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© Segunda Edición
Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cápac Yupanqui 1400. Jesús María Telf.471-3254 I Fax: 471-7443
Lima, Perú, 1997
Diseño e impresión: Art. Lautrec S.R.LIda.
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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
DE PESTE
COMITE RESPONSABLE
BIg. Sara Morales de Santa
Gadea Blg. Martha Glenny Araujo
Blg. Carmen Flores Mendoza
COMITÉ EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martíllez- Vargas
Dr. César Cabezas Sánchez
Dr. Carlos Carrillo Parodio
Dr. Jaime Chang Neyra
MINISTERIO DE SALUD
. ALTA DIRECCIÓN
Dr. Marino Costa Bauer
Ministro
Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco
Viceministro
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Dr. Carlos Carrillo Parodio
Jefe.
CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
Dr. César Cabezas Sánchez
Director Genera
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PERFIL DE AUTORES
8lgo. Sara Morales de Santa Gadea
Bióloga
Jefe del Laboratorio de Bacteriología Especial, División de Bacteriología, Centro Nacional de
Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
8lgo. Martha Glenny Araujo
Bióloga
Jefe del Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología,
Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA.
Dr. Carlos Carrillo Parodl
Médico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia. .
PERFIL DE WS EDITORES
Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas
Médico Cirujano, Doctor en Farmacología
Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA
Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas,
Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Miembro, Instituto de Medicina Tropical 'Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano
Heredia.
Dr. César Cabezas Sánchez
Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales
Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud,
M/NSA.
Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad
Peruana Cayetano Heredia.
Dr. Carlos Carrillo Parodl
Médico Cirujano, Doctor en Medicina
Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Jefe, Instituto Nacional de Salud
Dr. Jaime Chang Neyra
Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Deueloping Countries
Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de
Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA, Investigador, Instituto de Medicina Tropical
'f\lexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia.
Agradecimientos:
El Comite Editor expresa su agradecimiento a los señores Doctores César Naquira Velarde,
Humberto Guerra Allison, Isabel Montoya Piedra, por las valiosas sugerencias y correcciones
efectuadas al manuscrito.
La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el
Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia.
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INDICE
Presentación ........................................................................................... ............................................7
Resolución Jefatural .............................................................................. ............................................8
CAPITULO I
Introducción........................................................................................... .............................................9
CAPITULO II
Obtención y envío de la Muestra ....................................................................................................10
CAPITULO III
Pruebas de laboratorio para diagnóstico de Peste .......................... ............................................19
CAPITULO IV
Inmunofluorescencia Directa (IFA) .................................................... ............................................22
CAPITULO V
Prueba de Aglutinación en Látex........................................................ ............................................25
CAPITULO VI
Aislamiento por Cultivo de Yersinia pestis...................................................................................28
CAPITULO VII
Técnicas de ELISA...........................................................................................................................36
CAPITULO VIII
Inoculación en ratón............................................................................ ............................................43
CAPITULO IX
Normas de Bioseguridad .................................................................................................................45
CAPITULO X
Referencias Bibliográficas ................................................................. ............................................46
CAPITULO XI
Anexos ...............................................................................................................................................47
Anexo 1:
Definiciones de casos de Peste según el laboratorio ..................................................................48
Anexo 2:
Ficha de laboratorio para diagnóstico de Peste ...........................................................................49
Anexo 3:..
Sobre de envío de tiras de Nobuto (animales) ..............................................................................50
Anexo 4:
Ficha para el diagnóstico de Peste en animales...........................................................................51
Anexo 5:
Preparación de Medios de Cultivo y Reactivos ............................................................................52
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PRESENTACION
La Yersinia pestis es un microorganismo virulento, gramnegativo, móvil cuando se le aisla
del medio ambiente, pero que se torna inmóvil en los tejidos del huésped. Tres especies de
Yersinia pueden ocasionar enfermedades en el hombre: Yersinia enterocolítica, Yersinia
pseudotuberculosis y Yersinia pestis.
Las dos primeras, se adquieren por ingestión de alimentos contaminados, mientras que la última
requiere la picadura de un insecto, siendo la especie más invasiva. Son portadores de la
enfermedad: las ardillas, ratas del campo, marmotas, cerdos salvajes, osos y ocasionalmente
conejos. Los gatos domésticos pueden ser infectados de peste cuando cazan roedores enfermos
y transmitirla a los humanos.
Esta característica ha permitido que no existan problemas al escoger animales modelo para
estudiar la fisiopatogenia de la enfermedad. Desarrolla bien en cultivos celulares (HeLa, Hep-2,
Hence), poseyendo plasmidos de virulencia (adhesinas, invasinas y regulatorias).
Una historia clínica que refiera picaduras de pulgas y/o campamentos o permanencia en áreas
endémicas son importantes para el diagnóstico primario. El reconocimiento precoz de esta
enfermedad es crítico para el tratamiento apropiado, tanto de los pacientes como el de los
contactos y para el inicio de medidas de control que prevengan la rápida diseminación de la
enfermedad potencialmente fatal.
Los síntomas incluyen el síndrome parecido al resfrío viral (influenza): fiebre alta, escalofríos,
malestar, dolor de cabeza, y generalmente, pero no siempre, aumento del tamaño de los nódulos
linfáticos con dolor, cerca a las áreas de la inoculación primaria (áreas inguinales o axilares). El
tratamiento antibiótico es esencial en peste y cuanto más precoz, mejor será la evolución de la
enfermedad. Disminuir la población de roedores mediante eliminación de la basura y programas
de erradicación de roedores, es una acción esencial en el control de esta enfermedad.
Este manual constituye parte de la serie de Normas Técnicas que el Instituto Nacional de Salud,
como Organo Normativo Referencial está publicando, para su uso en la Red Nacional de
Laboratorios de Salud y por la comunidad técnico científica, en concordancia con los lineamientos
de politica institucional y sectorial.
Dr. Carlos Carrillo Parodi
Jefe
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CAPITULO I
INTRODUCCION
La Peste, es una infección bacteriana de animales y humanos causada por Yersinia pestis. El
bacilo de la Peste fue descubierto por el bacteriólogo francés Alexander Yersin, en 1894, en Hong
Kong. Se le llamó Pasteurella pestis hasta 1970.
Yersinia pestis, pertenece la Familia Enterobacteriaceae, y es un bacilo Gramnegativo aerobio
oxidasa negativa, que cuenta con gran número de antígenos y toxinas que desempeñan papeles
importantes en la virulencia y patogenicidad de la enfermedad.
La forma clínica más frecuente, es la linfadenitis regional aguda, llamada Peste Bubónica. Algunas
formas menos comunes son la Septicémica y la Neumónica. La mortalidad es alta en los casos no
tratados, pero el tratamiento antibiótico que se emprenda en fase temprana del curso de la
enfermedad reduce notablemente la letalidad.
La Peste, es de distribución mundial, con focos importantes en América, Africa y Asia. Los
reservorios naturales de Yersinia pestis, son sobre todo roedores urbanos y silvestres; y se
transmite entre animales y en ocasiones al hombre por la picadura de pulgas infectadas.
Yersinia pestis, ha causado pandemias devastadoras con altos índices de mortalidad durante
toda la historia. La primera conocida, se originó en Egipto en el año 542 D.C. y se extendió a
Turquía ya Europa. La más reciente, comenzó, aproximadamente en 1860, en la provincia china
de Yunnan, se extendió hacia la costa sur de China, llegando a Hong Kong en 1894. Luego, la
Peste fue llevada por barco a la India y otros países de Asia, Brasil y Estados Unidos (California).
Se calcula que ocurrieron 10 millones de muertes por esta enfermedad en la India durante el siglo
actual.
La Peste ingresó al Perú por los puertos de Pisco y Callao en 1903, afectando áreas urbanas
hasta 1910. En los últimos 35 años, sólo se han presentado casos de Peste Silvestre,
localizándose en los Departamentos de la Costa y Sierra Norte del país.
En el laboratorio. Y. pestis crece lentamente. y es bioquímicamente inactivo en contraste con
otras Enterobacterias. En caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI). Y. pestis, tiene un crecimiento
característico formando estalactitas en lugar de una turbidez homogénea. Las coloraciones de
Gram y Wayson no son específicos.
Los criterios para la definición del caso presuntivo y confirmado de Peste, según la OMS, se
muestran en el Anexo l.
El diagnóstico de laboratorio, es fundamental, para la confirmación de los casos humanos y de las
epizootias, así como para la vigilancia epidemiológica de la Peste.
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CAPITULO II
OBTENCION Y ENVIO DE LA MUESTRA
2.1. OBTENCION DE LA MUESTRA
El éxito de los procedimientos de laboratorio depende de una buena obtención de la muestra
y de la rapidez con que las mismas lleguen al laboratorio.
Se debe obtener la muestra antes de la administración de antibióticos. Si se han
administrado, informar de ello, al laboratorio.
El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deberá manejarse con gran cuidado
usando mandil, guantes y mascarilla por el riesgo de infección. El personal de laboratorio
puede infectarse por diversas vías: lesión en piel, mucosas y tracto respiratorio en accidentes
de laboratorio.
Deberá adoptarse toda clase de precauciones para no contaminar el material biológico y,
para evitar que se dispersen en el aire gotas minúsculas que puedan causar la infección de
otras personas y la propagación de la Peste Neumónica.
2.2. OBTENCION DE MUESTRAS DE CASOS HUMANOS
2.2.1. Aspirado de Bubón:
Deberá ubicarse los bubones; y seleccionar el que aproximadamente mida 3 cm o más de
diámetro. (Ver Foto 1)
-
-
-
Desinfecte dos veces la piel del bubón con alcohol yodado, descartando el algodón
cada vez, y una tercera vez con alcohol de 70°. Antes de la punción debe haberse
evaporado.
Aspire con la aguja N° 20 y una jeringa de 10 cc., 0.5 mL de solución salina estéril.
Sosteniendo la jeringa entre el índice y el pulgar de la mano derecha introduzca la
aguja en el bubón.
Con la mano izquierda, tire lentamente del émbolo de la jeringa. Deberá entrar en
ésta, un líquido que puede ser sanguinolento.
