INSTITUTO DEL AGUA Y LAS CIENCIAS AMBIENTALES II MASTER EN GESTIÓN SOSTENIBLE Y TECNOLOGIAS DEL AGUA PROYECTO FIN DE MASTER CURSO 2008-2009 ELIMINACIÓN DE NUTRIENTES EN SALMUERAS MEDIANTE CULTIVO DE MICROALGAS Alumno: José Antonio García García Tutora: Mariana Pilar Hernández ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN: I.1 Planteamiento del problema........................................................................................ 1 II. SISTEMA ESTUDIADO……………………………………………….3 II.2 Objetivos del proyecto……………………................................................................3 III. MATERIAL Y MÉTODOS: III.1 Parámetros físico-químicos.......................................................................................5 III.2 Parámetros biológicos……………………………………...................................... 5 IV.ALCANCE Y DESARROLLO DEL PROYECTO…………………....6 FASE 1: AISLAMIENTO Y ADAPTACIÓN DE ESPECIES EN LA SALMUERA. SELECCIÓN DE ESPECIES......................................................................................................6 FASE 2: OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO. CRECIMIENTO DE CEPAS Y DESARROLLO DE INÓCULOS EN LABORATORIO (TUBOS DE ENSAYO Y MATRACES DE 250 ML)............................................................................................................9 FASE 3: TRASLADO DE LOS CULTIVOS A FOTOBIOREACTORES DE VOLUMEN 2 L EN CONDICIONES CONTROLADAS ....................................................................................18 FASE 4: SIMULACIÓN DEL PROCESO EN REACTORES DE VOLUMEN INTERMEDIO Y DESARROLLO DE UNA PLANTA PILOTO PREINDUSTRIAL............27 V.CONCLUSIONES FINALES.................................................................36 ANEXO I: MATERIAL Y MÉTODOS .................................................... 37 ANEXO II: ANÁLISIS DE LA SALMUERA...........................................39 ANEXO III: FOTOS DE LAS ESPECIES Y LOS MONTAJES EXPERIMENTALES................................................................................. 40 BIBLIOGRAFIA……………………….....................................................44 I.INTRODUCCIÓN: I.1 Planteamiento del problema: Una de las propuestas más destacadas del programa AGUA (Actuaciones para la Gestión y Utilización del Agua) del Ministerio de Medio Ambiente, es la desalación como generador prioritario de recursos hídricos en cantidad y calidad, tanto para consumo humano como para uso agrícola e industrial. La desalación además supone la generación de vertidos denominados salmueras. El vertido puede ser de dos tipos: -Vertido al mar. -Vertido al dominio público hidráulico (ramblas y barrancos) El segundo caso se va a tratar en este proyecto, utilizando la salmuera producida en la planta desaladora de la Universidad de Alicante. En el caso de vertido a dominio público hidráulico, el programa AGUA establece que hay que impedir el vertido directo de salmueras procedentes de la desalación de agua a cauces o ramblas cercanas; para evitar la contaminación de las aguas superficiales o subterráneas, así como la alteración de las especies y procesos ecológicos naturales. En la actualidad no existe legislación específica sobre el vertido de salmueras al dominio público hidráulico. Las confederaciones hidrográficas se encargan de conceder las autorizaciones de vertido. En dichas autorizaciones se fijan los parámetros del vertido que se deben a controlar y las concentraciones máximas de dichos parámetros. A falta de una legislación específica sobre parámetros de vertido de salmueras al dominio público hidráulico, se puede tomar como referencia la Directiva 91/271/CEE que fija los requisitos que han de cumplir los vertidos procedentes de las instalaciones de tratamientos de aguas residuales. De estos requisitos los más restrictivos corresponden a las concentraciones totales de nitrógeno y fósforo en vertidos a zonas sensibles: Parámetros Fósforo total Nitrógeno total Concentración 2 mg /l P(10000-100000 h-e) 1 mg/l P (más de 100000 h-e) 15 mg/l N(de 10000-100000 h-e) 10 mg/l N(más de 100000 h-e) % Reducción 80% 70-80% Estas restricciones se llevan a cabo con el fin de evitar problemas de eutrofización en embalses, rios, etc o de contaminación de acuíferos. La eutrofización es el proceso de enriquecimiento en nutrientes de las aguas que provoca la estimulación de una serie de cambios del sistema entre los que el incremento de algas y macrófitos, el deterioro de la calidad del agua y otros cambios sintomáticos resultan indeseables e interfieren con la utilización de las aguas. Existen varias técnicas para la eliminación de los nutrientes presentes en el agua: Contaminante Nitrógeno Fósforo Tratamiento NitrificaciónDesnitrificación Extracción del amoniaco Intercambio iónico Cloración al “breakpoint” Evacuación al terreno Eliminación biológica Coagulación con sales metálicas y sedimentación Coagulación con cal y sedimentación Tipo de tratamiento Biológico (bacterias) Físico/Químico Químico Químico Biológico/Químico/Físico Biológico Físico/Químico Físico/Químico A parte de estas técnicas convencionales se están desarrollando otras que se centran en optimizar los procesos de eliminación de nitrógeno y fósforo de las aguas residuales con bacterias, plantas acuáticas, algas, microalgas, microalgas encerradas en alginatos, etc. Estos procesos se denominan genéricamente como fitorremediación. El uso de microalgas en el tratamiento de aguas residuales fue propuesto y experimentado en 1946. El objetivo era proporcionar un tratamiento terciario para aguas urbanas o agrícolas, basado en favorecer el crecimiento algal y en la probada eficiencia de las microalgas de absorber nutrientes como el nitrógeno (amonio o formas oxidadas inorgánicas) y fósforo (ortofosfato) que causan problemas de eutrofización cuando son descargados al cauce receptor. Aunque no hay estudios al respecto, se puede extrapolar el crecimiento algal a la eliminación de nutrientes en una salmuera. Dado el gran interés por la producción de ciertas especies de microalgas (Spirulina, Dunaliella, etc) en otros campos como la acuicultura, la nutrición, la medicina, etc se pueden realizar estudios de adaptabilidad de dichas especies a la salmuera procedente de la planta de la universidad. Así además de estudiar la eliminación de nutrientes se podría obtener un producto con un valor en el mercado. Las microalgas son organismos con estructura eucariota, fotoautótrofos, capaces de transformar la luz solar en energía química mediante fotosíntesis oxigénica con una elevada eficiencia y además capaces de asimilar carbono en forma de CO2. Presentan altas tasas de producción, adaptabilidad a distintas condiciones ambientales y están presentes en cualquier medio acuático donde exista una fuente de carbono, nutrientes y luz suficiente junto con un intervalo apropiado de temperatura. Existen varios problemas para la implantación de estos sistemas de depuración con microalgas como son la necesidad de un conocimiento profundo de la fisiología y bioquímica de las microalgas, las características del medio de cultivo, la verificación de los resultados de laboratorio a plantas de gran superficie y capacidad que demuestren su operatividad y la competencia con otras técnicas de depuración más convencionales y con un menor coste económico. II. SISTEMA ESTUDIADO: La salmuera que se va a utilizar en el proyecto proviene de la planta desaladora de la Universidad de Alicante. La planta desala agua salobre procedente de un acuífero subterráneo mediante un proceso Osmosis Inversa. La producción máxima de agua desalada es de 450 m3/dia con una conversión del 72%. El agua desalada va a parar a un depósito de regulación y se destina al riego de parques y jardines. Por ese motivo la planta permanece parada cuando el riego está garantizado. La planta produce un caudal medio de 100 m3/día de salmuera y puede llegar a producir un caudal máximo de 175 m3/día. La salmuera se vierte de manera indirecta en la Rambla de Rambuchar en el entorno del acuífero de captación. En la Tabla 1 se pueden observar algunas características del agua del acuífero así como de la salmuera de trabajo. También se han incluido a modo de comparación datos de un análisis de agua de mar y los límites de vertido para esta salmuera impuestos por la Confederación Hidrográfica del Júcar. Tabla 1. Parámetros significativos. Parámetro pH Conductividad Calcio Magnesio Sodio Potasio Cloruros Sulfatos Nitratos Nitrógeno Amoniacal Fósforo Total Boro Bicarbonatos Sílice Hierro Agua del acuífero mg/l 7,2 5710 uS/cm 158 272 991 15,6 1167 1588 148 0 Salmuera a utilizar mg/l 7,7 15360 uS/cm 825 659 2976 80,8 3388 4715 345 <0,08 Agua de mar mg/l 7,8 45000 uS/cm Limitación Vertido mg/l 5,5-9,5 Sin límite 400 1300 10500 390 19000 2700 0,5 0 Sin límite Sin límite Sin límite Sin límite 4400 6200 300 7 <0,1 4,8 345,3 0 0 <0,1 5,46 