UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE TÓPICOS DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR PRODUCTO INTEGRADOR II: CARACTERIZACIÓN GENOTÍPICA DE UN OGMS Elaborado por: Fecha 22/abril/2018 Karlamaría Rojas Mercado Cristina Elizabeth Manjarrez Alfaro Orlando Segura Vazquez Ilse Mariana Quilantan Sánchez Carlos Delgado Rojas Páginas 15 Gpo:283 Una empresa ha desarrollado una cepa de levadura metilotrófica por ingeniería genética. La cepa es portadora de la secuencia que codifica para la α-glucosidasa de Litopenaeus vannamei, y se emplea para la producción de esta enzima. La α-glucosidasa produce la hidrólisis de oligosacáridos y polisacáridos liberando α-D-glucosa y se emplea en la industria de alimentos o en el área de diagnóstico. La empresa requiere de un control de calidad de la cepa antes de someterla al bioproceso de producción, para lo cual antes inocular el fermentador requiere de caracterizar la cepa, para confirmar la presencia del gen heterólogo. Para resolver este problema, lo ha contratado a Usted como un QBP experto en biotecnología molecular para lo cual se le solicita un reporte técnico para el control de calidad de la cepa y Usted cuenta con la siguiente información: 1. La secuencia que codifica para la enzima alfa glucosidasa de camarón (Litopenaeus vannamei antes Penaeus vannamei) está reportada en el GenBank (banco de secuencias nucleotídicas) (Penaeus vannamei alpha glucosidase, Le Chevalier, P.A., Sellos, D.Y. and Van Wormhoudt, A.E). 2. Se cuenta con un par de oligonucleótidos diseñados por Ud y que suponen hibridan en la secuencia que codifica para la α-glucosidasa. Oligonucleótido Glu1: GAGCGTCGACAAAAGACAACAGACGAAGCTGCAGGCG Oligonucleótido Glu2: AAACCCTAGGTTACAGGCCATCATTGTC Con esta información Ud propone realizar las siguientes actividades para integrar el reporte técnico: 1) Confirmar si los oligonucléotidos diseñados son adecuados, para lo cual decide evaluar la especificidad de los oligonucleótidos y comprobar si se logra obtener una amplificación específica mediante herramientas bioinformáticas. Al realizar la amplificación in silico con los iniciadores diseñados, se determina el tamaño del fragmento amplificado. Alineamiento del oligonucleótido Forward (Glu1) por medio del programa BLAST obteniendo la secuencia CAACAGACGAAGCTGCAGGCG para realizar la amplificación in silico. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 2 de 15 Alineamiento del oligonucleótido Reverse (Glu2) por medio del programa BLAST obteniendo la secuencia TTACAGGCCATCATTGTC para realizar la amplificación in silico. © Por medio de primer BLAST se colocan los oligonucleótidos Glu1: CAACAGACGAAGCTGCAGGCG y Glu2: TTACAGGCCATCATTGTC para la amplificación teórica y la especificidad de estos. Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 3 de 15 Se muestra que Glu1: CAACAGACGAAGCTGCAGGCG y Glu2: TTACAGGCCATCATTGTC amplifican para la enzima α-glucosidasa. Amplificaron un fragmento de 2700 pb sin embargo se suman los fragmentos de los primers no amplificados: 2700 + 16 (Forward) + 10 (Reverse) = 2726 pb ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 4 de 15 2) Realizar una caracterización genotípica de la cepa recombinante. Para lo cual propone realizar: a) Una preparación de DNA genómico de la cepa. Lo cual requiere de un cultivo y la obtención de un paquete celular a partir del cual se extraerá el DNA. El DNA obtenido se analizará para determinar su concentración y su calidad. b) Determinar la presencia del gen heterólogo en el genoma de la cepa mediante PCR, para lo cual desarrolla un protocolo de PCR con los oligonucleótidos diseñados. c) Caracterizar el fragmento amplificado mediante enzimas de restricción, para lo cual propone una enzima de uso frecuente, que corte una solo vez el fragmento y que produzca fragmentos que resuelvan en un gel de agarosa, lo cual verificará con el uso de herramientas bioinformáticas antes de comprar los insumos para realizar el análisis. Caracterización por medio de enzimas de restricción in silico con EcoRI donde se obtiene un producto visible con gel de agarosa 0.7% obteniendo dos bandas de tamaño de 2072 pb y 654 pb. