INTRODUCCIÓN 1 PARTE EXPERIMENTAL: Objetivos: Conocer y realizar el procedimiento de los ensayos preliminares o inmediatos de sustancias tóxicas en una muestra biológica de orina. Detectar que sustancias tóxicas se encuentran en una muestra biológica de orina. Reactivos, materiales y equipos: 1) Sulfato de cobre 2) Resina de Guayaco 3) Solución acuosa de iodo-iodorado 4) Solución de almidón 1% 5) Solución de cloruro de paladio 6) Solución de tártaro emético al 10% 7) Solución acuosa de acetato de plomo al 10% 8) Solución acuosa de hidróxido de sodio al 2% 9) Sulfato ferroso 10) Ácido clorhídrico concentrado. 11) Solución acuosa de Acido Pícrico 12) Muestra de orina 13) Baño María 14) Tiras de papel filtro 15) Probeta Papel sensible de Schombein a) Nombre de la reacción: Papel guayaco-cúprico o de Schonbein. Es un ensayo sensible pero inespecífico en el cual se puede reconocer hasta 0.25µg de ácido cianhídrico. b) Fundamento: Se basa en el aumento del potencial de oxidación de sales cúpricas al pasar a sales cuprosas insolubles o poco disociadas, una vez formado el sistema Cu+2-CN se acopla la resina de guayaco(compuesto reductor) que por oxidación origina un derivado coloreado haciendo virar a la reacción de color castaño a azul. c) Técnica operatoria: Embeber una tira de papel filtro con solución de CuSO4 al 10% escurriendo el exceso, luego se embebe la misma tira en una solución alcohólica de resina de guayaco al 10% de reciente preparación. El papel reactivo se coloca en la boca del recipiente que contiene la muestra a analizar y se lleva a baño maría por 5 minutos observándose una coloración azul al final por una reacción de oxidación. 2 d) Mecanismo de reacción 16CN-1 +16H+ 16HCN + 8Cu++ 8(CN)2Cu 4C2N2+C22H26O6+H2O 4Cu2(CN)2 + 4HCN 16CN- + 8Cu++ + 7H2O + C22H26O6 12HCN 8Cu(CN)2 + 16H+ 4Cu2(CN)2 + 4C2N2 4HONC+ 4HCN+C22H24O9+8H+ 4[Cu2(CN)3]- + 4H+ 4HONC+ [Cu2(CN)3]- + 12H- + C22H24O9 e) Ecuación química balanceada 12HCN- + 3H2O+ 9CuSO4 + C22H26O6 9H2SO4+ 3Cu2(CN)4 +3Cu(CN)2 + C22H24O9 f) Resultado POSITIVO: Ligera coloración azul del papel sensible Papel sensible de iodo almidonado a) Nombre de la reacción: Papel iodo-almidonado. Sensibilidad de hasta 1µg de H2S o HCN b) Fundamento: El ensayo se fundamenta en la formación del anión triioduro (I3-) al combinarse el ioduro de potasio con el iodo elemental. Cabe resaltar que los triioduros a diferencia del iodo son altamente solubles en agua, por lo que el ioduro de potasio aumenta la solubilidad del iodo elemental en agua. El ion I2+ puede reducirse a ion yoduro (I-) por la acción de un agente reductor que puede ser el ácido sulfhídrico o el ácido cianhídrico y cuando todo el yodo se consume el color azul desaparece, llamándose a este proceso una valoración yodométrica. 3 c) Técnica operatoria: Embeber una tira de papel filtro con una gota de solución de almidón escurriendo el exceso para luego embeber la misma tira con una gota de solución acuosa de iodo-iodato. d) Mecanismo de reacción KI +I2 + 2almidón 2almidón-I + KI HCN + 2almidón-I 2I-1 + 2almidón +CN-1 + H+1 e) Ecuación química balanceada HCN + I2 ICN + HI Otra reacción: H2S + I3− S0 (Elemental) + 3I- + 2H+ f) Resultado POSITIVO: el papel se decoloro del color amarillo inicial, indica la presencia de H2S y/o HCN Papel sensible de Grignard a) Nombre de la reacción: Ensayo de Grindnard, es poco sensible, necesita 5 minutos para evidenciarla; esta es una adaptación de la clásica reacción de Hasiwetz y Waller(reacción isopurpúrica) b) Fundamento: Se fundamenta en que el ácido pícrico en presencia de HCN liberado de la muestra forma isopurpurato alcalino de color rojo a rojo naranja en el transcurso de cinco minutos. c) Técnica operatoria: Embeber una tira de papel filtro con solución acuosa de ácido pícrico para luego colocarlo en la boca del recipiente que contiene la muestra, dejándola por cinco minutos a baño maría. d) Mecanismo de reacción 4 e) Ecuación química balanceada f) Resultado POSITIVO: la tira cambio de amarillo a rojo naranja, indica la presencia de ácido cianhídrico(HCN). 