UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE FACULTAD DE

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UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
EFECTO DE LA TEMPERATURA Y LA INFECCIÓN
CON “Candidatus Xenohaliotis californiensis”
SOBRE LA RESPUESTA INMUNE Y LA EXPRESIÓN
DE HSP70 DE Haliotis rufescens
Tesis para optar al Grado de Doctor en Acuicultura
Programa Cooperativo de Doctorado en Acuicultura
Universidad de Chile
Universidad Católica del Norte
Pontificia Universidad Católica de Valparaíso
MARÍA HILDA AVELLANAL SANGUINETTI
Directores de Tesis: Federico Winkler Manns
Karin Lohrmann Sheffield
2013
UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
Los miembros de esta Comisión informante de Tesis designada para revisar la tesis
Doctoral de MARÍA HILDA AVELLANAL SANGUINETTI la han encontrado
satisfactoria y recomiendan que sea aceptada como requisito para obtener el grado de
Doctor en Acuicultura.
Directores de Tesis:
Dr. Federico Winkler
---------------------------------------------
Dra. Karin Lohrmann
---------------------------------------------
Comisión Informante:
Dr. Luis Mercado
---------------------------------------------
Dr. Alex Romero
---------------------------------------------
Dr. Claudio Miranda
---------------------------------------------
Dr. Jaime Romero
---------------------------------------------
Dr. Gabriel Yany
---------------------------------------------
UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL NORTE
FACULTAD DE CIENCIAS DEL MAR
DECLARACIÓN DEL AUTOR
Se permiten citas breves sin permiso especial de la Institución o autor,
siempre y cuando se otorgue el crédito correspondiente. En cualquier otra
circunstancia, se deberá solicitar permiso de la Institución o el autor.
_______________________________________
MARÍA HILDA AVELLANAL SANGUINETTI
ÍNDICE
Agradecimientos…………………………………………………………………..
i
Resumen…………………………………………………………………………...
ii
Abstract …………………………………………………………………………...
iii
Índice de Figuras………………………………………………………………….
iv
Índice de Tablas…………………………………………………………………...
vi
Introducción……………………………………………………………………….
1
Hipótesis…………………………………………………………………………... 23
Objetivo General…………………………………………………...……….……..
24
Objetivos Específicos……………………………………………………………... 24
Material y Métodos………………………………………………………………..
25
Resultados…………………………………………………………………………
43
Discusión………………………………………………………………………….. 73
Conclusiones………………………………………………………………………
84
Bibliografía………………………………………………………………………..
85
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, por su apoyo a mis aventuras durante todos estos años.
A mis profesores Federico Winkler y Karin Lohrmann por sus enseñanzas, apoyo y
paciencia.
Al CONICYT por la beca y su extension para realizar mis estudios (Beca
Latinoamericana para estudios de Doctorado en Chile, Nº 57080059), además del apoyo
para participación en congresos.
Al proyecto FONDEF D05I-10013 “Aumento de la productividad del cultivo de Abalón
rojo (Haliotis rufescens), mediante mejoramiento genético y control de patógenos” por
el financiamiento de la tesis.
A Marcela Rosas, por enseñarme a cultivar abalones, pero más que todo por su
compañía y amistad. Y a su familia por recibirme en su casa.
A la familia Berland–González, Katty, Marcos, Danyra, Maxi, Edmundo y Odi por
hacerme parte de su familia durante mi verano horribilis.
Al Grupo de Marcadores Inmunológicos en Organismos Acuáticos del Laboratorio de
Genética e Inmunología Molecular a Pontificia Universidad Católica de Valparaíso por
recibirme durante en su laboratorio. Especialmente a Luis Mercado, Jörn Bethke y
Claudia Palacios.
A los integrantes del Laboratorio de Fisiología y Genética Marina (FIGEMA-CEAZAUCN) por el espacio, material, apoyo para los análisis moleculares e inmunológicos.
A los integrantes del Laboratorio Central de Cultivos Marinos y Centro de Producción
de Abalón AWABI de la UCN, por su ayuda y consejos durante la realización de los
experimentos.
A el servicio de vigilancia de la UCN, por sus traslados y compañía en las madrugadas y
noches de los días de muestreo.
A Carola, Tamara, Marisol, Blanca, Emilio, Andrea, Héctor, las Claudias varias, Judith,
Roxana, Willy, Catalina, María Cristina, Pilar y Verónica.
i
RESUMEN
El síndrome del marchitamiento del pie del abalón (Withering Syndrome, WS) es una
enfermedad que afecta a poblaciones naturales y animales en cultivo del género Haliotis.
Su agente etiológico es la bacteria “Candidatus Xenohaliotis californiensis”, bacteria
tipo-rickettsial (WS-RLP) que se aloja en los epitelios del tracto gastrointestinal del
abalón, principalmente en el postesófago. El aumento de la temperatura del agua,
asociada al período de verano o al Fenómeno de El Niño, aumenta la susceptibilidad,
prevalencia e intensidad de la infección, además de favorecer el desarrollo de la
enfermedad. En Chile se ha detectado la presencia de la bacteria en los cultivos del
abalón rojo (Haliotis rufescens). En individuos juveniles del abalón rojo, infectados con
WS-RLP cultivados a 18°C, sin la presencia de signos clínicos externos de la
enfermedad, se ha observado desbalance energético. Este desbalance, sumado al factor
de estrés que podría significar la infección y la temperatura del agua, permiten suponer
que el efecto crónico de la temperatura elevada, la infección, o la interacción de ambos
factores afectan la respuesta inmune del abalón rojo. Para verificar esto, se evaluó
durante 150 días el efecto de la temperatura del agua (15 y 20°C) y la infección con WSRLP sobre los parámetros inmunológicos: proporción de hemocitos viables, conteo total
y diferenciado de hemocitos, capacidad de fagocitosis y estallido respiratorio de los
hemocitos en la hemolinfa de
juveniles de H. rufescens. También se analizó la
expresión de la proteína de estrés Hsp70, el crecimiento y supervivencia de los
individuos en relación a los factores ya mencionados. Diferencias crónicas en la
temperatura dentro de los rangos de tiempo estudiados, no afectaron los parámetros
inmunológicos analizados, la concentración de Hsp70 ni la supervivencia de H.
rufescens, pero si el crecimiento. La infección con “Candidatus Xenohaliotis
californiensis” afectó negativamente la respuesta inmune y el crecimiento, y está
asociada a un aumento de la expresión de la proteína Hsp70. No se observó interacción
entre la infección con WS-RLP y la temperatura sobre la respuesta inmune, la expresión
de Hsp70, el crecimiento o la supervivencia de H. rufescens. De esta forma, el desarrollo
de la enfermedad y la aceleración de su progresión no pueden ser atribuidas al efecto
crónico de la temperatura alta sobre el sistema inmune de H. rufescens.
ii
ABSTRACT
The Withering Syndrome (WS) is a disease that affects natural and cultured populations
of the genus Haliotis. Their etiologic agent is the rickettsial-like bacterium "Candidatus
Xenohaliotis californiensis", (WS-RLP) that is located in the epithelia of the
gastrointestinal tract of abalone, especially in the post-oesophagus. The temperature
increase of the water associated with the summer period or “El Niño” phenomenon
increases susceptibility, prevalence and intensity of infection, as well as promoting the
development of the disease. In Chile the presence of WS-RLP is detected in farmed red
abalone (Haliotis rufescens). Juveniles of red abalone, WS-RLP infected and cultured at
18°C and without external clinical signs of disease, have an energy imbalance. This
imbalance, coupled with the stress factor that could mean infection and water
temperature, suggest that the chronic effect of elevated temperature, infection, or the
interaction of both factors affect the immune response of red abalone. To verify this, we
evaluated during 150 days, the effect of water temperature (15 to 20°C) and WS-RLP
infection, on the immunological parameters: viable hemocyte ratio, total and differential
count of hemocytes, phagocytosis and hemocyte respiratory burst in the hemolymph of
juvenile H. rufescens. We also analyzed the expression of the stress protein Hsp70,
growth and survival of individuals in relation to the above factors. Chronic differences
in temperature within the time range studied, did not affect the immunological
parameters tested, the concentration of Hsp70 or survival of H. rufescens, but did affect
the growth rate. Infection with "Candidatus Xenohaliotis californiensis" negatively
affected the immune response and growth, and was associated with increased expression
of Hsp70. There was no interaction between infection with WS-RLP and the temperature
on the immune response, expression of Hsp70, growth or survival of H. rufescens. Thus,
the development of the disease and its progression acceleration can not be attributed to
the chronic effect of high temperature on the immune system of H. rufescens.
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Individuos adultos de Haliotis rufescens.
Página
1
Figura 2. Individuos juveniles de H. rufescens con y sin síntomas macroscópicos
de WS.
5
Figura 3. Micrografía de postesófago de H. rufescens. Flechas indican
inclusiones de “Ca. Xenohaliotis californiensis”.
9
Figura 4. Esquema de los mecanismos de acción del sistema inmune
inespecífico en moluscos.
14
Figura 5. Vías de destrucción intracelular de patógenos.
15
Figura 6. Tipos de hemocitos observados en moluscos.
17
Figura 7. Esquema del experimento.
25
Figura 8. Colecta de heces de H. rufescens.
27
Figura 9. Gel de poliacrilamida con electroforesis de ADN extraído de heces de
H. rufescens y amplificado para detección de “Ca. Xenohaliotis californiensis”.
29
Figura 10. Experimento montado en sala de ambiente controlado.
31
Figura 11. Ejemplo de cálculo del área de la fotografía digital y el área ocupada
por inclusiones bacterianas.
41
Figura 12. Micrografía de glándula digestiva de H. rufescens infectado con “Ca.
Xenohaliotis californiensis”.
44
Figura 13. Porcentaje de hemocitos viables en hemolinfa de H. rufescens con y
sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
46
Figura 14. Número de hemocitos viables/mL de hemolinfa en H. rufescens con
y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
48
Figura 15. Tipos de hemocitos identificados en monocapas de hemolinfa de H.
rufescens.
50
Figura 16. Porcentaje hemocitos hialinocitos y granulocitos en hemolinfa de H.
rufescens, con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a
15 y 20°C.
51
iv
Figura 17. Hemocitos de
(Saccharomyces cerevisiae).
H.
rufescens
fagocitadas
53
Figura 18. Porcentaje de hemocitos que fagocitan la levadura Saccharomyces
cerevisiae
54
Figura 19. Relación entre la absorbancia a 630 nm de hemocitos de H. rufescens
estimulados y no estimulados con Zimosán, con y sin infección con “Ca.
Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
56
Figura 20. Concentración de Hsp70 en proteína total de branquia de H.
rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a
15 y 20°C.
57
Figura 21. Variación en la longitud y peso total promedio de H. rufescens con y
sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
60
Figura 22. Tipos de inclusiones observadas en cortes histológicos de H.
rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis”
63
Figura 23. Área y número promedios de inclusiones bacterianas (WS-RLP y WSRLPv) en cortes histológicos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
65
Figura 24. Micrografía de corte histológico de glándula digestiva de H.
rufescens, con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”.
67
Figura 25. Área promedio de tejido de glándula digestiva normal y metaplásica
en individuos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y
cultivado a 15 y 20°C.
69
Figura 26. Micrografía de la musculatura del pie de H. rufescens tejido muscular
normal y degradado.
71
Figura 27. Área promedio de tejido muscular degradado en el pie en individuos
de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis” ” y cultivado a
15 y 20°C..
72
v
con
levaduras
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Patógenos descritos para el género Haliotis que causan
enfermedades severas en cultivo y poblaciones naturales.
Página
4
Tabla 2. Resultados del diagnóstico de H. rufescens por medio de las
técnicas PCR en heces y postesófago e histología.
43
Tabla 3. Análisis de Varianza Factorial para la viabilidad de hemocitos
circulantes en hemolinfa de H. rufescens con y sin infección con “Ca.
Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
46
Tabla 4. Análisis de Varianza Factorial del total de hemocitos viables/mL de
hemolinfa en H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
48
Tabla 5. Análisis de Varianza Factorial del porcentaje de tipo de hemocitos
(hialinocitos y granulocitos) en hemolinfa en H. rufescens con y sin infección
con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
52
Tabla 6. Análisis de Varianza Factorial de la fagocitosis en hemocitos de H.
rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y
cultivado a 15 y 20°C.
54
Tabla 7. Análisis de Varianza Factorial del estallido respiratorio de
hemocitos de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
56
Tabla 8. Análisis de Varianza Factorial de la concentración de Hsp70 en
branquias de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
58
Tabla 9. Porcentaje de supervivencia de H. rufescens con y sin infección con
“Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
58
Tabla 10. Análisis de Varianza de la longitud inicial de H. rufescens con y
sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”
61
Tabla 11. Análisis de Varianza de del peso inicial de H. rufescens con y sin
infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis
61
Tabla 12. Análisis de Varianza Factorial para el crecimiento total de longitud
de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y
cultivado a 15 y 20°C
61
vi
Tabla 13. Análisis de Varianza Factorial para el crecimiento total de peso de
H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y
cultivado a 15 y 20°C.
62
Tabla 14. Análisis de Covarianza para el área ocupada por las inclusiones
bacterianas en H. rufescens infectado con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y
cultivado a 15 y 20°C.
66
Tabla 15. Análisis de Covarianza para el número de inclusiones bacterianas
en H. rufescens infectado con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a
15 y 20°C.
66
Tabla 16. Correlación entre número y superficie de inclusiones bacterianas
en H. rufescens infectado con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a
15 y 20°C.
66
Tabla 17. Análisis de Covarianza del área ocupada por tejido normal en
glándula digestiva y glándula digestiva metaplásica en H. rufescens infectado
con “Ca. Xenohaliotis californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
69
Tabla 18. Frecuencia de individuos de H. rufescens infectados con “Ca.
Xenohaliotis californiensis”, clasificados de acuerdo al índice de degradación
de la glándula digestiva.
70
Tabla 19. Análisis de Covarianza del área de tejido muscular normal y
degradado en el pié de en H. rufescens infectado con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y cultivado a 15 y 20°C.
72
vii
INTRODUCCIÓN
Cultivo de abalón rojo en Chile
El abalón rojo, Haliotis rufescens, se distribuye naturalmente en la costa del Pacífico de
América del Norte, desde el estado de Oregón, en Estados Unidos, hasta el centro de
Baja California, en México. Vive sobre sustratos rocosos desde el intermareal, en pozas,
hasta profundidades de 65 metros, en zonas expuestas al oleaje con temperaturas entre
los 7 y 16º C (Hahn, 1989). En laboratorio esta especie muestra preferencia por una
temperatura de 18,8°C, y tiene un óptimo teórico de crecimiento a 18,4°C (Díaz et al.,
2000).
Figura 1. Individuos adultos de Haliotis rufescens
(Fotografía: Juan Enrique Illanes, UCN, Coquimbo).
Esta especie fue introducida en Chile en 1979 como parte de un proyecto de
investigación llevado a adelante por la Universidad Católica del Norte y Fundación
Chile, con el financiamiento de la OEA (Viviani, 1981). Se trasladaron 300 individuos,
juveniles y adultos, desde Estados Unidos con el fin de realizar estudios sobre relaciones
predador-presa, adaptación al medio, impacto ecológico, alimentación, crecimiento y
1
reproducción en laboratorio (Illanes, 2004; Owen et al., 1984). Su comercialización se
registra a partir de 1992 por parte de la Fundación Chile, con individuos obtenidos en el
centro de cultivo de la empresa Campos Marinos S.A., ubicada en la Isla de Chiloé
(Región de los Lagos) (Flores-Aguilar et al., 2007).
Los datos estadísticos muestran que en Chile la producción de abalón rojo durante 2011
fue de 834 toneladas, con un aumento del 550% con relación al año 2000
(SERNAPESCA, 2012). La industria de la Región de Coquimbo se centra
principalmente en la producción de semillas para abastecer centros de engorda en la
Región de los Ríos (instalaciones en tierra) y en la Región de Los Lagos (instalaciones
en el mar) (Enríquez & Villagrán, 2008). Los centros de engorda de las regiones de
Atacama y Coquimbo son todos en tierra y producen sus propias semillas o las compran
a las empresas que las producen en Coquimbo.
Enfermedades en abalones
Las condiciones de cultivo intensivo (temperatura alta del agua, abundancia de alimento,
exceso de materia orgánica, altas densidades de los individuos) tienen como
consecuencia un aumento de la incidencia de las enfermedades, las que se han
transformado en un problema para la acuicultura (Paillard et al., 2004). Bower &
Campbell (2000) resaltan que en los abalones la acuicultura ha hecho más evidente que
en cualquier otro molusco sus patógenos y enfermedades.