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 5 de 15 UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE TÓPICOS DE BIOTECNOLOGÍA MOLECULAR 5) Realizar un reporte técnico a la empresa. El reporte debe de realizarse de acuerdo al formato que aprendió en su formación en el curso de Tópicos de Biotecnología Molecular de su carrera y debe de incluir los puntos comprometidos a realizarse y arriba mencionados. En el reporte técnico deberá de que considerar lo siguiente para las secciones de metodología y resultados: OBJETIVO Obtener DNA genómico a partir de la cepa de Pichia pastoris por el método de solventes orgánicos para comprobar bioinfomáticamente y experimentalmente si contiene la secuencia codificante de la α glucosidasa de Litopenaeus vannamei, con la ayuda de la técnica de PCR se ampliará el DNA que se obtuvo para observar las cepas recombinantes. FUNDAMENTO Para poder llevar a cabo la preparación y el análisis de DNA genómico de una levadura se pueden utilizar técnicas como el método de extracción de solventes orgánicos (TSNT) que permitirá una lisis celular y posterior purificación del DNA. (Tamay, et al 2013) La cuantificación del DNA se puede llevar a cabo mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa con marcadores de concentración conocida. Esta es de las más utilizadas para analizar y caracterizar ácidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de DNA de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Además, si en dicha electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de tamaño conocido) se puede calcular el tamaño aproximado del DNA en estudio. En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular. Dado que el DNA posee carga negativa por sus grupos fosfato es atraído electrostáticamente por el cátodo de la cámara de electroforesis a partir del extremo del anodo. Las bandas de DNA de mayor tamaño se verán en la parte superior del gel. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 6 de 15 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. En la reacción, si usamos como sustrato ADN genómico, entonces típicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (ácido ribonucleico mensajero) se le conoce como RT-PCR. Esta conversión se logra mediante una reacción conocida como transcripción reversa y controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una molécula de ADNc. Este método fue copiado de los retro virus que usan una transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en millones de partículas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresión del ARNm de algún gen de interés. Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucleótidos o primers, los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora o buffer y H2O. Todos estos elementos interactúan en tres etapas principales de las que se compone la PCR: desnaturalización, hibridación y extensión. Los equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están diseñados para establecer un sistema homogéneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reacción, para corroborar si se amplificó la secuencia blanco de interés, los productos de la PCR son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reacción fue exitosa. (Tamay et al, 2013) ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 7 de 15 MATERIALES Y EQUIPOS Equipos Agitador Vortex Autoclave Campana bacteriológica Congelador de -20ºC pH metro Transiluminador Equipo para electroforesis -Cámaras horizontales -Fuentes de poder -Accesorios Espectrofotómetro Cámara de electroforésis Espectrofotómetro. Incubadora a 37ºC, con agitación Juego de micropipetas Máquina de hielo Centrifuga