DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PARASITOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y
PARASITOLOGÍA
ESTUDIO DE UN MODELO CATECOLAMINÉRGICO DEL
SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO Y SU RELACIÓN CON
LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Y LAS DISFUNCIONES
SIMPÁTICAS DERIVADAS
MARÍA FELICIDAD CANO JAIMEZ
UNIVERSITAT DE VALENCIA
Servei de Publicacions
2007
Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 17 de
Juliol de 2007 davant un tribunal format per:
-
D. Juan José Toledo Aral
Dª. Rosa Soler Tatché
D. Santiago Ambrosio Viale
D. Ignacio Marín Lozano
D. Francisco Pérez Sánchez
Va ser dirigida per:
Dª. Isabel Fariñas Gómez
©Copyright: Servei de Publicacions
María Felicidad Cano Jaimez
Depòsit legal:
I.S.B.N.:978-84-370-6959-3
Edita: Universitat de València
Servei de Publicacions
C/ Artes Gráficas, 13 bajo
46010 València
Spain
Telèfon: 963864115
Departament de Genètica TESIS DOCTORAL Estudio de un modelo catecolaminérgico del sistema nervioso periférico y su relación con la enfermedad de Parkinson y las disfunciones simpáticas derivadas MARIA FELICIDAD CANO JAIMEZ VALÈNCIA 2007 i
Facultat de Biologia
ESTUDIO DE UN MODELO CATECOLAMINÉRGICO
DEL SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO
Y SU RELACIÓN CON
LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Y
LAS DISFUNCIONES SIMPÁTICAS DERIVADAS
Memoria presentada por
Maria Felicidad Cano Jaimez
para optar al grado de
Doctora
Directora
Isabel Fariñas Gómez
ii
Departamento de Biología Celular y Parasitología
Área de Biología Celular
Unidad de Neurobiología Molecular
Dra. Dña. ISABEL FARIÑAS GÓMEZ, profesora titular del Departamento de Biología Celular y
Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Valencia
CERTIFICA: Que Dña. MARIA FELICIDAD CANO JAIMEZ, licenciada en Ciencias Biológicas, ha
realizado bajo su dirección el trabajo de investigación recogido en esta memoria que lleva como título
“Estudio de un modelo catecolaminérgico del sistema nervioso periférico y su relación con la
enfermedad de Parkinson y las disfunciones simpáticas derivadas” para optar al grado de Doctora por
la Universidad de Valencia.
Y para que así conste, en cumplimiento con la legislación vigente, expido el siguiente certificado en
Burjassot, abril de 2007.
Fdo. Dra. Dña. Isabel Fariñas Gómez
iii
Quisiera dar las gracias a todos los que han hecho realidad este momento…
A Isabel por brindarme la oportunidad de trabajar en su laboratorio y poner tanto empeño y paciencia en
tratar de enseñarme y “abrirme tantas veces los ojos”.
Al Dr. Alun Davies por hacerme un hueco en su laboratorio, muy especialmente a Lucia y Nondas por
enseñarme los cultivos periféricos contribuyendo así a este trabajo de tesis; también a Xavi, Humberto,
Rosa,… porque todos me hicieron pasar una estancia inolvidable en Edimburgo.
Al Dr. Arnon Rosenthal porque sin su contribución con los ratones de sinucleína este trabajo no hubiera
sido posible. Al Dr. Santiago Ambrosio por las determinaciones de noradrenalina y al Dr. José González
Castaño por su aportación de la línea de células PC12 sin los cuales no se hubiera podido completar dicho
trabajo de tesis.
A los profesores del departamento de Biología Celular de la UV porque todos contribuistéis a
“engancharme” a este mundo de la investigación durante los años de carrera. En especial a Martina -MK,
y los “churros”-, Paco –mi eterna fuente bibliográfica-, Rosana -toda energía- y a Verdugo porque con él
inicie esta aventura.
A mis compañeros de laboratorio, Elena, Sacri, Miguel (y Pili), Teresa, Celia, Laura -la primera hornadapor tantas horas y años y vivencias compartidas desde los orígenes del laboratorio…porque he aprendido
mucho de vosotros y me habéis apoyado en los momentos difíciles. En especial a Miguel por compartir
con él el mundo sinucleína y agradecerle sus inmunodetecciones de corazón y a Elena porque con ella me
adentré en el mundo de los DRGs embrionarios. A Helena y Pili porque habéis impulsado una verdadera
“revolución científica” en el lab. A Mª Ángeles, Nati, Zoraida, Mari Paz y Mª José, y Ana “la canaria” -la
segunda hornada- por vuestro entusiasmo y aliento. Han sido tantos “cortaditos y populares”
compartidos (y a los que los hicieron realidad)… A los “genéticos” del grupo de Ignacio, Sergio, Toni,
Miguel, Jorge e Ignasi.
A antiguos compañeros de laboratorio, Mario, Lucía, Nuria, Almudena,…A Carmen y Paco por sus
ánimos, ratos juntos y la pasión compartida por Manolo García. A los otros compañeros del
departamento Gregori, Sabina, Anabel,…A Tomás, Pilar, Mari Tere y Enrique por su disponibilidad y
apoyo técnico en la microscopía.
A mis compañeros y amigos del Cor de Cambra Mestral de Alaquàs, en especial a Xus y Manel, Mª Jesús
y Victor, Elena y Vicente. También a Jose, Maria y Clara. Por vuestro apoyo. A Toni, por ayudarme en
tantas incursiones informáticas. A Sandra, por compartir tantas inquietudes como amigas y mujeres. A
Juani, por su inagotable amistad.
Al grupo de “Mantenimiento” del Campus, por subirme la adrenalina y endorfinas… en especial a Ana y
su entusiasmo. A Joan y Vanesa –siempre más y mejor-. A los Pacos y los Pepes. A Diego por su
iniciación al Tai-Chi en esta última etapa de tesis.
A mi hermano Juan Manuel y a Isa, y mis sobrinos Iván, Macarena y Carlos porque su amor y energía me
han dado aliento para seguir adelante en este camino. También a mis padrinos, tías y tíos, primas y primos
de Terrassa, Valencia, Ventorros de Balerma y Loja, por su apoyo y calor.
A mis padres, Manuel y Felicidad, por los valores que me han transmitido, su cariño y comprensión y
estímulo para seguir siempre adelante. Va por vosotros. A mi abuela Caridad, por sus continuas muestras
de cariño. También a mi abuela MamaEncarna.
A Juan, por su paciencia, comprensión y apoyo durante todos estos años. Por todo lo que hemos vivido y
compartido juntos.
A la Conselleria de Cultura, Educació i Ciència de la Generalitat Valenciana por financiar parte de este
trabajo predoctoral. A Joves Investigadors por su lucha contra la precariedad becaria.
iv
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................1
1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON (EP) .......................................................3
1.1.1. Síntomas clínicos de la EP: hipocinesia..........................................................................3
1.1.2. Fisiopatología de la EP : ganglios basales y dopamina ..................................................3
1.1.3. Histopatología de la EP: pérdida neuronal y cuerpos de Lewy.......................................5
1.2. ETIOLOGÍA DE LA EP..................................................................................................................6
1.2.1. Factores ambientales: casos esporádicos y drogas “parkinsonianas”............................8
1.2.2. La genética de la EP........................................................................................................9
1.2.3. El primer factor genético: el gen PARK1 y la α-SYN.....................................................10
1.2.4. Otros factores genéticos identificados...........................................................................13
1.2.5. Patogénesis: neurodegeneración en la EP ...................................................................16
1.3. MODELOS ANIMALES EN EL CONTEXTO DE LA EP .......................................................................19
1.3.1. Modelos experimentales de parkinsonismo tóxico ........................................................20
1.3.2. Modelos genéticos por manipulación de genes asociados a EP familiar .....................23
1.3.3. Modelo de pérdida de función para la α-syn en ratón ...................................................24
1.3.4. Modelos de ganancia de función para la α-syn en ratón...............................................25
1.4. LA EP Y EL SISTEMA NERVIOSO PERIFÉRICO (SNP) ...................................................................27
1.4.1. Síntomas autonómicos en la EP....................................................................................27
1.4.2. Organización del SNP: división autonómica y sensorial ...............................................32
1.4.3. Desarrollo del sistema nervioso simpático: gangliogénesis, neurotrofismo y señalización
intracelular ...............................................................................................................................34
1.4.4. Otros sistemas catecolaminérgicos: neuronas sensoriales viscerales .........................41
1.4.5. Vulnerabilidad del SNP a drogas “parkinsonianas”.......................................................42
2. OBJETIVOS .................................................................................................................................44
3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................46
3.1. ANIMALES Y TRATAMIENTOS .....................................................................................................47
3.1.1. Animales y condiciones de estabulación.......................................................................47
3.1.2. Genotipado ....................................................................................................................47
3.1.3. Inyección de BrdU .........................................................................................................49
3.1.4. Inyecciones de MPTP....................................................................................................49
3.2. TÉCNICAS DE ANÁLISIS IN VIVO .................................................................................................49
3.2.1. Procesamiento histológico.............................................................................................49
3.2.2. Técnicas inmunohistoquímicas......................................................................................50
3.2.3. Recuentos celulares ......................................................................................................52
3.3. CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS ............................................................................................52
3.3.1. Disección, disociación y sembrado de las células.........................................................52
3.3.2. Tratamientos ..................................................................................................................56
3.3.3. Recuentos de supervivencia neuronal ..........................................................................56
v
3.3.4. Estudios morfométricos .................................................................................................57
3.3.5. Inmunocitoquímica.........................................................................................................57
3.4. CULTIVO DE CÉLULAS PC12 .....................................................................................................58
3.4.1. Mantenimiento y tratamientos........................................................................................58
3.4.2. Ensayos de viabilidad celular ........................................................................................59
3.4.3. Inmunofluorescencia......................................................................................................59
3.5. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS POR WESTERN BLOT.............................................................60
3.5.1. Extracción de proteínas .................................................................................................60
3.5.2. Electroforesis y transferencia ........................................................................................60
3.5.3. Inmunodetección............................................................................................................61
3.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO .............................................................................................................62
4. RESULTADOS .............................................................................................................................63
4.1. ESTUDIO DEL PATRÓN DE EXPRESIÓN DE LA Α-SYN EN EL SNP .................................................64
4.1.1. Marcadores específicos para la α-SYN .........................................................................64
4.1.2. La α-SYN se expresa abundantemente en el sistema sensorial y el simpático............65
4.1.3. La α-SYN se expresa en neuronas postmitóticas .........................................................68
4.2. FENOTIPO IN VIVO DEL SNP DEL MUTANTE DE Α-SYN .................................................................71
4.2.1. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal de la división sensorial del SNP:
complejo petroso-nodoso (NOD) .............................................................................................72
4.2.2. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal de la división simpática del SNP:
ganglio cervical superior (SCG)...............................................................................................73
4.3. FENOTIPO IN VITRO DE LAS NEURONAS PERIFÉRICAS DEL MUTANTE DE Α-SYN..............................75
4.3.1. La α-SYN no modula la morfología o la respuesta neurotrófica de las neuronas
sensoriales en cultivo...............................................................................................................75
4.3.2. La α-SYN no modula la morfología o la respuesta neurotrófica de las neuronas simpáticas
en cultivo ..................................................................................................................................78
4.3.3. La α-SYN modula la vía de supervivencia de las PLCγ1/PKCδ, pero no la de la PI3K/Akt
.................................................................................................................................................84
4.4. ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LA Α-SYN EN APOPTOSIS INDUCIDA EN NEURONAS SIMPÁTICAS ..90
4.4.1. La α-SYN no participa en la apoptosis inducida por daño genético..............................90
4.4.2. La ausencia de α-SYN no modifica la muerte inducida por la droga parkinsoniana MPP+
.................................................................................................................................................92
4.4.3. La sobreexpresión de α-SYN no modifica la muerte inducida por la droga parkinsoniana
MPTP/MPP+ .............................................................................................................................96
4.4.4. Los niveles de α-SYN no modifican la respuesta del sistema simpático a la intoxicación in
vivo con MPTP.........................................................................................................................99
5. DISCUSIÓN................................................................................................................................103
6. CONCLUSIONES.......................................................................................................................117
7. BIBLIOGRAFIA..........................................................................................................................119
vi
ABREVIATURAS
ara-C
citosina arabinósido
BDNF
brain-derived neurotrophic factor o factor neurotrófico derivado de cerebro
BrdU
5-bromo-2-desoxiuridina
COMT
catecol-O-metiltransferasa
DAPI
4’,6-diamino-2-fenilindol
DAT
dopamine transporter o transportador de dopamina
DLB
demencia con cuerpos de Lewy
DMI
desipramina
DMSO
sulfóxido de dimetilo
E
día embrionario
EP
enfermedad de Parkinson
FAP
fallo autonómico primario
LB
Lewy body; cuerpos de Lewy
LRRK2
leucine-rich repeat kinase 2; quinasa con repeticiones ricas en leucina 2
MAO-B
monoaminaoxidasa tipo B
MAPK/ERK
mitogen-activated protein kinase / extracellular signal-regulated kinase
+
MPP
1-metil-4-fenilpiridina
MPTP
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
MSA
multisystem atrophy o atrofia multisistémica
NAT
noradrenalina transporter; transportador de noradrenalina
NGF
nerve growth factor; factor de crecimiento nervioso
NOD
ganglio nodoso
NT-3
neurotrofina 3
6-OHDA
6-hidroxidopamina
P
día posnatal
PI3K
fosfatidil inositol 3’-quinasa
PINK1
PTEN induced putative kinase 1; posible quinasa inducida por PTEN 1
PKC
proteína quinasa C
PKCδ
PKC delta
α-syn
gen alfa-sinucleína (o α-sinucleína)
α-SYN
proteína Alfa-sinucleína
SCG
ganglio cervical superior
SNA
sistema nervioso autonómico
SNC
sistema nervioso central
SNP
sistema nervioso periférico
SNpc
substantia nigra pars compacta
tg+
ratón transgénico que sobreexpresa la α-syn humana bajo el promotor del gen TH
tg-
ratón no transgénico
TH
tirosina hidroxilasa
UCHL1
ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1; esterasa carboxi-terminal de ubicuitina L1
VMAT2
vesicular monoamine transporter 2; transportador de monoaminas vesicular
vii
1. INTRODUCCIÓN
1
Introducción
Las enfermedades neurodegenerativas forman un grupo heterogéneo que incluye desde
enfermedades de tipo esporádico y hereditario, como las de Alzheimer o Parkinson, pasando por
enfermedades puramente hereditarias, como la de Huntington, hasta enfermedades infecciosas
debidas
a
priones.
Estamos
acostumbrados
a
considerar
que
cada
enfermedad
neurodegenerativa afecta a poblaciones neuronales específicas: la corea de Huntington causa la
muerte de las neuronas del núcleo caudado, ocasionando movimientos caóticos, la enfermedad
de Parkinson (EP) destruye neuronas de la substantia nigra (SN) y produce rigidez y temblor,
impidiendo el inicio de los movimientos, la esclerosis lateral amiotrófica daña las neuronas
motoras espinales y corticales y causa debilidad y espasmos, la enfermedad de Alzheimer afecta
al hipocampo y los lóbulos parietales y previene la formación de nuevos recuerdos. Actualmente,
sin embargo, se considera que este concepto, que podríamos llamar de vulnerabilidad selectiva,
aunque operativamente muy útil es, en realidad, una simplificación (Hardy y Gwinn-Hardy, 1998).
Así, los pacientes con corea de Huntington, EP y esclerosis lateral amiotrófica pueden desarrollar
demencia en las fases tardías de la enfermedad, lo que refleja una patología cortical, y los
pacientes con enfermedad de Alzheimer frecuentemente desarrollan parkinsonismo. Por tanto,
se piensa que las enfermedades neurodegenerativas pueden ser generadas por mecanismos
comunes. No hay que olvidar que las enfermedades neurodegenerativas comparten muchos
aspectos en sus manifestaciones más tardías. En todas ellas se producen depósitos anormales
de proteínas y déficit funcionales dramáticos de naturaleza progresiva, debidos a pérdida de
neuronas y a alteraciones sinápticas (Hardy y Gwinn-Hardy, 1998). La aparente selectividad
neuronal sería debida, por tanto, a que cada enfermedad afecta en grado variable a poblaciones
distintas de neuronas a lo largo del tiempo durante el que se desarrolla la enfermedad. La
plasticidad propia del sistema nervioso permitiría una cierta compensación funcional hasta que
se produce una cantidad de daño tan grande que genera un fallo catastrófico, en la población
neuronal más susceptible o afectada. El resultado es que, muchas veces, las enfermedades dan
la apariencia de ser selectivas cuando, de hecho, tienen un efecto global que afecta a distintos
sistemas funcionales en momentos distintos a lo largo de la evolución de la enfermedad.
La forma ideal de combatir estas enfermedades sería conocer con detalle las causas que
las producen y poder detenerlas en sus inicios, antes de que los primeros signos inequívocos de
deterioro se manifiesten. Desgraciadamente, hoy en día, el diagnóstico de estas enfermedades
se produce en fases muy avanzadas de la patología, cuando ya se ha producido la pérdida de
innumerables neuronas. Es, por tanto, importante encontrar procesos comunes a las distintas
enfermedades que puedan proporcionarnos información acerca de cómo se generan estas
neuropatologías en los primeros estadios. Análisis moleculares y genéticos realizados en los
últimos años han descrito la participación de una proteína presináptica, la α-sinucleína (α-SYN),
en la génesis de la EP y posiblemente de otras patologías, colectivamente denominadas αsinucleopatías, constituyéndose en el primer posible elemento molecular común a distintas
enfermedades neurodegenerativas.
2
Introducción
1.1. Características de la enfermedad de Parkinson (EP)
La EP es una enfermedad neurodegenerativa asociada al envejecimiento y caracterizada
por alteraciones motoras severas. Se trata de la segunda enfermedad neurodegenerativa más
común, tras la enfermedad de Alzheimer, y afecta sobre todo a la población de la tercera edad
(prevalencia de 0,6-3,6% en el intervalo de 65-80 años en la población europea). La edad media
de inicio de la enfermedad es 55 años y, entre esta edad y los 70 años, la incidencia aumenta
hasta seis veces (de Lau y Breteler, 2006).
1.1.1. Síntomas clínicos de la EP: hipocinesia
La EP fue descrita originalmente en 1817, cuando el médico británico James Parkinson
publicó una ponencia sobre lo que llamó la “parálisis temblorosa" (reeditado en Parkinson, 2002).
En ese documento, se exponían los síntomas principales de la enfermedad que posteriormente
llevaría su nombre. Los enfermos con EP presentan una sintomatología clínica típica (síntomas
primarios), con disfunciones motoras características que incluyen la dificultad para iniciar el
movimiento (acinesia), movimientos ralentizados (bradicinesia), rigidez muscular, temblor en
reposo e inestabilidad postural. Existen otra serie de síntomas (síntomas secundarios) que
acompañan a los motores, como depresión, cambios y/o problemas emocionales o alteraciones
periféricas autonómicas, que pueden ser variables en su momento de aparición e intensidad
dependiendo de cada individuo.
1.1.2. Fisiopatología de la EP : ganglios basales y dopamina
A principios de la década de 1960 se identificó el defecto cerebral fundamental que causa
los síntomas más característicos de la EP: la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de
la substantia nigra pars compacta (SNpc). La muerte de estas neuronas causa una pérdida de
inervación dopaminérgica en las regiones a las que la SNpc proyecta, los núcleos caudado y
putamen, estructuras implicadas en el control del movimiento. La dopamina es un
neurotransmisor de la familia de las catecolaminas que contribuye a la precisión de los
movimientos y la coordinación de los cambios de postura en los mamíferos por su acción en los
circuitos de los ganglios basales. Los llamados “ganglios basales” comprenden cuatro núcleos
principales: el estriado (núcleos caudado, putamen y accumbens en humanos), el globo pálido
(segmento externo e interno), la SN (parte compacta y reticular) y el núcleo subtalámico. Las
fibras dopaminérgicas que inervan el estriado desde la SNpc establecen contactos sinápticos
3
Introducción
con neuronas GABAérgicas de proyección que poseen receptores para dopamina de tipo D1 o
de tipo D2. La acción de la dopamina sobre estas neuronas depende del tipo de receptor, ya que
la acción sobre receptores D1 causa una despolarización de la neurona postsináptica, mientras
que la interacción del neurotransmisor con receptores D2 causa una inhibición. Las neuronas
estriatales GABAérgicas con receptores D1 y D2 proyectan a núcleos distintos, por lo que las
acciones iniciadas por la dopamina pueden seguir dos caminos distintos, las llamadas “vía
directa” y “vía indirecta” (Figura 1). La vía estriatopalidal directa se inicia con la activación por
dopamina de neuronas del estriado a través de receptores D1; estas neuronas proyectan al
globo pálido interno (GPi) y la SN reticular (SNr), causando una inhibición de las neuronas de
estos núcleos. Las neuronas de estos núcleos también utilizan GABA como neurotransmisor en
sus dianas en el tálamo, por lo que la acción inicial de la dopamina causa una desinhibición
(activación) de las aferencias glutamatérgicas a la corteza motora. En la vía indirecta, las
proyecciones estriatales no se dirigen directamente al GPi y la SNr sino que el globo pálido
externo (GPe) y el núcleo subtalámico (STN) actúan como estaciones de relevo intermedias. Las
neuronas estriatales con receptores D2, inhiben al GPe al recibir la estimulación dopaminérgica.