5 Papel sensible de nitrato de plata (AgNO3) a) Nombre de la reacción: reacción poco sensible debido a la poca cantidad de reactivo para reaccionar b) Fundamento: El nitrato de plata reacciona con el sulfuro de hidrogeno de la muestra problema formando sulfuro argéntico, también se forma arsina y fosforo blanco. c) Técnica operatoria: Embeber una tira de papel filtro con solución de nitrato de plata 10%, colocar al borde de un frasco que contenga a muestra problema con ácido tartárico y colocarlo a baño maría por 5 minutos d) Mecanismo de reacción: H2S + 2Ag+ ASH3 + 6Ag+ + 2H2O Ag2S + 2H+ AsO2H + 6H+ + 6 Ag° e) Ecuación química balanceada H2S + 2Ag+ Ag2S + 2H+ f) Resultado NEGATIVO: no presentó coloración negra Papel sensible de cloruro de paladio a) Nombre de la reacción: Es un ensayo sensible con papel sensible de cloruro de paladio (10%), reconoce el monoxido de carbono que se libera de la muestra. b) Fundamento: el paladio metalico producido da esa coloracion grisacia oscura, el cloruro de pladio reacciona con el monoxido de carbono presente en la muestra produciendo el paladio metalico y la precipitacion de dioxido de carbono, ademas de acidificar el medio y se reconoce por un cambio de viraje del papel a color negro. c) Técnica operatoria: se coloca 1 gota de cloruro de paladio 10%, se cola en la parte superior del frasco que contiene la muestra, se lleva a baño María por 5 minutos y se procede a revelar. 6 d) Mecanismo de acción: e) Balanceo de reacción: f) Resultado POSITIVO presenta ligera coloración gris. Papel sensible de tartrato emético a) Nombre de la reacción: Es un ensayo sensible con papel sensible de tartaroemetico 10%, reconoce acido sulfurico que se libera de la muestra. b) Fundamento: el tartaroemetico al entrar al contacto con el acido sufhidrico precipita en sulfuro de antimonio. c) Técnica operatoria: se coloca 1 gota de tartaroemetico 10%, se cola en la parte superior del frasco que contiene la muestra, se lleva a baño María por 5 minutos y se procede a revelar. 7 d) Mecanismo de acción: e) Balanceo de reacción: f) Resultado NEGATIVO, no hubo cambio de coloración. Papel sensible de acetato de plomo a) Nombre de la reacción:: Es un ensayo sensible con papel sensible de acetato de plomo (10%), reconoce el acido sulfhidrico que se libera de la muestra. b) Fundamento: el acetato de plomo reacciona con el acido sulfhidrico, el cual hace que se precipite sulfuro de plomo, el cual se reconoce en el papel un color negruzco. c) Técnica operatoria: se coloca 1 gota de acetato de plomo 10%, se cola en la parte superior del frasco que contiene la muestra, se lleva a baño María por 5 minutos y se procede a revelar. d) Mecanismo de acción y reacción química balanceada: e) Resultado 8 NEGATIVO, no hubo cambio de coloración. Papel sensible de alcalina a) Nombre de la reacción: Es un ensayo sensible con papel sensible de alcalimno (1 gota de NaOH (10%), posteriormente se agrega FeSO4,1gota de Hcl concentrado), reconoce el cianuro que se libera de la muestra. b) Fundamento: se basa en la formacion de un complejo