1025 0 0 0,004 4,5 140 0,3 0,004 8 5 Sin límite Sin límite Sin límite En lo que se refiere a la salmuera, se han contrastado los datos de este análisis (5-09-08) con otros realizados posteriormente, y se ha comprobado que las concentraciones de los parámetros de la salmuera no suelen variar de manera considerable en el tiempo. Como particularidad se puede observar que la concentración de fósforo es bastante pequeña (muy por debajo del límite de vertido impuesto por laconfederación y también por debajo del que impone la directiva europea 91/271/CEE) El nitrógeno se encuentra prácticamente en forma de nitrato. La concentración de nitratos es muy alta y sobrepasa los límites de vertido (tanto el de confederación como el de la directiva europea 91/271/CEE) La concentración de boro también sobrepasa el límite de vertido. Las concentraciones de cloruros y sulfatos son bastante elevadas pero están dentro de los límites de vertido. La ausencia de fósforo condiciona el desarrollo del proyecto en dos sentidos: -En primer lugar, el proyecto se centrará en la eliminación de nitrógeno en forma de nitrato del vertido de salmuera (para cumplir los límites de vertido) - Por otro lado la proporción atómica de los principales nutrientes C:N:P en los organismos planctónicos es de 106:16:1 (REDFIELD, 1934; FLEMING, 1940). Es decir el fósforo es un elemento esencial en el crecimiento de las microalgas por lo que es muy posible que sea necesario aportarlo para que puedan crecer estos microorganismos y poder eliminar así más cantidad de nitrato. Ahora bien añadir fósforo entraría en contradicción con los objetivos iniciales del proyecto por lo que habrá que añadirlo en pequeñas cantidades y tener en cuenta que no se rebase la concentración máxima permitida en el vertido. Las características de la salmuera también condicionan el proyecto en otro tipo de aspectos. Una de las mayores dificultades proviene de encontrar la especie o especies que se adapten mejor a este tipo de salmuera ya que tiene unas características diferentes al agua de mar o al agua dulce que son los medios acuáticos más convencionales y de los cuales proceden la mayoría de especies que se usan para cultivo comercial. No se encontró en toda la bibliografía consultada ningún trabajo que reporte cultivos de microalgas en salmuera procedente de desaladoras por lo que el presente trabajo es innovador en este campo. Es necesario por tanto, un trabajo previo de selección y/ o adaptación de especies a este medio tan particular Teniendo en cuenta todas estas consideraciones se establecen los objetivos del proyecto. II.1 Objetivos del proyecto: - Eliminación de nutrientes de la salmuera de la desaladora de la Universidad de Alicante mediante cultivo de microalgas. - Utilización de salmueras como medio de cultivo de microalgas de interés industrial. III. MATERIAL Y MÉTODOS: III.1 Parámetros físico-químicos: Todos los análisis químicos se efectuaron conforme a los métodos estandarizados APHA-AWWA-WPCF (1989). A continuación se describe el fundamento analítico de los métodos utilizados en la medida de los parámetros del proyecto. En el Anexo I se incluye una descripción más detallada de dichos métodos. Conductividad eléctrica y Salinidad: Se determinó con un conductímetro CRISON CM-35 dotado de célula con electrodo de platino. pH: Se midió con un Ph-metro Crison Basic 20+ Nitratos: Se determinaron mediante el método espectrométrico del ultravioleta selectivo. Las medidas se realizaron con el espectrofotómetro GÉNESIS. Cloruros, bromuros y sulfatos: Se determinaron por cromatografía iónica en la SSTTI de la Universidad. Fosfato, Boro, Hierro: Se determinaron por ICP en la SSTTI de la Universidad. Peso Seco: Para determinar el peso seco se filtró una proporción adecuada de suspensión de algas a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa de 0,45 micras de tamaño de poro. Se dejó secar el filtro durante varias horas a 60ºC en un horno y se pesó. En el proceso de filtrado mediante bomba de vacío se utiliza el filtro para calcular el peso seco y el agua filtrada para realizar los análisis de nitratos y otros iones. III.2 Parámetros biológicos: Densidad celular (células/ml): El seguimiento del cultivo se hizo mediante recuento celular en cámara hematocitométrica Neubauer con un microscopio Aixiocop2plus. Tasa crecimiento(dia-1): La tasa de crecimiento de un cultivo en fase exponencial proporciona información sobre el tiempo que tarda en duplicarse una cantidad determinada de células. Se calcula a partir de las densidad celular final (Xf) e inicial (X0) en un intervalo de días (t) mediante la empresión: = lnXf − lnX0 / DELTAt IV. ALCANCE Y DESARROLLO DEL PROYECTO: Como se ha comentado anteriormente el principal objetivo del proyecto es la eliminación de nutrientes de la salmuera de la desaladora de la Universidad de Alicante mediante cultivo de microalgas. Un segundo objetivo es el empleo de salmueras como medio de cultivo de microalgas de interés industrial. Para su desarrollo el proyecto lo dividimos en cuatro etapas: 1. Aislamiento y adaptación de especies en la salmuera. Selección de especies. 2. Optimización del medio de cultivo. Crecimiento de cepas y desarrollo de inóculos en laboratorio (tubos de ensayo y matraces de 250 ml) 3. Traslado de los cultivos a fotobioreactores de volumen 2 L en condiciones controladas. 4. Simulación del proceso en reactores de volumen intermedio y desarrollo de una planta piloto preindustrial. FASE 1: AISLAMIENTO Y ADAPTACIÓN DE ESPECIES EN LA SALMUERA. SELECCIÓN DE ESPECIES. Una de las mayores dificultades del proyecto proviene de encontrar especies que se adapten a las características de la salmuera. Para desarrollar esta primera fase se trabajó de dos maneras diferentes: a) Aislando especies que crecían en la salmuera en el entorno de la planta desaladora y en la zona de vertido de la misma b) Realizando ensayos con especies conocidas y comprobando su adaptación a la salmuera. a) Para aislar especies se procedió de la siguiente manera: En el exterior de la planta desaladora, se puso un recipiente al sol con la salmuera que sale de la planta y se dejó dos semanas para comprobar la colonización por parte de las especies presentes en la propia salmuera y en el aire y partículas de polvo del entorno. Pasadas las dos semanas se observó color verde en el recipiente y se llevó a observación al microscopio. La comunidad presente estaba formada por una clorofícea clorococal, la cianofícea filamentosa Anabaena sp y las diatomeas bentónicas de los géneros Nitzschia y Navicula. Estas últimas a pesar de ser interesantes por su alto contenido en sílice, como producto valorizable, su cultivo no es operativo ya que se adhieren a las paredes del recipiente y oscurecen rápidamente el interior. No obstante se mantienen en la cámara del laboratorio como todas las demás especies que hemos aislado por si fueran de utilidad mas adelante. Por otro lado se cogió una muestra de la zona de vertido en la rambla de Rambuchar y se filtraron 6 L de agua a 10, 5 y 3 micras de tamaño de poro para separar las algas de posibles organismos zooplanctónicos y obtener distintos inóculos con especies de entre 3 y 10 micras diámetro. Se tomó el sobrenadante de los filtros y se sembró igualmente en salmuera enriquecida con nutrientes para estimular el crecimiento de las especies presentes, siempre pensando en la creación de inóculos tolerantes a la salmuera. A partir de las dos muestras y por el método de diluciones sucesivas se consiguió aislar 6 especies: 4 del grupo clorofíceas, una diatomea y una cianofícea filamentosa: Botryococcus sp. Scenedesmus quadricauda Scenedesmus acuminatus Chlorella sp Nitzschia sp Anabaena sp. Las 4 clorofíceas son de los géneros Chlorella, Botryococcus y Scenedesmus . Para su correcta identificación se hace necesario el análisis genético. No obstante están separadas y se puede trabajar con ellas a falta de una caracterización más exacta. b) Los ensayos de adaptación fueron los siguientes: Se realizaron ensayos con las siguientes especies de las que se tiene larga experiencia en cultivos tanto para investigación como con fines comerciales. Fueron adquiridas en centros especializados, o aisladas en agua dulce en trabajos anteriores del equipo de investigación. En paralelo seguía el proceso de adaptación de las autóctonas Spirulina subsalsa Dunaliella salina. Mychonastes sp Nannochloropsis salina Scenedesmus tenuispina Pavlova lutheri Tetraselmis Chuii Chlamydomonas sp De las dos primeras especies se tiene una gran experiencia en explotaciones industriales, ya que han sido estudiadas desde los años 60. Las otras seis especies han sido estudiadas posteriormente. Todas tienen como finalidad obtener suplementos alimenticios (ácidos grasos omega-3, beta caroteno, proteínas, etc) tanto para alimentación humana como animal (acuicultura) Se