Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología Fisiología bacteriana Luis A. Merino Fisiología bacteriana Las bacterias son capaces de realizar una serie de transformaciones químicas mediante reacciones enzimáticas que se traducen en síntesis de nuevos productos, transporte, movimiento y duplicación celular Se considera crecimiento bacteriano al aumento ordenado de todos los componentes celulares con el consiguiente aumento del número de células bacterianas, o sea que el resultado final del crecimiento bacteriano es la duplicación celular. El crecimiento bacteriano se inicia con la captación de nutrientes a partir del medio ambiente y los pasos intermedios entre la captación de nutrientes y la división celular constituyen el metabolismo bacteriano. El metabolismo bacteriano está compuesto de dos etapas: una de síntesis o Anabolismo y una de destrucción o Catabolismo. Durante el anabolismo o fase anabólica las sustancias simples se convierten en sustancias complejas y durante el catabolismo o fase catabólica las sustancias complejas se convierten en sustancias simples. El conocimiento de los requerimientos metabólicos y de las condiciones de crecimiento de las bacterias es útil para predecir la forma correcta de obtención, remisión y conservación de muestras clínicas, para seleccionar los medios de cultivo que se utilizarán en el diagnóstico y para estimar el tiempo necesario para que la bacteria alcance un número suficiente como para que su desarrollo se haga visible. Nutrición bacteriana Las bacterias deben obtener del medio ambiente los sustratos que serán utilizados para su crecimiento. Nutrición bacteriana es el proceso mediante el cual las bacterias captan nutrientes a partir del medio que las rodea. Dichos nutrientes deben estar en solución, aún aquellos que son gaseosos. Si bien los constituyentes generales de las bacterias son muy similares, la capacidad de captación de nutrientes y de síntesis de nuevos productos es muy variable entre distintas especies bacterianas Todas las bacterias necesitan para desarrollar ciertos elementos básicos como ser C, P, S, N y agua. Aunque muchas bacterias sólo requieren adicionalmente algunas moléculas simples para crecer (como ser aminoácidos y azúcares) y son consideradas nutricionalmente no exigentes (Pseudomonas, Escherichia, Staphylococcus), existen otras consideradas nutricionalmente exigentes que requieren además compuestos más complejos como vitaminas y cofactores para poder desarrollar (Haemophilus, Neisseria). Ciertas bacterias son incapaces de producir y almacenar su propia energía por lo que deben tomarla a partir de la célula que se encuentran infectando y se denominan bacterias energéticamente exigentes (Chlamydias y Rickettsias). Los dos primeros grupos mencionados son capaces de desarrollar en medios fabricados artificialmente en el laboratorio (in vitro) mientras que el último grupo sólo desarrolla en medios de cultivos que contengan células vivas. Absorción de nutrientes La encargada de la absorción selectiva de nutrientes es la membrana citoplasmática ya que la pared es porosa e impide solo el paso de elementos de gran tamaño insolubles o particulados. 1 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología A través de la membrana no sólo ingresan sustancias sino que muchas son eliminadas a través de ellas, tanto en procesos activos como pasivos. Transporte a través de la membrana plasmática La absorción de nutrientes se realiza a través de la membrana plasmática mediante los siguientes mecanismos de transporte: Difusión pasiva: se produce por diferencia de concentraciones de los nutrientes entre el interior celular y el medio ambiente (glicerol, agua, O2, CO2) Difusión facilitada: participan aquí ciertas proteínas de la membrana denominadas permeasas que permiten el paso de moléculas desde el exterior al interior celular (aminoácidos, azúcares). Transporte activo:. Este mecanismo implica un gasto de energía y constituyen las denominadas bombas de transporte, por ejemplo bombas de sodio, calcio, oxígeno, etc. Translocación de grupo: implican que la sustancia que ingresa pierde un grupo químico en el exterior y gana otro en el interior celular, es decir existe una alteración molecular (lípidos) Captación de hierro: debi-do a la alta carga que posee el ión Fe3+, éste debe unirse primero a ciertas proteínas denominadas sideróforos y recién así puede ser introducida a la célula bacteriana. En la figura de la izquierda se presentan ejemplos de los mecanismos de transporte transmembrana mencionados. Ciertas moléculas de gran tamaño deben ser previamente digeridas mediante enzimas que libera la bacteria (exoenzimas) para que recién puedan ser absorbidas las moléculas más pequeñas. Se mencionan ejemplos de moléculas de gran tamaño y las exoenzimas que las digieren: Almidón - amilasas, Proteínas proteasas, ADN - Desoxirribonucleasas, Gelatina - gelatinasas, Lípidos - lipasas y fosfolipasas. 2 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología No todas las especies bacterianas son capaces de producir todas las exoenzimas, por lo que el estudio de la producción de algunas de ellas es útil en la identificación de los géneros y especies. Requerimientos de O2 y CO2 En función de los requerimientos de O2 y CO2, las bacterias pueden clasificarse en: Bacterias aerobios estrictas: necesitan una concentración de alrededor del 21% de oxígeno para poder desarrollar. (Pseudomonas, Mycobacterium, Corynebacterium) Bacterias microaerófilas: sólo necesitan alrededor de un 5% de oxígeno para desarrollar. Mayores concentraciones inhiben su desarrollo. (Campylobacter, Helicobacter) Bacterias anaerobios obligadas o estrictas: son incapaces de sobrevivir en presencia de oxígeno, es decir requieren un 0% de oxígeno (Fusobacterium, Clostridium) Bacterias anaerobias aerotolerantes: pueden sobrevivir, aunque no crecer, en presencia de hasta un 0,5% de oxígeno. (Actinomyces, Propionibacterium) Bacterias anaerobias facultativas: son capaces de crecer en una atmósfera tanto con o sin oxígeno. (Streptococcus, Staphylococcus, Enterobacteriaceae) Bacterias capnófilas: son bacterias aerobias que necesitan además para crecer un 5-10% de CO2. (Neisseria, Haemophilus) Para estudiar en el laboratorio los requerimientos de oxígeno de las bacterias, se coloca la bacteria en un medio de cultivo en un tubo profundo (Tubo 1) y se lo incuba durante 24 horas a 37ºC. Al cabo de ese tiempo se observa el sitio en el cual desarrolló la bacteria. Si la bacteria desarrolló sólo en la superficie o sea en contacto con el oxígeno, la bacteria es aerobia estricta (Tubo A). Si en cambio sólo se verifica desarrollo en la profundidad del medio e cultivo, la bacteria es anaerobia estricta (Tubo B). Una bacteria microaerófila desarrollará a cierta distancia de la superficie, donde la concentración de oxígeno es baja (Tubo C) y una bacteria anaerobia facultativa desarrollará en todo el volumen del medio de cultivo (Tubo D) 24 hs 37 ºC Tubo 1 A B C D Temperatura óptima de crecimiento Las bacterias requieren diferentes temperaturas para desarrollar y sobrevivir. Esta característica es importante para comprender ciertas características patógenas de las bacteria, para entender sobre la forma en que las bacterias pueden transmitirse desde el medio ambiente al hombre y para mantener las muestras clínicas a la temperatura adecuada hasta su procesamiento en el laboratorio. 3 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología En base a su temperatura óptima de desarrollo y sobrevida, las bacterias se clasifican en: Bacterias Psicrófilas: soportan bajas temperaturas, entre 0 - 20ºC (Pseudomonas, Listeria) Bacterias Mesófilas: desarrollan mejor a temperaturas intermedias, entre 20 - 45ºC (Staphylococcus, Streptococcus) Bacterias Termófilas: son capaces de soportar altas temperaturas, de 55ºC o más (Bacterias no patógenas) Bacterias Estenotérmicas, son mesófilas pero sólo desarrollan y sobreviven en rangos estrechos de temperatura, entre 35 - 36ºC (Neisseria) Bacterias Euritérmicas: son capaces de sobrevivir en amplios rangos de temperatura, entre 0- 44ºC. (Enterococcus) Requerimientos de pH La concentración