INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INDERDISCIPLINACIA DE INGENIERÍA CAMPUS GUANAJUATO PRÁCTICA #7 EFECTO DE FACTORES QUÍMICOS Y AMBIENTALES EN CRECIMIENTO MICROBIANO 2BV1 EQUIPO 2 PRESENTA ALVIS PÉREZ EDWIN TONATIUH BARRAGÁN MALDONADO LIZETH FRAUSTO ROCHA JUAN EMMANUEL GARCÍA VARGAS MARTÍN ENRIQUE GÓMEZ TORRES BRENDA GUADALUPE ROMÁN MURILLO ULISES PROFESORES AZA GONZÁLEZ CÉSAR MACÍAS SÁNCHEZ KARLA LIZBETH SÁNCHEZ LÓPEZ JUAN FRANCISCO SILAO DE LA VICTORIA A 08 DE NOBIEMBRE DE 2018 OBJETIVO Realizar técnicas microbiológicas para demostrar el efecto de antibióticos, temperatura y pH en el crecimiento microbiano. INTRODUCCIÓN La actividad de los microorganismos se ve afectada por las condiciones químicas y físicas del medio, el conocimiento de los efectos ambientales nos permite explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible conocer métodos que controlen o potencien las actividades microbianas. Existen diversos factores pero los siguientes tienen una función destacada en el control del crecimiento microbiano: la temperatura, el pH, la disponibilidad de agua y el oxígeno. La temperatura es uno de los factores más importantes que afectan al crecimiento y a la supervivencia de los microorganismos. A baja o muy alta temperatura los microorganismos no crecerán. Para cada microorganismo existe una temperatura mínima por debajo de la cual no es posible el crecimiento y una óptima a la que se produce el crecimiento más rápido y una temperatura máxima por encima de la cual no es posible el crecimiento. La temperatura óptima está siempre más cerca de la máxima que de la mínima (Brock, & Madigan, 2015). Fig.1 Temperatura de distintos microorganismos. Psychrophiles: con temperaturas óptimas bajas. Mesophiles: con temperaturas óptimas moderadas. Thermophiles: con temperaturas óptimas altas. Hyperthermophiles: con temperaturas óptimas muy elevadas. Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible su crecimiento y regularmente posee un pH óptimo bien definido. La mayoría crece en un margen de 2 y 3 unidades. Los ambientes naturales tienen un pH entre 5 y 9 los organismos con pH óptimo de estos valores son más comunes. Solo unas cuantas especies pueden crecer a un pH por debajo de 2 unidades, estas especies son de un tipo extremófilos llamados acidófilos. Unos cuantos extremófilos presentan un pH óptimo de valores muy elevados, de pH 10 a estas especies se les llama alcalófilos o basófilos. En los acidófilos o alcalófilos el pH intracelular puede variar algunas unidades respecto a la neutralidad, pero en su mayoría el pH óptimo para el crecimiento está entre las 6 y 8 unidades llamados neutrófilos. Antimicrobianos. Los antibióticos se pueden definir como un producto del metabolismo microbiano que es capaz de matar o inhibir el crecimiento de otros microorganismos y además es efectivo a bajas concentraciones. Actualmente se conocen más de 5000 antibióticos de los cuales alrededor del 75% son producidos por el género Streptomyces. Los antibióticos deben su toxicidad selectiva a las diferencias entre las células eucariotas y procariotas. Su eficacia tóxica es la consecuencia de su capacidad de inhibir una reacción bioquímica específica y esencial, bien sea para la célula eucariota o para la célula procariota. Para que el antibiótico ejerza su acción es necesario que llegue al foco infeccioso, penetre en las bacterias (por difusión o transporte activo) y alcance intracelularmente la concentración necesaria. Una vez dentro de la célula el antibiótico puede ser bacteriostático si inhibe la multiplicación de forma reversible, o bactericida si tiene un efecto letal (Mateos F.). Antibiograma por difusión Es una de las técnicas más utilizadas, también conocido por el método de Kirby - Bauer. Se inocula la superficie de una placa de Petri con agar de manera uniforme con una cantidad estandarizada del microorganismo de prueba. Se colocan sobre la superficie del agar solidificado discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los agentes antimicrobianos. Durante la incubación los antimicrobianos se difunden por el agar desde los discos. Cuanto más lejos, del disco se difunde el agente menor es su concentración. Si el antimicrobiano es eficaz se forma un halo de inhibición alrededor del disco después de un período de incubación estandarizado. Se mide el diámetro del