Éste, a su vez, inhibe al STN cuyas neuronas son excitadoras glutamatérgicas y proyectan al
GPi y a la SNr. En un estado normal, no deficiente en dopamina, está activada la proyección
talámica sobre la corteza motora. En una situación en la que falta dopamina, como en la EP, su
acción sobre ambas vías conduce a una inhibición anormal de dicha proyección, y como
consecuencia, a los trastornos característicos (ver revisión de Lang y Lozano, 1998; Gerfen,
2006).
Figura 1. Vías centrales responsables del control
del movimiento motor. Vías directa e indirecta
señaladas sobre el esquema de una sección sagital
de cerebro de ratón. La corteza cerebral y el tálamo
proporcionan una inervación excitatoria (flechas
verdes) al estriado. Las eferencias de los ganglios
basales se originan del globo pálido medial (GPm) y
la substantia nigra pars reticulata (SNr) dirigiéndose
hacia los núcleos talámicos, que proyectan a áreas
frontales de la corteza cerebral. La vía directa se
origina a partir de las neuronas de proyección
estriatal (puntos azules, neuronas con receptores
D1) cuyos axones (flechas azules) se extienden
hacia los núcleos GPm y SNr. La vía indirecta se
origina a partir de las neuronas estriatopalidales
(rojas, neuronas con receptores D2) cuyos axones
terminan dentro del globo pálido (GP). Las neuronas
del GP proyectan al núcleo subtalámico (STN), que
a su vez proyecta al GPm y SNr. Por tanto, las
neuronas estriatopalidales están conectadas
indirectamente, a través del GP y el STN, con las
eferencias de los ganglios basales. Modificado de
Gerfen, 2006.
4
Introducción
Los síntomas primarios de los síndromes parkinsonianos no aparecen hasta que ha
desaparecido el 50% de las neuronas dopaminérgicas o la dopamina del estriado se ha reducido
en un 75-80%, pudiendo transcurrir entre 10-20 años desde el inicio de la enfermedad hasta su
detección, y de ahí la importancia de realizar un diagnóstico acertado en las etapas iniciales de
la enfermedad (Dunnett y Björklund, 1999). De hecho, clínicamente, cualquier enfermedad que
causa una deficiencia de dopamina en los núcleos caudado/putamen puede causar
“parkinsonismo”, un síndrome caracterizado por temblor en reposo, rigidez, hipocinesia y
acinesia e inestabilidad postural. La EP es la causa más común de parkinsonismo, siendo
responsable del 80% de los casos. Puesto que otras formas de parkinsonismo distintas de la EP
tienen síntomas similares pero requieren tratamientos diferentes, es esencial diagnosticar rápida
e inequívocamente la enfermedad para iniciar el tratamiento adecuado. Actualmente, para
confirmar el diagnóstico en la fase clínica se realiza una tomografía axial computerizada (TAC)
para detectar lesiones típicas en el mesencéfalo. Otra técnica de diagnóstico es la tomografía
por emisión de positrones (PET) con [18F]fluoroDOPA, análogo de la L-DOPA marcado
radiactivamente. La captación de este precursor metabólico de la dopamina es directamente
proporcional al número de terminales sinápticos dopaminérgicos presentes en una zona y, por
tanto, el nivel de señal en el PET da una idea de si se han producido pérdidas de inervación
dopaminérgica al área evaluada. Esta técnica muestra como en los enfermos de Parkinson
existe una reducción de la captación predominantemente en el putamen (ver revisión de Lang y
Lozano, 1998).
1.1.3. Histopatología de la EP: pérdida neuronal y cuerpos de Lewy
Aunque el diagnóstico de la EP en los pacientes se realiza en base a los síntomas
clínicos, la confirmación definitiva requiere la identificación post mortem de las manifestaciones
histopatológicas que definen a esta enfermedad. Los marcadores patológicos de la EP son la
pérdida de neuronas dopaminérgicas de la SNpc y la presencia de inclusiones proteicas
citoplasmáticas intraneuronales, denominadas cuerpos de Lewy (LBs) (Shults, 2006). Las
neuronas de la SNpc contienen, normalmente, cantidades importantes del pigmento
neuromelanina (Marsden, 1983), lo que hace que su pérdida en pacientes con EP se manifieste
como una despigmentación en la zona que ocupan. Las neuronas de este núcleo proyectan
principalmente al putamen, núcleo en el que se produce el mayor déficit en dopamina durante la
enfermedad (Bernheimer et al., 1973). Las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral,
adyacente a la SN, están mucho menos afectadas en la EP y, por tanto, el déficit en dopamina
es menor en el núcleo caudado al que éstas neuronas tegmentales proyectan (Price et al., 1978).
5
Introducción
El análisis post mortem del cerebro de un enfermo de Parkinson revela la presencia de
LBs, así como de neuritas distróficas, conteniendo también acúmulos proteicos, en neuronas de
la SNpc. Los LBs son agregados proteicos citoplasmáticos esféricos y muy eosinófilos en
preparaciones convencionales de anatomía patológica. Están compuestos por diversas
proteínas, incluyendo parkina, ubicuitina y neurofilamentos, aunque el componente mayoritario
es la α-SYN (Spillantini et al., 1998). Miden más de 15 μm de diámetro y tienen una estructura
organizada, con un centro denso hialino y un halo claro. Los análisis mediante microscopía
electrónica muestran que el centro tiene una estructura gránulo-vesicular y que el anillo exterior
está compuesto por fibrillas de 8-10 nm en una configuración radial desde el centro (Duffy y
Tennyson, 1965). Los LBs se encuentran en todas las áreas cerebrales afectadas por la
enfermedad (Forno, 1986; Spillantini et al., 1998), lo que sugiere una relación causal. Aun así,
los LBs no son específicos de la EP ya que pueden encontrarse en pacientes con enfermedad de
Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy (LBD), síndrome de Down, fallo autonómico
progresivo (FAP) y en otras más (Shults, 2006) e, incluso, como una manifestación patológica
incidental en personas de edad avanzada (Gibb y Lees, 1988).
Aunque la neuropatología más característica de la EP es la pérdida de las neuronas
dopaminérgicas, la neurodegeneración afecta también a neuronas noradrenérgicas (locus
coeruleus), serotoninérgicas (núcleo del rafe), colinérgicas (núcleo basal de Meynert, núcleo
dorsal motor del vago), e incluso a neuronas de la corteza cerebral, hipotalámicas, bulbo olfatorio
y sistema nervioso autonómico (ganglios simpáticos, parasimpáticos y sistema nervioso
entérico), en un patrón neurodegenerativo progresivo, que se manifiesta, generalmente, en
estadios avanzados de la enfermedad (Braak et al., 2004; Figura 2). Estas pérdidas neuronales
son responsables de otros síntomas asociados a la EP, como la demencia de las etapas tardías
de la enfermedad o los problemas periféricos que veremos más adelante, entre otros. El hecho
de que la afectación no se restrinja a un solo tipo de neuronas sugiere que a alteraciones
asociadas a la neurodegeneración característica de la EP pueden no estar operando de forma
exclusiva en las neuronas dopaminérgicas de la SNpc, aunque la especificidad de la enfermedad
en sus manifestaciones iniciales indique que las neuronas de este núcleo son especialmente
vulnerables a dichas alteraciones.
1.2. Etiología de la EP
La falta de comprensión de las causas detonantes de esta enfermedad ha hecho que
todavía estemos lejos de un tratamiento eficaz que prevenga el inicio de la enfermedad o que
detenga su progresión. Las causas de la aparición de la enfermedad no están muy claras,
6
Introducción
aunque parece que existen tanto razones ambientales como genéticas. El 90% de los casos de
EP se denominan “idiopáticos” o “esporádicos”, sin un claro componente familiar hereditario
detectable. Para estos casos se ha propuesto normalmente una causa ambiental. El 10% de los
casos están causados por alteraciones en un único gen (Olanow y Tatton, 1999; de Lau y
Breteler, 2006). La identificación de varios de estos genes ha hecho avanzar nuestra
comprensión de los mecanismos implicados en la génesis de esta enfermedad (ver Tabla 1).
Figura 2. Regiones y vías neuroquímicas afectadas por la neurodegeneración asociadas a la EP.
En azul oscuro se muestran los sitios con cambios patológicos en la EP. Las vías afectadas y destinos se
muestran mediante flechas y el color indica el neurotransmisor utilizado tanto en las secciones coronales
como en la sagital (rojo = dopamina, verde = noradrenalina, naranja = serotonina, azul claro =
acetilcolina). La deficiencia en dopamina en la vía nigroestriatal causa los problemas motores clásicos de
la EP. Modificada de Lang y Lozano, 1998.
7
Introducción
1.2.1. Factores ambientales: casos esporádicos y drogas “parkinsonianas”
La hipótesis de que la EP es causada por una toxina ambiental ha sido la dominante hasta
mediados de los años 90 cuando se descubrieron los primeros genes que causan EP familiar.
Existían datos que apoyaban la génesis tóxica de la enfermedad, como eran la existencia de EP
postencefálica, resultante de una infección, o el descubrimiento de que la administración del
compuesto 1-metil-4-fenil-1,2,3,6,-tetrahidropiridina (MPTP) causaba parkinsonismo (Langston y
Ballard, 1983). Así, a principios de los años 80, algunos heroinómanos en California se vieron
expuestos a MPTP, un contaminante no previsto en un procesamiento modificado para la
producción de heroína sintética, y desarrollaron un síndrome clínicamente idéntico a la EP en
pocas semanas (Langston et al., 1983). Según la hipótesis ambiental, fuertemente impulsada por
este suceso, la neurodegeneración asociada a la EP tendría su origen en la exposición a alguna
neurotoxina dopaminérgica. Compuestos parecidos al MPTP en cuanto al mecanismo de acción
son, precisamente, compuestos que son utilizados como herbicidas (paracuato) o como
insecticidas (rotenona). De hecho, los estudios epidemiológicos muestran un mayor riesgo de
sufrir EP en zonas rurales con exposición a herbicidas y pesticidas (Tanner, 1992; Di Monte,
2003). Se ha sugerido la asociación de otras toxinas con el desarrollo de parkinsonismo, como
es el caso, por ejemplo, de ciertos metales (hierro y cobre), cianuro, solventes orgánicos,
monóxido de carbono y disulfuro de carbono (ver Di Monte, 2003). Sin embargo, no se han
encontrado cantidades elevadas ni acúmulos de ninguna de estas toxinas en el cerebro de
pacientes con EP y, cuando se ha observado parkinsonismo asociado a alguno de esos
compuestos, no es el mismo que el que se asocia a la EP.
Otra posibilidad propuesta es que la neurodegeneración asociada a EP sea causada por
una toxina endógena producida por alteraciones en el metabolismo normal, ya sea por
exposición a determinados ambientes o a diferencias genéticas interindividuales. Esta hipótesis
surge de la observación de que las neuronas afectadas primariamente en la EP son las neuronas
dopaminérgicas, neuronas que tienen una carga natural de estrés oxidativo mayor que el de
otras neuronas. El propio metabolismo de la dopamina genera especies reactivas de oxígeno
(ROS) en el citoplasma celular (Cohen, 1984). Debido a su anillo catecol inestable, la dopamina
puede sufrir oxidación espontánea en presencia de oxígeno molecular y agua y entonces
producir peróxido de hidrógeno, superóxido y dopamina-o-quinona. Además de la autooxidación,
la dopamina puede ser desaminada por la monoaminaoxidasa (MAO) y producir ácido
dihidroxifenilacético (DOPAC) y peróxido de hidrógeno, el cual, puede ser convertido en
radicales hidroxilo en presencia de hierro. Los niveles de hierro son especialmente elevados en
las neuronas de la SNpc, por su asociación con la neuromelanina, lo que causa la producción
elevada de iones hidroxilo a través de la llamada reacción de Fenton (Cohen, 1984). Además de
8
Introducción
la reacción de las ROS con el resto de macromoléculas celulares, la dopamina y sus derivados
pueden inhibir el complejo I de la cadena de transporte electrónica mitocondrial. En este sentido,
se ha observado que la SN de enfermos con EP presenta actividad reducida del complejo I
mitocondrial, un aumento de las ROS, que consecuentemente producen daño oxidativo a lípidos,
proteínas o DNA, una mayor concentración de hierro, catalizador de la formación de radicales
hidroxilo a partir del peróxido de hidrógeno, una reducción de los sistemas eliminadores del
peróxido de hidrógeno, más neurotoxinas derivadas del metabolismo de la dopamina en el fluido
cerebroespinal, así como un aumento de los niveles de enzimas detoxificantes como la
superóxido dismutasa (ver revisión de Lotharius y Brundin, 2002).
1.2.2. La genética de la EP
La denominación “esporádico” refleja nuestra incapacidad para reconocer un componente
genético, lo que puede ser debido a la complejidad de la posible base genética. Algunos estudios
han sugerido que ciertos polimorfismos nucleotídicos en diversos loci se encuentran asociados a
una mayor susceptibilidad a padecer EP (Li et al., 2002), incluyendo polimorfismos en los genes
tau (Martin et al., 2001) y APOE (Zareparsi et al., 2002). Aunque en algunos trabajos se había
visto una falta de concordancia para la EP entre gemelos homocigóticos (Tanner et al., 1999),
trabajos posteriores con gran número de casos de EP han mostrado la importancia del
componente genético en la aparición de la enfermedad (Sveinbjornsdottir et al., 2000). Así,
aproximadamente el 10% de los casos de EP son hereditarios y en algunas familias se ha
asociado el padecer la enfermedad con alteraciones en un único gen (ver revisión de Huang et
al., 2004). El interés por estudiar en profundidad los casos monogénicos de la EP radica en que
la mayor parte de los casos familiares de EP tienen características clínicas y patológicas que
solapan de forma considerable con las de los casos esporádicos. Esto indica que comparten
mecanismos patogénicos y, por tanto, la identificación de moléculas cuya alteración activa estos
mecanismos es fundamental para nuestra comprensión de la génesis y evolución de la
enfermedad. Se han identificado, hasta la fecha, seis genes ligados a EP hereditaria (PARK1, 2,
5, 6, 7 y 8). Aunque los productos de estos genes no encajan en una vía patogénica común,
constituyen posibles claves para nuestra comprensión de qué vías moleculares pueden estar
contribuyendo a la degeneración dopaminérgica.
9
Introducción
El primer gen identificado en casos de EP familiar fue alfa-sinucleína (SNCA o PARK1),
que codifica para la proteína Alfa-sinucleína (α-SYN), constituyente mayoritario de los LBs tanto
en casos familiares como esporádicos de la EP (Polymeropoulos et al., 1997). A este le siguieron
genes como los que codifican para parkina (PARK2) (Kitada et al., 1998) y UCHL1 (PARK5)
(Leroy et al., 1998). Las dos proteínas codificadas por ellos participan en la vía ubicuitinaproteosoma. Y más adelante, moléculas como DJ-1 (van Duijn et al., 2001) o PINK1, con
participación en estrés, o quinasas como LRRK2/dardarina (ver Tabla 1), de las que hablaremos
a continuación.
Tabla 1. Loci/genes asociados a EP familiar monogénica
Locus:gen
PARK1 y PARK4: SNCA
(α-sinucleína)
Posición
4q21
Herencia
AD
Inicio
Temprano
Referencia
Polymeropoulos et al., 1997
Singleton et al., 2003
PARK2: parkina
6q25
AR
Juvenil
Kitada et al., 1998
PARK3
2p13
AD
Clásico
Gasser et al., 1998
PARK5: UCHL1
4p14
ND
Clásico
Leroy et al., 1998
PARK6: PINK1
1p35-36
AR
Temprano, lento
Valente et al., 2004
1p36
AR
Temprano, lento
Bonifati et al., 2003
PARK7: DJ-1
12p11.2-q13.1
AD
Clásico
Paisán-Ruíz et al., 2004
PARK10
1p32
ND
Clásico
Hicks et al., 2002
PARK11
2q36-37
ND
Clásico
Pankratz et al., 2003
NA: NR4A2/Nurr1
2q22-23
ND
Clásico
Lee et al., 2003
PARK8: LRRK2
Locus, NA: no asignado. Herencia, AD: autosómica dominante; AR: autosómica recesiva; ND: no determinada.
1.2.3. El primer factor genético: el gen PARK1 y la α-SYN
En 1997, Polymeropoulos y colaboradores identificaron una mutación dominante en el gen
SNCA, o α-syn como lo denominaremos en este trabajo, que codifica para la α-SYN en un grupo
de familias de ancestro griego o siciliano. Esta primera mutación identificada consistía en la
sustitución aminoacídica A53T. Después de ésta, se identificaron dos mutaciones adicionales:
A30P en un grupo de familias alemanas (Kruger et al., 1998) y E46K en familias españolas
(Zarranz et al., 2004). El cambio puntual y el modo de herencia autosómica dominante sugieren
que la patología se produce por una ganancia de función de la forma mutada. La patología
muestra que, en todos los casos, se produce pérdida de neuronas nigrales y presencia de LBs,
aunque también se observan depósitos de α-SYN en otras zonas cerebrales. Además de las
mutaciones puntuales en el gen de la α-syn, se ha visto que un aumento en el número de copias
del gen, por duplicación (Chartier-Harlin et al., 2004; Ibáñez et al., 2004) o triplicación (Bradbury,
10
Introducción
2003; Singleton et al., 2003; Farrer et al., 2004; Singleton et al., 2004) producen EP familiar.
Además, polimorfismos en el promotor del gen α-syn que producen aumento en la expresión de
α-SYN se asocian a EP esporádico (Farrer et al., 2001; Touchman et al., 2001; Chiba-Falek et
al., 2003). Estos datos sugieren que aumentos en los niveles de α-SYN, incluso cuando ésta es
normal, son también deletéreos. Otra de las razones que relacionan la α-SYN con la EP es que
es el componente proteico mayoritario de los LBs (Spillantini et al., 1997; Wakabayashi et al.,
1997), en los que adopta una conformación en hoja β-plegada, uniéndose a otras proteínas
como sinfilina 1 (Wakabayashi et al., 2000), parkina (Schlossmacher et al., 2002) o la chaperona
14-3-3 (Kawamoto et al., 2002), entre otras.
La α-SYN es una proteína pequeña, de 140 aminoácidos, codificada por un gen que se
localiza en el cromosoma 4q22.1 (Chen et al., 1995). Pertenece a la familia de las sinucleínas,
junto con otras proteínas como la β-sinucleína (β-SYN) y la γ-sinucleína (γ-SYN), que se
localizan en los cromosomas 5 y 10 respectivamente. Estructuralmente, la α-SYN presenta tres
zonas bien diferenciadas o dominios (ver Figura 3). En primer lugar, la región N-terminal es la
más conservada en la familia y se denomina dominio de homología 14-3-3, presentando una
serie de repeticiones de 11 aminoácidos, homólogas y degeneradas. En el caso de la α-SYN
presenta siete de estas repeticiones con una secuencia central consenso KTKEGV. Esta región
de la molécula media su unión a lípidos y la dimerización. En segundo lugar, se encuentra la
región más hidrofóbica de la proteína, entre los residuos 61-95, que corresponde a la secuencia
peptídica NAC. Este dominio, se identificó como el componente no amiloide de las placas seniles
presentes en los enfermos de Alzheimer (Uéda et al., 1993). Por último, el extremo carboxilo
tiene un alto grado de residuos acídicos. Respecto a su estructura conformacional, en su forma
soluble, como monómero, la proteína se encuentra desplegada en su forma nativa (Weinreb et
al., 1996), pero puede formar oligómeros en los que se dispone como hélice α, estabilizada con
hojas β, y más estructurada cuando se une a lípidos (Chandra et al., 2003) tal como sucede en
vesículas sinápticas o mitocondrias (Conway et al., 2000), o bien sufrir una transición estructural
a hoja β, tal y como se encuentra en los LBs.
