INFORME DE LABORATORIO PRÁCTICO N°2: pH Y SOLUCIONES BUFFER Asignatura: BIO-005 Nombre de Autores: Figueroa, Camila Gacitúa, Richard Garret, Javiera León, Joaquín Sanzana, Anastasia Vielma, Támara Nombre del docente del práctico: Cigarroa, Camila Fecha de realización: 16 de abril del 2019 Fecha de entrega: 18 de abril del 2019 Introducción En el laboratorio se trabajará con distintas soluciones para diferenciar pHs e identificar las capacidades amortiguadoras de los compuestos a emplear, además se realizará una titulación de un aminoácido. Las reacciones químicas que ocurren en nuestro organismo necesitan un medio óptimo para llevarse a cabo y así mantener el equilibrio interno. Uno de los principales factores que influyen en el metabolismo es el pH del medio1 y 2. Todas las células necesitan un medio que les permita realizar todas sus funciones sin problemas2. Los tampones o soluciones amortiguadoras se encargan de que el medio permanezca estable, para un correcto funcionamiento del organismo. La acción de los tampones fisiológicos de mantener un pH cercano a 7 (neutro) cuando se expone o agregan concentraciones de disoluciones muy básicas o muy ácidas, puede verificarse debido a la capacidad amortiguadora, viendo si el rango del pK coincide con el pH óptimo y si hay grandes variaciones del pH1 y 3. También hay tampones para medios ácidos como básicos (no es exclusivo del neutro), en especial algunos aminoácidos (en pH bajo) pueden ser muy buenos buffers, debido a su capacidad amortiguadora en un medio ácido y su grupo R1 y 4. La curva de titulación de un aminoácido es la que permite visualizar sí una solución es un buen buffer o no, ya que nos muestra los datos del experimento en una gráfica (zona de tamponamiento)3. Objetivos Evaluar y comparar la capacidad amortiguadora del suero salino, el tampón fosfato y un aminoácido (aspartato) usando diversos métodos para medir el pH. Realizar una titulación de Arginina y dibujar la gráfica (curva de titulación). Procedimiento experimental- Materiales y Métodos Actividad 1 Se vertió en 3 vasos precipitados un poco de las soluciones a utilizar; tampón fosfato, suero salino y aspartato 0,05M. Se midió el pH de las disoluciones y anotó los resultados respectivamente. Se vertió en un pequeño vaso precipitado azul de bromotimol (indicador) y con una pipeta pasteur se le agregaron 5 gotitas aproximadamente a todos los tubos, se anotó los resultados. Se agitaron los tubos para homogenizar. Con una pipeta se agregaron 10, 10 y 11 mL de cada solución a los tubos de ensayo. En total 9 tubos, de los cuales 3 fueron separados (los con 11mL) y los otros 6 se les agregó 1 mL de NaOH 0,1 M a 3 tubos (de disoluciones diferentes) y a los otros 1mL de HCl 0,1 M. Se agitaron los 6 tubos que se les agregó el ácido y base fuerte para homogenizar. Se anotaron los datos finales. Se utilizaron 3 formas para medir el pH de las disoluciones, papel indicador, pHmetro y el indicador azul de bromotimol, para tener más resultados que comparar. Actividad 2 Se midieron con una probeta 50 mL de una solución de arginina 0,05M, los cuales fueron depositados en un matraz Erlenmeyer (rotulado). Se le adicionaron 10 gotas de azul de timol a la solución, y se le midió el pH, el cual resultó 2,72; tomando un color amarrillo intenso. Posteriormente se llenó una bureta de 50 mL con solución de NaOH 0,1M, para ser incorporados a la solución pausadamente, depositando de a 5 mL, y así midiendo el pH y los cambios de color que se generaron cada vez que se