En el caso de que no entre líquido alguno en la jeringa, inyecte la solución salina en
el bubón, empuje suavemente el émbolo con el pulgar. Imprímase a la aguja
introducida en el bubón un movimiento circular; a continuación, tire lentamente del
émbolo, para así obtener el líquido seroso.
Retire la jeringa y limpie con alcohol de 70° el sitio de la punción.
Sostenga la jeringa en posición vertical, con la aguja hacia abajo e inocule parte del
aspirado del bubón en el medio de transporte CaryBlair.
El resto del aspirado se usará para el frotís, para la prueba de Inmunofluorescencia
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Directa. Dejar caer una gota de la muestra contenida en la jeringa y extiéndala con la
misma aguja sobre una lámina porta-objeto limpia y desengrasada formando una
capa bastante delgada. Dejar secar el frotís a temperatura ambiente.
- Para descartar el material contaminado, sumerja la jeringa y la aguja en fenol al 5%,
extrayendo suavemente el émbolo.
Se obtendrá, además, muestras de sangre para hemocultivo y serología.
2.2.2. Sangre:
La muestra se obtendrá de pacientes febriles que se encuentran en la fase septicémica de la
enfermedad.
A fin de obtener una mayor posibilidad de aislar el agente etiológico, se obtendrá cuatro muestras
seriadas de sangre en un lapso de 90 minutos para cultivo. La primera muestra de sangre deberá
ser aproximadamente de 10 mL (5 mL para serología y 5 mL para cultivo); las tres muestras
restantes de 5 mL cada una para cultivo.
Antes de proceder a la extracción de la sangre, limpiar con algodón embebido con alcohol
yodado la tapa del frasco de cultivo; descartar el algodón y colocar nuevamente otro algodón
embebido en alcohol de 70°, el que permanecerá hasta la obtención de la sangre.
Localizar la vena y desinfectar la piel por dos veces con alcohol yodado y una tercera vez, con
alcohol de 70°, realizando movimientos centrípetos y descartando cada vez el algodón.
Extraiga 10 mL de sangre en caso de adultos y 5 mL en caso de niños.
Retire el algodón del frasco de cultivo e inocule a través del tapón de jebe 5 mI. de sangre en
caso de adultos y 2.5 mI en niños. (Ver Foto 2).
Foto 1: Bubón en paciente con Peste Bubónica, del cual se obtendrá la
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muestra de aspirado
Foto 2: Inoculación de muestra de sangre en frasco de cultivo (medio bifásico).
Foto 3: Inoculación de muestra de esputo en Medio de Transporte Cary-Blair
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o de la sangre se transfiere a un tubo de ensayo de 13 x 100 mm sin anticoagulante para
separar el suero, vertiendo suavemente la sangre por la pared del tubo para evitar la rotura
de los glóbulos rojos; dejar reposar a temperatura ambiente y una vez retraído el coágulo.
separar el suero. El suero obtenido se trasvasa a un vial de crioconservación (NUNC) y servirá para la realización de la prueba serológica de aglutinación en látex.
2.2.3. Esputo:
a) Este tipo de muestra se obtiene solamente en caso de sospecha de Peste
Neumónica. Asimismo, se obtendrá de estos pacientes muestras de sangre en paralelo
para pruebas serológicas y cultivo.
-
El paciente deberá expectorar dentro de un recipiente estéril con tapa rosca y de
boca ancha, adoptando las debidas medidas de Bioseguridad.(*)
b) Preparación del frotís de esputo:
-
Colocar sobre la mesa de trabajo, idealmente, una hoja de papel absorbente
plastificado.
Colocar los envases conteniendo las muestras de esputo, previamente rotulados,
sobre la mesa de trabajo. De la misma forma, colocar las láminas porta-objetos en
orden correlativo, en las cuales, se preparará el frotís para realizar la prueba de
Inmunofluorescencia Directa:
* Flamear el asa de siembra, dejar enfriar.
* Destapar cuidadosamente el envase de la muestra, manteniendo la
boca del envase cerca del mechero encendido. Coger con el asa de siembra una
pequeña porción de la muestra y extenderla sobre la lámina porta-objetos, haciendo
movimientos de vaivén, hasta lograr que el extendido sea homogéneo (ni muy fino ni
muy grueso); que no llegue a los bordes de la lámina, para evitar que el operador se
contamine al manipularla.
* Dejar secar a temperatura ambiente para luego fijar el extendido al calor. Terminado el
frotis, pasar el asa de siembra por el frasco con arena y fenol al 5%; luego dejar el asa
en la caja de metal para ser enviado a autoclavar.
c) Inoculación de la muestra en Medio de Transporte:
-
Con ayuda del asa de siembra. extraer. parte de la muestra del recipiente e
inoculada en el medio de transporte Cary-Blair. (Ver Foto 3).
En cada una de las muestras y láminas con frotís. se debe poner el nombre del paciente o
código que identifique la muestra y debe ir acompañada de una ficha clínico-epidemiológica
(Anexo N° 2) con los datos del paciente. Se debe escribir el mismo código tanto en el tubo
de medio de transporte, hemocultivo, tubo con sangre, lámina, así como en la ficha que lo
acompaña.
___________________________________________
:*) Nota del Editor: Véase Capítulo IX de este manual.
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2.2.4. Organos de pacientes fallecidos – Caso sospechoso de Peste
Se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones:
a. Cuerpo no refrigerado (24 - 48 horas), realizar autopsia inmediatamente; obtener
muestras de hígado, bazo y bubón. Si no se puede procesar inmediatamente, se puede
guardar las muestras hasta por 06 meses en medio de transporte Cary-Blair o
Thioglicolato a 4°C. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 100% por cultivo el agente
etiológico, así como realizar Inmunofluorescencia Directa.
b. Cuerpo no refrigerado (después de 48 horas), obtener muestras de hígado, bazo y bubón
y procesar inmediatamente. Se tiene la posibilidad de recuperar en un 20% por cultivo el
agente etiológico así como realizar Inmunofluorescencia Directa y PCR.
c. Muerto por largo tiempo (06 meses - muchos años), obtener muestra de médula ósea de
fémur. Se realiza diagnóstico por PCR.
d. No es recomendable realizar la digitomía, sólo se llevará a cabo si no es posible ejecutar
lo anteriormente mencionado. La digitomía tiene un porcentaje muy bajo de obtención de
un resultado positivo.
2.3. OBTENCION DE MUESTRAS DE ESPECIMENES ANIMALES
2.3.1. Roedores muertos:
Deben ser recolectados, individualmente, en bolsas de polietileno conteniendo insecticida,
el mismo que deberá ir acompañado de su respectiva ficha.
2.3.2. Roedores vivos:
2.3.2.1. Anestesia del roedor
- El animal capturado vivo, será introducido en un saco de tela conteniendo algodón
empapado con éter. Todo en su conjunto, debe ser introducido en una bolsa de
polietileno de 35 x 45 cm.
- Una vez adormecido el animal y sus ectoparásitos, se pasa a una bolsa de
polietileno.
· Se espolvorea al animal con insecticida.
· Se da ligeros golpes al animal dentro de la bolsa para eliminar el
insecticida y ectoparásitos adheridos al mismo.
2.3.2.2. Despulgue
- Se procede al cepillado del animal sobre un lavatorio conteniendo agua.
- Las pulgas colectadas se colocarán en frascos con capacidad de 2 mL. conteniendo
solución salina estéril al 2.5% más Tween 20. Las pulgas, así conservadas, se
enviarán al Instituto Nacional de Salud para el aislamiento de Yersinia pestis
mediante cultivo.
2.3.2.3. Biometrfa
- Al animal anestesiado se le coloca sobre la mesa de autopsia.
- Se procede a realizar mediciones, observación del color del pelamen, sexo, peso y
anotar algunas alteraciones morfológicas (presencia de bubones ).
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2.3.2.4. Obtención de sangre
- Al animal anestesiado se le desinfecta la cola/oreja.
- Obtener sangre en papel filtro (tiras de Nobuto).
- En la parte ancha de ,la tira, escribir con lápiz el código del animal. (Ver Foto 4)
- Las tiras de Nobuto se dejan secar a temperatura ambiente.
- Introducir las tiras de Nobuto secas al sobre, en el que se registrará toda la
_nformación referente al animal (Ver Anexo N° 3).
2.3.2.5. Disección
- La disección se realiza junto al mechero y con materiales de disección estériles.
- Se procede a desnucar al animal.
- El animal, es puesto en una bandeja de tecnopor descartable de 40 cm2. Colocar el
roedor en posición de cúbito dorsal y prender con alfiler las patas.
- Desinfectar la parte abdominal con alcohol corriente, pasar el algodón embebido de
alcohol por tres veces.
- Levantar la piel con una pinza, a dos dedos del escroto o vagina y realizar un
piquete.
- Separar la piel del cuerpo.
- Realizar el corte ventral!", edio has'a la altura del corazón. (Ver Foto 5)
2.3.2.6. Obtención de muestra de Organos
- Con una tijera y con ayuda de la pinza, cortar desde la base del hígado y del bazo.
- Obtener muestras de bazo e hígado y colocarlos, separadamente, en una placa petri
estéril.
- Cortar pequeñas muestras de bazo y/o hígado para inocular en medio de transporte
Cary Blair y realizar impronta, las cuales, serán remitidas al Laboratorio Regional de
Referencia correspondiente. La impronta servirá para realizar la prueba de
Inmunofluorescencia Directa, las que resulten positivas se sembrarán en placas de
Agar sangre de carnero al 6% y BHI. (Ver Foto 6).
Las muestras de órganos, sangre y lámina con frotís correspondientes al mismo
animal, deberán tener el mismo código y estar acompañadas de la ficha
correspondiente (Ver Anexo N° 4).
2.3.3. Animales Centinelas (perros)
Extraer con una jeringa descartable de Tuberculina, 1 mL de sangre de la vena Safena de
la pata posterior del animal.
Depositar la sangre en dos tiras de Nobuto, de tal manera, que quede embebida la parte
angosta de la tira.
En la parte ancha de la tira, escribir con lápiz, el código del animal. Dejar secar a
temperatura ambiente.
Introducir las tiras de Nobuto secas en el sobre, en el que se registrará toda la
información referente al animal.