de iones hidrógeno en el medio condiciona el crecimiento de las bacterias. En función de su capacidad para desarrollar a diferentes pH, las bacterias pueden clasificarse en: Neutrófilas: entre 5,5 - 8,0 (Staphylococcus, enterobacterias) Acidófilas: entre 0,0 - 5,5 (Lactobacillus) Alcalófilas: entre 8,0 - 11,5 (Vibrio) El conocimiento del pH óptimo para el desarrollo de las bacterias permite conocer los equilibrios y cambios posibles dentro de los diferentes ecosistemas bacterianos existentes en el organismo, ya que existen bacterias que se aseguran un ambiente ácido para impedir el desarrollo de bacterias neutrófilas y alcalófilas. Obtención de energía Para poder desempeñar los procesos metabólicos, las bacterias, como todos los seres vivos deben producir y almacenar energía para luego poder reutilizarla. Sólo el grupo mencionado más arriba (energéticamente exigentes) es incapaz de obtener energía por sí solos. El proceso general de obtención y consumo de energía puede sintetizarse como sigue: Moléculas complejas Degradación producción de Energía Metabolitos intermedios Síntesis consumo de Energía Moléculas complejas Para obtener energía, las bacterias pueden valerse de diferentes mecanismos: A) Respiración aeróbica (Oxidación): Ocurre en presencia de oxígeno, es decir en aerobiosis. El sustrato es la glucosa u otro azúcar y el aceptor final de electrones es el oxígeno molecular. 4 Universidad Nacional del Nordeste Glucosa + O2 - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología CO2 + H2 O + 38 ATP La respiración aeróbica involucra los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. Glucólisis Decarboxilación oxidativa Ciclo de Krebs Transporte de electrones Durante el proceso de forman productos tóxicos (O2- y H2 O2) que deben ser transformados por la bacteria productora en O2 y agua mediante enzimas como la peroxidasa y la superóxidodismutasa. Este mecanismo es utilizado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas en aerobiosis. B) Respiración anaeróbica: Ocurre en ausencia de oxígeno. El sustrato es la glucosa u otros azúcares y los aceptores finales de electrones son iones inorgánicos. Glucosa + S CO2 + SH2 + 34 ATP La respiración anaeróbica involucra los siguientes pasos: 1. 2. 3. 4. Glucólisis Decarboxilación oxidativa Ciclo de Krebs Transporte de electrones Durante el proceso no se liberan productos tóxicos. Este mecanismo es utilizado por las bacterias anaerobias obligadas y las anaerobias facultativas en anaerobiosis. C) Fermentación: es un proceso que ocurre en ausencia de oxígeno. El sustrato es la glucosa u otros azúcares y los aceptores finales de electrones son moléculas orgánicas. Piruvato + NAD+ + ATP Glucosa + NADH La fermentación involucra los siguientes pasos: 1. Glucólisis 2. Degradación del piruvato 3. Productos con alta energía: ácido láctico, propiónico, butírico, acético, alcohol etílico, etc. Este mecanismo es utilizado por las bacterias anaerobias estrictas y anaerobias facultativas en anaerobiosis. Para estudiar el metabolismo energético de las bacterias, se siembran con la bacteria en estudio dos tubos conteniendo glucosa y un indicador de pH, uno de los cuales se cubre con vaselina líquida de manera tal de impedir que el medio de cultivo se ponga en contacto con el oxígeno ambiental (Tubos 1 y 2). Luego de 24 hs. de incubación a 37 ºC se observa lo ocurrido en ambos tubos. Un cambio de color de verde a amarillo en el medio de cultivo indica que la bacte- 5 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología ria a desarrollado y utilizado la glucosa como fuente de energía, produciendo una acidificación del medio con el consiguiente cambio en el color del indicador de pH. Si el cambio de color se evidencia en el medio expuesto al aire, significa que la bacteria utilizó la glucosa en presencia de oxígeno, es decir tubo lugar una oxidación (Tubo A) y la bacteria es oxidadora. Si el cambio de color ocurre en el medio tapado con vaselina, la utilización de la glucosa se realizó en ausencia de oxígeno, es decir ocurrió una fermentación (Tubo B) y la bacteria es fermentadora. Si no se registra cambio en ninguno de los tubos, significa que la bacteria es no glucidolítica, es decir, no es capaz de utilizar la glucosa como fuente de energía. 