INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INDERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO PRÁCTICA #8 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS ALVIS PÉREZ EDWIN TONATIUH 2BV1 PRESENTA EQUIPO 2 BARRAGÁN MALDONADO LIZETH FRAUSTO ROCHA JUAN EMMANUEL GARCÍA VARGAS MARTÍN ENRIQUE GÓMEZ TORRES BRENDA GUADALUPE ROMÁN MURILLO ULISES PROFESORES AZA GONZÁLEZ CÉSAR MACÍAS SÁNCHEZ KARLA LIZBETH SÁNCHEZ LÓPEZ JUAN FRANCISCO SILAO DE LA VICTORIA A 29 DE NOVIEMBRE DE 2018 OBJETIVOS Aislar hongos obtenidos de diferentes muestras y conocer sus características morfológicas y estructurales para lograr su identificación. Identificar el tipo de hifa que posee cada microorganismo inoculado. INTRODUCCIÓN Los hongos son organismos que tienen células con núcleo (eucariotas) y que requieren de otros seres vivos para obtener su alimento (son heterótrofos). Sus células poseen una pared gruesa de un compuesto llamado quitina, el cual les provee rigidez y resistencia. La quitina también es el principal constituyente del exoesqueleto de los artrópodos. La mayoría de los hongos son pluricelulares y sus cuerpos están constituidos por filamentos tubulares microscópicos, denominados hifas, que se ramifican y entrecruzan. (CONABIO, 2012). Algunas hifas, que se conocen como hifas septadas, poseen unas paredes internas llamadas septos, que las dividen en células. Otras hifas carecen de septos y son cenocíticas, con múltiples núcleos en un citoplasma común. (Hongos, s.f.). Un conjunto de hifas se conoce como micelio. Lo que vemos sobre la superficie con diversas formas y a veces con “sombrerito” y que también llamamos hongos son los órganos reproductivos de uno de los grupos. Para alimentarse, los hongos primero descomponen su alimento en pequeñas moléculas que después absorben a través de las membranas de sus células. La mayoría se alimentan de materia orgánica muerta (saprobios), otros son parásitos y algunos son depredadores. (CONABIO, 2012). Durante la reproducción sexual o asexual, los hongos producen esporas que permiten su dispersión hacia nuevos lugares o les ayudan a sobrevivir en condiciones adversas, como la deshidratación o la congelación. También pueden desarrollarse a partir de cualquier fragmento de micelio, por pequeño que sea, aunque esto no ocurre frecuentemente (CONABIO, 2012). Los hongos son de suma importancia para los seres humanos, ya que estos cuentan con varios aspectos de suma importancia para nosotros. Los hongos tienen gran importancia económica debido a que gracias a las setas que son recolectadas para consumo humano representan una gran ganancia económica. Los hongos han trascendido más allá de mitos, cuentos y leyendas; se presentan como un potencial culinario en muchos países, a través de la manifestación de diversos productos y platillos. Los hongos microscópicos por un lado, con la elaboración de quesos, panes y algunas bebidas industrializadas como el vino. Los principales hongos cultivados actualmente es el champiñón (Agaricusbisporus), la seta (Pleurotus spp.) el shiitake (Lentinula edodes) y Volvariella volvácea. El género Agaricus ha sido el hongo más cultivado y consumido en Europa, Norteamérica y México, éste último con una producción de 36 500 ton/año. Por su parte, Lentinula edodes es producido en su mayor parte en Japón, Volvariella volvácea en Asia y Pleurotus en Sudamérica y México, con una producción de 2 190 ton/año en este país. El volumen de producción de hongos frescos en México se estima en 38 708 toneladas anuales, lo que representa alrededor del 59% del total de la producción en Latinoamérica, siendo este país el 18o productor a nivel mundial (Carrera et al., 2004). Su exportación genera divisas por más de cuatro millones de dólares anuales. Las operaciones comerciales tienen un monto anual aproximado de 150 000 000 de dólares, generando alrededor de empleos directos e indirectos. Otra de las importancias es su valor en el