2.4. ENVIO DE MUESTRAS Y CULTIVOS
2.4.1 Envío al Laboratorio Regional de Referencia
Tanto las muestras de casos humanos como la de especímenes animales, deberán ser
remitidas al Laboratorio Regional de Referencia (Piura, Chiclayo y Cajamarca) según
corresponda para la realización de las pruebas de Identificación Presuntiva de Yersinia
pestis (Aglutinación en Látex, Inmunofluorescencia Directa y Aislamiento primario).
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Foto 5: Disección de espécimen animal (ratón) para extracción de órganos Yersinia
pestis (Prueba de Tamizaje). Ola placa es dividida en dos secciones, cada una de ellas
tiene control negativo (-) y control (+), mas 10 muestras de sueros problemas a
procesarse en cada sección.
FOTO 6: Siembra de muestra de órgano en placas de Agar Samgre
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Foto 7: Yersinia pestis en una muestra por la Prueba de Inmunofluorescencia
Directa a una magnificación de 1,000X
Foto 8: Prueba de Aglutinación para diagnóstico de Yesenia pestis (Prueba de
Tamizaje). La polaca es dividida en dos secciones, cada una de ellas tiene control
negativo (-) y control positivo (+), más 10 muestras de sueros problemas a
procesarse en cada sección.
2.4.2 Remisión de Cultivos al Laboratorio Nacional de Referencia
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Los Laboratorios de Referencia Regional deberán remitir al Instituto Nacional de Salud:
•
Cultivos con pruebas presuntivas para identificación confirmatoria de Y. pestis, en
tubos o frascos pequeños con tapa rosca o de jebe conteniendo Agar Tripticasa de
Soya (TSA). Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o pierda la
identificación, acompañado de su respectiva ficha.
•
Dos muestras de sueros de un mismo paciente, obtenidas con un intervalo de tiempo
para Confirmación Serológica de caso de Peste, con los resultados obtenidos en el
Laboratorio de Referencia Regional. La remisión debe ser en tubos o frascos
pequeños con tapa rosca o de jebe, crioviales de conservación; nunca debe remitirse
la muestra en jeringa. Debe rotularse el frasco, de tal manera, que no se borre o
pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha.
•
El 100% de las pulgas para confirmación de especie y determinación de la presencia
de Y. pestis. La remisión debe hacerse en frascos con capacidad de 2 mL
conteniendo solución salina más Tween 20. Debe rotularse el frasco, de tal manera,
que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha.
•
El 10% de cráneos de animales capturados de la misma especie y procedentes de
una misma zona, para verificación de especie. Debe rotularse el frasco, de tal
manera, que no se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva
ficha.
•
EI 10% de los animales taxidermizados que tengan la misma morfología y procedan
de la misma zona. Debe rotularse debidamente el espécimen, de tal manera, que no
se borre o pierda la identificación, acompañado de su respectiva ficha.
•
Todas las muestras deben transportarse dentro de un recipiente seguroseguro para
evitar accidentes el mismo que esté correctamente identificado por fuera, indicando
la dirección a donde va a ser enviado y señalando que contiene material biológico,
como se indica a continuación:
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE
Cápac Yupanqui 1400 - Jesús María, Lima II
Teléfonos 471-2529, 471-9920 FAX (01)471-7443 - (01) 471-2529 CONTIENE
MATERIAL BIOLOGlCO
REFRIGERAR
Se deberá comunicar al Instituto Nacional de Salud, vía telefónica o vía fax, la remisión de
muestras.
________________________________________________________________________________________
TODO MATERIAL CBIOLOGICO REMITIDO PARA IDENTIFICACIÓN Y/O
CONFIRMACION DEBERA ESTAR ACOMPAÑADO DE SU RESPECTIVA
FICHA CLINICO-EPIDEMOLOGICA Y/O ENTOMOLOGICA, EN CASO
CONTRARIO, NOSE REALIZARA NINGUN ESTUDIO”.
________________________________________________________________________________________
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CAPITULO IV
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (IFA)
Prueba que es usada como Diagnóstico Presuntivo de Peste, basada en una reacción antígeno
anticuerpo específica contra el antígeno capsular F1 de Yersinia pestis conjugado con
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
Asimismo, esta prueba es usada para realizar la vigilancia de roedores silvestres y epizootias.
4.1. MUESTRAS APROPIADAS
-
Aspirado de bubón
Esputo
Cultivo
Organos: Hígado, bazo, tejido de nódulo linfático
4.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA
-
-
Conjugado de anticuerpo fluorescente (suero de conejo con Anti Fl conjugado con
lsotiocianato de Fluoresceína).Ç
Buffer Fosfato Salino (PBS), pH 7.2 0.2
Láminas porta-ebjetos (lmm de grosor)
Laminillas cubre-objetos
Líquido de montaje (90% Glicerol en PBS)
Jarras de coloración (Koplin)
Lápiz de cera o plumón de tinta indeleble
Cámara húmeda
Micropipeta graduable de 5 a 50 uL de un canal
Tips de 1
- 100 uL
Controles: Positivo y Negativo
Microscopio de fluorescencia
Suero fisiológico
4.3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
4.3.1. Preparación de Frotis o Impronta: Preparar 2 láminas por cada
muestra.
A. Organo:
-
Coger con una pinza estéril un pedacito de bazo o hígado y colocarlo sobre una
lámina porta-objetos limpia y desengrasada.
Presionar suavemente a manera de un sello.
Dejar secar a temperatura ambiente.
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B. Cultivo:
-
Flamear el asa de siembra en el mechero, dejar enfriar.
Colocar una gota de suero fisiológico estéril sobre una lámina portaobjetos.
Coger con el asa de siembra 1 ó 2 colonias de la placa de Agar sangre y colocarla
sobre la gota de suero fisiológico.
Homogenizar y extender la gota formando una capa bastante delgada; dejar secar a
temperatura ambiente.
C. Aspirado de Bubón:
-
Colocar la jeringa en posición vertical con la aguja hacia abajo. Dejar caer una gota
de la muestra extendiéndola sobre una lámina porta-objetos limpia y desengrasada
formando una capa bastante delgada.
En caso de que la muestra se encontrara en medio de transporte (tubo y/o frasco):
* Flamear el asa de siembra, dejar enfriar.
* Coger con el asa de siembra una pequeña porción de la muestra y
extenderla en una lámina portaobjetos formando una capa bastante delgada.
-
En ambos casos, dejar secar a temperatura ambiente.
-
D. Esputo:
-
Flamear el asa de siembra y dejar enfriar.
Coger con el asa de siembra una pequeña porción de la muestra y extenderla en
una lámina porta-objetos formando una capa bastante delgada, dejar secar a
temperatura ambiente.
E. Hemocultivo:
De las colonias presentes en la fase sólida del frasco de hemocultivo se prepara un frotís
empleando el siguiente procedimiento:
-
-
Usar una lámina portas-objeto limpia. Pasarla por alcohol y secarla.
Colocar sobre la lámina con una pipeta Pasteur y/o asa de siembra, una gota de
suero fisiológico estéril. Con ésta, coger 2 ó 3 colonias, y realizar una emulsión de
las mismas con el suero fisiológico.
Dejar secar a temperatura ambiente; y finalmente, fijarla al calor para realizar la
prueba.
4.3.2. Coloración de las láminas
-
Cada prueba debe correrse paralelamente con controles preparados de una muestra
que se conoce que es positiva y una muestra negativa.
Calentar la lámina en el mechero para fijar las muestras, dejar enfriar y con el lápiz
de cera, hacer un círculo en cada muestra.
Agregar 25 uL del conjugado para cubrir cada muestra e incubar a temperatura
ambiente (23-29°C) durante 30 minutos en cámara húmeda.
Lavar las muestras con buffer fosfato salino (PBS) por dos veces, sumergiéndolas
durante 10 minutos cada vez en las jarras de coloración. Dejar secar las muestras a
temperatura ambiente.
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4.3.3. Lectura
La lámina puede observarse, directamente, en el microscopio de fluorescencia, agregando una
gota de aceite de inmersión dentro del círculo que contiene la muestra. Alternativamente,
algunos microscopios requieren de un montaje especial, en tal caso, agregar una gota del
líquido del montaje y cubrir con una laminilla cubre-objeto. Examinar la muestra.
La presencia de organismos fluorescentes verdes ovoides pequeños o partículas pequeñas se
considera como una prueba positiva. Cuando los pacientes sospechosos de Peste han recibido
tratamiento antibiótico previo a la obtención de muestra no se observa la morfología celular
característica, pero, partículas pequeñas de material celular disperso pueden estar presentes
debido a la lisis de las bacterias, por lo que, es importante, que en la Ficha ClínicoEpidemiológica se señale el esquema de tratamiento recibido por el paciente a fin de poder
interpretar el resultado de la prueba. (Ver Foto 7)
4.4. FACTORES DE ERROR
-
La variación en el pH del buffer fosfato salino.
La congelación y descongelación continua del conjugado disminuye el título del
mismo.
Fallas en el procedimiento de fijación de la muestra.
4.5. CONTROL DE CALIDAD
Cuando es recibido el reactivo (Conjugado para Inmunofluorescencia), pequeñas alícuotas
(100 uL) deben ser preparadas y conservadas a una temperatura de -20°C. Una vez que se
usa una de las alícuotas, ésta debe ser conservada a 4°C en la oscuridad.
El reactivo debe ser evaluado anualmente, para asegurar la reactividad del mismo.
Cuando se preparan los frotices de las muestras a procesarse, también debe prepararse una
batería de controles: positivo y negativo.
Los microscopios de fluorescencia deben ser revisados y realineados una vez al año.
24
CAPITULO V
PRUEBA DE AGLUTINACION EN LATEX
Prueba de diagnóstico presuntivo que permite detectar la presencia de anticuerpos contra
Yersinia pestis, es una reacción antígeno anticuerpo específica para el antígeno capsular F1 de
Yersinia pestis, adherido a una partícula coloreada (látex).