En los haliótidos se han descrito patógenos que los afectan severamente, tanto en
ambiente natural como en cultivo. Bower & Campbell (2000) los clasifican en relación a
los efectos que éstos han tenido. En la categoría I se agrupan los patógenos que causan
enfermedades con mortalidades muy altas y que han impactado en forma negativa en la
industria acuícola o sobre poblaciones naturales. La categoría II incluye a los
considerados benignos o con requerimientos especiales que no permitirían su
establecimiento en otra localidad. En la tercera categoría se incluyen los organismos que
normalmente son benignos pero que ciertas condiciones ambientales o de estrés del
abalón permiten su proliferación. La Tabla 1 muestra los patógenos y enfermedades que
2
afectan a los abalones y que, según estos criterios, se incluyen en la Categoría I (Bower,
2003; Bower & Campbell, 2000).
El grupo de enfermedades más severas (Categoría I) muestra patologías restringidas a un
solo país, como la Amiotrofía que sólo está descrita en Japón y la Enfermedad de las
pústulas presente en China. También se observan enfermedades con una distribución
muy amplia, como el Síndrome del marchitamiento del pie del abalón y las infestaciones
con poliquetos.
La introducción de especies no nativas en otros países y los esfuerzos por repoblar
ambientes naturales han ampliado la distribución de muchos de los patógenos, siendo los
poliquetos perforadores de la concha y la bacteria “Candidatus Xenohaliotis
californiensis” dos de los casos más claros de los efectos que puede tener el traslado de
animales sin control de sus patógenos (Berthe, 2003; Radashevsky & Olivares, 2005;
Sato-Okoshi et al., 2008; Wetchateng et al., 2010).
3
Tabla 1. Patógenos descritos para el género Haliotis que causan enfermedades severas
en cultivo y poblaciones naturales.
Patógeno /
Nombre de la enfermedad
Amiotrofía
(posiblemente causada por un
virus)
Especie que afecta
H. discus discus
H. discus hannai
Herpevirus /
Ganglioneuritis viral del abalón
y Enfermedad viral del abalón
H. discus hannai
H. diversicolor
H. laevigata
H. rubra
Vibrio fluvialis II (bacteria) /
Enfermedad de las pústulas
H. discus hannai
“Candidatus Xenohaliotis
californiensis” (bacteria) /
(Síndrome de marchitamiento
del pie del abalón – Withering
syndrome)
H. corrugata,
H. cracherodii
H. diversicolor
supertexta
H. fulgens
H. midae
H. tuberculata
H. sorenseni
H. walallensis
H. rufescens
H. cracherodii
H. rubra
H. laevigata
H. cyclobates
H. scalaris
H. rufescens
H. kamtschatkana
H. iris
Perkinsus olseni (Protozoo)
Labyrinthuloides haliotidis
(Protozoo)
Haplosporidio (especie
desconocida)
Terebrasabella heterouncinata
(Poliqueto) / Sabelidosis
H. rufescens
H. corrugata
H. midae
H. fulgens
Polidoriasis (Polydora limicola,
P. ligni, P. websteri, P. hoplura,
P. woodwicki, P. uncinata,
Dipolydora armata, Boccardia
knoxi)
H. rufescens
H. discus hannai
H. rubra
H. diversicolor
H. iris
Ubicación del patógeno / síntomas)
Distribución
Atrofia del manto y de la musculatura
del pie (no puede adherirse al sustrato)
Concha crece deforme
Animales
moribundos
presentan
tumores en ganglio pedal
Patologías que afectan al tracto
digestivo, glándula digestiva, nefridios,
hemocitos y tejido neural.
Disminuye apetito, actividad, fotofobia,
tasa de crecimiento.
Aumento en la secreción de mucus, pie
y manto contraídos, musculatura del pie
negra y endurecida
Lesiones tipo ampollas en el pie del
abalón
Enfermedad progresiva, que provoca las
disgregación de los tejidos conectivos y
las fibras musculares
Glándula digestiva y postesófago /
Metaplasia y degeneración de glándula
digestiva, anorexia, letargo, degradación
de la musculatura del pie
Japón
Prolifera en el pie y manto, provocando
abscesos
esféricos
marrones.
Externamente se aprecian pústulas
purulentas
Destrucción de tejidos de pie y cabeza
del organismo
Células gliales del los nervios del manto
y pie, dentro de las branquias,
hemolinfa, corazón, nefridio, pie.
Disminuye tasa de crecimiento, deforma
las conchas y poros respiratorios
(pueden llegar a faltar), en caso
extremos la concha se vuelve
quebradiza
Disminuye la tasa de crecimiento,
deforma las conchas, la concha se
vuelve quebradiza
Australia
Australia
China
Taiwán
China
Chile
China
E. Unidos
España
Irlanda
Islandia
México
N. Zelanda
Tailandia
Taiwán
Canadá
N. Zelanda
E. Unidos
Chile
Islandia
México
Sudáfrica
Australia
Canadá,
Chile
China,
Japón
México
N. Zelanda
Sudáfrica
Tasmania
(Bower, 2003; Bower & Campbell, 2000; Radashevsky & Olivares, 2005; Travers, 2008; Wetchateng et
al., 2010)
4
Síndrome del marchitamiento del pie del abalón.
El síndrome del marchitamiento del pie del abalón, o Withering Syndrome (WS), es una
enfermedad que afecta a varias especies del género Haliotis.
El WS afecta a abalones de más de 25 mm de longitud en poblaciones naturales y en
cultivo (Bower & Campbell, 2000; Friedman, 2012). Sus síntomas visibles son el
letargo, retracción de los tejidos viscerales, atrofia de la musculatura del pie (Fig. 2),
siendo letal en sus etapas más avanzadas. Los individuos afectados se ven descoloridos,
no responden a estímulos y no se adhieren bien al sustrato (Bower & Campbell, 2000).
Figura 2. Individuos juveniles de Haliotis rufescens con y sin síntomas macroscópicos
de WS. Individuo de la izquierda sin síntomas, individuo de la derecha con síntomas de
WS.
La desaparición casi total de las poblaciones naturales de H. cracherodii durante la
década del 80 en la costa del Pacífico de Estados Unidos (99% de mortalidad) (Haaker et
al., 1992; Lafferty & Kuris, 1993; Richards & Davis, 1993) promovió la investigación
de este fenómeno. En 1986 se confirmó que la causa de estas muertes era el síndrome
del marchitamiento del pie del abalón (WS) (Haaker et al., 1992). Esta enfermedad
5
también se ha asociado a altas tasas de mortalidad en los cultivos de H. rufescens en
California (USA) y Baja California (México) durante el evento del El Niño de 1997-98
(Friedman et al., 2000b; Moore et al., 2000). También se la señala como causa probable
del fracaso de los intentos reiterados de repoblar hábitats naturales de las distintas
especies de abalones de la costa de Oeste de Norteamérica (Friedman, 2012).
Antes de que se detecten los síntomas visibles del WS se han verificado alteraciones
metabólicas, como disminución de la hemocianina en la hemolinfa y la cantidad de
glicógeno en la musculatura del pie, junto con una disminución de la abundancia de los
hemocitos y aumento en las anormalidades morfológicas de ellos (Bower & Campbell,
2000). Individuos de H. cracherodii infectados y asintomáticos, consumen 4,4 veces
menos alimento, 1,2 veces menos oxígeno y excretan 3,8 veces más amonio por gramo
de peso húmedo que un animal sano. En cortes histológicos se observan cambios
morfológicos en la glándula digestiva que pueden ser la presencia de glándula digestiva
metaplásica (en H. rufescens) o degeneración de la misma (en H. cracherodii). En la
glándula digestiva metaplásica se sustituye el tejido con capacidad de realizar digestión
intracelular por tejido de transporte, similar al del postesófago. Cuando se observa
degeneración de la glándula digestiva, hay atrofia de los túbulos o acinos secretores,
aumento del tejido conectivo e inflamación. Estos cambios se observan junto con la
disminución de la ingesta de alimento (anorexia), consumo de las reservas de glicógeno
y, posteriormente, el uso de la musculatura del pie como fuente de energía. En un corte
histológico del pie se observa la presencia de tejido conectivo abundante y tejido
muscular escaso y desorganizado (Bower & Campbell, 2000)
Una característica de esta enfermedad es la presencia de un período largo de incubación,
donde los abalones infectados por la bacteria no presentan signos clínicos que permitan
realizar un diagnóstico en base a características macroscópicas, el que puede llegar a
siete meses o más. Cuando los signos de letargo, retracción del manto e incapacidad de
mantenerse adherido al sustrato son visibles, la enfermedad ya no es tratable porque el
abalón presenta degeneración total de su glándula digestiva y musculatura del pie. La
6
muerte del individuo generalmente ocurre un mes o dos después de la aparición de los
primeros síntomas clínicos (Bower & Campbell, 2000).
El incremento de la temperatura del agua, asociado a la temperatura estival o al
Fenómeno de El Niño, aumenta la prevalencia de la infección, sugiriendo que este factor
promueve la transmisión del patógeno (Braid et al., 2005) o causa cambios en la
fisiología de los abalones, lo que facilita la infección y desarrollo del patógeno. También
acelera la progresión de la enfermedad y, por lo tanto, el aumento la mortalidad (Braid et
al., 2005; Friedman et al., 1997; Moore et al., 2000). Trabajando con individuos
colectados en poblaciones naturales de H. rufescens en el sur de California y simulando
en el laboratorio temperaturas de condiciones naturales y de propias de periodos con
fenómenos El Niño o La Niña, se observa que en los animales con y sin infección con
WS-RLP la supervivencia e índice de condición de los individuos son menores a la
temperatura de El Niño, al compararlo con temperaturas de condiciones naturales y La
Niña (Moore et al., 2011). Este experimento también muestra que la mortalidad causada
por la enfermedad se comienza a manifestar aproximadamente 50 días después de
finalizado el periodo de temperaturas altas.
La temperatura a la cual los abalones son más susceptibles a la infección y a la cual se
desarrolla la enfermedad parece ser específica para cada especie de abalón, como se ha
verificado en cinco especies diferentes. En H. cracherodii la mayor susceptibilidad se
observa a temperaturas superiores a los 20°C, mientras que H. rufescens lo es a partir de
los 18,5°C (Bower, 2003). H. fulgens (Moore et al., 2009) y H. discus hannai (González
et al., 2012) no se infectan ni muestran síntomas a las mismas temperaturas que H.
rufescens. En ejemplares provenientes de poblaciones naturales y cultivos de H. fulgens
de Baja California, se observó que sólo desarrollan la enfermedad por sobre 25°C,
mientras que a 20º C mantienen muy bajos niveles de prevalencia de la infección
(García-Esquivel et al., 2007). En H. diversicolor supertexta, especie que se cultiva
entre 27 y 29°C, se ha detectado la presencia de WS-RLP, pero a 28°C no se observa
desarrollo del síndrome, no hay glándula digestiva metaplásica ni signos de degradación
en ella, y en la musculatura del pie tampoco se observa degradación (Wetchateng et al.,
7
2010). En este caso se presume que la temperatura de cultivo de esta especie de abalón
sea limitante para que la enfermedad se desarrolle. En base a estos resultados se postula
que el síndrome sería inducido en animales infectados a una temperatura superior a la
óptima para cada especie de abalón (Moore et al., 2009).
El agente etiológico del síndrome es la bacteria intracelular “Candidatus Xenohaliotis
californiensis” (WS-RLP: Withering Syndrome–Rickettsial-like Prokaryote) (Fig. 3). Fue
identificada en el año 2000 en base a rasgos morfológicos, patológicos y genómicos.
Estos últimos se basaron en la secuenciación del 98% del gen que codifica el ARNr 16S
(1501 pb, Genbank Accesion AF133090.2) (Friedman et al., 2000b). Fue descrita como
una bacteria pequeña, intracelular obligada, Gram negativa, pleomórfica, que forma
inclusiones citoplasmáticas dentro de las células del epitelio gastrointestinal. Presenta
tinción basófila a la técnica de tinción con Hematoxilina-Eosina. Estas características
son las que permiten su inclusión dentro del orden Rickettsial (Friedman et al., 2000b).
Debido a su característica de ser un huésped intracelular obligado no se ha podido
cultivar en medios de cultivo sintéticos o líneas celulares de peces. Al no existir líneas
celulares de moluscos, la clasificación dentro de este orden de bacterias es provisional,
denominándoselas tipo-rickettsiales (Rickettsial-like Prokaryote o RLP). Se localiza
intracelularmente en las células epiteliales del postesófago, intestino, además de los
epitelios de absorción y transporte de la glándula digestiva (Friedman et al., 2000b).
8
Figura 3. Micrografía de postesófago de H. rufescens. Flechas indican inclusiones de
“Ca .Xenohaliotis californiensis”. (Tinción: Hematoxilina-Eosina)
Esta bacteria es considerada endémica de la costa de California (Estados Unidos) y Baja
California (México) (Balseiro et al., 2006; Moore et al., 2002). También se ha
identificado en Chile, China, España, Islandia, Irlanda, Nueva Zelanda, Taiwán y
Tailandia (Balseiro et al., 2006; Bower, 2003; Campalans & Lohrmann, 2009; Ockert,
2005; Wetchateng et al., 2010). Infecciones por WS-RLP también se han observado en
H. corrugata, H. cracherodii, H. diversicolor supertexta, H. fulgens, H. midae, H.
tuberculata, H. sorenseni y H. walallensis (Balseiro et al., 2006; Braid et al., 2005;
Burton et al., 2007; Cáceres-Martínez, 2002; Friedman, 2012; Ockert, 2005). Por otra
parte, en China y Sudáfrica se han detectado organismos similares a “Ca. Xenohaliotis
californiensis” y síntomas de WS en abalones (Cáceres-Martínez, 2002). La distribución
de la bacteria desde California al resto del mundo se explica por el transporte de
animales infectados (semilla y/o reproductores) (Berthe, 2003; Day & Prince, 2007;
Friedman, 2012; Friedman & Finley, 2003; Wetchateng et al., 2010). En la mayoría de
los países donde se ha detectado WS-RLP, distintas especies de haliótidos fueron
introducidas en los años 80 y principios de los 90, cuando aún no se había identificado la
9
enfermedad, o no existía una metodología confiable para el diagnóstico de la presencia
de su agente etiológico.
El orden Rickettsiales incluye a un grupo grande y diverso de protobacterias
intracelulares obligadas, Gram negativas, de distribución cosmopolita. El orden tiene dos
familias, Rickettsiaceae y Anaplasmataceae. Las bacterias de la familia Rickettsiaceae se
localizan en el citoplasma de células eucariotas y muchos son agentes etiológicos de
enfermedades que afectan a humanos como el tifus murino, epidémico y de los
matorrales. Esta familia también incluye organismos que afectan a animales acuáticos.
Por ejemplo, Piscirickettsia salmonis es la causa de la piscirickettsiosis en los
salmónidos (Fryer & Hedrick, 2003). La hepatopancreatitis necrotizante en el camarón
Litopenaeus vannamei (Morales Covarrubias, 2012), la enfermedad del camarón
manchado en el camarón del pacífico (Pandalus platyceros) (Bower et al., 1996) y las
mortalidades masivas del cangrejo Eriocheir (Wang & Gu, 2002), también son causadas
por rickettsiales.
En moluscos, se han identificado infecciones por RLP en bivalvos como Argopecten
irradians, Argopecten purpuratus, Crassostrea ariakensis, Crassostrea rizophorae,
Chlamys opercularis, Hippopus hippopus, Meretrix lusoria, Patinopecten yessoensis,
Pecten maximus, Placopecten magellanicus, Tapes japonica, Venerupis rhomboide
(Azevedo et al., 2005; Campalans & Lohrmann, 2009; Elston, 1986; Gulka et al., 1983;
Kellner-Cousin et al., 1993; Le Gall & Mialhe, 1992; Norton et al., 1993; Villalba et al.,
1999).
Para la detección de la infección con WS-RLP y diagnóstico del síndrome, la
Organización Mundial de la Sanidad Animal (O.I.E.: Office International des
Epizooties) recomienda varias técnicas, pero la confirmación de un caso debe hacerse
por histología y/o hibridación in-situ (Friedman, 2012). En el tejido de la glándula
digestiva y postesófago se utiliza de detección del ADN de la bacteria por medio del uso
de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Andree et al., 2000).
Burton et al. (2007) desarrollaron un método para la aplicación de esta técnica usando
10
heces de los abalones para la obtención de ADN y así obtener una metodología no
invasiva que evita sacrificar el individuo para la obtención de muestras.