pusieron 6 tubos de ensayo con salmuera enriquecida y 2 ml del cultivo de cada especie. Todos estos ensayos se llevaron a cabo en cámara de cultivo cerrada con temperatura 18ºC y luz natural con fotoperíodo 16-8. Al cabo de 3 semanas los resultados fueron los siguientes: Cultivo de Dunaliella: sobreviven, pero no se aprecia crecimiento. Cultivo de Spirulina subsalsa: no sobreviven. Cultivo de Mychonastes sp: sobreviven y crecen Cultivo de Nannochloropsis salina: sobreviven y crecen . Cultivo de Scenedesmus tenuispina: sobreviven y crecen . Cultivo de Pavlova lutheri: sobreviven y crecen . Cultivo de Tetraselmis chui: sobreviven y crecen pero se adhieren a las paredes. Cultivo de Chlamydomonas sp: sobreviven y crece moderadamente pero se adhieren a las paredes. Para desarrollar las siguientes fases del proyecto se seleccionaron dos de las especies que mejor se han adaptado (Nannochloropsis salina y Mychonastes sp) Los criterios para seleccionar estas especies fueron los siguientes: - Se ha observado un gran crecimiento (densidades celulares altas) - No se adhieren a las paredes de los recipientes lo que facilita trabajar con ellas. - Resistentes a la contaminación bacteriana. - Tienen aplicaciones en otros campos como por ejemplo la acuicultura. Por cuestiones de espacio y de tiempo se consideró trabajar de momento con sólo estas dos especies. Se han descartado las especies aisladas en la salmuera porque no han sido todavía completamente identificadas. No obstante no se descarta utilizar cualquiera de las otras especies en fases posteriores del proyecto. De momento tampoco se contempla la posibilidad de utilizar una combinación de especies por las dificultades que presentaría su estudio. FASE 2: OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO. CRECIMIENTO DE CEPAS Y DESARROLLO DE INÓCULOS EN LABORATORIO (TUBOS DE ENSAYO Y MATRACES DE 250 ML) En esta fase se realizaron tres experimentos principales con las dos especies indicadas anteriormente (Nannochloropsis salina, y Mychonastes sp) y cada uno con unos objetivos diferenciados (optimización del medio de cultivo para obtener las mayores densidades celulares, comprobar el efecto del cambio de volumen, la iluminación, etc) A continuación se detallan las características de cada experimento, sus objetivos, los resultados obtenidos y las conclusiones: a) EXPERIMENTO PARA OPTIMIZAR EL MEDIO DE CULTIVO (TUBOS ENSAYO DE 30 ML CON SALMUERA AUTOCLAVADA) Y ADICIÓN DE DIFERENTES NUTRIENTES (TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 20 W) b) EXPERIMENTO PARA MEDIR EL EFECTO DEL FÓSFORO (TUBOS ENSAYO DE 30 ML CON SALMUERA AUTOCLAVADA , TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 20 W) c) EXPERIMENTO EN MATRACES DE 250 ML CON SALMUERA SIN AUTOCLAVAR (TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 60 W) a) EXPERIMENTO PARA OPTIMIZAR EL MEDIO DE CULTIVO (TUBOS ENSAYO DE 30 ML CON SALMUERA AUTOCLAVADA) Y ADICIÓN DE DIFERENTES NUTRIENTES (TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 20 W) El objetivo de este experimento era encontrar el medio de cultivo en el que se pudiera conseguir mayor rendimiento y compararlo con el medio de cultivo que se desea depurar (la salmuera sin ningún aditivo) Tomando como referencia el análisis de la salmuera realizado en el mes de Septiembre (que se incluye en el Anexo II) la salmuera tiene un contenido en P total < 0,1 mg/L. Se utilizó la salmuera como medio de control y cuatro medios más compuestos por salmuera más una serie de aditivos que se suelen utilizar en cultivos de microalgas (fosfato, metales y vitaminas en las proporciones del medio de cultivo f2 de RYTHER & GUILLARD) Los medios de cultivo utilizados son: -Salmuera Sola (S): -Salmuera+Fosfato (SF): -Salmuera+Fosfato+Metales (SFM): -Salmuera+Fosfato+Vitaminas (SFV): -Salmuera+Fosfato+Metales+Vitaminas (Todo): Fósforo Total<0,1 mg/l Fósforo Total=1mg/l Fósforo Total=1mg/l Fósforo Total=1mg/l Fósforo Total=1mg/l Para cada medio y especie se utilizaron tres tubos de ensayo con el fin de tener réplicas en total 45 tubos de ensayo que se colocaron en una nevera a 22ºC con luz artificial de 20 W en fotoperiodo 16-8. Se realizó la siembra que se dejó crecer por 3 semanas. El seguimiento de cultivo se hizo mediante recuento celular en cámara hematocitométrica Neubauer con un microscopio Aixiocop2plus. Los resultados en (células/ml) se transfirieron a gráficas (ver figuras 1 y 2) para seguir mejor su evolución: Nannochloropsis (tubos ensayo) 12000000 CELULAS/ML 10000000 S 8000000 SF 6000000 SFM SFV 4000000 TODO 2000000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 DIA Figura 1. Densidades celulares en los experimentos para la especie Nannochloropsis salina. Células/ml Mychonastes (tubos ensayo) 5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 S SF SFM SFV TODO 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Dia Figura 2. Densidades celulares en los experimentos para la especie Mychonastes sp. Los mejores rendimientos se obtuvieron con el medio Todo y SFM respectivamente Las conclusiones de este primer experimento fueron las siguientes: - En la salmuera sin ningún aditivo las densidades celulares que se obtuvieron fueron muy bajas. Por tanto es conveniente que el medio a utilizar lleve fósforo (en una concentración máxima aún por determinar) y metales (prácticamente todos los experimentos posteriores se hicieron con el medio SFM) - Las vitaminas no parecen vitales, aunque a largo plazo pueden tener importancia y es posible que al cabo de unas cuantas generaciones, se expresen sus deficiencias. Aunque no se añadieron vitaminas en posteriores experimentos se tiene en cuenta esta posibilidad si se observan problemas en los cultivos. - Es necesario conocer la concentración inicial de cada especie para tener un punto de partida claro. Es importante agitar bien el recipiente antes de tomar la muestra para contar. - Todo el proceso de crecimiento y por tanto el consumo de nutrientes se da en la primera semana, por lo que es importante que se tomen muestras diarias hasta el día en que se estabiliza el crecimiento y a partir de ahí, tomarlas en días alternos. - El cambio de temperatura ha tenido un efecto positivo pues se observó mayor crecimiento que a 18ºC. La temperatura por tanto es un factor a controlar en futuros experimentos. b) EXPERIMENTO PARA MEDIR EL EFECTO DEL FÓSFORO (TUBOS ENSAYO DE 30 ML CON SALMUERA AUTOCLAVADA , TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 20 W) El objetivo de este experimento era determinar la máxima densidad celular que se puede conseguir modificando la concentración de fósforo. Se partía de la hipótesis de que a mayor concentración de P, y si no hay otro factor limitante, mayor producción de biomasa y por tanto mayor eliminación de nitratos. Por lo tanto se esperaba alcanzar mayor cantidad de biomasa en los tubos con más fósforo y que el proceso fuera más largo también hasta agotar este nutriente. Para conseguir estos resultados se utilizaron las especies Mychonastes Nannochloropsis en tubos de ensayo de 30 ml. y Para dicho experimento se prepararon 16 tubos de ensayo (4 medios diferentes x 2 tubos por medio x 2 especies). Los medios de cultivo esta vez fueron los siguientes: -Salmuera sin aditivos (S)<0,1 mg Fósforo Total -Salmuera+Dosis normal de fosfato+Metales (SFM)= 1mg/l Fósforo Total -Salmuera+Dosis doble de fosfato+Metales (SF2M)= 2 mg/l Fósforo Total -Salmuera+Dosis triple de fosfato+Metales (SF3M)= 3 mg/l Fósforo Total El experimento se mantuvo por 3 semanas con el fin de dar tiempo suficiente a una posible separación de las curvas de las distintas concentraciones de fosfato. El seguimiento de cultivo se hizo nuevamente mediante recuento celular Los resultados en (células/ml) se transfieron a gráficas (ver figuras 3 y 4) Además se incluyeron en tablas los valores de las tasas de crecimiento (tablas 2 y 3) que informan sobre la velocidad de duplicación de los cultivos. Tabla 2.Tasas de crecimiento de la especie Nannochloropsis salina. -1 Dias 1 2 3 4 5 8 9 10 11 12 15 16 17 18 19 Maxima dens (Cel/ml) Tasas de crecimiento (dia ) S -0,086 -0,743 1,460 -0,074 0,021 0,047 -0,071 0,052 0,059 -0,055 0,101 SFM 0,162 -0,665 1,423 0,417 0,299 0,336 0,200 -0,093 0,125 0,119 0,256 0,142 -0,007 0,125 S2FM -0,050 -0,332 1,264 0,305 0,305 0,378 0,371 -0,170 0,030 0,166 0,102 0,273 -1,066 1,048 1,8E+0 6 3,5+07 3,2+07 S3FM 0,018 -0,417 1,178 0,474 0,315 0,264 0,086 0,287 -0,085 0,116 0,278 -0,022 -0,088 0,263 3,0E+07 Nannochloropsis (ensayo fósforo) 4,00E+07 3,50E+07 CELULAS/ML 3,00E+07 2,50E+07 Salmuera Salm + 1P 2,00E+07 Salm + 2P Salm + 3P 1,50E+07 1,00E+07 5,00E+06 0,00E+00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 DIA Figura 3. Densidades celulares en los experimentos para la especie Nannochloropsis salina. Tabla 3.Tasas de crecimiento de la especie Mychonastes