos sobre cultivos celulares se
preparan soluciones madre concentradas en DMSO, que son almacenadas a
temperatura ambiente por períodos prolongados. En el momento del análisis
biológico se toma la alícuota correspondiente y se diluye en medio de cultivo para
obtener la concentración final deseada. Este protocolo considera la concentración
máxima de DMSO aceptable para cada tipo celular que usualmente se encuentra
entre 0,5-2% v/v. Por ello, fue de interés establecer la estabilidad química de las
TSCs en dichas condiciones. Los diferentes derivados fueron solubilizados en
DMSO-d6 en concentración de 2500µM y las soluciones fueron analizadas por 1HRMN a diferentes tiempos. La integridad química se conservó en todos los casos, lo
que fue confirmado repitiendo las determinaciones espectroscópicas sobre la
muestras iniciales luego de 30 y 90 días de preparadas.
Posteriormente, se estudió la estabilidad física de las soluciones de TSC1-4
durante 30 días, a 25º C, en dos medios diferentes: uno orgánico (DMSO, 100%)
similar a las condiciones de almacenamiento previo a la evaluación biológica y uno
acuoso (agua:DMSO, 98:2) que se asemejó a las condiciones de uso aunque en este
caso los ensayos se realizaron a 25º C. Para ello, se monitoreó la caída de la
concentración en función del tiempo por espectrofotometría UV-Vis. En ambos
casos, se prepararon soluciones madre 75µM y se diluyeron de forma consecutiva
con los solventes correspondientes hasta obtener las siguientes concentraciones
de estudio: 7,5; 15,0; 22,6; 37,5µM (Capítulo III. 1. 2). Las Figuras IV. 1. 5 y IV.
104
1. 6 representan la estabilidad física de soluciones de las TSC1-4 en ambos
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
Solubilidad TSC2 (µM)
Solubilidad TSC1 (µM)
medios.
75µM
80
70
60
50
100
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
30
30
20
20
10
10
0
0
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 0
Día 30
Tiempo (días)
100
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
Día 7
Día 15
Día 30
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
Día 1
Tiempo (días)
Solubilidad TSC4 (µM)
Solubilidad TSC3 (µM)
7,5µM
40
40
90
90
0
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 30
Tiempo (días)
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 30
Tiempo (días)
Figura IV. 1. 5. Solubilidad de las TSC1-4 en soluciones de DMSO 100% durante 30 días, a
25º C.
De estos estudios, se pudo concluir que las soluciones de las TSCs en DMSO,
permanecieron estables durante al menos 30 días. Por el contrario, en solución
acuosa, las concentraciones en solución decrecieron desde 75µΜ (día 0) a 6,618,8µM (día 30) para las TSC2-4 y a 67,8µM (día 30) para la TSC1. Esta pérdida de
título se debió a la alta tendencia de estos derivados de TSC a autoagregarse
espontáneamente en medio acuoso, coincidiendo con los puntos demostrados en
el Capítulo IV. 1. 1. Por otro lado, se observó nuevamente que la TSC1 fue el
derivado más soluble y con menor tendencia a la agregación y a la precipitación.
105
Solubilidad TSC2 (µM)
Solubilidad TSC1 (µM)
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 0
Día 30
Día 1
Día 7
Día 15
Solubilidad TSC4 (µM)
Solubilidad TSC3 (µM)
Tiempo (días)
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
Día 30
Tiempo (días)
100
90
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
80
70
60
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 0
Día 30
Día 1
Tiempo (días)
Día 7
Día 15
Día 30
Tiempo (días)
Figura IV. 1. 6. Solubilidad de las TSC1-4 en soluciones de agua:DMSO (98:2) durante 30
días, a 25º C.
IV. 1. 3. Investigación de los posibles fenómenos y mecanismos de
autoagregación de las TSCs en medio acuoso
Como fuera mencionado en los Capítulos IV. 1. 1, y IV. 1. 2, las primeras
caracterizaciones de las TSC1-4 aportaron evidencias claras de la posible
autoagregación de estos compuestos en medio acuoso. Para sustentar dichas
observaciones, se investigó exhaustivamente el comportamiento las TSCs en medio
acuoso mediante otras metodologías complementarias: (i) 1H-RMN (1D-DOSY, 2DROESY y 2D-DOSY), (ii) DLS, (iii) TEM y (iv) tensión superficial.
En el caso de 1H-RMN se utilizó una mezcla de solventes deuterados D20:DMSO-d6
(34:66) y concentraciones de laTSC3 de 2500µM; esta concentración fue la mínima
que permitió la detección de todas las señales del compuesto utilizando esta
técnica (ver Capítulo IV. 1. 2). La TSC3 fue la TSC elegida para llevar a cabo este
106
complejo estudio debido a que fue el derivado que demostró mayor tendencia a la
agregación, menor solubilidad acuosa y sobre todo por su relevancia biológica
como potencial agente antiviral contra el VHC, respecto del observado sobre VDVB
[22]. La justificación del uso del medio agua:DMSO estuvo relacionada con la
necesidad de utilizar un cosolvente no tóxico en los ensayos biológicos celulares.
Teniendo en cuenta el espectro de 1H-RMN de la TSC3 (Figura IV. 1. 1), los
desplazamientos principales encontrados fueron los siguientes: Hh 3.79 (s, 3H,
OCH3); Hh 3.80 (s, 3H, OCH3); Hf 7.00 (1H, ArH) y Hg 7.33 (1H, ArH). Los protones
de –NH2 y –NH se intercambiaron con deuterio y no fueron detectados. Además, los
desplazamientos principales encontrados por 1D-DOSY fueron los siguientes: Hh
3.79 (s, 3H, OCH3); Hh 3.80 (s, 3H, OCH3); Hf 6.94 (1H, ArH) y Hg 7.27 (1H, ArH).
Nuevamente, los protones de –NH2 y -NH se intercambiaron con deuterio. El Hg
mostró un corrimiento de 0.10 y 0.16 ppm en relación al espectro en DMSO-d6
100%, para 1H-RMN y 1D-DOSY, respectivamente. Generalmente en este tipo de
estudios, se espera observar la desaparición de señales de protones específicos
que evidencien algún tipo de interacción por puente hidrógeno intra o
intermolecular. Por otro lado, debe destacarse que el ensayo no pudo realizarse
bajo las condiciones deseadas (de mayor contenido acuoso). Así, es probable que
un 66% de DMSO resultara un porcentaje elevado de solvente orgánico, que
permitió mantener soluble a la TSC3 y que no favoreció la autoagregación. Si
bien, los cambios espectrales no fueron contundentes y no permitieron confirmar
la agregación de la TSC3, los desplazamientos pequeños sugirieron cambios en las
interacciones soluto-soluto.
A pesar que los resultados obtenidos a través de la realización de experimentos de
1
H-RMN convencional no fueron totalmente satisfactorios, esta técnica se
encuentra ampliamente reportada en la literatura científica para demostrar la
agregación de fármacos [32]. Por ello, se decidió llevar a cabo experimentos de
RMN bidimensional. A pesar del trabajo realizado en diferentes condiciones
experimentales, no se detectaron cambios de relevancia.
Para ahondar en los estudios de agregación, soluciones de TSC en agua:DMSO
(98:2) se estudiaron por DLS. Se determinaron el Dh, y la distribución de tamaños
(expresada como PDI) de las partículas generadas en función del tiempo (30 días).
Se evaluaron concentraciones de las TSC1-4 entre 7,5 y 75,0µM. Dichas
concentraciones fueron relevantes porque que estos compuestos demostraron
actividad antiviral en dicho rango [21-27]. Todas las TSCs demostraron la
107
generación espontánea de partículas de tamaño nanométrico en el rango entre
1200
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
D h (nm)
D h (nm)
120 y 300 nm (Figura IV. 1. 7).
Día 30
1000
1200
Día 0
800
600
600
400
400
200
200
Día 15
Día 30
0
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
7,5µM
µM)
Concentración TSC1 (µ
1200
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
D h (nm)
D h (nm)
Día 7
1000
800
0
Día 1
Day 30
1000
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
µM)
Concentración TSC2 (µ
1200
Día 0
Día 1
Día 7
Día 15
Día 30
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
7,5µM
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
7,5µM
µM)
Concentración TSC3 (µ
15µM
22,6µM
37,5µM
75µM
µM)
Concentración TSC4 (µ
Figura IV. 1. 7. Diámetro hidrodinámico (Dh) de los agregados de las TSC1-4 generados en
agua:DMSO (98:2) medidos por DLS, durante 30 días. Los resultados son expresados como
el valor promedio de 4 determinaciones ± S.D.
Las TSCs menos solubles (menor S0) como por ejemplo TSC3 y TSC4, mostraron
tamaños iniciales menores, a diferencia de TSC1 y TSC2 que presentaron
nanopartículas de mayor tamaño. Por ejemplo, soluciones 7,5µM de las TSC1 y
TSC3 formaron nanopartículas de 320 y 188 nm, respectivamente (Figura IV. 1.
7). Esto se debe a que a menor solubilidad del compuesto, se forman más
rápidamente, una mayor cantidad de núcleos de cristalización lo que da lugar a un
mayor número de partículas de menor tamaño. Cuando la solubilidad aumenta, la
nucleación es más lenta, dando lugar a un menor número de núcleos (y de
nanopartículas) de mayor tamaño. Por otro lado, todas las muestras mostraron un
aumento gradual del tamaño de los agregados en función del tiempo,
108
independientemente de la concentración inicial. Los tamaños finales estuvieron
entre 550 nm y 1 µm. En general, a mayor concentración inicial, mayores los
tamaños finales observados. Este comportamiento constituyó evidencia adicional
que las nanopartículas iniciales (de menor tamaño) servirían como sitios de
nucleación para la posterior deposición de nuevas moléculas de TSC y la formación
de nanocristales. Otro parámetro relevante determinado por DLS fue el
porcentaje de intensidad de cada dispersión. Este resultó sensible a la
concentración inicial de las muestras estudiadas y a la formación de agregados de
mayor tamaño. Así, los porcentajes de intensidad aumentaron de 10-12 % (día 0) a
25-45 % (día 30). El PDI de los diferentes sistemas acompañó el crecimiento del
tamaño de los agregados en función del tiempo. Los datos se presentan en la
Tabla IV. 1. 3. Es importante destacar que a pesar de la presencia de
nanopartículas de tamaños relativamente grandes todos los sistemas fueron
macroscópicamnete transparentes (al ojo desnudo). Este fenómeno resalta la
trascendencia de estos estudios y arroja serias dudas respecto de la validez de
estudios biológicos en los cuales el fármaco está “aparentemente” (y
macroscópicamente) solubilizado, pero donde en realidad está presente en forma
de estructuras nanoscópicas. En otras palabras, la interacción de un fármaco
soluble con las células será diferente al que se espera en el caso de que este
formando nanopartículas.
El Z-pot es una medida de la densidad de carga sobre la superficie de las
partículas y depende de: (i) la concentración de la estructura cargada y (ii) el
tamaño de la partícula. Un factor que afecta al Z-pot es el pH de la solución; las
soluciones de TSC en agua:DMSO (98:2) mostraron valores de pH entre 6,0 y 7,0.
109
Tabla IV. 1. 3. Índices de polidispersión (PDI) de los agregados de las TSC1-4 generados
en medio agua:DMSO (98:2), medidos por DLS durante 30 días. Los resultados se expresan
como el valor promedio de 4 determinaciones ± S.D.
TSC
TSC1
TSC2
TSC3
TSC 4
TSC
(µM)
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
0
0,382 (0,090)
0,325 (0,060)
0,323 (0,052)
0,444 (0,086)
0,343 (0,048)
0,302 (0,028)
0,479 (0,040)
0,428 (0,157)
0,402 (0,077)
0,358 (0,103)
0,350 (0,017)
0,410 (0,094)
0,444 (0,021)
0,387 (0,051)
0,505 (0,491)
0,367 (0,130)
0,426 (0,085)
0,433 (0,107)
0,369 (0,076)
0,458 (0,145)
1
0,430 (0,015)
0,402 (0,127)
0,350 (0,036)
0,464 (0,129)
0,362 (0,032)
0,701 (0,077)
0,703 (0,108)
0,611 (0,152)
0,581 (0,045)
0,672 (0,098)
0,189 (0,039)
0,371 (0,078)
0,387 (0,052)
0,325 (0,046)
0,462 (0,024)
0,734 (0,171)
0,837 (0,152)
0,756 (0,078)
0,477 (0,069)
0,312 (0,051)
PDI (±S.D.)
Tiempo (días)
7
0,633 (0,036)
0,588 (0,141)
0,493 (0,125)
0,674 (0,040)
0,605 (0,131)
0,472 (0,074)
0,557 (0,096)
0,486 (0,033)
0,606 (0,053)
0,525 (0,061)
0,433 (0,031)
0,572 (0,061)
0,492 (0,099)
0,560 (0,019)
0,647 (0,007)
0,649 (0,143)
0,589 (0,022)
0,546 (0,092)
0,536 (0,128)
0,608 (0,038)
15
0,714 (0,041)
0,715 (0,182)
0,531 (0,031)
0,576 (0,068)
0,638 (0,103)
0,539 (0,039)
0,470 (0,042)
0,522 (0,098)
0,677 (0,049)
0,695 (0,033)
0,631 (0,048)
0,465 (0,030)
0,585 (0,013)
0,630 (0,042)
0,461 (0,257)
0,386 (0,049)
0,475 (0,019)
0,398 (0,050)
0,313 (0,187)
0,640 (0,077)
30
0,681 (0,054)
0,606 (0,016)
0,535 (0,042)
0,591 (0,050)
0,497 (0,058)
0,625 (0,015)
0,596 (0,064)
0,445 (0,117)
0,333 (0,195)
0,492 (0,025)
0,617 (0,041)
0,548 (0,094)
0,673 (0,052)
0,508 (0,024)
0,644 (0,077)
0,370 (0,030)
0,337 (0,037)
0,337 (0,037)
0,514 (0,033)
0,705 (0,047)
La Tabla IV. 1. 4 resume los resultados de Z-pot obtenidos a partir de soluciones
de las TSC1-4 de concentraciones entre 7,5 y 75,0µM en agua:DMSO (98:2). Todas
las muestras evidenciaron una superficie cargada negativamente, con valores
entre de Z-pot entre -8,68 y -16,53 mV a día 0. Dichos valores no son
suficientemente negativos para estabilizar el sistema coloidal por repulsión de
cargas entre las nanopartículas. Debido a esto se esperó que las nanopartículas
tiendan a aglomerarse a medida que avanzó el estudio. Para estudiar el efecto del
medio acuoso, se evaluó el Z-pot de nanopartículas de TSC3 obtenidas en agua
ultra-pura 100%, resultando un valor de -10 mV. Este resultado indicó que el
cambio de medio no alteró los valores hallados para este parámetro de manera
relevante. A medida que los tamaños de las nanopartículas se incrementaron, los
valores de Z-pot se tornaron más negativos. El aumento de concentración siguió
una tendencia similar. Estos resultados indicaron que a medida que aumentó el
tamaño de partícula, aumentó la electronegatividad superficial y sugirieron un reacomodamiento electrónico a nivel superficial.
110
Tabla IV. 1. 4. Potencial zeta (Z-pot) de agregados de las TSC1-4 (7,5-75,0µM) en
agua:DMSO (98:2), medidos por DLS durante 30 días. Los resultados se expresan como el
valor promedio de 4 determinaciones ± S.D.
TSC
TSC1
TSC2
TSC3
TSC4
TSC
(µM)
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
7,5
15,0
22,6
37,5
75,0
0
-16,53 (2,77)
-17,03 (3,19)
-12,57 (4,10)
-15,40 (0,28)
-12,36 (9,67)
-8,68 (1,53)
-11,76 (4,73)
-7,75 (0,18)
-11,85 (1,20)
-11,90 (2,55)
-15,13 (4,90)
-23,95 (4,45)
-12,57 (1,20)
-4,21 (1,61)
-9,47 (2,71)
-12,10 (2,83)
-10,79 (2,14)
-5,64 (2,51)
-5,74 (0,04)
-9,94 (4,33)
Z-pot (mV) (±S.D.)
Tiempo (días)
1
7
15
-16,00 (2,12)
-7,50 (2,80)
-11,21 (2,81)
-14,05 (2,76)
-7,24 (0,33)
-16,55 (0,21)
-14,50 (3,39)
-5,66 (0,48)
-11,40 (0,57)
-15,30 (7,07) -11,32 (5,00) -13,75 (0,07)
-11,00 (1,41) -15,10 (0,20) -15,03 (1,81)
-10,35 (0,21) -10,70 (0,71) -14,35 (0,49)
-15,50 (1,70)
-8,25 (0,35)
-15,35 (1,06)
-13,55 (3,32)
-6,84 (0,44)
-7,67 (0,81)
-9,51(1,12)
-9,12 (0,71)
-12,25 (0,35)
-7,17 (0,01)
-13,37 (0,65)
-9,15 (0,51)
-24,55 (3,32) -19,95 (5,02) -20,35 (7,99)
-21,95 (6,58) -19,43 (3,29) -12,55 (2,47)
-20,75 (2,47) -10,48 (0,31) -28,97 (2,89)
-24,90 (1,61) -16,67 (1,07) -19,70 (3,65)
- 9,33 (3,25)
-18,07 (1,62) -19,67 (3,59)
-9,35 (0,69)
-12,35 (1,48) -12,50 (1,13)
-11,05 (0,64) -11,65 (0,35) -11,05 (0,21)
-11,65 (0,35) -11,85 (0,35) -12,25 (0,07)
-9,20 (0,11)
- 9,09 (0,01)
- 9,35 (1,07)
-7,57 (4,72)
-16,87 (3,23) -23,80 (1,74)
30
-16,65 (3,61)
-19,00 (2,83)
-12,80 (0,99)
-20,65 (0,49)
-16,97 (3,02)
-13,85 (0,07)
-17,15 (0,21)
-15,25 (0,07)
-14,80 (0,28)
-12,10 (2,43)
-10,53 (0,64)
-6,29 (1,58)
-11,70 (0,57)
-12,10 (2,55)
-16,58 (1,65)
-15,30 (3,39)
-12,40 (0,85)
-12,35 (0,64)
-10,60 (0,28)
-19,33 (1,96)
Para estudiar la morfología de los agregados, muestras de TSC3 de diferente
concentración inicial y a diferentes tiempos fueron analizadas por TEM. Esta
técnica es ampliamente utilizada para la visualización de la morfología de
nanoestructuturas como micelas, nanopartículas, nanoagregados, liposomas, entre
otras. La Figura IV. 1. 8A muestra las imágenes TEM de nanoagregados esféricos
de soluciones de la TSC3 en medio agua:DMSO (98:2). Es importante destacar
nuevamente que estos agregados, invisibles al ojo humano, alcanzaron tamaños de
hasta 1 µm a día 30 (Figura IV. 1. 8B). Este fenómeno es crucial en los ensayos
biológicos, debido a que sólo moléculas en solución podrán llegar a demostrar
eventualmente actividad biológica.
111
A
B
C
Figura IV. 1. 8. Micrografías TEM de nano y microagregados de una solución 7,5µM de
TSC3 en agua:DMSO (98:2) (A,B): (A) día 0 y (B) día 30. Barra de escala = 100 nm. (C)
solución 150µM de TSC3 en el mismo solvente a día 0. Barra de escala = 10 µm.
Si bien la morfología de los agregados fue inicialmente esférica, sugiriendo la
formación de estructuras del tipo micelas, como ha sido descripto para otros
fármacos anfifílicos, ensayos empleando el método del anillo mostraron que estos
compuestos no disminuyeron la TS del solvente a medida que aumentó la
Tensión superficial (mN/m)
concentración (Figura IV. 1. 9).
90
85
80
75
70
65
60
55
50
0
10
20
30
40
50
Concentración de TSC3 (µg/mL) en agua:DMSO (98:2)
Figura IV. 1. 9. Tensión Superficial (mN/m) por el método del anillo de Du-Noüy en
función de la concentración de la TSC3.
Estos resultados indicaron que los agregados formados por TSCs no son estructuras
del tipo micelares, ya que las micelas deberían provocar la caída de TS por encima
de la concentración micelar crítica.
112
IV. 2. COMPLEJACIÓN DE TIOSEMICARBAZONAS CON CICLODEXTRINAS NATIVAS Y
QUÍMICAMENTE MODIFICADAS
Artículo
científico
II.
Novel
1-indanone
thiosemicarbazone
antiviral
candidates: Aqueous solubilization and physical stabilization by means of
cyclodextrins.
Pharmaceutical
Research,
Octubre
2011,
1-17;
DOI:10.1007/s11095-011-0599-y. Referencia 46 de la presente tesis doctoral.
El estudio de estrategias de nanotecnología farmacéutica para aumentar de
manera significativa la solubilidad de las TSC1-4 en medio acuoso y prevenir su
autoagregación mediante la estabilización física en solución fue de especial
interés en la presente tesis doctoral. En esta sección se presentarán y discutirán
los resultados de los estudios de complejación de las diferentes TSCs con CDs
nativas y químicamente modificadas como aproximación para mantener estas
moléculas en solución y facilitar los ensayos biológicos in vitro.
IV. 2. 1. Estudio de la solubilización de las TSCs en medio acuoso mediante el
uso de CDs
Para investigar el efecto del tamaño de la cavidad de las diferentes CDs sobre la
capacidad de solubilización de las TSCs y optimizar la eficiencia del proceso, se
emplearon CDs con diferentes tamaños de cavidad (Tabla I. 1). Los tamaños
estimados para α-CD, β-CD y γ-CD son aproximadamente 5, 6 y 8 Å,
respectivamente. Estos valores corresponden a volúmenes de cavidad de 174, 262
y 427 Å3. En β-CD, un cinturón secundario formado por las uniones puente
hidrógeno intramoleculares resulta en una estructura cristalina rígida de baja
solubilidad en agua (~1,85% p/v) [48]. Además, es bien sabido que β-CD puede
formar complejos insolubles con el colesterol resultando en colapso cardiovascular
y/o nefrotoxicidad. Por este motivo, se reemplazó la β-CD por derivados
modificados químicamente que mantienen el tamaño de la cavidad pero que son
altamente solubles en agua como HPβ-CD y Mβ-CD. Además, estos derivados son
menos citotóxicos y más versátiles para conducir estudios de complejación
exhaustivos, debido a su mayor solubilidad acuosa [121].