Al presente, el único tratamiento efectivo informado para reducir la intensidad o
eliminar la infección con WS-RLP es la administración del antibiótico oxitetraciclina
(Friedman et al., 2003; Friedman et al., 2007; Rosenblum et al., 2008). Su aplicación
por medio de una inyección intramuscular o en el alimento antes del inicio de la
temporada de mayor temperatura en el agua puede reducir la intensidad de la infección y
las pérdidas causadas por mortalidad (Bower, 2003; Friedman, 2012) En cultivo, los
individuos de H. cracherodii y H. rufescens tratados con oxitetraciclina son resistentes a
re-infecciones hasta un año después de la aplicación del antibiótico debido a que la
glándula digestiva es capaz de retener el antibiótico por seis meses a un año (Braid et al.,
2005; Friedman et al., 2003). La concentración de oxitetraciclina en la musculatura del
pie, en cambio, alcanza valores bajo 2 ppm entre los 15 a 22 días posteriores al término
de su administración (Braid et al., 2005; Friedman et al., 2003; Friedman et al., 2007),
máximo de antibiótico detectable permitido en productos de acuicultura permitida por la
Administración de Alimentos y Drogas de Estados Unidos (F.D.A.) (F.D.A., 2001).
En Chile, WS-RLP está presente en los cultivos de abalones de la zona norte y sur del
país (Campalans & Lohrmann, 2009). La O.I.E. establece que la presencia de la
infección con esta bacteria es de declaración obligatoria a la autoridad sanitaria
correspondiente en cada país (O.I.E., 2013). Por ello, de acuerdo a la legislación
sanitaria vigente en Chile se incluye en la Lista 3 de Enfermedades de Alto Riesgo
(EAR), que incluye las enfermedades de declaración obligatoria por la O.I.E. presentes
en el país (M.E.F.T., 2013)
Sistema inmune en moluscos.
En los últimos años, la expansión de la acuicultura de moluscos ha impulsado un avance
en el estudio del sistema inmune de este grupo, tanto respecto al análisis de los tipos
celulares que lo componen y sus funciones, como a la respuesta inmune en organismos
sanos y enfermos, evaluadas principalmente por capacidad de fagocitosis, estallido
11
respiratorio y producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Costa et al., 2009;
Tiscar & Mosca, 2004).
La primera línea de defensa con la que los organismos enfrentan un agente invasor son
barreras externas, como la piel o epitelios. Si el agente extraño supera esas barreras se
produce la activación de un sistema interno de defensa conformado por el Sistema
Inmune Innato (Collado et al., 2008). Éste surge temprano en la evolución y se mantiene
en todos los animales con muy pocas variaciones (Collado et al., 2008; Humphries &
Yoshino, 2003).
En los moluscos, al igual que todos los invertebrados, sólo existe un sistema inmune
inespecífico, basado en un componente celular y humoral que se caracteriza por generar
una respuesta inmediata no específica (Fig. 4) (González & Arenas, 2007; Medzhitov,
2001; Zhang et al., 2006). El sistema celular está compuesto por los hemocitos que
reconocen, fagocitan, destruyen y eliminan células extrañas, constituyendo el
mecanismo principal para la eliminación de patógenos (Ralph et al., 2004; Tiscar &
Mosca, 2004; Yakovleva et al., 2001). El componente humoral está constituido por
moléculas disueltas en la hemolinfa con funciones antimicrobianas: enzimas lisosomales
como la fosfatasa ácida y la fosfatasa alcalina (Travers, 2008), aglutininas y opsoninas
(lectinas) (Hooper et al., 2007; Yakovleva et al., 2001) y péptidos antimicrobianos
(defensinas) (Mitta et al., 1999). Este sistema inespecífico, no posee la capacidad de
distinguir entre agentes extraños diferentes, pero si es capaz de reconocer estructuras
específicas como los Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PMAP) (Medzhitov
& Janeway, 1997).
Dentro de las funciones de los hemocitos se pueden citar la fagocitosis y la producción
de especies reactivas del oxígeno (ROS). Ellos, además, modulan la inmunidad humoral
a través de la síntesis y secreción de moléculas con actividad antibacteriana, citotóxica o
actividad opsonizadora, como enzimas lisosomales, aglutininas, opsoninas y péptidos
antimicrobianos (Pampanin et al., 2002). Estas células, además, intervienen en procesos
12
de transporte de nutrientes, oxígeno y productos para excreción, reparación de la concha
y eliminación de contaminantes (Tiscar & Mosca, 2004; Zhang et al., 2006).
La fagocitosis es el proceso mediante el cual partículas o microorganismos son
internalizados dentro de los hemocitos formando una vacuola digestiva llamada
fagosoma (Fig. 4) (Rodríguez & Le Moullac, 2000). Es un proceso altamente
conservado a lo largo de la evolución, ya que se observa en organismos unicelulares
como forma de ingestión de nutrientes y en vertebrados está presente en los procesos
inflamatorios (Feng, 1988). Las etapas de la fagocitosis son el reconocimiento de la
partícula extraña seguido de la adhesión de la misma. Este proceso puede darse por un
encuentro al azar entre el hemocito y la partícula o por quimiotaxis. Una vez reconocido
el cuerpo extraño se produce la adhesión, donde las aglutininas son las mediadoras para
la unión de la partícula extraña a los receptores de la superficie del hemocito. La
internalización se produce por la emisión de seudópodos que engloban y atrapan al
cuerpo extraño, pero también puede ser por invaginación de la membrana celular. Este
proceso lleva a la formación de una vacuola en el citoplasma del hemocito (fagosoma).
Los lisosomas presentes en el citoplasma del hemocito interactúan con el fagosoma,
liberando en su interior enzimas hidrolíticas ácidas para destruir el agente extraño. Una
vez finalizada la destrucción, se forman gránulos de glucógeno que son usados en los
procesos metabólicos del hemocito o son liberados a la hemolinfa.
El estallido respiratorio es un proceso asociado a la fagocitosis, mediante el cual los
hemocitos destruyen, dentro de los fagosomas, el material fagocitado (Hooper et al.,
2007; Roch, 1999) y ocurre en base a la generación de especies reactivas de oxígeno
(ROS), como el anión superóxido (O2-), el radical hidroxilo (-OH), ácido hipocloroso
(HOCl), el singlete de oxígeno (102-) y peróxido de hidrógeno (H2O2), los que destruyen
las membranas celulares y oxidan los ácidos nucleicos (Díaz, 2006) (Fig. 5). Son
moléculas que pueden actuar solas o en combinación con las enzimas hidrolíticas que
intervienen en la fagocitosis (Adema et al., 1991). El contacto de la membrana celular
del hemocito con el agente extraño desencadena la inducción del ensamblaje de los
componentes del complejo NADPH-oxidasa, para la formación del complejo funcional
13
activo, el cual transfiere electrones desde el NADPH al oxígeno molecular (Torreilles et
al., 1996). Junto con la fagocitosis, son los dos procesos básicos de defensa
inmunológica en todos los animales (Auffret, 1988; Bayne et al., 1980; Feng, 1988).
Arenas et al. (2003) destacan que la fagocitosis y el estallido respiratorio son parámetros
inmunológicos que se deben analizar para evaluar el sistema inmune de moluscos en
cultivo.
Figura 4. Esquema de los mecanismos de acción del sistema inmune inespecífico en
moluscos. Rosado: patógenos. Celeste: hemocitos. Verde: Componente humoral. Azul:
Componente celular. (Modificado de Soudant et al. (2008)).
14
Figura 5. Vías de destrucción intracelular de patógenos (dentro del fagosoma). SOD:
superóxido dismutasa; MPO: mieloperoxidasa (Modificado de Soudant et al. (2008))
Los tipos de hemocitos de los moluscos se clasifican de acuerdo a sus características
morfológicas, y con este criterio se diferencian dos tipos celulares: hialinocitos y
granulocitos (Cheng, 1981) (Fig. 6). Los hialinocitos son células redondeadas, con una
relación citoplasma/núcleo muy alta, con citoplasma claro y sin gránulos celulares. Los
granulocitos se distinguen por la presencia de gránulos citoplasmáticos y a su vez se
pueden dividir en eosinófilos y basófilos, de acuerdo a su afinidad por las tinciones
(Rasmussen et al., 1985).
Estudios recientes han profundizado en la investigación de los factores genéticos y
moleculares involucrados en la respuesta inmune en moluscos. Se ha identificado y
cuantificado la expresión de genes asociados a la respuesta inmune en Mya arenaria
(Araya et al., 2010) y Mytilus galloprovincialis (Costa et al., 2009) En H. discus discus
se han secuenciado genes que codifican proteínas de resistencia a Mixovirus (De Soyza
15
et al., 2007), de enzimas que controlan el estrés oxidativo, además de la regulación de su
expresión, de péptidos antimicrobianos y de sus reguladores (De Soyza et al., 2009b; De
Soyza et al., 2010a), del Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα) (De Soyza et al., 2009a;
De Soyza et al., 2010b) y del Factor-1 Inflamatorio Allograf (AIF-1) (De Soyza et al.,
2010c). Asimismo se ha secuenciado el gen para la enzima superóxido dismutasa en
juveniles de H. diversicolor supertexta (Li et al., 2010b) y se ha identificado secuencias
génicas y su expresión para receptores de TNFα en Chlamys farreri (Li et al., 2009) y
TCTP (proteína tumoral controlada traduccionalmente) en Venerupis philippinarum (Li
et al., 2010a)
16
Figura 6. Tipos de hemocitos observados en moluscos. H: hialinocitos. GR:
granulocitos. (a) Haliotis tuberculata (gasterópodo) (Modificado de Travers (2008)) (b)
Chlamys farreri (bivalvo) (Modificado de Lin et al. (2011).
Con respecto al síndrome del marchitamiento del abalón, se ha observado que individuos
de H. cracherodii con síntomas visibles de WS presentan un aumento de la quimiotaxis,
y disminución de la fagocitosis y del estallido respiratorio en sus hemocitos, respecto a
animales asintomáticos (Friedman et al., 2000a). No obstante, no está claro si dicho
efecto es una consecuencia directa de la infección con la bacteria o el resultado del
decaimiento en el estado general de los animales como consecuencia del avance de la
enfermedad. Por otra parte, se han encontrado diferencias en los patrones de expresión
17
de genes involucrados en la respuesta inmune de H. cracherodii entre poblaciones
afectadas por la enfermedad y poblaciones resistentes a la misma, sugiriendo que esta
diferencia puede ser responsable de la inhibición de la proliferación y/o tolerancia a la
bacteria WS-RLP (Crosson et al., 2010).
Proteínas de estrés térmico.
Las proteínas de estrés (HSP: Heat Shock Proteins) son proteínas altamente conservadas
en la naturaleza, y están presentes en todos los organismos vivos (bacterias, plantas y
animales). Estas proteínas llevan a cabo funciones esenciales en condiciones normales o
estresantes para la célula, previniendo la agregación de proteínas, como chaperonas
durante el transporte de proteínas entre organelos celulares, supervisando el plegamiento
que determina la estructura terciaria de proteínas nuevas y alteradas, y removiendo
proteínas con daño irreversible (Farcy et al., 2007). Se expresan en forma constitutiva en
las células, pero también son inducibles cuando estas células son sometidas a estrés
generado por el aumento en la temperatura, infecciones, toxicidad a metales pesados,
daño de tejidos, radiación, cáncer o hipoxia (Farcy et al., 2007).
Las HSP se agrupan y designan de acuerdo a su peso molecular, formando familias,
Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 y las HSP pequeñas. El análisis de sus secuencias
nucleotídicas permite una clasificación sistemática con bases filogenéticas, es decir que
dentro de una familia, sus miembros tienen un grado muy alto de homología de sus
secuencias (incluso entre procariotas y eucariotas), mientas que esta homología
disminuye al realizar la comparación entre familias (Robert, 2003).
La familia de la Hsp70 se considera como la proteína de estrés más importante por el rol
preponderante de chaperona que cumple frente a estrés extremo, entre ellos estrés
térmico. La acción de estos estresantes tiene como característica que su acción provoca
un incremento de los niveles de proteínas anormales (Cheng et al., 2006). Ella es la más
conservada de todas las familias, con una homología nucleotídica de 75% entre la Hsp70
de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) y de humanos (Lindquist, 1986).
18
La familia Hsp70 se ha estudiado en varias especies de moluscos. En Ostrea edulis
(Piano et al., 2005), Placopecten magellanicus, Argopecten irrandians (Brun et al.,
2008), Mytilus galloprovincialis (Franzellitti & Fabbri, 2005), Concholepas concholepas
(Roco, 2010) y H. tuberculata (Farcy et al., 2007) se ha observado un aumento en la
inducción de su síntesis frente a estrés térmico. En H. rufescens y Mytilus
galloprovincialis, compuestos tóxicos (fenobarbital, pentaclorofenol y heptacloro),
además del estrés térmicos, incrementaron la expresión de la familia completa Hsp70
(Snyder et al., 2001).
La expresión de la proteína de estrés Hsp70 se ha asociado con la respuesta inmune en
vertebrados e invertebrados (Robert, 2003; Zhou et al., 2010). En desafíos con
patógenos se ha verificado un aumento de la expresión de estas proteínas. En la ostra
perlífera Pinctada fucata, desafiada con la bacteria Vibrio alginolyticus (Wang et al.,
2009) y en abalón H. discus hannai infectado con Vibrio anguillarum (Cheng et al.,
2007b), se ha apreciado un aumento de la expresión de ARNm para Hsp70. Esto permite
suponer que la proteína Hsp70 también participaría en la respuesta de H. rufescens
frente a la infección con WS-RLP y podría ser un indicador de estrés causado por la
infección.
Efecto de la temperatura sobre la fisiología de los abalones.
La temperatura es uno de los factores que condiciona la distribución geográfica de de
una especie. Ésta varía según la latitud y profundidad del agua. Esto implica que una
especie presenta la capacidad de aclimatarse dentro de un rango determinado de
temperatura.
En organismos ectotérmicos, como los moluscos, la temperatura influye directamente
sobre el metabolismo y balance energético (Britz et al., 1997) afectando procesos
fisiológicos como la ingestión (Hahn, 1989; Preece & Mladenov, 1999.), respiración y
excreción (Barkai & Grifiths, 1987).
19
La temperatura afecta al sistema inmune de los moluscos deprimiendo o estimulando su
respuesta (Auffret & Oubella, 1994; Fisher, 1998; Fisher et al., 1987; Hégaret et al.,
2003a; b; Monari et al., 2007). En el abalón H. rubra, la exposición prolongada a
temperaturas elevadas, deprime la respuesta inmune antibacteriana (Dang et al., 2012).
En H. diversicolor supertexta, el estrés térmico también se deprime la respuesta inmune
y aumenta su susceptibilidad a la infección con Vibrio parahaemolyticus (Cheng et al.,
2004).
Steinarsson & Imsland (2003) citan diferencias en la temperatura óptima para el
crecimiento de H. rufescens a diferentes edades, señalando que los adultos tienen una
temperatura óptima de crecimiento menor que los juveniles. En H. midae, al aumentar la
temperatura del agua se registra incremento a corto plazo en el consumo de oxígeno y
excreción de nitrógeno (Vosloo & Vosloo, 2010). En esta misma especie el incremento
de la temperatura del agua promueve el crecimiento en longitud y la tasa de consumo de
alimento, y disminuye el factor de condición (Britz et al., 1997).
En el abalón rojo (H. rufescens) con y sin infección por WS-RLP y mantenido a 18°C, se
observó que 71% de los machos no produjo gametos y disminuía el número de células
en la línea germinal, mientras que las en las hembras hay disminución de la fecundidad
(Rogers-Bernett et al., 2010). Dahlhoff & Somero (1994) trabajaron con H. rufescens,
H. corrugada, H. cracherodii. H. kamtschatkana y H. fulgens y observaron que se
producía una inactivación de las mitocondrias y la enzima citocromo-c oxidasa cuando
cada especie se mantenía a una temperatura próxima al extremo superior de tolerancia
descrito para ella. El abalón H. fulgens cultivado a 25°C, presenta una disminución en el
crecimiento, supervivencia y deterioro de la salud general, al compararlos con abalones
cultivados a 20°C. Además se detectó alteración en las tasas de consumo y de
conversión y retraso en la maduración de los gametos (García-Esquivel et al., 2007).
20
Definición del problema
El síndrome del marchitamiento del pie del abalón es una enfermedad crónica que afecta
a varias especies del género Haliotis, ya sea a poblaciones naturales como en centros de
cultivo. La bacteria causante de esta enfermedad, “Ca. Xenohaliotis californiensis”, es
considerada endémica de la costa de California (Estados Unidos), pero debido al traslado
de reproductores y semilla, ha sido introducida en otros países. El agente etiológico y la
enfermedad han sido identificados en Chile y se ha informado que la prevalencia de la
infección puede llegar al 90%.
El aumento de la temperatura del agua, asociado al verano o al fenómeno de El Niño,
aumenta la susceptibilidad y prevalencia de la infección, además de acelerar el
desarrollo de la enfermedad.