Asimismo, es usada para realizar la vigilancia serológica, de animales centinelas y roedores
silvestre
5.1. MUESTRAS APROPIADAS
-
Caso humano: Suero, de preferencia no hemolizado
Espécimen animal: Sangre en papel filtro (tiras de NOBUTO)
5.2. MATERIALES NECESARIOS PARA ESTA PRUEBA
-
-
Placas de microtitulación de 96 pocillos, sin carga iónica de polipropileno y de fondo
en U
Micropipeta Multicanal de 12 canales de 5-50 uL de capacidad Micropipeta de un
canal, de 5-50 uL de capacidad
Tips para micropipetas (0.1 - 100 uL)
Diluyente : Buffer Fosfato Gelatina pH 6.8
Partículas de Látex sensibilizadas con Fracción Antigénica F1 Buffer de Inhibición de
la Aglutinación (Buffer Fosfato Gelatina con Fracción Antigénica F1)
Buffer Borato pH 8.
Tubos de prueba 10x75 mm
Sueros Control: Positivo y Negativo
Bafio María
Centrífuga
5.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
5.3.1. Preparación de sueros de casos humanos
-
Obtener muestra de sangre en tubo sin anticoagulante.
Separar el suero por centrifugación (2,500-3,000 rpm) durante 10 minutos.
Observar que el suero no esté contaminado.
Inactivar el suero a 56°C durante 30 minutos.
5.3.2. Preparación de muestras de sangre de especimenes animales
(Tiras de NOBUTO)
-
-
Obtener muestra de sangre en tiras de NOBUTO. Separar la parte
ancha de la tira de NOBUTO.
Cortar en 2 fragmentos la sección de la tira de NOBUTO, donde
se encuentra la muestra, e introducirlos en el tubo de 10x75 mm
que contiene 0.4 mL de buffer Borato. Dejar en refrigeración (4°C)
durante toda la noche.
Presionar con aplicadores (vidrio o plástico) las tiras de NOBUTO
25
-
contra la pared del tubo de 10x75 mm
Separar el suero por centrifugación (5,000 rpm) durante 10
minutos. Inactivar el suero a 56°C durante 30 minutos.
5.3.3. Procedimiento
A. Prueba de Tamizaje
La realización de esta prueba se efectúa usando 4 pocillos por cada muestra.
- Dividir horizontalmente la microplaca en dos secciones: 4 columnas hacia arriba y 4
columnas hacia abajo. Se pueden trabajar 10 muestras en cada sección, sumando
además un control positivo y un control negativo en cada sección.
- Utilizando la micropipeta multicanal, colocar 25 uL de buffer diluyente a cada uno de
los pocillos de la microplaca. Utilizando la micropipeta de un canal, adicionar 25 uL
de cada uno de los sueros problema y controles a cada pocillo de la primera fila de
cada sección.
- Realizar las diluciones, utilizando la micropipeta multicanal, mezclando por tres
veces la muestra de suero en el primer pocillo de cada fila y luego transferir 25 uL de
éste al segundo pocillo y así sucesivamente hasta el cuarto pocillo, descartando los
últimos 25 uL.
- Girar la placa, de tal manera, que se empiece por la última dilución al agregar con la
micropipeta multicanal, los 25 uL del látex a cada pocillo.
- Cubrir la microplaca y dejar en reposo durante 6 horas a temperatura ambiente (2225°C), en un lugar donde no haya vibraciones. Leer con una buena fuente de luz y
fondo blanco.
- El título de la prueba de tamizaje, estará dado por la última dilución en la cual se
observe aglutinación. (Ver Foto 8)
B. Prueba Estándar
Seleccionar las muestras en las cuales se observe aglutinación con títulos > 1: 1 O en casos
de humanos y 1: 128 para especímenes animales para correr, simultáneamente, la titulación
final de las muestras y la Prueba de Inhibición de la Aglutinación para determinar la
especificidad de la reacción. Se realiza usando 8 pocillos para la prueba de aglutinación y 4
pocillos para la prueba de inhibición de la aglutinación.
-
-
-
Dividir verticalmente la microplaca en dos secciones: una sección con 8 columnas y
la otra con 4 columnas. Se pueden trabajar 6 muestras de suero sumando además
un control positivo y un control negativo.
Colocar 25 uL del buffer fosfato gelatina en los primeros 8 pocillos y 25 uL del buffer
de inhibición a los 4 pocillos restantes.
Agregar, 25 uL de las muestras de suero a cada primer pocillo de aglutinación y a
cada primer pocillo de inhibición de la aglutinación. Diluir en forma seriada las
muestras de suero, empezando por el primer pocillo y descargando los últimos 25
uL. Los mismos tips pueden usarse para realizar la dilución de los pocillos de
inhibición. Agregar a todos los pocillos, 25 uL del látex.
Cubrir la microplaca e incubar a temperatura ambiente durante 6 horas.
C. Lectura
Examinar los pocillos después de 6 horas de incubación de la prueba. Buscar una
aglutinación clara en forma de red con bordes regulares como resultado Positivo.
26
Los pocillos negativos tendrán un botón muy bien delimitado en los bordes o un círculo bien
definido.
Determinar los títulos de acuerdo a la Tabla de Título Final (Tabla 1). Los resultados de
Inhibición son interpretados como reacción específica. Si el título de la muestra de suero es
muy alto, la inhibición de la aglutinación es reducida.
Se considera, Positiva la prueba, cuando el título es > 1: 1 O en caso de humanos y 1: 128 en caso
de especímenes animales.
5.4 FACTORES DE ERROR
-
La formación de burbujas en el momento de realizar las diluciones dificulta la interacción
antígeno-anticuerpo.
Temperaturas mayores de 28°C favorecen la desecación de las muestras.
5.5 CONTROL DE CALIDAD
Cada lote de látex y buffer, deben ser evaluados con un panel de sueros de títulos conocidos y
así asegurar que los reactivos estén funcionando en óptimas condiciones.
27
CAPITULO VI
AISLAMIENTO POR CULTIVO DE Yersinia pestis
6.1 AISLAMIENTO POR CULTIVO E IDENTlFICACION DE Yers;nia
pestis (EN EL MEDIO AGAR SANGRE)
La confirmación absoluta de un brote de Peste, requiere del aislamiento e identificación del agente
etiológico.
En la fase aguda de la enfermedad, hay una intermitente bacteremia, por lo que se requiere
la obtención de 4 muestras de sangre para tener mayor probabilidad de cultivo positivo. Los
nódulos linfáticos también contienen abundantes organismos.
Yersinia pestis puede ser identificada, presuntivamente, por la prueba de
Inmunofluorescencia Directa. La confirmación se basa en pruebas adicionales que incluyen
la morfología de los colonias bacterianas en cultivos de agar sangre al 6% y caldo BHI,
caracterización bioquímica y sensibilidad al bacteriófago especifico de Yersin;a pestis a
temperatura de 37°C como a temperatura ambiente (22 - 25°C).
Si se trata de pulgas o muestras que se encuentren contaminadas, entonces, se prepara un
inóculo para la inoculación en ratones.
El medio de agar sangre al 6%, es el medio sólido estándar que se usa para el cultivo de
Yersinia pestis.
La superficie del medio de cultivo a usar debe estar completamente seca y a temperatura
ambiente antes de proceder a la siembra.
Las muestras obtenidas de pacientes sospechosos de Peste para cultivo pueden ser
sembradas directamente (aspirado de bubón, esputo, órganos), o subcultivadas
(hemocultivos), en los medios de cultivo anteriormente mencionados.
6.2 METODOLOGIA:
6.2.1. SEMBRADO Y MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS DE
Yersinia pestis EN CULTIVO
En caso de muestras de aspirado de bubón, esputo, órganos, se siembra directamente la
muestra en el medio; la muestra se estría en la superficie del agar e incuba por 24 horas a
37°C.
Yersinia pestis, crece como colonias translúcidas blanco-grisáceas. A las 24 horas se
observan colonias pequeñas como cabeza de alfiler. Después de una incubación de 48
horas, las colonias miden aproximadamente 1-2 mm de diámetro y son blanco-grisáceas y
más opacas. No son hemolíticas. (Ver Foto 9 y 10).
28
Foto 9: Colonias de Yersinia pestis aisladas en Agar Sangre (48 horas de
incubación). Colonias traslúcidas blanco-grisáceas, no hemolíticas.
Foto 10: Colonias de Yersinia pestis a las 72 horas de incubación.
29
Foto 11: Crecimiento de Yersenia pestis en caldo infusión cerebro-corazón
(BHI): Crece como pequeños acúmulos de célula, no presentando turbidez (tubo
izquierdo) a diferencia de otras bacterias que sí presentan turbidez (tubo
derecho).
Foto 12: Pruebas de Oxidasa, el color violeta oscuro (derecha) indica la prueba
positiva, la ausencia de color (izquierda) indica prueba negativa.
30
6.2.2. CRECIMIENTO EN CALDO INFUSION CEREBRO CORA
ZON (BHI)
El caldo de infusión cerebro corazón, es el medio estándar usado en el laboratorio para
crecimiento de la bacteria. Es un caldo de aislamiento primario y de caracterización de
Yersinia pestis.
Antes de proceder a la inoculación de las muestras de aspirado de bubón, sangre, esputo,
órganos, el medio debe encontrarse a temperatura ambiente.
Con el asa de siembra se realiza la inoculación de la muestra (pequeño inóculo) en un tubo
tapa rosca que contenga aproximadamente 10 mL de caldo. Incubar a 37°C durante 24 a 48
horas.
Yersinia pestis, tiene un crecimiento típico y característico en el caldo de cultivo. Los
organismos crecen como pequeños acúmulos de células dando la apariencia de estalactitas,
usualmente, crece en los lados y fondo del tubo; el resto del caldo permanece claro. Después
de 24 a 48 horas de incubación, el crecimiento característico es observado si los tubos no se
mueven. Si se agita, el crecimiento sedimenta en el fondo. No produce crecimiento turbio.
(Ver Foto 11)
6.2.3 AISLAMIENTO A PARTIR DE HEMOCULTIVOS
En caso de hemocultivos, el frasco que contiene la muestra del paciente, se deja en
incubación a 37°C. Aproximadamente a las 6 horas, se inclina el frasco de tal manera, que la
fase líquida bañe la fase sólida por unos minutos. Se vuelve el frasco a su posición vertical y
se deja incubar 24 horas. A las 24 horas, se observa si hay crecimiento en la fase sólida,
líquida o en ambas. Si no se observa desarrollo a las 24 horas, se inclina el frasco de tal
modo que la fase líquida bañe la fase sólida por unos minutos; se vuelve el frasco a su
posición vertical y se deja incubando 24 horas más a 37°C.