ámbito de la salud ya que la penicilina, uno de los antibióticos más usados y recetados en el mundo desde su descubrimiento es nada menos que un tipo de hongo llamado Penicillium notatum (Rohen, Persky, Hadar, 2002). RESULTADOS Tabla 1. Aislamiento y microcultivo de las muestras. Incubación de la Aislamiento de la colonia en muestra PDA PDA 48h a 72h a 28°C Microcultivo 24h a 48h a 28°C PDA 48h a 72h a 28°C Microcultivo 24h a 48h a 28°C Microcultivo Tabla 2. Resultados de Aspergillus niger y el hongo del bolillo. Especie o muestra Estructura macroscópica Aspergillus niger Hongo del bolillo Rhizopus stolonifer Colonia Color del reverso Color del anverso Aspecto Filamentosa Amarilla terminando con un borde de color naranja Verde militar con toques negros Filamentosa Blanco Velloso Pulverulento Hifa Clasificación de espora Cenocítica Conidiosporas Cenocítica Esporangiosporas Positiva Positiva Blanco Imagen Estructura microscópica Imagen Prueba de Yodo-lugol Imagen Tabla 3. Resultados de Penicillinum chrysogenum y hongo de salsa de tomate. Especie o muestra Estructura macroscópica Penicillinum chrysogenum Hongo de salsa de tomate Aspergillus niger Colonia Color del reverso Color del anverso Aspecto Filamentosa Amarillo cremoso Filamentosa Amarilla Blanco Blanco Algodonoso Algodonoso Hifa Clasificación de espora Septada Conidiosporas Cenocítica Esporangiosporas Positiva Positiva Imagen Estructura microscópica Imagen Prueba de Yodo-lugol Imagen Tabla 4. Resultados de Saccharomyces cerevisiae. Especie o muestra Saccharomyces cerevisiae Estructura macroscópica Colonia Color Forma Elevación Borde Levaduriforme Beige claro Circular Pulvinada Entero Hifa ¿Clasificación de esporas? No No Imagen Incubada de 48-72h a 28°C Estructura microscópica Imagen DISCUSIÓN Penicillium chrysogenum es uno de los hongos más importantes para el ser humano, ya que gracias al estudio de este se pudo encontrar una de las sustancias de mayor relevantes en la historia: la penicilina. En nuestro cultivo, Penicillium chrysogenum presenta una coloración amarilla en el centro con el micelio color blanco con textura algodonosa. “Se caracteriza por ser un hongo filamentoso, con hifas septadas. Cuando es cultivado en laboratorio, sus colonias son de crecimiento rápido. Tienen apariencia aterciopelada hasta algodonosa y coloración verde azulada (Gómez, V. 2013)”. Creemos que el color blanco del micelio se debe por lo joven que es el cultivo ya que “las colonias son de crecimiento rápido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca, a 25 °C (no crecen o crecen pobremente a 37 °C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulación abundante (Pontón et al, 2002)”. Aspergillus niger no causa tantas enfermedades como otras especies de Aspergillus, pero en altas concentraciones puede producir aspergilosis, que provoca alteraciones pulmonares. Esta enfermedad aparece con más frecuencia en horticultores, ya que inhalan el polvo del hongo con más facilidad. En el cultivo de la muestra de salsa de tomate se observó su colonia filamentosa amarilla con blanco y un aspecto algodonoso. Aspergillus niger el cual es un hongo filamentoso se encuentra formado por hifas hialinas septadas y puede tener reproducción sexual y asexual. El cual produce un moho negro/verdoso es muy común en varios vegetales como la lechuga, el tomate, la acelga y el limón (Antonio Micheli, 2018). En el cual fue difícil la identificación de moho ya que hubo crecimiento excesivo de micelio en la caja petri, no se aprecia bien el color de las muestras. La muestra de Aspergillus niger coincide con lo descrito anteriormente. Rhizopus es un género de mohos que incluyen especies cosmopolitas de hongos filamentosos hallados en el suelo, degradando frutos y vegetales, heces animales, y residuos. Dadas las características en nuestra muestra del bolillo (Kunz, K.,Weidenboerner, M., Kunz, B.,1995) por lo que podemos decir que el organismo presente en nuestra muestra es el Rhizopus stolonifer (Arul, J., 1996). Es un hongo filamentoso que presenta esporangióforos sin ramificar, hifas no septadas, de color pardo oscuro que nacen de un nudo de rizoides. Esporangios esféricos negros y abundantes rizoides. La colonias de crecimiento rápido tienen un aspecto consistente, con denso micelio aéreo, algodonosas, al principio blancas, después se tornan gris oscuras, el micelio (rojizo, grisáceo o marrón). Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular, probablemente el microorganismo más utilizado por el hombre a través del tiempo; aunque no se tuviera, en un principio, conciencia plena de la participación del microorganismo en la elaboración de diversos alimentos como el pan o las bebidas alcohólicas. En su morfología microscópica las células de levadura tienen una forma elipsoidal relativamente simple y la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de S.cerevisiae hace que sea fácil producir mutantes homocigotos de deleción diploides y los agruparon en siete clases: alargadas, redondas, pequeñas, grandes y puntiagudas (Taro, L. S., Miwaka, O., Hiroshi S., Fumi, S., Ayaka, S., 2004). En tanto a la morfología colonial según (Meyen, E., Hansen, E.C., 1883) el color de la Saccharomyces cerevisiae es entre blanco y beige, con apariencia suave, elevación pulvinada y de forma oval. Tal descripción es congruente con el crecimiento en nuestro cultivo. Al realizar las pruebas de almidón en los cultivos se dificulta apreciar el halo debido a que se le agregó un reactivo no identificado antes del Yodo-Lugol, pero si se observa detenidamente se puede apreciar un halo en la muestra de tomate, Aspergillus niger y en el microorganismo Rhizopus stolonifer de nuestra muestra del bolillo. Lo que nos indica un resultado positivo ya que estos organismos son capaces de producir amilasa y utilizar el almidón como fuente de carbono (Abiola, C. & Oyetayo, V.O., 2015). Respecto al Penicillium chrysogenum no se puede observar si existe halo así como tampoco se aprecia una colonia específica esto es por el error que se tuvo al realizar las pruebas y al momento de inocular el Penicillium chrysogenum no hubo crecimiento suficiente para que el halo se pueda distinguir pero según (Balkan, B. 2005) es capaz de producir amilasa por lo tanto en la prueba de hidrólisis de almidón el Penicillium chrysogenum es positivo. CONCLUSIÓN Las pruebas de almidón fue difícil observarlas debido a que en la muestra del hongo del bolillo, éste se esparció por todo el agar y debimos quitar mucho del micelio que se formó e igual el hongo de la salsa de tomate tuvo mucho crecimiento y los resultados no fueron correctamente observados. Se pudo observar la diferente morfología macroscópica y microscópica de los diferentes microorganismos inoculados. Se logró observar que algunos de los microorganismos inoculados presentaba ambos tipos de hifas, septadas y cenocíticas; y otros solo presentaban una de éstas dos. CUESTIONARIO 1.- Describa cuales son las estructuras de reproducción características de un hongo filamentoso. Se reproducen por la formación de esporas, las cuales pueden ser pigmentadas y le dan el color al hongo. Sus esporas o conidios son transportados por el aire, son normalmente inhalados y presentan gran resistencia en el medio ambiente. La mayoría de los hongos filamentosos de interés clínico y vegetal, tienen una fase de reproducción sexuada (telomorfa), pero es su forma asexual (anamórfica) la que casi siempre produce las enfermedades y es observada en las muestras. (Microbiología, 2017). Esporas o conidios (Spore = semilla): son células uni o plurinucleadas, de aspecto hialino o pigmentado (azul, verde, amarillo, rojo, negro) y son ellas las que dan el color a las colonias o micelios. Cuando se originan de forma sexuada (por fusión de gametos) se denominan esporas y si su origen es de tipo asexuado (esporulación o fragmentación) se llaman