En individuos juveniles de H. rufescens infectados con WS-RLP cultivados a 18°C, sin la
presencia de signos clínicos externos de la enfermedad, se ha observado desbalance
energético. Este desbalance, sumado al factor de estrés que podría significar la infección
y la temperatura del agua, permiten suponer que la temperatura, la infección o la
interacción de ambas tendrían un efecto en la respuesta inmune del abalón rojo. Si el
sistema inmune es deprimido, el abalón rojo sería más susceptible a la infección de otros
patógenos presentes normalmente en los cultivos. En caso de una sobrestimulación de la
respuesta inmunológica, ello implicaría un mayor costo energético para mantenimiento
del sistema inmune, lo que podría afectar directamente el crecimiento y la supervivencia
de los individuos afectados con la infección o cultivados a temperaturas altas.
En este trabajo se busca evaluar el efecto de la infección con WS-RLP, la temperatura del
agua y la interacción de ambas sobre algunos parámetros de la respuesta inmune en
individuos juveniles de H. rufescens. También se evaluará el efecto de estos factores
sobre la expresión de la proteína de estrés Hsp70, con el fin de analizar su uso como
indicador de estrés o de respuesta inmunológica. Adicionalmente se comparará el
crecimiento y supervivencia en individuos con y sin infección con WS-RLP, cultivados a
dos temperaturas.
21
El efecto de la temperatura del agua se evaluó a 15°C, temperatura a la cual no se
informa manifestación de WS (Braid et al., 2005; Friedman, 2012) y está dentro del
rango de desarrollo normal del abalón rojo (Hahn, 1989). También se trabajó con 20°C,
temperatura mayor al rango superior descrito en el ambiente natural (Hahn, 1989) y de
preferencia (Díaz et al., 2000) de esta especie de abalón y que favorece la infección con
WS-RLP y el desarrollo del WS (Friedman, 2012).
Los resultados obtenidos aportarán información sobre los efectos de la infección con
“Ca. Xenohaliotis californiensis” y su interacción con la temperatura, sobre la fisiología
de H. rufescens.
22
HIPÓTESIS
1.
La temperatura a 20°C afecta la respuesta inmune, la expresión de la proteína de
Hsp70, el crecimiento y la supervivencia en Haliotis rufescens.
2.
La infección con “Candidatus Xenohaliotis californiensis” afecta la respuesta
inmune, la expresión de Hsp70, el crecimiento y la supervivencia en Haliotis
rufescens.
23
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la temperatura y la infección con “Candidatus Xenohaliotis
californiensis” sobre la respuesta inmune, la expresión de Hsp70, el crecimiento y la
supervivencia en Haliotis rufescens.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1.
Evaluar el efecto de la temperatura del agua sobre la respuesta inmune, la
expresión de Hsp70, el crecimiento y la supervivencia de H. rufescens.
2.
Evaluar el efecto de la infección con “Candidatus Xenohaliotis californiensis”
sobre la respuesta inmune, la expresión de Hsp70, el crecimiento y la
supervivencia de H. rufescens.
3.
Verificar la existencia de interacción entre la temperatura y la infección con
“Candidatus Xenohaliotis californiensis” sobre la respuesta inmune, la expresión
de Hsp70, el crecimiento y la supervivencia en H. rufescens.
24
MATERIAL Y MÉTODOS
1.
Diseño experimental
El efecto de la temperatura del agua se evaluó a 15°C, temperatura a la cual no se
informa manifestación de WS (Braid et al., 2005; Friedman, 2012) y está dentro del
rango de desarrollo normal del abalón rojo (Hahn, 1989), y a 20°C, temperatura que está
por sobre el óptimo descrito para el desarrollo (Hahn, 1989) y de preferencia (Díaz et
al., 2000) de esta especie de abalón y que favorece la infección con WS-RLP y el
desarrollo del WS (Moore et al., 2001). El efecto de la infección se evaluó en animales
con y sin infección por WS-RLP, condición se verificó por la presencia de la bacteria en
las heces de H. rufescens (Burton et al., 2007). En cada tratamiento se montaron dos
réplicas, con 18 animales cada una, en 12 estanques con 100 L de agua cada uno, en un
esquema como el representado en la figura7.
Figura 7. Esquema del experimento
Para la evaluación de las variables inmunológicas, concentración de Hsp70, análisis
histológico y crecimiento se colectando muestras en los días 0 (inicio del experimento),
10, 30, 100 y 150 (final del experimento).
25
2.
Selección de organismos
Se usaron individuos de Haliotis rufescens de 40 y 50 mm de longitud de concha,
provenientes de la población obtenida en el proyecto FONDEF D05I-10013 “Aumento
de la productividad del cultivo de abalón rojo (Haliotis rufescens) mediante
mejoramiento genético y control de patógenos”, obtenidos en el Centro de Producción
de Abalones de la Universidad Católica del Norte (Coquimbo, Región de Coquimbo).
Los individuos provenían de la población generada en el período de desove de primavera
de 2008 y verano de 2009, y provienen de familias de hermanos completos y medios
hermanos obtenidos del cruce de un macho con 3 hembras cada uno. Al momento de
iniciar los experimentos (Enero de 2012) los individuos tenían aproximadamente 36
meses de edad. Se seleccionaron al azar de la población anteriormente mencionada y se
marcaron para su identificación individual.
Al inicio del trabajo se comprobó la infección de individuos de H. rufescens por “Ca.
Xenohaliotis californiensis” mediante diagnóstico por análisis de las heces por PCR
(Friedman et al., 2003). Los animales recibieron alimento balanceado (Abfeed®) a
saciedad durante 48 horas, posteriormente cada abalón se colocó en un recipiente con
800 mL de agua de mar microfiltrada y tratada con UV durante 12 a 14 horas (Figura 8
a, b). Luego, las heces se recolectaron con micropipetas con puntas estériles y se
colocaron en forma individual en tubos eppendorf estériles de 1,5 mL. Los tubos se
centrifugaron a 15.300 g por 10 minutos a 4°C, se retiró el sobrenadante, se agregó
etanol absoluto y se conservó a -20°C hasta el momento de realizar la extracción de
ADN.
26
Figura 8. Colecta de heces de H. rufescens. (a) Recipientes con agua de mar y abalones
para colecta de heces. (b) abalón en el recipiente con agua y heces (círculo rojo).
La extracción de ADN desde las heces se realizó con el con el kit comercial Qiagen
“QIAmp Dna Mini-Stool” siguiendo el protocolo del fabricante.
La detección de la presencia de la bacteria WS-RLP se realizó por medio de la
metodología de PCR, de acuerdo al protocolo descrito en el Manual de Pruebas
Diagnóstico de la O.I.E (Friedman, 2012). Los partidores para PCR desarrollados para
27
detectar “Ca. Xenohaliotis californiensis” amplifican específicamente un segmento de
160 pb del gen de ARNr 16S (GenBank Accesion: AF133090.2). Los partidores
utilizados fueron RA 5-1 (5’-GTT-GAA-CGT-GCC-TTCAGT-TTA-C-3’) y RA 3-6
(5’-ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3’). La amplificación por PCR se
realizó en un volumen de reacción estándar de 25 μL que contenía una solución tampón
de PCR 1x, (Tris 20 mM, KCl 50 mM), cloruro de magnesio 1,5 mM (MgCl2),
dinucleótidos trifosfato 1,5 mM (dNTPs, 0,2 mM, 0,5 mM de cada partidor, 1,6
unidades de polimerasa Taq y 5 μL de ADN). El programa para la reacción de
amplificación fue: desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, 40 ciclos a 95°C
durante 1 minuto, 62°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos, con una
extensión final a 72°C durante 10 minutos.
De cada reacción de PCR se tomó una alícuota para comprobar el producto de
amplificación por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida al 12%. El gel de
poliacrilamida se preparó de acuerdo al siguiente protocolo: para 1 gel se utilizaron 2,
mL de agua destilada desionizada (H2O dd), 2,3 mL de solución A (acrilamida al 12% +
bisacrilamida al 0,32%), 2,4 mL de solución B (Tris 1,49M, pH 8,8), APS (persulfato de
amonio) al 10%, 10 µl TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina).
La solución tampón de carga fue la siguiente: 0,5 mL de Tris 0,62 M, pH 6,8, 0,5 mL de
glicerol, 250 µL de β mercaptoetanol, 200 µL de azul de bromofenol 1,8% y 200 µL de
xilencianol 1%. Para cargar el ADN en el gel se utilizaron 10 µL de tampón de carga,
más 10 µL del ADN amplificado. También se cargó en cada gel un marcador de peso
molecular de 100 pares de bases. El tampón de corrida de la electroforesis fue TrisGlicina 1X.
El gel se tiñó con nitrato de plata de acuerdo al siguiente protocolo: una hora en 125 mL
de solución E (287 mL de etanol 96%, 3 mL de ácido acético). Se retiró la solución E y
el gel se colocó 30 minutos en 100 mL de solución de nitrato de plata 0,65 M. Se lavó
una vez con H2O destilada desionizada (H2O dd). Una vez lavado el nitrato de plata, se
agregó 100 mL de una solución con 30 mL de hidróxido de sodio al 10%, 69,2 mL de
28
H2O dd y 0,8 mL de solución G (38 mL de formaldehído + 162 mL de H2O dd). Se dejó
el gel en esta solución hasta que se observaron las bandas correspondientes al producto
de amplificación La reacción se detuvo con ácido acético glacial al 10%. Todo el
proceso de tinción se realizó colocando el recipiente que contenía el gel y la solución en
agitación.
El diagnóstico negativo de la infección con WS-RLP se verificó por la ausencia de la
banda correspondiente al nivel de 160 pb (Fig. 9).
Figura 9. Gel de poliacrilamida con electroforesis de ADN extraído de heces de H.
rufescens y amplificado para detección de “Ca. Xenohaliotis californiensis”.
PM: marcador de peso molecular (100 pb), C+: control positivo para “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, H: control negativo con agua. En azul se marca animales negativo, en
rojo animales positivos, en blanco control positivo. La flecha indica la banda de 160 pb
que identifica a “Ca. Xenohaliotis californiensis”.
3.
Montaje del experimento
Los estanques para la realización del experimento se colocaron en una sala de ambiente
controlado dentro del Laboratorio Central de Cultivos Marinos de la Universidad
Católica del Norte (Fig. 10). Dicha sala está dotada de un sistema de enfriamiento de
29
aire, que mantuvo la temperatura ambiente constante a 15° C durante el desarrollo del
experimento.
Antes de colocar los animales en los estanques experimentales, cada individuo fue
medido (longitud y ancho) y pesado. Estas medidas se tomaron nuevamente a cada
individuo que se retiró del estanque en los muestreos sucesivos.
Para reducir el riesgo de infección de los animales diagnosticados negativos para la
presencia de la bacteria durante el establecimiento del experimento, se montaron
primero los estanques correspondientes a los tratamientos con animales no infectados.
Posteriormente se ubicaron los animales infectados. En todo este proceso se trabajó con
guantes de látex desechables, los que se cambiaron y desecharon al trabajar en cada
estanque.
Con el fin de habituar a los animales al ambiente de la sala experimental, los abalones se
aclimataron por 7 días en los estanques y con los refugios con los que se realizará el
experimento. Para esto se mantuvieron los animales a la misma temperatura que
presentó el agua del centro de cultivo solamente se realizó cambios de agua y se entregó
alimento.
30
Figura 10. Experimento montado en sala de ambiente controlado. (a) Disposición de los
estanques en la sala de experimentación. Marca azul: estanques con animales no
infectados. Marca roja: estanques con animales infectados. Marca negra: estanques para
acopio de agua a 20°C y 15°C para el recambio. (b) estanques con agua a 15°C (sin
calefactor) (c) estanques con 20°C (con calefactor).
31
4.
Desarrollo del experimento
Para el tratamiento a 15°C, la temperatura se logró y mantuvo por medio del aire
acondicionado de la sala. Para lograr 20°C en los estanques, la temperatura se obtuvo y
mantuvo durante todo el experimento con calefactores de 150 W, ubicados en un
extremo del estanque. Para evitar que los abalones se agruparan en las cercanías el
calefactor, el aireador se colocó debajo de éste, generando una cortina de burbujas de
aire que impidió que los animales se fijaran sobre la pared donde estaba ubicado el
calefactor.
Para evitar fluctuaciones de temperatura, contaminación del agua y proteger los
animales experimentales de factores externos al experimento (x ej. luz), todos los
estanques se mantuvieron tapados con planchas de poliestireno expandido de 50 mm de
espesor. Adicionalmente, los estanques experimentales mantenidos a 20°C se forraron
con poliestireno expandido para reducir la pérdida de calor de los estanques a 20°C.
Finalizada la aclimatación se inició el experimento (día 0), se encendiendo el aire
acondicionado de forma que la temperatura del agua en los estanques experimentales a
15°C bajó gradualmente hasta igualarse con la de la sala. En forma paralela, en los
estanques con tratamientos a 20°C se encendieron los calefactores y el agua comenzó a
subir gradualmente hasta alcanzar y estabilizarse en la temperatura deseada.
El experimento tuvo una duración de 150 días. Durante él los individuos se mantuvieron
con 100 L de agua de mar microfiltrada a la temperatura correspondiente. En cada
estanque se colocó un refugio para los abalones formado por medio tubo de PVC de 30
cm de diámetro y 70 cm de longitud (Fig. 10). Se realizó recambio de agua, limpieza de
los estanques y entrega de alimento cada 48 horas. La limpieza consistió en retirar toda
el agua y restos de alimento y lavar suavemente paredes del estanque y refugio con agua
dulce. Posteriormente se llenó el estanque con el agua a la temperatura correspondiente
y se agregó una nueva ración de alimento balanceado AbFeed ® (aproximadamente 5 g
por estanque).
32
Para evitar la contaminación accidental de los animales no infectados, en los recambios
de agua y manipulación de los organismos durante los muestreos se trabajó con guantes
de látex desechables, los que se cambiaban luego de trabajar en cada estanque. Una vez
finalizado el trabajo de recambio de agua de los estanques, se limpió el piso de la sala
con Hipoclorito de sodio 250 ppm.
5.
Toma de muestras
La hemolinfa para los análisis inmunológicos se obtuvo del seno pedal del abalón
mediante un corte en la base del pie, colectándola con micropipetas con puntas estériles.
Los análisis inmunológicos se realizaron sobre un pool de hemolinfa confeccionado de
individuos de un mismo estanque formándose 8 pooles. Para esto, 500 µL de hemolinfa
de cada animal de un mismo estanque se combinaron en tubos de 15 mL y se les agregó
solución de Alsever (antiagregante) (Alsever & Ainslie, 1941) en proporción 1:3
(hemolinfa/antiagregante). La muestra se mantuvo en hielo hasta su análisis.
El análisis de Hsp70 se realizó en tejido de las branquias del abalón (branquia derecha),
extraídas durante la disección. La branquia se colocó en tubos eppendorf, se congeló
inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservó a -80°C hasta su análisis.
Muestras de tejido (las vísceras completas) y musculatura del pie se colocaron en cajas
de inclusión para histología y se conservaron por 24 horas en solución de fijación de
Davidson hasta la preparación de las muestras para histología (Shaw & Battle, 1957).
Debido a que las diferentes pruebas de diagnóstico no tienen la misma sensibilidad para
detectar la presencia de WS-RLP, adicionalmente a la prueba de ADN en las heces y la
de histología en la glándula digestiva y, se incluyó la prueba de detección de ADN de la
bacteria en los tejidos del postesófago del abalón (Andree et al., 2000) Para esto, de cada
individuo muestreado se colectó tejido del postesófago, el que fue fijado en etanol
absoluto y conservado a -20°C.
33
6.
Variables analizadas
Las variables que se analizaron durante el período experimental fueron:
a.
Diagnóstico por PCR en los tejidos de postesófago
Para la extracción de ADN de los tejidos usó el kit comercial “AxyPrep
TM
Multisource
Genomic DNA Miniprep Kit”, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El
protocolo de PCR y electroforesis en geles de acrilamida fue el mismo utilizado para el
diagnóstico en base al ADN en las heces.
b.
Análisis de parámetros inmunológicos
b1.
Número y viabilidad de hemocitos circulantes totales
El total de hemocitos circulantes en la hemolinfa se estimó de acuerdo a la técnica
descrita por (González & Arenas, 2007), mediante recuento celular en cámara de
Neubauer en microscopio óptico, obteniendo el total de hemocitos por mL de hemolinfa.
La viabilidad de los hemocitos se determinó de acuerdo a la metodología de tinción con
Azul de Tripano (Tennant, 1964). Para esto, a 10 μL de hemolinfa con antiagregante se
le agregaron 10 μL Azul de Tripano y, luego de 3 minutos, se realizó recuento de células
en una cámara de Neubauer considerándose como células viables las que no se tiñen, ya
que en las células viables el colorante no traspasa la membrana celular (Morales &
Moya, 2008).