La α-SYN había sido identificada inicialmente en rastreos independientes para: 1)
proteínas enriquecidas en terminales sinápticos en la raya eléctrica Torpedo californica
(Maroteaux et al., 1988), 2) moléculas reguladas durante la reorganización de los núcleos del
canto en las aves canoras -sinelfina- (George et al., 1995), 3) precursor del componente no
amiloide (NACP) de las placas seniles características de la enfermedad de Alzheimer (Uéda et
al., 1993). Tras la identificación en la raya eléctrica, se utilizó su cDNA para identificar y aislar en
rata una proteína de 140 aminoácidos (Alfa-sinucleína). El producto del gen de la β-syn se aisló
como una fosfoproteína específica y enriquecida en terminales sinápticos de cerebro en bovinos
11
Introducción
y presente en rata y humano (PNP-14, “PhosphoNeuroProtein-14 kDa”) (Nakajo et al., 1990,
1993). Fue en 1994 cuando Jakes et al. describieron las similitudes entre dos de estas
secuencias proteicas en humanos, una equivalente a NAC y la sinucleína de rata de Maroteaux,
y la otra similar a la PNP-14; por el reconocimiento de estas similitudes y precedentes, se sugirió
los nombre de α- y β-sinucleína. La proteína α-SYN está muy conservada en vertebrados y en
particular en mamíferos siendo la homología aminoacídica entre la proteína humana y la murina
de más de un 95% (Clayton y George, 1998). Aunque la denominación de la proteína codificada
por el gen de la α-syn es Alfa-sinucleína, utilizaremos la abreviatura de α-SYN en el presente
trabajo. Por su conservación proteica entre especies y abundante expresión en el cerebro se le
supone un papel biológico importante en neuronas. Su denominación de α-sinucleína obedece a
la observación inicial de que parecía localizarse en los terminales nerviosos presinápticos y en la
envoltura nuclear neuronal (Maroteaux et al., 1988; Maroteaux y Scheller, 1991). Se sabe que
interacciona con membranas lipídicas y, dada la localización específica, asociada principalmente
a las vesículas sinápticas de los terminales nerviosos del cerebro (Uéda et al., 1993; Iwai et al.,
1995), se le propone una función sináptica. El producto del gen ortólogo de la α-syn en pájaro
pinzón, la sinelfina, también se localiza en terminales sinápticos y su distribución durante la
remodelación de los núcleos del canto sugiere la participación de esta proteína en procesos de
plasticidad neuronal y consecuentemente de aprendizaje (George et al., 1995). Recientemente
se ha visto que la sobreexpresión de α-SYN afecta el tráfico vesicular entre el retículo
endoplasmático y el aparato de Golgi y, Rab1, pequeña GTPasa que controla el tráfico vesicular
entre estos dos compartimentos, es capaz de rescatar de la pérdida neuronal producida en
modelos de EP por sobreexpresión de α-SYN (Cooper et al., 2006). Sin embargo, la función de
mutaciones
A3
0
E4 P
6K
A5
3T
la α-SYN es todavía bastante desconocida.
NH2-
-COOH
repeticiones KTKEGV imperfectas
71
agregación
82
hidrofóbico:
promueve
cola ácida
120
140
C-terminal:
reduce
Figura 3. Estructura de la proteína α-SYN. Se muestran los dominios estructurales,
así como la localización de los cambios aminoacídicos únicos que causan EP.
También se señalan aquellas zonas que propician o reducen la capacidad de
autoagregación. Adaptado de Cookson, 2005.
12
Introducción
El patrón de expresión de la α-SYN en cerebros adultos está relativamente bien
caracterizado. El RNA mensajero (mRNA) se detecta en múltiples poblaciones neuronales, con
niveles muy abundantes en áreas como la amígdala, el hipocampo y la substantia nigra (Li et al.,
2002). La señal inmunocitoquímica de la proteína α-SYN, por otro lado, se concentra en los
terminales presinápticos, como muestra el característico marcaje en forma de puncta, similar al
de proteínas de localización exclusivamente sináptica (Iwai et al., 1995; Irizarry et al., 1996;
Murphy et al., 2000), lo que sugiere un rápido transporte de la proteína hacia las porciones más
distales del axón. A nivel de microscopía electrónica se ha observado que el inmunomarcaje
para α-SYN en los terminales presinápticos del SNC es citosólico y/o asociado a vesículas
sinápticas (Iwai et al., 1995; Irizarry et al., 1996; Murphy et al., 2000). Aunque el patrón de
expresión de la α-SYN durante el desarrollo está menos caracterizado, sí se ha observado que
aparece pronto en el desarrollo del cerebro de mamíferos, tanto de humanos como de roedores,
aunque sólo en un número muy restringido de áreas, y que va aumentando en estadios
posteriores. La expresión de α-SYN durante la embriogénesis también se restringe a las
poblaciones neuronales pero, a diferencia de lo que ocurre en el cerebro adulto, la proteína se
encuentra tanto en los somas como en las proyecciones de las neuronas que la expresan (Hsu
et al., 1998; Petersen et al., 1999; Baltic et al., 2004).
En cuanto al SNP, inmunotinciones en ganglios sensoriales espinales de ratones, ratas y
humanos adultos han mostrado que los somas de las neuronas sensoriales primarias de
roedores, pero no de humanos, expresan niveles abundantes de α-SYN (Giasson et al., 2001).
Durante el desarrollo embrionario sólo se ha estudiado la expresión del mRNA de la α-SYN en
ganglios espinales de pollo, mediante hibridación in situ (Tiunova et al., 2000). Sólo en el caso de
la γ-SYN se ha descrito expresión abundante en ganglios simpáticos y sensoriales de ratón
(Ninkina et al., 2003).
1.2.4. Otros factores genéticos identificados
Aparte del locus PARK1, se han descrito diversos loci, algunos cuya naturaleza génica ya
ha sido identificada, asociados a EP familiar (Tabla 1). La parkina es una proteína de 465
aminoácidos con actividad ubicuitina ligasa (E3) que pertenece a la familia RBR de ubicuitina
ligasas, caracterizadas por transferir moléculas de ubicuitina desde una proteína conjugadora de
ubicuitina (E2) a una proteína específica, lo que la dirige hacia su degradación por el proteosoma
(Shimura et al., 2000; Zhang et al., 2000). Las mutaciones detectadas en el gen que codifica
para la parkina causan EP juvenil, antes de los 30 años (Kitada et al., 1998; Mizuno et al., 2001).
La condición heterocigótica también causa disfunción dopaminérgica y EP pero con un inicio más
13
Introducción
tardío (Hedrich et al., 2002; Hilker et al., 2002). Las mutaciones identificadas hasta la fecha
representan el 50% de los casos de EP autosómica recesiva y son todas ellas de falta de
función, sugiriendo que la activación deficiente del sistema de degradación de proteínas está
implicada en la génesis de la enfermedad (Lücking et al., 2000, 2003). La EP causada por falta
de parkina presenta la característica pérdida de neuronas de la SNpc, pero no suele presentar
LBs (Mizuno et al., 2001). Aunque de expresión bastante generalizada, parkina se expresa
abundantemente en el cerebro (Shimura et al., 1999; Solano et al., 2000) y se encuentra también
en los LBs en casos de EP esporádica (Schlossmacher et al., 2002). En mamíferos, parkina se
localiza principalmente en el citoplasma de células postmitóticas, aunque una fracción se asocia
con la membrana mitocondrial externa (Darios et al., 2003). Sustratos específicos de esta
proteína son, por ejemplo, la propia parkina, una variante o-glicosilada de la α-SYN, PAEL-R, un
receptor del retículo endoplasmático rugoso similar a la endotelina, y tau (Imai et al., 2001;
Shimura et al., 2001).
La esterasa carboxilo-terminal de ubicuitina L1 (UCHL1), también conocida como PGP
9.5), es una de las proteínas más abundantes del cerebro, representando el 1 o 2% del
contenido proteico total (Wilkinson et al., 1989). Pertenece a una familia de enzimas con
actividad ubicuitina hidrolasa en el extremo carboxilo, que recicla la ubicuitina utilizada por el
sistema de degradación ubicuitina-proteosoma. Posee, además, una actividad ubicuitina ligasa
dependiente de dimerización. La expresión de esta proteína es altamente específica de neuronas
y de células del sistema neuroendocrino difuso (Doran et al., 1983) y se encuentra en los LBs y
otros agregados proteicos (Wilkinson et al., 1989). Su relación con la EP se descubrió al
encontrarse, en dos hermanos con EP con herencia autosómica dominante, una mutación de
cambio de sentido (I93M) responsable de una disminución del 50% en la actividad de UCHL1
(Leroy et al., 1998). Posteriormente se encontró un nuevo polimorfismo (S18Y), muy frecuente
en poblaciones orientales, que protege frente al riesgo de padecer EP de un modo dependiente
de la dosis alélica (Maraganore et al., 1999). Los niveles de UCHL1 se encuentran disminuidos
en los cerebros de pacientes con EP o Alzheimer (Choi et al., 2004). Aunque todos estos
trabajos relacionan la mutación de este gen con el riesgo de padecer EP, existe cierta
controversia sobre si UCHL1 es realmente un gen implicado en la EP (Maraganore et al., 2004;
Healy et al., 2006).
La implicación de parkina y posiblemente de UCHL1 en EP sugiere que la etiología de la
enfermedad pueda tener algo que ver con un funcionamiento anómalo de la degradación de
algunas proteínas, quizá de α-SYN, entre otras.
14
Introducción
Aunque los estudios ambientales sugerían que parte de la neurodegeneración
dopaminérgica se podía explicar por disfunción mitocondrial y estrés oxidativo, pronto se
encontró que la mutación en ciertos genes conducía a un daño similar y al riesgo de padecer EP.
DJ-1, producto del gen PARK7 o DJ-1, parece formar parte de un mecanismo de respuesta a
estrés oxidativo (Yokota et al., 2003; Shendelman et al., 2004; Taira et al., 2004), actuando como
chaperona en respuesta al aumento de ROS. Mutaciones en PARK7 han sido identificadas como
causantes de EP juvenil (Bonifati et al., 2003). Existen varias mutaciones descritas en este gen,
que juntas explican el 1% de los casos de EP juvenil (Abou-Sleiman et al., 2003; Hague et al.,
2003). DJ-1 es una proteína de 189 aminoácidos de expresión ubicua en todo el cerebro, siendo
más fuerte en aquellas regiones normalmente afectadas en la EP (Bonifati et al., 2003), y
localizada tanto en neuronas (Rizzu et al., 2004) como en astrocitos (Bandopadhyay et al.,
2004). A diferencia de la α-SYN y la parkina, DJ-1 no es un componente esencial de los LBs
(Bandopadhyay et al., 2004), aunque se encuentra en asociación con inclusiones intraneuronales
formadas por la proteína asociada a los microtúbulos, tau (Neumann et al., 2004; Rizzu et al.,
2004). Aunque se localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma y en terminales
presinápticos, cuando se oxida se localiza en la mitocondria, lo que parece contribuir a su posible
papel neuroprotector (Canet-Avilés et al., 2004). La actividad de DJ-1 parece evitar la formación
de agregados proteicos y, más concretamente, de protofibrillas de α-SYN (Shendelman et al.,
2004) con la cual se ha visto que interacciona (Meulener et al., 2005). DJ-1 interacciona con
parkina en situaciones de estrés oxidativo lo que podría proporcionar un vínculo entre
degradación de proteínas y ROS (Moore et al., 2005). De forma similar, el producto de PARK6,
PINK1 (PTEN-induced kinase 1) es también una proteína mitocondrial que parece proteger a las
células frente a la disfunción respiratoria (Valente et al., 2004). Mutaciones en el gen PINK1 han
sido asociadas con parkinsonismo recesivo (Hatano et al., 2004; Valente et al., 2004). PINK1,
junto con DJ-1 y PARK2, son los tres genes recesivos autosómicos asociados a la EP hereditaria
cuyo patrón fenotípico de la enfermedad es bastante similar para las tres mutaciones. Aunque se
desconoce la función de PINK1 y el gen se transcribe de manera ubicua (Unoki y Nakamura,
2001), se piensa que tiene una función importante en fosforilación mitocondrial ya que 11 de las
14 mutaciones descritas se localizan en el dominio quinasa de PINK1 (Hatano et al., 2004;
Valente et al., 2004). Así, la fosforilación alterada de proteínas diana en la mitocondria puede
representar un mecanismo patogénico, que conduce a un estrés anormal y neurodegeneración.
Otra quinasa recientemente implicada en la etiología de la EP es el producto del gen
LRRK2. Se trata de una proteína citoplasmática de 286 kDa que se expresa abundantemente en
el cerebro (Ross y Farrer, 2005) y con función desconocida. Mutaciones en el gen LRRK2
(PARK8), en particular la G2019S, producen EP de manera autosómica dominante (Paisán-Ruíz
et al., 2004; Zimprich et al., 2004), siendo ésta la mutación más frecuente tanto en la EP familiar
15
Introducción
como en la esporádica. Dicha mutación cambia un residuo de glicina altamente conservado al
principio del segmento de activación quinasa. Existen diversos trabajos que apoyan la idea de
que los efectos dominantes de esta mutación se deben a la hiperactividad de la proteína y no a
una pérdida de función y haploinsuficiencia (ver Marín, 2006). LRRK2 es un miembro de la
familia de proteínas Roco y parece tener múltiples funciones. Entre estas funciones se incluye un
dominio característico de esta familia denominado Roc, parecido a GTPasas pequeñas de la
superfamilia Ras. El otro dominio característico se denomina COR de función desconocida.
Además de estos dominios, existen otros como las repeticiones ricas en leucinas o el dominio
quinasa. El motivo rico en leucinas puede tener una variedad de funciones incluyendo
interacciones proteína/proteína y unión a sustrato para ubicuitinación. Se desconocen las
funciones del dominio GTPasa y quinasa. En los cerebros provenientes de pacientes con EP con
la mutación en LRRK2 se ha demostrado tanto pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNpc
y/o presencia de ovillos neurofibrilares, depósitos de tau anormales, y sinucleinopatía con LBs
(revisado en Taylor et al., 2006). Aunque LRRK2 interacciona con parkina (Smith et al., 2005), se
desconocen los sustratos que fosforilan/interaccionan tanto con PINK1 como con LRRK2 y su
implicación en la neurodegeneración.
En la siguiente tabla (Tabla 2) se resumen las moléculas que se han visto asociadas a la
EP hereditaria y su función biológica.
Tabla 2. Función biológica de moléculas asociadas a EP hereditario
Locus
proteína
Función biológica
PARK1
α-SYN
Tráfico vesicular entre retículo
endoplasmático y aparato de Golgi;
y entre compartimentos sinápticos
PARK2
parkina
Ubicuitina ligasa (E3)
Esterasa carboxilo-terminal de
ubicuitina L1
Proteína quinasa mitocondrial,
estrés oxidativo?
PARK5
UCHL1
PARK6
PINK1
PARK7
DJ-1
Respuesta a estrés oxidativo?
PARK8
LRRK2
Proteína quinasa
1.2.5. Patogénesis: neurodegeneración en la EP
Existe controversia acerca del modo de muerte neuronal que se produce en la EP (ver Vila
y Przedborski, 2003). El problema principal es que en las muestras humanas procedentes de
autopsia muchas de las neuronas afectadas ya han muerto. Sí existen, sin embargo, evidencias
de que marcadores biológicos del proceso de apoptosis (Bax, Bcl-XL, caspasa-3, -8 y -9)
16
Introducción
aparecen alterados en muestras post mortem de EP (Hartmann y Hirsch, 2001; Tatton et al.,
2003). En los modelos experimentales de parkinsonismo tóxico sí se ha demostrado la
participación de procesos apoptóticos (Tatton y Kish, 1997; Vila et al., 2001), pero también de
otras formas de muerte neuronal, como es el caso de la autofagia (Stefanis et al., 2001; GómezSantos et al., 2003) o la necrosis (Jackson-Lewis et al., 1995). De todas formas, incluso si
admitimos un proceso apoptótico para explicar toda la pérdida neuronal, estamos lejos de
conocer los mecanismos que inducen dicho proceso en las neuronas dopaminérgicas. Aunque
se desconoce cuáles son estos mecanismos que producen la neurodegeneración, las dos
hipótesis más aceptadas actualmente son: 1) plegamiento anómalo de proteínas que conduce a
su agregación patológica y 2) estrés oxidativo por disfunción mitocondrial, o incluso una
combinación de ambas.
La deposición anormal de proteínas en neuronas del SNC es una característica común a
prácticamente todas las enfermedades neurodegenerativas (ver, por ejemplo Ross, 1997), por lo
que, aunque el tipo, localización y componentes de los agregados varía de una a otra
enfermedad, su presencia correlaciona con la disfunción neuronal. Si las células son incapaces
de activar suficientemente sus sistemas de chaperonas, implicadas en el replegamiento, o sus
sistemas de degradación proteica, entonces se produciría el acúmulo de las proteínas nocivas.
En este contexto, la relación con el envejecimiento podría fundamentarse en el hecho de que,
con la edad, disminuye la capacidad de las neuronas de inducir ciertas chaperonas y la
capacidad de degradación por proteosoma (Sherman y Goldberg, 2001). Con este argumento se
podría pensar que los agregados son tóxicos y causan daño celular directamente, por ejemplo
interfiriendo con el tráfico intracelular, o indirectamente, secuestrando proteínas que son
importantes para la supervivencia neuronal. Pero, de ser así, debería detectarse una correlación
directa entre la formación de inclusiones y la neurodegeneración aunque las evidencias más
recientes, sobre todo en el caso de la enfermedad de Huntington (ver revisión de Bates, 2003),
sugieren que éste no es el caso. Por el contrario, se podría pensar en las inclusiones
citoplasmáticas como un intento, por parte de la célula, de secuestrar moléculas mal plegadas
que puedan ser tóxicas (ver revisión de Kopito, 2000).
Las mutaciones patogénicas asociadas a EP familiar parecen causar la presencia y/o
acumulación de proteínas con conformación anormal y, posiblemente, tóxica. Este es el caso de
las mutaciones en los genes α-syn, parkina y UCHL1. La α-SYN parece ser propensa a la
agregación, algo bastante sorprendente si se tiene en cuenta que la proteína nativa carece de
estructura conformacional y está desplegada. La porción central hidrofóbica, cerca de los
dominios repetidos, y ausente en la β-SYN, tiende a la autoasociación, contribuyendo a la
agregación de la molécula (Giasson et al., 2001; Cookson, 2005). In vitro, la α-SYN puede formar
17
Introducción
fibrillas, lo que sugiere que esta molécula es suficiente por sí sola para formar inclusiones
(Uversky, 2003) e induce su propia fibrilización y la de tau, tanto in vitro como in vivo (Giasson et
al., 2003). Sin embargo, y a pesar de la presencia de esta molécula en los LBs, se desconoce
todavía la relación entre alteraciones en α-SYN y el inicio de la EP. Aunque la mutación A53T
acelera la formación de fibrillas in vitro, la A30P no la favorece, sino que promueve tan sólo la
formación de oligómeros (Giasson et al., 1999; Conway et al., 2000) y la α-SYN oligomérica se
deposita en fracciones relativamente insolubles de tejido cerebral de pacientes con la triplicación
génica (Miller et al., 2004). En general, y aunque todavía en debate, se considera que, muy
posiblemente, sean las formas oligoméricas de α-SYN las más tóxicas (ver revisión de Cookson,
2005) y no las fibrillas, por lo que sería la agregación de α-SYN, y no los LBs en sí mismos, lo
que causaría la patología y el daño celular.
Además de la agregación proteica, agresiones tóxicas o mutaciones en ciertos genes (DJ1/PINK1) podrían causar la misma situación, por ejemplo, mediante el daño molecular producido
por ROS, que oxidan de forma anormal a las macromoléculas celulares, incluidas las proteínas.