A) Estudios de solubilidad de fases: La estequiometría de los diferentes
complejos TSC/CD fue obtenida de los diagramas de solubilidad de fases [122] que
113
se construyeron graficando la concentración de TSC (M) en función de la
concentración de CD (M). Estos diagramas indicaron la formación de sistemas del
tipo A (Figuras IV. 2. 1), según Higuchi y Connors [53], donde el incremento
gradual de la concentración de CD resultó en un incremento gradual de la
solubilidad del fármaco complejado (ver Capítulo I. 2. 4). Asimismo, relaciones
estrictamente lineales indicaron gráficos del tipo AL (R2 = 0,9354–0,9984). En estos
casos, la relación sustancia:complejante resultó ser 1:1. Frecuentemente, gráficos
del tipo AL muestran una meseta o plateau en donde no se produce un aumento de
la concentración de la sustancia complejada al aumentar la de complejante [122].
Debido que para estos sistemas no se observó dicha meseta, las concentraciones
máximas de CDs empleadas en el estudio estuvieron determinadas por la
solubilidad máxima de cada una de ellas en agua y por la viscosidad del sistema.
La mayoría de los sistemas de TSC1-3/CDs mostró perfiles lineales dentro de todo
el rango de concentraciones de trabajo (AL) o lineales a bajas concentraciones de
CD, con una desviación negativa (AN) a mayores concentraciones. Estos resultados
indicaron que la formación de los complejos comprometió una molécula de TSC
por cada molécula de CD. A pesar de esto, en el caso de diagramas de solubilidad
lineales con una pendiente menor a la unidad, no se puede excluir la formación de
complejos de órdenes mayores (ver Capítulo I. 2. 4). Sin embargo, en ausencia de
datos adicionales, se asume la formación de complejos 1:1 [41].
Para los complejos de TSC4 fueron observadas curvas positivas (tipo Ap), donde la
solubilidad de TSC se vió incrementada de manera no lineal a partir de una
concentración de CD determinada (por ejemplo 15% para Mβ-CD y 45% para HPβCD) (Tabla IV. 2. 1, Figura IV. 2. 1D,H).
114
Tabla IV. 2. 1. Constantes de estabilidad aparente (K1:1), eficiencia de complejación (EC),
y factores de solubilidad (F3% y FMax) de complejos TSC/CD.
Tipo de
F3% (±S.D.)
Fmax (±S.D.)
diagrama
solubilidad
0,0127
0,9971 12,866 202,9
ANc
3,7 (0,1)
21,6 (2,6)
HPβ-CD
TSC1
0,0239
0,9941 24,487 386,2
ANc
11,2 (0,7)
96,4 (3,5)
Mβ-CD
0,0035
0,9896
3,513
55,4
AL
3,0 (1,5)
10,9 (1,6)
γ-CD
0,0032
0,9892
3,211
253,0
AL
9,7 (0,9)
107,1 (20,0)
HPβ-CD
TSC2
0,0055
0,9937
5,530
435,8
AL
21,7 (4,0)
207,4 (4,3)
Mβ-CD
0,0012
0,9354
1,202
94,7
AL
9,0 (3,6)
24,3 (8,8)
γ-CD
0,0029
0,9998
2,910
514,2
ANc
11,5 (8,1)
35,8 (9,8)
α-CD
0,0007
0,9848
0,701
123,8
AL
10,1 (3,3)
64,8 (0,2)
HPβ-CD
TSC3
0,0024
0,9984
2,406
425,0
AL
14,6 (2,4)
203,9 (12,5)
Mβ-CD
0,0011
0,9944
1,101
194,6
AL
4,4 (2,0)
41,5 (8,7)
γ-CD
0,0010
0,9775
1,001
176,9
AL
13,7 (2,2)
41,8 (7,5)
HPγ-CD
0,0014
0,9934
1,402
186,2
Apc
7,1 (1,3)
122,2 (20,8)
HPβ-CD
TSC4
0,0010
0,9899
1,001
133,0
Apc
3,7 (0,9)
215,3 (18,2)
Mβ-CD
0,0011
0,9713
1,101
146,3
AL
4,8 (1,2)
26,1 (2,7)
γ-CD
a
m: Pendiente, tomada de la porción lineal de los diagramas de solubilidad de fases. bSolubilidad
intrínseca en agua ultrapura: TSC1 = 6,341 10-05 M; TSC2 = 1,269 10-05 M; TSC3 = 5,660 10-06 M; TSC4
= 7,528 10-6 M [28]. cK1:1 fue calculada a partir de la porción lineal de los diagramas de solubilidad
de fases [41].
TSC
CD
ma
R2
EC
(10-3)
K1:1
(M-1)b
Este comportamiento se podría deber a dos causas. Por un lado, se asume la
formación de complejos con estequiometría 1:1 en la porción lineal del diagrama
(cuando las concentraciones de CD son bajas), aunque no se puede descartar la
formación de una cantidad limitada de complejos de inclusión del tipo 1:2 a
mayores concentraciones de CD. Estas observaciones serían consistentes con la
habilidad de la TSC4 de ser alojada en la cavidad de la CD a través de sus dos
porciones: (i) la porción aromática común a todas las TSCs estudiadas y (ii) la
cadena lateral N4-alilo que también presenta carácter hidrofóbico. En este
contexto, el resto alilo parecería jugar un rol de gran importancia, ya que
complejos de TSC no sustituidas en la posición N4 no desplegaron este tipo de
comportamiento en todo el rango de concentraciones de trabajo. Por otro lado,
también podrían formarse complejos de no-inclusión a través de la interacción de
la TSC con la superficie de las CDs a altas concentraciones. Los datos obtenidos
sugerirían que los complejos de TSC4 con β-CD químicamente modificadas no
formarían este tipo de complejos.
De manera contraria, los complejos TSC1/Mβ-CD, TSC1/HPβ-CD y TSC3/α-CD
mostraron una desviación negativa de la linealidad, indicando patrones de tipo AN
(Tabla IV. 2. 1, Figura IV. 2. 1. A,E,N).
115
Es importante mencionar que a pesar de que los complejos formados resultaron de
tipo 1:1, la relación molar en los sistemas no fue 1:1. Este comportamiento es
evidente a partir de los diagramas de solubilidad de fases, donde son necesarias
grandes cantidades de CD (en moles por litro) para complejar pequeñas
cantidades molares de TSCs (Figuras IV. 2. 1). Esto indicó la presencia de
moléculas de CD libres en solución. Debido a que el proceso de formación del
complejo es dinámico y que el complejo se encuentra en equilibrio con TSC y CD
libres, el exceso de CD podría ser necesario para forzar la entrada de las TSCs a la
cavidad. De esta forma, la autoagregación de moléculas de TSC podría verse
disminuida y en consecuencia mantenerse soluble por mayor tiempo.
116
B
0,007
0,007
Solubilidad TSC2 (M)
Solubilidad TSC1 (M)
A
2
R = 0,9941
0,006
0,006
0,005
0,005
0,004
0,004
0,003
0,003
0,002
0,002
0,001
0,001
0,000
0,000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Concentración Mβ
β-CD (M)
C
2
R = 0,9984
0,0016
0
0,0014
0,0012
0,0010
0,0008
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Concentración Mβ
β-CD (M)
D
Solubilidad TSC4 (M)
Solubilidad TSC3 (M)
0,0018
0,0018
R2 = 0,9899
0,0016
0,0014
0,0012
0,0010
0,0008
0,0006
0,0006
0,0004
0,0004
0,0002
0,0002
0,0000
0,0000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0
0,5
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Concentración Mβ
β-CD (M)
β-CD (M)
Concentración Mβ
E
F
0,0018
Solubilidad TSC2 (M)
Solubilidad TSC1 (M)
2
R = 0,9937
2
R = 0,9971
0,0016
0,0014
0,0012
0,0010
0,0008
0,0018
0,0014
0,0012
0,0010
0,0008
0,0006
0,0006
0,0004
0,0004
0,0002
0,0002
0,0000
2
R = 0,9892
0,0016
0,0000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Concentración HPβ
β-CD (M)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
Figura IV. 2. 1. Diagramas de solubilidad de fases de complejos de inclusión TSC/CD: (A)
TSC1/Mβ-CD, (B) TSC2/Mβ-CD, (C) TSC3/Mβ-CD, (D) TSC4/Mβ-CD, (E) TSC1/HPβ-CD, (F)
TSC2/HPβ-CD, (G) TSC3/HPβ-CD, (H) TSC4/HPβ-CD, (I) TSC1/γ-CD, (J) TSC2/γ-CD, (K)
TSC3/γ-CD, (L) TSC4/γ-CD, (M) TSC1/HPγ-CD y (N) TSC1/α-CD. La solubilidad de TSC (M)
se graficó en función de la concentración de CD (M). Los resultados se expresan como el
valor promedio de 3 determinaciones ± S.D.
117
0,5
Concentración HPβ
β-CD (M)
G
H
0,0012
Solubilidad TSC4 (M)
Solubilidad TSC3 (M)
0,0012
2
R = 0,9848
0,0010
0,0008
0,0006
0,0010
0,0008
0,0006
0,0004
0,0004
0,0002
0,0002
0,0000
0,0000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0
β-CD (M)
Concentración HPβ
0,1
0,2
0,3
J
0,0010
2
R = 0,9896
0,0008
0,0006
R2 = 0,9354
0,0008
0,0006
0,0004
0,0002
0,0002
0,0000
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0,2
0
Concentración γ-CD
(M)
γ
0,0004
0,04
0,08
0,12
L
2
R = 0,9944
0,0003
0,0002
0,0001
0,16
0,2
Concentración γ-CD (M)
Solubilidad TSC4 (M)
K
0,0004
R2 = 0,9713
0,0003
0,0002
0,0001
0,0000
0,0000
0
0,04
0,08
0,12
0,16
0,2
0
Concentración γ-CD (M)
M
0,04
0,08
0,12
Solubilidad TSC3 (M)
0,0004
R2 = 0,9775
0,0003
0,0002
0,16
0,2
Concentración γ-CD (M)
N
Solubilidad TSC1 (M)
0,5
0,0010
0,0004
0,0000
0,4
β-CD (M)
Concentración HPβ
Solubilidad TSC2 (M)
Solubilidad TSC1 (M )
I
Solubilidad TSC3 (M)
R2 = 0,9934
0,0004
R2 = 0,9998
0,0003
0,0002
0,0001
0,0001
0,0000
0,0000
0
0,05
0,1
0,15
0,2
Concentración HPγγ-CD (M)
Figura IV. 2. 1 (continuación)
118
0
0,05
0,1
0,15
0,2
Concentración α-CD (M)
Como fuera descripto anteriormente, los complejos fármaco/TSC en solución son
sistemas dinámicos donde la molécula complejada interactúa con la cavidad y la
superficie de la CD, formando complejos de inclusión y de no-inclusión [58]. Estos
complejos son caracterizados por la constante de estabilidad aparente, K1:1
[43,53]. La Tabla IV. 2. 1 presenta los datos de K1:1, EC y factores de solubilidad
en sistemas de CD 3% (F3%) y de concentración máxima (Fmax). Generalmente,
cuando la complejación es adecuada, los valores de K1:1 se encuentran en el rango
entre 50 y 2000M-1 (ver Capítulo I. 2. 4) [41,54]. Valores menores de 50M-1 indican
la formación de complejos de inclusión débiles y están asociadas con valores bajos
de EC. De forma contraria, valores mayores de 2000M-1 indican la formación de
complejos con interacciones extremadamente fuertes, que limitan la liberación de
la sustancia desde la cavidad, disminuyendo su biodisponibilidad [55].
Los valores de K1:1 se calcularon de acuerdo a la ecuación 1 y en general
estuvieron dentro del rango entre 50-2000M-1 (Tabla IV. 2. 1). En el caso de
sistemas que presentaron diagramas del tipo Ap y AN, las constantes K1:1 fueron
calculadas con la misma ecuación a partir de la porción lineal de la recta. El
cálculo de las constantes K1:2 no fue objeto de estudio.
Para comparar la capacidad de solubilización de las CDs a una concentración fija y
la capacidad de solubilización máxima, se calcularon dos parámetros adicionales
(F3% y Fmax) (Tabla IV. 2. 1). Los resultados sugirieron que Mβ-CD desplegó la
mayor capacidad de solubilización seguida por HPβ-CD. Este comportamiento fue
consistente con todas las TSC. Por ejemplo, los valores de F3% y Fmax para la TSC3
en Mβ-CD fueron 14,6 y 203,9, respectivamente (Tabla IV. 2. 1); la concentración
máxima de Mβ-CD en agua fue 60% p/v. Esto implicó un aumento de la solubilidad
de 1,5 a 305,9 µg/ml. Es importante destacar que estas β-CDs químicamente
modificadas muestran la mayor solubilidad intrínseca en agua. Por el contrario, la
solubilidad en agua de las CDs nativas α-CD y γ-CD es de aproximadamente 14 y
23% p/v, respectivamente (Tabla I.1). Así, cuando se compararon concentraciones
idénticas en sistemas con diagramas de tipo AL, derivados modificados de β-CD
siempre mostraron el mejor rendimiento (ver F3%, Tabla IV. 2. 1), mientras que γCD
fue la de
menor
capacidad
de
complejación,
formando complejos
relativamente débiles. Por ejemplo, los valores de K1:1 de los complejos TSC1/γ-CD
y TSC2/γ-CD fueron 55,4 y 94,7M-1, respectivamente. Estos valores fueron
cercanos al límite inferior antes definido de 50M-1. La incorporación de un grupo
119
funcional –OCH3 en el anillo aromático de la TSC1 para obtener la TSC2 y el
aumento resultante del tamaño de la porción hidrofóbica de la molécula mejoró la
asociación de la TSC con γ-CD y HPγ-CD y resultó en el aumento de K1:1 (Tabla IV.
2. 1).
A su vez, α-CD dio lugar a la solubilización de la TSC3 en un nivel intermedio.
Estos resultados sugirieron que el tamaño del anillo aromático hidrofóbico de la 1indanona se ajusta mejor al tamaño de la cavidad de β-CD que al de las otras dos
CDs. Mientras α-CD probablemente posea una cavidad demasiado pequeña para
incorporar eficientemente la molécula de TSC, γ-CD posee una cavidad demasiado
grande que no permite la generación de interacciones suficientemente fuertes con
las moléculas de TSCs. Esto provoca la rápida liberación de la TSC desde la
cavidad hacia el medio acuoso (Tabla IV. 2. 1). Esta hipótesis es sustentada por el
hecho de que los complejos de TSC3 con γ-CD y HPγ-CD (dos CDs con diámetro
idéntico de cavidad, pero diferente solubilidad acuosa máxima) mostraron EC y
valores de K1:1 y Fmax similares, independientemente que los perfiles de solubilidad
fueron diferentes (Tabla IV. 2. 1). Es interesante destacar que mientras que la
mayor pendiente (0,0239) y los mayores valores de EC (24,487 x 10-3)
correspondieron al complejo TSC1/Mβ-CD, seguido por TSC1/HPβ-CD (0,0127 y
12,866 x 10-3, respectivamente), estos complejos no desplegaron los valores más
altos de K1:1 ni los mayores incrementos en la solubilidad de la TSC (expresados
como Fmax, Tabla IV. 2. 1). Este fenómeno se debe a diferentes razones. Por un
lado, TSC1 muestra la mayor solubilidad acuosa intrínseca y los valores F se
calculan como una relación entre la solubilidad en el sistema con CD y la
solubilidad intrínseca. Por otro lado, y el de mayor relevancia, es que los
diagramas de solubilidad de fases (curvas tipo AN) de estos complejos muestran
una desviación negativa de la linealidad en función de la concentración de Mβ-CD
y HPβ-CD (aproximadamente por encima de 3% p/v). Perfiles del tipo AN pueden
estar asociados tanto a la autoagregación de Mβ-CD (CAC = 11%) y HPβ-CD (CAC =
3%) a altas concentraciones como a la alteración del carácter efectivo del
solvente en presencia de una concentración de CDs extremadamente alta
[41,112] (ver determinación de CAC más abajo, Capítulo IV. 2. 2).
Es importante señalar que los valores más altos de K1:1 se obtuvieron para los
complejos TSC3/α-CD (514,2 M-1), TSC2/Mβ-CD (435,8 M-1) y TSC3/Mβ-CD (425,0
M-1), los cuales fueron acompañados por valores de F3% y Fmax relativamente altos
120
(excepto para el valor Fmax de TSC3/α-CD) (Tabla IV. 2. 1). La razón de esta
excepción fue que TSC3/α-CD mostró un perfil de solubilidad AN, donde a mayores
concentraciones de CD existe una menor eficiencia de solubilización.
Como se demostrará en la sección siguiente, a bajas concentraciones, α-CD
desplegó una tendencia elevada a la autoagregación (CAC = 0,63%) que afectó
negativamente la eficiencia de solubilización de TSC3. Por el contrario, TSC4/MβCD mostró el valor más alto de Fmax de todos los complejos estudiados (215,3),
mientras que los valores de K1:1 y EC se mantuvieron relativamente bajos. Esto se
debió a que el comportamiento de solubilidad de fases resultó ser de tipo Ap. Es
decir, esta CD fue más eficiente para solubilizar TSC4 a mayores concentraciones.
Finalmente, es importante remarcar que K1:1 no es el único parámetro para
establecer el papel desempeñado por el tamaño de la cavidad en la formación de
complejos de inclusión y que se debe abordar un análisis exhaustivo de todos los
parámetros.
La presencia de residuos de solventes orgánicos empleados en la preparación de
los complejos podría resultar en efectos citotóxicos durante la evaluación
biológica de los complejos TSC/CD en cultivos celulares. Para asegurar la
completa eliminación de los mismos en la etapa de rotaevaporación, las muestras
fueron analizadas por GC (ver Capítulo III. 2. 2). La concentración de todos los
residuos expresados como MeOH residual fue menor a 100 ppm, siendo la
concentración máxima permitida por la Farmacopea Europea de 3000 ppm [123].
La Tabla IV. 2. 1, réune los datos de constantes de estabilidad aparente,
eficiencia de complejación y factores de solubilidad logrados entre las CDs y las
TSC1-4 de interés.
IV. 2. 2. Caracterización de los complejos TSC/CD y estudio de la interacción
fármaco/complejante
A) Autoagregación de CDs libres de TSC: La autoagregación de CDs en agua es un
fenómeno bien conocido y reportado en la literatura [54,124-128]. La
importancia de este comportamiento radica en que la respuesta biológica puede
verse alterada en fármacos complejados que resultan agregados a través de la
propia agregación de las CDs. Por esta razón, las propiedades de agregación de las
diferentes CDs libres (sin TSC) se caracterizaron antes del estudio de la agregación
de los complejos TSC/CD. DLS es una técnica sencilla para la determinación de la
121
CAC [128]. En la Tabla IV. 2. 2 se reúnen los datos de CAC para las CDs de
estudio. β-CD mostró el menor valor de CAC (1,87mM), consistente con su baja
solubilidad acuosa. α-CD y γ-CD son CDs más solubles. Así, sus valores de CAC
resultaron ser más elevados, 6,43 y 12,00mM, respectivamente. Luego, las
modificaciones químicas en β-CD y γ-CD resultaron en derivados aún más solubles
en medio acuoso, con lo que la CAC fue aún mayor: 21,43mM para HPβ-CD;
57,20mM para HPγ-CD y 85,00mM para Mβ-CD.
Tabla IV. 2. 2. Concentración de agregación crítica (CAC) en agua Milli-Q y Dh de
agregados de CDs nativas y modificadas medidos por DLS, a 25ºC. Los resultados se
expresan como el valor promedio de 4 determinaciones ± S.D.
CAC
CD
Dh
Pico 1
mM
Pico 2
% (p/v)
Dh
Población
(nm) (±S.D.) (%) (±S.D.)
6,43
0,63
188,6 (11,7)
100,0 (0,0)
α-CD
1,87
0,21
172,0 (43,9)
100,0 (0,0)
β-CD
12,00
1,55
230,7 (20,3)
100,0 (0,0)
γ-CD
3,00
180,9 (4,5)
88,8 (1,6)
HPβ
β-CD 21,43
85,00
11,00
282,6 (27,0)
84,8 (1,1)
Mβ
β-CD
9,00
158,1 (16,7)
87,6 (1,9)
HPγγ-CD 57,20
*Formas monoméricas de CD modificadas químicamente.
Dh
(nm) (±S.D.)
1,4* (0,3)
1,6* (0,0)
1,7* (0,1)
Población
(%) (±S.D.)
11,2 (1,6)
15,2 (1,1)
12,4 (1,9)
PDI (±S.D.)
0,627 (0,185)
0,200 (0,118)
0,103 (0,076)
0,457 (0,041)
0,678 (0,102)
0,339 (0,038)
El tamaño y la distribución de tamaños de los agregados de cada CD libre también
fueron caracterizados ya que los mismos podrían afectar la capacidad de atravesar
membranas biológicas y el proceso de absorción in vivo. En general, se observó
que CD nativas mostraron un comportamiento unimodal con Dh en la CAC entre
172,0 y 230,7 nm (Tabla IV. 2. 2); cuanto menor fue la CAC (y menor la
solubilidad de la CD), menor el tamaño de los agregados. Las CDs modificadas
químicamente mostraron la presencia de dos poblaciones de distinto tamaño: (i)
una población de mayor proporción (84,8–88,8%) con tamaños entre 158,1–282,6
nm correspondiente a CDs agregadas (Tabla IV. 2. 2, pico 1) y (ii) una población
de menor proporción (11,2–15,2%) de CDs no agregadas o formas monoméricas de
tamaños entre 1,4 y 1,7 nm (Tabla IV. 2. 2, pico 2). Estos resultados confirmaron
que a pesar de poseer grupos funcionales que impedirían la formación de puentes
hidrógenos intramoleculares presentes en β-CD nativa (aumentando la solubilidad
acuosa), las CDs químicamente modificadas también se agregaron. No obstante, la
122
agregación ocurrió en menor proporción. Cabe mencionar, que la contribución del
tamaño de la cavidad al tamaño de los agregados formados no pareció ser
significativa.
Estudios preliminares de actividad antiviral frente VDVB sugirieron que la TSC3 es
la más efectiva [22,23, Capítulo I. 1. 2]. Por lo tanto, TSC3 fue el compuesto
seleccionado para evaluar con mayor profundidad la actividad frente al VHC. Por
ello, los estudios de caracterización fueron más extensos para los complejos de
este compuesto. Esto permitió seleccionar el complejo más apropiado para el
desarrollo de los ensayos biológicos.