halo y entre mayor es el halo, existe mayor sensibilidad del microorganismo al antibiótico. (Tortora, Funke, & Case, 2007). Fig. 2 Antibiograma de difusión. RESULTADOS Tabla 1. Resultado de las diferentes diluciones de la Cefalotina. Antibiótico Muestra Salmonella enterica Diámetro de inhibición Cefalotina Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución 10 10 10 10 10 2.8 cm 2.0 cm 1.2 cm 0.8 cm Nulo -2 -3 -4 Imagen Gráf. 1 Crecimiento de la inhibición del antibiótico de Cefalotina. -5 -6 Tabla 2. Resultado de las diferentes diluciones de la Dicloxacilina. Antibiótico Muestra Salmonella enterica Dicloxacilina Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución 10 10 10 10 10 0.7 cm Nulo Nulo Nulo Nulo -2 Diámetro de inhibición -3 -4 Imagen Gráf. 2 Crecimiento de la inhibición del antibiótico de Dicloxacilina. -5 -6 Tabla 3. Resultado de las diferentes diluciones de la Ampicilina. Antibiótico Muestra Ampicilina Dilución Dilución Dilución Dilución Dilución 10 10 10 10 10 Nulo Nulo Nulo Nulo Nulo -2 Diámetro de inhibición Salmonella enterica -3 -4 -5 Imagen Gráf. 3 Crecimiento de la inhibición del antibiótico de Ampicilina. -6 Tabla 4. Resultados de las variaciones de Temperatura. Temperatura 4° C 20° C 25° C 37° C 50° C Turbidez No Si Si Si No Imagen Tabla 5. Resultados de la variación del pH. pH 3 5 7 9 11 Turbidez No Si Si Si No Imagen DISCUSIÓN Salmonella enterica es un bacilo Gram-negativo del género Salmonella, con flagelos en peritricos. S. enterica constituye un grupo importante de bacterias patógenas para animales y seres humanos. Cuando S. enterica coloniza el tracto intestinal, algunas bacterias salen junto la materia fecal, y como S. enterica no crece en el agua, el microorganismo se queda en el desecho. Los principales agentes contaminantes de S. enterica son los alimentos, el suelo, la ropa y la materia fecal; mayormente dado en granjas. Puede ser esparcido también por insectos que tuvieron contacto con heces fecales, haciendo que el radio de contagio sea mayor; contagiando a más individuos y reiniciando el ciclo de infección. (Andino & Hanning, 2015). S. enterica en el medio con cefalotina, mostró una inhibición donde en la disolución 10^-2 el halo fue mayor (2.8 cm), mostrando que en una concentración fuerte, la sensibilidad de S. enterica es menor, contrarrestando con la tabla que expone la Coordinación de la Subcomisión de Antimicrobianos; S. enterica sería sensible al antibiótico in vitro de cefalotina y su crecimiento sería muy poco. Cosa parecida a la muestra analizada con la sustancia dicloxacilina, en esta muestra el halo de crecimiento solo se presentó en la disolución 10^-2 donde el diámetro de inhibición fue muy reducido; tan solo 0.7 cm, la resistencia a este antibiótico. En las demás secciones donde se encontraban las diferentes disoluciones de dicloxacilina no existió halo de inhibición. La dicloxacilina se usa tratamiento de infecciones por estafilococo productor de penicilinasa, y penicilina G-resistentes y penicilina G-estafilococo sensible (estos dos últimos son las soluciones que normalmente se encuentran en los fármacos comunes). Como penicilina G y dicloxacilina pertenecen al mismo grupo de antibióticos su función es de bactericida; con la excepción de que el último mencionado es más potente que el primero; pero S. enterica es resistente a un gran campo de penicilinas; incluyendo las ampicilinas; lo que concuerda con nuestro resultado: S. enterica mostró mayor resistencia al antibiótico dicloxacilina, y el crecimiento bacteriano fue mayor. Fig. 3 Caracterización fenotípica de los perfiles de resistencia más frecuentes hallados en las enterobacterias. Fig.4 Antibióticos y concentraciones utilizadas para las pruebas de susceptibilidad en Salmonella entérica. Del cultivo con los antibiogramas con ampicilina, no hubo crecimiento bacteriano debido a una incorrecta inoculación o manejo del medio; pero se intuye con la información anterior sobre la dicloxacilina; que le resultado hubiera sido muy parecido, esto es; poca inhibición bacteriana y por tanto mayor resistencia de S. enterica a la ampicilina. S. enterica en los indicadores de temperatura que se elaboraron mostró mayor turbidez en las temperaturas 25° C y 37°C, según la Dra. Inés Contreras Osorio, profesora de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de Chile: "Se desarrolla