conidios. (Microbiología, 2017). La morfología de las esporas (o conidios) es bastante variable y características de cada especie de hongo. Las esporas pueden ser: a) Según forma: ovales, elípticas, estrelladas, fusiformes, helicoidales, piriformes, etc. b) Según la presentación de tabiques o septos: • Amerospora: ausencia de tabiques (Aspergillus, Penicillium, Mucor). • Didimospora: presencia de 1 sólo tabique (Trichothecium). • Fragmospora: presencia de varios tabiques transversales (Microsporum, Fusarium). • Dictiospora: presencia de tabiques longitudinales y transversales (Alternaria). (Microbiología, 2017). 2.- ¿Cuáles son las implicaciones económicas y ambientales de los hongos fitopatógenos y saprófitos? Los hongos del suelo juegan un papel clave en los procesos de descomposición que mineralizan y reciclan nutrientes de plantas. (Magalhaes y Pfenning, s.f.). Las bacterias y los hongos atacan y destruyen todo tipo de materia orgánica que procede de la naturaleza y, gracias a la intervención de los microorganismos heterótrofos, retornan a ella en el ciclo de la economía natural. Los hongos saprófitos contribuyen a la degradación de materia. Los hongos fitopatógenos desfiguran, manchan y reducen la producción de frutos. En los ecosistemas agrícolas, los patógenos de plantas actúan en el suelo y en la rizósfera, causando una notable reducción en las cosechas y afectando su calidad. (Magalhaes y Pfenning, s.f.). Las pérdidas económicas causadas por hongos fitopatógenos pueden ser altas. Los hongos, como Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides y Penicillium spp, afectan a cultivos de alta importancia económica. (Sutton BC, 1993). 3.- ¿Qué es el dimorfismo celular en los hongos? De un ejemplo. El término dimórfico, aplicado a los hongos, significa que determinadas especies pueden presentarse bajo dos tipos o aspectos morfológicos diferentes. Se conocen, respectivamente, como fase miceliar y fase levadura. La fase levadura (hongos levaduriformes) corresponde a células individualizadas, de forma más o menos ovalada, que se multiplican de modo asexual por un proceso de gemación (blastosporas). La fase miceliar se caracteriza porque el hongo presenta abundantes hifas o filamentos (micelio), generalmente con abundantes tipos de esporas. La presentación de una u otra fase depende de determinadas condiciones ambientales. (Clínica Universidad de Navarra, 2018). Ejemplo: Histoplasma capsulatum. Histoplasma capsulatum es un hongo dimórfico térmico, con crecimiento filamentoso o micelial en su estado saprófito en el suelo, y con crecimiento levaduriforme o esferular a 37ºC al parasitar a humanos o animales. Pertenece al filo Ascomycota. La forma micelial microscópicamente presenta hifas hialinas septadas; a partir de una hifa parental se desarrollan hifas (conidióforos) en ángulo recto que generan grandes conidios unicelulares (macroconidios de 8 a 15 micras). Macroscópicamente las colonias crecen lentamente a 25ºC en Saboraud. Al principio aparecen colonias blancas de aspecto algodonoso (colonias tipo A) y después aparecen colonias de escaso micelio. La forma levaduriforme microscópicamente presenta levaduras ovoides y de paredes finas, que se reproducen por gemación polar con una base estrecha. Macroscópicamente las levaduras crecen lentamente a 37ºC, en medio de infusión cerebro-corazón enriquecido con 5%-10% de sangre de carnero, formando colonias con apariencia cremosa y húmeda, de color grisáceo a beige. (Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, 2015). 4.