Refrigerador Baños de agua Microcentrífuga Balanza analítica Fuente de poder Termociclador MATERIALES Guantes desechables sin talco Bolsa de plastico Gradillas de plástico Hielera Mechero Cajas de plástico para guardar tubos con muestras Toallas absorbentes Contenedor para deshechos de material biológico Contenedor para deshechos de fenol Puntillas estériles para micropipetas (azules, amarilla y blancas) Tubos Eppendorf de (1.5mL 0 2mL) Contenedor para desechos químicos Celdas de plástico Material biológico, soluciones, medios de cultivo y reactivos Cepa de Pichia pastoris pPic α-Glu, KM71. Medio de cultivo YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Glucosa 2%) SEVAG (cloroformo: alcohol isoamílico, 24:1) Etanol al 100% H2Oestéril Oligonucleótidos 5 μM c/u. TSNT(Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100Mm, Tris-HCl 10Mm y EDTA 1mM pH=8) TE 1X (Tris-HCl 10mM pH= 8, y EDTA 1mM pH=8) Fenol Etanol al 70% Buffer de lisis Buffer Green dNTP’s 10 μM ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 8 de 15 GoTaq DNA Polimerasa 5 U/mL Gel de agarosa al 0.8% DNA 200 ng/mL Marcador molecular Hyper Ladder 1 (BIOLINE) PROCEDIMIENTO Herramientas bioinformáticas utilizadas en el punto 1 En el Gen Bank del NCBI se localizó La secuencia que codifica para la enzima alfa glucosidasa de camarón (Litopenaeus vannamei antes Penaeus vannamei) y se verifico que concuerden los autores. La amplificación y caracterización in silico se realizó por medio del programa BLAST Crecimiento celular 1.100 µL cepa KM71 de Pichia pastoris 2. agregar 10 mL de YPD 3. Incubar a 30ºC, 250 rpm por 24 horas. Hasta alcanzar la fase exponencial (DO600 nm de 6˜10). 4. 4 mL del cultivo por centrifugaciones sucesivas 5. Centrifugar por 5-10 minutos a 16,000 g para separar el paquete celular, decantar el sobrenadante. 6. Guardar el paquete celular a -20 C para su posterior uso Proceso general Homogenización (Lisis celular) 1. Añadir al paquete celular 200 µL de la solución amortiguadora de lisis TSNT, mezclar perfectamente por inversion o con pipeta. Extracción de contaminantes 1. Agregar 500 µL de fenol saturado y mezclar por inversión. 2. Agregar 100 µL de cloroformo-alcohol isoamílico 24:1. 3. Agitar en el vortex 5 min 4. Añadir 200 µL de TE 1X pH8 y mezclar por inversión de tres a cinco veces. 5. Centrifugar 8 min a 14,000 rpm y transferir la fase acuosa a un tubo Eppendorf de 2.0 mL. Precipitación y lavado de DNA 1. Precipitar el DNA agregando 1 mL de etanol 100%. Mezclar lentamente por inversión hasta observar la precipitación del DNA en forma de una hebra blanca. 2. Centrifugar 8 min a 14,000 rpm. 3. Decantar el sobrenadante teniendo cuidado de que no se desprenda la pastilla de DNA. 4. Lavar con 1000 µL de etanol al 70% y mezclar por inversión. 5. Centrifugar 8 min a 14,000 rpm, decantar y secar a temperatura ambiente de 5–10 min. 6. Secar ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 9 de 15 Solubilización 1. Resuspender en 50 µL de TE 1X pH=8 y almacenar a 4º C para posteriormente determinar concentración y calidad de la muestra de DNA. 2. Calentar a 65 C por 20 min. Protocolo PCR Preparación de tubos 1. Limpiar y despejar el área pre-PCR. 2. Etiquetar tres tubos Eppendorf con equipo, grupo y control positivo, negativo o muestra según sea el caso. 3. Resuspender el DNA plasmídico de P. pastoris KM71-pPic α-Glu 20ng/µl en 10µl de Buffer TE. 4. Tomar 36.9µl de H2O estéril (MiliQ) con la micropipeta y depositarlos en uno de los tubos Eppendorf etiquetado. 5. Agregar al tubo 15µl de Buffer Green 5X. 6. Añadir 7.5µl del oligonucleótido 1 5µM al tubo. 7. Repetir el paso 6 con el oligonucleótido 2. 8. Tomar 1.5µl de dNTP’s 10mM y añadirlos al tubo Eppendorf. 9. Agregar 0.6µl de Go Taq DNA Polimerasa 5U/µl al tubo de reacción. 10. Tomar 23µl de esta reacción y añadirlos a un nuevo tubo Eppendorf etiquetado. 