Los resultados se expresaron como número de hemocitos viables por volumen de
hemolinfa (1 mL).
b2.
Tipos de hemocitos
Se prepararon frotis de hemocitos en monocapas de acuerdo a la metodología descrita
por (González & Arenas, 2007). Previamente se eliminó el suero y antiagregante de la
muestra de hemolinfa, centrifugando la muestra a 350 g y 4°C por 10 minutos. Una vez
desechado el sobrenadante, se sustituyó con medio de cultivo celular L15 modificado
34
(Medio Leibovitz, cloruro de sodio 2,5% y antibióticos penicilina y estreptomicina al
1%) Una muestra de hemocitos con medio de cultivo conteniendo aproximadamente
100.000 hemocitos viables fue colocada sobre un portaobjetos. La muestra se incubó a
20°C durante 30 minutos en una cámara húmeda, para que los hemocitos se adhirieran al
portaobjeto. Posteriormente se fijó y tiñó con la técnica de Hemacolor®, donde los
núcleos se tiñen de azul y citoplasma azul claro o violeta. Se realizaron 3 monocapas por
cada pool de hemolinfa.
De cada monocapa se tomaron fotografías digitales de 5 campos al azar y se contaron los
diferentes tipos de hemocitos.
b3.
Fagocitosis
La capacidad de fagocitosis se evaluó de acuerdo a la metodología descrita por
(González & Arenas, 2007). Las muestras de hemolinfa obtenidas inicialmente, sin
antiagregante, se centrifugaron a 10.621 g por 10 minutos a 4°C, descartado el
sedimento y conservando el sobrenadante. Luego, levaduras (Saccharomyces cerevisiae)
se opsonizaron con 1 mL del sobrenadante de la hemolinfa, durante 40 minutos a 20°C.
Una muestra de hemocitos con medio de cultivo conteniendo aproximadamente 100.000
hemocitos viables fue colocada sobre un portaobjetos. La muestra se incubó a 20°C
durante 30 minutos en una cámara húmeda, para que los hemocitos se adhirieran al
portaobjeto. Para cuantificar la actividad fagocítica, se agregó sobre cada monocapa una
suspensión de levaduras con suero de la hemolinfa de los abalones, en una relación 10:1
(levaduras/hemocitos) y se incubó en cámara húmeda por 1 hora a 20°C. Posteriormente,
cada portaobjetos se lavó con solución tampón PBS, se tiñó con Hemacolor®, se dejó
secar (aproximadamente 30 minutos) y cada monocapa se montó con resina sintética
Flo-Texx® y un cubreobjeto. Nuevamente se dejó secar (48 horas) previo a su análisis
en el microscopio de luz.
La fagocitosis se cuantificó mediante observación al microscopio de luz con el objetivo
de 40x. Por cada muestra se observaron 5 campos diferentes, y se contabilizó el número
35
de hemocitos que fagocitan y el de hemocitos totales. El resultado se expresó como
porcentaje de hemocitos que fagocitó levaduras.
b4.
Estallido respiratorio
Para determinar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se utilizó la
técnica de medición de la reducción de Nitro Azul de Tetrazolio (NBT: Nitro Blue
Tretazolium). Las ROS provocan la reducción del NBT, generando Formazán, y su
concentración se cuantifica por espectrofotometría.
En placas de cultivo celular de 96 pocillos se colocó un volumen de hemolinfa
conteniendo 200.000 hemocitos viables por pocillo, y se incubó a 18° C por 2 horas con
medio de cultivo L15 modificado y Zimosán a una concentración final de 50 µL en el
pocillo. Una vez finalizada la incubación se retiró el medio de cultivo y se agregaron
100 uL de NBT en concentración de 1 mg/mL, disuelto en L15, y se incubó por una hora
más a 18°C. En el control, el inductor se reemplazó por L15. Una vez finalizada la
incubación, se retiró el medio de cultivo y se agregó 100 µL de metanol 100%, para fijar
por 3 minutos. Posteriormente se lavó 2 veces con metanol 70% y se dejó secar. Se
agregó 120 µL de KOH 2M y 140 µL de DMSO (Dimetilsulfóxido). Se incubó por 20
minutos. La presencia del NBT reducido se midió a 630 nm en lector de microplacas
(Morales & Moya, 2008).
c.
Expresión de Hsp70
La cuantificación de la expresión de la Hsp70 se realizó por medio la prueba de ELISA
Indirecto (Crowther, 2009).
c1.
Extracción de proteínas
Se homogenizaron 30 μg de branquia en 300 μL de solución tampón de homogenización
(Tris-HCl,
pH
7,5,
SDS
(Dodecilsulfato
Sódico),
EDTA
(Ácido
Etilenodiaminotetraacético 99%), Pefabloc (4-(2-aminoetil)-benceno sulfonilo fluoruro
clorhidrato), Pepstatin y Leupeptin (coctail inhibidor de proteasas) y se homogenizó con
una varilla de vidrio. El homogenizado se incubó durante 5 minutos a 100°C, para ser
36
nuevamente homogenizado e incubar por segunda vez a 100°C. Posteriormente se
centrifugó a 21.000 g durante 15 minutos. Se retiró el sobrenadante, dividiéndolo en dos
alícuotas, cada una de las cuales se colocó en un tubo, eppendorf de 600 μL, uno para
cuantificación de la concentración de proteínas totales y otro para el análisis de ELISA.
Cuantificación de proteínas totales (Kit Micro BCA)
Primero se realizó una dilución de la proteína a una concentración 1/100. Posteriormente
se preparó la solución del kit de Micro-BCA en proporción 50:1 (BCA/Cu2+). En un
tubo eppendorf se colocaron 200 μL de la solución BCA/Cu2+ y se le agregaron 25 μL
de la proteína diluida. Se incubó a 60°C por 15 minutos. Cada muestra se realizó por
duplicado. La lectura se realizó en placa de poliestireno de 96 pocillos, a 562 nm, en
lector de microplacas.
La concentración de proteína total se cuantificó interpolando los datos de absorbancia en
una curva de calibración. Esta curva se construyó con diluciones de albúmina estándar
(BSA: Bovine Serum Albumin), con las siguiente concentraciones: 125, 100, 75, 50, 25,
10 y 5 µg/mL
c2.
Cuantificación de Hsp70
Debido a la concentración alta de proteínas extraídas de las branquias del abalón rojo, el
volumen de proteína que se debió cargar en la placa de ELISA fue muy pequeño. Para
evitar errores se realizaron dos diluciones seriadas de la proteína. La primera se fue a
una concentración final de 200 μg/mL y la segunda de 60 μg/mL. Ambas diluciones se
realizaron con tampón carbonato bicarbonato 0,05M, pH 9,6 (Sigma - C3041). Se
sembraron 50 μL de la proteína en placas de poliestireno de 96 pocillos preparadas para
ELISA. Posteriormente se lavó dos veces con PBS (tampón fosfato salino) y se bloqueó
con 200 μL de leche descremada al 5%, diluida en PBS (tampón de bloqueo) y se incubó
por 2 horas a 25°C. Una vez finalizada la incubación se lavó nuevamente con PBS (2
veces). Posteriormente se agregó el anticuerpo primario (100 μL a una concentración 40
ng/µL) diluido en tampón de bloqueo con Tween20 a 0,05 %. Se incubó a 4°C durante
un tiempo mínimo de 16 horas. Una vez finalizada la incubación del anticuerpo
37
primario, se lavó con 200 μL de PBS (4 veces). Posteriormente se agregó el anticuerpo
secundario (100 μL, concentración: 1/2500) diluido en tampón de bloqueo con Tween20
a 0,05%. Se incubó a 25°C por dos horas. Se lavó con 200 µL de PBS (4 veces) y se
agregó 100 μL de una solución confeccionada con un cápsula de O-fenilendiamina
(OPD) (Sigma - P9029) disuelto en 25 mL de tampón fosfato citrato 0,05M con
perborato de sodio al 0,03%, pH 5.0 a 25°C (Sigma - P4922). Se incubó 30 minutos a
25°C y se leyó en lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. La curva de
calibración se realizó con concentraciones de 0,5, 1, 2 y 3 µg/mL de Hsp70 (Heat Shock
Cognate Protein 70 bovine (Sigma - H8285)).
El anticuerpo primario es un péptido sintético, IgG de ratón anti-epítope de Hsp70 de
Argopecten purpuraturs producido por el Grupo de Marcadores Inmunológicos en
Organismos Acuáticos del Laboratorio de Genética e Inmunología Molecular del
Instituto de Biología de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso. El anticuerpo
secundario es un anticuerpo policlonal “Goat Anti-Mouse IgG (H+L), Peroxidase
Conjugated” (Thermo Scientific - 1430).
d.
Supervivencia.
La supervivencia se calculó para cada tratamiento en base a la mortalidad observada en
cada recambio de agua, restando el número final de individuos muertos a la cantidad
inicial de abalones colocados en el estanque.
e.
Crecimiento.
El crecimiento se evaluó en base a la longitud de la concha y el peso húmedo total. El
crecimiento en longitud y peso húmedo se calculó en base a la diferencia entre la
talla/peso inicial y la talla/peso medidos al retirar el animal del estanque. De esta forma
se analizó si existen diferencias en la tasa de crecimiento durante el desarrollo del
experimento.
38
f.
Histopatolgía
Se analizó la estructura histológica de la glándula digestiva, postesófago y pie del abalón
en base a la observación de cortes histológicos de estos órganos con el fin de cuantificar
la intensidad de la infección y el avance del síndrome.
Confección de cortes histológicos
Las muestras fijadas por 24 horas en solución de Davidson se transfirieron a etanol 70%
para su conservación hasta el momento de preparación de los bloques de parafina para
realizar los cortes histológicos. El proceso de preparación de los bloques se llevó a cabo
deshidratando los tejidos en una batería graduada de alcoholes desde 70% hasta 100%,
aclarados con xilol. El tejido se colocó en moldes metálicos con Paraplast Plus©
fundido, los que se colocaron inmediatamente en hielo para su enfriado rápido.
Los bloques de parafina se cortaron con un espesor de 5 µm, se montaron en un
portaobjeto y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Al final del proceso el corte se montó
con resina sintética Flo-Texx® y un cubreobjeto. De cada bloque se realizaron 3 cortes
histológicos a diferentes profundidades (inicio, medio, final).
Análisis digital de imágenes
De los cortes histológicos se tomaron micrográficas digitales de acuerdo a los siguientes
criterios:
•
Para el análisis de la estructura de la glándula digestiva de cada corte histológico se
tomaron 3 micrográficas al azar con el objetivo 5x.
•
Para el análisis de las inclusiones bacterianas, de cada corte histológico se tomaron
10 micrográficas al azar con el objetivo 40x.
•
Para el análisis del tejido del pie, de un corte histológico elegido al azar se tomaron
10 micrografías, con el objetivo 20x.
39
A partir de estas micrografías se estimó el área de tejido normal y glándula digestiva
metaplásica, área de tejido normal y degradado de la musculatura del pie, además del
área total ocupada por las inclusiones WS-RLPs.
Con el software AxioVisionLE (Versión 4.6.3.0), calibrado de acuerdo al microscopio y
el objetivo con que se tomó la fotografía, se midió el área total de 10 fotografías al azar
mediante el uso de una tabla digitalizadora. En base a estas 10 mediciones se calculó el
promedio del área de cada fotografía (Fig. 11). Con el mismo software se midió el área
ocupada por las inclusiones bacterianas (Fig. 11), el área de la glándula con tejido
normal y el área de la glándula digestiva metaplásica, además del área de tejido
muscular del pie normal y degradado.
Adicionalmente, los resultados se expresaron usando la escala ordinal de glándula
digestiva metaplásica usada por (Moore et al., 2000):
0 = 0 - 5 % de glándula digestiva metaplásica.
1 = 6 -10 % de glándula digestiva metaplásica.
2 = 11 - 25 % de glándula digestiva metaplásica.
3 = > 25 % de glándula digestiva metaplásica.
40
Figura 11. Ejemplo de cálculo del área de la fotografía digital y el área ocupada por
inclusiones bacterianas.
7.
Análisis estadístico.
La normalidad de los datos se verificó mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov
para bondad de ajuste a la distribución normal. La homocedasticidad se verificó
mediante la prueba de Bartlett (Zar, 2009).
La supervivencia se analizó con el test de Chi-cuadrado de independencia (Sokal &
Rohlf, 2009; Zar, 2009) La frecuencia de individuos distribuidos de acuerdo al índice de
degradación de la glándula digestiva se analizó con la prueba Exacta de Fisher (Zar,
2009).
41
Para el análisis de fagocitosis y recuento diferencial de hemocitos, al ser datos
expresados en porcentaje, previo al análisis para verificar normalidad, se transformaron
función angular arco seno (Sokal & Rohlf, 2009).
Los datos de longitud y peso inicial de los abalones se compararon con un Análisis de
Varianza de una vía (Sokal & Rohlf, 2009).
Los datos de crecimiento total, de las variables inmunológicas y la proteína Hsp70, se
analizaron con Análisis de Varianza Factorial de niveles mixto (Montgomery, 2001). El
análisis consideró como efectos fijos la infección con WS-RLP, la temperatura y los días
de experimentación. Temperatura e infección son factores de dos niveles, mientras que
el tiempo es un factor con 5 niveles (uno por cada muestreo realizado).
Para el análisis de los datos de área y número de inclusiones bacterianas, área de
musculatura normal y degradada del pie y área de glándula digestiva normal y
metaplásica, se realizaron regresiones lineales simples de cada parámetro vs. el tiempo
de muestreo. Posteriormente se compararon con Análisis de Covarianza (Sokal & Rohlf,
2009).
Todos los análisis se realizaron con el software Statistica® (Versión 8), con excepción
de la prueba exacta de Fisher que se realizó en la página web VassarStats (2013).
42
RESULTADOS
a.
Verificación de diagnóstico de infección con WS-RLP
De los 60 animales diagnosticados inicialmente como negativos para la presencia de
ADN de “Ca. Xenohaliotis californiensis” mediante análisis por PCR de muestras de
heces, el análisis histológico mostró que un 6,7% (4 abalones) eran positivos a la
presencia de WS-RLPs (93,3 % de consistencia en el diagnóstico). De estos 4 abalones, 2
fueron positivos y 2 negativos al realizar el análisis de PCR en los tejidos del
postesófago. Los restantes 56 animales fueron confirmados como negativos a la
infección con WS-RLP mediante el análisis por histología y PCR en los tejidos del
postesófago (Tabla 2).
De 60 animales diagnosticados positivos para la presencia de “Ca. Xenohaliotis
californiensis” mediante la técnica de PCR en heces, todos fueron confirmado como
positivos para la presencia de la bacteria mediante análisis histológico (100%
consistencia en el diagnóstico). El análisis por PCR de los tejidos del postesófago, sin
embargo arrojó 8 abalones negativos (13,3%) (Tabla 2). En uno de estos animales, sólo
se detectó inclusiones bacterianas libres en el lumen de la glándula digestiva con
metaplasia (Fig. 12).
Tabla 2. Resultados del diagnóstico en 120 ejemplares de H. rufescens por medio de las
técnicas PCR en heces y postesófago e histología.
PCR heces
Negativo
Positivo
Total
PCR tejido postesófago
Negativo
Positivo
58
2
8
52
66
54
43
Histología
Negativo Positivo
56
4
0
60
56
64
Figura 12. Micrografía de glándula digestiva de H. rufescens infectado con “Ca.
Xenohaliotis californiensis”. (a) GD: Tejido normal de glándula digestiva, Met:
Metaplasia. Recuadro azul, inclusiones de “Ca. Xenohaliotis californiensis” liberadas de
la célula y ubicadas en el lumen del tejido de la glándula digestiva metaplásica. (b)
detalle del recuadro de la Figura 10a, flecha señala inclusiones libres. (Tinción
Hematoxilina-Eosina).
44
b.
Análisis de los parámetros inmunológicos
b1.
Hemocitos viables
El porcentaje de hemocitos viables en la hemolinfa de H. rufescens (Fig. 13), varió entre
75,3% (con infección a 20°C en el día 0) y 98,2% (sin infección a 15°C en el día 150).
En los tratamientos sin infección a 20°C y con infección a 15 y 20°C, se observó un
incremento constante del porcentaje de hemocitos viables desde el inicio del
experimento hasta el día 30. En el día 30, los abalones no infectados, a 15°C,
presentaron una disminución de los valores respecto de la medición anterior. En el día
100, en todos los tratamientos se observa una baja en el porcentaje de hemocitos viables,
para aumentar nuevamente al final del experimento (día 150).