B) Autoagregación de complejos de inclusión TSC/CD: Luego de determinar la
CAC y el tamaño de las CDs libres, se procedió a caracterizar los fenómenos de
agregación de los complejos TSC/CD.
Los complejos de CDs no modificadas presentaron una única población de tamaño
entre 199–830 nm (Tabla IV. 2. 3). Este comportamiento fue independiente del
tipo de CD. Generalmente, a mayor concentración de CD en el sistema, mayor el
tamaño de estructura formado (Tabla IV. 2. 3). Estos resultados estuvieron de
acuerdo con estudios previos [54].
Por el contrario, los complejos de CDs químicamente modificadas mostraron una
población de tamaño entre 1,4–2,5 nm correspondiente a las formas monoméricas
de CDs y que constituyeron hasta un 48% del total (Tabla IV. 2. 3). Este
comportamiento fue similar al de las CDs libres. Asimismo, la población que
correspondió a complejos agregados mostró tamaños similares a los de la CD libre
correspondiente (Tabla IV. 2. 3). Por ejemplo, complejos de TSC1-4 con HPβ-CD
al 3% p/v (CAC), mostraron tamaños que oscilaron entre 121,2-194,6 nm, mientras
que los agregados de HPβ-CD (sin TSC) fueron de 180,9 nm. Es importante
mencionar que los agregados de complejos TSC/CD aumentaron de tamaño tanto
en relación a la concentración de TSC y CD en el complejo, como a la
hidrofobicidad y tendencia de agregación de la TSC. Es así que complejos de la
TSC4 con HPβ-CD alcanzaron tamaños de hasta 2 µm. Este comportamiento fue el
esperado ya que la molécula de TSC favorecería la autoagregación del complejo
[54].
Un perfil de agregación interesante se observó para los complejos de TSC3/HPβCD ya que los mismos aumentaron de tamaño como consecuencia del aumento de
la concentración de CD y de la carga de TSC; el Dh aumentó de 152,4-191,9 nm a
123
250,8 nm para las concentraciones de CD que crecieron de 0,5 a 30%. El tamaño
de los complejos con concentración de HPβ-CD de 60% no pudo ser determinado
debido a la elevada viscosidad (1,4718 cP a 25° C) y la fuerte agregación que
resultó en valores de PDI > 0,7.
Tabla IV. 2. 3. Diámetro hidrodinámico (Dh) de complejos de inclusión TSC/CD con CDs
nativas y modificadas, a día 0, medidas por DLS. Los resultados son expresados como el
valor promedio de 4 determinaciones ± S.D.
Pico 1
TSC
CD
HPβ
β-CD
TSC1
Mβ
β-CD
γ-CD
HPβ
β-CD
TSC2
Mβ
β-CD
γ-CD
α-CD
TSC3
HPβ
β-CD
CD %
(p/v)
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
7,5
15,0
22,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
7,5
15,0
22,0
0,5
1,5
3,0
7,5
10,0
14,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
Dh
(nm) (±S.D.)
163,7 (2,7)
154,4 (1,2)
149,3 (1,5)
255,8 (1,0)
390,5 (3,8)
195,2 (3,3)
268,9 (9,9)
220,3 (5,7)
420,5 (54,6)
494,6 (89,3)
199,6 (21,1)
272,2 (14,6)
769,7 (139,6)
296,8 (8,2)
648,7 (22,3)
830,0 (10,9)
152,5 (12,9)
121,2 (5,4)
126,0 (2,4)
215,2 (5,2)
357,3 (3,2)
203,9 (2,2)
183,9 (2,3)
181,9 (6,4)
332,7 (11,2)
483,2 (33,5)
248,0 (9,5)
234,1 (3,2)
268,6 (5,1)
261,2 (13,7)
502,3 (23,1)
*
309,6 (13,1)
395,4 (23,0)
471,4 (31,9)
473,0 (29,6)
897,6 (180,1)
736,4 (12,7)
152,4 (19,1)
153,5 (1,5)
176,9 (13,7)
191,9 (7,5)
250,8 (26,3)
Pico 2
Población
(%) (±S.D.)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
91,5 (1,0)
89,2 (0,4)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
93,5 (0,3)
91,4 (0,7)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
92,5 (0,1)
85,7 (0,5)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
90,8 (1,1)
100,0 (0,0)
57,9 (4,2)
59,7 (0,1)
52,3 (4,3)
124
Dh
(nm) (±S.D.)
2,0 (0,1)
2,5 (0,1)
1,8 (0,1)
1,8 (0,1)
2,1 (0,1)
2,3 (0,1)
1,4 (0,4)
2,0 (0,0)
2,0 (0,0)
2,3 (0,1)
Población
(%) (±S.D.)
8,5 (1,0)
10,8 (0,4)
6,5 (0,3)
8,6 (0,7)
7,5 (0,1)
14,3 (0,5)
9,2 (1,1)
42,1 (4,2)
40,3 (0,1)
47,7 (4,3)
PDI (±S.D.)
0,266 (0,009)
0,181 (0,024)
0,161 (0,013)
0,127 (0,025)
0,119 (0,093)
0,058 (0,011)
0,086 (0,029)
0,088 (0,045)
0,363 (0,065)
0,532 (0,091)
0,234 (0,091)
0,297 (0,082)
0,198 (0,042)
0,128 (0,026)
0,074 (0,030)
0,089 (0,064)
0,296 (0,023)
0,398 (0,053)
0,088 (0,014)
0,119 (0,018)
0,248 (0,007)
0,316 (0,033)
0,055 (0,024)
0,091 (0,038)
0,389 (0,079)
0,567 (0,051)
0,182 (0,028)
0,236 (0,020)
0,204 (0,005)
0,227 (0,013)
0,224 (0,018)
> 0,700
0,368 (0,082)
0,344 (0,040)
0,264 (0,015)
0,312 (0,032)
0,205 (0,013)
0,175 (0,044)
0,380 (0,013)
0,171 (0,006)
0,333 (0,116)
0,871 (0,012)
0,354 (0,031)
Tabla IV. 2. 3.
(continuación)
Mβ
β-CD
TSC3
γ-CD
HPγγ-CD
HPβ
β-CD
TSC4
Mβ
β-CD
γ-CD
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
7,5
15,0
22,0
0,5
1,5
3,0
7,5
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
15,0
30,0
0,5
1,5
3,0
7,5
15,0
22,0
212,3 (7,9)
289,4 (12,9)
270,4 (10,3)
250,1 (57,2)
*
256,3 (20,6)
305,7 (49,8)
256,0 (10,8)
421,2 (23,1)
368,9 (44,4)
676,1 (60,9)
246,6 (11,9)
147,2 (10,5)
191,5 (12,9)
219,6 (15,9)
313,7 (13,3)
505,5 (47,6)
178,1 (37,6)
197,5 (2,6)
194,6 (8,1)
688,7 (30,3)
2213,3 (265,9)
150,9 (5,2)
197,7 (5,7)
194,7 (6,4)
468,7 (78,9)
*
204,6 (3,4)
448,0 (15,1)
269,9 (24,4)
419,0 (44,6)
347,4 (11,1)
627,3 (0,6)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
67,3 (3,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
70,9 (3,8)
100,0 (0,0
100,0 (0,0
100,0 (0.0)
88,6 (0,9)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
1,9 (0,0)
291,9(23,1)
1,7 (0,1)
-
32,7 (3,0)
29,1 (3,8)
11,4 (0,9)
-
0,027 (0,031)
0,122 (0,038)
0,192 (0,026)
0,420 (0,011)
> 0,700
0,193 (0,147)
0,227 (0,004)
0,137 (0,024)
0,226 (0,014)
0,267 (0,017)
0,088 (0,062)
0,346 (0,029)
0,295 (0,045)
0,176 (0,043)
0,260 (0,014)
0,206 (0,012)
0,435 (0,072)
0,232 (0,071)
0,080 (0,026)
0,087 (0,033)
0,158 (0,031)
0,542 (0,057)
0,044 (0,032)
0,074 (0,015)
0,063 (0,021)
0,410 (0,035)
> 0,700
0,122 (0,024)
0,313 (0,111)
0,227 (0,046)
0,321 (0,106)
0,242 (0,145)
0,086 (0,083)
*Agregación.
El tamaño promedio y la distribución de tamaños, así como también un esquema
del posible mecanismo de agregación para un sistema TSC3/Mβ-CD con
concentración de CD de 15% p/v se representan en la Figura IV. 2. 2. En líneas
generales, los complejos TSC/Mβ-CD desplegaron mayores tamaños que los de
HPβ-CD, que a concentraciones del 30%, alcanzaron tamaños de aproximadamente
500 nm, a día 0.
125
Size Distribution by Intensity
Complejo TSC3/Mβ-CD
15
100
H 2N
S
HN
N
80
H 2N
S
N
10
H3 CO
Forma monomérica
OCH 3 O
H3CO O OCH
3
OCH3
O
OCH3
O
OCH3
OCH3
O
H3CO
H3CO
H CO
OH3CO 3
H3CO
O
O HO3CO H CO
O
3
O
OCH3 O
H3CO O OCH
3
OCH3
O O
OCH3
OCH 3
60
OCH3
40
U n d e r s iz e
I n t e n s it y ( % )
HN
5
20
0
1
10
100
0
10000
1000
Size (d.nm)
Tamaño
(nm)
Figura IV. 2. 2. Tamaño promedio y distribución de tamaños por intensidad (%) de un
complejo de inclusión TSC3/Mβ-CD (15% p/v) en agua, a día 0. Se representa el posible
mecanismo de agregación.
Los tamaños mayores fueron observados para los complejos de inclusión TSC/γ-CD
y TSC/α-CD, que además resultaron en soluciones opalescentes, incluso a día 0.
Por otro lado, el tamaño y la intensidad de la opalescencia de este tipo de
complejos se incrementaron notablemente en función del tiempo (Figura IV. 2.
3).
A
B
Size Distribution by Intensity
30
Size Distribution by Intensity
30
100
100
I n te n s it y ( % )
40
10
20
60
40
10
20
0
1
10
100
1000
U n d e r s iz e
60
80
U n d e r s iz e
I n te n s it y ( % )
80
20
20
0
10000
0
1
Size (d.nm)
Tamaño
(nm)
10
100
1000
0
10000
Size (d.nm)
Tamaño
(nm)
Figura IV. 2. 3. Distribución de tamaño por intensidad (%) de una solución de complejo de
inclusión TSC3/γ-CD por DLS. (A) Día 0 y (B) Día 7. Fotos incluidas: Intensidad de la
opalescencia versus tiempo de TSC3/γ-CD en agua. La concentración de γ-CD es 15% p/v.
126
La formación de sistemas opalescentes por complejos a base de γ-CD ha sido
reportada con anterioridad [126,127]. Mezclas de complejos huésped/γ-CD con
derivados modificados como HPγ-CD minimizan la aparición de opalescencia pero
no previenen completamente la autoagregación de dichos complejos en medio
acuoso [126,127].
Para completar el estudio de los fenómenos de agregación de los complejos en
condiciones similares a las del ensayo biológico, la estabilidad física del complejo
de mayor interés, TSC3/HPβ-CD, fue monitoreada en función del tiempo, a 37ºC.
Los resultados se presentan en la Tabla IV. 2. 4.
Tabla IV. 2. 4. Solubilidad y diámetro hidrodinámico (Dh) de TSC3/HPβ-CD durante 7 días,
a 37º C. Los resultados de DLS se expresan como el valor promedio de 4 determinaciones
± S.D.
Tamaño
HPβ
βCD
% (p/v)
0,5
1,5
3
15
30
Pico 1
Pico 2
Tiempo
(días)
Solubilidad
TSC3 (µM)
(±S.D.)
Dh (nm)
(±S.D.)
%
(±S.D.)
Dh (nm)
(±S.D.)
%
(±S.D.)
PDI
(±S.D.)
0
1
7
0
1
7
0
1
7
0
1
7
0
1
7
48,1 (3,8)
46,3 (1,0)
49,1 (0,5)
58,3 (0,7)
53,6 (0,0)
54,4 (0,2)
46,7 (0,2)
41,4 (0,5)
32,4 (0,2)
117,7 (13,8)
107,0 (1,7)
95,9 (4,0)
171,0 (1,8)
118,5 (0,2)
109,9 (4,2)
118,8 (13,2)
197,9 (7,8)
268,5 (44,8)
131,9 (3,8)
189,9 (11,9)
176,2 (22,5)
160,2 (5,3)
210,8 (11,1)
256,2 (3,7)
242,3 (38,5)
288,1 (64,5)
276,8 (57,2)
228,3 (21,4)
378,2 (15,3)
209,3 (51,1)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
100,0 (0,0)
80,9 (1,0)
64,5 (4,5)
43,8 (4,7)
38,6 (6,2)
66,2 (1,4)
40,8 (3,3)
1,9 (0,1)
1,9 (0,1)
1,8 (0,0)
2,0 (0,1)
2,0 (0,1)
1,9 (0,1)
19,1 (1,0)
35,5 (4,5)
56,2 (4,7)
61,4 (6,2)
33,8 (1,4)
59,2 (3,3)
0,852 (0,086)
0,819 (0,050)
0,808 (0,067)
0,293 (0,028)
0,263 (0,086)
0,512 (0,013)
0,362 (0,151)
0,161 (0,046)
0,232 (0,194)
0,607 (0,143)
0,415 (0,161)
0,453 (0,080)
0,784 (0,088)
0,883 (0,042)
0,812 (0,197)
Para obtener información adicional sobre el rol desempeñado por ambos
componentes del complejo en el proceso de autoagregación se estudió el Z-pot;
este parámetro ha sido utilizado para determinar la densidad de carga superficial
de agregados de CDs [129,130]. Tanto las CDs y las TSCs libres como los
complejos de inclusión presentaron valores de Z-pot negativos. Los valores para
los complejos TSC3/HPβ-CD oscilaron entre -41,90 mV y -2,44 mV (60,0% p/v) para
concentraciones de CD de 0,5 y 60%, respectivamente, a día 0 (Figura IV. 2. 4,A).
Estos valores no se modificaron a los largo de 7 días. Además, este
127
comportamiento fue consistente para todo el rango de concentraciones de CD
estudiado, a excepción de 0,5% y 1,5% p/v que en el día 7, disminuyeron de -41,90
a -25,2 mV. Generalmente, cuanto menor fue el tamaño del complejo TSC3/HPβCD, más negativo el valor de Z-pot. Por ejemplo, un tamaño de 152,4 nm
correspondió a un Z-pot de -41,90 mV (TSC3/HPβ-CD 0,5%), mientras que un
tamaño de 250,8 nm a uno de -5,23 mV (TSC3/HPβ-CD 30,0%). CDs prístinas libres
de TSC siguieron una tendencia similar, con valores de -20,03 y -2,17 mV para
sistemas de concentración de CD de 0,5 y 60%, respectivamente.
Zeta-potential (mV)
TSC3/HPβ
β-CD(%
(%w/v)
p/v)
β-CD concentration
TSC3/HPβ
0
0,5
0.5
1,5
1.5
3
3.0
15
15.0
30
30.0
60
60.0
-5
-10
Z-pot -15
(mV)
-20
-25
-30
-35
-40
-45
Figura IV. 2. 4. Potencial zeta (Z-pot) representativo de complejos de inclusión
TSC3/HPβ-CD en función de concentraciones de HPβ-CD.
A pesar de que los valores fueron siempre negativos, el aumento de la
concentración de TSC y CD en el complejo provocó el aumento del Z-pot a valores
menos negativos y la fuerte desestabilización del sistema coloidal (Figura IV. 2.
4). Estos resultados estuvieron de acuerdo con investigaciones previas [130] y se
asociaron con la autoagregación de CDs y complejos TSC/CD (Tabla IV. 2. 3). Este
comportamiento demostraría el impacto de la concentración de la CD en el perfil
de agregación y su interacción con la célula, ya que la presencia de residuos de
ácido siálico confiere a la membrana celular una superficie de carácter
128
electronegativo. Por otra parte, valores de Z-pot menos negativos dieron lugar a
sistemas menos estables físicamente (ver más abajo, Capítulo IV. 2. 3).
La
morfología
de
los
complejos
de
inclusión
TSC/CD
fue
estudiada
exhaustivamente por distintas técnicas microscópicas. El estudio microscópico por
TEM para la visualización de los agregados droga/CD fue llevado a cabo por otros
grupos de investigación y los resultados no han sido siempre satisfactorios
[58,124,125]. Para la correcta observación de los agregados de CDs se ha
reportado la utilización de técnicas más complejas y costosas como el Cryo-TEM
[124]. A pesar de lo anteriormente expuesto, complejos de TSC3/HPβ-CD y
TSC3/γ-CD mostraron estructuras relativamente pequeñas (Dh = 90-500 nm) que se
encontraron incluidas dentro de supra-agregados esféricos u ovalados de tamaño
micrométrico (1-6 µm) (Figura IV. 2. 5).
A
B
C
D
Figura IV. 2. 5. Microfotografías TEM representativas de complejos de inclusión TSC3/CD
conteniendo: (A,B) HPβ-CD 15 % p/v, (C) γ-CD CAC (1,55 % p/v) y (D) γ-CD 15 % p/v. Barra
de escala: (A) 500 nm, (B) 600 nm, (C) 400 nm and (D) 150 nm. Las flechas en (C) indican
la presencia de nanocristales de TSC.
Estos resultados estuvieron de acuerdo con estudios previos que han demostrado
la aglomeración de vesículas esféricas de eugenol y β-CD o HPβ-CD (Dh = 200-300
nm) para formar estructuras de tamaño micrónico [131]. Además, las
129
microfotografías TEM de TSC3/HPβ-CD (15% CD) y TSC3/γ-CD (1,55% CD) revelaron
la presencia de estructuras nanoscópicas de aproximadamente 150 nm que fueron
compatibles con la cristalización de TSC libre en una etapa posterior al secado
(Figura IV. 2. 5,C ver las flechas).
La tinción negativa y el subsecuente secado de la muestra pudieron,
eventualmente, promover tanto la cristalización de la TSC como la aglomeración
de los agregados y debido a ello los tamaños visualizados por TEM fueron
sensiblemente mayores a los obtenidos por DLS (Figura IV. 2. 5) [57,124,125].
Con el objeto de estudiar la morfología de los complejos en condiciones donde la
agregación fuera menor, una muestra de complejo TSC3/HPβ-CD conteniendo 15%
de CD fue diluída 50 veces (a una concentración final de CD de 0,3%) y analizada
por AFM [131]. Así, se observaron estructuras con un diámetro aproximado de 20
nm y una altura de 50 nm (Figura IV. 2. 6). Es importante remarcar que la CAC de
HPβ-CD fue aproximadamente 3% p/v, una concentración 10 veces superior a la
ensayada por AFM. Por ello, la desagregación de los agregados de complejo frente
a la mayor dilución aparece como un mecanismo probable que explica porque los
tamaños medidos por AFM resultaron menores a los determinados por DLS.
50.43 nm
50.43 nm
A
B
19nm
0.00 nm
0.00 nm
Figura IV. 2. 6. Microfotografía AFM por el modo de contacto de un film de TSC3/HPβ-CD
(concentración final de CD 0,3 % p/v). (A) Imagen 2D TM-AFM. Barra de escala: 19 nm. (B)
Imagen 3D TM-AFM. Barra de escala: 95,7 nm.
La amorfización producida durante el proceso de liofilización ha sido ampliamente
investigada para diferentes sistemas [132]. SEM es una técnica capaz de
evidenciar cambios en la estructura del material que resultan de dicha pérdida de
130
la estructura cristalina. En este contexto, hemos investigado la morfología
superficial del complejo TSC3/HPβ-CD antes y después de la liofilización y la hemos
comparado con las propiedades de la CD y la TSC3 libres. Los resultados se
ejemplifican en la Figura IV. 2. 7.
B
A
C
D
Figura IV. 2. 7. Microfotografías SEM representativas de (A) TSC3 pura no liofilizada, y
productos liofilizados: (B) TSC3 (C) HPβ-CD y (D) TSC3/HPβ-CD. Barra de escala = 2 µm.
La TSC3 no liofilizada mostró cristales irregulares (Figura IV. 2. 7A).
Contrariamente a ello, luego de la liofilización, la TSC3 perdió su apariencia
cristalina y mostró una superficie uniforme consistente con una estructura amorfa
(Figura IV. 2. 7B). La integridad química del compuesto liofilizado fue confirmada
por 1H-NMR en DMSO-d6 (no mostrado). HPβ-CD y TSC3/HPβ-CD mostraron una
morfología sustancialmente distinta (Figura IV. 2. 7C,D) con una matriz formada
por la CD amorfizada que en el caso del complejo probablemente contiene a la
TSC dispersa a nivel molecular (Figura IV. 2. 7D).
De los resultados del análisis microscópico se concluye que si bien todas estas
técnicas son comúnmente empleadas para caracterizar fenómenos de agregación,
DLS resultó ser la más robusta ya que las muestras no demandaron un tratamiento
131
previo y se minimizaron los artefactos provenientes de la manipulación. Asimismo,
si bien AFM y SEM suelen ser utilizadas como técnicas complementarias de
caracterización, no constituyen herramientas útiles para confirmar la formación
del complejo de inclusión (ver abajo).
C) Cristalinidad de TSC en el complejo: Para estudiar las propiedades de las TSCs
en el complejo y establecer si las mismas se encuentran en estado cristalino o
dispersas a nivel molecular, todas las muestras fueron analizadas por XRD y DSC.
Estas dos técnicas son ampliamente utilizadas para el análisis de complejos de CD
[132,133]. Los difractogramas y las propiedades térmicas de los complejos
TSC/CD se compararon con las de los compuestos puros y las PMs, que presentaron
una composición idéntica a la del complejo. Los difractogramas de todas las TSCs
puras y de α-CD y γ-CD coincidieron con el perfil característico de polvos
cristalinos. Mβ-CD, HPβ-CD y HPγ-CD resultaron ser completamente amorfas antes
y después del proceso de liofilización. Debido a que el comportamiento resultó
idéntico para las cuatro TSCs, el análisis XDR se ejemplifica para los complejos de
TSC3 con Mβ-CD, HPβ-CD, HPγ-CD y γ-CD en la Figura IV. 2. 8. Todos los
complejos de TSC3 fueron completamente amorfos y no evidenciaron la presencia
de las señales características de la TSC (Figura IV. 2. 8). La desaparición de
señales características de un fármaco cristalino suele evidenciar la complejación.