El descubrimiento de que el MPTP bloquea la cadena de transporte electrónico, al inhibir el
complejo I mitocondrial (Nicklas et al., 1987), o la observación de actividad anómala del complejo
I en muestras de enfermos con EP (ver Greenamyre et al., 2001), sugiere la posibilidad de que
defectos en fosforilación oxidativa jueguen un papel en la patogenia de la EP. En la SNpc de los
pacientes de EP se encuentran elevados los niveles de varios marcadores biológicos de daño
oxidativo (ver Przedborski y Jackson-Lewis, 1998), daño que puede verse generado y/o
aumentado por el propio metabolismo de la dopamina (ver apartado 1.2.1.). Asimismo, el estrés
oxidativo global puede contribuir a un aumento de proteínas anómalas en las neuronas. En este
sentido, se encuentra tanto que herbicidas y pesticidas causan el plegamiento anómalo y/o la
agregación de la α-SYN (Uversky et al., 2001; Lee et al., 2002; Manning-Bog et al., 2002), y que
la α-SYN de los LBs presenta modificaciones oxidativas anormales (Giasson et al., 2000).
El conocimiento de qué conformación de la α-SYN es la más tóxica, el papel de los
agregados y el estrés oxidativo en la toxicidad neuronal ayudarán en el diseño de posibles
terapias basadas en estrategias antiagregación o antioxidación. En cualquier caso, y aunque el
debate acerca de la patogenia en esta enfermedad está todavía abierto, se podría plantear un
esquema similar al que se muestra en la Figura 4.
18
Introducción
α-SYN
mutación
DJ-1
PINK1
toxinas
ambientales
metabolismo
de dopamina
otras proteínas
proteínas mal plegadas
parkina
estrés
oxidativo
UCHL1
proteosoma
(degradación)
toxicidad
supervivencia
neuronal
Figura 4. Esquema que propone una interrelación entre posibles procesos
celulares implicados en la etiopatogenia de la EP y las moléculas asociadas a
EP familiar. Adaptado de Marín y Vallejo, 2005.
1.3. Modelos animales en el contexto de la EP
Existen diversas aproximaciones al estudio experimental de la EP pero, como en cualquier
patología humana, lo ideal es poder disponer de un modelo animal en el que se reproduzcan los
síntomas de la enfermedad, para poder investigar los mecanismos subyacentes. Además, los
modelos animales proporcionan un sustrato para el ensayo de posibles aproximaciones
terapéuticas. En el contexto de la EP se ha intentado generar diferentes modelos animales, tanto
genéticos como farmacológicos, para reproducir en mayor o menor medida la histopatología y/o
sintomatología motora de los enfermos de EP. La generación de estos modelos se ha basado
tanto en el uso de tóxicos parkinsonianos como en la modificación genética experimental de
genes asociados a EP familiar en diversos organismos. Aún así, hoy día no existe un modelo
perfecto, dado que cada modelo reproduce alguno o varios de los aspectos de la EP, desde
acúmulos proteicos citoplásmicos, hasta la afectación de las neuronas dopaminérgicas, su
liberación dopaminérgica o incluso su muerte, sin abarcarla completamente (ver, por ejemplo,
Pérez-Sánchez et al., 2002; Marín y Vallejo, 2005).
19
Introducción
1.3.1. Modelos experimentales de parkinsonismo tóxico
Los modelos farmacológicos pretenden, por un lado, conocer qué factores ambientales
pueden reproducir el fenotipo de la EP, y por otro lado, conocer los mecanismos moleculares por
los que dicho fenotipo se produce. Estos modelos se basan en el uso de toxinas específicas de
los sistemas catecolaminérgicos (Betarbet et al., 2002). Entre las neurotoxinas que producen
neurodegeneración dopaminérgica en modelos animales se encuentra la 6-hidroxidopamina (6OHDA), el MPTP y, más recientemente, el paracuato, la rotenona o el maneb. Todas estas
toxinas, excepto el maneb que inhibe al complejo III de la cadena de transporte electrónico,
inhiben al complejo I y consecuentemente conducen a la formación de ROS (ver revisión de
Schober, 2004). Sin embargo, sólo el MPTP está claramente ligado a una forma de
parkinsonismo humano y, por tanto, su empleo en primates ha constituido el modelo más valioso
hasta la fecha. Aunque muy utilizados e intensamente explorados, hay que tener en cuenta que
el carácter agudo de los efectos de la mayoría de estos neurotóxicos difiere de la lenta
progresión de una enfermedad neurodegenerativa como la EP.
El mejor modelo farmacológico lo constituyen los monos tratados con MPTP. En primates
como humanos, monos o babuinos, el MPTP causa síntomas parkinsonianos graves e
irreversibles, indistinguibles de los de la EP esporádica, con degeneración de las neuronas
dopaminérgicas de la SNpc y con algunos agregados de α-SYN (ver Kitamura et al., 2000). En
primates no humanos, tras la administración de dosis subcrónicas de MPTP, se observan
inclusiones intraneuronales eosinófilas que recuerdan a los LBs (Forno et al., 1986). Sin
embargo, la susceptibilidad frente al MPTP fuera del grupo de los primates varía dependiendo de
la especie, de la cepa e incluso de la edad y/o sexo del individuo (Sundstrom y Samuelsson,
1997). Así, por ejemplo, las ratas no son vulnerables al MPTP y, entre los ratones, hay cepas
sensibles (DBA, C57Bl6) y cepas en las que este tóxico produce alteraciones en los niveles de
dopamina pero no causa la muerte de las neuronas dopaminérgicas (Sonsalla y Heikkila, 1986;
Sundstrom et al., 1987; German et al., 1996). Tampoco se ha descrito la formación de LB en
ratones tratados con MPTP (Hirsch et al., 2003).
El MPTP administrado sistemáticamente atraviesa la barrera hematoencefálica y es
transformado en el metabolito tóxico activo, MPP+, por la monoaminaoxidasa tipo B (MAO-B) en
el interior de los astrocitos o de las neuronas serotoninérgicas (Chiba et al., 1984; Javitch y
Snyder, 1984; Mayer et al., 1986). Se desconoce todavía cómo es captado por los astrocitos y
cómo el MPP+ accede al espacio extracelular, pero sí se sabe que la especificidad de este
neurotóxico por neuronas catecolaminérgicas es debida a que el MPP+ utiliza específicamente
los transportadores de catecolaminas (Javitch et al., 1985), el transportador de dopamina (DAT)
20
Introducción
en neuronas dopaminérgicas y el transportador de noradrenalina (NAT) en neuronas
noradrenérgicas. Una vez en el citoplasma, el MPP+ accede al interior de las mitocondrias de
forma aún desconocida, pero dependiente de energía, donde inhibe a la NADH coenzima Q10
reductasa del complejo I de la cadena transportadora de electrones, produciendo una
disminución en los niveles de ATP y un incremento en radicales libres que aumentan el nivel de
estrés oxidativo (Przedborski et al., 2004). Parte del MPP+ accede al interior de las vesículas
sinápticas a través del transportador de monoaminas vesicular (VMAT2), donde supuestamente
es destruido en el ambiente ácido de las mismas (Javitch et al., 1985; Bezard et al., 1999; ver
Figura 5).
La 6-OHDA fue el primer neurotóxico descubierto con acción específica sobre las
neuronas catecolaminérgicas centrales, bien aplicado in vitro bien inyectado directamente al
cerebro, por su imposibilidad de atravesar la barrera hematoencefálica. Su inyección sistémica
produce simpatectomía química al dañar el sistema nervioso periférico (Jonsson, 1983). Su
toxicidad resulta muy específica de neuronas dopaminérgicas dada su similitud estructural con la
dopamina, y la consiguiente entrada por los mismos transportadores, aunque no altera otras
áreas que generalmente se ven afectadas en los enfermos de EP (Luthman et al., 1989; Betarbet
et al., 2002; Del Tredici et al., 2002; Figura 5). Respecto a su modo de acción, una vez en el
interior de la neurona, la 6-OHDA inhibe el complejo I de la cadena mitocondrial y produce,
además, estrés oxidativo adicional derivado del propio metabolismo y autooxidación de la
molécula igual que sucede con la dopamina endógena (Cleeter et al., 1992; Jeon et al., 1995;
Betarbet et al., 2002). Entre los inconvenientes que presenta el modelo tóxico experimental con
6-OHDA está el que no reproduce alguno de los síntomas característicos de la EP como los LBs
(Andrew et al., 1993). Por otro lado, el daño que produce suele ser agudo, a diferencia de lo que
sucede con la progresión de la EP en humanos, y el efecto puede ser bastante variable y, por
tanto, su interpretación delicada (ver revisiones de Blum et al., 2001; Schober, 2004; Bové et al.,
2005).
La rotenona es un compuesto natural que se utiliza como insecticida y que cruza la
membrana celular libremente acumulándose en los orgánulos de la célula como la mitocondria,
donde interfiere en la fosforilación oxidativa al inhibir el complejo I de la cadena transportadora
de electrones (Schuler y Casida, 2001; Figura 5). Aunque los primeros modelos animales en rata
no resultaron específicos, cambios específicos en las dosis y tiempos de exposición condujeron
a protocolos con los que se obtienen alteraciones específicamente en neuronas dopaminérgicas,
aparición de inclusiones fibrilares citoplásmicas similares a los LBs y activación de la caspasa 3
(Betarbet et al., 2000; Alam y Schmidth, 2002; Hoglinger et al., 2003; Sherer et al., 2003).
21
Introducción
Recientemente se ha puesto a punto el uso de la rotenona en Drosophila melanogaster en la que
produce síntomas motores (Coulom y Birman, 2004). Aunque in vitro la rotenona produce
acumulación y agregación de la α-SYN, daño oxidativo progresivo y una muerte dependiente de
caspasas (Sherer et al., 2002), no se ha observado la presencia de LBs, aunque sí de
inclusiones proteicas en algunas neuronas dopaminérgicas residuales (Betarbet et al., 2000;
Hoglinger et al., 2003; Sherer et al., 2003). No obstante, no se entiende el daño específico a las
neuronas dopaminérgicas cuando se trata de una sustancia lipofílica que difundiría por igual por
todo el cerebro y que causa una inhibición uniforme del complejo I mitocondrial (Betarbet et al.,
2000)
Dada la semejanza estructural entre el MPTP/MPP+ con ciertos pesticidas como el
paracuato (Barbeau et al., 1985), se han expuesto roedores a este herbicida (Liou et al., 1996;
Brooks et al., 1999). Existen evidencias de que el paracuato puede atravesar la barrera
hematoencefálica a través de un sistema activo como el transportador de aminoácidos neutros
(Shimizu et al., 2001; McCormack y Di Monte, 2003). Al igual que sucedió con la rotenona, los
primeros modelos no lograron reproducir ninguna respuesta neuropatológica típica de la EP,
pero finalmente consiguieron que el modelo empleando paracuato produjera agregados
intraneuronales de α-SYN y fibrillas amiloides, además de la muerte selectiva de las neuronas
dopaminérgicas (Thiruchelvam et al., 2000; McCormack et al., 2002).
+
Figura 5. Modo de acción de neurotóxicos (MPP , 6OHDA, rotenona) sobre la neurona dopaminérgica. Las
neurotoxinas producen disfunción mitocondrial y daño
+
oxidativo. La 6-OHDA y el MPP entran a través del DAT, la
rotenona entra por difusión pasiva. Los tres producen un
+
aumento de radicales libres. Tanto el MPP como la
rotenona inhiben al complejo I mitocondrial, y aumentan la
expresión de α-SYN. Tanto el aumento en la expresión
como la modificación por radicales libres de α-SYN podría
conducir a la formación de los LBs. Modificado de Beal,
2001.
22
Introducción
1.3.2. Modelos genéticos por manipulación de genes asociados a EP familiar
Disponer de modelos genéticos de una enfermedad ofrece grandes ventajas para el
estudio de posibles mecanismos alterados, búsqueda de otras moléculas implicadas y ensayos
terapéuticos. Hasta la fecha, no se ha generado un modelo genético animal perfecto de EP,
aunque, sorprendentemente, las mejores perspectivas las han proporcionado los mutantes
generados en Drosophila. La expresión dirigida de α-syn humana (mutada y salvaje) en
drosófilas no causa alteraciones generales pero produce la perdida de neuronas TH-positivas de
forma progresiva en los adultos causando disfunciones motoras (Feany y Bender, 2000) que
pueden ser revertidas mediante sobreexpresión de parkina (Haywood y Staveley, 2004) o de la
chaperona hsp70 (Auluck et al., 2002). A excepción de la α-syn, los cinco restantes genes
relacionados con la EP en humanos tienen su ortólogo en Drosophila donde se explora el papel
de las proteínas codificadas por estos genes (Whitworth et al., 2006). Estos organismos
modificados ofrecen la posibilidad de realizar búsquedas genéticas masivas de modificadores de
la mutación que nos permitan avanzar en nuestro conocimiento de las alteraciones moleculares
que subyacen a la EP (Bilen y Bonini, 2005). El ratón presenta un sistema nigroestriatal
asimilable al de humanos y ofrece también la posibilidad de generar mutantes nulos y cepas
transgénicas. Se han llevado a cabo intensos esfuerzos para conseguir un posible modelo
genético de EP en ratón mediante la generación de múltiples cepas de ratones con
modificaciones en genes que, en humanos, se asocian a EP familiar. A pesar de ello, no existe
todavía ningún modelo genético de EP en ratón que recapitule las características de la patología
humana (Pérez-Sánchez et al., 2002; Marín y Vallejo, 2005).
Se han generado cuatro mutantes nulos para parkina (Goldberg et al., 2003; Itier et al.,
2003; von Coelln et al., 2004, Pérez y Palmiter, 2005), uno para UCHL1 (Yamazaki et al., 1988;
Saigoh et al., 1999) y otro para DJ-1 (Golberg et al., 2005; Kim et al., 2005), y de los ratones
mutantes nulos para α-syn hablaremos en el siguiente apartado. Ninguno de estos tres tipos de
ratones mutantes presenta pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNpc. En general, las
afectaciones en la vía nigroestriatal son tenues, pero presentan alguna característica
parkinsoniana. En los ratones mutantes para parkina y DJ-1 se observa una respuesta reducida
en la liberación de dopamina inducida en estriado. Asimismo, una sobreexpresión de los genes
para parkina o DJ-1 en la SN de animales intoxicados con MPTP y deficientes para cada uno de
estos genes muestran menor vulnerabilidad (Paterna et al., 2007). En el caso de los mutantes de
parkina cada uno de los ratones presenta un fenotipo diferente, lo que podría explicarse por la
ausencia total de mRNA para parkina en el caso del ratón mutante nulo para el exón 7 a
diferencia del generado por deleción del exón 3 (von Coelln et al., 2004). El ratón con deleción
en el exón 7 es el que presenta el fenotipo más similar al que aparece en enfermos con EP
idiopática o por mutación en parkina. Este ratón presenta pérdida de neuronas del locus
23
Introducción
coeruleus con la consiguiente reducción de noradrenalina en bulbo olfatorio y médula espinal
(von Coelln et al., 2004). A diferencia de éste, los ratones con el exón 3 delecionado muestran un
aumento en los niveles de dopamina estriatal extracelular, además de una reducción en la
excitabilidad en neuronas estriatales, y desajustes sensorimotores (Goldberg et al., 2003). Por el
contrario, en otro mutante de genotipo similar se observa una reducción de DAT en el estriado, y
déficit motores y cognitivos (Itier et al., 2003). Por último, en el mutante por deleción del exón 2
no se observa ningún fenotipo parkinsoniano (Pérez y Palmiter, 2005). El ratón con fenotipo
tembloroso tiene la mutación en este gen de manera espontánea y presenta niveles aumentados
de metabolitos de la dopamina en estriado y tubérculo olfatorio. Por otro lado, aunque el ratón
mutante nulo para UCHL1 (o ratón gad, del inglés gracile axonal distrophy) presenta un fenotipo
con temblor, dificultad para moverse y atrofia muscular de las patas traseras, no se debe a una
afectación nigroestriatal (Yamazaki et al., 1988). Ya en el caso del ratón mutante nulo para DJ-1
sólo aparece una reducción en su actividad locomotora tras tratamiento con metanfetamina o
MPTP (Kim et al., 2005). A nivel celular y subcelular en este mutante, se observa una mayor
pérdida de neuronas dopaminérgicas y de terminales TH en el estriado cuyo efecto se revierte al
introducir la expresión de DJ-1 en el ratón mutante. Sin embargo, los niveles de TH o dopamina y
derivados permanecen inalterados. En resumen, estos animales modelo no reproducen fielmente
el fenotipo parkinsoniano pero permiten estudiar algunos aspectos de la enfermedad.
1.3.3. Modelo de pérdida de función para la α-syn en ratón
Para estudiar la función normal de la α-SYN y su implicación en la EP se han desarrollado
diferentes
modelos
animales
carentes
de
α-SYN,
además
del
uso
de
cultivos
celulares/neuronales primarios o líneas celulares que inactivan la proteína. Entre los modelos
animales,
se
han
utilizado
desde
moscas
Drosophila
transgénicas,
gusanos
como
Caenorhabditis elegans o el ratón del cual hablaremos seguidamente (ver revisión de von
Bohlen, 2004).
Hasta la fecha existen cinco ratones mutantes nulos para α-syn, cuatro generados por
ingeniería genética (Abeliovich et al., 2000; Cabin et al., 2002; Dauer et al., 2002; Schlüter et al.,
2003) y uno encontrado de manera natural en una cepa de ratón que porta una deleción en la
zona en la que se encuentra el gen y que afecta además a otros genes (Specht y Schoepfer,
2001). Sólo el trabajo de Abeliovich et al. ha realizado un estudio funcional mostrando
normalidad funcional motora y sensorimotora, aunque con atenuación en la locomoción en
respuesta a anfetamina, y sin cambios en la concentración de dopamina o sus metabolitos en
condiciones normales. El desarrollo del cerebro es aparentemente normal con un número normal
de neuronas dopaminérgicas, aunque existen cambios específicos como una reducción en los
24
Introducción
niveles estriatales de dopamina, y una recuperación de la liberación del neurotransmisor
dopamina más rápida en una forma de plasticidad sináptica (Abeliovich et al., 2000). Por tanto, la
α-SYN jugaría un papel activador en la regulación y liberación sináptica de la dopamina.
Tampoco existe ningún cambio en la expresión o localización de proteínas de vesículas
sinápticas, aunque otros ratones mutantes nulos para α-syn muestran una reducción en el
número de vesículas sinápticas de reserva, vesículas que son movilizadas durante estimulación
repetida (Murphy et al., 2000; Cabin et al., 2002). Por otro lado, las diferentes líneas de ratones
mutantes nulos para α-syn presentan resistencia total (Dauer et al., 2002) o parcial (Schlüter et
al., 2003; Drolet et al., 2004; Robertson et al., 2004; Klivenyi et al., 2006) a la intoxicación con
MPTP. Se desconoce el mecanismo por el cual la carencia de esta proteína protege a estas
células frente al tóxico. Además, se ha comprobado que la falta de un fenotipo más llamativo en
este mutante no es debido a la redundancia con otro miembro de la familia sinucleína, la β-SYN,
proteína homóloga y de expresión en terminales presinápticos, como así se muestra en el ratón
doble mutante nulo para α-syn y β-syn (Chandra et al., 2004).