incorporaron los 5 mL hasta vaciar completamente la solución de NaOH de la bureta, en el matraz con el aminoácido. Finalmente se graficó la curva de titulación para comprender mejor la variación de pH de la disolución de arginina con la base fuerte. Resultados Actividad 1 Considerar que los tubos 4, 5, 6 7, 8 y 9 tuvieron el mismo pH inicial que sus respectivos tubos 1, 2 y 3. Nomenclatura: Tubo 1 (T1): Suero salino con pH inicial Tubo 2 (T2): Tampón fosfato con pH inicial Tubo 3 (T3): Aspartato con pH inicial Tubo 4 (T4): Suero salino + NaOH Tubo 5 (T5): Tampón fosfato + NaOH Tubo 6 (T6): Aspartato + NaOH Tubo 7 (T7): Suero salino + HCl Tubo 8 (T8): Tampón fosfato + HCl Tubo 9 (T9): Aspartato + HCl Papel indicador (PI) Uso de bromotimol como indicador (BT) pHmetro portátil (PH) TUBOS PI INICIAL BT INICIAL PH INICIAL PI FINAL BT FINAL PH FINAL T1 5 T2 7 T3 3 T4 5 T5 7 T6 3 T7 5 T8 7 T9 3 Amarillo claro 5, 40 Verde Amarillo claro 5, 40 Verde 7,13 Amarillo intenso 2,82 Amarillo claro 5,40 Verde 7,13 Amarillo intenso 2,82 7,13 Amarillo intenso 2,82 5 7 3 12 7 3 1 7 2 Amarillo claro 5,40 Verde Amarillo intenso 2,82 Azul Verde 7,19 Amarillo intenso 1,72 Verde 11,05 Amarillo intenso 3,45 Amarillo intenso 2,40 7,13 7,16 Actividad 2 Los resultados obtenidos fueron los siguientes: Volumen NaOH (mL) 0 [OH-] (M) pH Color Solución 5,25x10^-12 2,72 Amarillo Intenso 5 1,20x10^-6 8,08 Verde-azulado 10 1,41x10^-6 8,15 Verde-azulado 15 2,34x10^-6 8,37 Verde-azulado 20 4,63x10^-6 8,67 Verde-azulado 25 6,92x10^-6 8,84 Azul 30 2,04x10^-5 9,31 Azul 35 3,16x10^-5 9,85 Azul 40 7,94x10^-5 9,98 Azul 45 6,03x10^-4 10,89 Azul 50 1,32x10^-3 11,76 Azul A medida que se iba incorporando la solución de NaOH a la solución de arginina, se apreciaron cambios tanto en el color, como en el aumento de pH; los cambios más notables comenzaron al principio cuando se le agregaron 5 mL a la disolución; pasa de amarillo intenso a verde- azulado. La otra variación importante, se notó que desde los 35 mL el color es un azul mucho más fuerte mientras aumenta considerablemente el pH. Discusión Según la literatura, el sistema de tamponamiento es esencial para mantener la homeostasis del organismo; el pH óptimo que permite el trabajo de las enzimas dentro de la célula es cercano al neutro, además el fosfato se encuentra en concentraciones altas, por ello el tampón fosfato es el más importante y utilizado para evitar las altas fluctuaciones del pH1. También la capacidad amortiguadora del buffer fosfato indica que es eficiente, ya que su rango sería de 5,86 a 7,86. El pka de 6,86 es el que se utiliza para el pH fisiológico, el tampón fosfato es un ácido poliprótico, esto quiere decir que presenta más de dos hidrógenos en su estructura (H3PO4) por lo cual posee 3 equilibrios de ionización asociado cada uno a una constante de disociación distinta1 y 3. Por otro lado, el aspartato, cuyo grupo R presenta un grupo carboxilo, contribuye a que la molécula sea más polar y soluble en agua. Tiene afinidad con el medio ácido, según los experimentos realizados con los tubos de ensayo (de la primera actividad) pudo notarse que este aminoácido es un buen tampón de un medio con pH bajos1 y 4. Por último, de la experiencia de la primera actividad; las soluciones salinas como NaCl(ac) tienden a variar su pH Estructura del Aspartato al entrar en contacto con ácidos o bases fuertes. Su pH termina cambiando notoriamente, debido a la disociación de iones que tienden a reordenarse por cargas 2 y 3. El uso de diferentes técnicas para