Sin embargo, la TSC tampoco fue detectada en la PM, indicando que la
concentración de TSC en el complejo está por debajo del límite de detección del
equipo. A pesar que la γ-CD fue originalmente cristalina, la liofilización provocó su
amorfización (Figura IV. 2. 8D). El comportamiento de α-CD fue similar
(resultados no mostrados). Estos resultados junto a los estudios SEM con TSC3 libre
constituirían evidencia indirecta de la probable amorfización de TSC en los
complejos. Los estudios de DSC arrojaron resultados similares y no permitieron
dilucidar de manera directa las propiedades de TSC3 en el complejo (resultados
no mostrados).
132
Figura IV. 2. 8. Difractogramas de XRD de muestras prístinas y liofilizadas (**) de TSC3,
Mβ-CD, HPβ-CD, HPγ-CD, γ-CD y de los respectivos complejos TSC3/CD.
D)
Interacción
TSC/CD:
Los
resultados
presentados
hasta
el
momento
constituyeron evidencia sólida de la formación de los complejos. Sin embargo, la
interacción TSC/CD no pudo ser confirmada de manera directa. Con el objeto de
confirmar que los complejos formados fueron de inclusión, profundizamos el
estudio de la interacción TSC/CD empleando técnicas adicionales [133-137].
Inicialmente, los complejos fueron estudiados por espectroscopía ATR/FT-IR y los
resultados comparados a los de TSCs prístinas y PMs. Las bandas características de
estiramiento -NH del extremo -NH2 terminal de las TSC1, TSC2 y TSC3 fueron
observadas en 3375.4-3371.4 y 3263.3-3259.3 cm-1, respectivamente, mientras
que las bandas de estiramiento -NH-C(S)-NH2 en 3153.4-3149.4 cm-1 (Figura IV. 2.
9). En el caso de TSC4, las bandas características de estiramiento –NH se
encontraron levemente desplazadas en 3354.9 y 3205.9 cm-1 debido a la Nalilación de la porción TSC [28]. Asimismo, las bandas características de
estiramiento de C=N aparecieron entre 1604.3-1594.5 cm-1 (Figura IV. 2. 9). En
todas las PMs, estas señales fueron aún evidentes. Por el contrario, los complejos
133
de inclusión TSC/CD mostraron la completa desaparición de estas bandas
confirmando la formación del complejo de inclusión.
El análisis por
1
H-RMN suele ser un método útil para la caracterización de
complejos de inclusión sustancia/CD. La formación de complejos es revelada por
el cambio y/o desaparición de señales de protones de droga y/o CDs debido a la
aparición de nuevas interacciones [112,134]. El desplazamiento de señales de
protones a mayores o menores valores de campo magnético también es
considerado evidencia de la formación de los complejos. Los protones de CD-H3 y
CD-H5 son bien conocidos por localizarse dentro de la cavidad, CD-H6 en la zona
inferior de la cavidad y CD-H1 en el exterior del cono truncado [134-137]. Los
cambios espectrales producidos en las señales de los protones de la CD son
debidos a la interacción de la misma con la molécula incluida en la cavidad o
asociada en la superficie. Debido a que las señales de las TSCs no fueron
detectadas, el estudio se centró en el análisis de los desplazamientos sufridos por
los protones pertenecientes a las CDs cuando se hallan formando complejos con
las TSCs. Es importante destacar que concentraciones de las TSCs superiores a
2500µM permitieron obtener espectros de muy alta calidad. De acuerdo con los
diagramas de solubilidad de fases presentados anteriormente (Figura IV. 2. 1), la
concentración de las TSCs en los complejos fue superior a 2500µM y debería haber
sido detectada. Estos resultados sugirieron que las TSCs se encontraron formando
parte de los complejos de inclusión y estuvieron de acuerdo con los resultados de
ATR/FT-IR,
en
los
cuales
determinadas
bandas
características
de
TSCs
desaparecieron una vez que las mismas estuvieron formando parte del complejo.
134
C
A
1652.1 cm-1
1656.4 cm-1
D
B
3149.4 cm-1
3151.0 cm-1
3371.4 cm-1
3259.4 cm-1
3371.4 cm-1
3259.1 cm-1
1595.0 cm-1
1594.5 cm-1
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
N° de onda (cm-1)
Figura IV. 2. 9. Espectros ATR/FT-IR representativos de (A) HPβ-CD, (B) TSC3, (C) complejo TSC3/HPβ-CD (D) TSC3/HPβ-CD PM.
135
1000
500
N° de ondas (cm-1)
En la Tabla IV. 2. 5 se reúnen los desplazamientos químicos de 1H-RMN (ppm) de
las CDs y sus respectivos complejos de inclusión con las TSCs, en D20 100%. Por
otro lado, se muestran las diferencias de desplazamientos químicos de H
(∆δ) entre los complejos de inclusión TSC/CD y la CDs libres. Las ∆δ fueron
calculadas a partir de la ecuación 5 (Capítulo III. 2. 2).
Todas las señales correspondientes a las CDs fueron afectadas en mayor o menor
medida. Cuanto más hidrofóbica la TSC complejada, más fuerte el desplazamiento
de los protones de la CD. Se evidenció un desplazamiento hacia campos
magnéticos más altos para CD-H5 cuando TSC4 se encontró complejada con Mβ-CD,
y en consecuencia la desaparición de CD-H6. Por otro lado, en presencia de TSC2 y
TSC3, HPβ-CD y γ-CD, demostraron desplazamientos hacia campos magnéticos más
bajos con respecto a las CDs libres. Este fenómeno puede deberse a un efecto de
desprotección o anisotrópico por la inclusión de la porción aromática hidrofóbica
de la TSC dentro de la cavidad de la CD. Además, el desplazamiento de CD-H1
hacia campos magnéticos más bajos podría deberse a la interacción de TSC con la
superficie de la CD, como fuera sugerido por Gibaud et al [137]. Aunque nuestros
datos sugirieron que la formación de complejos de no-inclusión TSC/CD fue menos
factible, la interacción temporal de TSC con la superficie de las CDs en estado
líquido no puede ser descartada del todo. Asimismo, el desplazamiento a campos
mayores de CD-H5 en complejos de TSC4 puede tener su origen en la formación de
complejos de inclusión de tipo 1:2, fenómeno ya discutido previamente. Estudios
avanzados de dinámica molecular que están siendo llevados a cabo, sugieren que
la interacción TSC/CD establece enlaces de tipo puente hidrógeno principalmente
dentro de la cavidad de CD y, en menor medida en la superficie de la CD. Estos
resultados podrían sustentar los resultados de RMN que sugieren que,
independientemente
de
las
características
moleculares,
completamente incorporadas en la cavidad de la CD.
136
las
TSC
están
Tabla IV. 2. 5. Desplazamientos químicos 1H-RMN δ (ppm) de Mβ-CD, HPβ-CD y γ-CD
liofilizadas antes y después de la complejación de TSC en D2O, a 25 °C.
Mβ
β-CD (δ0)
3.4146
3.4929
3.5545
3.5888
3.6645
3.6841
3.7138
3.8857
3.9004
3.9987
5.0834
5.2923
TSC2/Mβ
β-CD (δ1)
3.4095
3.4867
3.5477
3.5831
3.6323
3.6618
3.6806
3.8942
3.9842
5.0734
5.2806
CD-H
HPβ
β-CD (δ0)
-CH3
CD-H
-OCH3
H2
-OCH3
H4
H6
H5
H3
H1
H4
H2
H5
H6
H3
H1
CD-H
-0.0051
-0.0062
-0.0068
-0.0057
-0.0322
-0.0223
-0.0332
-0.0062
-0.0145
-0.0100
-0.0117
TSC4/Mβ
β-CD (δ2)
3.4070
3.4816
3.5467
3.5790
3.6585
3.6760
3.7058
3.8868
3.9924
5.0777
5.2855
-0.0076
-0.0113
-0.0078
-0.0098
-0.0060
-0.0081
-0.0080
-0.0136
-0.0063
-0.0057
-0.0068
TSC2/HPβ
β-CD (δ1)
∆δ1
TSC3/HPβ
β-CD (δ3)
∆δ3
1.1529
1.1689
3.4956
3.5251
3.6038
3.6160
3.6437
3.6679
3.7333
3.8826
3.9478
3.9712
3.9950
4.0190
4.0372
4.0602
5.0860
5.2506
1.1575
1.1734
3.5037
3.5284
3.6053
3.6518
3.6732
3.7354
3.8842
3.9476
3.9712
3.9942
4.0263
4.0387
4.0625
5.1009
5.2535
0.0046
0.0045
0.0081
0.0033
0.0015
0.0081
0.0053
0.0021
0.0016
0.0002
0.0000
0.0008
0.0073
0.0015
0.0023
0.0149
0.0029
1.1577
1.1736
3.5039
3.5284
3.6062
3.6524
3.6729
3.7360
3.8843
3.9463
3.9698
3.9931
4.0377
4.0632
5.1004
5.2525
+0.0048
+0.0047
+0.0083
+0.0033
+0.0024
+0.0087
+0.0050
+0.0027
+0.0017
+0.0015
+0.0014
+0.0019
+0.0050
+0.0030
+0.0144
+0.0019
γ-CD (δ0)
TSC2/γγ-CD (δ1)
∆δ1
TSC3/γγ-CD (δ3)
∆δ3
∆δ1
∆δ2
3.5818
3.5825
0.0007
3.5867
+0.0049
3.6054
3.6061
0.0007
3.6103
+0.0049
3.6289
3.6295
0.0006
3.6337
+0.0048
3.6597
+0.0049
3.6548
3.6555
0.0007
H2
3.6644
3.6651
0.0007
3.6693
+0.0049
3.6796
3.6803
0.0007
3.6845
+0.0049
3.6891
3.6898
0.0007
3.6940
+0.0049
3.8579
3.8585
0.0006
3.8628
+0.0049
H5
3.8659
3.8665
0.0006
3.8704
+0.0045
3.8748
3.8754
0.0006
3.8793
+0.0045
3.8884
3.8890
0.0006
3.8932
+0.0048
H6
3.9175
3.9181
0.0006
3.9225
+0.0050
3.9273
3.9279
0.0006
3.9319
+0.0046
H3
3.9511
3.9517
0.0006
3.9557
+0.0046
3.9749
3.9756
0.0007
3.9795
+0.0046
5.1221
5.1227
0.0006
5.1269
+0.0048
H1
5.1319
5.1326
0.0007
5.1368
+0.0049
δ0 es δCD-libre; δ1, δ2, δ3 son δTSC/CD complejos; ∆δ1, ∆δ2, ∆δ3 representan las diferencias de
desplazamientos químicos de H entre los complejos de inclusión TSC/CD y la CD-libre.
H4
137
IV. 2. 3. Evaluación de la estabilidad fisicoquímica de los complejos de
inclusión en distintas condiciones de almacenamiento
La autoagregación primaria y posterior precipitación de la TSC3 en medio acuoso
representa uno de los principales obstáculos para los estudios biológicos. Por lo
tanto, el estudio de la estabilidad fisicoquímica de los diferentes sistemas TSC/CD
resultó de especial interés. Los ensayos de actividad antiviral in vitro se realizan
habitualmente durante 2-4 días e incluyen el cambio de medio de cultivo (que
contiene el complejo TSC/CD) cada 24 h. Así, para alcanzar resultados
reproducibles y robustos, el complejo en estudio debe permanecer en solución sin
cambios significativos en su estado de agregación durante al menos 24 h.
La Figura IV. 2. 10 presenta los resultados del estudio de estabilidad física de los
diferentes complejos en todas sus concentraciones y que fueron monitoreadas
durante 7 días por espectroscopía UV-Vis.
En general, la estabilidad física del complejo TSC3/CD dependió de: (i) el tipo de
CD y (ii) la concentración de CD (y TSC). Los complejos de TSC con α-CD y γ-CD
permanecieron en solución con cambios muy leves en la concentración,
independientemente de la TSC (Figura IV. 2. 10I-L,N). Una tendencia similar fue
observada para aquellos sistemas a base de CD químicamente modificadas y de
TSC1 y TSC2, las dos TSCs más solubles y con menor tendencia a agregarse. Por el
contrario, los complejos de CDs modificadas con las TSC3 y TSC4 fueron menos
estables que aquellos a base de CDs nativas y mostraron una caída gradual de la
concentración de TSC en función del tiempo (Figura IV. 2. 10A-H,M); estas TSCs
fueron las más hidrofóbicas de acuerdo a los estudios de lipofilicidad y con mayor
tendencia a la agregación. Estos resultados indican que la agregación del complejo
también es promovida por el fármaco complejado cuando éste presenta una alta
tendencia a la agregación. Finalmente, si bien los sistemas de γ-CD parecieron ser
estables en solución estos presentaron una opalescencia marcada con tamaños
cercanos al micrón. Estas características dificultarían el ensayo en cultivos
celulares.
138
A
B
7000
Día 0
Día 1
Solubilidad TSC2 (µ
µ M)
Solubilidad TSC1 (µ M)
7000
Día 7
6000
6000
5000
Día 0
5000
4000
Día 7
0,5
1,5
400
300
4000
3000
Día 1
200
3000
2000
2000
1000
1000
0
100
0
3
0
0,5
1,5
3
15
30
60
0,5
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
C
1,5
3
15
Solubilidad TSC4 (µ
µ M)
Solubilidad TSC3 (µ
µ M)
Día 0
Día 1
Día 7
1600
Día 0
Día 1
Día 7
**
1400
1400
1200
60
1800
1800
1600
30
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
D
100
80
1000
*
60
**
*
40
800
1200
40
1000
30
800
20
600
0,5
400
600
**
0
1,5
3
200
0
0
1,5
3
10
15
30
60
0,5
1,5
3
**
0,5
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
**
0
400
200
0,5
20
1,5
3
15
30
60
15
30
60
Concentración Mβ
β-CD (% p/v)
F
E
1600
1800
Día 0
Día 1
Solubilidad TSC2 (µ M)
Solubilidad TSC1 (µ
µ M)
1800
Día 7
1600
1400
Día 0
Día 1
Día 7
1400
1200
1200
1000
1000
800
800
600
600
400
400
200
200
0
0
0,5
1,5
3
15
30
0,5
60
β-CD (% p/v)
Concentración HPβ
1,5
3
β-CD (% p/v)
Concentración HPβ
Figura IV. 2. 10. Estabilidad física de soluciones de complejos de inclusión TSC/CD
estimada a los largo de 7 días por UV-Vis, a 25° C: (A) TSC1/Mβ-CD, (B) TSC2/Mβ-CD, (C)
TSC3/Mβ-CD, (D) TSC4/Mβ-CD, (E) TSC1/HPβ-CD, (F) TSC2/HPβ-CD, (G) TSC3/HPβ-CD,
(H) TSC4/HPβ-CD, (I) TSC1/γ-CD, (J) TSC2/γ-CD, (K) TSC3/γ-CD, (L) TSC4/γ-CD, (M)
TSC3/HPγ-CD y (N) TSC3/α-CD. Los resultados son expresados como el promedio ± S.D. (n
= 3). (*) La disminución de la concentración de TSC fue estadísticamente significativa con
respecto a la concentración en el complejo a día 0 (P < 0,05).
139
G
H
1200
Día 0
300
Día 1
Día 0
80
*
40
**
**
**
20
0
0,5
1,5
3
*
100
600
400
*
200
0
0,5
1,5
3
15
30
60
0,5
Concentración HPβ
β-CD (% p/v)
I
1,5
3
J
15
30
60
7,5
15
22
15
22
Concentración HPβ
β-CD (% p/v)
1000
Día 0
Día 1
Solubilidad TSC2 (µ
µ M)
1000
Solubilidad TSC1 (µ M)
Día 7
800
0
Día 7
800
600
400
200
Día 0
Día 1
Día 7
800
600
400
200
0
0
0,5
1,5
3
7,5
15
22
Concentración γ-CD (% p/v)
K
Solubilidad TSC3 (µ
µ M)
Día 1
1000
60
200
Día 7
Solubilidad TSC4 (µ
µ M)
Solubilidad TSC3 (µ
µ M)
400
Día 0
Día 1
Día 7
300
200
1,5
3
L
Solubilidad TSC4 (µ
µ M)
400
0,5
100
Concentración γ-CD (% p/v)
400
Día 0
Día 1
Día 7
300
200
100
0
0
0,5
1,5
3
7,5
15
22
0,5
Concentración γ-CD (% p/v)
M
1,5
3
7,5
Concentración γ-CD (% p/v)
N
400
Día 0
Día 1
Solubilidad TSC3 (µ M)
Solubilidad TSC3 (µ M)
400
Día 7
Día 0
Día 1
Día 7
300
300
200
200
*
100
*
100
*
0
0
0,5
1,5
3
7,5
15
30
Concentración HPγγ-CD (% p/v)
Figura IV. 2. 10 (continuación)
140
0,5
1,5
3
7,5
10
14
Concentración α-CD (% p/v)
Como hemos descripto para las TSC puras, la agregación no sólo se manifestó
como un descenso de la concentración en solución, sino también como un
aumento gradual del tamaño de las partículas. El aumento de tamaño puede
alterar la respuesta biológica por condicionar el pasaje del fármaco a través de
barreras como por ejemplo la membrana celular. En este contexto, para
complementar y sustentar el estudio de estabilidad física de los complejos, el
tamaño de las diferentes muestras fue monitoreado a lo largo de 7 días por DLS
(Figura IV. 2. 11). Los aumentos de tamaño de los complejos de inclusión de TSCs
fueron estadísticamente significativos al ser comparados con los tamaños iniciales
en casi todos los casos (P < 0,05). Si bien esto representó una desventaja para los
estudios de actividad antiviral, los ensayos propuestos demandaron el recambio
completo del medio de cultivo, conteniendo la muestra evaluada cada 24 h.
141
1400
Día 0
Día 1
Día 7
1200
*
D h (nm)
B
D h (nm)
A
1400
Día 0
*
800
800
600
600
**
**
**
*
*
400
*
200
200
0
0
0,5
1,5
3
C
15
0,5
30
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
1,5
3
D
1200
Día 0
Día 1
D h (nm)
D h (nm)
1400
Día 7
15
30
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
1400
Día 0
Día 1
Día 7
1200
1000
1000
800
800
600
*
600
400
400
** Agregación
*
**
**
**Agregación
200
200
**
0
*
0,5
1,5
** **
3
E
** **
15
** ** **
* * *
0
0,5
30
β-CD (% p/v)
Concentración Mβ
1,5
3
Día 0
Día 1
Día 7
500
15
30
Concentración Mβ
β-CD (% p/v)
F
600
D h (nm)
D h (nm )
*
Día 7
1000
1000
400
Día 1
1200
600
Día 0
Día 1
* *
Día 7
500
400
400
300
300
200
200
100
100
* *
*
*
*
0
0
0,5
1,5
3
15
30
Concentración HPββ-CD (% p/v)
0,5
1,5
3
15
30
β-CD (% p/v)
Concentración HPβ
Figura IV. 2. 11. Estabilidad física de soluciones de los complejos de inclusión TSC/CD
estimada a los largo de 7 días por DLS, a 25° C. (A) TSC1/Mβ-CD, (B) TSC2/Mβ-CD, (C)
TSC3/Mβ-CD, (D) TSC4/Mβ-CD, (E) TSC1/HPβ-CD, (F) TSC2/HPβ-CD, (G) TSC3/HPβ-CD,
(H) TSC4/HPβ-CD, (I) TSC1/γ-CD, (J) TSC2/γ-CD, (K) TSC3/γ-CD, (L) TSC4/γ-CD, (M)
TSC3/HPγ-CD y (N) TSC3/α-CD. Los resultados son expresados como el promedio ± S.D. (n
= 3). (*) El aumento de tamaño de los complejos de inclusión de TSC fue estadísticamente
significativo cuando se comparó con el tamaño inicial (P < 0,05).
142
H
600
Día 0
Día 1
Día 7
500
*
400
3000
D h (nm)
D h (nm)
G
Día 0
1800
300
*
1200
200
0
1,5
3
15
30
0,5
β-CD (% p/v)J
Concentración HPβ
I
Día 0
Día 1
Día 7
*
1000
Día 0
*
30
Día 1
Día 7
600
*
**
*
* *
400
*
400
15
β-CD (% p/v)
Concentración HPβ
800
**
600
3
1000
* *
800
1,5
1200
D h (nm)
1200
D h (nm )
*
0
0,5
**
*Agregación
200
***
0
0
0,5
1,5
3
7,5
15
0,5
22
1,5
3
7,5
15
22
Concentración γ-CD (% p/v)
Concentración γ-CD (% p/v)
L
1400
1200
Día 0
Día 1
*
Día 7
1400
D h (nm )
K
D h (nm )
* *
600
100
200
Día 7
*
*
* *
Día 1
2400
Día 0
Día 1
Día 7
1200
*
1000
1000
**
800
800
*
600
*
400
**
600
400
**
*
**
200
200
0
0
0,5
1,5
3
M
7,5
15
0,5
22
Concentración γ-CD (% p/v)
1,5
3
7,5
15
22
Concentración γ-CD (% p/v)
N
1200
Día 0
Día 1
D h (nm)
Dh (nm)
1200
Día 7
1000
Día 0
Día 1
Día 7
*
1000
800
800
600
* *
**
**
*
*
600
**
400
*
*
400
200
200
0
0
0,5
1,5
3
7,5
15
30
Concentración HPγγ-CD (% p/v)
Figura IV. 2. 11 (continuación)
143
0,5
1,5
3
7,5
10
14
Concentración α-CD (% p/v)
Por otro lado, las concentraciones máximas de CD que pudieron evaluarse en
cultivos celulares estuvieron condicionadas por la citotoxicidad de la CD y en
general fueron menores al 0,5% p/v (ver abajo). Así, los complejos TSC/CD
mostraron tamaños entre 150–400 nm a día 1, los cuales fueron sensiblemente más
pequeños que aquellos formados por las TSCs libres (Figura IV. 2. 11). Además,
fueron observados tamaños relativamente pequeños para complejos de TSCs con
CDs químicamente modificadas como HPβ-CD que oscilaron entre 120-200 nm en
concentraciones que podrían a priori ser evaludas en ensayos in vitro (0,5-3% p/v,
Tabla IV. 2. 3), sin riesgo de pérdida de material de los complejos durante la
filtración esterilizante (0,22 µm). Asimismo, es importante destacar que el
aumento de tamaño de partícula debe ser analizado con cautela. En el caso de las
TSCs puras, dicho aumento implicó la generación de partículas insolubles que no
permitirían mantener un título de TSCs en solución, ni liberar nuevas moléculas a
la solución desde los agregados. Por el contrario, en el caso de los complejos, los
agregados nanoscópicos están formados fundamentalmente por la agregación de
moléculas de CD las cuales mantienen a la TSC en su cavidad en estado soluble.