Si se observa presencia de colonias en la fase sólida, se procederá a realizar un frotis para
la prueba de Inmunofluorescencia Directa y subcultivarlas en placas de agar sangre al 6% y
caldo BHI.
6.3. PRUEBAS DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA
6.3.1. PRUEBA DE OXIDASA
Sobre un pedazo de papel filtro estéril en una placa de petri, se coloca un extendido del
cultivo utilizando un palillo de dientes estéril y sobre el extendido se coloca 2 a 3 gotas de
reactivo de oxidasa. La coloración que aparece en 10 segundos, violeta oscura o rosada
(dependiendo del reactivo a usarse) indicará un resultado positivo; la ausencia de coloración
indicará un resultado negativo característico de Yersinia. Como control positivo de la prueba
se utiliza una cepa de Pseudomonas aeruginosa y como control negativo una cepa de
Escherichia coli. (Ver Foto 12)
6.3.2. PRUEBA DE CATALASA
Sobre una lámina porta-objeto limpia y desengrasada en una placa de petri, se coloca una
31
colonia utilizando el asa de siembra. Inmediatamente, agregar una gota de Peróxido de
Hidrógeno al 3%. El burbujeo inmediato indicará un resultado positivo característico de
Yersinia. La ausencia de burbujeo indicará un resultado negativo. Como control positivo se
utiliza una cepa de Staphylococcus aureus y como control negativo una cepa de
Escherichia coli.
6.3.3. MOVILIDAD EN AGAR
Es una prueba de identificación presuntiva y se usa para diferenciar la Yersinia pestis (No
Móvil) de la Yersinia pseudotuberculosis (Móvil).
La muestra apropiada para la realización de esta prueba, es solamente cultivo puro.
Con el asa de puntura, coger una colonia de la placa de agar sangre e inocularla sólo en el
tercio superior del tubo rosca que contiene el medio de movilidad. Incubar a 37°C durante
24 horas.
Para la lectura utilice los siguientes criterios:
a. Organismo móvil: Se observa, enturbamiento homogéneo del medio y
la puntura de inoculación no es visible.
b. Organismo no móvil: No se observa enturbamiento en el medio y la
puntura de inoculación es visible.
6.4. PRUEBAS DE IDENTIFICACION CONFIRMATORIA
6.4.1. CARACTERIZACION BIOQUIMICA
Se realiza el perfil bioquímico de las colonias sospechosas de ser Yersinia pestís aisladas
de cultivo. Para el estudio bioquímico se emplean la fermentación de azúcares y
decarboxilación de los aminoácidos, entre otras. Son pruebas de identificación confirmatoria.
La muestra apropiada para la realización de estas pruebas es solamente cultivo puro.
Aunque Yersinia pestís, bioquímicamente, es notablemente inactivo, se realizan estas
pruebas para su diferenciación con Yersinia enterocolítica y Y. pseudotuberculosís.
Yersinia pestis es oxidasa negativa, catalasa positiva; fermenta la glucosa, xilosa, manitol y
usualmente. maltosa. No fermenta lactosa ni sacarosa. Es indol negativo; reduce nitrato;
lisina y omitina decarboxilasa negativa; hidroliza la esculina, no así, la úrea y gelatina. (Ver
Tabla 2)
Se debe realizar esta prueba, utilizando simultáneamente, controles:
-
Control Positivo: Cepa avirulenta Yersinia pestís A1122. ç
Control Negativo: Yersinia pseudotuberculosís I-A.
32
Fermentación de Azúcares
Se preparan los azúcares al 1 % en Caldo de Fermentación con indicador de Andrade. Se siembra
en cada uno de los azúcares el cultivo a investigarse y se incuba a 37°C durante 24 horas. La
coloración roja indica acidez en el medio (fermentación del azúcar); Yersinia pestis sólo fermenta
la glucosa, manitol, xilosa y usualmente mal tosa. La persistencia del color del medio (amarillo)
indicará la no fermentación del azúcar; Yersinia pestis no fermenta la lactosa ni sacarosa. (Ver
Foto 13).
6.4.2. LISIS POR BACTERIOFAGO
Se realiza esta prueba cuando se ha obtenido cultivo puro. Las colonias sospechosas de ser
Yersinia pestis deben ser procesadas en dos placas de agar sangre de camero al 6%. Es una
prueba de Identificación Confirmatoria. Las células de Yersinia pestis son sensibles a ser
lisadas por un bacteriófago específico y esta actividad, es dependiente de la temperatura. El
bacteriófago de Y. pestis, específicamente, lisa su célula huésped a temperatura ambiente (2225°C) y a 37°C. Yersinia pseudotuberculosis, es también lisada por el bacteriófago sólo a
37°C.
En cada una de las placas de agar sangre, se coloca la tira de papel filtro impregnada con el
bacteriófago de Yersinia pestis, se estría el cultivo sospechoso a cada lado de la tira, la estría
debe ser delgada, aproximadamente, de 5 mm. Asimismo, se deben estriar los controles, Y.
pestis A1l22 (Positivo) y Y. peudotuberculosis I-A (Negativo).
Una de las placas, se incuba a 37°C y la otra placa, se deja a temperatura ambiente durante 24
horas.
33
Para la lectura emplee los siguientes criterios:
a. Placa de agar sangre incubada a 37°C:
Tanto Y. pestis como Y. pseudotuberculosis son lisadas por el bacteriófago a esta
temperatura (hay una zona de inhibición del crecimiento cerca a la tira del bacteriófago).
b. Placa de agar sangre incubada a temperatura ambiente:
Sólo Y. pestis es lisada por el bacteriófago. (Ver Foto 14)
Foto 13: Caracterización bioquímica de Yersenia pestis empleando el Sistema API29E,
mostrando la diferencia de Y. pestis con otros gérmenes.
Foto 14: Lisis de Yersenia pestis por bacteriófago.
34
35
CAPITULO VII
TECNICAS DE ELISA
La técnica de ELISA, nos permite detectar antígeno (F 1) de Yersinia pestis, así como
anticuerpos contra el mismo, en muestras de suero de casos humanos. Prueba que nos permite
determinar si se trata de una infección reciente o pasada.
7.1. ELISA PARA DETECCION DE ANTICUERPOS CONTRA Yersinia
pestis
Esta técnica deberá usarse como prueba complementaria a la técnica de Aglutinación en
Látex. Mediante esta técnica se puede detectar Inmunoglobulina G e Inmunoglobulina M,
dependiendo de la etapa de la enfermedad.
El fundamento de esta prueba se basa en una reacción antígeno-anticuerpo, la cual, puede
visualizarse por la interacción existente entre la enzima y el substrato.
7.1.1. Materiales necesarios para esta prueba
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Reactivos de ELISA
Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6.
Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X.
Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IX TBSt.
Conjugado: Inmunoglobulinas (lgG e IGM) unida a la enzima Fosfatasa Alcalina.
Substrato: p-nitrofenilfosfato más Peróxido de Hidrógeno al 30%.
Solución de stop: Hidróxido de Sodio 5N.
Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2
Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL
Micropipeta graduable de un canal 10 - 50 uL
Tips (50 - 200 uL)ç
Lector de ELISA
Lavador de microplacas para ELISA
Computadora e impresora
Controles: Suero Positivo (1)
Suero Negativo (4)
7.1.2. Procedimiento
•
•
•
•
•
•
•
Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL del stock de la fracción antigénica F
1 (4 mg/mL) diluida en 1 :20 en Buffer Carbonato, pH 9. Dejar en refrigeración (4°C) toda
la noche o a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. . Agregar a cada
pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt
Agregar 50 uL de los sueros problema y controles diluidos en 1 X TBST en las siguientes
diluciones: 1: 1 00 Y 1: 1 000 (todas por duplicado). Incubar a 37°C durante 1 hora.
.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt
Agregar 50 uL del conjugado diluido 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt
36
•
•
Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA.
7.1.3. Lectura
Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativo de cada una de las diluciones,
con estos cálculos, determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3 para
determinar el cut-off.
Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off, será considerada
como Positiva.
El color amarillo significa positividad de la prueba
7.2. ELISA PARA CAPTURA DE IgM ANTI Yersinia pestis
Nos permite detectar la infección temprana de la enfermedad, mediante la captura de
anticuerpo s IgM contra Yeri;nia pestis.
Técnica aplicada a muestras de suero de casos humanos.
7.2.1. Materiales necesarios para esta prueba:
-
Reactivos de ELISA
37
•
•
•
•
•
•
•
Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6
Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X
Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en IXTBSt
Conjugado: Inmunoglobulina (IgM) unida a la enzima Peroxidasa
Substrato ABTS: Substrato Peroxidasa y Peróxido de Hidrógeno
Solución Stock de la fracción antigénica F 1, 1:200 . Anti -Inmunoglobulina humanaIgM
Solución de stop: Acido Sulfúrico 2 M.
-
Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2
Micropipeta multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 uL
Micropipeta graduable de un canal
10 - 50 uL
Tips (50 - 200 uL)
Lector de ELISA
Lavador de microplacas para ELISA
Computadora e impresora
Controles: Suero Positivo conteniendo IgM anti Fl (1)
Suero Negativo que no tengan Ig M (4)
7.2.2. Procedimiento
-
-
-
Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de anti-inmunoglobulina humana
IgM diluida en 1 : 1 00 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeración (4°C) toda la noche ó
a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar a cada
pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante l hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de
los sueros problema y controles diluí dos en 1 X TBST en las siguientes diluciones: 1: 10
Y 1: 100 (todas por duplicado). Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL de
F1 (20 mglmL) dilúido en 1 X TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Agregar 50 uL del
conjugado diluido 1:4000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt. Adicionar 50 uL
del substrato e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de ELISA.
7.2.3. Lectura
Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las
diluciones, con estos cálculos determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3
para determinar el cut-off.
Toda muestra cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cut-off será considerada
como Positiva.
38
El color verde indica positiva de la prueba.