medir el pH y así notar la capacidad amortiguadora de los compuestos, fue de utilidad ya que permitió comprobar que los resultados no están alejados entre ellos y son consecuentes con la literatura ya establecida respecto al pH. La actividad 2 puede ser explicada por la naturaleza básica en nitrógeno, que, al ser titulado con una base fuerte, pudo mantener relativamente constante un pH básico. Su estructura más estable es en un medio básico, como puede verse en su curva de titulación 1,5 y 6. Presenta 3 pk, de los cuales el del grupo R es de valor más alto1 y 5. Nuestra gráfica no alcanza a mostrar bien las 3 curvas, por lo que se puede proyectar consecuente con la literatura qué si se hubiese agregado hasta unos 65 mL aproximadamente, la curva de mejor la zona de tamponamiento del pk del grupo R y si se principio (durante los primero 10mL, después de a 5mL), el notaría más1,3 y 4. del aminoácido arginina, rico Estructura de la Arginina la gráfica dibujada mostraría hubiese agregado de 1mL al pk con un valor más bajo se Conclusión De acuerdo a los resultados de la primera experiencia y conforme a los objetivos planteados previamente a la realización de la actividad. Pudo notarse que las disoluciones de los 9 tubos de ensayo, solo las que se les agregó una base o un ácido fuerte, presentaron un comportamiento diferente: identificándose que el aspartato, aminoácido, cumple como un buffer de medio ácido. Y el tampón fosfato como buffer en pH neutro. Esto se debe a sus capacidades amortiguadoras y a su naturaleza o estructura química. La segunda experiencia, se puede concluir que al titular un aminoácido (y anotar sus cambios de pH según el volumen de disolución que se agrega, NaOH en este caso) puede estimarse aproximadamente sus zonas de tamponamiento y pk, ya que, al graficar los datos obtenidos, muestra una curva que indica claramente que hay zonas en que el pH permanece relativamente constante, y también, zonas en que se eleva considerablemente. Referencias Bibliográficas 1.Lehringer. El agua: 2.3 Tamponamiento contracambios de pH en los sistemas biológicos. En: Geller, E. Principios de Bioquímica. 6ª Edición. España: Editorial omega; 2009. p. 43-70. 2.Lehringer. Fundamentos de bioquímica: 1.2 Fundamentos químicos. En: Geller, E. Principios de Bioquímica. 6ª Edición. España: Editorial omega; 2009. p. 1-40. 3.Lehringer. El agua: 2.2 Ionización del agua, ácidos débiles y bases débiles. En: Geller, E. Principios de Bioquímica. 6ª Edición. España: Editorial omega; 2009. p. 43-70. 4. Lehringer. Aminoácidos, péptidos y proteínas. En: Geller, E. Principios de Bioquímica. 6ª Edición. España: Editorial omega; 2009. p. 71-112. 5. Romo, M., et al. LA L- ARGININA: EL AMINOÁCIDO DE LAS HERIDAS. Rev. enferm. CyL Vol 4 - Nº 2: 2012; p. 65-79. Disponible en: http://www.revistaenfermeriacyl.com/index.php/revistaenfermeriacyl/article/view/85/ 63 6. Martínez-Augustin, O. y Sánchez de Medina, F. Rev. Ars Pharm 2004; 45 (4): 303-317. Cuestionario 1.Defina los conceptos de ka, pka y kw ka: constante de disociación de un ácido débil para calcular el pka y pH de una solución. pka: la fuerza que tienen las moléculas de un ácido débil al asociarse, funciona como rango para estilar la capacidad amortiguadora de una solución buffer. kw: constante de disociación del agua o producto iónico del agua. Su valor es de 10-14; kw= [H30+]x[OH-]= 10-14 o [H+]x[OH-]= 10-14 2. Explique químicamente la relación existente entre el pka de un ácido y el pH del medio en que se encuentra. El pka± 1 es el