De esta manera, se espera que en el caso de los complejos, las moléculas de
fármaco se liberen desde el reservorio hacia el medio de cultivo durante el ensayo
y que las mismas interaccionen con las células. De acuerdo a los resultados
obtenidos, la complejación de las TSCs apareció como una estrategia sólida para
avanzar en los estudios de actividad antiviral.
144
IV. 3. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-VHC DE LAS TIOSEMICARBAZONAS
VEHICULIZADAS USANDO CICLODEXTRINAS
Artículo científico III. Novel 1-indanone thiosemicarbazones and their
inclusion complexes with hydroxypropylβ -cyclodextrin: Antiviral activity
against the hepatitis C virus (HCV). Artículo enviado para su consideración a
Pharmaceutical Research. Referencia 84 de la presente tesis doctoral.
El VHC es el agente etiológico de una de las infecciones más extendidas en el
mundo, que cumple un rol clave en el desarrollo del cáncer de hígado. El
tratamiento farmacológico actual es eficaz en un número limitado de pacientes y
su costo elevado compromete la asequibilidad al mismo. En este contexto, urge
descubrir compuestos antivirales más eficaces. Una mejor comprensión de la
dinámica viral y el ciclo viral condujo al hallazgo de varios potenciales blancos
para el diseño de nuevas drogas antivirales. Estos fármacos, llamados DAA,
incluyen una serie de inhibidores de la NS3/NS4A serin-proteasas, NS5B RdRp e
inhibidores de la proteína no estructural NS5A, componentes cruciales de la
replicación viral [94].
En la actualidad, los inhibidores de proteasa NS3/NS4A son los que se encuentran
en el estadío más avanzado de desarrollo clínico. Datos clínicos de Fase III de
pacientes previamente tratados y no tratados con IFN+RBV, infectados con el VHC
de genotipo 1, a los que se le administra telaprevir o boceprevir, en combinación
con IFN+RBV, demostraron tasas de RVS que oscilaron entre 66-75% y 59-66%,
respectivamente [138].
Uno de los obstáculos más notables para la evaluación preclínica y clínica de
nuevos fármacos es la escasa solubilidad acuosa de más del 70% de ellos. Esto
constituye un desafío no sólo en las etapas preclínicas y clínicas posteriores, sino
también en los ensayos biológicos preliminares. La baja solubilidad de nuevos
fármacos contribuye a aumentar la tasa de abandono de nuevas drogas (drug
attrition) en estadíos tempranos de investigación.
En la presente tesis doctoral, se investigó por primera vez la actividad anti-VHC
de dos novedosas TSCs derivadas de 1-indanonas, las TSC3 y TSC4 y de sus
complejos de inclusión con HPβ-CD en dos sistemas de replicón (FL y SG) de VHC
de subgenotipo 1b. Para ellos, las células cultivadas en forma de monocapa fueron
expuestas a diferentes concentraciones de estos compuestos durante 96 h. Para
ajustar las condiciones del ensayo y concentrar nuestros mayores esfuerzos en la
145
evaluación de complejos con mayores posibilidades de implementación en clínica,
en una etapa preliminar estudiamos exhaustivamente (i) las propiedades de
solubilidad y agregación de ambas TSCs y de los complejos respectivos en medio
de cultivo y (ii) la citotoxicidad de HPβ-CD en diferentes concentraciones.
IV. 3. 1. Estudio de la solubilidad y agregación de las TSCs y de los complejos
TSC/CD en medio de cultivo
La estabilidad física de las TSC3 y TSC4 libres y sus complejos de inclusión
TSC/HPβ-CD fue evaluada para seleccionar aquellas muestras que cumplen con un
requisito fundamental: estabilidad física (y concentración constante) durante 24
h. Las muestras que formaron cristales visibles a simple vista (por ejemplo, TSC4
57µM en DMSO 1% v/v) a día 0 fueron descartadas y no se investigaron con mayor
profundidad. La TSC3 57µM en DMSO 1% v/v también formó agregados, pero estos
resultaron nanoscópicos (no visibles a simple vista) y por lo tanto se evaluó tanto
la citotoxicidad como la actividad antiviral de dicha muestra. Para evaluar la
autoagregación de las TSCs prístinas en las condiciones específicas de los ensayos
biológicos, se prepararon las soluciones de TSC en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1) y los
respectivos complejos de inclusión TSC/HPβ-CD en PBS:DMEM (1:1 o 1:2) o DMEM
puro, según corresponda (ver Capítulos III. 3. 2 y III. 3. 3) y las concentraciones
de TSCs fueron monitoreadas durante 24 h, a 37º C por UV-Vis (ver Capítulos III. 3.
2 y III. 3. 3). Se constató que el medio de cultivo empleado no interfiriera en la
cuantificación de la TSC por esta metodología.
La TSC3 prístina mostró la estabilidad física más baja en todo el rango de
concentraciones (entre 13,0 a 57,0µM en DMSO al 1% v/v) (Figura IV. 3. 1). Esto
coincidió con los estudios realizados en agua [28] (Capítulo IV. 1). La TSC4 resultó
físicamente inestable sólo a la concentración más alta, 57,0µM (Figura IV. 3. 1),
dando lugar a una pérdida rápida de la concentración a día 0, llegando a un 34,7%
de la concentración inicial (Figura IV. 3. 1). Este comportamiento se correlacionó
con los resultados de log Kwater experimental [28] (Capítulo IV. 1). Por el
contrario, la formación de complejos de TSC3 y TSC4 con HPβ-CD resultó en
sistemas de mayor estabilidad física. Por ejemplo, la concentración de TSC3 (13,0
µM en DMSO al 1% v/v) se redujo desde 100 a 54,2% a las 24 h, mientras
TSC3/HPβ-CD (13,0µM/0,125-0,25% p/v de CD) se mantuvo soluble en el rango de
96,2-98,5% (Figura IV. 3. 1). Los complejos TSC4/HPβ-CD demostraron mayor
146
estabilidad que la TSC4 libre. Por ejemplo, TSC4 57µM que precipitó en su forma
libre formando cristales micro y macroscópicos, incluso a día 0, mientras la TSC se
TSC solubilidad (µ
µM)
mantuvo en solución cuando fue complejada (TSC4/HPβ-CD 57,0µM/3,0% p/v).
60
Solubilidad Teórica
*
Solubilidad Experimental día 0
50
Solubilidad Experimental día 7
*
*
*
40
30
*
*
20
*
*
10
*
*
*
*
0,5
TS
%
C3
c/C
D
TS
0,5
C4
%
a/C
D0
,12
TS
5%
C4
a/C
D0
,25
TS
%
C4
a/C
D0
, 5%
TS
C4
b/C
D0
,5%
TS
C4
c/C
D3
,0%
%
TS
C3
b
/CD
0, 5
%
,25
TS
C3
a
/C
D
%
25
a/C
D0
0,1
TS
C3
TS
C3
a
/C
D
TS
C4
c
b
TS
C4
a
TS
C4
b
TS
C3
c
TS
C3
TS
C3
a
0
Figura IV. 3. 1. Estabilidad física de las TSCs libres, HPβ-CD libre de TSC y complejos de
inclusión TSC/HPβ-CD en medio de cultivo estimada por UV-Vis durante 24 h, a 37° C. Las
concentraciones iniciales de TSCa, TSCb, TSCc fueron 13,0; 23,0 y 57,0µM en
DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), respectivamente. Las mismas concentraciones de TSC fueron
usadas en los diferentes complejos. La concentración de CD en DMEM o PBS:DMEM (1:1 o
1:2) es expresada como %p/v. Todos los datos fueron expresados como la media ± S.D. de
al menos 3 experimentos independientes. *Caída estadísticamente significativa de la
concentración de TSC cuando fue comparada con la concentración teórica a día 0 (P <
0,05).
Este resultado está de acuerdo con los obtenidos en los estudios realizados en
medio acuoso (Capítulo IV. 1. 2). Sin embargo, esta concentración de HPβ-CD fue
extremadamente citotóxica y no pudo ser evaluada en ensayos de actividad
antiviral (ver abajo).
IV. 3. 2. Citotoxicidad por apoptosis de las TSCs y de los complejos TSC/CD
La citotoxicidad de CDs es un fenómeno bien conocido y que se atribuye a
varios factores, incluyendo su efecto detergente sobre las membranas biológicas,
y depleción de colesterol y fosfolípidos de membrana, lo que ha llevado a
147
observar: (i) muerte por apoptosis de diferentes tipos celulares en ensayos in vitro
y (ii) toxicidad sistémica como hemólisis, incluso a bajas concentraciones [139].
La hidroxipropilación de CDs lleva a una reducción de la citotoxicidad, ya que
altera la interacción de las CDs con los componentes de la membrana celular (por
ejemplo, el colesterol y los fosfolípidos) [139]. HPβ-CD es generalmente
considerada un excipiente farmacéutico seguro para la vehiculización de fármacos
hidrofóbicos [121].
Previo al análisis por citometría de flujo, las células tratadas con (i) TSC3 y TSC4
(13,0-57,0µM) en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), (ii) CD libre de fármaco (0,125-3%
p/v) en DMEM, (iii) complejos de inclusión TSC/CD (0,125-3% p/v) en DMEM o
PBS:DMEM (1:1 o 1:2) y (iv) los controles sin tratamiento, fueron observadas bajo
el microscopio óptico de luz invertida. La Figura IV. 3. 2 muestra la morfología de
células Huh 7.5 FL post-tratamiento con complejos de inclusión TSC3/HPβ-CD y
sus respectivos controles. El complejo TSC3/HPβ-CD 1% fue citotóxico a las 96 h
(Figura IV. 3. 2A), mientras que el complejo TSC3/HPβ-CD 0,5% no mostró signos
de citotoxicidad (Figura IV. 3. 2B).
A
B
E
F
C
D
Figura IV. 3. 2. Fotografías de microscopía óptica de células Huh 7.5 FL-VHC tratadas
con: (A) TSC3/HPβ-CD 1% (B) TSC3/HPβ-CD 0,5% (C) control negativo (D) control positivo
y (E-F) TSC3/HPβ-CD 3%. (A-D) 96 h; (E y F) 24 h y 48 h, respectivamente. La
concentración de CD es expresada como % p/v.
A su vez, los complejos TSC3/HPβ-CD 3% mostraron una marcada citotoxicidad a
partir de las 24 h de tratamiento (Figura IV. 3. 2E). A las 48 h, este efecto fue
más pronunciado, observándose la morfología característica de detritos celulares
148
que indican ruptura de la membrana celular como consecuencia de la elevada
citotoxicidad (Figura IV. 3. 2F). A través del estudio microscópico, pudo
establecerse que los complejos TSC/CD no citotóxicos fueron aquellos obtenidos
con concentraciones de CD < 0,5% p/v. Estos resultados fueron sustentados con los
que presentaremos a continuación provenientes del análisis por citometría de
flujo. Los estudios de citotoxicidad por apoptósis comprendieron las siguientes
muestras: (i) TSC3 y TSC4 libres, (ii) HPβ-CD libre y (iii)
complejos TSC/CD
(Capítulo III. 3. 4).
Ninguna de las soluciones de TSC libre en todo el rango de concentraciones
estudiado causó una disminución significativa de la viabilidad celular en ambos
sistemas de replicón; la viabilidad osciló entre 86,4–90,1% (Figura IV. 3. 3). Estos
valores fueron comparables con los de los controles sin tratamiento que se
encontraron en el rango entre 88,9 y 94,5%. Cuando los replicones de VHC fueron
expuestos a HPβ-CD libre, la citotoxicidad se mostró fuertemente dependiente de
dos parámetros fundamentales: (i) la concentración de CD y (ii) el tiempo de
incubación. A concentraciones > 0,5% p/v, se observó un alto porcentaje de
detritos celulares, indicando la ruptura de la membrana celular. Estos resultados
coincidieron con los resultados preliminares realizados por microscopía óptica. Por
el contrario, a menores concentraciones (0,125 a 0,5% p/v), la viabilidad celular
fue similar a la de los controles (87,6–91,6%) (Figura IV. 3. 3). Nuestros resultados
estuvieron de acuerdo con trabajos previos donde se demostró que diferentes
tipos de células expuestas a HPβ-CD durante varias horas toleran concentraciones
de CD de hasta un 0,5-1% p/v [139]. Además de la concentración de CD utilizada,
el tiempo de incubación jugó un papel central y condicionó la citotoxicidad. Como
fue de esperar, a mayor tiempo de exposición, mayor la citotoxicidad de la CD. En
general, los complejos TSC3/HPβ-CD de 0,125-0,5% p/v no mostraron pérdida
significativa de la viabilidad para ambos sistemas de replicón, y los valores de
viabilidad oscilaron entre 87,1-91,4%. La Figura IV. 3. 4 muestra los resultados de
citometría de flujo obtenidos.
Curiosamente, los complejos TSC4/HPβ-CD (13,0µM/0,25–0,5% y 23,0µM/0,5% p/v)
resultaron ser citotóxicos para ambos sistemas de replicón, en comparación con
sus componentes por separado, lo que sugiere un efecto de citotoxicidad sinérgica
por parte de los complejos (Figura IV. 3. 3).
149
Viabilidad celular (%)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
*Detritos
*Detritos
Co
ntr
ol
ST
TS
C3
a
TS
C3
b
TS
C3
c
TS
C4
a
TS
C4
b
TS
C
4c
CD
0,1
25
%
CD
0,2
5%
CD
0,5
%
CD
1,0
%
TS
CD
C3
3
a/C
,0%
D0
TS
,1 2
C3
5%
a/C
D0
TS
,25
C3
%
a/C
D0
TS
C3
,5%
b/C
D0
TS
C3
,5%
c/C
TS
D0
C4
a/C
,5%
D0
TS
,1 2
C4
5%
a/C
D
TS
0,2
C4
5%
a/C
D0
TS
C4
,5%
b/C
D0
TS
C4
,5%
c/C
D3
,0%
0
Figura IV. 3. 3. Citotoxicidad de las TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos de inclusión
TSC/HPβ-CD determinadas por citometría de flujo. Control ST: control sin tratamiento.
Las concentraciones iniciales de TSCa, TSCb, TSCc fueron 13,0; 23,0 y 57,0µM en
DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), respectivamente. Las mismas concentraciones de TSC fueron
usadas en los diferentes complejos. La concentración de CD en DMEM o PBS:DMEM (1:1 o
1:2) es expresada como % p/v. Las barras representan la viabilidad promedio de los
sistemas de replicón FL y SG. Todos los datos fueron expresados como la media ± S.D. de
al menos 3 experimentos independientes. *Detritos: Las muestras mostraron detritos
celulares y no fueron analizadas por citometría de flujo. **Caída estadísticamente
significativa de la concentración de TSC cuando es comparada con la concentración
teórica a día 0 (P < 0,05).
Estos resultados sugerirían que los complejos deberían ser considerados nuevas
entidades químicas y no meramente una combinación de dos componentes,
fármaco y CD. Así, en el caso de la TSC4, estas estructuras fueron más propensas
a interactuar con las membranas celulares y dañarlas. Cabe aclarar que para una
misma concentración de TSC (57µM), TSC3 requirió 0,5% CD mientras que TSC4
necesitó 3% p/v.
150
A
AV+/IP+
AV+/IP -
B
C
Figura IV. 3. 4. Análisis por citometría de flujo de la apoptosis celular mediante doble
marcación AV-FTIC/IP en células Huh 7.5 FL. (A) Control sin tratamiento, y células
tratadas con: (B) TSC3/HPβ-CD 0,5% y (C) TSC3/HPβ-CD 3%. La concentración de CD es
expresada como %p/v.
Para complementar el estudio de citotoxicidad, se cuantificó la actividad de dos
transaminasas hepáticas, TGO y TGP, en los sobrenadantes de cultivos celulares
expuestos a las diferentes muestras durante 96 h. La cuantificación de las mismas
se utiliza generalmente como un indicador complementario de citotoxicidad en
células hepáticas [115]. Sorprendentemente, se observó que las relaciones de
TGO/TGP en los sobrenadantes de los cultivos expuestos a TSC y TSC/CD
disminuyeron significativamente con respecto a los controles sin tratamiento
(Tabla IV. 3. 1). Por ejemplo, los controles no tratados de FL y SG mostraron una
relación TGO/TGP de 8,3 y 6,0, respectivamente, mientras que los valores de
TSC3 23,0µM fueron de 2,0 (FL) y 1,0 (SG). Los complejos TSC/CD mostraron
valores intermedios entre 1,5 y 5,0. Más interesante aún, esta caída de TGO/TGP
151
mostró cierta correlación con la actividad anti-VHC, que será discutida más
adelante.
Tabla IV. 3. 1. Relación TGO/TGP en los sobrenadantes de células Huh 7.5 de replicón de
genoma completo (FL) y subgenómico (SG) del VHC de subgenotipo 1b, después de 96 h de
incubación con TSCs libres, HPβ-CD libre de TSC y complejos de inclusión TSC/HPβ-CD.
Todos los datos fueron expresados como la media ± S.D. de al menos 3 experimentos
independientes. *Caída estadísticamente significativa de las relaciones TGO/TGP con
respecto a los controles sin tratamiento (P < 0,05).
TGO/TGP (±S.D.)
FL
SG
Control sin tratamiento
8,3 (0,9) 6,0 (1,0)
2,5* (0,5) 3,5* (0,5)
TSC3 13,0µ
µMa
3,0* (0,3) 3,5* (0,5)
TSC3 23,0µ
µMa
4,0* (0,4) 3,0* (0,4)
TSC3 57,0µ
µMa
1,0* (0,5) 3,0* (0,6)
TSC4 13,0µ
µMa
2,0* (0,5) 1,0* (0,4)
TSC4 23,0µ
µMa
4,0* (0,5) 2,0* (0,6)
TSC4 57,0µ
µMa
4,5* (0,7) 4,0* (0,8)
HPβ
β-CD 0,125%b
2,5* (0,7) 2,0* (0,5)
HPβ
β-CD 0,25%b
2,5* (0,7) 3,0* (0,2)
HPβ
β-CD 0,5%b
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,125%b 5,0* (0,7) 2,0* (0,7)
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,25%b 4,0* (0,6) 2,5* (0,6)
3,7* (0,5) 2,0* (0,3)
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,5%b
2,5* (0,4) 1,5* (0,5)
TSC3/HPβ
β-CD 23,0µ
µM/0,5%b
5,0* (0,7) 2,6* (0,2)
TSC3/HPβ
β-CD 57,0µ
µM/0,5%b
TSC4/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,125%b 3,5* (0,6) 2,3* (0,8)
ND
ND
TSC4/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,25%b
ND
ND
TSC4/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,5%b
ND
ND
TSC4/HPβ
β-CD 23,0µ
µM/0,5%b
ND
ND
TSC4/HPβ
β-CD 57,0µ
µM/3,0%b
a
TSCs en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1). bConcentración de CD expresada como %p/v en las diferentes
muestras de HPβ-CD libre y de complejos de inclusión.
ND: No determinado debido a la alta citotoxicidad de los complejos.
Tratamiento
IV. 3. 3. Estudios de la actividad anti-VHC de las TSCs libres y de los complejos
TSC/CD
Se evaluó la actividad antiviral de las TSC3 y TSC4 prístinas y de sus complejos
con HPβ-CD que no habían demostrado ser citotóxicos en los ensayos previos. Se
cuantificaron los niveles totales de ARN viral en los sobrenadantes mediante RTPCR y los valores se normalizaron para cada control sin tratamiento y en cada
ensayo individual. El sistema de replicón SG empleado en este estudio, codifica
para proteínas virales no estructurales, mientras que el sistema FL codifica tanto
para proteínas estructurales como para no estructurales. La caída pronunciada en
los niveles de ARN viral por exposición a las TSC3 y TSC4 libres, HPβ-CD libre y los
152
complejos de inclusión durante 96 h fue equivalente en ambos sistemas de
replicón (Tabla IV. 3. 2; Figura IV. 3. 5).
Tabla IV. 3. 2. Disminución de los niveles totales de ARN viral luego de la exposición a
TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos durante 96 h. Las concentraciones de ARN viral en
los controles sin tratamiento fueron considerados 100%. Todos los datos se expresan como
la media ± S.D. de al menos 3 experimentos independientes. *Caída estadísticamente
significativa de la concentración de ARN total con respecto al control sin tratamiento (P <
0,05).
Niveles totales de ARN viral
% (±S.D.)
FL
SG
Control sin tratamiento
100,00 (11,68) 100,00 (14,54)
0,56* (0,14)
0,42* (0,06)
TSC3 13,0µ
µMa
0,34* (0,08)
0,25* (0,05)
TSC3 23,0µ
µMa
0,66* (0,17)
1,65* (0,41)
TSC3 57,0µ
µMa
0,23* (0,05)
0,24* (0,06)
TSC4 13,0µ
µMa
0,36* (0,07)
0,25* (0,05)
TSC4 23,0µ
µMa
ND
ND
TSC4 57,0µ
µMa
63,08* (12,47) 79,40* (1,95)
HPβ
β-CD 0,125%b
60,75* (12,45) 83,07* (1,75)
HPβ
β-CD 0,25%b
56,68* (12,18) 72,86* (2,40)
HPβ
β-CD 0,5%b
16,59* (0,49)
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,125%b 18,25* (3,65)
17,27* (2,39)
15,88* (0,41)
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,25%b
15,94* (2,87)
15,61* (0,50)
TSC3/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,5%b
3,50* (0,45)
1,87*(0,34)
TSC3/HPβ
β-CD 23,0µ
µM/0,5%b
5,48* (1,20)
6,98*(0,94)
TSC3/HPβ
β-CD 57,0µ
µM/0,5%b
23,53* (0,43)
TSC4/HPβ
β-CD 13,0µ
µM/0,125%b 24,56* (4,64)
a
TSCs en DMEM:PBS:DMSO (66:33:1). bConcentración de CD expresada como %p/v en las diferentes
muestras de HPβ-CD libre y de complejos.
ND: No determinado debido a la precipitación de la TSC en el medio de cultivo.