1.3.4. Modelos de ganancia de función para la α-syn en ratón
Por otro lado, los ratones transgénicos que sobreexpresan la α-syn pretenden reproducir
en la mayor medida posible la patología humana. Se han generado diferentes cepas de ratones
transgénicos, con formas salvajes y/o mutadas de la α-syn humana, bajo diferentes promotores,
tanto neuronales generales como los promotores del gen Thy1, o de los genes que codifican
para el factor trófico β procedente de las plaquetas (PDGFβ) o la proteína priónica del ratón, o
bien neuronales catecolaminérgicos como el del gen que codifica para la TH. Las diferencias
observadas entre estos diferentes ratones responde, además de a un promotor génico diferente,
al fondo genético de la cepa del ratón y al nivel de expresión de la proteína. Así, el primer ratón
transgénico para la α-syn salvaje humana bajo el control del promotor del gen PDGFβ presentó
menor número de terminales dopaminérgicos, inclusiones citoplásmicas no fibrilares, de α-SYN y
ubicuitina, y depósitos nucleares (Masliah et al., 2000). Asimismo, existía una correlación entre el
nivel de expresión del transgén y la formación de agregados, pérdida de terminales o neuronas
dopaminérgicas, así como de síntomas motores dependientes de la edad. Desde ese primer
ratón transgénico se han generado muchos otros (ver Tabla 3). Están los que presentan la forma
salvaje humana de la α-syn (Kahle et al., 2000; Masliah et al., 2000; Matsuoka et al., 2001;
Giasson et al., 2002; Kahle et al., 2002; Lee et al., 2002; Richfield et al., 2002; Rockenstein et al.,
2002; Gispert et al., 2003; Gómez-Isla et al., 2003), con la mutación A53T (van der Putten et al.,
2000; Matsuoka et al., 2001; Giasson et al., 2002; Lee et al., 2002; Gispert et al., 2003; GómezIsla et al., 2003), la A30P (Kahle et al., 2000; Matsuoka et al., 2001; Lee et al., 2002; Rockenstein
et al., 2002; Gómez-Isla et al., 2003) o ambas (Richfield et al., 2002). En cada caso se han
25
Introducción
buscado posibles fenotipos, como la presencia de inclusiones o agregados proteicos o la
alteración de proteínas relacionadas con el tráfico vesicular de la dopamina, y el desarrollo de un
fenotipo motor. De los múltiples ratones transgénicos para la α-syn generados, sólo unos pocos
muestran alteraciones en la vía nigroestriatal (Masliah et al., 2000; Richfield et al., 2002;
Rockenstein et al., 2002). Aunque ninguna de las cepas presenta una pérdida de neuronas
dopaminérgicas, la línea de ratones que sobreexpresan las formas mutadas A30P + A53T de la
α-syn bajo el promotor del gen TH presentan déficit motores relacionados con la edad. Aunque
no se observa una pérdida de neuronas TH, presenta una pérdida progresiva de DAT en el
estriado y una reducción en la dopamina y sus metabolitos (Richfield et al., 2002; Thiruchelvam
et al., 2004). Los ratones que sobreexpresan la forma salvaje de la α-syn humana con el
promotor del gen Thy1 presentan desajustes sensorimotores, agravados con la edad y
acompañados de un descenso en DAT y VMAT en estriado, además de una vulnerabilidad de la
SNpc a dosis subtóxicas de MPTP (Song et al., 2004). Además, estos ratones presentan
complicaciones en olfacción y en la función gastrointestinal, síntomas también observados en la
EP.
Tabla 3. Cepas de ratones transgénicos para α-syn
Ref.
α-syn
Promotor
Fondo
Expresión
1
wt
PDGF-β
C57Bl/6 x
DBA/2
10-80%
2
A53T
Thy-1
C57Bl/6
3
wt, A30P
Thy-1
C57Bl/6
4
wt, A30P,A53T
TH
SW x
C57Bl6/DBA
5
wt, A53T
prión
C57Bl/C3H
250-300%
> 400%
30-50%
6
wt, A30P,A53T
prión
C3H/HeJ x
C57Bl/6J
7
wt, A30P,A53T
TH
C57Bl/6
8
wt
PLP
9
wt, A30P
Thy-1
10
wt, A30P,A53T
prión
11
wt, A53T
prión
C57Bl/6 x
DBA/2
C57Bl/6 x
DBA/2
C57Bl/6J x
SJL
200%
Neuropatología
↓TH;↓DA;glia+,
ubicuitina+
degeneración
neuronas motoras
ubicuitina+
I: SN, STR, HP, Cx,
B
ubicuitina-
0,1-1,2 ng/μg
I: SC, B, C, Th, STR;
GFAP+
I; M, C, B, SC;
GFAP+, ubicuitina+
↓ DAT; ↓ DA,
DOPAC, HVA
inclusiones
oligodendrogliales
10x cantidad
en humano
FVB/N
Fenotipo motor
(edad)
moderado (3-6)
severo (1-2)
normal
sin analizar (12)
parálisis fatal (8-12)
hipocinesia, ataxia
(10)
moderado (9-12)
normal (12)
sin analizar (6)
>500%
GFAP+
temblor, distonía (6)
>500%
morfología neuronal
alterada;
acumulación α-SYN
hipocinesia
Referencias (Ref.): 1: Masliah et al., 2000; 2: Van der Putten et al., 2000; 3: Kahle et al., 2000; 4: Matsuoka et al., 2001;
5: Giasson et al., 2002; 6: Lee et al., 2002; 7: Richfield et al., 2002; 8: Kahle et al., 2002; 9: Rockenstein et al., 2002; 10:
Gómez-Isla et al., 2003; 11: Gispert et al., 2003. Todas las construcciones de “α-syn” corresponden al cDNA de la forma
humana indicada (wt: forma salvaje; formas mutadas con la mutación A30P o A53T). “Expresión” indica los niveles de
expresión del transgén con respecto a la expresión de la forma murina endógena, salvo alguna excepción indicada de
otra forma. “Edad” indica el tiempo de aparición de los síntomas motores, en meses. En “Neuropatología” “+” significa
niveles aumentados de la molécula indicada. Abreviaturas: B: tronco cerebral, C: cerebelo, Cx: corteza cerebral, DA:
dopamina, DAT: transportador de dopamina, HP: hipocampo, I: inclusiones, M: mesencéfalo, SC: médula espinal, SN:
substantia nigra, STR: estriado, T: telencéfalo, Th: tálamo, TH: tirosina hidroxilasa. Adaptado de Fernagut y Chesselet,
2004.
26
Introducción
A pesar de la enorme variabilidad en la afectación de la vía nigroestriatal en las diferentes
líneas de ratones transgénicos, estos organismos resultan muy útiles de estudiar por varias
razones. En primer lugar, las mutaciones que presentan son las que se encuentran en los casos
de EP familiar. En segundo lugar, la afectación motora y la patología agravada por la edad
recuerdan a lo que sucede en las fases iniciales de la EP. En tercer lugar, el hecho de reproducir
algunos aspectos de la enfermedad permite ensayar ciertas estrategias neuroprotectoras (ver
revisión de Fleming et al., 2005).
1.4. La EP y el sistema nervioso periférico (SNP)
En términos generales, el sistema nervioso periférico (SNP) es el sistema encargado de
“sentir” el medio interno y externo al cuerpo y de “actuar” en consecuencia, mediante acciones
de tipo involuntario. Está compuesto por el SNP sensorial, que recoge información sensorial y la
transmite desde la periferia hacia el SNC, y por el SNP autonómico (SNA), que se divide, a su
vez, en el SNA simpático, parasimpático y entérico, que difieren en sus acciones y en su
ubicación con respecto a las estructuras que inervan. De hecho, el SNA entérico se denomina
sistema nervioso entérico (Langley, 1921) ya que no se puede incluir dentro de la clasificación
simpática o parasimpática.
1.4.1. Síntomas autonómicos en la EP
James Parkinson también describió en los enfermos de EP una disfunción autonómica
clínica presentada como hipotensión ortostática, seborrea, salivación excesiva y disuria. Por
tanto, además de las alteraciones en el cerebro, el SNP también se ve afectado en los enfermos
que padecen la EP (Parkinson, 2002). Hoy en día se conocen estos y otros síntomas que indican
afectación del SNA en los enfermos con EP (ver revisiones de Goldstein et al., 2002; Chaudhuri
et al., 2006) que, si bien no resultan mortales, sí que deterioran aún más la calidad de vida de los
pacientes. Algunas de estas afectaciones son:
a) la hipotensión ortostática, esto es, una caída rápida de la tensión arterial al pasar a
una posición erguida. Las personas que la padecen tienen una sensación de
debilidad muscular, inestabilidad, visión borrosa cuando pasan del decúbito a la
sedestación o al ortostatismo
b) problemas urinarios o de estreñimiento
c) problemas cutáneos, sobre todo, de aumento de la sudoración
d) disminución de la salivación y problemas en la deglución
e) impotencia
27
Introducción
Estas disfunciones autonómicas pueden aparecer incluso como una manifestación inicial
de la enfermedad en algunos casos de EP, sugiriendo una afectación muy temprana de
estructuras autonómicas centrales y periféricas en la EP (Goetz et al., 1986; Korczyn, 1990;
Meco et al., 1991; Kaufmann et al., 2004). No obstante, el grado de hipocinesia y rigidez de los
síntomas motores cardinales, suelen correlacionar con los valores de los síntomas autonómicos
y, por tanto, ambas alteraciones pueden compartir mecanismos patológicos comunes.
Esta serie de síntomas aparecen por la afectación a múltiples niveles del sistema nervioso
autónomo en los enfermos de EP, incluyendo alteraciones en el hipotálamo, núcleos (EdingerWestphal, salivar, vagal dorsal) y ganglios parasimpáticos, así como núcleos (intermediolateral
de la columna torácica) y ganglios simpáticos (ver Micieli et al., 2003). Además, se ha detectado
la presencia de LB en estas poblaciones neuronales, en particular en los ganglios simpáticos de
los afectados por EP (Rajput y Rozdilsky, 1976; Orimo et al., 2006). Particularmente, la
regulación simpática al corazón está reducida y/o alterada en estos enfermos (ver revisión de
Goldstein, 2003). Esta disfuncionalidad se debe a una disminución en la cantidad de
noradrenalina en las terminaciones simpáticas al corazón que controla el ritmo cardíaco hecho
comprobado
por
una
captación
bencilguanidina (MIBG) marcado con
reducida
del
análogo
de
noradrenalina
meta-yodo-
123
I, u otros análogos, en el corazón de los enfermos de EP
desde los primeros estadios de la enfermedad (ver Courbon et al., 2003; Goldstein, 2004; Figura
6). Esta desinervación simpática cardiaca se ha confirmado anatómicamente con la observación
por inmunotinción con anticuerpos anti-TH en tejido cardiaco post mortem procedente de
pacientes con EP (Orimo et al., 2001, 2002, 2005; Amino et al., 2005).
Figura 6. Neuroimagen del corazón en pacientes con EP mediante tomografía por
emisión de positrones (PET). En las imágenes de arriba se ha utilizado amonio marcado
18
con nitrógeno-13 y en las de abajo F-dopamina. Algunos pacientes presentan niveles de
radiactividad normales (A, E) pero la gran mayoría presenta niveles bajos (B-D, F, G) o
casi nulos (H). Estas alteraciones se observan en pacientes de EP, incluso en ausencia
de hipotensión ortostática. De Goldstein, 2003.
28
Introducción
Aparte de la EP, existen tres entidades clínico-patológicas distintas que pueden producir
fallo autonómico primario e hipotensión ortostática:
a. Fallo autonómico puro (FAP; Pure Autonomic Failure): disfunción autonómica
(hipotensión ortostática y disfunción sexual y de la vejiga) sin signos de
neurodegeneración central.
b. Atrofia multisistémica (MSA, del inglés Multiple System Atrophy, que incluye el
síndrome Shy-Drager): fallo autonómico con degeneración progresiva en el SNC,
puede ser parkinsoniana, cerebelar o mixta.
c.
Enfermedad de Parkinson: fallo autonómico con la degeneración progresiva en el
SNC característica que causa el desorden del movimiento extrapiramidal.
En (a) y (c) se produce lesión posganglionar autonómica y disminuye, por tanto, la
inervación simpática al corazón. En (b) la lesión es preganglionar y, por tanto, la inervación
cardíaca está intacta. Además, a diferencia de la MSA o el FAP, casos con fallo autonómico
severo que precedan a la EP típica no son frecuentes y la insuficiencia autonómica es
generalmente menos severa (Benarroch, 1997; Banister y Mathias, 1999; Tabla 4).
Tabla 4. Clasificación de las entidades clínico-patológicas que presentan fallo
autonómico con o sin desórdenes del movimiento
FAP
Autonómico
preganglionar
Autonómico
posganglionar
Parkinsoniano
MSAP
MSAC
MSAM
EP-FA
X
X
X
X
X
X
X
X
Cerebelar,
piramidal o ambos
X
X
X
FAP: fallo autonómico puro; MSAP: MSA parkinsoniana, MSAC: tipo cerebelar, MSAM: tipo
mixta, EP-FA: enfermedad de Parkinson con fallo autonómico. De acuerdo con este
esquema, la EP con fallo autonómico (EP-FA) presenta lesión noradrenérgica
posganglionar simpática a diferencia de la MSA parkinsoniana (MSAp). De Goldstein,
2003.
Los cuerpos y neuritas distróficas de Lewy, cuyo componente mayoritario es la α-SYN,
están presentes en diferentes regiones del SNA y/o en dianas de éste como el corazón (ganglios
del surco interatrial, fibras nerviosas alrededor de las arterias coronarias y en el miocardio)
(Iwanaga et al., 1999; Figura 7), otras regiones del sistema simpático (núcleo intermediolateral
de la medula torácica y los ganglios simpáticos) (Hartog Jager y Bethlem, 1960; Rajput y
Rozdilsky, 1976; Jellinger, 1991; Wakabayashi y Takahashi, 1997) como el ganglio estrellado
29
Introducción
(Orimo et al., 2001), el plexo pélvico y la médula adrenal (Wakabayashi y Takahashi, 1997) en
enfermos de EP. Sin embargo, este rasgo histopatológico no es exclusivo de la EP y también se
observan LB y neuritas inmunorreactivas para α-SYN en células de afectados por FAP, MSA y
parálisis supranuclear progresiva (PSP). Aunque la aparición de estos LBs o agregados tipo LB
tiene lugar principalmente en la región nerviosa afectada en estas enfermedades, a veces, se
encuentran fuera de estas regiones como en la substantia nigra en enfermos de FAP o en los
ganglios simpáticos en la MSA (Hague et al., 1992; Arai et al., 2000; Nishie et al., 2004; Sone et
al., 2005; Tabla 5).
En relación a la implicación de la α-SYN en las alteraciones autonómicas, se han
encontrado pacientes con EP asociada a la mutación del gen de la α-syn que presentan
síntomas de hipotensión ortostática, fallo neurocirculatorio simpático y muerte de las neuronas
simpáticas que proyectan al corazón (Goldstein et al., 2001). En el caso de los enfermos de EP
por triplicación del gen de la α-syn presentan falta de proyección neuronal simpática al corazón
(Singleton et al., 2004). No existen estudios descritos sobre si también se da esta anomalía en
enfermos de EP por duplicación del gen de la α-syn. Recientemente, se ha relacionado el grado
de desinervación simpática al corazón con el número de LBs, la pérdida neuronal y la presencia
de inmunorreactividad para la TH en los ganglios simpáticos de enfermos de α-sinucleinopatías
(Orimo et al., 2006).
Figura 7. Fotografías de ganglios simpáticos (A-B) y plexos cardíacos (C-F) en pacientes de
EP. (A) Cuerpos de Lewy en neuronas del ganglio simpático (flecha) y con más detalle (C, D). (B)
Neuritas distróficas con expresión de α-SYN en el ganglio y (E) en el miocardio y con expresión de
ubiquitina alrededor de los vasos sanguíneos en el corazón (F). De Iwanaga et al., 1999.
30
Introducción
Tabla 5. Características clínicas y patológicas de algunas α-sinucleopatías
FAP
Fenotipo
principal
autonómico
(inervación
simpática
cardiaca
alterada,
hipotensión
ortostática)
EP
DLB
motor
demencia
• disfunción
autonómica
(hipotensión
ortostática y
desinervación
posgang. simp.
cardíaca)
• complicaciones
neuropsiquiátricas
• alteraciones en
olfacción,
sensorial y sueño
• depresión
• demencia
Fenotipo
secundario
sin otros síntomas
neurológicos (si
aparecen se
reclasifica a EP,
MSA o DLB)
Principal
región
afectada
SNA periférico
substantia nigra
• LB, LN, pérdida
neuronal en sist.
simpático y
parasimp. pre- y
posgangl.
• LB, pérdida
neuronal en SN,
locus coeruleus
• LB en núcleo
dorsal del rafe y
núcleo
pedunculopontino
• LB, LN, pérdida
neuronal en SN,
• LB y pérdida
neuronal en locus
coeruleus, rafe,
núcleo basal de
Meynert, núcleo
dorsal del vago,
corteza cerebral,
hipotálamo, bulbo
olfatorio y SNA
Presencia
de
agregados
proteicos y
pérdida
neuronal
MSA*
• parkinsonismo
• disfunción cerebelar y
piramidal
• fallo autonómico
(inervación simpática
cardiaca preservada)
• parkinsonismo
• desarreglos cognitivos
• alucinaciones visuales
• síntomas psiquiátricos
• alteraciones de la
consciencia
• disfunción
autonómica
(desinervación
posgangl. simp.
cardiaca)
depresión
corteza cerebral
corteza, cerebelo
• LB en sist. simpático,
inervación al epicardio
• ICGs en neuronas y
glia, pérdida neuronal
y gliosis en SN y
regiones
autonómicas**
• agregados tipo LB o
inclusiones neuronales
citoplásmicas en
ganglios simpáticos
Presencia
de α-SYN en
+
+
+
+
agregados
*MSA engloba a la degeneración estriatonigral, la atrofia olivopontocerebelar y el síndrome Shy-Drager
predominando en cada caso bien el fallo parkinsoniano, cerebelar o autonómico, respectivamente (Graham y
Oppenheimer, 1969). DLB, demencia con cuerpos de Lewy; EP, enfermedad de Parkinson; FAP, fallo autonómico
puro; ICGs, inclusiones citoplásmicas gliales; LB, cuerpos de Lewy; LN, neuritas de Lewy; MSA, atrofia
multisistémica; SN, substantia nigra; SNA, sistema nervioso autonómico. **regiones con inclusiones ICGs: oliva
inferior, núcleo pontino, células cerebelares de Purkinje, putamen, núcleo caudado, globo palido, locus coeruleus,
núcleo autonómico del tronco cerebral, columna intermediolateral de la médula espinal y núcleo de Onuf. Datos
obtenidos de Martí et al., 2003.
31
Introducción
1.4.2. Organización del SNP: división autonómica y sensorial
El SNA de mamíferos consiste en una extensa red de nervios y ganglios, conectados al
sistema nervioso central (tronco del encéfalo y médula espinal) por un lado y a las visceras por el
otro. Entre las dianas que inerva el SNA se encuentran los órganos de las cavidades
abdominales y torácicas como el corazón, glándulas, vasos sanguíneos, varios órganos de la
cabeza y cuello, y tejidos de la piel, controlando funciones de los sistemas respiratorio,
circulatorio, digestivo y urogenital y los músculos involuntarios de dichos sistemas y de la piel.
Todo este entramado de nervios y ganglios se organiza en grupos de ganglios que se pueden
subdividir en ganglios paravertebrales, prevertebrales, paraviscerales e intramurales. Además,
otro grupo de ganglios se localiza en la cabeza e inervan glándulas salivales, ojos y vasos
sanguíneos craneales. Los ganglios paravertebrales forman dos cadenas (cadena simpática) a
cada lado de la columna vertebral y están conectados a nivel torácico-lumbar con la médula
espinal mediante nervios espinales denominados rama comunicante blanca, por la mielinización
de sus axones. Por encima de la cadena simpática, a nivel cervical, se localizan los ganglios
cervical superior, medio y, por debajo, el ganglio estrellado. Los ganglios prevertebrales forman
un plexo (plexo abdominal formado por el ganglio celíaco y el ganglio mesentérico superior)
situado cerca de la aorta abdominal. Los ganglios paraviscerales se encuentran próximos a las
visceras, la mayoría en el plexo cardíaco y pélvico y en menor número en el plexo próximo a la
musculatura de la tráquea y los bronquios. Por último, los ganglios intramurales se localizan
dentro de la pared del tracto gastrointestinal y biliar (Gabella, 1995).
Anatómicamente, la división simpática del SNA comprende los ganglios paravertebrales y
prevertebrales y sus nervios asociados. Estos ganglios presentan la gran ventaja de que su
tamaño relativamente grande, su localización discreta, a cierta distancia del órgano que van a
inervar, y su accesibilidad permiten tanto su estudio en preparaciones histológicas como su
aislamiento para estudios bioquímicos o en cultivo tras su disociación. La mayoría de las
neuronas simpáticas posganglionares son noradrenérgicas, salvo algunas pocas que inervan las
glándulas sudoríparas y las arterias musculares, que son colinérgicas. La división parasimpática
del SNA comprende los ganglios autonómicos de la cabeza y nervios asociados como el vago.