sp. -1 Dias Tasas de crecimiento (dia ) S SFM S2FM 0,394 0,568 0,652 -0,942 -0,667 -0,637 1,687 1,531 1,475 0,104 0,208 0,138 0,087 0,301 0,361 0,220 0,483 0,137 -0,199 -0,058 0,056 0,127 -0,187 0,303 -0,039 0,284 -0,281 -0,012 0,056 0,003 0,268 -0,011 0,001 0,011 0,011 0,080 0,068 -0,355 0,133 2 3 4 5 8 9 10 11 12 15 16 17 18 19 Maxima dens (Cel/ml) 3,5E+0 1,8E+0 1,7E+0 6 7 7 S3FM 0,435 -0,345 1,345 0,238 0,277 0,334 0,125 -0,141 0,193 -0,024 0,055 -0,117 -0,140 0,339 1,4+07 Mychonastes (ensayo fósforo) 2,00E+07 1,80E+07 1,60E+07 Células/ml 1,40E+07 Salmuera 1,20E+07 Salm + 1P 1,00E+07 Salm + 2P 8,00E+06 Salm + 3P 6,00E+06 4,00E+06 2,00E+06 0,00E+00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Dia Figura 4. Densidades celulares en los experimentos para la especie Mychonastes sp. En los tubos con salmuera sin fósforo el crecimiento fue muy pequeño y se estancó en los primeros días. Este resultado estaba dentro de lo que se había previsto y confirmó que la escasez de fósforo en la salmuera limita el crecimiento de las microalgas. Los resultados en el resto de los experimentos no fueron los esperados ya que no se observaron diferencias entre las tres concentraciones de P utilizadas (1, 2 y 3 mg P/litro) No se cumplió la hipótesis inicial y el incremento de fósforo no tuvo efecto sobre el crecimiento algal. Como se puede comprobar en las figuras 3 y 4 el crecimiento fue muy similar para las tres concentraciones de P y la velocidad y duración del proceso la misma. Este hecho se contrastará en posteriores experimentos. El crecimiento presenta pautas similares en ambas especies, si bien Mychonastes presenta cierta intolerancia al exceso de P, ya que las máximas densidades celulares se dieron en los tubos con menos P. A raíz de estos resultados se decidió usar la concentración mínima (1 mg P/l) en los sucesivos experimentos a escala de laboratorio. Para ambas especies y en todos los medios, las tasas máximas de crecimiento se obtuvieron el cuarto dia, en concordancia con otros trabajos consultados. Según estos mismos estudios en estos primeros días la tasa de consumo de nutrientes (fósforo y nitrógeno) es también mayor, llegando incluso a almacenarse en el interior de las células para ser utilizados posteriormente. A partir del día 13 el comportamiento observado (estabilización de las gráficas y posterior aumento de la densidad celular) se debió a un reciclado de nutrientes por envejecimiento del cultivo y a recuentos de microalgas muertas. c) EXPERIMENTO EN MATRACES DE 250 ML CON SALMUERA SIN AUTOCLAVAR (TEMPERATURA 22ºC , ILUMINACIÓN 60 W) Con este experimento se pretendía estudiar el efecto que tienen tres variables diferentes en el crecimiento algal y obtener por primera vez datos sobre la eliminación de nutrientes (para las dos especies con las que estamos trabajando: Mychonastes y Nannochloropsis) Los objetivos concretos del experimento fueron: - Comprobar como afecta el cambio de volumen al crecimiento algal. - Comprobar la resistencia de las especies de algas a la contaminación bacteriana o de otro tipo, eventualmente presente en la salmuera de la planta (ya que para mayores volúmenes de trabajo y en cultivos exteriores es inviable autoclavar y esterilizar toda la salmuera empleada en el cultivo) - Comprobar el efecto que tiene la iluminación en el crecimiento de las algas. - Calcular la eliminación de nitratos. Para cumplir dichos objetivos se llevaron los cultivos a matraces de 250 ml dentro de cámara. En dicha cámara se controló la temperatura (22ºC) y la iluminación mediante tres lámparas de 20 W cada una(con periodos luz-oscuridad de 18-6 horas) Los medios de cultivo empleados son: la salmuera sin aditivos como control y el medio SFM que dio los mejores resultados en los experimentos anteriores. La evolución de los cultivos se estudió mediante la densidad celular y la tasa de crecimiento (figuras 5, 6 y tablas 4 y 5) Además, al trabajar con mayores volúmenes se pudo calcular la concentración final de nitratos en el cultivo y compararla con la de la salmuera. En este caso se tomó como referencia el análisis de la salmuera realizado en el mes de noviembre (que se incluye en el Anexo II) La principal diferencia con el anterior análisis es que la salmuera en este caso tenia un contenido en P total de 0,281 mg/l. Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Tabla 4.Tasas de crecimiento de la especie Nannochloropsis salina. Dias Tasas de -1 crecimiento (dia ) S SFM 2 0,599 0,567 5 0,579 0,637 6 0,080 0,378 7 0,059 0,292 8 0,081 0,329 9 0,098 0,377 12 0,092 -0,008 13 -0,899 0,046 14 1,105 0,294 15 0,387 16 -0,139 Maxima dens (Cel/ml) 1,2+E7 4,8E+07 Nannochloropsis (250 ml) 5,00E+07 Salmuera 4,50E+07 Salm + nut(1P) 4,00E+07 Células/ml 3,50E+07 3,00E+07 2,50E+07 2,00E+07 1,50E+07 1,00E+07 5,00E+06 0,00E+00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Dia Figura 5. Densidades celulares en los experimentos para la especie Nannochloropsis salina. Tabla 5.Tasas de crecimiento de la especie Mychonastes sp. Dias Tasas de -1 crecimiento (dia ) S SFM 2 0,390 0,748 5 0,796 0,781 6 -0,031 0,394 7 0,004 0,196 8 -0,001 0,320 9 0,051 0,006 12 0,001 0,034 13 14 0,153 0,001 0,011 15 0,139 16 -0,083 Maxima dens (Cel/ml) 8,0+06 4,0+07 Mychonastes (250 m l) 5,00E+07 4,50E+07 Salmuera Salm + nut(1P) 4,00E+07 Células/ml 3,50E+07 3,00E+07 2,50E+07 2,00E+07 1,50E+07 1,00E+07 5,00E+06 0,00E+00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Dia Figura 6. Densidades celulares en los experimentos para la especie Mychonastes sp. Al final del experimento se filtró un volumen determinado de cada matraz y se analizaron los nitratos en espectrofotómetro. Los filtros se secaron en estufa a 60º y se obtuvo el peso seco de la biomasa final. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla resumen: Densidad celular Maxima Fósforo inicial Nitratos final células/ml ppm ppm (mg/l) % g/l Nanno.S 1,18E+007 0,281 310,1 43,9 12,57 0,192 Nanno.SFM 4,86E+007 1,281 245,5 108,5 30,78 0,560 Mychon.S 8,06E+006 0,282 305,6 48,4 13,84 0,177 Mychon. SFM 3,70E+007 1,281 229,2 124,8 35,39 0,581 Muestra Reducción Reducción Nitratos Nitratos Biomasa Las conclusiones de este experimento fueron las siguientes: - En la salmuera sin aditivos el crecimiento de las dos especies fue similar al del otro experimento. Hubo un ligero aumento en la densidad celular debido a que la salmuera contenia un poco más de fósforo. El cambio de escala y la luz no produjeron ninguna mejora. Se volvió a confirmar el efecto limitante del fósforo. - En el otro medio de cultivo el cambio de escala y la mayor iluminación tuvieron como consecuencia un aumento de producción de biomasa (para las dos especies) que se duplicó respecto a la de los tubos de ensayo del experimento b. No se pudo cuantificar la influencia de cada parámetro. - Aunque no se esterilizó la salmuera no se produjo contaminación bacteriana en ninguno de los matraces. En experimentos posteriores se continuó sin esterilizar la salmuera. - En la salmuera sin aditivos la eliminación de nitratos fue menor (un 13%) en cambio en el otro medio de cultivo se consiguió una eliminación de nitrato de hasta un 35 % Se confirmó que a mayor densidad celular y mayor producción de biomasa se produce una mayor reducción de nitratos. Las dos especies dieron resultados muy similares posiblemente por tener un tamaño parecido. FASE 3: TRASLADO DE LOS CULTIVOS A FOTOBIOREACTORES DE VOLUMEN 2 L EN CONDICIONES CONTROLADAS El objetivo de este experimento era mejorar la productividad de las microalgas mediante agitación por aireación (para mejorar la asimilación de CO2) y preparar un montaje estable para obtener mayores inóculos que permitieran pasar a la fase de planta piloto en el exterior. Se partió de la hipótesis de que dicho aumento de productividad produciría una disminución de nutrientes en el medio de cultivo. Los objetivos concretos del experimento fueron: - Comprobar como afecta el cambio de volumen al crecimiento algal. - Comprobar el efecto de la aireación y la agitación del cultivo en el crecimiento algal. - Calcular la eliminación de nitratos y relacionarla con el crecimiento algal. Para cumplir dichos objetivos se llevaron los cultivos a matraces de 2 litros dentro cámara. En dicha cámara se controló la temperatura (22ºC) y la iluminación con tres lámparas de 20 W cada una (con periodos luz-oscuridad de 18-6 horas) La agitación se realizó suministrando aire con una bomba de acuario (9500 cm3/min) que se coloca dentro de la misma cámara. La agitación además de mejorar la asimilación de CO2 y por tanto el crecimiento de las algas debía impedir también su precipitación. Los medios de cultivo empleados fueron: la salmuera sin aditivos como control y el medio SFM que dio los mejores resultados en los experimentos anteriores. Además se continuó sin esterilizar la salmuera. Los experimentos se