rango, capacidad de amortiguación de una solución tamponante. Permite ver si la solución puede mantener un pH constante y así el equilibrio. La interacción de [H+] en un determinado pH puede regularse (para que no haya fluctuaciones bruscas) con un buffer. Si la concentración del ácido y su base conjugada o sal son iguales, el pH sería igual al pka (esto se puede sacar de la ecuación de hasselbach) 3.Explique la importancia de las soluciones buffer en la fisiología humana. Uno de los factores que puede tanto favorecer como inhibir la actividad enzimática de nuestro organismo es el pH del medio, por lo que es necesario mantener en los diferentes compartimentos del cuerpo pH específicos y distintos; para que las enzimas lleven a cabo sus funciones correctamente. A pH fisiológico las células trabajan, el cual es relativamente constante, las soluciones buffer impiden las variaciones extremas de éste, y así evitar cualquier patología o incluso la muerte. 4. Indique los pares ácido-base conjugados con los que se trabajará en el presente práctico. Ácido/ Base Tampón fosfato: H2PO4Aspartato: C4H7NO4 NaOH HCl Arginina: C6H14N4O2 Base/ Ácido Conjugado HPO4-2 C4H6NO4 ,grupo R ionizado y carga (-) OHClC6H15N4O2 ,grupo R ionizado y carga (+) 5. Identifique los grupos funcionales protonables de la glicina, histidina y glutamato Glicina: su grupo R es el hidrógeno, puede formar puentes de hidrógeno. Histidina: la cadena de cicloalqueno con nitrógeno, puede protonarse y formar puentes de hidrógeno, del grupo R. 1 1 Glutamato: el ácido carboxílico del grupo R puede protonarse y formar puentes de hidrógeno. 6. Indique la importancia, en relación a su carrera, del buffer fosfato. No hay una relación directa con el buffer fosfato en la aplicación de la kinesiología propiamente tal, a menos que sea un kinesiólogo en el área de investigación, y realice comparaciones o asociaciones entre el deporte, salud, homeostasis y las variaciones de pH. Casi en ningún caso se puede interactuar con los buffers, ya que los kinesiólogos no dan recetas, no inyectan sustancias, etc. La única relación indirecta es con la variación del pH, cuando una persona presenta una acidosis o alcalosis metabólica y se puede asistir con ejercicios, movimientos o masajes que ayuden a controlar la respiración para compensar y retomar la normalidad. 7. Interprete la curva de titulación para los aminoácidos alanina y glutamato. Según la gráfica, el glutamato presenta 3 pk y zonas de tamponamiento, en cambio la alanina 2 pk y zonas de tamponamiento. Esto se debe a que el glutamato se comporta como un ácido poliprótico y la alanina no. Por sus pk, ninguno podría ser un buen buffer a pH fisiológico, pero si pueden ser buenos a pH ácido. 8. Para preparar una solución con fármaco L1.1, es necesario utilizar concentraciones muy bajas debido a la poca solubilidad del compuesto en agua. Sabiendo que el fármaco posee un grupo carboxilo en su estructura (pka COOH=4), explique si su preparación ud utilizaría un tampón fosfato (pH 7,2) o un tampón acetato (pH 4) Tampón acetato porque al pH que actúa entra en el rango del pka COOH del fármaco, aumentaría la solubilidad debido a que habría más formación de puentes de hidrógeno, el fármaco y el tampón tienen un grupo carboxilo en común y los hace afines. En un pH bajo 4 el fármaco estaría protonado, al subir el pH tendría carga negativa y el tampón se encargaría de la disolución de L1.1 en el agua, sin que varíe tanto su pH (el pH del agua es más cercano al neutro y menos ácido)