El porcentaje promedio de hemocitos viables de todos los tratamientos, al inicio del
experimento (81%), es menor a los restantes muestreos (P < 0,05), el porcentaje
promedio de hemocitos viables en el día 10 (71 %) es menor al del día 150 (97%) (P <
0,05, Tabla 3).
La infección ni la temperatura afectaron el porcentaje de hemocitos viables (P > 0,05) y
no se observó interacción entre la combinación de los diferentes factores (P > 0,05,
Tabla 3).
45
Figura 13. Porcentaje de hemocitos viables, promedio (± error estándar), en hemolinfa
de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a
15 y 20°C.
Tabla 3. Análisis de Varianza Factorial del porcentaje de hemocitos circulantes en
hemolinfa de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”,
cultivados a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Interacciones
Infec-Temp
Infec-Tiempo
Temp-Tiempo
Infec-Temp-Tiempo
SC
GL
CM
F
1,22
8,84
1225,26
1
1
4
1,22
8,84
306,31
0,07
0,49
17,13*
3,36
68,36
42,94
101,06
357,65
1
4
4
4
20
3,36
17,09
10,73
25,26
17,88
0,19
0,46
0,60
1,41
*P < 0,05 (FV: Fuente de variación, SC: Suma de cuadrados, GL: Grados de
libertad, CM: Cuadrados medios, F: estadístico de Fisher).
46
b2.
Número de hemocitos viables.
El número de hemocitos viables por mL de hemolinfa varió entre 5,1 x 106 células (sin
infección a 20°C, día 0) y 10,3 x 106 células (con infección a 20°C, día 30 (Fig. 14).
En los abalones sin infección, a 15°C, el número de hemocitos disminuye desde el inicio
del experimento hasta el día 10, sin variaciones importantes en el resto del experimento.
En el tratamiento sin infección a 20°C, desde el día 0 al día 10 hay un aumento en el
número de hemocitos en la hemolinfa, y luego los valores se mantienen en el tiempo.
En los animales infectados, a ambas temperaturas, se observa un aumento en los
primeros 30 días, y luego, el número promedio de células se mantiene sin variaciones
relevantes hasta el final del experimento.
A partir del muestreo del día 10, el número de hemocitos viables en la hemolinfa es
mayor en los animales infectados que en los no infectados (P < 0,05, Tabla 4) pero no se
detectó un efecto significativo de la temperatura (P > 0,05, Tabla 4) Se apreció, además,
interacción entre la infección y el tiempo sobre el número total de hemocitos viables en
la hemolinfa (P < 0,05, Tabla 4)
47
Figura 14. Número promedio (± error estándar) de hemocitos viables/mL de hemolinfa
en H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a
15 y 20°C.
Tabla 4. Análisis de la Varianza Factorial del número total de hemocitos viables/mL de
hemolinfa en H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”,
cultivados a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Interacciones
Infec-Temp
Infec-Tiempo
Temp- Tiempo
Infec-Temp-Tiempo
Error
SC
GL
CM
F
4 x 1013
9 x 109
6 x 1012
1
1
4
4 x 1013
9 x 109
1 x 1012
133,58*
0,03
4,41*
2 x 107
3 x 1011
1 x 1012
2 x 1012
7 x 1012
1
4
4
4
20
2 x 1011
1 x 1012
2 x 1011
5 x 1011
3 x 1011
0,68
2,92*
0,74
1,55
*P < 0,05
48
b2.
Tipos de hemocitos
En las monocapas de hemolinfa de H. rufescens se observaron dos tipos de hemocitos,
con y sin gránulos densamente teñidos en el citoplasma (Fig. 15), lo que se presentan en
frecuencias diferentes (P < 0,05; Tabla 5)
El tipo celular más abundante fueron los hialinocitos (Fig. 15a), células con citoplasma
claro y sin gránulos, algunas de las cuales presentan el núcleo bilobulado. El porcentaje
de hialinocitos, varió entre 92% en abalones sin infección a 15°C en el día 30 y 97% en
animales con infección a 15°C en el día cero (Fig. 16a).
El segundo tipo celular son los granulocitos, los que se diferencian del tipo anterior por
la presencia de gránulos densamente teñidos en su citoplasma (Fig. 15b). Los gránulos
observados son basófilos (tinción azul oscura) y no se observaron gránulos acidófilos
(tinción rosada). El porcentaje de granulocitos, varió entre 8% en individuos sin
infección a 15°C en el día 30 y 3% en animales con infección a 15°C en el día 0 (Fig.
16b).
La infección, la temperatura ni el tiempo afectaron la proporción de cada tipo de
hemocitos (P > 0,05, Tabla 5), y no se observaron interacciones con la infección,
temperatura o el tiempo (P > 0,05, Tabla 5).
49
Figura 15. Tipos de hemocitos identificados en monocapas de hemolinfa de H.
rufescens. (a) Hialinocitos, la flecha muestra células con núcleos bilobulados.
(b) Granulocitos. (Tinción: Hemacolor ®).
50
Figura 16. Porcentaje hemocitos hialinocitos y granulocitos en hemolinfa de H.
rufescens, con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y
20°C.
51
Tabla 5. Análisis de Varianza Factorial del porcentaje de tipo de hemocitos (hialinocitos
y granulocitos) en hemolinfa en H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Tipo de células
Interacciones
Infec – Temp
Infec – Tiempo
Temp – Tiempo
Infec - Tipo célula
Temp - Tipo célula
Tiempo - Tipo célula
Infecc – Temp – Tiempo
Infecc – Temp - Tipo célula
Infecc – Tiempo - Tipo célula
Temperatura -Tiempo - Tipo célula
Infecc – Temp – Tiempo – Tipo célula
Error
SC
GL
CM
F
0
0
0
123572
1
1
4
1
0
0
0
123572
0
0
0
9045*
0
0
0
36,3
1,2
136,47
0
13,87
29,81
143,16
63,04
1092,91
1
4
4
1
1
4
4
1
4
4
4
80
0
0
0
36,3
1,2
34,11
0
13,87
7,45
35,79
15,76
13,66
1
1
1
2,66
0,09
2,5
0
1,02
0,55
2,62
1,15
*P < 0,05
b3.
Fagocitosis
La Figura 17 muestra los hemocitos de H. rufescens con levaduras Saccharomyces
cerevisiae fagocitadas en su citoplasma. Las levaduras se distinguen de los núcleos por
su forma redondeada y tamaño más pequeño que el núcleo del hemocito.
El porcentaje de hemocitos que fagocitan, en los abalones sin infección, varió entre 50 y
60% en los animales mantenidos a 15°C, y entre 43 y 55% a 20°C. En los infectados con
WS-RLPs, a 15°C fagocitaron entre 36 y 43% de los linfocitos, y entre 34 y 36,3% a
20°C (Fig. 18).
La infección y el tiempo tuvieron efecto negativo sobre la capacidad de fagocitosis de
los hemocitos (P < 0,05; Tabla 6). Los individuos sin infección tienen mayor porcentaje
de hemocitos que fagocitan levaduras que los individuos infectados (P < 0,05). Por otra
52
parte, se observó una disminución del porcentaje de hemocitos que fagocitan en el día 10
(con excepción de los animales con infección a 20°C) (P < 0,05; Tabla 6). No se
observan interacciones entre los diferentes factores considerados (P > 0,05).
Figura 17. Hemocitos de H. rufescens con levaduras fagocitadas (Saccharomyces
cerevisiae) (flechas negras: levaduras, N: núcleo del hemocitos; el citoplasma de la
célula se tiñe de color violeta claro). (Tinción: Hemacolor ®).
53
Figura 18. Porcentaje de hemocitos que fagocitan la levadura Saccharomyces cerevisiae
en hemolinfa de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”,
cultivados a 15 y 20°C (promedio ± error estándar).
Tabla 6. Análisis de la Varianza Factorial de la fagocitosis en hemocitos de H. rufescens
con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Interacciones
Infec-Temp
Infec-Tiempo
Temp-Tiempo
Infec-Temp-Tiempo
Error
SC
GL
CM
1081,97
89,38
127,94
1
1
4
1081,97
89,38
32,98
192,91*
15,94
5,70*
5,22
24,78
14,70
23,71
224,35
1
4
4
4
40
5,22
6,18
3,68
5,92
5,61
0,93
1,1
0,66
1,06
*P < 0,05
54
F
b4.
Cuantificación del anión superóxido intracelular (Reducción del NBT).
La metodología de reducción del NBT para la cuantificación del anión superóxido
intracelular, muestra que en abalones sin infección, a 15 y 20°C, la relación entre la
absorbancia medida en los hemocitos estimulados vs. no estimulados varió entre 2,2 y
2,7 (Fig. 19). En los animales con infección esta relación es menor (P < 0,05, Tabla 7) y
se encuentra entre 1,4 y 1,8.
Sólo la infección afectó negativamente este parámetro, disminuyendo la producción de
anión superóxido intracelular en los hemocitos de los animales infectados (P < 0,05). No
se observan interacciones entre la infección, la temperatura y el tiempo sobre la
concentración de anión superóxido intracelular. (P > 0,05, Tabla 7).
55
Figura 19. Relación entre la concentración de anión superóxido intracelular en
hemocitos de H. rufescens estimulados y no estimulados con Zimosán (0,2 %), con y sin
infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y 20°C (promedio ±
error estándar).
Tabla 7. Análisis de Varianza Factorial de la concentración de anión superóxido
intracelular de hemocitos de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Interacciones
Infec-Temp
Infec-Tiempo
Temp-Tiempo
Infec-Temp-Tiempo
Error
SC
GL
CM
F
6,03
0,00
0,18
1
1
4
6,03
0,00
0,04
126,88*
0,00
0,91
0,03
0,35
0,31
0,18
0,99
1
4
4
4
20
0,03
0,09
0,05
0,05
0,05
0,66
1,77
1,59
0,95
*P < 0,05
56
c.
Cuantificación de proteína Hsp70.
Los valores de concentración de la proteína Hsp70 en las branquias de H. rufescens,
variaron entre 15,5 (sin infección a 20°C, día 10) y 25,8 ng Hsp70/µg proteína total (con
infección a 15°C, día 150) (Fig. 20).
No se observó variación en la concentración promedio de la proteína Hsp70 en entre los
días 0 y 30 en ninguno de los cuatro tratamientos (P > 0,05, Tabla 8). Esta tendencia se
mantiene en los animales sin infección hasta el final del experimento. En cambio en los
animales infectados, la concentración de la proteína es mayor en el día 150 con relación
a los animales no infectados (P < 0,05).
Se observó interacción significativa entre el tiempo y la infección sobre la concentración
de Hsp70 en las branquias de H. rufescens (P < 0,05).
Figura 20. Concentración promedio (± error estándar) de Hsp70 cuantificada en la
proteína total de la branquia de H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
57
Tabla 8. Análisis de la Varianza Factorial de la concentración de Hsp70 en branquias de
H. rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y
20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Tiempo
Interacciones
Infec-Temp
Infec-Tiempo
Temp-Tiempo
Infec-Temp-Tiempo
Error
SC
GL
59,61
5,53
811,18
1
1
4
2,09
149,60
4,68
43,65
1066,58
1
4
4
4
100
CM
F
59,61
5,53
202,79
5,59*
0,53
19,01*
2,01
37,40
1,17
10,91
10,67
0,20
3,51*
0,11
1,02
*P < 0,05
d.
Supervivencia
Solo se registró mortalidad en los primeros 60 días de experimentación, en los estanques
a 15°C con y sin infección, de la primera réplica del experimento. Los 5 animales
muertos no presentaban signos de WS. Debido al estado de descomposición que
presentaban no fue posible realizar análisis moleculares o histológicos.
La supervivencia observada no presentó diferencias estadísticas entre los cuatro
tratamientos (P > 0,05, Tabla 9).
Tabla 9. Porcentaje de supervivencia de H. rufescens con y sin infección con “Ca.
Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
Infección
Si
No
Temperatura
15 ºC
20 ºC
92
100
94
100
58
P
> 0,05
e.
Crecimiento
La longitud inicial de la concha de los abalones varió entre 45,2 mm en los animales sin
infección ubicados en el estanque a 20°C y 45,7 mm en los animales con infección
ubicados en el estanque a 20°C, sin diferencias entre los cuatro grupos experimentales
(P > 0,05, Tabla 10). El peso inicial de los abalones varió en un rango entre 14,6 g (sin
infección a 20°C) y 15,4 g en los animales con infección colocados en el estanque 20°C,
y tampoco presentó diferencias entre los cuatro grupos de abalones (P > 0,05, Tabla 11).
La Fig. 21a muestra la variación en la longitud promedio de la concha y la Fig. 21b en el
peso promedio de los abalones durante el experimento. Los animales sin infección, a
ambas temperaturas, presentaron un incremento significativo de la longitud, con una
ganancia de 9,7 mm a 15° C y 12,3 mm a 20° C (1,9 y 2,5 mm/mes, respectivamente; P
< 0,05, Tabla 12). Los abalones infectados no evidenciaron crecimiento significativo
durante el experimento (P > 0,05).
Los animales sin infección también presentaron un incremento significativo del peso,
con una ganancia de 9,7 g a 15°C y 10,2 g a 20°C (2,0 y 1,9 g/mes, respectivamente, (P
< 0,05, Tabla 13), sin ser significativas las diferencias entre ambas temperaturas (P >
0,05). El peso final para los animales con infección, por el contrario, no fue diferente al
peso inicial (P > 0,05) ni se observó diferencias entre 15 y 20°C (P > 0,05, Tabla 13).
Tanto para el crecimiento en longitud como en peso se observó interacción entre la
infección y el tiempo (P < 0,05, Tablas 12, 13).
59
Figura 21. Variación en longitud y peso total promedio (± error estándar) de H.
rufescens con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a 15 y
20°C (a) Longitud (mm); (b) Peso (g)
60
Tabla 10. Análisis de Varianza para la longitud inicial de la concha de H. rufescens con
y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivado a 15 y 20°C.
FV
Entre Grupos
Dentro de Grupos
SC
9,46
1915,1
GL
3
116
Total
1924,57
119
ns
CM
3,15
16,51
F
0,19 ns
P > 0,05
Tabla 11. Análisis de Varianza para el peso inicial de H. rufescens con y sin infección
con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivado a 15 y 20°C.
FV
Entre Grupos
Intra Grupos
Total
ns
SC
27,55
2112,12
2139,67
GL
3
116
119
CM
9,18
18,21
F
0,50 ns
P > 0,05
Tabla 12. Análisis de Varianza Factorial para el crecimiento total de la longitud de la
concha de H. rufescens, con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”,
cultivado a 15 y 20°C.
FV
Efectos principales
Infección
Temperatura
Días
Interacciones
Infecc-Temp
Infecc-Días
Temp-Días
Infecc-Temp-Días
Error
*P < 0,05
SC
GL
CM
F
192,79
19,15
1153,39
1
1
1
192,79
19,15
1153,39
11,38*
0,51
68,06*
18,16
198,53
17,83
3,12
2304,61
1
1
1
1
136
18,16
198,53
17,83
3,12
16,95
1,07
11,72*
1,05
0,18
61
Tabla 13. Análisis de varianza factorial para el crecimiento total del peso de H.
rufescens, con y sin infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivado a 15 y
20°C.
FV
Infección
Temperatura
Días
Interacciones
Infecc-Temp
Infecc-Días
Temp-Días
Infecc-Temp-Días
Error
*P < 0,05
f.
f1.
SC
218,61
2,77
798,33
GL
1
1
1
CM
218,61
2,77
798,33
F
11,9*
0,15
43,46*
12,13
257,75
3,57
0,31
2497,96
1
1
1
1
136
12,13
257,75
3,57
0,31
18,37
0,66
14,03*
0,19
0,01
Análisis Histológico
Inclusiones bacterianas
En las observaciones en microscopía de luz de los cortes histológicos se distinguieron
tres tipos de inclusiones bacterianas que se diferencian por su estructura y el color que
adquieren al ser teñidas con la técnica Hematoxilina-Eosina. La inclusión descrita
originalmente como “Ca. Xenohaliotis californiensis” (Friedman et al., 2000b) (WSRLP), presenta color violeta claro, con textura homogénea (Fig. 22a, flecha blanca).
También se observó la inclusión descrita por Friedman & Crosson (2012) como
rickettsial variante (WS-RLPv) (Fig. 22a, flecha negra). Ésta se caracteriza por presentar
una superficie granulosa y teñirse de color violeta intenso. Solo se encontraron doce
inclusiones de una tercera variedad nombrada “stippled RLP” (RLP punteada)
(Friedman, datos no publicados) o “variedad celeste” (Fig. 22b), inclusión que al ser
teñida con Hematoxilina-Eosina adquiere color celeste claro y presenta una superficie
granulosa o punteada. Estas inclusiones celestes se encontraron en 4 animales y
corresponden al 1% del área total y 2 % del número total de inclusiones registradas. Para
los análisis solo se consideraron las dos rickettsiales identificadas en forma positiva
como agente etiológico del WS (WS-RLP y WS-RLPv) (Friedman & Crosson, 2012), y
no se incluyó la forma celeste.