azulado de prusia. c) Técnica operatoria: se coloca 1 gota de NaOH 10% lo que genera que alcalina el medio, posteriormente se agrega 1 gota de FeSO4 y una gota de HCl concentrado, se cola en la parte superior del frasco que contiene la muestra, se lleva a baño María por 5 minutos y se procede a revelar. d) Mecanismo de acción: e) Reacción balanceada: f) Resultado POSITIVO, presentó coloración azul 9 DISCUSION La investigación de componentes tóxicos en determinadas muestras biológicas, requieren un monitoreo adecuado a lo largo de todo el análisis toxicológico a realizar. Es sabido que una de las muestras de obtención para un análisis toxicológico es la orina, si bien puede obtenerse de manera adecuada puede resultar susceptible a una rápida contaminación ambiental relacionado al tiempo de exposición. Es por ello que los resultados obtenidos en esta práctica pueden tener un rango de error probablemente debido a un intervalo de tiempo no adecuado, un ambiente no aséptico, entre otros. En el análisis toxicológico realizado se pudo identificar la presencia de ciertos componentes volátiles tóxicos, con el empleo de los ensayos inmediatos, que son técnicas que se realizan en la atmósfera del recipiente que contiene la muestra mediante el empleo de los llamados papeles sensibles, donde se utilizan papeles impregnados en diferentes reactivos.1 La reacción de los papeles sensibles de Yodo almidonado, Alcalino y Grinard resultaron negativo sin embargo esta reacción resulta ser positiva ya que estaría indicando una posible presencia de cianuros en la muestra de orina utilizada en el análisis químico toxicológico. La reacción de Schonbein resulto positiva al reconocer cianuro, por lo tanto se puede ver una contradicción con las reacciones que dieron positivas al reconocimiento de cianuros . Como se sabe la reacción de Schonbein se basa en el potencial de óxido reducción de las sales cuprosas al pasar a sales cúpricas, donde el sulfato de cobre al reaccionar con el ácido cianhídrico produce ozono que es detectado por la resina de guayaco. Este ensayo es sensible pero inespecífico que reconoce a partir de 0.25 ug de cianuro.11 Por lo tanto se puede deducir que probablemente el impregnamiento con la muestra problema no fue lo suficiente. El ensayo de yodo almidonado resulto negativo es un ensayo muy sensible pero que se vio afectado debido a que la muestra fue el contenido estomacal ya que probablemente existiria una interferencia del sulfhídrico por su carácter reductor. El ensayo de Grinard es diferencial y complementario cuando existe pequeñísimas cantidades de cianuro, siendo su fundamento la formación del isopurpurato alcalino. Según Guatelli, un análisis decisivo que indica o no la presencia de ácido cianhídrico en un organismo vivo es el ensayo en papel alcalino, el cual nos descarta la sospecha de una intoxicación cianhídrica. La reacción de los papeles sensibles de nitrato de plata, acetato de plomo, cloruro de paladio y tártaro emético resultaron negativo, ya que el papel sensible resulto de color blanco. En el ensayo con el papel reactivo al nitrato de plata, no se presentó modificación alguna en el aspecto de la parte suspendida del papel, luego de estar en baño maría a 50-60 ºC, se puede concluir que no existe determinado grupo de venenos volátiles que afectan al catión argéntico, ni tampoco presencia deI compuestos volátiles reductores. La reacción de 10 acetato de plata resultó negativa descartando la presencia de ácido sulfhídrico en la muestra de orina, lo cual confirma el resultado obtenido con el papel