NTC4458

NORMA TÉCNICA
COLOMBIANA
NTC
4458
1998-09-23
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS
PARA ANIMALES.
GUÍA GENERAL PARA EL RECUENTO DE
COLIFORMES. TÉCNICA DE RECUENTO DE
COLONIAS
E:
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS. GENERAL GUIDANCE FOR THE ENUMERATION
OF COLIFORMS COLONY COUNT TECHNIQUE.
CORRESPONDENCIA:
esta norma es equivalente (EQV) a la
ISO 4832.
DESCRIPTORES:
análisis microbiológico; microbiología.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)
Apartado
14237
Bogotá,
D.C.
Tel.
6078888
Fax
2221435
Prohibida su reproducción
PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo nacional
de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el sector
gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en los
mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica
está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 4458 fue ratificada por el Consejo Directivo en 1998-09-23.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a través
de su participación en el Comité Técnico 000031 Microbiología.
ACEGRASAS
ASINAL
BIOASESORÍAS
BIOQUILAB LTDA
CALIDAD MICROBIOLÓGICA
CARULLA Y CÍA S.A.
CICOLAC
COLFRIGOS
COLSUBSIDIO
CONDIMENTOS EL REY
CREPES & WAFFLES
GASEOSAS LUX
INDEPENDIENTE
IVONNE BERNIER LABORATORIO
JUAN BANDERA Y CÍA
NESTLÉ DE COLOMBIA
POSTOBÓN
RICA RONDO
UNIVERSIDAD JORG TADEO LOZANO
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las
siguientes empresas:
ALPINA S.A.
ASEBIOL LABORATORIO LTDA
BAVARIA S.A.
CASA LUKER
CERVECERÍA LEONA S.A.
CONGELAGRO
DISA
INGENIO PROVIDENCIA S.A.
INGENIO RIOPAILA
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
INVIMA
LABORATORIOS GRAM
LLOREDA GRASAS S.A.
MEALS S.A.
MERCK
NULAB LTDA
QUIOS LTDA
SUIZO NOEL-ZENÚ
TRES M COLOMBIA S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
NTC 4458
MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.
GUÍA GENERAL PARA EL RECUENTO DE COLIFORMES.
TÉCNICA DE RECUENTO DE COLONIAS
1.
OBJETO
Esta norma da directrices generales para el recuento de microorganismos presentes en productos
destinados al consumo humano o alimentación de animales, por medio de la técnica de recuento
de colonias en un medio sólido después de incubación a 35 °C ± 2 °C.
2.
NORMAS QUE SE DEBEN CONSULTAR
Las siguientes normas contienen disposiciones que, mediante la referencia dentro de este
texto, constituyen disposiciones de esta norma. En el momento de su publicación eran válidas
las ediciones indicadas. Todas las normas están sujetas a actualización; los participantes,
mediante acuerdos basados en esta norma, deben investigar la posibilidad de aplicar la última
versión de las normas mencionadas a continuación.
ISO 6887:1983, Microbiology. General Guidance for the Preparation of Dilutions for Microbiological
Examination.
NTC 4206:1997, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas Generales para
los análisis microbiológicos. (ISO 7218:1997).
3.
DEFINICIÓN
Para los propósitos de esta norma se aplica la siguiente definición.
Coliformes: Bacterias que a la temperatura especificada (35 °C ± 2 °C) forman colonias
características en el medio agar - lactosa - bilis - rojo neutro - cristal violeta, o cualquier otro de
características similares, bajo las condiciones de ensayo especificadas en la presente norma.
4.
PRINCIPIO
4.1
Se realizan siembras usando un medio de cultivo selectivo y usando una cantidad
especificada de la muestra de ensayo si el producto inicial es líquido, o una cantidad especificada
de una suspensión inicial en el caso de otros productos.
1
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NTC 4458
Se realizan otras siembras en las mismas condiciones, usando diluciones decimales de la muestra
de ensayo o de la suspensión inicial.
4.2
Se incuban las placas a 35 °C ± 2 °C durante 24 h.
4.3
Se calcula el número de coliformes por mililitro o por gramo de muestra a partir del número
de colonias obtenido en las cajas seleccionadas (véase el numeral 10.1).
5.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTE
5.1
GENERALIDADES
Para los procedimientos de laboratorio corrientes, véase la NTC 4206 (ISO 7218).
5.2
DILUYENTE
Véase la norma ISO 6887 y la norma específica relacionada con el producto sometido a análisis.
5.3
MEDIO SELECTIVO
VIOLETA, VRBL
SÓLIDO:
AGAR-LACTOSA-BILIS-ROJO
NEUTRO-CRISTAL
Nota. Se utiliza el medio VRBL o cualquier otro similar preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Composición del medio VRBL
Peptona
Extracto de levadura
Lactosa
Cloruro de sodio
Sales biliares
Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua destilada o desionizada
7,0 g
3,0 g
10,0 g
5,0 g
1,5 g
0,03 g
0,002 g
12 g a 18 g 1
1 000 ml
Preparación
Se procede como se indica a continuación, para conservar la capacidad selectiva y especificidad
del medio.