11. Repetir la acción 10 con el tubo restante etiquetado, para que tres tubos contengan 23µl cada uno. 12. Agregar 2µl de agua estéril (MiliQ) al tubo etiquetado como control negativo, para obtener un volumen final de reacción de 25µl. 13. Añadir 2µl de DNA plasmídico para control positivo de P. pastoris KM71-pPic α-Glu al tubo para la reacción de control positivo, teniendo como volumen final 25µl. 14. Agregar 2µl de DNA plasmídico de P. pastoris KM71-pPic α-Glu20ng/µl al tubo etiquetado como muestra, teniendo un volumen final de 25µl. Ensayo en termociclador 15. Ingresar los tres tubos al termociclador y ajustarle los parámetros necesarios: Etapa Paso Condición 1 Paso 1 92ºC por 2 minutos Paso 1 92ºC por 1 minuto 50ºC por 30 2 Paso 2 segundos Paso 3 72ºC por 2 minutos 72ºC por 10 3 Paso 1 minutos 4ºC por tiempo 4 Paso 1 indefinido Número de ciclos 1 ciclo 30 ciclos 1 ciclo Infinito 16. Sacar los tubos del termociclador. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 10 de 15 Ensayo de electroforesis 17. Preparar una mezcla de agarosa a 0.8% en buffer TBE 1X 18. Calentar y agitar la mezcla hasta que se encuentre disuelta. 19. Agregar en la cámara elecrtoforética aproximadamente 50ml de la mezcla. 20. Colocar el peine de plástico sobre la mezcla. 21. Esperar 30 minutos o hasta que solidifique la solución. 22. Retirar los peines, y colocar cubriendo la superficie del gel, buffer TBE 1X 23. Mezclar 2µL del marcador de peso molecular 1 Kb Ladder con 2.5µL de GelRed y 2.5µL d Green Buffer. 24. Adicionar en el primer carril los 7 µL totales anteriores. 25. Tomar 2µL de muestra de DNA y adicionar 2.5µL de GelRed. 26. Añadir la mezcla anterior en el pocillo correspondiente. 27. Repetir el paso 25 y 26 para el control negativo y positivo. 28. Correr el gel a 100V a 85mA durante treinta y cinco minutos. 29. Retirar el gel de la cámara electroforética. 30. Colocar el gel en el transluminador. 31. Observar y analizar los resultados. COMENTARIOS Y RECOMENDACIONES: Todas las puntillas y tubos deben ser previamente esterilizados. Se debe tener sumo cuidado con las posibles fuentes de contaminación que podrían acarrear los tubos al momento de preparar estos con las muestras y controles. Debido a ello, el uso de guantes es estrictamente necesario. También es muy recomendable la limpieza del área de trabajo antes de comenzar con la experimentación. La enzima de restricción deber ser el último elemento añadido a la mezcla y no antes de algún otro reactivo. Se debe tener cuidado de pasar el volumen de TE por las paredes del tubo. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 11 de 15 Figura 2. En todos los casos se corrieron en el gel 5µL de la muestra de DNAg. El marcador de peso molecular empleado fue: Hyper Ladder 1 (BIOLINE). Las condiciones de corrimiento fueron: Gel de agarosa al 0.8 %, Buffer de corrimiento TBE 1X 80 minutos 100 volts 85 mili amperes. No se muestra ninguna banda en ninguno de los carriles, solo el control positivo, esto puede indicar que se llevó a cabo un mal procedimiento o quizás los manipuladores brincaron un paso, lo que conllevo a este error, sin embargo, se esperaba observar para el equipo 1,4 y 5, la detección de la cepa recombinante de Pichia pastoris. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 12 de 15 DISCUSION Al analizar la fotografía de la electroforesis los carriles del 1 al 6, se observa una banda de más de 10 000pb, misma que corresponde al tamaño del ADN genómico aislado, pues como señala Schutter K., el genoma de la cepa que se empleó tiene una cantidad de más de 9.3Mpb. El resto de los carriles exhiben un patrón similar al de la muestra de interés con ligeras variaciones con respecto a la intensidad de las bandas, indicando que el ADN está presente. Por consiguiente, se realizó un PCR y como resultado no se mostró ninguna banda en ninguno de los carriles, solo el control positivo, esto puede indicar que se llevó a cabo un mal procedimiento o quizás los manipuladores