Las neuronas posganglionares parasimpáticas se localizan en pequeños ganglios cercanos a los
órganos que van a inervar, más difíciles de identificar y menos accesibles que los ganglios
simpáticos. Utilizan la acetilcolina como neurotransmisor. Los ganglios paraviscerales cardiacos
y pélvicos están principalmente inervados por la división parasimpática, aunque los ganglios
pélvicos también reciben inervación simpática (Baluk, 1995).
Las neuronas simpáticas posganglionares utilizan como neurotransmisor la noradrenalina,
o norepinefrina, que pertenece a la familia de las catecolaminas, que incluye otros miembros
32
Introducción
químicamente relacionados, como la dopamina, neurotransmisor de las neuronas de la SN. A
partir de la dopamina se formará la noradrenalina y posteriormente, si es el caso, la adrenalina
(o epinefrina) (ver Figura 8). Por tanto, todas estas células que sintetizan catecolaminas
expresan TH, enzima limitante en esta ruta de biosíntesis (Nagatsu et al., 1964). La
noradrenalina sintetizada es liberada mediante la exocitosis de las vesículas sinápticas a la
hendidura sináptica, activando los receptores adrenérgicos de la membrana postsináptica y
receptores propios. Seguidamente, la mayor parte de la noradrenalina es recaptada hacia el
citoplasma por el transportador de noradrenalina (NAT), situado en la propia membrana
presináptica y que es bloqueable por drogas como la cocaína y las anfetaminas o por
antidepresivos tricíclicos como la desipramina (Axelrod et al., 1961), donde una pequeña
proporción de neurotransmisor, a través del transportador de monoaminas vesicular 2 (VMAT2),
entra y se reutiliza en nuevas vesículas mientras que la otra parte es metabolizada por la
monoaminaoxidasa (MAO). La noradrenalina que no es captada por el terminal sináptico es
degradada por otros tejidos mediante las enzimas MAO y catecol-O-metil transferasa (COMT)
(Tellioglu y Robertson, 2001; Eisenhofer et al., 2004; Figura 8).
Figura 8. Diagrama de la síntesis, liberación y metabolismo de la noradrenalina. (a) La
noradrenalina se sintetiza a partir de la tirosina, vía hidroxilación para formar dihidroxifenilalanina
(dopa), descarboxilación para formar dopamina, e hidroxilación para formar noradrenalina, y (b)
almacenada en vesículas. (c) Tras un estímulo, la noradrenalina se libera a la hendidura sináptica.
(d) La noradrenalina liberada activa los receptores adrenérgicos localizados en la membrana
postsináptica (α1, β1 y β2) y también (e) en la membrana presináptica (α2, β2), activando cascadas
postsinápticas (f). (g) El NAT es responsable de la recaptación presináptica de la noradrenalina de la
hendidura sináptica. (h) Tras la recaptación, parte de la noradrenalina es reciclada en vesículas
mediante la entrada por el VMAT2; (i) el resto es metabolizado en la mitocondria por la MAO, y (j) su
producto, el DHPG, es liberado al torrente sanguíneo. (k) Parte de la noradrenalina queda en el
plasma o (l) es captada por las células receptoras y metabolizado por la MAO o por la COMT para
formar DHPG o normetanefrina, respectivamente. COMT, catecol-O-metil transferasa; DHPG,
dihidroxifenilglicol; NAT, transportador de noradrenalina, MAO, monoaminaoxidasa; VMAT2,
transportador de monoaminas vesicular tipo 2. Modificada de Tellioglu y Robertson, 2001.
33
Introducción
Además del SNA, el SNP está constituido por la división sensorial. Ésta consiste en una
serie de ganglios pares, craneales y espinales (cervicales, torácicos, lumbares y sacros), en los
que se ubican los cuerpos de las neuronas sensoriales primarias. En la cabeza se localizan los
ganglios craneales: el ganglio trigémino, geniculado, los auditivos, superior, yugular, petroso,
nodoso, y en el tronco los ganglios espinales o ganglios de la raíz dorsal. Las neuronas
sensoriales primarias, de tipo pseudounipolar, proyectan una de sus ramas hacia los distintos
tejidos y órganos (piel, músculo, visceras) en los que se asociarán con receptores específicos.
La rama central se dirige e inerva la médula espinal. Esta organización permite la transmisión de
información sensorial (nociceptiva, propioceptiva y mecanoceptiva) desde la periferia al SNC (Le
Douarin et al., 1992).
A continuación se muestra cómo diferentes modalidades nerviosas del SNP (simpáticas y
sensoriales) inervan una estructura como el corazón (Figura 9).
Figura 9. Ilustración de la localización de los cuerpos
neuronales y las proyecciones que regulan la función
cardiaca. Inervación simpática en trazo continuo, inervación
sensorial en trazo discontinuo. C: nivel vertebral cervical,
DMV: núcleo motor dorsal del vago, IML: columna
intermediolateral, nA: núcleo ambiguo, nTS: núcleo del
tracto solitario, T, nivel vertebral torácico. Adaptado de
Hiltunen, 2001.
1.4.3. Desarrollo del sistema nervioso simpático: gangliogénesis, neurotrofismo y
señalización intracelular
El sistema nervioso se deriva de la constitución del tubo neural embrionario, la cresta
neural, y las placodas ectodérmicas. De la parte más dorsal del tubo neural recién formado se
delaminan las denominadas células de la cresta neural que migran dorso-ventralmente, entre
otras zonas, a la futura región que ocupará cada ganglio. Salvo en casos en los que hay
contribución de placodas ectodérmicas craneales, estas células constituyen las neuronas y la
glía de todos los ganglios autonómicos y sensoriales. Del engrosamiento de ciertas regiones
ectodérmicas craneales de la región se forman las placodas, origen de las neuronas y la glía de
34
Introducción
algún ganglio sensorial de la cabeza, como es el caso del complejo nodoso-petroso o los
ganglios estato-acústicos (Le Douarin et al., 1992).
Uno de los linajes celulares derivados de cresta neural más estudiados es el linaje
simpato-adrenal (Landis y Patterson, 1981; Marusich y Weston, 1991). Las células de la cresta
neural migran ventralmente hasta la aorta dorsal, junto a la que se agregan y diferencian para
dar lugar a neuronas simpáticas posganglionares, o hasta el primordio de la glándula adrenal, en
el que se diferencian en células cromafines (Doupe et al., 1985). En embriones de ratón, los
precursores simpáticos de ratón aparecen hacia el estadio E11,5 a lo largo de la aorta, en la
región torácica, y posteriormente, por migración rostral posterior, en la región cervical (C1-C5) y,
hacia E13,5, en la presunta región del SCG (Rubin, 1985). En estos estadios del desarrollo, los
ganglios constituyen una columna uniforme a todos los niveles vertebrales y están compuestos
por células gliales y neuroblastos que aunque empiezan a expresar TH siguen proliferando para
formar el ganglio (Hall y Landis, 1991). Aunque en E13,5 las células precursoras están
comprometidas con un destino neuronal (Hall y Landis, 1991), la división terminal de los
precursores neuronales simpáticos se da entre E12,5 y E16,5 (Landis y Damboise, 1986) con un
pico neurogénico en E14,5-E15,5. Mientras tanto, los precursores gliales del SCG están
quiescentes durante este tiempo y proliferan a partir de E16,5 (Hall y Landis, 1991, 1992). La
aparición del fenotipo noradrenérgico en los neuroblastos/neuronas simpáticas se puede
caracterizar por la expresión más temprana del transportador de noradrenalina (NAT) y algo más
tardía de la TH y la dopamina-β-hidroxilasa (DBH), enzima que transforma la dopamina en
noradrenalina, en células de la cresta neural en diferenciación (Sieber-Blum, 1989a, b; Hall y
Landis, 1992; Zhang y Sieber-Blum, 1992; Zhang et al., 1997). La diversidad celular del SNP
derivada de la cresta neural se genera por la acción de señales instructivas que inducen
combinaciones específicas de factores de transcripción que controlan, a su vez, la especificación
de los distintos subtipos celulares y la restricción progresiva de la multipotencia inicial de las
células de cresta neural (McEvilly et al., 1996; Anderson et al., 1997; Anderson, 1999; Ma et al.,
1999; Hippenmeyer et al., 2004). En el SNA, la influencia de miembros de la familia de los BMPs
(BMP2 y 4; bone morphogenetic protein), que son secretados por la aorta, parecen jugar un
papel fundamental en la inducción del fenotipo neuronal simpático mientras que la neuregulina
GGF (glial growth factor) instruye la diferenciación de las células de Schwann (Anderson, 1997).
En cuanto a los factores intrínsecos, el factor de transcripción Mash1 es esencial para la
generación de las neuronas simpáticas determinando su diferenciación terminal (Guillemot et al.,
1993).
Una vez se ha producido la generación de las neuronas periféricas se inicia un proceso de
selección modulado por miembros de las familias de factores neurotróficos relacionados con el
35
Introducción
factor de crecimiento nervioso (NGF) y con el factor neurotrófico derivado de glía (GDNF) (Huang
y Reichardt, 2001; Kirstein y Fariñas, 2002). Durante el desarrollo embrionario, para cada
estructura o región neural, se produce un exceso inicial de neuronas que es posteriormente
reducido por la competencia entre estas neuronas por factores tróficos que los territorios que
inervan producen en cantidades limitantes (Levi-Montalcini, 1987). Cada población neuronal
suele responder a uno o varios factores neurotróficos aunque suelen producirse cambios
dinámicos tanto en la dependencia neurotrófica como en la expresión de los receptores
neurotróficos durante el desarrollo (Airaksinen y Saarma, 2002; Kirstein y Fariñas, 2002).
Además de en supervivencia neuronal, los factores neurotróficos son importantes reguladores de
la proliferación y la diferenciación, y de otras funciones celulares como la migración y la dirección
del crecimiento axonal o la plasticidad sináptica (Huang y Reichardt, 2001).
La familia mejor conocida dentro de los factores neurotróficos es la familia de las
neurotrofinas que, en mamíferos, comprende a cuatro miembros: el factor de crecimiento
nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), la neurotrofina 3 (NT-3) y la
neurotrofina 4/5 (NT-4/5). Estas proteínas funcionan, como homodímeros asociados no
covalentemente, activando proteínas de la familia Trk (tropomyosin-related kinase) de receptores
tirosina quinasa que incluye tres miembros: TrkA, TrkB y TrkC. TrkA es el receptor para NGF,
tanto BDNF como NT-4/5 activan TrkB y NT-3 es el ligando para TrkC aunque se une también a
TrkA y TrkB con menor eficacia (Bibel y Barde, 2000; Huang y Reichardt, 2003; Figura 10).
Además de a los Trk, todas las neurotrofinas se unen con menor afinidad al receptor p75NTR,
glicoproteína transmembrana a la que hoy en día se le atribuyen diversas funciones (Bibel y
Barde, 2000; Dechant y Barde, 2002; Lu et al., 2005).
Figura 10. Esquema de la especificidad de unión entre las
neurotrofinas y los receptores Trk. De Fariñas et al., 2002.
Los Trk son proteínas transmembrana de tipo I y pertenecen a la superfamilia de
receptores tirosina quinasa. El dominio extracelular contiene dos regiones ricas en cisteínas
(dominios 1 y 3) flanqueando un dominio que consta de tres motivos de 24 residuos ricos en
leucinas (dominio 2). Les siguen dos dominios inmunoglobulina del tipo C2 en la región
yuxtamembrana (dominios 4 y 5) (Figura 11). Es el dominio 5 el mayor responsable de la unión
36
Introducción
con la neurotrofina y los dominios ricos en cisteína y leucina tienen un efecto modulador de dicha
interacción. Es importante la glicosilación del receptor Trk ya que regula su correcta localización
en la membrana e inhibe su activación espontánea (Friedman y Greene, 1999). El principal
producto de la transcripción de los genes trk es una proteína de 80 kDa, que tras varias etapas
de glicosilación origina proteínas de 110 y 140 kDa (gp140TrkA) (Martín-Zanca et al., 1989) o de
145 kDa (gp145TrkB y gp145TrkC) (Klein et al., 1989; Lamballe et al., 1991). Además de estas
variantes, existen isoformas alternativas para cada Trk. Existen isoformas con ausencia o
presencia de algunos aminoácidos en la parte extracelular yuxtamembrana lo que parece regular
la especificidad en la respuesta de los Trk a unas u otras neurotrofinas. Otras isoformas
presentan inserciones en el dominio quinasa o carecen de la mayor parte del dominio
intracelular. Se ha propuesto que estas isoformas podrían formar heterodímeros inactivos con las
Trk funcionales actuando como dominantes negativos o bien a modo de proteínas presentadoras
de neurotrofinas a receptores funcionales (ver revisión de Roux y Barker, 2002; Huang y
Reichardt, 2003).
Figura 11. Neurotrofinas y estructura extracelular de sus Trk. Las neurotrofinas
NTR
y se sintetizan como profuncionan como dímeros que se unen a receptores Trk y p75
NTR
proteínas que se unen exclusivamente a p75 . El dominio extracelular de los Trk contiene
un dominio rico en leucinas flanqueado por dos de cisteína, y yuxtamembrana presenta dos
dominios inmunoglobulina tipo C2. Modificado de Arévalo y Wu, 2006.
Las neurotrofinas se unen directamente y dimerizan a los receptores Trk resultando en la
activación y autofosforilación de residuos tirosina quinasa presentes en la zona de activación del
dominio citoplasmático. Aunque los receptores Trk contienen 10 tirosinas evolutivamente
conservadas, sólo tres de ellas, Y670, Y674 y Y675, son las responsables de la autofosforilación
del dominio quinasa que controla la actividad tirosina quinasa fuera de la zona de activación. La
fosforilación de estos aminoácidos conduce a una activación quinasa completa. La fosforilación
de los otros residuos promueve la señalización creando sitios de anclaje para proteínas
adaptadoras, acoplando estos receptores a cascadas de señalización intracelular, que incluyen
las vías Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K/Akt y PLCγ1/PKCδ (Kaplan y Miller, 2000; Huang y Reichardt,
2003; Figura 12), implicadas en supervivencia.
37
Introducción
Figura 12. Diagrama de las vías de señalización intracelular tras activación de los receptores
Trk de membrana: PI3K/Akt, Ras/Raf/MEK/ERK y PLCγ1/PKCδ. Modificado de Huang y
Reichardt, 2003.
La cascada de señalización Ras/Raf/MEK/ERK se inicia con la fosforilación del residuo
Y490 y el acoplamiento de una proteína adaptadora. Shc es la proteína adaptadora que se une a
través de su dominio PTB a Y490 y es activada a través de sus tirosinas. Una vez fosforilada,
fosfo-Shc interacciona con los complejos preformados Grb2-SOS (Ras exchange factor son of
Sevenless) que participan en la activación transitoria de Ras (Nimnual et al., 1998). En
consecuencia, Ras activa PI3K, la vía de la p38 MAPK/proteína quinasa activadora de MAPK 2 y
la vía c-Raf/ERK (Xing et al., 1998; Vanhaesebroeck et al., 2001). La activación de ERK1 y ERK2
requiere la fosforilación secuencial de Raf a MEK1 y/o MEK2 y de éstas a ERK1 y ERK2 (English
et al., 1999). Si bien la señalización a través de Shc/Grb2/SOS media una activación transitoria
de la vía de señalización de ERK (Grewal et al., 1999), una activación prolongada se consigue
con la unión al residuo fosforilado Y490 de la proteína adaptadora FRS2 (fibroblast growth factor
receptor substrate-2) (Meakin et al., 1999; Yan et al., 2002). La fosforilación de FRS2, proteína
que se encuentra anclada a membrana, recluta a un complejo formado por las proteínas
adaptadoras Grb2 y Crk, la fosfatasa Shp2, el substrato quinasa dependiente de ciclina p13suc1
y Src (Meakin et al., 1999). La señalización por Trk aumenta la asociación de Crk con FRS2 (Kao
et al., 2001). La asociación con Crk resulta en la activación con el factor intercambiador de
nucleótidos de guanina C3G, y ésta por la pequeña proteína G Rap1 (Nosaka et al., 1999). Rap1-GTP estimula B-Raf iniciando la cascada de ERK. De entre las dianas moleculares de ERK se
38
Introducción
incluyen las quinasas S6 ribosomales (RSKs). Tanto las RSKs como la proteína quinasa
activadora de MAPK 2 fosforilan CREB (cAMP-regulated enhancer-binding protein) y otros
factores de transcripción (Xing et al., 1998). Se ha visto que CREB regula genes esenciales para
la supervivencia in vitro de neuronas simpáticas (Riccio et al., 1999).
La activación directa de PI3K a través de Ras es la principal vía a través de la cual la
señalización por Trk promueve supervivencia en la mayoría de las neuronas (Vaillant et al.,
1999). No obstante, existen algunas neuronas que activan PI3K a través de la fosforilación de
IRS-1 (insulin-receptor substrate-1) (Yamada et al., 1997). Además de la activación de PI3K a
través de Shc-Grb2-SOS-Ras, los dominios SH3 de Grb2 son capaces de interaccionar con las
proteínas adaptadoras Gab1 y Gab2, además de SOS (Holgado-Madruga et al., 1996; Vaillant et
al., 1999). Una vez translocada a la membrana, Gab1/2 se fosforila a través de la actividad
tirosina quinasa de Trk, resultando en la formación de sitios de reconocimiento para proteínas
con dominios SH2 como la PI3K (Holgado-Madruga et al., 1997). La ocupación de los dos
dominios SH2 de la p85, subunidad reguladora de la enzima, por tirosinas fosforiladas provoca
un cambio de conformación de la subunidad p110, subunidad catalítica de la enzima, activando
su actividad quinasa (Rordorf-Nikolic et al., 1995). La PI3K cataliza la fosforilación de los fosfatidil
inositoles difosfato (PtdIns4,5-P2). Una vez fosforilados estos lípidos de membrana actúan como
segundos mensajeros sobre múltiples efectores que son reclutados a la membrana plasmática.
Este es el caso de la Ser/Thr quinasa Akt/PKB que con su dominio de homología a Pleckstrina
(dominio PH) se une a los fosfatidil inositoles trifosfato (Frech et al., 1997). Tras su unión a
membrana, Akt/PKB es activada por fosforilación en dos residuos diferentes (Alessi et al., 1996),
la Thr308 fosforilada por PDK1, quinasa reclutada a membrana por unión de su dominio PH a los
fosfatidil inositoles trifosfato (Alessi et al., 1997; Stokoe et al., 1997), y la Ser473 fosforilada por
el complejo mTOR/Rictor/GβL (Sarbassov et al., 2005). Dado que la principal función de la
señalización por PI3K es la de promover supervivencia neuronal, los substratos de Akt incluyen
proteínas implicadas en diferentes niveles de las vías de muerte celular. Entre los substratos que
Akt fosforila se incluye Bad (Datta et al., 2000), el factor de transcripción Forkhead (FKHRL1)
(Brunet et al., 1999), GSK3β (glicogen synthase kinase 3-β; Crowder y Freeman, 2000; Hetman
et al., 2000), la caspasa 9 de humanos, que no la de ratón (Brunet et al., 1999) o la quinasa del
inhibidor del factor de transcripción NF-κB (IKKβ; Madrid et al., 2000).
La fosforilación de Y785 de TrkA, y sitios análogos en TrkB y TrkC, recluta a la PLC-γ1 y
es activada mediante fosforilación por el dominio catalítico de Trk (Kaplan y Miller, 2000). La
fosfolipasa PLC-γ1 activada hidroliza fosfatidil inositoles y genera diacilglicerol (DAG) e inositol
1,4,5-trifosfato (IP3) (Vetter et al., 1991). Este fosfolípido induce la liberación de Ca2+
almacenado, aumentando los niveles de Ca2+ citoplásmico y, por tanto, activando muchas vías
39
Introducción
controladas por este segundo mensajero como la vía de la PI3K (Egea et al., 2001). Además, el
NGF activaría una proteína quinasa regulada por DAG, PKCδ, necesaria para la activación de la
vía de las ERKs y para el crecimiento neurítico (Corbit et al., 1999).
