Tamizaje microbiológico a las unidades de sangre (Sífilis) Integrantes: Fecha: 23/05/2019 Introducción La transfusión sanguínea es un procedimiento clínico cuya resolución correcta y oportuna es un factor determinante para tratar pacientes que necesiten compensar glóbulos rojos, plaquetas o algún elemento plasmático, incluso llegando a salvar vidas en casos críticos u operaciones delicadas. Para que una unidad de glóbulos rojos, plaquetas o plasma llegue al brazo de un paciente, debe pasar por una serie de procesos para asegurarnos de que esta no sea perjudicial para el receptor y así lograr una respuesta favorable. Dentro de todos los procesos, se requiere verificar el grupo sanguíneo, la presencia de anticuerpos irregulares, la calidad del elemento sanguíneo, entre otras, pero además se debe cerciorar que la sangre obtenida no contenga elementos infecciosos como virus, bacterias, hongos y parásitos. Ya que, por algunas características de estos mismos, los donantes pueden no saber que son transmisores de estos patógenos. Los principales microorganismos que se deberían buscan en una unidad de sangre son: VIH, virus hepatitis, chagas, sífilis, HTLV, toxoplasma, leishmania, etc. La mayoría de estos puede detectarse mediante ELISA. La técnica de ELISA (en ingles Enzyme-Linked ImmnunoSorbent Assay) es una técnica donde gracias a anticuerpos específicos, enzimas y su sustrato se puede detectar la presencia de antígenos o anticuerpos en el plasma sanguíneo. Por otra parte, también existen test rápidos para algunos microorganismos, entre los cuales destaca el Treponema pallidum, causante de la sífilis, el cual puede ser detectado indirectamente por pruebas como RPR, que consisten en un test de aglutinación utilizando partículas de carbón. En el presente informe se realizará una comparación del test ELISA con RPR utilizándolos para pesquisar la presencia de la infección en suero de 12 pacientes y así observar la diferencia entre estos. Resultados Tabla N°1: Absorbancia de los respectivos controles y muestras según técnica ELISA, medida a una longitud de onda de 450nm. Los resultados denotados con *** presentan absorbancias mayores a las que puede leer el equipo. Control Negativo 1 Control Negativo 2 Control Negativo 3 Control Positivo 1 Control Positivo 2 Control Positivo 3 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Absorbancia a 450nm 0,163 0,142 0,164 2,607 2,654 2,479 2,933 0,145 *** Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10 Muestra 11 Muestra 12 0,164 *** *** 0,139 0,136 3,408 *** 0,163 3,743 Calculo del punto de corte o cut-off: 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 = 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 1+𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 2+𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 3 3 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 = 0,163 + 0,142 + 0,164 3 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 = 0,156 𝐶𝑢𝑡 𝑜𝑓𝑓 = 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠 + 0,2 𝐶𝑢𝑡 𝑜𝑓𝑓 = 0,156 + 0,2 𝐶𝑢𝑡 𝑜𝑓𝑓 = 0,356 Tabla N°2: Resultado de las muestras analizadas según técnica de RPR y ELISA. Para la interpretación del test de ELISA se calculó el resultado de las muestras comparando la absorbancia de cada una con el cut-off calculado anteriormente. Las muestras cuyas absorbancias son menores o iguales a 0,356 se consideraron No reactivas, en cambio las muestras sobre este valor se consideraron Reactivas. Nº de muestra Test RPR Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 Muestra 7 Muestra 8 No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo Test ELISA Absorbancia a Resultado 450nm 2,933 Reactivo 0,145 No reactivo *** Reactivo 0,164 No reactivo *** Reactivo *** Reactivo 0,139 No reactivo 0,136 No reactivo Muestra 9 Muestra 10 Muestra 11 Muestra 12 No reactivo No reactivo No reactivo No reactivo 3,408 *** 0,163 3,743 Reactivo Reactivo No reactivo Reactivo Discusión En este práctico se realizó detección de T. pallidum vía RPR y ELISA IgG e IgM, prueba no treponémica y treponémica respectivamente. RPR es una técnica que se utiliza como prueba de tamizaje para la detección de sífilis y evaluar respuesta al tratamiento y ELISA para confirmación de estas al ser una prueba de detección de anticuerpos contra el treponema. De acuerdo a los resultados obtenidos (tabla Nº2) se desprende que no hubo correlación entre las pruebas realizadas, habiendo en su mayoría resultados No reactivos de acuerdo al RPR y Reactivos con el ELISA. Sin embargo, esto puede deberse a probables falsos negativos por parte del RPR o falsos positivos en el ELISA. En el caso del RPR, la totalidad de las muestras procesadas se reportaron como No reactivas lo cual no se correlaciona con los resultados reactivos obtenidos en ELISA. Los falsos negativos se pueden dar en todas las pruebas no treponémicas por fenómeno de prozona cuando las muestras son fuertemente reactivas, como por ejemplo en una sífilis secundaria en donde los títulos de anticuerpos son altos. Dicho fenómeno puede acontecer por realizar la prueba con muestras no diluidas o bien por un procedimiento incorrecto como dispensar el antígeno sobre una muestra que no fue previamente en la zona de reacción. En relación a la fase de la enfermedad puede obtenerse un resultado negativo en las fases muy tempranas del período primario. En el caso del ELISA, primero que todo se estableció el punto de corte (cut-off) en base al promedio de las absorbancias de los controles negativos más 0,2. Luego observo que las muestras reactivas superaban considerablemente el valor de cut-off establecido, y que ninguna muestra presentaba diferencias pequeñas respecto al mismo, descartándose la necesidad de establecer la zona gris. Dentro del grupo reactivo se observaron 4 muestras que poseían una absorbancia elevada fuera del rango de lectura del equipo (denotado como ***, véase tabla Nº2), esto podría deberse a una alta concentración de anticuerpos, aunque también podría haber errores en la técnica o reactividad cruzada. El resto de las muestras reactivas arroja valores dentro del marco de lectura, lo que podría deberse a que la concentración de anticuerpos es menor a la de las muestras fuera del rango, aunque no se puede descartar errores, también podría ser contaminación del pocillo con otros sueros reactivos. Las muestras que se consideren Reactivas se tienen que volver a analizar por duplicado utilizando más muestra de la misma extracción original. Si este nuevo análisis arroja nuevamente un resultado Reactivo, se asume que esta muestra contiene efectivamente anticuerpos frente a T. pallidum. Estos resultados se deben evaluar con otros datos del paciente e incluir las pruebas no treponémicas. En el caso que en el reanálisis los dos valores se consideren No Reactivos este se considerará como válido.