62
Figura 22. Tipos de inclusiones observadas en cortes histológicos de H. rufescens
infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis”. a: Flecha blanca “Ca. Xenohaliotis
californiensis” (WS-RLP), Flecha negra “Ca. Xenohaliotis californiensis” variante,
infectada con fago (WS-RLPv). b: Rickettsial “celeste”. (Tinción: Hematoxilina-Eosina).
El área de la glándula digestiva que ocupan las inclusiones WS-RLP (a 15 y 20°C) y
WS-RLPv a 15°C, se mantuvo constante durante todo el experimento (Fig. 23a) (P >
0,05 Tabla 14). En cambio, el tipo de inclusión WS-RLPv a 20°C aumenta el área
ocupada en forma continua a partir del día 30 hasta el fin del experimento (Fig. 23a) (P
< 0,05, Tabla 14).
63
El número promedio de inclusiones de WS-RLP y WS-RLPv por corte en animales
mantenidos a 15°C fue similar durante todo el experimento (Fig. 23b) (P > 0,05, Tabla
15). Las inclusiones WS-RLP a 20°C se comportan de la misma forma que la WS-RLPv a
15°C hasta el día 100 (Fig. 23b) (P > 0,05, Tabla 15). Para WS-RLPv a 20°C, se observa
un comportamiento similar al observado en al análisis del área, un sin una variación
relevante entre los días 0 y 30, y con posterioridad de esta muestreo, un aumento en
forma sostenida hasta fin del experimento (Fig. 23b) (P < 0,05, Tabla 15).
El número de inclusiones y el área promedio ocupada por ellas se correlacionaron
positiva y significativamente (P < 0,05) en las dos temperaturas y para ambos tipos de
inclusiones. El coeficiente de correlación varió entre 0,63 para WS-RLPv a 15°C y 0,92
para WS-RLPv a 20°C (Tabla 16).
64
Figura 23. (a) Área promedio (± error estándar) de inclusiones bacterianas (WS-RLP y
WS-RLPv) en cortes histológicos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis
californiensis” cultivados a 15 y 20°C y (b) Número promedio de inclusiones (± error
estándar) (WS-RLP y WS-RLPv) en cortes histológicos de H. rufescens infectados con
“Ca. Xenohaliotis californiensis” cultivados a 15 y 20°C
65
Tabla 14. Análisis de covarianza del área promedio de las inclusiones bacterianas
observadas en la glándula digestiva y postesófago de H. rufescens (WS-RLP y WS-RLPv)
a 15 y 20°C vs. días.
FV
Pendientes
Interceptas
Error
SC
44946,09
21834,34
25462,22
GL
3
1
15
CM
14982,03
21834,34
1697,48
F
8,83*
12,86*
*P < 0,05
Tabla 15. Análisis de covarianza del número promedio de inclusiones bacterianas
observadas en la glándula digestiva y postesófago de H. rufescens (WS-RLP y WS-RLPv)
a 15 y 20°C vs. días.
FV
Pendientes
Interceptas
Error
SC
0,34
0,19
0,30
GL
3
1
15
CM
0,11
0,19
0,02
F
5,57*
9,63*
*P < 0,05
Tabla. 16. Correlación entre el número promedio y el área promedio para las inclusiones
WS-RLP y WS-RLPv en cada individuo de H. rufescens infectado con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, cultivados a 15 y 20°C.
Tipo de inclusión
Temperatura (°C)
Coeficiente de Correlación
WS-RLP
WS-RLPv
15
20
15
20
0,79* 0,81* 0,63* 0,92*
* P < 0,05
f.2
Estructura de órganos digestivos
En animales no infectados con ”Ca. Xenohaliotis californiensis”, la glándula digestiva
presentó su estructura normal (Fig. 24a). Se observan túbulos o acinos secretores, con
células alfa y beta, además del tejido conectivo característico de este órgano (Sandoval,
2008).
En cambio, en todos los animales infectados se observó la presencia de metaplasia (Fig.
24b), es decir, la sustitución de tejido normal de la glándula digestiva por tejido de
transporte, muy similares en apariencia al tejido del postesófago, y la presencia de
inclusiones bacterianas en el tejido de glándula digestiva metaplásica (Fig. 24b).
66
Figura 24. Micrografía de corte histológico de glándula digestiva de H. rufescens. Glándula
digestiva de abalón sin infección de “Ca. Xenohaliotis californiensis” tejido” tejido normal, sin
metaplasia. (TC: Tejido conectivo, A: Células Alfa, B: Células Beta, L: Lumen del
túbulo/acino). (b) Glándula digestiva metaplásica en abalone infectado con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”. GD: tejido normal de glándula digestiva Met: Tejido metaplásico. Círculos rojos
marcan la presencia de inclusiones bacterianas (Tinción Hematoxilina-Eosina).
67
En la Figura 25 se muestra el área promedio de tejido normal y con metaplasia en la
glándula digestiva de los animales con infección con WS-RLPs durante el período
experimental. El área de glándula digestiva metaplásica varió entre el 9 y 23%
(promedio: 17% ± 4,3) del total del área de glándula digestiva.
El área relativa de la glándula digestiva ocupada por tejido metaplásico en animales
infectados no se incrementó durante el periodo experimental a ninguna de las dos
temperaturas (P > 0,05, Tabla 17) ni se observó asociación entre el área de glándula
digestiva ocupada por inclusiones y el área de glándula digestiva metaplásica (P > 0,05,
Tabla 17).
Al aplicar el índice de degradación de la glándula digestiva de Moore et al. (2001), la
mayoría de los animales (63% a 15°C y 72% 20°C) se encontraba en grado 2 de
intensidad de infección (11 a 25% del área ocupada por metaplasia) (Tabla 18). No se
observó diferencias en la frecuencia de abalones con diferente grado de degradación de
la glándula digestiva entre ambas temperaturas (P > 0,05).
68
Figura 25. Área promedio (± error estándar) (µm2) de glándula digestiva normal y
metaplásica en individuos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, cultivados a 15 y 20°C,
Tabla 17. Análisis de covarianza para el área de tejido normal y de glándula digestiva
metaplásica vs. días en H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis”,
cultivado a 15 y 20°C.
FV
Pendientes
Interceptos
Error
SC
530603
1404379
5794
GL
3
1
15
*P < 0,05
69
CM
176867
1404379
386
F
457,9*
3635,95*
Tabla 18. Frecuencia de individuos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis
californiensis”, clasificados de acuerdo al índice de degradación de la glándula digestiva
(Según Moore et al., 2001).
Grado
Área de glándula
digestiva metaplásica (%)
0
1
2
3
f3.
Porcentaje de
individuos
15°C
9,4
15,6
62,5
12,5
0– 4
5 – 10
11 – 24
> 25
20°C
0
21,9
71,9
6,3
Musculatura del pie
En los cortes histológicos de los animales sin infección, en el pie solo se observó tejido
muscular normal. En los animales infectados, en cambio, se detectó tanto musculatura
normal como degradada. En la musculatura normal se apreciaron fibras musculares
empaquetadas en forma compacta, distribuidas en sentido longitudinal y transversal
(Fig. 26a). El tejido muscular degradado presenta disminución de la longitud y cantidad
de las fibras musculares, además de desorganización de los paquetes musculares (Fig.
26b).
En los animales infectados con WS-RLPs, el área promedio del tejido muscular
degradado a 15°C varía entre 56 y 59 x 103 µm2, es decir, entre 23 y 25%,
respectivamente, del total de la musculatura del pie. En el tratamiento a 20°C, el área
promedio al inicio del experimento fue 86 x 103 µm2 (35% del total de la musculatura),
mientras que al día 150 aumentó en aproximadamente en un 63%, alcanzando los 140 x
103 µm2 (57% del total) (Fig. 27). En los abalones cultivados a 15°C, el área de tejido
muscular degradado se mantuvo en valores promedio similares durante todo el
experimento. En los animales mantenidos a 20°C, en cambio, se apreció un aumento
constante del tejido muscular degradado durante todo el experimento. En el día 150, en
el tratamiento a 20°C, el área de tejido degradado es mayor que al inicio y también es
mayor que en todos los animales analizados en el tratamiento a 15°C (P < 0,05, Tabla
19).
70
Figura 26. Micrografía de la musculatura del pie de H. rufescens. (a) tejido muscular
normal, (b) tejido muscular degradado (Tinción: Hematoxilina-Eosina).
71
Figura 27. Área promedio (± error estándar) de tejido muscular degradado en el pie en
individuos de H. rufescens infectados con “Ca. Xenohaliotis californiensis”, cultivados a
15 y 20°C.
Tabla 19. Análisis de covarianza para regresiones del área promedio de tejido muscular
degradado en el pie.
FV
Interceptos
Pendientes
Error
* P < 0,05
SC
3104
861
5063
GL
1
1
3
72
CM
998
3204
861
F
31,12*
8,35*
DISCUSIÓN
La temperatura no evidenció efecto sobre ninguna de las variables inmunológicas
analizadas y tampoco esta asociada a ninguna interacción significativa, pero si se
observó efecto significativo sobre la tasa de crecimiento en animales no infectados. Por
el contrario, la infección con “Ca. Xenohaliotis californiensis” afectó distintos
parámetros inmunológicos, como el número total de hemocitos viables, la capacidad de
fagocitosis y la concentración de anión superoxido intracelular, la expresión de Hsp70 y
el crecimiento de H. rufescens. Los únicos parámetros que no afectados por la infección
fueron el porcentaje de hemocitos viables, la proporción de los diferentes tipos de
hemocitos y la supervivencia.
Existen evidencias que indican que la manipulación de los abalones causa estrés en los
animales, lo que se evidencia en un aumento de la expresión de Hsp70 (Díaz, 2013),
2013). Así mismo la manipulación de los animales en los cultivos se ha asociado con
manifestaciones de inmunodepresión (Malham et al, 2003; Hooper et al., 2007).
También se ha observado que posteriormente al transporte entre granjas, se incrementa
la mortalidad de los animales (Hooper et al., 2011). En este trabajo se observó una
disminución de la expresión de Hsp70, la que aunque no es estadísticamente
significativa, fue consistente entre tratamientos, lo que sugiere que la manipulación para
montar los experimentos podría haber sido un factor estresante. Esto podría explicar la
tendencia a una disminución en algunos parámetros inmunológicos (porcentaje de
hemocitos viables, capacidad de fagocitosis, estallido respiratorio), entre los días 0 y 10.
Algunas disminuciones no mostraron ser estadísticamente significativas, pero aparecen
consistentes entre tratamientos. Para verificar la asociación entre el estrés debido a la
manipulación y la depresión del sistema inmune, sería necesario analizar
comportamiento de estas variables en un periodo de tiempo más cercano (horas) después
del proceso de manipulación.
No se detectó un efecto significativo de la infección y la temperatura sobre el porcentaje
de hemocitos viables y la proporciones de los dos tipos de hemocitos observados en H.
73
rufescens. Las proporciones de los tipos de hemocitos informados en este trabajo son
similares a los registrados en individuos sanos de H. tuberculata (Travers et al., 2008).
Esto indicaría que este carácter no es afectado significativamente por la infección y la
variación de la temperatura, lo que sugiere que no sería un buen indicador del estado
inmunológico de los abalones.
Efectos de la temperatura sobre la respuesta inmune, la expresión de Hsp70, el
crecimiento y supervivencia de H. rufescens
La temperatura ha sido identificada como uno de los factores que más afecta al sistema
inmune de moluscos, especialmente en bivalvos (Cheng et al., 2007b; Donaghy et al.,
2009; Fisher et al., 1987, 1989; Monari et al., 2007). El incremento de la temperatura
aumenta el porcentaje de hemocitos muertos en Crassostrea gigas (Gagnaire et al.,
2006). Por su parte, en la almeja Mactra veneriformis, un aumento en la temperatura,
está asociado a un mayor número de hemocitos y disminución en la capacidad de
fagocitosis, la actividad de lisozimas y la estabilidad de las membranas lisosomales (Yu
et al., 2009). Un efecto similar sobre las membranas lisosomales ha sido observado en
Haliotis rubra frente a un alza de la temperatura del agua (Wang et al., 2006). En el
abalón tropical Haliotis diversicolor supertexta, el alza en la temperatura del agua de 28
a 32°C reduce la actividad de la enzima fenoloxidasa y la capacidad de fagocitosis y
aumenta significativamente el estallido respiratorio y la susceptibilidad a la bacteria
Vibrio parahaemoliticus (Cheng et al., 2004). Del mismo modo, Lee et al. (2001)
observan en esta especie, una mayor susceptibilidad a Vibrio alginolyticus y V.
parahaemoliticus a 30°C que a temperaturas inferiores. En H. rubra, el alza de la
temperatura de 18 a 21 o 24°C , combinado con un desafío con bacterias del género
Vibrio y herpesvirus, está relacionado con el aumento el número de hemocitos y la
concentración de la enzima superóxido dismutasa, durante el primer día (Dang et al.,
2012). Así una serie de trabajos han demostrado que la temperatura afecta algunos
parámetros del sistema inmune, tanto como efecto por si sola como asociada a desafíos
con patógenos.
74
En general los resultados asociados al efecto de la temperatura han sido evaluados como
respuesta de corto plazo (horas a pocos días) del sistema inmune. El presente trabajo no
evidenció efecto de la temperatura sobre la respuesta inmune en mediano y largo plazo.
Estos resultados pueden deberse a un proceso de aclimatación de los abalones a las
condiciones experimentales. Por ejemplo en H. rubra, los parámetros inmunológicos
estudiados retornaron a valores similares al control a los 3 días en el desafío con virus y
a los 7 días en el desafío con bacterias (Dang et al., 2012). En el presente estudio la
primera evaluación se realizó en décimo día posterior al inicio del experimento, donde
los efectos eventuales de la temperatura ya podrían haber desaparecido. Por otra parte,
en H. rufescens sometido a un incremento gradual de temperatura, las primeras
manifestaciones de respuestas conductuales de estrés se observaron a partir de los
23,1°C (Díaz et al. 2000). Esto podría indicar que los 20°C de temperatura usados en
esta experiencia, pudieran no haber inducido una respuesta de estrés térmico. Esto sería
consistente con la ausencia de diferencias en la expresión de Hsp70 entre 15 y 20°C,
observadas en este trabajo. Para verificar si las temperaturas usadas pueden tener efecto
de estrés térmico a nivel celular, sería necesario evaluar el efecto de ellas a corto plazo
(horas) sobre la expresión de Hsp70 u otro indicador de estrés.
En diversas especies de abalones se ha observado que al incrementarse la temperatura,
siempre que estas no sean superiores a los niveles críticos para la especie, los animales
aumentan su tasa de crecimiento en longitud de la concha y en peso (Searle et al., 2006;
FAO, 1990; Ponce-Díaz et al., 2004; Britz et al., 1999). En este trabajo los abalones sin
infección con WS-RLPs mantenidos a 20°C muestran una mejor tasa de crecimiento en
longitud de la concha que los animales a 15°C, sin embargo esta diferencia no se
observó en los animales infectados con WS-RLPs. El peso de los animales, en cambio,
no mostró diferencias entre las temperaturas. Estas diferencias entre los resultados
obtenidos en longitud y peso, podrían deberse a patrones diferentes de distribución de
energía disponible para el crecimiento asociados a diferentes temperaturas.
Diversos resultados muestran que la temperatura puede afectar la supervivencia en
abalones (Britz et al., 1997; Díaz et al., 2000; Searle et al., 2006; Steinarsson &
75
Imsland, 2003). Al superarse la temperatura por sobre el rango de tolerancia de la
especie, la supervivencia disminuye. El rango de distribución térmica que se ha descrito
ara H. rufescens en el ambiente natural es entre 7 y 16°C (Hahn, 1989). Estudios de
conducta han permitido establecer que para esta especie la temperatura de preferencia es
18,8°C y que la temperatura critica máxima es 27,5°C (Díaz et al., 2000). Los resultados
de esta tesis sugieren que individuos sin infección con WS-RLPs podrían ser cultivados a
temperaturas entorno a 20°C, sin que esto afecte la supervivencia y obteniendo mejores
tasa de crecimiento.