7.3. ELISA PARA CAPTURA DE ANTIGENO (FI) DE Yersinia pestis
Técnica que permite dar un diagnóstico temprano de la infección de Peste y para la cual,
se utiliza anticuerpos monoclonales que permiten la captura de la fracción antigénica (F 1)
de Yersinia pestis. Igualmente, es aplicada a muestras de sueros de casos humanos.
7.3.1. Materiales necesarios para esta prueba
Reactivos de ELISA
•
•
•
•
•
•
•
•
Buffer Carbonato 0.1 M, pH 9.6 más lnmunoglobulinas anti F1
Buffer TRIS Salino más Tween 20 (TBSt), 10X
Buffer de Bloqueamiento: Suero Fetal de Ternero al 3% en 1X TBSt
Proteína «P» purificada FI (Monoclonal)
Conjugado: Inmunoglobulinas IgG e IgM unidas a la enzima Fosfatasa A1calina
Substrato: p-nitrofenilfosfato más Peróxido de Hidrógeno al 30%
Solución Stock de la fracción antigénica FI (4mg/mL)
Solución de stop: Hidróxido de Sodio 5N.
-
Placas para ELISA de 96 pocillos de fondo plano Inmulon 2 Micropipeta
multicanal graduable de 12 canales 50 - 200 Ul
Micropipeta graduable de un canal
10 - 50 uL
-
39
-
Tips (50 - 200 uL)
Lector de ELISA
Lavador de microplacas para ELISA
Computadora e impresora
Controles: Control Positivo, suero negativo más F1
Control Negativo, sueros negativo
Control Inhibición FI, suero negativo diluido 1:50
con Inmunoglobulinas Anti F1
Control Buffer de Inhibición, 1X TBSt
diluido 1:50 con Inmunoglobulinas Anti F1
(2)
(4)
(2)
7.3.2. Procedimiento
a. Sensibilización de las placas
-
-
Sensibilizar los 96 pocillos de la microplaca con 50 uL de Inmunoglobulina de
conejo anti F1 diluida en 1:2000 en Buffer Carbonato. Dejar en refrigeración (4°C)
toda la noche.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con 1 X TBSt Agregar
a cada pocillo, 200 uL del buffer de bloqueamiento. Incubar a 37°C durante 1hora.
b. Preparación de Controles
- Control Positivo Fl:
Un suero humano negativo conocjdo (1:10 en IX TBSt). Hacer diluciones en tubos con
la solución stock de F I en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los
seis tubos 0.5 mL del suero negativo 1:10, agregar, al primer tubo 50 uL del stock de F
1 Y mezclar bien por tres veces, de éste, coger 50 uL y agregar al segundo tubo; y así
sucesivamente, hasta el sexto, descartando los últimos 50 uL.
- Control Inhibición Fl:
Un suero humano negativo conocido (1:10) diluidos 1:50 con Inmuno-globulina de
Conejo anti FI (Buffer de Inhibición). Hacer diluciones en tubos con la solución stock de
FI en concentraciones de 10-1 a 10-6: Colocar en cada uno de los seis tubos 0.5 mL del
suero negativo 1:10 con el buffer de inhibición, agregar al primer tubo 50 uL del stock
de F1 y mezclar bien por tres veces, de éste coger 50 uL y agregar al segundo tubo y
así sucesivamente hasta el sexto, descartando los últimos 50 uL.
Agregar 50 uL de los sueros diluidos en cada pocillo de las secciones de la microplaca
destinadas tanto al Control Positivo como Control de la Inhibición FI.
- Control Suero Positivo:
Un suero humano positivo de título conocido.
- Control Suero Negativo:
Cuatro sueros humanos negativos conocidos.
c. Aplicación de muestras e incubación y lavado de las muestras
Lavar la microplaca a 31 ciclos (Iavador de microplacas) con IX TBSt.
Dividir la placa para cada muestra problema como para los controles
negativos
en dos columnas de 2 pocillos (4 pocillos por muestra). A los dos pocillos de la
primera fila, agregar 50 uL de 1 X TBSt ya los dos pocillos de la segunda fila,
40
agregar 50 uL del Buffer de Inhibición FI, agregar 5 uL del suero a los 4 pocillos
(1 : 10). De tal manera, que se tendrá 2 pocillos para detectar la presencia del
antígeno F1 y 2 pocillos para la inhibición de FI (verifica especificidad de la
prueba).
Se pueden trabajar 16 muestras problema por placa.
M = Muestra de suero problema
-
-
-
Incubar a 37°C durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt.
Agregar, 50 uL del monoclonal diluido en TBSt en 1 :2000. Incubar a 37°C
durante 1 hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt.
Agregar, 50 uL del conjugado diluído 1 :2000 en TBSt. Incubar a 37°C durante 1
hora.
Lavar la microplaca a 31 ciclos (lavador de microplacas) con 1 X TBSt.
Adicionar 50 uL del substrato e incubar a temperatura ambiente duran te 30
minutos.
Adicionar 50 uL de la solución Stop. Leer de inmediato a 405 nm en el lector de
ELlSA.
41
d. Lectura
Calcular el promedio de las lecturas de los controles negativos de cada una de las
diluciones. Con estos cálculos determinar la desviación estándar y luego multiplicarla por 3
para determinar el cut-off.
Toda muestra, cuya lectura sea mayor que el valor obtenido para el cutoff, será
considerada como Positiva.
El color amarillo indica positividad de la prueba.
42
CAPITULO VIII
INOCULACION EN RATON
La inoculación en ratón, es una prueba que se realiza para la recuperación de Yersinia pestis,
permitiendo determinar la patogenicidad del agente etiológico.
En el laboratorio, la inoculación en ratón, no es un procedimiento de rutina. Sólo se usa cuando se
tiene muestras de órganos y/o cultivos contaminados para la recuperación dé Y. pestis, así como
para determinar su presencia en las pulgas.
8.1. Muestras apropiadas
-
Organos contaminados
Cultivos contaminados Pulgas
8.2. Materiales necesarios para esta prueba
-
Yersinia pestis A 1122 (cepa avirulenta)
Bioterio
Jaulas para ratones
Bebedores para ratones
Cabina de flujo laminar tipo 2 Ratones de 45 días
Jeringa de tuberculina descartable Aguja N° 25
Solución salina estéril
Algodón
Alcohol de 700
8.3. Procedimiento
8.3.1 Suspensión de la muestra
Dependiendo del tipo de muestra, se realiza una suspensión homogénea en solución salina
estéril.
a. Organos: Homogenizar la muestra con arena estéril, agregándole, suero fisiológico estéril.
b. Cultivo Contaminado: Si el cultivo se encuentra en placa de agar sangre, se realiza una
suspensión homogénea de las colonias con 1 mL de suero fisiológico estéril. Si el cultivo se
encuentra en caldo BHI, tomar 0.1 mL de éste y diluír con 0.9 mL de suero fisiológico estéril.
c. Pulgas: Hacer un macerado de las pulgas con arena y suero fisiológico
estériles.
8.3.2 Inoculación
-
En la cabina de flujo laminar, preparar la suspensión a inocular y absorber con la
jeringa de tuberculina 0.5 mL de esta suspensión.
En el cuarto de inoculación, proceder a la desinfección con alcohol de la parte
43
-
abdominal de los ratones a inocular (2 ratones por muestra problema y 2 ratones para
la cepa avirulenta).
Inocular vía sub-cutánea 0.1 - 0.2 mL de la suspensión homogénea a cada ratón. De
igual manera, proceder con los ratones controles.
8.3.3 Observación, Control y Cofirmación
-
Observar, diariamente, el estado de los ratones inoculados. Deben controlarse durante
21 días después de la inoculación.
Entre los primeros tres a cuatro días después de la inoculación, los ratones empiezan a
estar moribundos, y finalmente, fallecen por diseminación de la infección.
En la cabina de flujo laminar, realizar biopsia de los órganos afectados, hígado y bazo
para realizar las pruebas de Inmunofluorescencia Directa, cultivo y pruebas de
identificación confirmatoria de Y. pestis.
44
CAPITULO IX
NORMAS DE BIOSEGURlDAD
El error humano y las prácticas impropias de laboratorio pueden comprometer las mejores
medidas de protección, por ello, es indispensable que cada laboratorio adopte un código de
prácticas apropiadas a su trabajo y que todo el personal lo observe estrictamente.
El personal de laboratorio está expuesto a un mayor riesgo de contaminación que otros
trabajadores. La mayoría de las infecciones adquiridas en el laboratorio pueden atribuírse a uno o
varios de los siguientes procedimientos peligrosos comunes:
-
Procedimientos que generan riesgos de inhalación; por ejemplo, al sembrar placas de
agar, emplear pipetas, centrifugar, homogenizar, flamear asas, abrir cultivos.
Procedimientos que generan riesgos de ingestión; por ejemplo, el pipetear con la boca,
manipulación de muestras, hacer frotis y cultivos.
Procedimientos relacionados a la eliminación de material infeccioso.
El material sospechoso de contener Yersinia pestis, deberá manejarse con gran cuidado usando
mandil, guantes y mascarilla, pues gotas minúsculas pueden causar infección por vía respiratoria
de otras personas y la propagación de la Peste Neumónica.
Todos los procedimientos para el diagnóstico de Peste, deben ser trabajados en cabina de flujo
laminar Tipo 2, lo que implica la adopción obligatoria de las siguientes medidas:
-
-
-
El personal de laboratorio debe tener una capacitación en las técnicas de laboratorio
para el diagnóstico de Peste.
No se debe pipetear material infeccioso con la boca (suero, muestras, cultivos ).
No se permitirá comer, beber, fumar, almacenar alimentos ni aplicarse productos de
tocador en el sector de los trabajos de laboratorio.
El laboratorio siempre estará ordenado, limpio y libre de todo el material que no sea
pertinente a los trabajos.
Las mesas de trabajo serán descontaminadas antes y después de haber procesado las
muestras.
Todas las personas deberán lavarse antes y después de manipular material infeccioso y
también al salir del laboratorio.
Todos los procedimientos se realizarán cuidadosamente a fin de reducir al mínimo la
formación de aerosoles. Para evitar la formación de éstos, se puede utilizar un frasco de
boca ancha conteniendo arena estéril y fenol al 5% o alcohol de 70°.