realizaron con las especies Mychonastes sp , Nannochloropsis salina, y por primera vez y se introducen otras dos especies: Pavlova lutheri y Tetraselmis chuii. Pavlova lutheri y Tetraselmis chuii son dos especies marinas que se han adaptado a la salmuera en sucesivas diluciones en agua de mar. Aunque hasta este experimento no habían sido probadas (por disponibilidad de espacio y tiempo) estaban dando muy buenos rendimientos en la cámara de mantenimiento. Son algas muy cultivadas para nutrición animal debido a su alto contenido en acidos grasos poliinsaturados riboflavina y otras moléculas interesantes como polihidroxiesteroles que están siendo investigadas como anticancerígenos. Estas cuatro especies se pusieron en erlenmeyers con 2 l de salmuera con el medio SFM. Se suministró aireación continua y 60 W de luz, en las mismas condiciones. Los resultados obtenidos en estos experimentos fueron los siguientes: Tabla 6.Tasas de crecimiento de la especie Nannochloropsis salina. Dias Tasas de -1 crecimiento (dia ) S SFN 2 0,131 0,077 3 0,532 1,035 4 0,525 0,563 7 -0,136 0,498 8 -0,028 0,148 9 0,950 0,101 10 0,807 0,402 11 -0,652 0,173 14 0,227 0,006 15 -0,589 0,429 16 0,137 -0,263 18 -0,031 Maxima dens (Cel/ml) 0,097 6,3+E 4,2E+0 6 7 Nannochloropsis (2 litros) 4,50E+07 4,00E+07 3,50E+07 Células/ml 3,00E+07 2,50E+07 Salmuera 2,00E+07 Salm + Nut (1P) 1,50E+07 1,00E+07 5,00E+06 0,00E+00 0 5 10 15 20 Dia Figura 7. Densidades celulares en los experimentos para la especie Nannochloropsis salina. Tabla 7.Tasas de crecimiento de la especie Mychonastes sp Dias Tasas de -1 crecimiento (dia ) S SFM 2 0,542 0,148 3 0,888 1,786 4 0,676 0,554 7 0,026 0,457 8 0,144 0,685 9 0,247 0,100 10 -0,116 0,621 11 0,047 -0,292 14 0,027 -0,047 15 -0,264 0,361 16 0,183 -0,232 18 0,041 Maxima dens (Cel/ml) -0,082 6,6+E 9,6E+0 6 7 Mychonastes (2litros) 1,20E+08 1,00E+08 células/ml 8,00E+07 Salmuera 6,00E+07 Salm + Nut (1P) 4,00E+07 2,00E+07 0,00E+00 0 5 10 15 20 Dia Figura 8. Densidades celulares en los experimentos para la especie Mychonastes sp. Las densidades celulares alcanzadas son las máximas que hemos obtenido hasta el momento. El efecto del cambio de escala y la aplicación de aireación, ha producido mayor efecto en Mychonastes que ha alcanzado casi los 100 millones de células por mililitro con tasas de crecimiento en los primeros días próximas a 2 dia-1 lo que significa que la población se duplica completamente en un día. Tabla 8.Tasas de crecimiento de la especie Pavlova lutheri Pavlova Dias Tasa de Crecimiento SFM 4 0,522 5 0,497 6 0,619 7 0,381 8 0,535 11 0,102 12 -0,138 13 0,131 Maxima dens (Cel/ml) 2,3+E7 PAULOVA (SFM) 2,500000E+07 C é lula s /m l 2,000000E+07 1,500000E+07 MATRAZ 2 L PAULOVA 1,000000E+07 5,000000E+06 0,000000E+00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Dia Figura 9. Densidades celulares en los experimentos para la especie Pavlova lutheri. Esta especie tiene un tamaño un poco mayor que Nannochloropsis y Mychonastes por eso las densidades celulares máximas son menores. Tabla 9.Tasas de crecimiento de la especie Tetraselmis chuii Tetraselmis Dias Tasa de Crecimiento SFM 5 0,667 6 0,487 7 0,280 10 0,141 11 -0,549 12 0,458 Maxima dens (Cel/ml) 1,94+E6 TETRASELMIS(SFM) DE NS IDAD CE L ULAR (CÉ L/M L ) 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 TETRASELMIS (2L) 1,00E+06 5,00E+05 0,00E+00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 DIAS Figura 10. Densidades celulares en los experimentos para la especie Tetraselmis chuii. Tetraselmis es una especie que tiene un tamaño unas 5-6 veces mayor que Pavlova lutheri. Para cada experimento se determinó la concentración de nitratos en diferentes días así como la biomasa(g/l) para determinar su evolución. La concentración inicial de nitratos en la salmuera era de 350 mg/l. Los resultados para la reducción de nitratos fueron los siguientes (considerando que la salmuera tiene una concentración inicial de nitratos de 350 mg/l) * Nannochloropsis: Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NS ppm (mg/l) % células/ml 16 336 13,95 3,99 4,02E+06 Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NSFM ppm (mg/l) % células/ml 8 294,0 56,0 16,00 1,38E+07 10 273,2 76,8 21,94 2,28E+07 16 263,0 87,0 24,86 3,26E+07 18 246,5 103,5 29,57 3,96E+07 * Mychonastes: Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NS ppm (mg/l) % células/ml 16 337,2 12,79 3,65 6,13E+06 Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NSFM ppm (mg/l) % células/ml 8 276,2 73,8 21,09 4,70E+07 10 194,2 155,8 44,51 9,68E+07 16 213,6 136,4 38,97 7,15E+07 18 229,5 120,5 34,43 6,07E+07 * Pavlova lutheri: Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NSFM ppm (mg/l) % células/ml 6 296,5 53,5 15,28 6,87E+06 8 279,1 70,9 20,27 1,71E+07 11 273,3 76,7 21,93 2,33E+07 13 270,0 80,0 22,86 2,31E+07 * Tetraselmis Chuii: Dia Nitratos final Reducción Nitratos Reducción Nitratos Densidad celular Maxima NSFM ppm (mg/l) % células/ml 5 262,8 87,2 24,92 5,90E+05 7 237,2 112,8 32,23 1,27E+06 10 186,0 164,0 46,84 1,94E+06 12 192.0 158,0 45,14 1,77E+06 La representación gráfica de los resultados es la siguiente: Eliminación de nitratos 375 350 N itra to s (m g /l) 325 300 Nannochloropsis 275 Mychonastes 250 Pavlova lutheri 225 Tetraselmis Chuii 200 175 150 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Dia Figura 11. Eliminación de nitratos de las diferentes especies El fósforo estaba por debajo de los límites de detección de los métodos utilizados. De todas formas las cantidades añadidas siempre están por debajo de los límites de vertido. Los valores máximos de reducción de nitratos y biomasa obtenidos se muestran en la siguiente tabla resumen, así como el dia que se obtuvieron: Densidad celular Maxima Fósforo inicial Nitratos final células/ml ppm ppm (mg/l) % g/l NS 6,32E+06 0,281 336,0 18,6 5,25 0,20 NSFM 4,24E+07 1,281 246,5 108,1 30,49 0,51 Muestra Reducción Reducción Nitratos Nitratos Biomasa MS 6,65E+06 0,281 337,2 17,4 4,92 0,20 MSF 9,68E+07 1,281 194,2 160,5 45,25 1,57 PSFM 2,31E+07 1,281 270 80,0 22,86 0,67 TSFM 1,94E+06 1,281 186 164 46,84 0,73 S:salmuera, SFM: Salmuera enriquecida con P y metales, N: Nannochloropsis, M:Mychonastes, P: Pavlova lutheri, T: Tetraselmis chuii Resultados y conclusiones de este experimento por especies: - En la salmuera sin aditivos el crecimiento de las especies fue muy pequeño y similar al de los anteriores experimentos. El cambio de escala y la agitación no produjeron ninguna mejora. Se vuelve a confirmar el efecto limitante del fósforo. La eliminación de nitratos ha sido muy baja (igual que el crecimiento algal) - La aireación y cambio de escala ha supuesto mejoras para Mychonastes que ha duplicado su biomasa con respecto a los matraces sin aireación del anterior experimento. Consecuentemente se detectó una reducción de nitratos hasta un 45% - Para Nannochloropsis el aumento de biomasa no ha sido tan apreciable y por tanto la eliminación de nitratos tampoco. Suponemos que hemos alcanzado su densidad celular máxima para la salmuera con la que trabajamos (es una especie marina) - Con Pavlova lutheri no se observó una reducción muy importante de nitratos (22,86%) aunque la cantidad de biomasa producida fue mayor. - Tetraselmis chuii fue la especie de la que mejores resultados se obtuvieron en eliminación de nitratos (46,84%) y la cantidad de biomasa obtenida fue bastante importante. Es la especie de mayor tamaño y aunque presenta algunos problemas de sedimentación tiene muchas aplicaciones industriales y ha sido estudiada ampliamente. Conclusiones finales: La eliminación de nutrientes en la salmuera está asociada al crecimiento algal y es diferente en cada especie. Para favorecer dicho crecimiento es necesario utilizar fósforo y metales en pequeñas cantidades. Es necesario controlar la aireación, la temperatura y la iluminación para optimizar el crecimiento algal. Para reducir completamente la concentración de nitratos sería necesario obtener densidades celulares mayores o bien utilizar un sistema con dos etapas. Con todos estos resultados experimentales ya se puede pasar a la fase 4. FASE 4: SIMULACIÓN DEL PROCESO EN REACTORES DE VOLUMEN INTERMEDIO Y DESARROLLO DE UNA PLANTA PILOTO PREINDUSTRIAL En las anteriores fases del proyecto se comprobó a escala de laboratorio la capacidad de las microalgas para depurar nutrientes (consiguiendo resultados bastante aceptables) y se pudo evaluar en diferentes especies la relación que existe entre crecimiento algal y reducción de nitratos. En esta fase se intentó extrapolar estos resultados a reactores de volumen mayor desarrollando una planta piloto preindustrial evaluando el efecto del cambio de escala y los costes de depuración. Además se tuvo en cuenta el objetivo secundario de utilizar estas microalgas para obtener un producto con un valor en el mercado. En función de los resultados experimentales