Tratamiento
Las TSC3 y TSC4 libres (13,0 y 23,0µM) redujeron la carga viral en más de un
99,4%. TSC3 57,0µM fue un poco menos eficaz, aunque los valores se mantuvieron
por encima del 98,3%. HPβ-CD libre también resultó activa aunque en menor
medida, con disminuciones de 36,9-43,3% y 16,9-27,1% en los sistemas FL y SG,
respectivamente. Este fenómeno podría justificarse por otros mecanismos, como
la
capacidad
de
las
CDs
de
depletar
colesterol
de
las
membranas
desestabilizándolas. Si bien en estos sistemas de replicón no es posible realizar
estudios de infectividad viral, esta observación podría constituir evidencia valiosa
para abordar en el futuro estudios de actividad antiviral y sinergia en otros
sistemas replicón disponibles actualmente. En general, los complejos TSC/CD
fueron leve a moderadamente menos activos que las TSC libres, mostrando niveles
de depleción de ARN viral entre 75,4% y 98,1% (Tabla IV. 3. 2, Figura IV. 3. 5).
153
FL-VHC
SG-VHC
100
90
80
70
60
50
*
*
*
40
*
30
*
20
*
10
CD
TS
0, 5
C3
%
a/C
D0
,
12
TS
5%
C3
a/C
D0
,25
TS
%
C3
a/C
D0
,5%
TS
C3
b/C
D0
,5%
TS
C3
c/C
D0
TS
,5%
C4
a/C
D0
,12
5%
,25
%
CD
0
,12
5%
CD
0
a
b
TS
C4
TS
C4
b
a
TS
C3
c
TS
C3
T
ol
S
Co
ntr
TS
C4
c
ND
0
TS
C3
Disminución de los niveles de ARN-VHC (%)
110
Figura IV. 3. 5 Disminución de los niveles totales de ARN viral luego de la exposición a
TSCs libres, HPβ-CD libre y complejos durante 96 h. Control ST: control sin tratamiento.
Las concentraciones iniciales de TSCa, TSCb, TSCc fueron 13,0; 23,0 y 57,0µM en
DMEM:PBS:DMSO (66:33:1), respectivamente. Las mismas concentraciones de TSC fueron
usadas en los diferentes complejos. La concentración de CD en DMEM o PBS:DMEM (1:1) es
expresada como %p/v. Todos los datos se expresan como la caída del nivel de ARN viral
(%) con respecto al control sin tratamiento (100% de carga viral) ± S.D. de al menos 3
experimentos independientes.
ND: No determinado debido a la precipitación de TSC en el medio de cultivo a día 0.
*Diferencia estadísticamente significativa entre FL-VHC y SG-VHC (P < 0,05).
También en este caso, las diferencias entre FL y SG no fueron estadísticamente
significativas. Curiosamente, el complejo de inclusión más activo fue TSC3/HPβCD (23,0µM/0,5% p/v) (Tabla IV. 3. 2, Figura IV. 3. 5). Esta actividad antiviral fue
acompañada por la menor relación TGO/TGP (Tabla IV. 3. 1).
Como fuera mencionado en el Capítulo I. 2. 9, diversos complejos de inclusión
antiviral/CD han demostrado ventajas significativas en el efecto antiviral y en la
biodisponibilidad en reservorios virales respecto de su contraparte sin complejar
[67-70]. En nuestro estudio, las TSC3 y TSC4 libres han demostrado una notable
actividad anti-VHC expresada por la fuerte disminución de los niveles de ARN del
VHC en más del 99%, después de 96 h. Los complejos TSC/CDs mostraron
descensos más moderados que las TSC libres, salvo para el caso de TSC3/HPβ-CD
23,0 µM/0,5% que también alcanzó una disminución cercana al 99% (Tabla IV. 3.
2, Figura IV. 3. 5). Este fenómeno se debió probablemente a que la concentración
154
efectiva de TSC en el medio de cultivo y disponible para ser absorbida por las
células fue menor en los complejos que en las muestras de TSC libre. En otras
palabras, la CD actúa como un reservorio de TSC la cual se libera lentamente al
medio. El perfil de liberación de un fármaco desde un complejo está regido por la
K1:1, que es una medida de la fuerza de interacción entre ambos componentes del
complejo (Capítulo I. 2. 4). Como fuera discutido anteriormente, valores de K1:1
entre 50 y 2000M-1 son apropiados para la formación de complejos (ver Capítulo I.
2. 4) [41,54,55]. Valores de K1:1 < 50M-1 indican interacciones débiles
sustancia/CD, mientras que valores por encima de 2000M-1 son indicativos de la
existencia de fuertes interacciones que limitan la liberación de la droga. Los
complejos TSC3/HPβ-CD y TSC4/HPβ-CD mostraron valores de K1:1 de 123,8 y
186,2M-1, respectivamente [46]. Estos valores se encontraron en el rango
aceptable para solubilizar y estabilizar TSC de manera efectiva, y al mismo tiempo
liberar
la
molécula
complejada.
Sin
embargo,
esto
provocó
que
las
concentraciones efectivas en el medio de cultivo fueran menores que en las
muestras de TSC libre y consecuentemente que el efecto antiviral se vea
disminuido. Es interesante destacar que a pesar que las TSC3 y TSC4 fueron
igualmente efectivas en su forma libre para todo el rango de concentraciones,
cuando las mismas estuvieron complejadas, TSC3 fue más activa que TSC4. Por
ejemplo, los niveles totales % de ARN viral (respecto del control no tratado) para
sistemas TSC/HPβ-CD (13,0µM/0,125% p/v) fueron 16,59-18,25% y 23,53-24,56%,
para TSC3 y TSC4, respectivamente. De acuerdo a los valores determinados de K1:1
para ambos complejos, la TSC4 tiene una mayor afinidad por la CD que la TSC3.
Estos resultados sustentarían la hipótesis de que la caída de la actividad en el caso
de los complejos se debe fundamentalmente a menores concentraciones efectivas
en el medio de cultivo. Esta capacidad de regular la liberación de la TSC desde la
cavidad se capitalizó para el diseño de lentes oculares medicadas para la
liberación prolongada en el ojo y el tratamiento de infecciones oftálmicas (ver
abajo).
Si bien la HPβ-CD prístina redujo los niveles de ARN del VHC, no se evidenció un
efecto antiviral sinérgico en los complejos TSC/CD. Estos resultados confirmaron
que los complejos no deben ser considerados una mera combinación de ambos
componentes sino que en algunos casos despliegan las propiedades de una nueva
entidad química.
155
Por otro lado, la disminución de TGO/TGP coincidió con la disminución de los
niveles de ARN-VHC en todas las muestras, lo que sugirió fuertemente que la
inhibición in vitro de la replicación viral en ambos sistemas de replicón normalizó
los niveles de transaminasas (Tabla IV. 3. 1). Si bien este parámetro podría ser
útil para una evaluación preliminar de actividad antiviral, la determinación de la
concentración de ARN viral extracelular (en el sobrenadante) e intracelular, no
podrá ser obviada en estudios posteriores.
Finalmente, debido a la biocompatibilidad de HPβ-CD y su amplia aplicación como
excipiente farmacéutico para la administración de fármacos por diferentes vías,
estos complejos pueden constituir una plataforma útil para el desarrollo
nanotecnológico avanzado de sistemas de administración de fármacos con mejor
solubilidad y biodisponibilidad de TSCs en etapas de estudio preclínico.
156
IV.
4.
EVALUACIÓN
DE
LA
ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA
DE
TIOSEMICARBAZONAS INCLUIDAS EN LENTES DE CONTACTO BLANDAS E
HIDROGELES FUNCIONALIZADOS CON CICLODEXTRINAS
Artículo científico IV. Contact Lenses of pHEMA-co-β -cyclodextrin for the
delivery of a novel antimicrobial thiosemicarbazone in the treatment of
ocular infections. Manuscrito en preparación 2012.
El empleo de SLCs impregnadas con fármacos está siendo evaluado para el
tratamiento de enfermedades tales como el glaucoma, infecciones oculares u
otras dolencias de relevancia [73,74]. La mayor ventaja de estos sistemas
terapéuticos es que prolongan la permanencia del fármaco en el área precorneal.
Así, con el uso de las mismas se pretende incrementar la biodisponibilidad ocular,
mejorar la eficacia de los tratamientos utilizando dosis reducidas, minimizar la
absorción sistémica y simplificar la posología para mejorar el cumplimiento de los
regímenes terapéuticos. A su vez, estas mismas SLCs impregnadas de fármaco son
las que diseñadas convenientemente podrían además corregir posibles defectos
relacionados con la visión [73,74]. La presente sección tuvo como objetivo
mostrar la aplicación potencial de la plataforma tecnológica desarrollada durante
esta tesis doctoral en la resolución de un problema clínico concreto y contribuyó a
avizorar las aplicaciones futuras de estas investigaciones.
El estudio presentado en esta sección se planeó en base al extenso conocimiento
previo de las TSCs como agentes quimioterápicos y la capacidad de las CDs para
complejar dichas moléculas y sostener su liberación en el tiempo [28,46,84]. En
este contexto, se desarrollaron SCLs funcionalizadas con CDs a las que se
incorporó TSC durante o luego de la síntesis. El empleo de TSC4 como droga
modelo se debió a que este compuesto demostró actividad antibacteriana y
antimicótica de amplio espectro en estudios previos.
El desarrollo experimental de las SCLs fue llevado a cabo en colaboración con el
Laboratorio
de
Ciclodextrinas,
Departamento
de
Farmacia
y
Tecnología
Farmacéutica, (Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela,
España) a cargo de los Profesores Carmen Alvarez-Lorenzo y Angel Concheiro a
través de una estancia en dicho laboratorio financiada por la Red Temática “RED
IBEROAMERICANA DE NUEVOS MATERIALES
PARA EL DISEÑO DE SISTEMAS
AVANZADOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS EN ENFERMEDADES DE ALTO IMPACTO
SOCIOECONÓMICO” del Programa CYTED. Los ensayos microbiológicos se realizaron
157
en el Laboratorio de Resistencia Bacteriana bajo la dirección del Prof. Gabriel
Gutkind (Cepario de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos
Aires).
IV. 4. 1. Síntesis y caracterización de hidrogeles a base de pHEMA-co-β
β -CD, HPβ
βCD y HPβ
β -CD/HPMC
La síntesis del monómero metacrilato-β-CD se reprodujo tal como fuera reportado
previamente (ver Capítulo III. 4. 1) [116,117]. El objetivo de sintetizar dicho
mónomero fue disponer de CDs ancladas covalentemente dentro del entramado
polimérico de la SCL que sirvan como cavidades para la formación de complejos de
inclusión con TSCs. El análisis ATR/FT-IR puso de manifiesto la aparición de una
banda en 1720.0 cm-1 característica de los grupos éster y un incremento de la
absorbancia en 1638.0 cm-1, debido a los estiramientos de enlaces C=C del
metacrilato. Estos datos coincidieron con los descriptos anteriormente y fueron
confirmatorios de la obtención del monómero [117].
La síntesis de los hidrogeles a base de pHEMA-co-βCD fue llevada a cabo siguiendo
las técnicas convencionales de polimerización por radicales libres utilizando un
agente entrecruzante y un iniciador de la polimerización (Capítulo III. 4. 2) [117].
Como el monómero metacrilato-β-CD es soluble en HEMA (mientras que la β-CD
prísitina es insoluble), se pudo confirmar de manera indirecta la modificación de βCD en el paso de solubilización del derivado en HEMA [117]. La proporción del
agente reticulante se fijó en 8mM, mientras se fue variando la cantidad de
monómero a base de CD, para que el entramado tuviese un tamaño de malla
suficiente como para permitir la difusión de macromoléculas con tamaño mayor al
de una CD y las moléculas de CDs se vieran incrementadas en número. Los
entramados se lavaron con abundante agua a ebullición para eliminar restos de
monómeros que no reaccionaron. Además, este lavado con agua hirviendo permitió
que los hidrogeles se cortaran más fácilmente en forma de discos de 10 mm de
diámetro, ya que el material se torna blando y maleable; de lo contrario se
endurece y la presión ejercida para el corte puede conducir al quiebre del mismo.
Se estudiaron dos técnicas de incorporación de la TSC4: (i) carga DP y (ii) carga PP.
La carga de la TSC4 en su forma PP tuvo además 3 variables experimentales: (i)
agitación 24 h con una suspensión de TSC4, (ii) agitación de 96 h con una
suspensión de TSC4 y (iii) autoclavado a 121° C durante 20 min de una suspensión
158
de TSC4. Las condiciones utilizadas en el autoclave fueron demasiado drásticas y
provocaron la degradación de la TSC4, por lo cual dicha técnica fue descartada. La
degradación de la droga fue evidenciada por espectrofotometría UV-Vis. Asimismo,
se evaluó que la pérdida de TSC4 de los hidrogeles con o sin monómero
metacrilato-β-CD por la técnica DP fue prácticamente despreciable. Esta
evaluación se realizó controlando la absorbancia al UV-Vis del agua de lavado a
ebullición de los hidrogeles sintetizados con la TSC4 DP.
La síntesis de hidrogeles super-hidrofílicos a base de HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC fue
llevada a cabo como se detalla en el Capítulo III. 4. 3. Estos hidrogeles suelen
conocerse como “geles de tubo”, y se emplearon como una variante para la
incorporación de TSC4.
Todos los hidrogeles mostraron una elevada transparencia (transmitancia a 600nm
superior al 90%). Estos resultados sugirieron una correcta polimerización [75,117].
Los hidrogeles a los que se incorporó TSC4 PP, mostraron cierta opalescencia
debido a que la carga del fármaco se realizó desde una suspensión. Dicha
opalescencia se incrementó a mayor tiempo de agitación. Por el contrario, los
hidrogeles que incorporaron TSC4 DP fueron completamente translúcidos.
El análisis ATR/FT-IR permitió diferenciar las técnicas de incorporación de TSC4 de
manera eficaz (Tabla IV. 4. 1). Las bandas características de la TSC4 libre se
encontraron en (cm-1): 3354.0 ν (NH st); 3195.4 ν (NH st); 1603.1 ν (C=N st); 1522.9
ν {C(S)-N st}; 1487.9 ν (C=S st). Las bandas características del grupo N4-alilo se
observaron en (cm-1): 1643.1, 955.3 y 921.6 ν (CH2-CH=CH2 st). Las mínimas
diferencias de desplazamiento encontradas con respecto al análisis FT-IR durante
la etapa de caracterización del compuesto (Capítulo IV. 1. 1) se debieron
probablemente a que este ensayo fue realizado utilizando ATR/FT-IR directamente
sobre el polvo cristalino, mientras que en el estudio anterior se utilizaron pastillas
de KBr. En sistemas PP, se evidenciaron las señales de la TSC4 levemente
desplazadas debido a la existencia de algún tipo de interacción de la TSC con la CD
o con el entramado polimérico del hidrogel (Tabla IV. 4. 1). En el caso de sistemas
DP, las señales características de la TSC4 desaparecieron y los espectros fueron
idénticos a los de los controles (0, 100 y 200 mg/ml de monómero) sin carga de
TSC4.
159
Tabla IV. 4. 1. Señales químicas de los hidrogeles a base de pHEMA-co-βCD cargados con
TSC4 DP y PP, analizadas por ATR/FT-IR acoplado a microscopio óptico.
Señales ATR/FT-IR (cm-1)
DP
PP
3564.6
3399.8
3386.3
3272.3
0+TSC4
3177.9
1705.1
1704.5
1537.5
1491.7
3398.7
3387.1
3275.1
100+TSC4
1704.6
1704.9
1538.0
1488.1
3564.9
3399.5
3432.2
3272.8
200+TSC4
3176.9
1706.2
1706.3
1536.6
1491.5
Los valores 0, 100 y 200, corresponden a 0, 100, y 200 mg/ml de monómero metacrilato-β-CD, en
ambos casos.
Tratamiento
Las señales que fueron comunes a sistemas DP y PP, correspondieron a los grupos –
OH, característicos de pHEMA, entre 3386.3-3432.2 cm-1 y a los grupos amida y
ésteres a 1704.5-1706.3 cm-1 (Tabla IV. 4. 1). Esto coincidió con datos ya
reportados para este tipo de hidrogeles [75,117].
La razón por la cual las señales del fármaco se hicieron presentes en el método PP,
se debió a que cuando las SLCs funcionalizadas con CDs se sumergieron en una
disolución concentrada de TSC4, los hidrogeles pudieron captarla y alojarla en la
fase acuosa, en la cavidad de la CD o en el entramado polimérico mediante
adsorción inespecífica, aún a nivel superficial. Este último fenómeno provocó el
aumento de la opalescencia, a diferencia de las SLCs que incorporaron TSC4 DP,
que fueron translúcidas y que a su vez no mostraron las señales correspondientes a
la TSC en el análisis ATR/FT-IR.
Antes de evaluar la liberación de la TSC4 en FLA, los estudios de FT-IR permitieron
establecer cualitativamente la presencia de la misma en sistemas PP. Por el
contrario, esto no fue posible en el caso de sistemas DP debido a la ausencia de
señales de TSC4 en los productos obtenidos. Así, los estudios de liberación en FLA
fueron cruciales para establecer también la carga de fármaco en cada sistema y
estudiar el efecto de los diferentes parámetros sobre los perfiles de liberación.
160
IV. 4. 2. Carga y liberación de TSC en FLA
Una vez incorporada la TSC4 a los hidrogeles, se estudiaron los perfiles de
liberación en un volumen de FLA suficiente para generar condiciones sink. En la
Figura IV. 4. 1 se muestran los perfiles de liberación obtenidos en las distintas
condiciones de incorporación de TSC, considerando las distintas proporciones
utilizadas de monómero metacrilato-β-CD y los hidrogeles super-hidrofílicos. El
sistema de SLCs que incorporó TSC4 DP mostró un perfil de liberación sostenida
donde toda la cantidad de TSC4 que se solubilizó en HEMA (1mg/ml) fue liberada
al medio de FLA. El hidrogel sin monómero de CD fue el que menor cantidad de
TSC4 liberó (Figura IV. 4. 1A).
Por otro lado, el sistema que incorporó mayor cantidad de la TSC4 fue el PP con
un % de monómero metacrilato-β-CD de 10% p/v con agitación durante 24 h
(Figura IV. 4. 1, B). El aumento de la concentración de CD de 10 a 20% p/v no
mejoró la carga de la TSC4 ni tampoco modificó la velocidad de liberación. Estos
datos sugirieron que la TSC4 podría estar interactuando en la cavidad de CD. Los
perfiles de liberación en cada sistema con monómero y sin monómero siempre
mostraron el mismo tipo de perfil, aunque dependiendo del sistema se
incorporaron mayores o menores cantidades de fármaco.
En la Figura IV. 4. 1C se presenta el perfil de liberación intermedio, donde la
carga fue prácticamente idéntica, independientemente de la presencia o no del
monómero de CD. Esto fue debido a que este sistema se agitó durante 96 h,
provocando la liberación paulatina del fármaco ya cargado. Así, los tres sistemas
cargaron la misma cantidad de TSC4 y no se evidenciaron diferencias significativas
entre ellos. En base a esto, se concluyó que 96 h resultó un tiempo de agitación
demasiado largo, que no mejoró la carga y que el equilibrio se alcanzó a tiempos
más cortos. Los sistemas que incorporaron la menor cantidad de TSC4 fueron los
hidrogeles super-hidrofílicos (Figura IV. 4. 1D). Este resultado fue esperado por
las
características
hidrofóbicas
del
fármaco
y
su
solubilidad
acuosa
extremadamente baja. Por otro lado, es importante remarcar que los sistemas A-C
fueron capaces de sostener la liberación de la TSC por dos semanas. A partir de
estos resultados, se podrían llevar a cabo estudios para ajustar la carga de
fármaco como para garantizar concentraciones en el ojo dentro de la ventana
terapéutica y sostener la misma durante el período requerido por una terapia
específica.
161
800
A
3500
600
3000
400
2500
200
2000
0
0
1500
5
10
15
20
25
1000
0mg/mL Monómero Beta-CD
100mg/mL Monómero Beta-CD
200mg/mL Monómero Beta-CD
500
0
0
40
80
120
160
200
240
280
320
4000
Liberación TSC4 (µ
µg/g hidrogel)
Liberación de TSC4 (µ
µg/g hidrogel)
4000
B
3500
3000
2500
2000
1500
1000
0 mg/mL Monómero Beta-CD
100mg/mL Monómero Beta-CD
200mg/mL Monómero Beta-CD
500
0
360
0
40
80
120
160
200
240
320
360
4000
4000
C
3500
1000
300
250
3000
400
200
2500
350
3500
800
600
3000
Liberación TSC4 (µ
µg/g hidrogel)
Liberación TSC4 (µg/g hidrogel)
280
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
200
150
2500
0
0
5
10
15
20
25
100
50
2000
2000
0
0
5
10
15
20
25
1500
1500
HPBeta-CD/HPMC
HPBeta-CD
1000
1000
0mg/mL Monómero Beta-CD
100mg/mL Monómero Beta-CD
200mg/mL Monómero Beta-CD
500
0
0
40
80
120
160
200
240
280
320
360
Tiempo (horas)
500
0
0
40
80
120
160
200
240
280
320
360
Tiempo (horas)
Figura IV. 4. 1. Perfiles de liberación de TSC4 en FLA expresada en µg a partir de hidrogeles preparados con distintas proporciones de
monómero metacrilato-β-CD (A-C) e hidrogeles a base de HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC (D), durante 14 días, a 25° C. Método DP (A), método PP,
agitación 24 h (B), método PP, agitación 96 h (C), y método PP, agitación 24 h (D). Los recambios de medio para mantener las condiciones
sink en cada sistema fueron diferentes: a partir de 30 h (A), 4 h (B), 24 h (C), y 8 h (D). Gráficos insertados mostrando el perfil de liberación
durante las primeras 24 h en aumento (A,C,D). Todos los datos fueron expresados como la media ± S.D. de al menos 3 experimentos
independientes.
162
IV. 4. 3. Evaluación del grado de hinchamiento de hidrogeles a base de pHEMAco-β
β-CD, HPβ
β -CD y HPβ
β-CD/HPMC
En la Figura IV. 4. 2A se muestran los perfiles de hinchamiento de los hidrogeles
a base de pHEMA-co-βCD en FLA: (i) controles sin carga de TSC4 (0, 100 y 200), y
DP (0+TSC4, 100+TSC4 y 200+TSC4).