La intensidad de la infección, en área y número de la inclusiones bacterianas (WS-RLPs),
y la degradación del tejido muscular del pie fueron mayores a 20°C qua a 15°C. Esto es
consistente con lo informado en la literatura (Ben-Horin et al., 2013; Bower, 2003;
Moore et al., 2000) donde se informa una asociación positiva entre el progreso de la
enfermedad y la temperatura del agua. En este trabajo se distinguió dos tipos de
inclusiones bacterianas, el tipo normal (WS-RLP) y el tipo variante (WS-RLPv)
(Friedman & Crosson, 2012). La inclusión variante se diferencia de WS-RLP debido a
que las bacterias están infectadas por un fago (Friedman & Crosson, 2012). A 15°C, no
se observó aumento en el área ni el número de ambos tipos de inclusiones. En cambio a
20°C, el área que ocupa la inclusión normal en la glándula digestiva no se incrementó
durante el experimento, pero el número de inclusiones si aumenta. Por su parte, la
inclusión variante presentó un claro aumento, tanto en área como en el número de
inclusiones, a partir del día 30. Esto sugiere que inclusiones bacterianas normales son
infectadas por el fago a medida que se van formando, transformándose en la forma
variante.
En animales infectados a ambas temperaturas (15 y 20°C) se observó degradación del
tejido muscular del pie. A la temperatura inferior, no se observó variación en la
proporción de tejido muscular degradado, pero si un incremento a 20°C. El WS sería
causado por la aparición de la glándula digestiva metaplásica, es decir que el tejido
normal de la glándula digestiva es sustituido por tejido epitelial de estructura similar a
los tejidos de transporte del postesófago (Friedman, 2012). Según Friedman et al.
76
(2002), este fenómeno interfiere con el proceso de digestión del alimento y absorción de
nutrientes, provocando que el abalón deba recurrir a sus reservas de energía acumuladas
en el pie. Braid et al. (2005) mostraron que animales infectados con WS-RLP y
mantenidos a 12 y 18,7°C no presentan diferencias en el contenido de glicógeno del pie
durante los primeros 200 días del experimento, pero a medida que la enfermedad
progresa, estas reservas de energía comienzan a disminuir. Al agotarse estas reservas, los
abalones recurrirían a la degradación del tejido muscular del pie para la obtención de
energía a partir de proteínas, dando origen al signo clínico que da nombre a la
enfermedad, marchitamiento del pie del abalón (Friedman, 2012). Los resultados del
presente trabajo sugieren que en H. rufescens la degradación de la musculatura del pie,
se iniciaría antes de que la glándula digestiva se encuentre gravemente afectada por la
aparición de metaplasia. Estos resultados son consistentes con los reportados
previamente que indican que temperaturas superiores a 18°C aceleran la degradación de
la musculatura en animales infectados con WS-RLP (Friedman, 2012).
Efecto de la infección con WS-RLP sobre la respuesta inmune, la expresión de Hsp70,
el crecimiento y la supervivencia.
La infección con WS-RLPs esta asociada a un mayor número de hemocitos viables,
además de una menor capacidad de fagocitosis y estallido respiratorio en los hemocitos
de H. rufescens. Los valores menores de estos dos últimos parámetros en los animales
infectados indicarían una depresión del sistema inmune. Por otra parte, este efecto
negativo en la capacidad de respuesta inmune podría estar siendo compensado por el
incremento de hemocitos viables. Estos resultados indicarían que la infección con WSRLP, un parásito intracelular, es capaz de afectar al sistema inmune de H. rufescens. Por
otra parte, la expresión de Hsp70 fue mayor en los animales infectados. La expresión de
esta proteína se encuentra asociada al estrés (Farcy et al., 2007; Franzellitti & Fabbri,
2005; Roco, 2010; Snyder et al., 2001) y existen evidencias de que el estrés podría
afectar negativamente la capacidad de respuesta inmune (Hooper et al., 2007; Lacoste et
al., 2002; Malagoli et al., 2007; Malham et al., 2003). Así, los niveles de expresión de
Hsp70 sugieren que los animales infectados estarían sometidos a mayor estrés que los no
77
infectados, lo que podría relacionarse con la disminución observada en algunos
parámetros de la respuesta inmune. Sin embargo, en el presente estado del conocimiento
no es posible excluir el efecto directo de la bacteria sobre el sistema inmune.
En los moluscos, además de participar en la respuesta inmune, los hemocitos tienen
funciones en el proceso de transporte de oxígeno, nutrientes, desechos metabólicos y la
reparación y eliminación de tejidos dañados (Hooper et al., 2007; Tiscar & Mosca
2004; Zhang et al., 2006). Se ha asociado el aumento del número total de hemocitos en
la hemolinfa de los moluscos a la movilización de estas células como respuesta a la
infección con un patógeno (Oubella et al., 1993, 1996) . En distintas especies de
bivalvos se ha observado un aumento significativo del número total de hemocitos luego
de un desafío con bacterias, virus o protozoos. Así en las almejas Ruditappes
philippinarum y Mercenaria mercenaria la infección con la bacteria Vibrio tapetis causa
aumento del número total de hemocitos circulantes en la hemolinfa (Allam et al., 2006).
Una situación similar se ha observado con la infección el virus AbHV (virus de la
ganglioneuritis viral del abalón) en híbridos de H. rubra y H. laevigata (Dang et al.,
2013). La literatura no informa resultados del efecto de la infección de bacterias
intracelulares obligadas sobre el número de hemocitos en la hemolinfa de moluscos. Sin
embargo, existen resultados del efecto de protozoos. Las evidencias muestran que la
infección de Mytilus galloprovincialis con Marteilia refringens (Carballal et al., 1998)
de Ostrea edulis con Bonamia ostreae; (Comesaña et al., 2012; da Silva et al., 2008), y
de Crassostrea gigas y C. virginica con Perkinsus marinus (Le Peyre et al., 1995)
provocan el aumento del número de hemocitos circulantes en la hemolinfa de sus
huéspedes.
La fagocitosis es un proceso básico de defensa del sistema inmune innato. Junto a los
procesos posteriores (maduración del fagosoma, unión con lisosoma) demanda un alto
consumo de energía proveniente del ATP (Coyne, 2011), requerido para la formación de
los seudópodos para la incorporación del cuerpo extraño a la célula, demanda la
reorganización del citoesqueleto y por lo tanto polimerización de la actina (May &
Machesky, 2001). González et al. (2012) informan que H. rufescens infectado con WS-
78
RLPs, tiene hasta un 49% menos de energía disponible para crecimiento, reproducción y
defensa. Así, esto sugiere que esta menor disponibilidad de energía podría dar cuenta de
la menor capacidad de fagocitosis observada en los individuos infectados con WS-RLPs.
Por otra parte, el “marcado” del patógeno con una proteína plasmática producida por los
hemocitos (aglutininas y opsoninas) que se une a la membrana o pared celular del
patógeno (opsonización), facilita y potencia la fagocitosis (Hooper et al., 2007;
Yakovleva et al., 2001, Vargas-Albores & Barraco, 2001). Este podría ser otro
mecanismo que influye sobre la capacidad de fagocitosis. En A. purpuratus ha se
observado que los hemocitos fagocitan menos las levaduras opsonizadas con el suero de
la hemolinfa de animales que presentan el cuadro patológico de retracción del manto. En
cambio, cuando las levaduras se opsonizaron con suero de animales sin la patología, la
fagocitosis fue significativamente mayor (González & Arenas,
2007). Así,
alternativamente la capacidad opsonizadora de la hemolinfa del abalón rojo infectado
con WS-RLPs, podría estar afectada por la presencia de la bacteria.
El estallido respiratorio es un proceso asociado a la fagocitosis, mediante el cual los
hemocitos destruyen, dentro de los fagosomas, el material fagocitado (Hooper et al.,
2007; Roch, 1999) ocurre en base a la generación de especies reactivas de oxígeno
(ROS) las que destruyen las membranas celulares y oxidan los ácidos nucleicos (Díaz,
2006). Los patógenos intracelulares obligados, como las RLP, tienen la capacidad de
inhibir el estallido respiratorio, lo que se considera sería un mecanismo de evasión
inmunitaria que les permite sobrevivir en el momento en que las células se encuentran
libres dentro del hospedador durante el proceso de infección, antes del ingreso y salida
desde las células blanco de la infección (Le Gall et al., 1991). Uno de estos mecanismos
de evasión inmunitaria es la inhibición del estallido respiratorio por medio de enzimas
del grupo de las fosfatasas ácidas (Reilly et al., 1996; (Lin & Rikihisa, 2007). Este tipo
de enzimas inhibe la actividad de la NADPH-oxidasa, ya sea desfosforilando el NADPH
(Reilly et al., 2006) o inactivando el complejo NADPH-oxidasa (Siemsen et al., 2009),
cuya función es catalizar la transferencia de un electrón desde el NADPH hacia el
oxígeno, produciendo así anión superóxido (García-Triana et al., 2001). La presencia de
79
una fosfatasa ácida inhibidora de la NADPH-oxidasa se ha postulado que esta presente
en Perkinsus sp., Bonamia sp., algunas bacterias rickettsiales y organismos del tiporickettsial (Hervio et al., 1991; Le Gall et al., 1991).
La disminución del estallido respiratorio, ha sido observado en los hemocitos de algunos
moluscos infectados con protozoos (Anderson et al., 1999; Comesaña et al., 2012), pero
en otros casos se ha observado el efecto contrario, como en Ostrea edulis infectada con
Bonamia ostreae viva, donde los hemocitos producen más especies reactivas del
oxígeno que el control no infectado (Morga et. al., 2011). Friedman et al. (2000a)
encontraron que los hemocitos de H. cracherodii con signos de WS, presentan menor
capacidad del estallido respiratorio al compararlos con animales sin signos de la
enfermedad. En nuestro trabajo, los resultados obtenidos muestran que la reducción en el
estallido respiratorio se presenta en animales infectados con WS-RLPs sin signos clínicos
de WS. Estos resultados sugieren que WS-RLPs podría presentar un mecanismo de
evasión inmunitaria, que interferiría con la producción de anión superóxido provocando
la disminución del estallido respiratorio.
La expresión de la proteína de estrés Hsp70 se ha asociado a la presencia de patógenos
en diversos moluscos. Así se ha observado incremento de la expresión del gen o la
concentración de la proteína ante desafíos con bacterias o inmunoestimulantes. Ejemplos
de este fenómeno se han registrado en la ostra perlífera Pinctada fucata, desafiada con la
bacteria Vibrio alginolyticus, en el abalón H. discus hannai y el bivalvo Argopecten
irradians, infectados con Vibrio anguillarum (Cheng et al., 2007b) y en los hemocitos
del mejillón zebra (Dreissena polymorpha) estimulados con LPS (lipopolisácaridos) (Xu
& Faisal, 2009). Los resultados de este trabajo, muestran que la presencia de la bacteria
WS-RLPs, patógeno intracelular, puede inducir un cambio en los niveles de expresión de
la Hsp70. La concentración de esta proteína se incrementó en el tiempo en los animales
infectados con WS-RLPs, lo que no se observó en los individuos no infectados. Esto
sugiere una reacción creciente del estrés del animal, asociada al aumento en la
intensidad de la infección y el avance del síndrome. Los resultados informados en la
literatura se refieren a una respuesta aguda (horas o pocos días). Nuestros resultados
80
muestran una respuesta de largo plazo en H. rufescens, que hasta ahora no había sido
descrita, asociada al efecto de una enfermedad crónica.
Los animales sin infección crecieron 12% más en longitud y 39% más en peso que los
animales infectados con WS-RLPs. En moluscos se ha observado que la infección con
patógenos y parásitos reduce el crecimiento. Villalba et al. (2004) muestran menores
tasas de crecimiento en la almeja Tapes decussatus y la ostra Crassostrea virginica,
infectadas con Perkinsus sp. En H. rufescens infectados con WS-RLP y cultivados a
18,5°C, Moore et al. (2000) informaron menor ganancia de peso e índice de condición
que en animales con baja intensidad de infección. En cambio Braid et al. (2005), no
encontraron diferencias en el crecimiento en longitud y peso en H. rufescens con y sin
infección con WS-RLP después de 447 días de cultivo a 12 y 18,7°C. En dicho trabajo
los animales sin infección se obtuvieron por medio de tratamiento con el antibiótico
oxitetraciclina, lo que podría haber protegido en alguna forma a los abalones de los
efectos de la infección con WS-RLPs. En nuestro experimento los animales infectados y
no infectados con WS-RLPs provienen de la misma población, lo que sugiere que los
animales no infectados eran resistentes a la infección con WS-RLP. Por estas diferencias
en las metodologías de ambos trabajos, los resultados no son necesariamente
comparables. Por otra parte, el daño causado por el patógeno en la glándula digestiva,
disminuye la capacidad asimilación (González et al., 2012) y disminuiría la capacidad
de digestión. Así, mismo en animales infectados se observa una disminución en las tasas
de ingestión de alimento y la disponibilidad de energía para crecimiento (González et
al., 2012). En este sentido, las observaciones de nuestro trabajo son consistentes con la
información disponible sobre la fisiología energética del abalón rojo infectado con WSRLPs.
La supervivencia de H. rufescens no fue afectada por la infección con WS-RLPs. Los
individuos muertos no presentaban signos macroscópicos de WS, por lo tanto se presume
que su muerte no fue causada por la enfermedad. En los animales sobrevivientes,
tampoco se observó signología del WS: anorexia, retracción del manto, encogimiento de
la musculatura del pie, cambios en la coloración y menor capacidad de adhesión a los
81
refugios. Friedman & Crosson (2012) describen la presencia de un fago que infecta a
WS-RLP y que provoca cambios en la textura y coloración de las inclusiones
bacterianas. Esta infección del fago podría causar la atenuación de la virulencia de WSRLP y explicar la disminución de la incidencia del WS observada en los últimos años en
las granjas abaloneras de California (Friedman & Crosson, 2012). Las inclusiones
infectadas por el fago también se observaron en esta tesis y se presentan en número
mayor (67%) y ocupan mayor área de la glándula digestiva (75 %) que las inclusiones
normales. Estos resultados podrían explicar la baja mortalidad registrada, la falta de
signos visibles de la enfermedad y el bajo porcentaje de la glándula digestiva
metaplásica durante todo el experimento realizado en este trabajo. De esta forma, es
posible postular que al igual que lo descrito por Friedman & Crosson (2012), la
infección con el fago, disminuiría la virulencia de ”Ca. Xenohaliotis californiensis” y
atenuaría los efectos de la enfermedad, explicando de esta forma la tasa alta de
supervivencia aún en los animales mantenidos a 20°C.
Efecto de las interacciones entre la temperatura y la infección sobre la respuesta
inmune, expresión de Hsp70, crecimiento y supervivencia
Se ha observado que la interacción entre la temperatura y la infección, están relacionadas
con el desarrollo de la enfermedad (Moore et al., 2002; Friedman et al., 1997). Moore et
al. (2000) demostraron que en H. rufescens, el aumento de la temperatura del agua
aceleraba el desarrollo del síndrome y aumentaba la mortalidad en animales infectados
con WS-RLP. Las evidencias indicadas previamente muestran un aumento en la
intensidad de la infección asociada al incremento de la temperatura del agua. En H.
cracherodii, Ben-Horin et al. (2013) demostraron que en animales infectados con WSRLP, la temperatura tiene un efecto similar al citado por Moore et al. (2000).
Interesantemente, nuestro experimento no evidenció efecto de la temperatura sobre la
respuesta inmune, ni interacción entre la temperatura y la infección sobre esta. Así, el
desarrollo de la enfermedad y la aceleración de su progresión a temperaturas más altas,
no pueden ser atribuidas al efecto de éstas sobre el sistema inmune de H. rufescens.
82
Por otra parte, en H. cracherodii, se ha propuesto recientemente que la mayor
fluctuación de temperaturas diarias aumenta la susceptibilidad de este abalón a la
infección con WS-RLP (Ben-Horin et al., 2013). Como se mencionó previamente,
existen evidencias de que cambios bruscos de la temperatura pueden causar estrés y
afectar la respuesta inmune en moluscos (Hégaret et al., 2003a, Monari et al., 2007).
Esto sugiere que la mayor susceptibilidad de los abalones a la infección con WS-RLP
podría estar mediada por una depresión en el sistema inmune, causada por cambios
bruscos en la temperatura del agua. Por otra parte, nuestros resultados evidencian que la
exposición en forma crónica a temperaturas altas o bajas, no afectarían el sistema
inmune de H. rufescens, y por lo tanto no aumentaría el riesgo de adquirir la infección.
83
CONCLUSIONES
Diferencias crónicas en la temperatura, no afectan los parámetros inmunológicos
analizados, la concentración de Hsp70 ni la supervivencia de H. rufescens, dentro de los
rangos estudiados, pero si el crecimiento.
La infección con “Candidatus Xenohaliotis californiensis” afecta negativamente la
respuesta inmune y el crecimiento, y causa un aumento de la expresión de la proteína
Hsp70 en H. rufescens.
No hay interacción entre la infección con “Candidatus Xenohaliotis californiensis” y la
temperatura, sobre la respuesta inmune, expresión de Hsp70, crecimiento y
supervivencia de H. rufescens.
84
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