se establecieron las siguientes condiciones de trabajo: - CULTIVOS MONOESPECÍFICOS porque se puede estudiar mejor la influencia de los diferentes parámetros y optimizar la productividad. También permiten obtener un producto más puro Se seleccionó Tetraselmis porque ha dado resultados muy buenos en la depuración de nitratos y además se utiliza en nutrición animal (cultivos marinos) Actualmente se está estudiando las aplicaciones de Tetraselmis en otros campos por su contenido en vitamina E, proteínas y ácidos grasos. Con la especie Mychonastes se obtuvieron mejores resultados en cuanto a eliminación de nitratos, pero no tiene aplicaciones conocidas por lo que se descartó en esta fase del proyecto. A continuación se incluyen algunas características de la microalga Tetraselmis chuii: Figura 12. Muestras de Tetraselmis chuii (en el microscopio y cutivos en cámara) Volumen celular Lípidos Proteinas Hidratos medio micras/m3 % % % 300 6 52 15 Hasta el momento la producción de Tetraselmis se viene empleando principalmente en acuicultura (para el cultivo integral de moluscos y de estados larvarios de algunos crustáceos y peces) En 1999 la producción de total de algas para este fin fue de 1000 toneladas. El cultivo de algas supone alrededor del 40% de los costes de producción en criaderos de semilla de bivalvos. Los sistemas de cultivo se pueden clasificar según su diseño en dos tipos: -SISTEMAS ABIERTOS: consisten en un estanque horizontal de poca profundidad. Los estanques suelen ser rectangulares, circulares, oblongos (tipo “raceway”) o inclinados -SISTEMAS CERRADOS: fotobioreactores flat-plate, tubulares horizontales, tubulares verticales, etc. Los sistemas abiertos son más baratos y fáciles de operar. En los sistemas cerrados se obtiene mayor producción de biomasa pero son más caros. Normalmente para trabajar con grandes volúmenes se utilizan los sistemas en abierto. La producción de Tetraselmis para acuicultura se viene realizando en sistemas abiertos “raceway” que operan en discontinuo o semicontiuo obteniéndose una producción de 20g/(m2dia) en los meses de verano. El periodo de aclimatación dura de 2 a 3 días y se denomina fase de inducción. Una vez se adaptan a las condiciones, la velocidad de división celular se acelera y el crecimiento del número de células en el cultivo se hace exponencial. Este período dura de 4 a 6 días y se denomina fase de crecimiento exponencial. La velocidad de división celular se ralentiza conforme se va limitando la penetración de la luz a través del cultivo o los nutrientes. Es entonces cuando el cultivo entra en la fase estacionaria que puede durar muchos días en los que el cultivo sigue en esta fase mediante el reciclado de nutrientes, de células muertas y en descomposición. Las distintas fases de cultivo se observan en la siguiente gráfica: Figura 13. Fases de crecimiento de la especie Tetraselmis Chuii. Las piscinas “raceway” son las más utilizadas, tanto en unidades aisladas como en varias unidas formando meandros. Para la agitación se usa una rueda de paletas girando a baja velocidad, hélices o bombas, para que la suspensión celular fluya a lo largo de los canales a una velocidad adecuada. Para disminuir la pérdida de carga y la deposición de sólidos, se sitúan tabiques deflectores en las esquinas de los canales para dirigir la corriente de la suspensión celular. Las paredes se fabrican de polietileno o cloruro de polivinilo. Los estanques abiertos tienen una serie de inconvenientes, destacando la dificultad de controlar la temperatura de la suspensión celular. La profundidad del cultivo no puede ser mayor de 20cm para que la luz llegue a todo el cultivo. La concentración de biomasa en el cultivo es baja, con el consiguiente impacto en los costes de recolección de las células. Estos sistemas de cultivo pueden funcionar de manera discontinua o semicontinua. En los cultivos discontinuos la población va pasando por las distintas fases de crecimiento ajustándose generalmente a una función logarítmica. Estos tipos de cultivo tienen la ventaja de ser fáciles de manejar y son adecuados para estudiar cinéticas de crecimiento y los parámetros que inciden en el crecimiento celular. Supone la recogida completa del recipiente de cultivo y es la forma más simple de operar. En los cultivos semicontinuos las condiciones de cultivo pueden ser cuidadosamente controladas. Generalmente al cuarto día el alga ha alcanzado la fase exponencial, entonces se retira el 50% del cultivo y se repone medio fresco. Los costes de explotación son mayores que en los cultivos discontinuos. Algunos ejemplos de estanque “raceway” se muestran en la figura 14: Figura 14. Estanques “raceway”. Continuando con la idea de desarrollar una planta piloto preindustrial para depurar volúmenes mayores de agua y obtener grandes cantidades de biomasa se optó por el cultivo en abierto mediante un estanque raceway. El estanque se ubicará en el exterior de la planta desaladora de la Universidad de Alicante. Antes de dimensionar el estanque se realizó un experimento en el exterior de la planta para obtener datos de crecimiento de la especie Tetraselmis chuii y ver como se comporta dicha especie fuera del laboratorio. El experimento se realizó con una cubeta de plástico transparente con 10 litros de salmuera sin autoclavar, añadiendo 1 ppm de fósforo como nutriente. El área de la cubeta es de 0,2 m2 y el volumen de agua no superó los 10 cm. No se utilizó ningún tipo de agitación. Se controlaron los siguientes parámetros -El pH -El intervalo de temperaturas -La iluminación (en luxes o W/m2) -La densidad celular(células(ml) y la tasa de crecimiento (dia-1) -Productividad por volumen (g/l) y por superfice (g/lm2dia) El experimento se llevó a cabo durante dos semanas en el mes de febrero. Tabla 10. Datos del cultivo de la especie Tetraselmis chuii en exterior Tetraselmis Densidad celular Tasa crecimiento Hora -1 iluminación Tª 2 ºC 12:30 26,79 18 0,636 12:30 51,24 22 1620000 0,83 10:30 36,6 19 9 1000000 -0,157 10:30 32,21 16 12 410000 Maxima dens (Cel/ml) 1620000 Dias células/ml dia W/m 1 35400 0 16:00 5 270000 0,677 13:30 6 270000 0 7 510000 8 11:00 16 pH 8,73 9,22 Los datos de productividad obtenidos fueron los siguientes: Tetraselmis Densidad celular Biomasa Productividad Dias células/ml g/l g/(lm dia) 7 510000 0,206 1,03 8 1620000 0,630 3,15 9 1000000 0,402 2,01 12 410000 0,085 0,43 2 El experimento se paró el decimocuarto dia y se recolectó todo el volumen de algas, realizando diferentes experiencias de filtración y centrifugación para comprobar la fiabilidad de estos métodos. La biomasa obtenida al final mediante filtración fue de 0,45 g/l y la productividad 2,25 g/(m2dia) El octavo dia se alcanzó la máxima densidad celular y la máxima producción. A partir de ahí el cultivo entró en fase estacionaria. La densidad celular en la suspensión tiende a disminuir porque las células se aglomeran y precipitan en el fondo del recipiente. En la siguiente gráfica se presentan las densidades celulares obtenidos en el experimento en exterior así como los datos obtenidos en laboratorio para matraces de 2 litros TETRASELMIS DENSIDAD CELULAR (CÉL/ML) 2,50E+06 2,00E+06 1,50E+06 CULTIVOS INTERIOR (2LITROS) 1,00E+06 CULTIVOS EXTERIOR (10LITROS) 5,00E+05 0,00E+00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 DIAS Figura 15. Comparación de densidades celulares en dos experimentos para la especie Tetraselmis chuii. En el cultivo interior la densidad celular máxima que se obtuvo fue mayor y también la cantidad de biomasa. En cambio en el cultivo exterior se alcanzó el valor máximo al octavo dia mucho antes que en el cultivo en interior. La fase estacionaria por tanto se alcanza antes en exterior y por tanto el tiempo de residencia necesario en exterior también es menor (8 dias). De todas formas el tiempo de residencia se puede ajustar y reducir partiendo de una densidad celular mayor. Lo que es más dificil de aumentar es la densidad celular máxima. Dicha densidad celular está limitada por muchas variables. Según la bibliografía consultada (FAO, Manual práctico de cultivo de bivalvos en criadero) en sistemas abiertos es muy difícil aumentar la densidad celular por encima de dos millones de células/ml principalmente porque no se pueden controlar las variables más importantes como son la iluminación y las variaciones de temperatura. La principal limitación es la iluminación solar (W/m2). Cuando aumenta la densidad celular la luz no llega a todas las células por lo que hay un máximo de células por unidad de volumen incluso aunque haya nutrientes suficientes para que puedan seguir creciendo. La iluminación solar y las temperaturas los días del experimento fueron bastante favorables para el crecimiento algal, por eso se produjo de manera tan rápida. Los cultivos de microalgas, según la bibliografía consultada, dan los mejores