En todos los procedimientos que obliguen al contacto directo con el material infeccioso,
el personal de laboratorio, deberá llevar mandil, guantes y mascarilla.
Mientras se llevan a cabo los trabajos, las puertas del laboratorio permanecerán
cerradas.
Cualquier derrame peligroso, accidente o exposición manifiesta o potencial a material
infeccioso se notificará al jefe de laboratorio y se procederá a descontaminar el área del
accidente de inmediato.
El jefe de laboratorio garantizará que solamente tengan acceso al laboratorio las
personas a quienes se les han advertido los posibles riesgos y estén debidamente
protegidas.
45
CAPITULO X
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.
BAHMANYAR M., and CAVANAUGH D. C. (1976). Plague Manual. Organización Mundial
de la Salud, Ginebra. 76 pp.
2.
CAMPBELL GL and HUGHES 1M. (1995). Plague in India: A new warning from an old
Nemésis. Annals ofInternal medicine, 122(2): 151-153.
3.
CHU C. M. (1995). Guía para Diagnóstico de Peste (en prensa). Bacterial Zoonoses
Branch. Diagnostic and Reference Section. Division ofVectorBorne Infectious Diseases.
Centers for Disease Control and Prevention. Fort Collins, Colorado.
4.
CLARK W.A., HOLLIS D.G., WEAVER R.E., and RILEY P. (1984). Identification ofunusual
pathogenic gram-negative aerobic and facultatively anaerobic bacteria. U.S. Departament
of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta. pp: 311-329.
5.
LENNETTE E., BALOWS A., and HAUSLER W. (1987). Manual de Microbiología Clínica
4ta. Ed. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires, 1370 pp.
6.
LYAMUYA E.F., NYANDA P., MOHAMMMED A.H. and MHALU F.S.
(1992). Laboratory studies on Yersinia pestis during the 1991 outbreak of Plague in
Leshoto, Tanzania. loumal of Tropical Medicine and Hygiene. 95: 335-338.
7.
MARSHALL 1.D., MANGIAFICO 1.A., and CAVANAUGH D.C. (1992). Comparison ofthe
reliability and sensitivity ofthree serological procedures in detecting antibody to Yersinia
pestis. American Society for Microbiology. Aplied Microbiology. 24: 202-204.
8.
ORGANlZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1993). Métodos Bási
cos de Laboratorio en Bacteriología Clínica.OMS, Ginebra. 50 pp.
9.
Plague in India: A new warning from an old Nemesis. Annals ofInternal Medicine. 122 (2) :
151-153.
10. SONNENWIRTH A. and JARETT L. (1983). GRADWOHL Métodos y Diagnósticos del
Laboratorio Clínico. 8va. Ed. Editorial Médica Panamericana, México, págs. 1594-1701.
11. WILLIAMS J.E., ARNTZEN L., TYNDAL G.L., and ISAACSON M. (1986). Application of
enzyme immunoassays for the confirmation of clinically suspect plague in Namibia, 1982.
Bulletin of the World Health Organization; 64 (5): 745-752.
12. WYNGAARDEN J.B. and SMITH Ll. H. (1987). CECIL Tratado de Medicina Interna. 17va.
Ed. Nueva Editorial Interamericana, México. Vol. 11, págs. 1786-1789.
46
CAPITULO XI
(ANEXOS)
47
ANEXO 1
DEFINICIONES DE CASOS DE PESTE SEGUN EL
LABORATORIO
Para la definición de casos, por laboratorio, en humanos y especímenes animales se deben tener
en cuenta los criterios dados por la Organización Mundial de la Salud:
Un caso es diagnosticado como PRESUNTIVO de Peste, si reúne uno o ambos de las siguientes
condiciones:
-
Si las muestras dan resultado positivo a la prueba de Inmunoflurescencia Directa.
Si s610 CI1 una muestra de suero, se obtiene por la prueba de Aglulinación por Lálex
resultados positivos > 1: 10 para casos humanos y
1: 128 para especímenes animales (Tiras NOBUTO).
Un caso es determinado como CONFIRMADO de Peste, si cumple una de las siguientes
condiciones:
-
-
Si, además de Inmunofluorescencia Directa Positiva se aisla e identifica Y pestis mediante
caracterización bioquímica y lisis por bacteriófago.
Si, dos muestras de suero obtenidas en tiempos apropiados, demuestran mediante la prueba
de Aglutinación por Látex, una diferencia de cuatro títulos con respecto al título de la primera
muestra.
En pacientes sin antecedentes de vacunación ni exposición, se obtiene, en una sola muestra
de suero, por la prueba de Aglutinación por Látex, resultado positivo con un título> 1: 128.
48
CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DIRECCION EJECUTIVA DE
LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE
Cápac Yupanqui 1400 Jesús María Lima 11
Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443
ANEXO N° 2
FICHA DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE
CODIGO N° ..................
NOMBRE: ...........................................................................................................................
EDAD:............................................................... ……..............SEXO: M ( ) F ( )
PROCEDENCIA: Dpto: ..................................... ……………..Provincia: ........................
Distrito: .................................. ……………..Caserío:……………..........
DIRECCION: ...................................................... ……….…….Ocupación: ......................
Estado actual: Sano ( )
Fecha de alta:... /.... /.....
Fallecido ( )
Enfermo ( )
Fecha inicio sínt. : ....... /..... /.....
Fecha de defunción:.... /..... /.....
Bubón:
SI ( )
NO ( )
Localización:..................... …………….Tamaño: ……………………….......
Neumonía:
( ) Septicemia: ( )
Otro: .............................................
Recibió tratamiento: SI ( ) NO ( ) Fecha Inicio: ... /... /...
Cuál:....................................................................................................................................
Dosis:........................................................ …..................Tiempo: .......................................
DIAGNOSTICO CLINICO:
..............................................................................................................................................
MUESTRA:
Aspirado de bubón
()
Esputo
()
Hígado
()
Ganglio Linfático
()
Fecha de obtención de la muestra:...../ ...../.....
Fecha de envío de la muestra:............/ ...../.....
Examen solicitado: IFA
()
Confinnación ( )
Hemocultivo
Suero
Bazo
()
()
()
Cultivo
()
Serología ( )
Fecha de recepción:..... l ..... l.:...
Nombre del remitente: ..........................................................................................................
.............................................................
Firma
Establecimiento de Salud: .. ................................................................... ……………………......
..................................................................................................................................................
49
ANEXO 3
SOBRE DE ENVIO DE TIRAS DE NOBUTO (ANIMALES)
Código .............................................................................
Fecha de ......../......./.........
Animal .......................................................
Colección.................................................................
Nombre: ............................................................................................................................................................
...........................................................................................................................................................................
Sexo (M) ( F )
Edad (Joven, adulto) ...............................................
PROCEDENCIA
Localidad..................................................
Distrito...........................................................
Provincia ..................................................
Departamento................................................
DESCRIPCION DEL LUGAR
..........................................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................................................
NOMBRE DEL COLECTOR:
Epizootía ( )
DIRECCION :
...........................................................................................................................................................................
Ectoparásitos
(
)
50
CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA DlRECCION EJECUTIVA DE
LABORATORIOS DE REFERENCIA LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL DE PESTE
Cápac Yupanqui 1400 Jesús María Lima 11
Telf 471-2529 471-9920 Anexo 43 FAX 471-7443
ANEXO N° 4
FICHA PARA EL DIAGNOSTICO DE PESTE EN ANIMALES
CODIGO N° ..........................................................
NOMBRE DEL COLEéTOR :.................................……….FECHA: ….1...l.....
PROCEDENCIA:
Opto:............................................................
Provincia: ..........................................
Localidad.....................................................
Caserío:…………………...................
Nombre vulgar del animal: .............................................................................................................................
Sexo:............................................................
Peso:...................................................
Aspecto del pelamen del cuerpo:
Ventral: .............................................................................................
Dorsal: ..............................................................................................
Aspecto del pelamen de la cola:
Ventral: ..............................................................................................
Dorsal: ...............................................................................................
Aspecto del pelamen de la cabeza: ...............................................................................................................
Biometría:
L.O. ................ …mm
L.C………………….mm
L.P. ................ …mm
L.T…………………..mm
Condición del espécimen:
Vivo ( )
Muerto ( )
Capturado en:
Vegetación primaria ( )
Vegetación secundaria ( )
Domicilio ( )
Peridomicilio ( )
Examen clínico:
Bubón
SI ( )
NO ( )
Localización: ...............................................................
MUESTRA:
Tamaño: ..................................................
Aspirado de bubón ( )
Nódulo linfático
( )
Animal entero
( )
Sangre ( )
Hígado ( )
Bazo ( )
Cráneo ( )
Cultivo ( )
Pulgas ( )
Frotis: Si ( ) No ( )
F. de envío......./...../.......
Fecha de obtención de la muestra...... l..... 1.....
Fecha de recepción de la muestra ......1 .... 1.....
Nombre del remitente: ................................................................................................................................
Firma:...........................................................................................................................................................
Nombre del Establecimiento de Salud:
.....................................................................................................................................................................................
51
ANEXO N° 5
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS
5.1. MEDIOS DE CULTIVO
5.1.1 MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY-BLAIR
Ingredientes
-
Trioglicolato de sodio
1.5 g
Fosfato disódico
1.1 g
Cloruro de sodio
5.0 g
Agar
5.0 g
Agua destilada
991.0 mL
pH 8.4. Ajustar usando solución de NaOH ION
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada en baño María calentando hasta que la solución se
aclare (no se deje hervir). Una vez, enfriada la preparación a 50°C, añadir 9 mL de solución de
cloruro de calcio al 1% recién preparada y ajustar el pH a 8.4 (con hidróxido de Sodio ION).
Distribuir cantidades de 5 mL en tubos limpios y esterilizados de 13x100 con tapa de rosca dejando
un pequeño espacio de aire en la parte superior y con las tapas sin enroscar. Esterilizar a vapor
fluente durante 15 minutos, dejar enfriar y ajustar las tapas. De no contar con tubos se puede
emplear frascos tipo penicilina con tapa de jebe.