brincaron un paso, lo que conllevo a este error, sin embargo, se esperaba observar para el equipo 1,4 y 5, la detección de la cepa recombinante de Pichia pastoris. Se debe considerar que para determinaciones precisas por análisis la muestra no debe estar contaminada, debido a que los contaminantes invalidan los resultados de concentración obtenidos (Rada y Taboada, 1998). Gómez (2011) menciona que, al realizar una extracción de DNA, la electroforesis nos permite ver si hay errores o no en el protocolo de la extracción, en donde menciona que cuando se observan bandas extendidas, esto puede indicar una degradación del material genético, mientras que, si hay cambios en la fluorescencia de las bandas, nos indica que puede haber la presencia de contaminantes. El PCR es aplicado para Pichia pastoris para cuantificar los casetes de expresión integrados (Stryer, 2003). Como eucariota, Pichia pastoris tiene muchas de las ventajas de eucariotas superiores sistemas de expresión tales como procesamiento de proteínas, plegamiento de proteínas y modificación postraduccional, mientras que es tan fácil de manipular como E. coli o Saccharomyces cerevisiae (Watson,2006). Es más rápido, más fácil y menos costoso de usar que otros sistemas de expresión eucariotas tales como baculovirus o cultivo de tejidos de mamíferos, y generalmente da niveles de expresión más altos. La levadura comparte las ventajas de manipulaciones moleculares y genéticas con Saccharomyces, y tiene el agregado ventaja de niveles de expresión de proteínas heterólogas de 10 a 100 veces mayores. Estas características hacen que Pichia sea muy útil como un sistema de expresión de proteínas (Williams et al 1990). CONCLUSIONES La utilización de metodologías de resiembra y conservación que garanticen la calidad de las cepas preferentemente de calidad ATCC son indispensables para la realización de una hibridación de un oligómero con las características deseadas por la pureza que las cepas en uso brindan además de ser cultivos económicos, con altos niveles de producción de las proteínas recombinantes, deficientes en proteasas y demás características sobre su fisiología y genética factor que presuntamente se vio afectado pues en la obtención de las bandas para su caracterización la obtención de los resultados no es favorable pues la prueba no detecto la cepa Pichia pastoris. LITERATURA CONSULTADA Cornejo R., Díaz A., Aguilar B., Munive M. 2014. Herramientas Moleculares Aplicadas en Ecología. Aspectos teóricos y prácticos. Primera edición. México: SEMARNAT Gómez U. (2011). Biotecnología especializada y determinación molecular// extracción y determinación de material genético/ edición 2 edito. Velledit, Departamento de enfermedades y diagnóstico, Medellín Colombia determinación prolongada. Perera, J., & Tormo, A. 2002. Ingeniería genética: Preparación, análisis, manipulación y clonaje de DNA: Vol.1. Madrid: Síntesis. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 13 de 15 Rada T., A., Taboada. G. 1998. Métodos de obtención y purificación de ADN humano para su aplicación en Genética Molecular. BIOFARBO Vol. VI: 63-68. Schutter, K., Lin, Y., Tiels, P., Hecke, A., Glinka, S., Weber-Lehmann, J., Callewaert, N. 2009. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat Biotechnol Nature Biotechnology, 561-566. Stryer L. (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté Barcelona, España Tamay de D., Ibarra C., Velasquillo C. 2013 Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa PCR) y de la PCR en tiempo real, Investigación en Discapacidad, vol 2, num 2 Williams J, Kubelik K, Livak J & Rafalski Y. (1990). DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Rev. Nucleic Acids Res. 18:6531 – 6535 pp. ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 14 de 15 ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 15 de 15 ©Tópicos en Biotecnología Molecular FCB, UANL,2017 Abril, 2018 Página 16 de 15