Las neuronas simpáticas son dependientes de las neurotrofinas NGF y NT-3. Neuronas
simpáticas aisladas a partir de embriones o neonatos de roedores mueren en cultivo si no se les
suministra NGF (Chun y Patterson, 1977). Si se aumenta experimentalmente la cantidad de NGF
disponible durante el desarrollo se rescatan neuronas simpáticas que morirían de forma natural,
mientras que el descenso manipulado en los niveles del factor trófico conduce a una muerte
exacerbada de las neuronas simpáticas (Levi-Montalcini, 1987; Albers et al., 1994). De la misma
manera, ratones deficientes nulos en los genes que codifican para NGF o su receptor TrkA
pierden al menos 80% de las neuronas simpáticas antes de la segunda semana después del
nacimiento (Crowley et al., 1994; Smeyne et al., 1994; Fagan et al., 1996). El NGF se sintetiza en
los territorios con inervación simpática y los axones de las neuronas simpáticas posganglionares
transportan NGF (Levi-Montalcini, 1987). La reducción considerable (50%) en neuronas
simpáticas que se observa en los mutantes para NT-3 indica que esta neurotrofina también es
esencial para la supervivencia de las neuronas simpáticas (Fariñas et al., 1994; Ernfors et al.,
1994; Francis et al., 1999). Aunque NT-3 no parece capaz de mantener la supervivencia de
neuronas simpáticas postnatales in vitro, los simpatoblastos, que tampoco sobreviven en medios
sin suero, pueden ser mantenidos en cultivo con concentraciones bajas de NT-3 (Birren et al.,
1993; DiCicco-Bloom et al., 1993). Este resultado está de acuerdo con la observación de que los
simpatoblastos no expresan TrkA sino TrkC durante la embriogénesis (Birren et al., 1993;
DiCicco-Bloom et al., 1993). Aunque esto sugirió durante un tiempo que la dependencia del
sistema simpático de estas dos neurotrofinas sería, posiblemente, secuencial, los estudios en
mutantes para NGF y NT-3 han revelado que la dependencia in vivo para NT-3 y NGF en
neuronas simpáticas se produce simultáneamente y que la acción de NT-3 se produce a través
de TrkA (Francis et al., 1999). Eso sí, la población mantenida por NT-3 es una subpoblación de
aquella que requiere NGF para sobrevivir (Francis et al., 1999). Por otro lado, las neuronas
simpáticas posganglionares sintetizan BDNF y éste regula la inervación por parte de las
neuronas simpáticas centrales (Causing et al., 1997).
La familia de factores neurotróficos relacionados con el GDNF (GFLs), que incluye
además a artemina, persefina y neurturina, también contribuyen al desarrollo y supervivencia de
las neuronas simpáticas durante la embriogénesis. Todos estos factores señalizan a través de la
tirosina quinasa c-RET, aunque no se unen directamente a ella sino que lo hacen a través de
coreceptores conocidos como GFRα (1-4) unidos a la membrana plasmática a través de uniones
de tipo glicosil fosfatidilinositol (Airaksinen y Saarma, 2002). Estos coreceptores, que no pueden
40
Introducción
señalizar por sí mismos, presentan, aunque con un cierto solapamiento, relaciones de
especificidad con los miembros de la familia. A partir de RET se activan distintas vías
intracelulares de transducción de la señal que conducen a distintos comportamientos celulares,
entre ellos la supervivencia (Airaksinen y Saarma, 2002). Aunque en este trabajo de tesis
doctoral no se ha evaluado el papel de GDNF en la supervivencia de neuronas periféricas, sí que
hay que resaltar que RET y algunos miembros de la familia del GDNF muestran acciones en el
desarrollo de los ganglios simpáticos. Esto se hace evidente en el análisis de mutantes nulos
para factores y receptores de esta familia, observándose problemas en la proliferación de los
precursores simpáticos en los mutantes de Ret, Artn y Gfra3 y cambios, aunque muy moderados,
en el número de neuronas simpáticas en el mutante de Gdnf y Gfra1 (Airaksinen y Saarma,
2002).
1.4.4. Otros sistemas catecolaminérgicos: neuronas sensoriales viscerales
Además de la expresión de TH en el SNA, el ganglio nodoso presenta una población de
neuronas, entre 15-20% del total, que también expresa TH (Dahlqvist y Forsgren, 1992) y
dependen del factor neurotrófico BDNF (Erickson et al., 2001). El nodoso o complejo ganglionar
sensorial nodoso-petroso (denominado así porque en ratón no puede individualizarse
morfológicamente el ganglio nodoso y el ganglio petroso) es un ganglio sensorial craneal
eminentemente visceral, componente crítico en los reflejos autonómicos cardiovascular,
respiratorio y visceral, ya que transmite información relativa a la presión sanguínea, distensión
gástrica y la oxigenación sanguínea al SNC (Figura 9). Muchas de las neuronas nodosaspetrosas transmiten información sensorial de tipo visceral, tanto de la vasculatura arterial como
información para el control de la respiración. Por ejemplo, transmiten información quimiosensorial
desde las células glómicas del cuerpo carotídeo, que responden a cambios en la presión parcial
de oxígeno en sangre, e información mecánica desde los barorreceptores, aferentes a modo de
terminaciones libres que inervan regiones especializadas en el tracto cardiaco y que responden a
deformaciones mecánicas causadas por cambios rápidos en la presión arterial sanguínea. La
lesión de estas neuronas puede producir hipotensión postural, respuestas cardiovasculares
inadecuadas a cambios gravitacionales, e insuficiencia respiratoria. Por tanto, entre las diversas
estructuras que inerva el ganglio nodoso en el cuerpo, a través del nervio vago, se encuentra el
corazón y vasos sanguíneos como la aorta (Zhuo et al., 1997).
Embriológicamente, el ganglio nodoso se forma a partir de la migración de las células
derivadas de la placoda ectodérmica durante E10,5 en el ratón (Morin et al., 1997), con el pico
de neurogénesis en E14 (Altman y Bayer, 1982), y la muerte celular programada en E12-E16
(Davies y Lumsden, 1990). Respecto a la dependencia trófica para la supervivencia neuronal
41
Introducción
sensorial los estudios en ratones mutantes nulos de los genes que codifican para BDNF, NT-3 o
NT-4/5 han mostrado una pérdida del 40-60% de las neuronas totales del ganglio en cada caso
(Ernfors et al., 1994a, 1994b; Liu et al., 1995; Conover et al., 1995; Silos-Santiago et al., 1997;
Fariñas et al., 1994; Ernfors et al., 1994; Erickson et al., 1996, 2001). Asimismo, desaparece un
95% de las neuronas que constituyen el ganglio nodoso en ausencia del receptor TrkB (SilosSantiago et al., 1997) o en el ratón doble mutante nulo para BDNF/NT-4/5 (Conover et al., 1995;
Silos-Santiago et al., 1997; Erickson et al., 1996), sugiriendo que las neuronas nodosas son
heterogéneas respecto a la respuesta a los diferentes ligandos de TrkB y que BDNF y NT-4/5
son los principales ligandos de TrkB actuando de modo no redundante y complementario sobre
poblaciones
celulares
discretas
de
neuronas
nodosas.
Las
neuronas
sensoriales
quimiorreceptoras y barorreceptoras comparten el requerimiento por la neurotrofina BDNF, que
se expresa en los territorios diana en el momento del establecimiento de la inervación sensorial,
y algunas de estas neuronas expresan tirosina hidroxilasa (Brady et al., 1999). Por el contrario, la
población de neuronas nodoso-petrosas dependientes de NT-4/5 pertenecen a otro grupo y son
todas ellas negativas para tirosina hidroxilasa (Erickson et al., 1996).
1.4.5. Vulnerabilidad del SNP a drogas “parkinsonianas”
Las drogas más usadas para analizar la susceptibilidad del SNP han sido el MPTP/MPP+ y
la 6-OHDA. Se ha estudiado el efecto de estos neurotóxicos sobre las neuronas simpáticas de
roedores (Luthman y Jonsson, 1986; Luthman y Sundstrom, 1990; Alkadhi y Hogan, 1992;
Takatsu et al., 2000; Ren et al., 2004; Fukumitsu et al., 2006), primates (Goldstein et al., 2003),
cánidos (Johannessen et al., 1990) y aves (Bhave et al., 1996). A nivel del sistema simpático de
roedores, el MPTP produce desinervación cardiaca (Takatsu et al., 2000) y descenso de la
noradrenalina (Wallace et al., 1984; Ambrosio et al., 1988; Fuller et al., 1989). Funcionalmente se
ha visto un descenso de NAT de los terminales simpáticos posganglionares cardiacos
(Fukumitsu et al., 2006) así como un aumento de los radicales libres y agentes antioxidantes
(Bhave et al., 1996) y un descenso de la contractibilidad de los miocitos cardíacos (Ren et al.,
2004). Aunque la conversión de MPTP a MPP+ en el corazón parece no estar mediada por la
MAO-B (Fuller y Hemrick-Luecke, 1986; Fuller et al., 1988), la toxicidad del metabolito activo
MPP+ estaría mediada por la entrada a través del receptor de membrana para monoaminas, en
particular, el NAT (Jonsson et al., 1986; Alkadhi y Hogan, 1992; Bhave et al., 1996). De hecho, el
tratamiento con desipramina, un bloqueador de la recaptación de noradrenalina, bloquea la
intoxicación por MPTP o MPP+ (Luthman y Jonsson, 1986; Bhave et al., 1996).
42
Introducción
El primer efecto biológico observado de la 6-OHDA fue el descenso de modo duradero de
noradrenalina en la proyección simpática al corazón (Porter et al., 1963, 1965) y posteriormente
se vio la destrucción de la inervación simpática al corazón (Dowell, 1976). La administración de
este neurotóxico a perros se ha utilizado para estudiar el sistema cardiovascular (Soares-daSilva et al., 1988; Valette et al., 1995; Ruffy y Leonard, 1997). En roedores y primates el
tratamiento con 6-OHDA destruye selectivamente las neuronas catecolaminérgicas (Porter et al.,
1965; Porter y Stone, 1967; Sundstrom et al., 1988; Luthman et al., 1989; Goldstein et al., 2003).
Esta simpatectomía química puede ser total, como sucede tras la administración a animales
neonatos ya que destruye cuerpos y terminales celulares noradrenérgicos (Angeletti y LeviMontalcini, 1970; Angeletti y Levi-Montalcini, 1971; Jaim-Etcheverry y Zieher, 1971; Clark et al.,
1972; Finch et al., 1973), o bien parcial en el caso de animales adultos, ya que destruye sólo los
terminales noradrenérgicos (Thoenen y Tranzer, 1968; de Champlain, 1971; Clark et al., 1972;
Finch et al., 1973). Se han estudiado los cambios que ocasiona la intoxicación en diferentes
marcadores catecolaminérgicos como los niveles de expresión y actividad de la TH,
catecolaminas y DOPA sobre todo de nervios adrenérgicos (Heikkila et al., 1973; Kawamura et
al., 1999). A diferencia de lo que sucede con el MPTP, las distintas cepas de ratón no muestran
diferencias en la respuesta a 6-OHDA (Luthman et al., 1990). Por otro lado, la lesión con 6OHDA en ratones neonatos en presencia de bloqueadores de la captación de la dopamina no
produce fallo motor (Luthman et al., 1989). Respecto a su modo de acción, parte de la
neurotoxicidad producida por la 6-OHDA se debe a la inactivación de la COMT a nivel
extracelular (Borchardt et al., 1976).
En resumen, las neuronas catecolaminérgicas del SNP son susceptibles de ser
intoxicadas con drogas que causan parkinsonismo y se observan disfunciones de estas
neuronas en pacientes con EP.
43
2. OBJETIVOS
44
Objetivos
La EP es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada principalmente por alteraciones
en el SNC que causan los característicos trastornos del movimiento. Sin embargo, muchos
pacientes con EP manifiestan alteraciones autonómicas que aparecen durante el curso de la
enfermedad, sugiriendo una afectación del SNP. El descubrimiento de que ciertas toxinas, como el
MPTP, inducen síntomas de EP en los seres humanos ha sugerido la implicación de factores
tóxicos ambientales en la aparición y desarrollo de la enfermedad. Los estudios genéticos, por otro
lado, han identificado mutaciones en genes únicos que producen EP familiar sugiriendo un fuerte
componente genético, a pesar de que los casos de EP familiar monogénica constituyen un 5-10%.
Las primeras mutaciones asociadas a EP familiar con herencia autosómica dominante en humanos
se identificaron en el gen SNCA que codifica para la α-sinucleína y conducían a cambios
aminoacídicos únicos en la proteína, o a aumentos en la dosis génica. A pesar de que algunas
evidencias sugieren que la α-SYN pueda estar implicada en plasticidad sináptica y en modulación
de la neurotransmisión dopaminérgica en el SNC, su función normal es todavía desconocida. Para
tratar de entender el papel de la α-SYN en situaciones normales y patológicas hemos llevado a
cabo un análisis del papel que juega esta proteína en el SNP normal y expuesto a tóxicos
ambientales que producen parkinsonismo. Los objetivos del trabajo han sido:
1. La caracterización del patrón de expresión de la α-SYN en el SNP
2. El análisis del fenotipo de un mutante nulo para α-syn a nivel del SNP
3. El estudio de la relación entre α-SYN y la respuesta de las neuronas simpáticas a
tóxicos ambientales que producen parkinsonismo
45
3. MATERIAL Y MÉTODOS
46
Material y métodos
3.1. Animales y tratamientos
3.1.1. Animales y condiciones de estabulación
En este estudio se han utilizado ratones de una cepa con fondo genético mixto 129/SvJ ×
C57BL/6J de genotipo salvaje (α-syn+/+) y mutante homocigoto para el gen de la α-sinucleína
(α-syn-/-), que fue generada en el laboratorio del Dr. Arnon Rosenthal (Department of Neuroscience,
Rinat Neuroscience, South San Francisco, USA) tal como se describe en Abeliovich et al. (2000). La
colonia de ratones se mantuvo en condiciones de heterocigosis y los animales de genotipo salvaje y
mutante para los distintos análisis se obtuvieron mediante cruces entre individuos de genotipo αsyn+/+ y entre individuos de genotipo α-syn-/-, respectivamente. Se han utilizado, además, ratones de
una cepa transgénica (tg) en la que la expresión del cDNA que codifica para la forma salvaje de la
α-syn humana se encuentra bajo el control del promotor largo del gen de la TH (TH-hα-syn tg+)
sobre un fondo genético C57Bl6 puro y que presenta expresión en las poblaciones
catecolaminérgicas del SNP además de las del SNC. Esta línea transgénica, no caracterizada
previamente, también fue generada en el laboratorio del Dr. Rosenthal. El transgén se mantuvo
siempre en heterocigosis mediante cruzamiento de individuos transgénicos heterocigotos con
animales de genotipo salvaje de fondo C57Bl6 obtenidos de la compañía Charles River (Charles
River Laboratorios España). Todos los animales fueron mantenidos en condiciones adecuadas de
estabulación, en el Servicio de Producción Animal del Campus de Burjassot de la Universidad de
Valencia.
Para los estudios embrionarios se pusieron a cruzar animales de los genotipos apropiados a
última hora de la tarde. Si a la mañana siguiente, a primera hora, se observaba tapón vaginal
indicativo de una cópula, se separaba la hembra para el seguimiento de la gestación y se
consideraba como estadio embrionario (E) 0,5 el mediodía de ese día.
3.1.2. Genotipado
Para establecer el genotipo de cada animal se realizaba previamente la extracción de DNA a
partir de un trozo del extremo de la cola, en el caso de los animales adultos, o bien de parte de la
región posterior del cuerpo en el caso de los embriones. El procedimiento que se seguía se describe
a continuación.
47
Material y métodos
Protocolo de purificación de DNA genómico:
1. Se añade proteinasa K (0,1 mg/ml) en tampón específico (0,5% SDS, 0,1 M NaCl,
0,05 M Tris pH 8,0 y 3 mM EDTA) suficiente para cubrir la muestra (500 μl aprox.).
2. Se incuba durante toda la noche a 55-60 °C en rotación.
3. Se centrifuga a 16000 g (Eppendorf 5417R) durante 5 min.
4. Se cogen unos 300 μl del sobrenadante y se transfieren a otro tubo Eppendorf. Se
añaden 75 μl de acetato potásico 8 M (Panreac) y 500 μl de cloroformo (Panreac) y
se agita.
5. Se congela a -20/-70 °C. Tras descongelar bien, al menos durante 1 h, se
centrifuga a 16000 g durante 5 min.
6. Se recoge el sobrenadante (300 μl) en un tubo nuevo y se añade 1 ml de etanol
absoluto.
7. Se agita bien y se centrifuga durante 5-10 min.
8. Se lava dos veces con etanol al 70% y se deja secar el precipitado.
Alternativamente se puede pescar el DNA con una varilla de vidrio y se deja secar
igualmente.
9. Se resuspende el DNA en 100 μl de agua milli-Q (Millipore) y se guarda a 4°C.
Una vez obtenido el DNA genómico de cada individuo, se determinó el genotipo de los
animales mediante PCR (94°C/1’, 62°C/30’’, 72°C/1’ durante 35 ciclos), utilizando los siguientes
cebadores:
alelo salvaje wt directo
GGC GAC GTG AAG GAG CCA GGG A
alelo salvaje wt inverso
CAG CGA AAG GAA AGC CGA GTG ATG TAC T
alelo mutante neo directo CGG TGC CCT GAA TGA ACT GC
alelo mutante neo inverso GAT ACT TTC TCG GCA GGA GCA A
El genotipo de los ratones TH-hα-syn tg+ también se determinó por PCR (95°C/30’’, 70
°C/30’’, 72°C/90’’ durante 2 ciclos; 95°C/30’’, 66°C/30’’, 72°C/90’’ durante 2 ciclos; 95°C/30’’, 60
°C/30’’, 72°C/90’’ durante 25 ciclos) y los cebadores fueron:
directo GAT CTA ATG GGA CGG AGG CCT TTC T
inverso ATC ACA ATT GTT CTT AGG CTT CAG GTT CGT AGT CT
48
Material y métodos
3.1.3. Inyección de BrdU
Para los estudios de proliferación se procedió a la inyección intraperitoneal de 5-bromo-2desoxiuridina (BrdU, Sigma; 50 mg/kg peso animal) a partir de una solución de 10 mg/ml BrdU en
suero salino (0,9% cloruro sódico en agua destilada) de las ratonas gestantes con embriones del
estadio de interés. Las hembras se sacrificaron dos horas tras la inyección mediante dislocación
cervical, se diseccionaron los embriones como se comenta más adelante y se procesó el material
para la detección de la incorporación de BrdU mediante inmunocitoquímica.
3.1.4. Inyecciones de MPTP
Se administró un régimen crónico de inyecciones de MPTP (Sigma, 200 mg/kg) a ratones
macho de doce semanas de edad. El tóxico se disolvió en suero salino a una concentración de 10
mg/ml y se administró una inyección intraperitoneal a cada ratón, a razón de 40 mg MPTP/kg peso
animal, cada día durante 5 días consecutivos. Paralelamente, otra tanda de animales fueron
inyectados el mismo número de veces con suero salino. Los animales fueron sacrificados 4 días
tras la última inyección y se diseccionaron cuidadosamente corazón y glándulas adrenales de cada
animal para las cuantificaciones posteriores de proteínas mediante western blot y de
neurotransmisores mediante HPLC.
3.2. Técnicas de análisis in vivo
3.2.1. Procesamiento histológico
Hembras preñadas en distintos días de gestación fueron sacrificadas mediante dislocación
cervical y los embriones extraídos y fijados por inmersión en solución fijadora de Carnoy (60%
etanol absoluto, 30% cloroformo, 10% ácido acético). Los embriones fueron deshidratados (etanol
70%-96%-100%), aclarados en tolueno y embebidos en parafina y se obtuvieron series de cortes
sagitales de 7 μm mediante un microtomo de parafina (Leica). Las secciones fueron recogidas sobre
portaobjetos (O. Kindler GmbH), pretratados con una solución de gelatina alumbre (1:10 de la
solución madre que contiene alumbre de cromo al 0,14%, gelatina al 0,45% y azida sódica al 0,1%,
Prolabo), y teñidas con solución de Nissl (violeta de cresilo al 2%) o con hematoxilina de Gill nº 2
(Sigma). Para el análisis histológico de los ganglios simpáticos y sensoriales de animales
postnatales, se procedió a la disección de los ganglios y posterior fijación y procesado igual a los
realizados para los embriones.