rendimientoss durante los meses de abril a octubre cuando las condiciones meteorológicas son más favorables. Depende mucho de la climatología del lugar. Posiblemente en nuestra zona el cultivo se pueda realizar incluso en los meses de invierno, pero esté más limitado en los meses de verano por las altas temperaturas que también inhiben el crecimiento. Otro posible factor que influye en el crecimiento algal es el pH. Según la bibliografía consultada para la microalga Tetraselmis chuii el gradiente de pH recomendado es de 7,5-8,2 (Biondi, Tredici, 2006) Se observó experimentalmente que el pH sube durante el experimento hasta 9,2. El aumento de pH se debe al consumo de CO2 que utilizan las algas en la fotosíntesis. Otra fuente de inhibición es el exceso de O2 que se origina en el fotosíntesis. Se estableció la hipótesis de que la falta de agitación dificultan la renovación del CO2 y la difusión del O2, aumentando el pH y limitando el crecimiento algal. Se intentará solucionar este problema en el sistema abierto utilizando un motor o una hélice para que circule el agua. En el caso de persistir el problema del pH se realizará un aporte controlado de CO2. Además hay que tener en cuenta la pérdida de volumen de agua por la evaporación que origina un aumento de la salinidad. Por los datos que se obtuvieron se puede concluir que el cultivo en salmuera al exterior puede dar resultados bastante aceptables, cercanos a los reportados en la bibliografía por trabajos que usan medios de cultivo más convencionales. Aunque no se podrá controlar la temperatura y la iluminación, se realizará un registro lo más exhaustivo posible para conocer la influencia de dichos parámetros en el crecimiento algal y en la productividad. Una vez comprobada la viabilidad del cultivo de Tetraselmis chuii en exterior se elaboró el esquema de la planta piloto. Para ello se utilizaron tanto los datos experimentales obtenidos en anteriores experiencias como datos bibliográficos sobre instalaciones de cultivo de Tetraselmis chuii. La planta constará de: -Estanque “raceway” -Sistema de recogida (filtración/centrifucación) -Secado producto -Fotobioreactores dentro de laboratorio para producir cultivos madre Los parámetros de control serán los siguientes: -El pH -El intervalo de temperaturas -La iluminación (en luxes o W/m2) -La densidad celular(células(ml) y la tasa de crecimiento (dia-1) -Productividad por volumen (g/l) y por superfice en la recogida final de producto(g/lm2) -Contaminación por bacterias u otros microorganismos El esquema de la planta piloto que propuesto sería el siguiente: Filtración por gravedad o centrifugación 200 Entrada l Salmuera Estanque Secado térmico a 105ºC 1ªetapa Salmuera Depurada Estanque 2ªetapa (opcional) Producto Seco Salmuera sin nutrientes Figura 16. Diagrama de flujo de la planta piloto. La salmuera que sale de la planta se lleva a un depósito de regulación de 200 litros. Este de depósito de regulación sirve para almacenar el agua durante unas horas para que precipiten los sulfatos y otras sales que inhiben el crecimiento de las algas y que pueden ensuciar el fotobioreactor. Del depósito la salmuera pasa al fotobioreactor raceway que estará cubierto con una tela transparente que deje pasar la luz pero que impida el ensuciamiento de la balsa. El estanque irá dotado de una hélice, movida por un pequeño motor de 0,5 kw para el movimiento continuo del medio de cultivo a fin de que la luz llegue a todas las microalgas y haya un buen intercambio de gases con la atmósfera. Las dimensiones del depósito son las siguientes: Profundidad (m) Superficie de cultivo (m2) Volumen de agua (m3) Relación A/V 0,2 0,9860 0,197 5 Figura 17. Esquema del estaque Raceway. La alimentación de la balsa en principio se hará de manera discontinua. En el estanque se introduce el cultivo de Tetraselmis chuii (procedente del laboratorio) con una densidad celular mínima de 35000 células/ml. Aunque la altura de los depósitos puede ser mayor, la profundidad de la lámina de agua no debe superar los 0,2 m para que llegue la luz a todo el cultivo. El tiempo de residencia es de 8 días en el que se alcanza la densidad celular máxima. Se puede acortar este tiempo aumentando la densidad celular máxima inicial. Se añadirá 1 ppm de fosfato. Una vez alcanzada la densidad celular máxima se procede a recoger el cultivo mediante filtrado o centrifugación. La salmuera resultante se puede volver a utilizar como medio de cultivo en otro depósito hasta conseguir la total eliminación de nutrientes. Atendiendo a los datos hasta ahora obtenidos la eliminación total de nitratos se conseguiría en otra etapa de 8 días. En el caso de no querer utilizar el mismo medio se podría utilizar el segundo depósito como una segunda línea de producción, almacen de vertido, etc. La salmuera final se vertería en las mismas instalaciones de la planta y el producto final sería sometido a secado térmico.Con los resultados obtenidos se puede realizar una estimación de 150 gramos de Tetraselmis por 200 litros de salmuera depurada. El sistema de recogida puede ser de dos tipos: 1-Filtración por gravedad: Es el método más simple y económico. Se puede usar distintos tipos de materiales como mallas sintéticas (poliester, poliamida, fibras de celulosa). El tamaño de los poros de la malla puede oscilar entre 10-20 micras. Antes de ser filtrado, el cultivo conviene que pase por un tamiz o malla de 0,3 mm para eliminar los cuerpos extraños como insectos, arenas, etc. Se puede hace uso de un saco colocado encima del estanque o un recipiente con bordes rectos. La filtración se puede acelerar moviendo o raspando suavemente la malla. Últimamente se viene empleando la filtración de flujo tangencial que utiliza como fuerza directriz una diferencia de presión generada por una bomba. La solución se hace pasar tangencialmente por una membrana que es permeable al solvente y no al soluto. La separación se produce en la superficie de la membrana casi únicamente por un mecanismo físico de separación. Seleccionando adecuadamente el tamaño de poro de la membrana y la presión a través de ella, se pueden obtener altos caudales de filtrado y buenos rendimientos. 2. Centrifugación Es el método más directo y aplicable a todo tipo de microalgas tanto filamentosas como unicelulares. Su principal ventaja es su simplicidad y que el producto obtenido no contiene ningún compuesto químico. Implica elevados costes de inversión y alto consumo energético (1 kwh m-3) lo que desaconseja su uso cuando la biomasa a recoger no alcanza un precio elevado en el mercado. En el proyecto se utilizaron ambas técnicas en función de la cantidad de producto que se deseaba obtener. Todos los métodos basados en el principio de sedimentación tienen una eficiencia baja, y a pesar de que consumen una décima parte de la energía empleada en un sistema de centrifugación, el coste relativo de este sistema de recogida de células es de un orden de magnitud mayor que el de la centrifugación. Una vez que la mayor parte del agua ha sido eliminada se procede al secado. Para la mayor parte de las aplicaciones de la biomasa recogida, se necesita obtener un producto que contenga menos de un 10% en agua, ya que la humedad contribuye al deterioro de la biomasa del alga al permitir un cierto crecimiento de bacterias y hongos. El proceso de secado es de los más importantes en la producción de algas y supone un 30% del coste total de la producción y la principal limitación económica junto con el sistema de recogida para la producción de compuestos que no alcancen un elevado precio en el mercado. La selección del método depende de las características del alga, la escala de operación y el uso final del producto seco. En este proyecto se utilizó la técnica de calentamiento en horno a 120º C durante 10 segundos. Posteriormente el producto seco se analizará para conocer su composición exacta en pigmentos, proteinas y ácidos grasos con el fin de concretar la finalidad de la producción de las microalgas. Aunque cuando la producción se realice totalmente en el exterior, es necesario disponer de instalaciones interiores para el mantenimiento de los cultivos stock y el escalonamiento de los cultivos que servirán de inóculo a los sistemas de producción. El proceso de cultivo se inicia a partir de colonias algales en tubos de ensayo, matraces de 100 y 250. Estos cultivos se mantienen como cultivos “stock” de reserva, para disponer de inóculos siempre que se necesiten. Éstos a su vez sirven para inocular en matraces de 2 litros con aireación , con temperatura controlada a 22ºC (tal y como de ha ensayado experimentalmente) Así se dispone de los cultivos madres necesarios para iniciar el cultivo en el estanque “raceway”. El presupuesto aproximado de la instalación es el siguiente: ESTANQUE RACEWAY TELA+BOMBA IMPULSION Y TECHO 1000 Euros ACCESORIOS Y TUBERIAS MATERIAL DE