24 hs a 37ºC Tubos 1 y 2 A B C Medios de Cultivo Se denomina medio de cultivo al conjunto de sustancias que permiten el crecimiento de los microorganismos bajo determinadas condiciones de incubación (Tiempo, temperatura y oxígeno). Éstos deben reunir los nutrientes mínimos indispensables para que las bacterias puedan sobrevivir y desarrollarse. Los medios de cultivo cumplen un papel fundamental en el aislamiento de bacterias a partir de muestras clínicas y en la obtención de grandes cantidades de microorganismos para fabricar vacunas. Los medios de cultivo pueden clasificarse según su consistencia, su composición y la finalidad de uso. Según su consistencia Medios líquidos, también denominados caldos Medios sólidos, poseen una sustancia solidificante que generalmente es agar-agar, una sustancia que solidifica a temperatura ambiente y sólo sirve de soporte para los nutrientes. Al inicio de la Microbiología como ciencia sólo se podía obtener las bacterias en medios líquidos pero era muy difícil y a veces hasta imposible obtener en forma aislada dos bacterias que se encontraban juntas en una muestra. El desarrollo de medios de cultivos sólidos marca un hito importante dentro de la ciencia médica debido a que a partir de su aplicación en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas se ha podido recuperar a las bacterias en forma aislada para 6 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología poder realizarle las pruebas de identificación, sensibilidad a antimicrobianos e inoculación en animales (2º, 3º y 4º postulados de Koch) Según su composición Medios sintéticos o simples, poseen composición exactamente conocida, sólo contienen sustancias orgánicas e inorgánicas conocidas. Por ejemplo: agar glucosa, indicador de pH. Medios complejos: poseen una composición que sólo se conoce en parte ya que algunos de los ingredientes posee una composición variable Por ejemplo: medios con sangre, suero equino, yema de huevo, extracto de carne, etc. También se denominan medios enriquecidos. Según su finalidad Medios para aislamiento primario: son medios sólidos que se usan para obtener bacterias aisladas a partir de una muestra clínica. Son ejemplos de medios de aislamiento primario los siguientes: Agar nutritivo, Agar sangre, Agar chocolate, Agar Eosina-Azul de Metileno (E.M.B.), Agar Salmonella-Shigella (S.S.), Agar Manitol Salado, etc. Medios de enriquecimiento: son medios líquidos en los cuales se siembra inicialmente la muestra para aumentar el número de bacterias antes de ser subcultivado a un medio sólido. Son ejemplos de medios de enriquecimiento los siguientes: Caldo selenito, Caldo CerebroCorazón, Caldo Tioglicolato Medios de identificación: son medios líquidos o sólidos que permiten estudiar alguna característica metabólica de la bacteria como ser producción de enzimas. Son ejemplos de medios de identificación los siguientes: Agar triple azúcar hierro (TSI), Agar citrato, Agar urea, etc. Según sus propiedades Medios generales: Permiten el crecimiento de la mayoría de las bacterias presentes en la muestra. Por ejemplo: agar sangre, agar chocolate, agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo cerebro corazón. Medios selectivos: Permiten el crecimiento de sólo determinado tipo de bacteria presente en la muestra, impidiendo el desarrollo de otras debido a que contienen sustancias (antibióticos, colorantes, sales, etc.) que inhiben el desarrollo de ciertas bacterias. Por ejemplo: agar manitol salado (alta concentración de ClNa), Agar Thayer-Martin (presencia de antibióticos), agar EMB (contiene eosina y azul de metileno que inhiben a las bacterias grampositivas), etc. Medios diferenciales: Poseen sustancias que permiten diferenciar entre grupos bacterianos según determinadas características biológicas (hemólisis, fermentación de azúcares, precipitación de sales, etc) y permiten realizar una identificación