5.1.2. MEDIO BIFASICO PARA HEMOCULTIVO CON SPS (RCS)
A. Fase Sólida: Agar Infusión Cerebro Corazón o Agar Tripticasa de Soya más 1% Agar
-
-
-
-
Ingredientes:
Infusión de cerebro de ternera
Infusión de corazón de vacuno
Peptona proteosa
Dextrosa
Cloruro sódico
Fosfato sódico dibásico
Agar
Agua destilada
pH 7.4 0.2
200.0 g
250.0 g
10.0 g
2.0 g
5.0 g
2.5 g
15.0 g
1000.0 mL
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensión
homogénea. Calentar con agitación continua hasta la ebullición para disolver completamente.
Medir pH 7.4 0.2
Repartir 25 mL del medio en frascos de 100 mL ó 15 mL del medio en frascos de 60 mL con
tapa de algodón. Autoclavar a 121°C por 15'. Al día siguiente, autoclavar nuevamente a la
misma temperatura y tiempo.
Inclinar los frascos sobre una de las paredes del frasco y dejar que se solidifique el medio en
plano inclinado.
52
B.
-
Fase Liquida: Caldo Infusión Cerebro
Polianetolsulfonato de Sodio (SPS).
Corazón,
1%
Gelatina
y
0.025%
Ingredientes:
Infusión de cerebro de ternera
200.0 g
Infusión de corazón de vacuno Peptona proteosa
250.0 g
Dextrosa
10.0 g
Cloruro sódico
2.0 g
Fosfato sódico dibásico
5.0 g
Agua destilada
1000.0 mL
pH 7.4 ± 0.2
Preparación
- Disolver los ingredientes en agua destilada, mezclar hasta obtener una suspensión
homogénea. Disolver al calor a 50°C. Repartir 30 mL ó 20 mL del medio (dependiente de la
capacidad de frascos de cultivos a usarse: 100 ó 60 mL) en tubos taparoscade20xl50. MedirpH
7.4 0.2. Autoclavar a 121°C por 15 minutos.
- Al día siguiente, autoclavar, nuevamente, a la misma temperarura y tiempo.
C. Mezcla de la Fase Sólida y Liquida
-
Vertir, en forma estéril, la fase líquida en el frasco que contiene la fase sólida. Finalmente,
taponar usando tapones de jebe estériles tipo penicilina.
El medio bifásico preparado se controla durante una semana a una temperatura de 37°C Y a
temperatura ambiente hasta completar 20 días. Al término del control, colocar el precinto al
frasco.
5.1.3. AGAR SANGRE AL 6%
Ingredientes
A. Medio Base: Agar Base de Sangre (BAB)
Composición:
- Infusión de carne corazón
- Triptosa
- Cloruro de Sodio
- Agar
- Agua destilada
pH 6.8 ± 0.2
500.0 g
10.0 g
5.0 g
15.0 g
1000.0 mL
B. Sangre de cordero desfibrinada 60.0 mL
Preparación
-
-
-
Suspender 40 g del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y calentar
agitando, frecuentemente, hasta que hierva durante un minuto para disolver completamente el
polvo. El pH final debe ser 7.3 :!: 0.2.
Autoclavar a 121°C durante 15 minutos.
Cuando el medio se encuentre a una temperatura entre 45-50°C, añadir en forma aséptica 60
mL de sangre desfibrinada de carnero, agitar para obtener una mezcla uniforme y repartir 20
mL en placas petri estériles.
Controlar su esterilidad durante 24 horas a 37°C.
53
5.1.4. CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON
Ingredientes
- Infusión de cerebro de ternera
- Infusión de corazón de vacuno
Peptona proteosa
- Dextrosa
- Cloruro sódico
- Fosfato sódico dibásico
- Agua destilada
pH 7.4 ± 0.2
200.0 g
250.0 g
10.0 g
2.0 g
5.0 g
2.5 g
1000.0 mL
Preparación
-
-
-
Suspender 37 gramos del medio deshidratado en el litro de agua destilada, mezclar bien y
calentar agitando frecuentemente hasta que hierva durante un minuto para que se disuelva
por completo el polvo. El pH final debe ser 7.4:f: 0.2. Distribuir 8 mL del medio en tubos tapa
rosca de 16 x 125.
Autoclavar a 121°C durante 15 minutos.
Controlar la esterilidad del medio durante 24 horas a 37°C.
Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los
ingredientes se disuelvan completamente.
-
B. Indicador de Andrade al 1%
-
Ingredientes:
Fucsina Acida
Hidróxido de Sodio 1 N
Agua destilada
5.0 g
160.0 mL
1000.0 mL
Preparación
Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada.
Guardar en frasco color ámbar en refrigeración (4°C) hasta el momento de ser usado.
5.1.5. MEDIO DE MOVILIDAD
Ingredientes
-
Extracto de carne
Peptona
Cloruro de Sodio
Agar
Agua destilada
pH 7.4:f: 0.2
2.0 g
10.0 g
5.0 g
4.0 g
1000.0 mL
54
Preparación
Disolver los ingredientes en los 1000 mL de agua destilada, mezclar bien. Calentar y hervir
por un minuto. El pH final debe ser 7.4 0.2. Repartir 3 mL del medio preparado tubos tapa
rosca de 13 x 100. Esterilizar a 121°C por 15 minutos.
5.1.6. MEDIO DE FERMENTACION DE AZUCARES
A. Caldo Base
Ingredientes:
Peptona
Extracto de carne
Cloruro de Sodio
Agua destilada
-
6.0 g
1.8 g
3.0 g
600.0mL
Preparación
Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada, calentar a fuego lento hasta que los
ingredientes se disuelvan completamente.
B.
Indicador de Andrade al 1 %
-
Ingredientes:
Fuesina Acida
Hidroxido de sodio 1N
Agua destilada
5.0 g
160.0 mL
1000.0 mL
Preparación
-
Disolver los ingredientes en el litro de agua destilada.
Guardar en frasco color ámbar en refrigeración (4º C) hasta el momento de ser usado.
C. Azúcares al 1 %
Glucosa
Maltosa
Salicina
Lactosa
Sacarosa
Manitol
D. Preparación
-
Añadir, al caldo base preparado 6 mL del Indicador de Andrade. El medio debe quedar
incoloro. El pH del medio debe ser 7.1 - 7.2. Dispensar 100 mL del medio preparado en cada
uno de los balones o matraces y añadir l g del azúcar a preparar. Disolver con calor y distribuir
2 mL en tubos de 12 x 75. Autoclavara 121°C por 10 minutos.
55
5.2. REACTIVOS
5.2.1. OXIDASA
El reactivo de oxidasa es tóxico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del
contacto directo.
5.2.1.1 Método 1
Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada.
Lectura Prueba Positiva: Coloración rosada.
5.2.1.2 Método 2
- Reactivo A: Disolver 0.1 g de Alfa Naftol en 10 mL de alcohol etílico 95°.
- Reactivo B: Disolver 0.1 g de p-aminodimetilanilina oxalato en 10 mL de agua destilada.
- Lectura Prueba Positiva: Coloración morada.
- Los reactivos deben colocarse en frascos color ámbar y guardarse entre 4 y 8 C no más de
una semana; por eso, se recomienda no preparar más de 2 mL.
5.2.2. BUFFER FOSFATO SALINO (PBS)
Ingredientes
-
NaCI
Na2HP04
KH2P04
Agua destilada
7.65 g
0.724 g
02.1 g
1000.0 mL
Preparación
-
Disolver en el agua destilada los ingredientes. Ajustar pH a 7.2 ± 0.2 con NaOH 1N.
5.2.3. BUFFER FOSFATO SALINO GELATINA
Ingredientes
A. Solución A
-
NaH2P04
0.05M
Na CI
0.1%
Agua destilada
1000 mL
pH 6.6 ± 0.2. Ajustar usando solución de NaOH 10N
B. Solución B
-
Gelatina
Agua destilada
2%
100 mL
56
Preparación
-
Mezclar los ingredientes de la solución A y agitar constantemente hasta obtener una solución
homogénea.
Mezclar los ingredientes de la solución B, disolver con calor y hacer hervir durante un minuto
para diluir bien la solución.
Mezclar las soluciones A y B, tomando 800 mL de la primera y los 100 mL de la segunda. A
esta mezcla adicionar 100 mL de agua destilada. Autoc1avar a 121 DC durante 15 minutos.
Repartir el buffer fosfato salino gelatina junto al mechero en frascos de
100 mL con tapa rosca.
5.2.4. BUFFER BORATO
Ingredientes
Soluciones Stock
-
Cloruro de Sodio
Acido Bórico
Hidróxido de Sodio
C1Na
H3BO3
NaOH
1.5M
0.5M
1.0M
(87.66g/L)
(30.92g/L)
(40.00g/L)
Preparación
Solución A
En un balón de 2000 mL, mezclar 80 mL de CINa 105M, 100 mL de H3B03 O.5M, 24 mL de
NaOH 1M y 796 mL de agua destilada, haciendo un volumen de 1000 mL.
Solución B (Buffer de ajustamiento)
En un balón de 125 mL, mezclar 5 mL de NaCI 1.5 con 70 mL de H3B03 0.5M.
A la solución A añadir 2-3 mL de la solución B, mezclar bien. Ajustar pH. Seguir añadiendo la
solución B hasta encontrar el pH final (8.0) del buffer. Autoclavar a 121°C durante 15 minutos.
Añadir 1 g de NaN3 (Azida de Sodio). Guardar en refrigeración a 4°C.
5.2.5. FENOL ACUOSO AL 5%
El ácido fénico es tóxico y deben tomarse precauciones para proteger la piel del contacto
directo:
-
Ingredientes
Acido Fénico (cristales)
Agua destilada
1Kg
100mL
Preparación
Solución Stock
57
Al kilogramo del ácido fénico, se agrega 100 mL de agua destilada y se calienta en baño
María, obteniéndose 1,100 mL de Fenol Acuoso.
Solución de Trabajo
Se toma 55 mL de la solución stock de fenol acuoso y se completa con 945 mL de agua
destilada, obteniéndose 1000 mL de Fenol Acuoso al 5%. El cual, se conserva en un frasco
ámbar.
58
ANOTACIONES
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………………………………
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