mejor en ambientes ricos en nutrientes y a temperatura ambiente. Su temperatura óptima de crecimiento es 37ºC (la temperatura del cuerpo humano)”. Coincidiendo con nuestro resultado; haciendo que S. enterica entre en la categoría de mesófilos (Ray, B, 2004). En los indicadores de pH se mostró mayor turbidez en el pH de 5 y 7; mostrando que S. enterica llega tener cierto grado de resistencia en ambientes ácidos. CONCLUSIÓN Se pudo observar la diferencia en la eficacia de distintos antibióticos (Ampicilina, Dicloxacilina y Cefalotina) en el crecimiento de Salmonella enterica en base al diámetro de inhibición que se presentó en las cajas con los sensidiscos, así como el rango favorable de temperatura y pH basado en la presencia de turbidez en los tubos de ensaye. En el caso de la Cefalotina en las diluciones 10-2, 10-3 y 10-4 se puede apreciar que hubo inhibición de tamaño considerable, en cambio, en las dilución 10-5, la inhibición es mínima, como es de esperarse en la dilución 10-6 la inhibición es nula; también se pudo apreciar la resistencia que posee el microorganismo a la Dicloxacilina ya que, solamente en la dilución 10-2 se pudo apreciar inhibición. En la caja con Ampicilina no se pudo determinar la resistencia del microorganismo porque hubo un error al inocular y no apareció masa bacteriana a estudiar. CUESTIONARIO 1.- Explique 4 procesos biológicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a un antibiótico. *Inactivación enzimática. El principal mecanismo de inactivación es la hidrólisis, como sucede con las betalactamasas y los betalactámicos, pero también pueden ocurrir modificaciones no hidrolíticas tales como las acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones inactivantes de aminoglucósidos. (Vignoli y Seija, s.f.). *Modificación del sitio activo. La modificación de un aminoácido genera un blanco diferente y así disminuye la afinidad de unión por el antimicrobiano. El PBP (penicillin-binding-protein) es un complejo enzimático que permite la síntesis del peptidoglicano y si se produce mutación del sitio de unión al antimicrobiano como los beta-lactámicos, éstos no pueden actuar y se genera resistencia a ellos. (Revista de Otorrinolaringología y Cirugía de Cabeza y Cuello, 2018). *Alteraciones de las membranas bacterianas. Se ve fundamentalmente en gramnegativos, donde la membrana externa de la envoltura celular rica en lípidos es impermeable a las sustancias hidrofílicas. De este modo dichas sustancias quedan confinadas a la penetración a través de proteínas transmembrana con función de porinas. Existen algunas moléculas de antibiótico, como penicilina y vancomicina, que por su tamaño son incapaces de pasar a través de las porinas de bacilos gramnegativos. (Vignoli y Seija, s.f.). *Bombas de eflujo. Transporta al antimicrobiano hacia el exterior de la célula sin modificaciones, pero sin acción antimicrobiana. Existen bombas de eflujo multidrogas en la pared bacteriana que permiten la expulsión de drogas como los antimicrobianos. (Revista de Otorrinolaringología y Cirugía de Cabeza y Cuello, 2018). 2.- Explique el modo de acción de cada uno de los antibióticos usados en la práctica. Ampicilina Es un antibiótico beta-lactámico. Es bactericida. Actúa inhibiendo la última etapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas específicas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular. Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su muerte. (ResearchGate, 2018). Cefalotina Al igual que otros antibióticos betalactámicos, inhibe las transpeptidasas, lo que impide la biosíntesis del peptidoglucano que da consistencia y rigidez a la pared bacteriana. La inhibición de la formación del componente rígido hace que la pared celular bacteriana pierda su capacidad para resistir la presión interior, se rompa y se produzca la muerte de los microorganismos susceptibles. Es activa contra diversos microorganismos grampositivos. (Rodríguez, 2013). Dicloxacilina La dicloxacilina es una penicilina isoxazólica resistente a las betalactamasas con acción bactericida contra gérmenes grampositivos y algunos gramnegativos. Su mecanismo de acción es la inhibición de la síntesis de la pared celular bacteriana, interfiriendo en el paso final de la síntesis y en el reordenamiento de la pared celular en la fase de crecimiento y división. (P.R.Vademécum, 2018). 3.