Los discos secos captaron rápidamente FLA, alcanzándose el equilibrio de
hinchamiento luego de 48 h, cuando finalizó el ensayo. El grado de hinchamiento
fue entre un 43-93% para todos los hidrogeles, lo que indicó una elevada afinidad
por el FLA. Sin embargo, se observó una disminución de la captación a mayor % de
monómero metacrilato-β-CD en el hidrogel, independientemente de la carga de
TSC4. Este comportamiento se debió al mayor grado de entrecruzamiento y a la
menor hidrofilicidad de las redes poliméricas en presencia de la CD. Por el
contrario, el grado de hinchamiento cuando el hidrogel no contuvo monómero a
base de CD, fue del 90-100%, mientras que alcanzó hinchamientos intermedios
(67%) con 10% p/v de monómero. Si bien, la cantidad de monómero metacrilato-βCD aumentó en la mayoría de los casos la cantidad de TSC4 incoporada, redujo la
captación de medio acuoso, y de esta forma el grado de hinchamiento resultó
hasta un 50% menor que en el caso de su contraparte sin monómero de CD.
B
110
Q t (%)
Q t (%)
A
100
90
80
650
550
450
70
60
350
50
250
40
30
0
100
200
0+TSC4
100+TSC4
200+TSC4
20
10
0
150
50
-50
-10
-10
0
10
20
30
40
HPBeta-CD
HPBeta-CD/HPMC
50
Tiempo (horas)
-10
0
10
20
30
40
50
Tiempo (horas)
Figura IV. 4. 2. (A) Perfil de hinchamiento en FLA de los hidrogeles a base de pHEMA-coβCD. 0, 100 y 200 mg/ml es la concentración de monómero metacrilato-β-CD en el
hidrogel sin TSC4. 0+TSC4, 100+TSC4 y 200+TSC4 es la concentración de monómero
metacrílico de β-CD, conteniendo TSC4 y obtenido por la técnica DP. (B) Perfil de
hinchamiento en FLA de los hidrogeles a base de HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC. Todos los datos
fueron expresados como la media ± S.D. de al menos 3 experimentos independientes.
163
Asimismo, se evaluó el hinchamiento de los hidrogeles super-hidrofílicos y
superabsorbentes de HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC que llegaron a superar más de 4
veces su peso seco inicial (Figura IV. 4. 2B). Los valores más elevados
correspondieron a los sistemas de HPβ-CD/HPMC. Esto fue consistente con otros
trabajos donde se ha descripto que este tipo de hidrogeles pueden captar varias
veces su peso en agua [118].
IV. 4. 4. Evaluación de la actividad antimicrobiana de hidrogeles a base de
pHEMA-co-β
β-CD, HPβ
β -CD y HPβ
β-CD/HPMC cargados con TSC
Los ensayos microbiológicos fueron llevados a cabo con el objetivo de elucidar si
las cantidades de TSC4 cargadas en las CDs ancladas a los hidrogeles de pHEMAco-β-CD, HPβ-CD y HPβ-CD/HPMC fueron suficientes y su velocidad de liberación
adecuada para inhibir el crecimiento de microorganismos sensibles a TSC4 en 24
h. Para ello, se evaluaron dos bacterias con implicancia en infecciones oculares,
Staphylococcus aureus (bacteria Gram-positiva) y Pseudomona aeruginosa
(bacteria Gram-negativa), en ensayos de placa. Se evaluaron los siguientes
dispositivos: (i) disco control impregnado con TSC4 (200µg) solubilizado
previamente en DMSO y secado, (ii) SCL de pHEMA-co-β-CD con TSC4 obtenida por
método DP, (iii) SCL de pHEMA-co-β-CD con TSC4 obtenida por método PP
(agitación de 24 h), (iv) SCL de pHEMA-co-β-CD sin TSC4 y (v) disco control
impregnado con DMSO y secado sin TSC4 (ver Capítulo III. 4. 6). El estudio utilizó
en todos los casos las SCLs sintetizadas con 10% p/v del monómero metacrilato-βCD, ya que estos sistemas mostraron los mejores resultados de captación y
liberación de TSC4. Los resultados demostraron la inhibición del desarrollo
bacteriano, aunque las zonas de inhibición no fueron de gran superficie a las 24 h
de incubación (Figura IV. 4. 3).
164
A
(A)
C
B
1
3
2
4
1
2
3
4
D
Figura IV. 4. 3. Zonas de inhibición frente a (A-B) Staphylococcus aureus y (C-D)
Pseudomona aeruginosa después de 24 h de incubación sobre placas de ágar Müller-Hinton
con TSC4 y discos impregnados con TSC4. (B y D) aumento de (A y C): (1) Disco
impregnado con 200µg de TSC4, (2) control de SCL sin TSC4, (3) SCL impregnada con TSC4
durante 24 h de agitación, (4) SCL impregnada con TSC4 durante la polimerización del
monómero metacrilato-β-CD (se observa un halo, que es atribuido a que la TSC4 no ha
logrado difundir de la SLC en el tiempo de incubación). El ensayo fue evaluado utilizando
SCL a base de pHEMA-co-β-CD con 10% p/v de monómero metacrilato-β-CD.
Es importante tener en cuenta que la liberación de la TSC4 se estudió
previamente en FLA y que las condiciones de difusión en el ágar fueron
probablemente muy diferentes. Un estudio más exhaustivo, llevado a cabo en
medio de cultivo líquido sería más apropiado para este tipo de sistemas de
liberación. Además, la liberación de la TSC4 desde las SLCs que contienen CDs
unidas covalentemente a la red polimérica fue más lenta que la que tuvo lugar en
complejos solubilizados directamente en medio de cultivo y utilizados para
evaluar la actividad anti-VHC [82]. Por último, si bien no se observaron zonas de
inhibición muy marcadas lo cual podría atribuirse a limitaciones intrínsecas del
ensayo, las muestras cargadas con TSC4 no mostraron en ningún caso desarrollo
microbiano debajo de la superficie de la SCL que estuvo en contacto directo con
165
el ágar, sugiriendo que el TSC4 despliega actividad antibacteriana contra estos
dos patógenos (Figura IV. 4. 4). Estos resultados, reportados por primera vez en la
presente tesis doctoral, constituyen una evidencia adicional del potencial de estos
compuestos en el tratamiento de un amplio espectro de infecciones. Por el
contrario, en la muestra control, la superficie permitió dicho crecimiento (Figura
IV. 4. 4, indicado con flecha). Estos ensayos también confirmaron que la SCL per
se no tuvo actividad antibacteriana.
Figura IV. 4. 4. Figura representativa de SLCs sobre placas de agar Müller-Hinton. La
flecha indica una SLC control, donde se observa crecimiento bacteriano (Staphylococcus
aureus) en su superficie de apoyo, mientras que dicho desarrollo no se observa en
muestras conteniendo TSC4 (SLCs cargadas con TSC4 a cada lado de SLC control).
166
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
167
168
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
A continuación, se mencionan las principales conclusiones a las que se arribó
en esta tesis doctoral. Asimismo, se plantean las perspectivas de trabajo que
surgen de la misma, sentando las bases para futuros desarrollos en el área.
En este trabajo de tesis doctoral se caracterizaron exhaustivamente la estabilidad
fisicoquímica y las propiedades de agregación de novedosas tiosemicarbazonas
derivadas de 1-indanonas con potencial actividad antimicrobiana, previamente a
la vehiculización de las mismas en un nanotransportador eficaz.
Se obtuvieron evidencias concretas de la autoagregación de estos derivados en
medio acuoso y se profundizó en dicho estudio para avanzar en el conocimiento de
los parámetros que gobiernan la agregación molecular. Este tipo de estudio no
había sido conducido para compuestos conteniendo la agrupación TSC con
anterioridad, a pesar de que algunos otros derivados de TSCs se encuentren desde
hace años en estudios clínicos que puedan llevar a convertirlos en auténticos
fármacos.
La posibilidad del uso de CDs, como vehículo para mejorar la solubilidad y
prevenir la autoagregación de moléculas de TSCs en medio acuoso ha sido
exhaustivamente investigada. Las CDs son oligosacáridos macrocíclicos naturales
que combinan una nano-cavidad hidrofóbica con una superficie hidrofílica y se ha
demostrado que mejoran la solubilidad en agua y la estabilidad física de TSCs.
Todos los resultados obtenidos avalaron la hipótesis de que, la complejación de
TSCs utilizando CDs, resulta ser una estrategia nanotecnológica eficaz para
mejorar la solubilidad y la estabilidad de las TSCs en medio acuoso y la posterior
evaluación de su actividad in vitro. La solubilidad de las TSCs en medio acuoso fue
incrementada hasta 215 veces y se mantuvo estable durante 7 días. Por otro lado,
la mejora en la solubilidad de las TSCs complejadas con CDs, resultó en el
siguiente orden en todos los casos: Mβ-CD >> HPβ-CD > γ-CD = HPγ-CD = α-CD. A
partir del estudio por DLS se pudo concluir que la concentración de estos
complejos juega un importante rol en la posterior agregación de los mismos, y que
la agregación resulta mayor cuando se sobrepasa la CAC. A pesar de esto, los
agregados de complejos de inclusión TSC/CD son apropiados para mantener
solubles a las moléculas de TSC en medio acuoso durante un tiempo prolongado.
169
El conocimiento exhaustivo del comportamiento en medio acuoso de cada
complejo TSC/CD ha permitido evaluar a algunos de estos derivados en líneas
celulares de hepatoma humano a las que se han incorporado replicones de VHC,
con resultados promisorios. Es así que en este trabajo se describió la actividad
anti-VHC de dos novedosas TSCs derivadas de la 5,6-dimetoxi-1-indanona y sus
complejos de inclusión con HPβ-CD en sistemas de replicón FL y SG del VHC de
genotipo 1b. Se observó una potente supresión de los niveles totales de ARN viral
en ambas líneas celulares. La singularidad de nuestro estudio se basó en el hecho
de que se emplearon modelos in vitro para el estudio de actividad sobre el VHC y
no un modelo subrrogante, como VDVB. Es de destacar que la TSC3 fue
caracterizada, en paralelo al desarrollo de esta tesis doctoral, como un compuesto
que inhibe la RdRp del VDVB, modelo subrrogante de VHC de difícil cultivo in
vitro.
Por otra parte, teniendo en cuenta el extenso conocimiento previo sobre TSCs
como potenciales agentes quimioterápicos y sobre la capacidad de las CDs para
encapsular dichas moléculas, se aprovechó esta propiedad en la preparación de
SCLs funcionalizadas con CDs que incorporaron TSCs. Se evaluó cómo la velocidad
de liberación de la TSC4, incluida en la CD y anclada en el entramado polimérico,
se ve afectada en comparación con el comportamiento de los complejos TSC/CD
en solución. Se evaluó microbiológicamente la capacidad de liberación de la TSC4
desde los discos de hidrogel y la inhibición del crecimiento de una serie de
microorganismos de interés en patologías oculares.
El trabajo desarrollado en esta tesis doctoral sienta las bases para que moléculas
conteniendo el grupo TSC en su estructura, poco solubles en agua y con alta
tendencia a la autoagregación en medios acuosos, puedan ser estabilizadas
utilizando ciclodextrinas, con el objeto de optimizar la evaluación de su actividad
biológica.
170
CAPÍTULO VI
BIBLIOGRAFÍA
171
172
CAPÍTULO VI. BIBLIOGRAFÍA
1. G. Domagk, R. Behnisch, F. Mietzsch, H. Schmidt. On a new class of compounds
effective in vitro against tubercle bacilli. Naturwiss. 1946; 33, 315.
2. Z. Iakovidou, A. Papageorgiou, M. A. Demertzis, E. Mioglou, D. Mourelatos, A.
Kotsis, P. Nath Yadav and D. Kovala-Demertzi. Platinum (II) and Palladium (II)
complexes
with
2-acetylpyridine
thiosemicarbazone:
Cytogenetic
and
antineoplastic effects. Anti-Cancer Drugs 2001; 12, 65–70.
3. D. Sriram, P. Yogeeswari, P. Dhakla, P. Senthilkumar, D. Banerjee. Nhydroxythiosemicarbazones: Synthesis and in vitro antitubercular activity. Bioorg.
Med. Chem. Lett. 2007; 17, 1888–1891.
4. A.K. Halve, B. Bhashkar, V. Sharma, R. Bhadauria, A. Kankoriya, A. Soni, K.
Tiwari.
Synthesis
and
in
vitro
antimicrobial
studies
of
some
new
3-
[phenyldiazenyl] benzaldehyde N-phenyl thiosemicarbazones. J. Enzyme Inhib.
Med. Chem. 2008; 23, 77–81.
5. X. Du, C. Guo, E. Hansell, P.S. Doyle, C.R. Caffrey, T.P. Holler, J. H. McKerrow
and F. E. Cohen. Synthesis and structure−activity relationship study of potent
trypanocidal thiosemicarbazone inhibitors of the trypanosomal cysteine protease
cruzain. J. Med. Chem. 2002; 45, 2695–2707.
6. R.B. de Oliveira, E.M. de Souza-Fagundes, R.P. Soares, A.A. Andrade, A.U.
Krettli, C.L. Zani. Synthesis and antimalarial activity of semicarbazone and
thiosemicarbazone derivatives. Eur. J. Med. Chem. 2008; 43, 1983-1988.
7. I.C. Mendes, L.R. Teixeira, R. Lima, H. Beraldo, N.L. Speziali, D.X. West.
Structural and spectral studies of thiosemicarbazones derived from 3- and 4formylpyridine and 3- and 4-acetylpyridine. J. Mol. Struct. 2001; 559, 355-360.
8. W. Levinson, V. Coleman, B. Woodson, A. Rabson, J. Lanier, J. Whitcher, C.
Dawson. Inactivation of herpes simplex virus by thiosemicarbazones and certain
cations. Antimicrob. Agents Chemother. 1974; 5, 398-402.
9. Y. Teitz, D. Ronen, A. Vasover, T. Stematsky, J.L. Riggs. Inhibition of human
inmunodeficiency virus by N-methylisatin-β4’:4’-diethylthiosemicarbazone and Nallylisatin-β4’: 4’-diethylthiosemicarbazone. Antiviral Res. 1994; 24, 305-314.
10. W. Levinson, A. Faras, B. Woodson, J. Jackson, J.M. Bishop. Inhibition of RNAdependent DNA polymerase of rous sarcoma virus by thiosemicarbazones and
several cations. Proc. Nat. Acad. Sci. 1973; 70, 164-168.
173
11. Y. Yu, D.S. Kalinowski, Z. Kovacevic, A.R. Siafakas, P.J. Jansson, C. Stefani,
D.B. Lovejoy, P.C. Sharpe, P.V. Bernhardt, D.R. Richardson. Thiosemicarbazones
from the old to new: Iron chelators that are more than just ribonucleotide
reductase inhibitors. J. Med. Chem. 2009; 52, 5271-5294.
12. I.K.M. Morton, J.M. Hall in: Concise dictionary of pharmacological agents:
Properties
and
synonyms,
Kluwer
Academic
publishers,
Dordrecht,
The
Netherlands. 1999.
13. M.C. Pirrung, S.V. Pansare, K.D. Sarma, K.A. Keith, E.R. Kern. Combinatorial
optimization of isatin-beta-thiosemicarbazones as anti-poxvirus agents. J. Med.
Chem. 2005; 48, 3045-3050.
14. R.A. Finch, M.C. Liu, S.P. Grill, W.C. Rose, R. Loomis, K.M. Vasquez, Y.C.
Cheng,
A.C.
Sartorelli.
Triapine
(3-aminopyridine-2-carboxaldehyde-
thiosemicarbazone): A potent inhibitor of ribonucleotide reductase activity with
broad spectrum antitumor activity. Biochem. Pharmacol. 2000; 59, 983-991.
15. http://apps.who.int/medicinedocs/en/d/Js5513s/2.8.html. Modelo OMS de
información sobre prescripción de medicamentos: Medicamentos utilizados en las
enfermedades micobacterianas, Ginebra, 1992.
16. D.R. Richardson, D.S. Kalinowski, V. Richardson, P.C. Sharpe, D.B. Lovejoy,
Mohammad Islam, P.V. Bernhardt. 2-acetylpyridine thiosemicarbazones are potent
iron chelators and antiproliferative agents: Redox activity, iron complexation and
characterization of their antitumor activity. J. Med. Chem. 2009; 52, 1459-1470.
17. J. Yuan, D.B. Lovejoy, D.R. Richardson. Novel di-2-pyridyl-derived iron
chelators with marked and selective antitumor activity: In vitro and in vivo
assessment. Blood 2004; 104, 1450-1458.
18. T. Siatra-Papastaikoudi, A. Tsotinis, C.P. Raptopoulou, C. Sambani, H.
Thomou. Synthesis of new alkylaminoalkylthiosemicarbozones of 3-acetylindole
and their effect on DNA synthesis and cell proliferation. Eur. J. Med. Chem. 1995;
30, 107-114.
19. P. Tarasconi, S. Capacchi, G. Pelosi, M. Cornia, R. Albertini, A. Bonati, P.P.
Dall'Aglio, P. Lunghi, S. Pinelli. Synthesis, spectroscopic characterization and
biological properties of new natural aldehydes thiosemicarbazones. Bioorg. Med.
Chem. 2000; 8, 157-162.
174
20.
D.
Kessel,
R.
Stanley
McElhinney.
Antitumor
effects
of
bis
(thiosemicarbazones)-inhibition of deoxyribonucleic acid synthesis in vitro.
Biochem. Pharmacol. 1975; 24, 133-137.
21. C. Garcia, B. Brousse, M. Carlucci, A. Moglioni, M. Martins Alho, G. Moltrasio,
N. D 'Accorso, E.B. Damonte. Inhibitory effect of thiosemicarbazone derivatives on
Junin virus replication in vitro. Antiviral Chem. Chemother. 2003; 14, 99-105.
22. L.M. Finkielsztein, E.F. Castro, L.E. Fabian, G.Y. Moltrasio, R.H. Campos, L.V.
Cavallaro, A.G. Moglioni. New 1-indanone thiosemicarbazone derivatives active
against BVDV. Eur. J. Med. Chem. 2008; 43, 1767-1773.
23. E.F. Castro, L.E. Fabian, M.E. Caputto, D. Gagey, L.M. Finkielsztein, G.Y.
Moltrasio, A.G. Moglioni, R.H. Campos, L.V. Cavallaro. Inhibition of bovine viral
diarrhea virus RNA synthesis by thiosemicarbazone derived from 5,6-dimethoxy-1indanone. J. Virol. 2011; 85, 5436-5445.
24. L.M. Finkielsztein, G.Y. Moltrasio, M.E. Caputto, E.F. Castro, L.V. Cavallaro,
A.G. Moglioni. What is known about the antiviral agents active against bovine viral
diarrhea virus (BVDV)?. Curr. Med. Chem. 2010; 17, 2933-2955.
25. B.N. Brousse, R. Massa, A.G. Moglioni, M. M. Alho, N. D’ Accorso, G. Gutkind,
G.Y. Moltrasio. Antibacterial and antifungal activity of some thiosemicarbazones
and 1,3,4-thiadiazolines. J. Chil. Chem. Soc. 2004; 49, 45-49.
26. M.E. Caputto, L.E. Fabian, D. Benítez, A. Merlino, N. Ríos, H. Cerecetto, G.Y.
Moltrasio, A.G. Moglioni, M. González, L.M. Finkielsztein. Thiosemicarbazones
derived from 1-indanones as new anti-trypanosoma cruzi agents. Bioorg. Med.
Chem. 2011; 19, 6818-6826.
27. N. Gómez, D. Santos, R. Vázquez, L. Suescun, A. Mombrú, M. Vermeulen,
L.M. Finkielsztein, C. Shayo, A.G. Moglioni, D. Gambino, C. Davio. Synthesis,
structural
characterization,
thiosemicarbazone
platinum(II)
and
and
pro-apoptotic
palladium(II)
activity
of
complexes:
1-indanone
Potential
as
antileukemic agents. ChemMedChem. 2011; 6, 1485-1494.
28. R.J. Glisoni, D.A. Chiappetta, L.M. Finkielsztein, A.G. Moglioni, A. Sosnik.
Self-aggregation behaviour of novel thiosemicarbazone drug candidates with
potential antiviral activity. New J. Chem. 2010; 34, 2047-2058.
29. A.S. Qureshi, H. Qureshi, A. Hameed. Hepatitis C therapy-the future looks
bright. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2009; 28, 1409-1413.
30. D. Atwood, A. T. Florence. Surfactant systems: Their chemistry, pharmacy and
biology. Chapter 3, Micellization, Chapman and Hall. 1983; 72-117.
175
31. R. Espada, S. Valdespina, C. Alfonso, G. Rivas, M.P. Ballesteros, J.J. Torrado.
Effect of aggregation state on the toxicity of different amphotericin B
preparations. Int. J. Pharm. 2008; 361, 64-69.
32. P. Taboada, D. Attwood, J.M. Ruso, F. Sarmiento, V. Mosquera. Selfassociation of amphiphilic penicillins in aqueous electrolyte solution: A lightscattering and NMR study. Langmuir 1999; 15, 2022-2028.
33. A. Fini, G. Fazio, G. Feroci. Solubility and solubilization properties of nonesteroidal anti-inflammatory drugs. Int. J. Pharm. 1995; 126, 95-102.
34. P. Taboada, D. Attwood, J.M. Ruso, M. García, V. Mosquera. Thermodynamic
properties of some antidepressant drugs in aqueous solution. Langmuir. 2001; 17,
173-177.
35. D. Attwood, V. Mosquera, J.L. Lopez-Fontan, M. Garcia, F. Sarmiento. Selfassociation of phenothiazine drugs: Influence of the counterion on the mode of
association. J. Colloid Interface Sci. 1996; 184, 658-662.
36. Y.V. Frenkel, A.D. Clark, J.K. Das, Y-H Wang, P.J. Lewi, P.A.J. Janssen, E.
Arnold. Concentration and pH dependent aggregation of hydrophobic drug
molecules and relevance to oral bioavailability. J. Med. Chem. 2005; 48, 19741983.
37. D.A. Fernandez, J. Awruch, L.E. Dicelio. Synthesis and photophysical
properties of a new cationic water-soluble Zn phthalocyanine. J. Photochem.
Photobiol. B 1997; 41, 227-232.
38.
J.M.
López-Nicolás,
F.
García-Carmona.
Effect
of
hydroxypropyl-β-
cyclodextrin on the aggregation of (E)-resveratrol in different protonation states
of the guest molecule. Food Chem. 2010; 118, 648-655.