Se mezclan muy bien en agua, los componentes o el medio completo deshidratado, y se dejan
reposar durante varios minutos. Se ajusta el pH de tal modo que después de la esterilización sea
7,4 °C a 25 °C.
Se permite que ebulla durante 2 min y se enfría inmediatamente el medio en un baño de agua
(véase el numeral 6.5) a 45 °C.
Se debe evitar el calentamiento excesivo del medio.
1
De acuerdo con la resistencia del gel del agar.
2
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En consecuencia, no se debe esterilizar en autoclave y se debe verificar la esterilidad del medio
en el momento de su uso. (véase el numeral 9.2.2)
El medio se debe usar dentro de un lapso máximo de 3 h desde el momento de su preparación.
6.
EQUIPO Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
Nota 1. El equipo y material desechable es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable si cumple con
las especificaciones adecuadas.
Se utiliza el equipo y material usual de laboratorio microbiológico y, en especial, lo siguiente.
6.1
APARATO PARA ESTERILIZACIÓN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIÓN EN
HÚMEDO (AUTOCLAVE)
Véase la NTC 4206 (ISO 7218).
6.2
INCUBADORA
Con capacidad de operar a 35 °C ± 2 °C.
6.3
CAJAS DE PETRI
De vidrio o plástico, con diámetro de 90 mm a 100 mm.
6.4
PIPETAS DE SUMINISTRO TOTAL
Con capacidad nominal de 1 ml.
6.5
BAÑO DE AGUA
O aparato similar, con capacidad de operar a 45 °C ± 0,5 °C.
6.6
EQUIPO DE RECUENTO DE COLONIAS
Consistente en una base iluminada y un contador digital mecánico o electrónico.
6.7
MEDIDOR DE pH
Con aproximación a ± 0,1 unidad de pH a 25 °C.
7.
MUESTREO
El muestreo se debe haber efectuado de acuerdo con la norma específica apropiada para el
producto que se estudia. Si no existe una norma específica, se recomienda que las partes
interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
3
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA
8.
NTC 4458
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
La muestra de ensayo se debe preparar de acuerdo con la norma que trate acerca del producto
que interese. Si no existe norma específica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a
un acuerdo sobre este punto.
9.
PROCEDIMIENTO
9.1
MUESTRA DE ENSAYO, SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES
Véase la norma ISO 6887 y la norma específica apropiada para el producto que interese.
9.2
INOCULACIÓN E INCUBACIÓN
9.2.1 Se toman dos cajas de Petri estériles (véase el numeral 6.3). Usando una pipeta estéril
(véase el numeral 6.4), se transfiere a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es
líquido, o 1 ml de la suspensión inicial en el caso de otros productos.
Se toman otras dos cajas de Petri estériles. Usando otra pipeta estéril, se transfiere a cada caja 1 ml
de la primera dilución decimal (10-1) de la muestra de ensayo, si el producto es liquido, ó 1 ml de la
primera dilución decimal (10-2) de la suspensión inicial en el caso de otros productos.
Se repite el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, usando una pipeta estéril para
cada dilución decimal.
9.2.2 Se vierten aproximadamente 15 ml del medio (véase el numeral 5.3), a 45 °C ± 0,5 °C, en
cada caja de Petri. El tiempo transcurrido entre el final de la preparación de la suspensión inicial (o de
la dilución 10-1 si el producto es líquido) y el momento en que el medio (véase el numeral 5.3) se
vierte en las cajas no debe ser mayor de 20 min.
Cuidadosamente se mezcla el inóculo con el medio y se deja solidificar la mezcla, estando las
cajas de Petri sobre una superficie horizontal fría.
9.2.3 Después de que se complete la solidificación, se vierten aproximadamente 4 ml de medio
VRBL (véase el numeral 5.3) a 45 °C ± 0,5 °C, sobre la superficie del medio inoculado. Se deja
solidificar como se describió anteriormente. Se pretende dejar una doble capa para visualizar
mejor las colonias.
9.2.4
Se invierten las cajas preparadas y se incuban a 35 °C ± 2 °C durante 24 h ± 2 h.
9.3
RECUENTO DE LAS COLONIAS
Después del período especificado de incubación (véase el numeral 9.2.4), se cuentan las colonias
coliformes características en cada caja que contenga no más de 150 colonias2, ya sean
características o no usando el equipo para el recuento de colonias.
Nota 2. Después de la incubación durante 24 h, las colonias características son de color rojo púrpura con un diámetro de
0,5 mm o mayor, y algunas veces están rodeadas de una zona rojiza de bilis precipitada.
2
Por encima de este número existe el riesgo de que las colonias coliformes tengan una apariencia atípica.
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10.
EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
10.1
MÉTODO DE CÁLCULO
10.1.1 Caso general - Cajas que contengan entre 15 y 150 colonias características
Se seleccionan las cajas que contengan no más de 150 colonias características en dos diluciones
consecutivas. Es necesario que una de estas cajas contenga al menos 15 colonias características.
Se calcula el número N de colonias por mililitro o por gramo de producto, dependiendo del caso,
usando la siguiente ecuación:
N=
∑C
(n 1 + 0,1 n 2 )d
Donde:
ΣC
=
es la suma de colonias contadas en todos los platos retenidos;
n1
=
es el número de platos retenidos en la primera dilución;
n2
=
es el número de platos retenidos en la segunda dilución;
d
=
es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución.
Se redondea el resultado calculado con dos cifras significativas.
Se toma como resultado el número de unidades formadoras de colonias, UFC/ml o UFC/g de
producto, expresado como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10x donde x es la potencia
apropiada de 10.
Ejemplo:
Un recuento de coliformes dio los siguientes resultados:
-
en la primera dilución seleccionada (10-2): 83 y 97 colonias
-
en la segunda dilución seleccionada (10-3): 13 y 8 colonias
N=
∑C
(n1 + 0,1 n2) d
=
83 + 97 + 13 + 8
(2 + 0,1 x 2 ) x 10 − 2
=
201
= 9 136
0,022
Al redondear el resultado como se indicó antes, se obtiene 9 100 ó 9,1 x 103 UFC/ml o UFC/g de
producto.
10.1.2 Caso en el que cada caja contiene menos de 15 de colonias características
Si cada una de las cajas, seleccionadas contiene menos de 15 de colonias características, se calcula
el número estimado NE de coliformes usando la ecuación presentada en el numeral 10.1.1.
5
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EJEMPLO.
Un recuento de colonias de coliformes dio los siguientes resultados:
-
En una dilución de 10-4 : 140 y 145 colonias, de las cuales 5 y 3 respectivamente
fueron características.
-
En una dilución de 10
fueron características.
NE =
-5
: 11 y 8 colonias, de las cuales 0 y 1 respectivamente
5 + 3 + 0+ 1
(2 + 0,1 x 2) x 10
−4
=
9
2,2 x 10
−4
= 40 000
Al redondear el resultado como se especificó en el numeral 10.1.1, da 4,0 x 10 -4 UFC/ml o UFC/g
del producto.
10.1.3 Estimación de números pequeños
Si las dos cajas, correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a la suspensión
inicial (otros productos) contienen menos de 15 colonias características, los resultados se reportan
así:
-
< 15 UFC/ml (productos líquidos);
-
< 15 x 1/d UFC/g (otros productos), en donde d es el factor de dilución de la
suspensión inicial.
10.1.4 Colonias no características
Si las dos cajas correspondientes a la muestra de ensayo (productos líquidos) o a la suspensión
inicial (otros productos) no contienen colonias características, se informa el resultado como sigue:
10.2
-
<1 UFC/ml (productos líquidos);
-
<1 x 1/d UFC/g (otros productos), donde d es el factor de dilución de la suspensión
inicial.
PRECISIÓN
10.2.1 Cajas que contengan entre 15 y 150 colonias características (véase el numeral 10.1.1)
Solamente por razones estadísticas, en el 95 % de los casos los límites de confianza de este método
varían desde ± 16 % hasta ± 52 % (Cowell y Morisetti, J. Sci. Fd. Agric., 1969, Vol. 20, p. 573). En la
práctica, se puede encontrar variación aún mayor especialmente entre resultados obtenidos por
diferentes microbiólogos.
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10.2.2 Cada caja contiene menos de 15 colonias características (véase el numeral 10.1.2)
Consúltese la Tabla A.1. Para obtener los límites de confianza, se multiplican los límites superior e
inferior dados por 1/d, en donde d es el factor de dilución.
11.
INFORME DEL ENSAYO
El informe del ensayo debe especificar el método usado y los resultados obtenidos. También se
deben mencionar todos los detalles operativos no especificados en la presente norma, o
considerados como opcionales, junto con detalles de cualquier incidente que pueda haber influido
en los resultados.
El informe de ensayo también debe incluir toda la información necesaria para la identificación
completa de la muestra.
12.
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance
for the Enumeration of Coliforms. Colony Count Technique. Geneva: ISO, 1991, 5 pp.
(ISO 4832-1991).
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Anexo A (Normativo)
Límites de confianza para la estimación de
números pequeños de colonias
En la Tabla A.1 se dan los límites de confianza al nivel del 95 % para la estimación de números
pequeños, cuando el número de colonias en las cajas seleccionadas es menor de 15.
Tabla A.1
Número de coliformes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Límites de confianza al nivel del 95 %
Inferior
Superior
<1
2
<1
4
<1
5
1
6
2
9
2
10
2
12
3
13
4
14
4
16
5
18
6
19
7
20
7
21
8
23
8