- ¿Qué es una levadura y qué mecanismos se ven involucrados para persistir en condiciones adversas? Las levaduras son filogenéticamente un grupo diverso de hongos unicelulares en los cuales las fases teleomorfas o sexuales de división celular se dan por fisión o gemación. Están constituidas en su mayor parte por células aisladas que suelen ser esféricas, ovoideas, elipsoides o alargadas. Las levaduras pertenecen a dos clases de hongos: ascomicetos o basidiomicetos, aunque muchas de ellas se presentan comúnmente en la forma imperfecta. (Manual de Microbiología de los Alimentos, s.f.). Las levaduras tienen un papel muy importante en la producción y deterioro de los alimentos, ya que intervienen en la fabricación del vino, cerveza y pan. (Viñas y Usalli, 1998). Las levaduras están desprovistas de clorofila, por lo que no pueden producir compuestos orgánicos necesarios para su desarrollo a partir de sustancias minerales, actuando entonces como saprófitos o parástitos. (Viñas y Usalli, 1998). Para persistir en condiciones adversas, las levaduras forman diferentes tipos de esporas dependiendo el tipo de reproducción que poseen; la mayoría forma acosporas; también algunas forman micorrizas. (Fennema, 2000). BIBLIOGRAFÍA Abiola, C., Oyetayo, V.O. (2015). Isolation and Biochemical Characterization of Microorganisms Associated with the Fermentation of Kersting's Groundnut (Macrotyloma geocarpum). Nigeria. Federal University of Technology. Recuperado de: https://documentcloud.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A6e5953 e4-3089-449d-9692-d63415326c3c Balkan, B. (2005). Production and properties of alpha-amylase from Penicillium chrysogenum and its application in starch hydrolysis. Turkey. Trakya University. Recuperado de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/15881598/ Clínica Universidad de Navarra. (2018). Hongo dimórfico. España. Recuperado de: https://www.cun.es/diccionario-medico/terminos/hongodimorfico?fbclid=IwAR30zErLX4LeNrA8QgxlL3M1ddnEsfK9LAvHqAfKWWqbz4Ptt__YMz MpVXI Fennema, O. (2000). Química de los alimentos. Acribia S.A. Zaragoza, España. p.1258 Hongos. Comisiòn Nacional para el Conocimiento de la Biodiversidad .(CONABIO)2012 https://www.biodiversidad.gob.mx/especies/gran_familia/hongos/hongos.html Hongos. (s.f.). Evolución y diversidad. Recuperado de: http://biblio3.url.edu.gt/Libros/2011/bot/19.pdf Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. (2015). Histoplasma Capsulatum. España. Recuperado de: http://www.insht.es/RiesgosBiologicos/Contenidos/Fichas%20de%20agentes%20biologicos/Fich as/Hongos/Histoplasma%20capsulatum%20(ajellomyces%20capsulatus)%202016.pdf Kunz, K.,Weidenboerner, M., Kunz, B.(1995). Control de los hongos relevantes para la comida Cladosporium herbarum, Eurotium repens, Penicillium expansum y Rhizopus stolonifer mediante el uso de especias en pan de trigo. Univ. Bonn Germany. Recuperado de: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=DE95S0253 López Tevez, L., & Torres, C. (2018). Aislamiento e identificación de mohos en el aire. Universidad Nacional del Nordeste. Recuperado de: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp12.pdf Magalhaes, L., Pfenning, L. (s.f.). Hongos del suelo saprófitos y patógenos de plantas. Recuperado de: https://micrositios.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/667/cap8.pdf Meyen, E., Hansen, E.C. (1883) Saccharomyces cerevisiae. Recuperado de: http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/BioloMICS.aspx?TableKey=14682616000000012 &Rec=705&Fields=All Micheli, A. (2018). Aspergillus niger. EcuRed.Recuperado de: https://www.ecured.cu/Aspergillus_niger Microbiología. (2017). Micología. Recuperado de: https://es.wikibooks.org/wiki/Microbiolog%C3%ADa/Micolog%C3%ADa Sutton BC. Mitosporic Fungi (Deuteromycetes). pp. 15-55 en: Reynolds DR, Taylor JW, editores.The Fungal Holomorph. CAB International, Wallingford, Oxon, 1993 Taro, L. S., Miwaka, O., Hiroshi S., Fumi, S., Ayaka, S., (2004). SCMD: Saccharomyces cerevisiae Morphological Database. Tokyo. University of Tokyo. Recuperado de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC308847/ Viñas, I., Usalli, J. (1998). Optimización de la producción del agente de biocontrol. España. Universitat de Lleida. Recuperado de: https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/8389/TSMAC1de3.pdf?sequence=1