-Explique un proceso de resistencia antimicrobiana que se haya reportado para cada uno de los antibióticos usados en la práctica. La resistencia a la ampicilina está mediada por el gen blaZ que codifica para una betalactamasa, con el control del antirrepresor BlaR1 y el represor BlaI. En presencia de ampicilina, estimula la autofragmentación de BlaR1 que fragmenta secuencialmente a BlaI y permite así la expresión del gen blaZ, cuyo producto hidroliza a la ampicilina para producir ácido peniciloico inactivo. Existen cinco familias de bombas de excreción multirresistentes a fármacos: la superfamilia casette de unión a ATP (ABC), la superfamilia del máximo facilitador (MFS), la familia de extrusión de compuestos tóxicos y multifármacos (MATE), la familia de resistencia de bajo espectro (SMR) y la familia de resistencia división nodular (RND). Las bacterias Gram positivas poseen las bombas de las familias ABC, MFS, MATE y SMR (Serra, 2017). En un estudio que se realizó con 10 cepas de SARM de pacientes pediátricos se encontró que las combinaciones de dicloxacilina más amikacina y cefalotina más amikacina tuvieron actividad sinérgica o sinergia parcial en 90 y 100% de las cepas probadas, respectivamente. La sinergia de la combinación de vancomicina más amikacina solamente se encontró para una cepa; para 40% de las cepas el resultado fue indiferente. Cuando se combinó vanco-micina más un betalactámico (cefalotina o imipenem) el efecto fue aditivo. Durante los dos años de vigilancia estricta se encontró la disminución de la concentración mínima inhibitoria 50 (CMI50) para la dicloxacilina al final del estudio con una diferencia estadísticamente significativa (p < 0.05). La resistencia a cefalotina se incrementó en los primeros seis meses pero disminuyó a 8.3% al final y también disminuyó la resistencia a amikacina (Miranda, 2011). BIBLIOGRAFÍA Access Medicina. (2018). Cefalotina: Antimicrobianos. Recuperado de: https://accessmedicina.mhmedical.com/content.aspx?bookid=1552&sectionid=90368293 Andino, A & Hanning, I (2015) Salmonella enterica: Survival, Colonization, and Virulence Differences among Serovars. Recuperado de: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4310208/ Maturana, B (2011) Salmonella: un microorganismo siempre presente. Recuperado de: http://www.uchile.cl/noticias/75284/salmonella-un-microorganismo-patogeno-siempre-presente Brock, T., & Madigan, M. (2015). Biología de los microorganismos (1st ed.). Madrid: Pearson Educación. Iañez, E.(1998). Resistencia bacteriana a los antibióticos. Argentina. Hipertextos del área de la Biología. Recuperado de: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/21_micro.htm Miranda, M. G. (2011). Resistencia antimicrobiana de Staphylococcus aureus en México. México. SciELO. Recuperado de: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1665-11462011000400003 Pedro F. Mateos. Agentes antimicrobianos y microorganismos. Salamanca: Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca. Recuperado de: http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/apuacuba/a3-agentes_antimicrobianos_y_microorganismos.pdf P.R.Vademécum. (2018). Dicloxacilina AMSA. México. Recuperado de: https://mx.prvademecum.com/producto/?producto=5688 Tortora, G., Funke, B., & Case, C. (2007). Introducción a la microbiología. Buenos Aires. Recuperado de: http://redbiblio.unne.edu.ar/pdf/0603-002731_d.pdf ResearchGate. (2018). Mode of action of ampicillin. Berlin. Recuperado de: https://www.researchgate.net/post/mode_of_action_of_ampicillin Revista de otorrinolaringología y cirugía de cabeza y cuello. (2009). Chile. Antimicrobial resistance mechanisms in respiratory pathogens. Doi: http://dx.doi.org/10.4067/S071848162009000200014 . Recuperado de: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-48162009000200014 Rodríguez, R. (2013). Vademécum académico de medicamentos. Mc Graw Hill. Serra, M. A.(2017). La resistencia microbiana en el contexto actual y la importancia del conocimiento y aplicación en la política antimicrobiana. La Habana. SciELO. Recuperado de: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2017000300011 Vignoli, R., Seija, V. (s.f.). Principales mecanismos de resistencia antibiótica. Recuperado el día 06 de Noviembre de 2018 de: http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Principalesmecanismosderesistenciaantibiotica.pdf