reactivo al nitrato de plata, estas dos reacciones podrían descartar que la persona sufrió una intoxicación debido a la producción de ácido sulfhídrico. Además el ácido sulfhídrico en concentraciones toxicas, se percibe inmediatamente por el olfato y la intensidad del olor, y esta cualidad estuvo ausente en la muestra de orina, ya que esta presentaba un olor característico. Al igual que en la reacción con el papel sensible de tártaro emético, que debido a la ausencia de ácido sulfhídrico en la muestra de orina no se formó el precipitado de sulfuro de antimonio, por ende el papel sensible no viró a una coloración naranja tenue.9 La acción del ácido sulfhidrico sobre los cationes se debe principalmente al carácter precipitante del ión S2–. El que el S2– precipite unos u otros cationes depende fundamentalmente de la acidez de la disolución y del producto de solubilidad del correspondiente sulfuro metálico. 2 Finalmente la reacción de cloruro de paladio resultó negativa indicando la ausencia del monóxido de carbono, ya que no se observa una coloración plateada que se manifiesta cuando el monóxido de carbono reduce diversas sales metálicas oxidantes, como lo es el paladio II (Pd+2). Según los resultados obtenidos es muy probable que el organismo del cual se obtuvo la muestra haya estado intoxicado con cianuro, que es un componente químico altamente reactivo y muy toxico, que figura en la lista Hazardous Substance List según OSHAS. Esta molécula es relativamente pequeña y se puede absorber por tracto gastrointestinal inhalatoria, dérmica, conjuntival y parenteral.3 En humanos y animales, la ruta de mayor eliminación de cianuro como tiocianato es la vía urinaria, pero en pequeñas cantidades también se elimina por las vías respiratoria y digestiva. Una porción de cianuro libre se excreta inalterado con la respiración, saliva, sudor, y orina. En la intoxicación aguda con sales de cianuro o ácido cianhídrico, las concentraciones del ión cianuro en sangre son del orden de 2-10 mg/l. El ensayo cualitativo descripto anteriormente tiene insuficiente sensibilidad para detectar estas concentraciones y sólo deben usarse para contenido estomacal y residuos de la escena. 4 CONCLUSIONES El procedimiento de análisis del toxico en la muestra de orina realizado en la práctica se hizo mediante reacciones en papeles sensibles y estos reaccionaron con los vapores que emitió la muestra puesta en baño maría, donde el cambio de coloración indicó la presencia de compuestos tóxicos presentes en la muestra. La muestra de orina dio positivo para la reacción de schombein, detectándose la presencia del anión CN- ; mientras que las otras 11 reacciones fueron negativas descartando en la muestra la presencia de compuestos de ácido cianhídrico e hidrogeno sulfurado, oxido de carbono , fosforo blanco, arsenonamina, estibamina. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Stewart, C. P. and Stolman, A. (1960) Toxicology. Mechanisms And Analytical Methods. Academic Press, New York and London. Volumen I y II 2. Cátedra de Toxicología y Química Legal-UBA (2005) Guía de Trabajos Prácticos de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UBA 3. Flanagan R, Braithwaite R, Brown S, Widdop B, Wolff F. Basic Analytical Toxicology. Geneva: Word Health Organization; 2004, 2002-20025 4. R.J. Flanagan; R.A. Braithwaite; S.S. Brown; B. Widdop and F.A. de Wolff. Basic Analytical Toxicology. UNITED NATIONS ENVIRONMENT PROGRAMME INTERNATIONAL LABOUR ORGANISATION WORLD HEALTH ORGANIZATION. INTERNATIONAL PROGRAMME ON CHEMICAL SAFETY Geneva, 1 CUESTONARIO 12