presuntiva inicial de las bacterias presentes en la muestra. Son ejemplos: agar sangre (hemólisis), agar EMB (fermentación de lactosa), etc. Aislamiento primario Una vez obtenida la muestra clínica, para realizar el diagnóstico etiológico de la enfermedad infecciosa, o sea, para aislar al agente causal de la misma, es necesario sembrar (inocular) la muestra en medios de cultivo sólidos (y eventualmente líquidos si se desea realizar un enriquecimiento previo) (Ver figura inferior) 7 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología Muestras clínicas Sólido Medios de cultivo Líquido El objetivo de este paso es obtener colonias bacterianas aisladas. Se denomina colonia al conjunto de bacterias que provienen de una misma célula madre y en los medios de cultivo aparecen como acúmulos de miles de bacterias que pueden observarse a simple vista. Las colonias aisladas se obtienen diseminando la muestra sobre la superficie del agar con ayuda de un ansa bacteriológica. Las figuras siguientes muestran un esquema de cómo se disemina la muestra sobre la superficie del agar y una fotografía de colonias aisladas sobre una placa de agar EMB luego de 24 horas de incubación a 37ºC. Inicio de la siembra Incubar 24 hs a 37ºC Final de la siembra Duplicación bacteriana En organismos multicelulares la multiplicación celular se traduce en aumento del tamaño del individuo pero en organismos unicelulares el crecimiento se traduce en aumento del número de individuos. La duplicación bacteriana se produce por fisión binaria en la que la división del ADN y la división celular se llevan a cabo simultáneamente. El tiempo necesario para que se observen las colonias en un medio de cultivo adecuado y bajo condiciones de temperatura y atmósfera correctas dependerá del tiempo de duplicación celular de la bacteria en estudio. En la figura siguiente se esquematiza un proceso de duplicación bacteriano. 8 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología A continuación se presentan ejemplos de tiempos de división y del tiempo mínimo que debe esperarse para observar colonias en los medios de cultivo. Escherichia coli - División: 20 minutos - Colonias: 24 horas Clostridium botulinum - División: 35 minutos - Colonias: 48 horas Mycobacterium tuberculosis - División: 12 horas - Colonias: 30 días Cinética del crecimiento bacteriano Debido a que las bacterias se duplican en cada generación, la población bacteriana a través del tiempo aumentará en forma exponencial de 2. Número de bacterias Si se presenta el número de bacterias en función del tiempo, tendremos una curva exponencial pero si representáramos el ciclo vital de un grupo de bacterias tendríamos cuatro fases (Ver figura siguiente): 3 2 4 1 Tiempo 1. Fase de latencia: las bacterias se adaptan al medio en el que se encuentran, en este período el número de células no varía. El tiempo de adaptación es variable para las diferentes 9 Universidad Nacional del Nordeste - Facultad de Medicina - Microbiología e Inmunología bacterias. En esta etapa, por ejemplo, las esporas bacterianas se transforman en células vegetativas. 2. Fase exponencial: es aquí donde se inicia la multiplicación bacteriana, el número de bacterias aumenta exponencialmente y es aquí donde se liberan las enzimas y toxinas. 3. Fase estacionaria: llega un momento en que existe una competencia por los nutrientes ya que estos van disminuyendo en su concentración y las bacterias dejan de crecer. En este período las bacterias esporuladas comienzan a esporular. Algunas bacterias mueren pero otras se dividen por lo que el número de células se mantiene sin variaciones. 4. Fase de muerte: el número de bacterias comienza a disminuir debido a que las bacterias que mueren supera al número de bacterias que se dividen. En la práctica, este modelo de crecimiento bacteriano nos sirve para conocer cuánto tiempo deberá ser incubado un medio de cultivo con el objeto de que las bacterias en estudio siempre se encuentren en la fase de crecimiento exponencial, ya que es allí cuando se manifiestan todas sus propiedades bioquímicas y patogénicas. 10