LABORATORIO CULTIVOS MADRE 200 Euros PARA 500 Euros PRODUCTOS QUÍMICOS PARA UN AÑO 300 Euros EQUIPOS DE CONTROL(luxómetro, phmetro, 600 Euros termómetros) TOTAL 2600 Euros La experiencia en el funcionamiento de la planta proporcionará los datos necesarios para evaluar los costes de operación y mantenimiento. El proyecto admite muchas variaciones. Se puede operar la planta en continuo considerando como prioritario la eliminación de nutrientes, suprimiendo los procesos de recogida de algas que resultan muy costosos. V. CONCLUSIONES FINALES: Con los resultados experimentales obtenidos se puede concluir que se pueden utilizar las microalgas en procesos de eliminación de nutrientes en salmueras. La eliminación de nutrientes en la salmuera está asociada al crecimiento algal y es diferente en cada especie. Cuanto mayor es la densidad celular de una especie se obtiene una mayor cantidad de biomasa y una mayor eliminación de nutrientes (nitratos en el caso de nuestro estudio) Es necesario un conocimiento lo más detallado posible de las especies que se desean utilizar para optimizar el proceso de depuración. La fase de adaptación de las especies al medio que se desea depurar es primordial antes de llevar a cabo cualquier tipo de cálculo. Puede ocurrir que especies que dan buenos resultados en procesos de depuración de aguas residuales o en procesos industriales no se adapten a otro medio diferente. Una vez adaptada la especie al medio de trabajo es necesario optimizar su crecimiento para poder conseguir la mayor eliminación de nutrientes posibles en el menor tiempo posible. La optimización del crecimiento pasa por controlar que la relación nitrógeno/fósforo sea la adecuada, añadir oligoelementos, vitaminas, etc. Posteriormente si el proceso de depuración no lo permite o los costes son excesivos se puede dejar de añadir estos compuestos teniendo en cuenta como pueden afectar al crecimiento algal. En nuestro caso se optimizó el medio de depuración añadiendo 1 ppm de fósforo y algunos metales como cobalto, imprescindibles para el metabolismo de asimilación de nitratos que poseen las microalgas. Otros factores importantes a tener en cuenta son la aireación, la temperatura y la iluminación. Cada especie trabaja con un rango de temperaturas óptimo y unos ciclos de iluminación. La intensidad de la luz suele ser el principal limitante e imposible de controlar en una instalación exterior. Estas variables influyen mucho en el crecimiento algal y hay que tenerlas en cuenta en el proceso de depuración utilizando especies lo más resistentes posibles. La aireación o la inyeccion de CO2 es necesaria para que realicen la fotosíntesis y controlar el pH del medio que suele elevarse durante el proceso. El uso de microalgas en depuración prácticamente ha estado limitado a tratamientos de agua residuales en lagunas aerobias, etc. Como se ha comprobado el proceso de eliminación de nutrientes de puede extrapolar a una salmuera con toda las limitaciones antes comentadas. Normalmente los procesos de producción de algas se han llevado a cabo en discontinuo o semicontinuo. Las operaciones de producción en continuo se están ensayando actuamente en fotobioreactores cerrados. Se puede intentar desarrollar un proceso en continuo de depuracion de nutrientes con microalgas. La separación de las microalgas del agua suele ser el factor limitante y el principal problema a resolver. Hasta ahora la biomasa creada no es importante e y no tiene un gran valor de mercado por lo que se puede suprimir su recogida para abaratar costes y centrar el proyecto en la eliminación de nutrientes. ANEXO I: MATERIAL Y MÉTODOS. Todos los análisis químicos se efectuaron conforme a los métodos estandarizados APHA-AWWA-WPCF (1989). A continuación se describe el fundamento analítico de los métodos utilizados en la medida de los parámetros del proyecto. Nitratos: Se determinaron mediante el método espectrométrico del ultravioleta selectivo. Las medidas se realizaron con el espectrofotómetro GÉNESIS y cubetas de sílice de 1 cm de1 cm de recorrido de luz. Esta técnica se utiliza solamente para medir nitratos en muestras con bajo contenido en materia orgánica. El método requiere una muestra óptimamente clara. Al contener el agua a analizar microalgas es necesario filtrar las muestras turbias con filtro de membrana de 0,45 micras de diámetro de poro. La determinación de nitrato se debe realizar nada más tomar las muestras. Si se debe almacenar consérvese a 4ºC hasta 24 horas, para períodos más largos añádanse 2 ml de H2SO4 y manténgase a 4ºC. El procedimiento para realizar las medidas es el siguiente: Se diluyen las muestras según convenga (ya que la concentración de nitratos no debe superar las 10 ppm) y se enrasan en matraces aforados de 50 ml. Añadir 1 ml de HCl 1 N para evitar interferencias de hidróxido o carbonato de hasta 1000 mg CaCO3/l. El cloruro no afecta a la determinación. Se lee en el espectrofotómetro primero a 220 nm y posteriormente a 275 nm para restar las posibles interferencias por materia. Si la absorbancia de alguna muestra medida a 275 nm es mayor del 10% de la absorbancia medida a 220 nm significa que puede haber interferencias por materia orgánica, y se debe repetir el análisis por el otro método de nitratos (brucina). Antes de medir las muestras es necesario realizar la curva de calibrado con varios patrones que tenga concentraciones de nitrato entre 0-10 mg/l (la curva de calibrado de NO3 verifica la ley de Beer hasta los 11 mg N/l) Para muestras y patrones, réstese dos veces la absorbancia leída a 275 nm de la lectura a 220 nm, para obtener la absorbancia debida a N03-. Trácese la curva patrón comparando la absorbancia debida a N03 - con la concentración de N03- - N del patrón. Utilizando la absorbancia corregida de la muestra, obténgase la concentración directamente a partir de la curva patrón. 0,500 f(x) = 0,043x + 0,005 R² = 0,996 Absorbancia 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ppm NO3(mg/l) Figura 18. Recta calibrado para la obtención de nitratos. Densidad celular(células/ml): El seguimiento de cultivo se hace mediante recuento celular en cámara hematocitométrica Neubauer con un microscopio Aixiocop2plus. En especies móviles de algas, es recomendable añadir 1 ó 2 gotas de formol a la muestra antes de inicial el recuento. Las cámaras hematocitométricas son unos portaobjetos de cristal gruesos con dos cámaras en la superficie superior. Se coloca un cubreobjetos sobre las dos cámaras proporcionando una profundidad que normalmente suele ser de 0,1 mm y haciendo que cada cámara tenga un volumen determinado. La base de cada cámara se marca con una cuadrícula para facilitar el recuento de células dentro de esa región (ver figura 19) Con el cubre colocado, se introducen una o dos gotas de la muestra de algas con ayuda de una pipeta Pasteur para llenar las dos cámaras. Cada uno de los cuadritos pequeños en que se subdivide cada cuadro grande mide 0,05 mm de lado, 0,0025 mm2 de area x 0,1mm de profundidad = 0,00025 mm3 equivalentes a 0,00000025 ml. Como el recuento se hace sobre los 16 cuadros grandes, éstos son de 0.25 mm x 0.25 mm = 0,0625 mm2 x 0,1 mm de profundidad = 0,00625 mm3 equivalentes a 0,00000625 ml. Nº de células /ml = Nº medio de células en un cuadro grande / 0,00000625. Figura 19. Ejemplo de recuento sobre una cámara Neubauer ANEXO II: ANÁLISIS DE LA SALMUERA. Parámetro Análisis Salmuera Análisis Salmuera pH Cloruros Sulfatos Nitratos Nitrógeno Amoniacal Fósforo Total Boro Septiembre2008 mg/l 7,7 3388 4715 345 <0,08 <0,1 5,46 Noviembre 2009 mg/l 7,61 3388 4844 350 <0,08 0,281 5,35 ANEXO III: FOTOS DE LAS ESPECIES Y LOS MONTAJES EXPERIMENTALES. Figura 20. Experimentos de aislamiento y adaptación de especies (fase 1) Figura 21. Experimentos de optimización de medio de cultivo (fase 2) Figura 22. Resultados de los experimentos de la Fase 3 (Nannocholopsis) Figura 23. Resultados de los experimentos de la Fase 3 (Mychonastes) Figura 24. Montaje experimental de la Fase 3(Pavlova lutheri y Tetraselmis Chuii) Figura 25. Montaje experimental de la Fase 4 Tetraselmis Chuii y Pavlova lutheri Figura 26. Célula Tetraselmis Chuii Figura 27. Cultivo mixto de células Pavlova lutheri y Tetraselmis Chuii BIBLIOGRAFÍA: Ana P.Carvalho, Isabel Pontes, Hugo Gaspar, F. Xavier Malcata. Metabolic relationship between macro- and micronutrientes, and the eicosapentaenoic acid and docohexaenoic acid contents of Pavlova lutheri. Enzyme and Microbial Technology 38(2006) Ana P.Carvalho, Luis A. Mereiles and F. Xavier Malcata. Microalgal Reactors: A Review of Enclosed System Designs and Perfomances. Microbial Technology 22(2006) Ana Otero, Jaime Fábregas. Changes in the nutrient composition of Tetraselmis suecica cultured semicontinuosly with different nutrient concentrations and renewal rates. 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