39. D. Atwood, E. Boitard, J.P. Dubés, H. Tachoire. A colorimetric study of the
influence of temperature on the self-association of amphiphilic antidepressant
drugs in aqueous solution. J. Colloid Interface Sci. 2000; 227, 356-362.
40.
A.J.
Kesel.
Broad-spectrum
antiviral
activity
including
human
immunodeficiency and hepatitis C viruses mediated by a novel retinoid
thiosemicarbazone derivative. Eur. J. Med. Chem. 2011; 46, 1656-1664.
41. M. Brewster, T. Loftsson. Cyclodextrins as pharmaceuticals solubilizers. Adv.
Drug. Del. Rev. 2007; 59, 645-666.
42. C. Alvarez-Lorenzo, F.R. Dos Santos, A. Sosnik, J. Torres-Labandeira, A.
Concheiro, In: Handbook of hydrogels: Properties, preparation and applications.
Stein D.B (Ed.), Nova Publishers, Hauppauge, NY, 61-102, 2009.
176
43. E.M. Martin del Valle. Cyclodextrins and their uses: A review. Process
Biochem. 2004; 39, 1033-1046.
44. T. Loftsson, M.E. Brewster. Pharmaceutical applications of cyclodextrin. 1.
drug solubilization and stabilization. J. Pharm. Sci. 1996; 85, 1017-1025.
45. T. Loftsson, D. Duchêne. Cyclodextrins and their pharmaceutical applications.
Int. J. Pharm. 2007; 329, 1-11.
46. R.J. Glisoni, D.A. Chiappetta, A.G. Moglioni, A. Sosnik. Novel 1-indanone
thiosemicarbazone antiviral candidates: Aqueous solubilization and physical
stabilization by means of
cyclodextrins.
Pharm. Res.
2011,
1-17;
DOI
:10.1007/s11095-011-0599-y.
47. J. Szejtli. Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure Appl.
Chem. 2004; 76, 1825–1845.
48. T. Loftsson, M. Másson, M.E. Brewster. Self-association of cyclodextrins and
cyclodextrin complexes. J. Pharm. Sci. 2004; 93, 1091-1099.
49. R. Challa, A. Ahuja, J. Ali, R.K. Khar. Cyclodextrin in drug delivery: An update
review. AAPS PharmSciTech 2005; 6, E329-E357.
50. K. Cal, K. Centkowska. Use of cyclodextrins in topical formulations: Practical
aspects. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2008; 68, 467-478.
51. J. Szejtli, T. Osa (Eds.). Comprehensive supramolecular chemistry.
Cyclodextrins, Ed. Pergamon, Oxford. 1996; 3.
52. H. Yang, M.A. Parniak, C.E. Isaacs, S.L. Hillier, L.C. Rohan. Characterization
of cyclodextrin inclusion complexes of the anti-HIV non-nucleoside reverse
transcriptase inhibitor UC781. AAPS Journal 2008; 10, 606-613.
53. T. Higuchi , K.A Connors. Phase solubility techniques. Adv. Anal. Chem.
Instrum. 1965; 4, 117-212.
54. M. Messner, S.V. Kurkov, P. Jansook, T. Loftsson. Self-assembled cyclodextrin
aggregates and nanoparticles. Int. J. Pharm. 2010; 387, 199-208.
55.
A.P.
Mukne,
M.S.
Nagarsenker.
Triamterene-β-cyclodextrin
systems:
Preparation, characterization and in vivo evaluation. AAPS PharmSciTech 2004; 5,
1-9.
56. T. Loftsson, D. Hreinsdóttir, M. Másson. The complexation efficiency. J. Inc.
Phenom. Macrocycl. Chem. 2007; 57, 545-552.
57. P. Jansook, T. Loftsson, γ-CD/HPγCD: Synergistic solubilization. Int. J. Pharm.
2008; 363, 217-219.
177
58. P. Jansook, S.V. Kurkov, T. Loftsson. Cyclodextrins as solubilizers: Formation
of complex aggregates. J. Pharm. Sci. 2010; 99, 719-728.
59. D. Zouvelekis, K. Yannakopoulou, I.M. Mavridis, E. Antoniadou-Vyza. The selfassociation of the drug acemetacin and its interactions and stabilization with βcyclodextrin in aqueous solution as inferred from NMR spectroscopy and HPLC
studies. Carbohydrate Res. 2002; 337, 1387-1395.
60. M.P. McIntosh, N. Leong, K. Katneni, J. Morizzi, D.M. Shackleford, R.J.
Prankerd. Impact of chlorpromazine self-association on its apparent binding
constants with cyclodextrins: Effect of SBE7-β-CD on the disposition of
chlorpromazine in the rat. J. Pharm. Sci. 2010; 99, 2999-3008.
61. Y. Ohtani, T. Irie, K. Uekama, K. Fukunaga, J. Pitha. Differential effects of
alpha-, beta- and gamma-cyclodextrins on human erythrocytes. Eur. J. Biochem.
1989; 186, 17-22.
62. M.E. Davis, M.E. Brewster. Cyclodextrin-based pharmaceutics: Past, present
and future. Nat. Rev. Drug Discov. 2004; 3, 1023-1035.
63.
http://www.viralshield.com/CompanyProfile.html.
Viral
Shield
Pharmaceuticals, Inc. preventing the spread of viruses around the world.
64. D.R.M. Graham, E. Chertova, J.M. Hilburn, L.O. Arthur, J.E.K. Hildreth.
Cholesterol depletion of human immunodeficiency virus type 1 and simian
immunodeficiency virus with β−Cyclodextrin inactivates and permeabilizes the
virions: Evidence for virion-associated lipid rafts. J. Virol. 2003; 77, 8237–8248.
65. C.M. Bremer, C. Bung, N. Kott, M. Hardt, D. Glebe. Hepatitis B virus infection
is dependent on cholesterol in the viral envelope. Cell Microbiol. 2009; 11, 249–
260.
66. S.M. Sagan, Y. Rouleau, C. Leggiadro, L. Supekova, P.G. Schultz, A.I. Su, J.P.
Pezacki. The influence of cholesterol and lipid metabolism on host cell structure
and hepatitis C virus replication. Biochem. Cell Biol. 2006; 84, 67-79.
67. S.B Kapadia, H. Barth, T. Baumert, J.A. McKeating, F.V. Chisari. Initiation of
hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between
CD81 and scavenger receptor B type I. J. Virol. 2007; 81, 374–383.
68. N. Grancher, V. Venard, F. Kedzierewicz, W. Ammerlaan, C. Finance, C.P.
Muller, A. Le Faou. Improved antiviral activity in vitro of ribavirin against measles
virus after complexation with cyclodextrins. Antiviral Res. 2004; 62, 135-137.
69. M. Bencini, E. Ranucci, P. Ferruti, F. Trotta, M. Donalisio, M. Cornaglia, D.
Lembo, R. Cavalli. Preparation and in vitro evaluation of the antiviral activity of
178
the acyclovir complex of a β-cyclodextrin/poly(amidoamine) copolymer. J.
Control. Release 2008; 126, 17–25.
70. C. Nicolazzi, V. Venare, A. Le Faou, C. Finance. In vitro antiviral efficacy of
the ganciclovir complexed with beta-cyclodextrin on human cytomegalovirus
clinical strains. Antiviral Res. 2002; 54, 121-127.
71. C. Udata, J. Patel, D. Pal, E. Hejchman, M. Cushman, A.K. Mitra. Enhanced
transport of a novel anti-HIV agent-cosalane and its congeners across human
intestinal epithelial (Caco-2) cell monolayers. Int. J. Pharm. 2003; 250, 157-168.
72. D. Gulsen, A. Chauhan. Ophthalmic drug delivery through contact lenses.
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004; 45, 2342-2347.
73. C. Alvarez-Lorenzo, H. Hiratani, A. Concheiro. Contact lenses for drug
delivery: Achieving sustained release with novel systems. Am. J. Drug Deliv.
2006; 4, 131-151.
74. C. Alvarez-Lorenzo, A. Concheiro. Lentes de contacto blandas medicadas.
Arch. Soc. Esp. Oftalmol. 2008; 83, 73-74.
75. J.F. Rosa dos Santos, C. Alvarez-Lorenzo, M. Silva, L. Balsa, J. Couceiro, J.J.
Torres-Labandeira, A. Concheiro. Soft contact lenses functionalized with pendant
cyclodextrins for controlles drug delivery. Biomaterials 2009; 30, 1348-1355.
76. J.F. Rosa dos Santos, J.J. Torres-Labandeira, N. Matthijs, T. Coenye. A.
Concheiro, C. Alvarez-Lorenzo. Functionalization of acrylic hydrogels with α-, βor γ-cyclodextrin modulates protein absoption and antifungal delivery. Acta
Biomaterialia 2010; 6, 3919-3926.
77. Q.L. Choo, G. Kuo, A.J. Weiner, L.R. Overby, D.W. Bradley, M. Houghton.
Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis
genome. Science 1989; 244, 359-362.
78. World Health Organization. Hepatitis C – global prevalence (update). Wkly.
Epidemiol. Rec. 1999; 74, 425-426.
79. http://www.who.int/csr/disease/hepatitis/whocdscsrlyo2003/en/index.html.
World Health Organization.
80. National Institutes of Health. Consensus development conference statement:
Management of hepatitis C, 2002.
81. J.B. Wong, G.M. McQuillan, J.G. McHutchison, T. Poynard. Estimating future
hepatitis C morbidity, mortality, and costs in the United States. Am. J. Public
Health 2000; 90, 1562-1569.
82. http://www.epidemic.org/thefacts/hepatitisc/hepatitisC
179
83. R. Bartenschlager, M. Frese, T. Pietschmann. Novel insights into hepatitis C
virus replication and persistence. Adv. Virus Res. 2004; 63, 71-180.
84. R.J. Glisoni, L.M. Cuestas, V. Mathet, J. Oubiña, A. Moglioni, A. Sosnik. Novel
1-indanone thiosemicarbazones and their inclusion complexes with hydroxypropylβ cyclodextrin: Antiviral activity against the hepatitis C virus (HCV). Manuscrito
enviado para su consideración. Pharm. Res. 2012.
85. X. Forns, R.H. Purcell, J. Bukh. Quasispecies in viral persistence and
pathogenesis of hepatitis C virus. Trends Microbiol. 1999; 7, 402-410.
86. C. Kuiken, P. Hraber, J. Thurmond, K. Yusim. The hepatitis C sequence
database in Los Alamos. Nucleic Acids Res. 2008; 36 (Database issue):D512-6.
Available: http://hcv.lanl.gov.
87. S. Brillantini, G. Mazella, E. Roda. Ribavirin for chronic hepatitis C: An the
mystery goes on. Digestive Liver Disease 2011; doi:10.1016/j.dld.2010.10.007.
88. M. Ikeda, N. Kato. Modulation of host metabolism as a target of new
antivirals. Adv. Drug Deliv. Rev. 2007; 59, 1277-1289.
89. N. Enmoto, I. Sakuma, Y. Asahina, M. Kurosaki, T. Murasaki, C. Yamamoto, N.
Izumi, F. Marumo, C. Sato. Comparision of full-length sequences of interferon
sensitive and resistant hepatitis C virus 1b. Sensitivity to interferon is conferred
by amino acid substitutions in the NS5A region. J. Clin. Invest. 1995; 96, 224-230.
90. J. Schinkel, W.J.M. Spaan, A.C.M. Kroes. Mutations in the NS5A gene and
hepatitis C virus resistance to interferon: Solving the controversy. J. Hepatol.
2001; 63, 8-16.
91. C.M. D´Abramo, L. Cellai, M. Gotte. Excision of incorporated nucleotide
analogue chain-terminators can dimish their inhibitory effects on viral RNAdependent RNA polymerases. J. Mol. Biol. 2004; 337, 1-14.
92. R.K.F. Beran, V. Serebrov, A. Marie Pyle. The serine protease domain of
hepatitis C viral NS3 activates RNA helicase activity by promoting the binding of
RNA substrate. J. Biol. Chem. 2007; 282, 34913-34920.
93. Y. Wang, Z. Zhu, P. Wang, J. Yu, L. Wan, J. Chen, M. Xiao. Characterization
of interaction between NS3 and NS5B protein of classical swine fever virus by
deletion of terminal sequences of NS5B. Virus Res. 2011; 156, 98-106.
94. K. Mori, M. Ikeda, Y. Ariumi, H. Dansako, T. Wakita, N. Kato. Mechanism of
action of ribavirin in a novel hepatitis C virus replication cell system. Virus Res.
2011; 157, 61-70.
180
95. N. Sakamoto, M. Watanabe. New therapeutic approaches to hepatitis C virus.
J. Gatroenterol. 2009; 44, 643-649.
96. P. Halfon, S. Locarnini. Hepatitis C virus resistance to protease inhibitor. J.
Hepatol. 2011; 55, 192-206.
97. V.E. Buckwold, B.E. Beer, R.O. Donis. Bovine viral diarrhea virus as a
surrogate model of hepatitis C virus for the evaluation of antiviral agents.
Antiviral Res. 2004; 60, 1-15.
98. K. Moriishi, Y. Matsuura. Evaluation systems for anti-HCV drugs. Adv. Drug
Deliv. Rev. 2007; 59, 1213-1221.
99. K. Koike, K. Moriya, Y. Matsuura. Animal models for hepatitis C and related
liver disease. Hepatol. Res. 2010; 40, 69-82.
100. Y. Amako, K. Tsukiyama-Kohara, A. Katsume, Y. Hirata, S. Sekiguchi, Y.
Tobita, Y. Hayashi, T. Hishima, N. Funata, H. Yonekawa, M. Kohara. Pathogenesis
of Hepatitis C Virus infection in tupaia belangeri. J. Virol. 2010; 1, 303-311.
101. R. Bartenschlager, V. Lohmann. Novel cell culture systems for the hepatitis C
virus. Antiviral Res. 2001; 52, 1-17.
102. F. Puig-Basagoiti, J.C. Sáiz. Replicones subgenómicos del virus de la hepatitis
C (VHC): Nuevas expectativas para la profilaxis y el tratamiento de la hepatitis C.
Gastroenterol. Hepatol. 2001; 24, 506-510.
103. R. Bartenschlager, A. Kaul, S. Sparacio. Replication of the hepatitis C virus in
cell culture. Antiviral Res. 2003; 60, 91-102.
104. M. Triyatni, E.A. Berger, B. Saunier. A new model to produce infectious
hepatitis C virus without the replication requirement. PLoS Pathog. 2011;
7(4):e1001333. doi:10.1371/journal.ppat.1001333.
105. M. Alho, A.G. Moglioni, B. Brousse, G.Y. Moltrasio, N.B. D´Accorso. Synthesis
and characterization of 2,2-disubstituted thiadiazolines. Arkivoc 2000; 4, 627640.
106. M.M. Hsieh, J.O. Dorsey. Bioavailability estimation by reversed-phase liquid
chromatography: High bonding density C-18 phases for modeling biopartitioning
processes. Anal. Chem. 1995; 67, 48–57.
107. D. Casoni, A. Kot-Wasik, J. Namiénisk, C. Sârbu. Lipophilicity data for some
preservatives estimated by reversed-phase liquid chromatography and different
computation methods. J. Chromatogr. A 2009; 1216, 2456–2465.
108. Z. Mrkvičková, P. Kovaříková, S. Balíková, J. Klimeš. Determination of
lipophilicity of novel potential antituberculotic agents using HPLC on monolithic
181
stationary phase and theoretical calculations. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008; 48,
310–314.
109. C. Hansch, A. Leo. Substituent constants for correlation analysis in chemistry
and biology. Wiley-Interscience, New York, 1st. Ed., 1979.
110. S.H. Yalkowsky, W. Morozowich, E.J. Ariens. A physical chemical basis for
the design of orally active prodrugs. Drug design Ed Academic Press, New York,
1980; 9.
111. T. Fujita, J. Iwasa, C. Hansch. A new substituent constant, π, derived from
partition coeffcients. J. Am. Chem. Soc. 1964; 86, 5175–5180.
112. C. Garnero, A. Zoppi, D. Genovese, M. Longhi. Studies on trimethoprim:
hydroxypropyl-β-cyclodextrin: Aggregate and complex formation. Carbohydrate
Res. 2010; 345, 2550-2556.
113. C. Okuse, J.A. Rinaudo, K. Fardar, F. Wells, B.E. Korba. Enhancement of
antiviral activity against hepatitis C virus in vitro by interferon combination
therapy. Antiviral Res. 2005; 65, 23-34.
114. K.J. Blight, J.A McKeating, C.M Rice. Highly permissive cell lines for
subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication. J. Virol. 2002;76,
13001–13014.
115. M.L, Cuestas, A. Sosnik, V. Mathet. Poloxamines display a multiple inhibitory
activity of ATP-binding cassette (ABC) transporters in cancer cell lines. Mol.
Pharmaceutics 2011; 8, 1152-1164.
116. R. Saito, K. Yamaguchi. Synthesis of bimodal methacrylic acid oligomers by
template polymerization. Macromol. 2003; 36, 9005-9013.
117. J.F. Rosa Dos Santos, R. Couceiro, A. Concheiro, J.J. Torres-Labandeira, C.
Alvarez-Lorenzo.
Poly(hydroxyethylmethacrylate-co-methacrylated-β-
cyclodextrin) hydrogels: Synthesis, cytocompatibility, mechanical properties and
drug loading/release properties. Acta Biomaterialia 2008; 4, 745-755.
118. B. Blanco-Fernandez, M. Lopez-Viota, A. Concheiro, C. Alvarez-Lorenzo.
Synergistic performance of cyclodextrin-agar hydrogels for ciprofloxacin delivery
and antimicrobial effect. Carbohydrate Polym. 2011; 85, 765-774.
119.
H.
Beraldo.
Semicarbazones
and
thiosemicarbazones:
Their
wide
pharmacological profile and clinical applications. Quím. Nova 2004; 27, 461–471.
120. I. Dilovic, M. Rubcic, V. Vrdoljak, S.K. Pavelic, M. Kralj, I. Piantanida, M.
Cindric. Novel thiosemicarbazone derivatives as potential antitumor agents:
182
Synthesis, physicochemical and structural properties, DNA interactions and
antiproliferative activit. Bioorg. Med. Chem. 2008; 16, 5189–5198.
121. S. Gould, R. Scott. 2-hydroxypropyl-β-ciclodextrin (HPβ-CD): A toxicology
review. Food Chem. Toxicol. 2005; 43, 1451-1459.
122. D.J.W. Grant, T. Higuchi. Solubility behavior of organic compounds.
Techniques of Chemistry. Wiley Interscience, New York, Chapter 10. 1990; 21.
123. European pharmacopeia, 3rd Ed., supplement 5.4. (Residual solvents), 2000,
p298.
124. M. Bonini, S. Rossi, G. Karlsson, M. Almgren, P. Lo Nostro, P. Baglioni. Selfassembly of β-Cyclodextrin in water. Part 1: Cryo-TEM and dynamic light
scattering. Langmuir 2006; 22, 1478-1484.
125. Y. He, P. F. X. Shen, H. Gao. Cyclodextrin-based aggregates and
characterization by microscopy. Micron 2008; 39, 495-516.
126. L. Szente, J. Szejtli, G.L. Kis. Spontaneous opalescence of aqueous γcyclodextrin solutions: Complex formation or self-aggregation? J. Pharm. Sci.
1998; 87, 778-781.
127. P. Jansook, M. D. Moya-Ortega, T. Loftsson. Effect of self-aggregation of γcyclodextrin on drug solubilization. J. Incl. Phenom. Macrocycl. Chem. 2010; 68,
229-236.
128. Surfactant micelle characterization using dynamic light scattering. Malvern
Instruments. Application Note, 2006.
129. M. Skiba, D. Duchêne, F. Puisieux, D. Wouessidjewe. Development of a new
colloidal drug carrier from chemically-modified cyclodextrins: Nanospheres and
influence of physicochemical and technological factors on particle size. Int. J.
Pharm. 1996; 129, 113-121.
130. A.M. Da Silveira, G. Ponchel, F. Puisieux, D. Duchêne. Combined
poly(isobutylcyanoacrylate) and cyclodextrins nanoparticles for enhancing the
encapsulation of lipophilic drugs. Pharm. Res. 1998; 15, 1051-1055.
131. M.J. Choi, A. Scoottitantawat, O. Nuchuchua, S.G. Min, U. Ruktanonchai.
Physical and light oxidative properties of eugenol encapsulated by molecular
inclusion and emulsion-diffusion method. Food Res. Int. 2009; 42, 148-156.
132. Y.T. Kim, B.K Shin, V.K. Garripelli, J.K. Kim, E. Davaa, S. Jo, J.S. Park. A
thermosensitive vaginal gel formulation with HPγCD for the pH-dependent release
and solubilization of amphotericin B. Eur. J. Pharm. Sci. 2010; 41, 399-406.
183
133. A.A. Smith, R. Manavalan, K. Kannan, N. Rajendiran. Spectral characteristics
of tramadol in different solvents and β-cyclodextrin. Spectrochim. Acta Part A
2009; 74, 469-477.
134. J. Li, M. Zhang , J. Chao, S. Shuang. Preparation and characterization of the
inclusion complex of baicalin (BG) with β-CD and HP-β-CD in solution: An
antioxidant ability study. Spectrochim. Acta Part A 2009; 73, 752–756.
135. B. Yavuz, E. Bilensoy, I. Vural, M. Şumnu. Alternative oral exemestane
formulation: Improved dissolution and permeation. Int. J. Pharm. 2010; 398, 137–
145.
136. N. Dupuy, D. Barbry, M. Bria, S. Marquis, L. Vrielynck, J. Kister. 1H-NMR
study of inclusion compounds of phenylurea derivatives in β-cyclodextrin.
Spectrochim. Acta Part A 2005; 61, 1051–1057.
137. S. Gibaud, S.B. Zirar, P. Mutzenhardt, I. Fries, A. Astier. Melarsoprolcyclodextrins inclusion complexes. Int. J. Pharm. 2005; 306, 107–121
138. J. Vermehren, C. Sarrazin. New hepatitis C therapies in clinical
development. Eur. J. Med. Res. 2011; 16, 303-314.
139. L. Matilainen, T. Toropainen, H. Vihola, J. Hirvonen, T. Järvinen, P. Jarho,
K. Järvinen. In vitro toxicity and permeation of cyclodextrins in Calu-3 cells. J.
Control. Release 2008; 126, 10-16.
184