49
Material y métodos
3.2.2. Técnicas inmunohistoquímicas
Para realizar las detecciones inmunocitoquímicas en cortes de parafina se procedió a la
desparafinación con xilol (Panreac), durante 15 min, e hidratación de las preparaciones histológicas
en una batería de alcoholes de concentración decreciente (100, 96, 70%), seguido del lavado en
tampón fosfato, 0,1 M (4 Na2HPO4 0,1 M: 1 NaH2PO4 0,1 M, Panreac) a pH 7,4 (PB).
En aquellos casos en los que la detección inmunocitoquímica se basó en el marcaje con
peroxidasa, se bloqueó la peroxidasa endógena mediante una incubación en metanol al 10% y H2O2
al 3% en PB durante 15 min, seguido de un lavado con PB. En el caso de que la detección a realizar
fuese la de la BrdU inyectada, se procedió a la desnaturalización de la cromatina con HCl 2 N
durante 20 min a 37 °C, seguida de una neutralización con borato sódico 0,1 M, pH 8,5, durante 10
min.
En todos los casos, previo a la adición del anticuerpo primario, se bloquearon las uniones
inespecíficas incubando las secciones en PB con Triton X-100 (Sigma) al 0,2% y suero de cabra al
10% (solución de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpo
primario diluido en solución de bloqueo, a la dilución que se especifica en la siguiente tabla (Tabla
6), se realizó durante toda la noche.
Tabla 6. Anticuerpos primarios utilizados para inmunocitoquímica
Anticuerpo primario
dilución (concentración)
origen
(referencia comercial, clon)
conejo anti-fosfo-Akt
1:100 (no especif.)
Cell Signaling (9611)
conejo anti-PKC-delta
1:200 (200 µg/ml)
Santa Cruz (sc-213, C-17)
conejo anti-caspasa 3 activada
1:300 (no especif.)
Cell Signaling (9661)
conejo anti-LSox5
1:100 (no especif.)
Julio A. Barbas
conejo anti-tirosina hidroxilasa
ratón IgG anti-α-sinucleína humana
ratón IgG1 anti-bromodesoxiuridina
1:300 (67 µg/ml)
Pel-Freez (P40101)
1:200 (no especif.)
Zymed Labs (LB509)
1:300 (53 µg/ml)
Dako (M0744)
ratón IgG1 anti-sinucleína-1
1:100-1:500 (250 µg/ml)
Trans Labs (S63320, clon 42)
ratón IgG2a anti-β-tubulina III
1:700 (1000 µg/ml)
Covance (MMS-435P, clon TUJ1)
Tras varios lavados con PB, las secciones fueron incubadas durante 1 h a temperatura
ambiente con anticuerpos secundarios apropiados según el anticuerpo primario y el sistema de
detección deseado, todos ellos recogidos en la Tabla 7.
50
Material y métodos
Tabla 7. Anticuerpos secundarios utilizados para inmunohistoquímica
marcador
dilución
casa comercial
caballo IgG anti-ratón
biotina
1:300
Vector Labs
cabra IgG anti-conejo
biotina
1:300
Vector Labs
F(ab’)2 cabra anti-IgG de ratón
AlexaFluor 488
1:1000
Molecular Probes
F(ab’)2 cabra anti-IgG de conejo
AlexaFluor 488
1:1000
Molecular Probes
F(ab’)2 cabra anti-IgG de ratón
Cy3
1:1500
Jackson ImmuRes.
F(ab’)2 burro anti-IgG de conejo
Cy3
1:1500
Jackson ImmuRes.
Método de la peroxidasa
Inmunofluorescencia
Para las detecciones basadas en peroxidasa, se utilizaron anticuerpos secundarios
biotinilados y, tras varios lavados con PB, se procedió a la incubación de las secciones con el
complejo avidina-biotina peroxidasa (ABC) (Vector Labs; Pierce), según especificaciones del
fabricante, durante 1 h a temperatura ambiente. Tras varios lavados con PB, la peroxidasa del
complejo se reveló mediante una solución de 3,3’-diaminobencidina 4-HCl (DAB, Sigma) al 0,05% y
H2O2 al 0,003% en PB durante 5 min y/o hasta que se apreciaba la aparición de la reacción
coloreada específica en el tejido en inspección ocular bajo una lupa. Tras lavar las secciones con
PB y agua, éstas fueron deshidratadas en una batería de alcoholes de concentración creciente (70,
96, 100 %), aclaradas con xilol, y montadas de forma permanente con medio de montaje (Eukitt,
Panreac) y cubreobjetos.
En el caso de las detecciones fluorescentes se utilizaron anticuerpos secundarios marcados
con fluoróforos que emitían o bien en el espectro verde (AlexaFluor 488) o bien en el rojo (Cy3) y,
tras la incubación en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 1 h a temperatura
ambiente y los correspondientes lavados, las secciones fueron incubadas en una solución de 4’,6diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma) a 10-50 µg/ml durante 5 min y, tras lavar con agua destilada, se
montaron las preparaciones colocando 20-80 µl de medio de montaje comercial especial para
muestras fluorescentes (FluorSave™, Calbiochem). Las muestras se observaron en un microscopio
de fluorescencia convencional (Nikon E600) o en microscopio confocal (Leica Multiespectral del
Servicio de Microscopía Electrónica de los Servicios Centrales de Soporte a la Investigación
Experimental de la Universidad de Valencia).
51
Material y métodos
3.2.3. Recuentos celulares
Los ganglios nodoso (NOD) y cervical superior (SCG) fueron identificados y mapeados en las
series de cortes sagitales de los distintos embriones utilizando una lupa binocular. Se tomaron
fotografías al microscopio de una sección de cada cuatro y se contabilizaron las células BrdU
positivas y el resto de células, identificadas por la contratinción con hematoxilina de Gill nº 2, en
cada una de las secciones fotografiadas. Se promedió el número de células contadas en los cortes
seleccionados extrapolándolo al número total de secciones que constituían cada ganglio, tal como
se describe en Fariñas et al., (1996). El recuento en los ganglios postnatales se realizó de igual
modo que en los embrionarios pero en preparaciones teñidas con violeta de cresilo al 2% (tinción de
Nissl).
3.3. Cultivos celulares primarios
3.3.1. Disección, disociación y sembrado de las células
Para las disecciones se utilizó material de acero inoxidable (Dumont Dumostar) más o menos
fino, dependiendo de la consistencia y edad del tejido a diseccionar, que se desinfectó con alcohol
al 70% durante al menos una hora antes de empezar cada disección, así como placas de plástico
estériles de 60 y 100 mm de diámetro (Orange Scientific).
Para la obtención de los embriones y ganglios se siguió el siguiente procedimiento.
Protocolo de disección de los embriones de ratón:
1. Se sacrifica la ratona gestante mediante dislocación cervical.
2. Se limpia el abdomen de la hembra con alcohol al 70%.
3. Se realiza una pequeña incisión en la piel de la ratona a nivel abdominal, cortando
desde el centro hacia los lados.
4. Se coge con pinzas el útero con los embriones y se corta a cada lado de los
ovarios asegurando la extracción de todos los embriones y se colocan en una placa
de 100 mm de diámetro con medio L15.
5. Se separa cada uno de los embriones del útero con las tijeras y con pinzas se
facilita la extracción de la bolsa embrionaria. Se eliminan los posibles restos de
membranas.
52
Material y métodos
Protocolo de disección de los ganglios NOD y SCG de los embriones E14,5:
1. Se decapitan los embriones y elimina la parte superior de la cabeza por encima de
los ojos con tijeras finas. Se divide la cabeza por el plano sagital y eliminan los
posibles restos de cerebro que pudieran quedar adheridos.
2. Colocando una mitad del cráneo con el plano cortado hacia arriba, se realiza una
pequeña incisión con pinzas finas a nivel del hueso occipital y se levanta hacia la
región posterior de la cabeza. Debajo de este hueso y pegado a la estructura ósea
del oído interno se encuentran los ganglios NOD y SCG.
3. Se recolectan cuidadosamente los ganglios con pinzas muy finas. Ambos ganglios
tienen aspecto blanquecino y transparente. El NOD es una estructura con forma
redondeada, mientras que el SCG es una estructura con forma alargada que se
encuentra en la base inferior del NOD.
4. Se eliminan las raíces de dichos ganglios con bisturís de modo que queden lo más
limpios posible.
5. Se recogen los ganglios con pipeta Pasteur de vidrio pretratada para hacerla
antiadherente y se depositan en un tubo falcon de 10 ml (Orange Scientific).
Para la disección de los ganglios NOD y SCG en animales P7 se puede seguir el
procedimiento de los E14,5. Después, hay que asegurarse de eliminar todo el tejido circundante
(raíces nerviosas, tejido conjuntivo, grasa, etc.) y es necesario trocear los ganglios con bisturís de
modo que el tejido quede más accesible a las enzimas digestivas.
Para la recolección de los ganglios fue necesario el empleo de pipetas Pasteur largas de
vidrio tratadas para evitar que el tejido aislado se pegara al vidrio. El tratamiento, que siempre se
realizó en campana de flujo laminar (Telstar), consistió en:
1. Estrechamiento de la punta de vidrio con llama para eliminar cualquier imperfección
del vidrio que pudiera dañar los ganglios y disminuir el volumen de paso.
2. Recubrimiento de la pipeta con una solución Sigmacote (Sigma) aspirando varias
veces la solución mediante el empleo de una tetina de plástico. Se trata de una
solución antiadherente de silicona en heptano que forma una capa covalente y
microscópica sobre el cristal. Se deja secar unos minutos.
3. Lavado con agua milli-Q estéril, aspirando y soltando varias veces. Se deja secar
unos minutos.
4. Recubrimiento de la pipeta con cualquier tipo de suero estéril, como suero de
caballo (HS; Gibco). Se deja secar unos minutos.
53
Material y métodos
Todos los medios utilizados fueron filtrados a través de filtros de tamaño de poro 0,2 μm
(Millipore) para su completa esterilización. Se utilizó medio de cultivo L15 (Gibco) para la disección
de los embriones y/o animales postnatales y medio F12 (Gibco) para el lavado de los ganglios,
células y placas, adicionando al medio antibiótico/antimicótico (60 μg/ml de penicilina y 100 μg/ml de
estreptomicina, Gibco). También se utilizó medio HBSS sin calcio y sin magnesio (Gibco) al que se
le añadió 0,2% Na2HCO3 (Sigma) para las digestiones. Antes de su uso, los medios de cultivo
fueron atemperados a 37°C.
Para la disociación de las células se procedió en la forma que se indica a continuación.
Protocolo de disociación de las células:
1. Se lavan los ganglios recolectados con medio F12. Para ello se añade más medio
F12 en el tubo con los ganglios y se centrifuga. Los ganglios embrionarios se
centrifugan a 2000 g durante 2 min mientras que los ganglios de P7 se centrifugan
a 1300 g durante 2 min. Se elimina el sobrenadante.
2. Se procede a la digestión enzimática para disociar las células. Para los ganglios
embrionarios se añade tripsina al 0,05% (Worthington) en HBSS sin calcio y sin
magnesio. Se incuba el contenido en baño a 37°C durante 15 min. Los ganglios
postnatales requieren de la incubación secuencial con dos enzimas digestivas:
colagenasa (Worthington) y tripsina. Primero se añade la colagenasa al 0,2% en
F12 y se preincuba a 4°C durante 30 min. Posteriormente se incuba a 37°C
durante 15 min. Se elimina la enzima con un lavado en F12. En segundo lugar, se
añade la tripsina al 0,05% en HBSS sin calcio ni magnesio e incuba durante 20 min
a 37°C. Se inactiva la tripsina añadiendo suero de caballo inactivado por calor
(HIHS) (Gibco) al 10% en F12.
3. Se hacen dos lavados con F12. En el caso de las neuronas postnatales es
necesario añadir DNAsa bovina pancreática (tipo IV, Sigma) a 40 μg/ml ya que se
libera DNA de las células dañadas y esto dificulta la trituración y el lavado posterior
de las células.
4. Tras eliminar el sobrenadante, se añade 1 ml de medio de cultivo definitivo, esto
es, F12 suplementado (ver composición más adelante).
5. Se disgrega mecánicamente con una pipeta Pasteur pretratada, aspirando el
volumen y expulsándolo de manera firme pero suave tratando de evitar tanto una
excesiva disgregación como la formación de burbujas.
6. Se examina una gota de la suspensión celular bajo microscopio invertido para
analizar el estado de disgregación.
54
Material y métodos
7. Se realiza un recuento estimativo del número de células viables en cámara
Neubauer. Para ello se mezclan 10 μl de la suspensión celular y 10 μl de azul
tripán (0,1% azul tripán en suero salino, Sigma) y se colocan 10 μl de la mezcla
bajo el cristal de la cámara. Se realiza el recuento de los cuatro cuadrantes
principales de las células no teñidas y, por tanto, viables, y se aplica la siguiente
fórmula para determinar el número de células vivas por mililitro de suspensión
celular:
Nº células/ml = (recuento células/4) * 2 * 10000
El número óptimo de células a sembrar para conseguir un cultivo a baja densidad es
de unas 3000 por placa de 35 mm. En estos cultivos se trata de minimizar los posibles
efectos de las neurotrofinas u otros factores tróficos que puedan liberar las propias
neuronas y/o glía del cultivo.
Las placas de cultivo utilizadas para la siembra de las células obtenidas fueron placas de
plástico estériles de dos tamaños: placas de 35 mm de diámetro (Nunc), para los recuentos de
supervivencia, y placas de 24 pocillos (Orange Scientific) con cubres de cristal estériles (O. Kindler
GmbH) para las inmunocitoquímicas. En ambos casos, el sustrato utilizado para la adhesión de las
células fue poli-D/L-ornitina/laminina (Edgard et al., 1984). Las soluciones de sustratos y las
condiciones de tratamiento con los mismos fueron:
•
poli-D/L-ornitina (Sigma), a 0,5 mg/ml en tampón borato 0,15 M pH 8,7. Se incuban
las placas durante toda la noche con la solución de poli-D/L-ornitina, se lavan
varias veces con agua milli-Q y se dejan secar.
•
laminina (Sigma), a 20 μg/ml en HBSS sin calcio ni magnesio. Se incuban las
placas, previamente tratadas con poli-D/L-ornitina, con la solución de laminina
durante al menos 3 h a 37 °C en incubador.
El medio F12 suplementado en el que se sembraban las células disgregadas consistió en
medio F12 con un suplemento compuesto por glutamina 2 mM, BSA al 0,35% (Albumax II; Gibco),
60 ng/ml de progesterona (Sigma), 16 pg/ml de putrescina (Sigma), 400 ng/ml de L-tiroxina (Sigma),
38 ng/ml de selenito sódico (Sigma), 340 ng/ml de triyodotironina (Sigma), 60 pg/ml de penicilina y
100 pg/ml de estreptomicina (Gibco) (Davies et al., 1993). A partir de la suspensión de células tras
la disociación en 1 ml de F12 suplementado, se transfería este volumen a un tubo falcon de 50 ml,
añadiendo el volumen de medio definitivo necesario para distribuir 1 ml de la suspensión celular por
placa de 35 mm o 0,5 ml por pocillo de la placa de 24 pocillos ya que, previamente, se había
añadido la mitad del volumen final en el pocillo junto con las neurotrofinas. Seguidamente, se movía
55
Material y métodos
el tubo falcon suavemente para tratar de distribuir homogéneamente las células en el medio.
Finalmente, se sembraba el volumen adecuado de la suspensión celular en las placas y se
introducía en el incubador de CO2 (Forma Scientific) (5% CO2, 95% humedad).
Las neuronas periféricas pueden requerir un aporte neurotrófico específico dependiendo del
tipo y edad para permitir su supervivencia en cultivo. Así, a las neuronas nodosas embrionarias en
cultivo se les añadió factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF; Peprotech). A las neuronas
simpáticas E14,5 del SCG se les añadió factor de crecimiento nervioso (NGF; Peprotech) y
neurotrofina 3 (NT-3; Peprotech). A las neuronas P7 del SCG se les añadió NGF. La neurotrofina se
añadió al medio de cultivo de la placa antes de añadir el resto de volumen con la suspensión
celular.
3.3.2. Tratamientos
Los compuestos empleados para los diferentes tratamientos de las células en cultivo fueron
citosina arabinósido (ara-C; Sigma) al 0,5 y 1 mM en F12 suplementado; rottlerina (Calbiochem) a
0,1, 1, 3 y 10 μM en DMSO; 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA; Calbiochem) a 0,1 μM en
DMSO; 2-(4-morfolinil)-8-fenil-cromona (LY294002; Calbiochem) a 10, 20 y 50 μM en DMSO; 1metil-4-fenilpiridina (MPP+; Sigma) a 1, 10, 50 y 100 μM en F12 suplementado; desipramina (DMI;
Sigma) a 4 nM y 10 μM en F12 suplementado; inhibidor de la quinasa asociada a Rho a 1,6 nM
(ROCK; Calbiochem). El sulfóxido de dimetilo (DMSO; Sigma) necesario como disolvente de
algunos de los compuestos utilizados se utilizó como máximo al 0,2% en el medio de cultivo final.
Se comprobó previamente que esta concentración final de DMSO no tenía efecto en la
supervivencia de las distintas poblaciones de células estudiadas y, en aquellos casos en los que el
DMSO constituía el vehículo de la molécula ensayada, el control siempre fue DMSO a la misma
concentración.
3.3.3. Recuentos de supervivencia neuronal
Los cultivos se realizaron a baja densidad, para minimizar los efectos tróficos auto/paracrinos
de las propias neuronas y garantizar el estudio de los efectos inducidos por los factores
neurotróficos que añade el propio investigador. El recuento de células en las placas de 35 mm se
hizo sobre una retícula de tamaño fijo. Las dimensiones de la gradilla eran 12 x 12 mm y se trazó
con un escalpelo sobre la base de una placa petri de plástico de 100 mm de diámetro utilizando un
papel milimetrado y bajo los oculares de una lupa. Los recuentos celulares de supervivencia se
56
Material y métodos
determinaron con el objetivo de 10x del microscopio invertido. Se estableció un criterio morfológico
para la identificación de las neuronas como aquéllas con a) un soma bastante redondeado,
refringente y más o menos grande, al menos con respecto al de otras células presentes en el
cultivo, y b) presencia de neuritas más o menos largas. Para garantizar que los experimentos y
réplicas (n = 3) eran comparables entre sí se realizaba, para cada experimento, un recuento inicial a
las 6 h tras el sembrado inicial, tiempo suficiente para que las neuronas se depositaran sobre el
fondo de la placa de cultivo y comenzasen a emitir las características neuritas que las hacen
reconocibles morfológicamente. Tras este recuento, que en nuestros experimentos, rindió un
número de neuronas de 300-800 en la superficie considerada, se añadieron los distintos
tratamientos. Los recuentos de supervivencia neuronal se realizaron a 24, 48 y 72 h desde la
siembra El recuento de supervivencia se ha representado en todos los casos como el tanto por
ciento de neuronas supervivientes respecto del recuento inicial a las 6 h.
3.3.4. Estudios morfométricos
El estudio del crecimiento neurítico en las neuronas nodosas embrionarias se realizó a partir
de fotografías tomadas con óptica de contraste de fases cada 20 min hasta un total de 2 h. El
crecimiento neurítico se determinó midiendo tanto los avances como los retrocesos de las neuritas
de cada neurona.
El estudio en las neuronas embrionarias simpáticas se realizó en células fijadas a los tiempos
establecidos de 2 y 6 h, cuando las neuritas ya se habían extendido una longitud adecuada. Tras la
fijación, se fotografiaron las células de la región central de la placa a 20x en el microscopio invertido
con óptica de contraste de fases, para su posterior análisis. A partir de las fotografías, se obtuvieron
dibujos en papel de acetato de los perfiles de las diferentes neuritas que partían del soma de cada
neurona. Tras el escaneado de los dibujos, se trataron las imágenes para homogeneizar las líneas
de los dibujos utilizando un programa de análisis de imagen (Scion Image para Windows de Scion
Corporation), se binarizó la imagen y se midió el perímetro de las neuritas, cuantificando así el
crecimiento neurítico de cada neurona.
3.3.5. Inmunocitoquímica
La inmunocitoquímica de células en cultivo se realizó a partir de células sembradas sobre
cubreobjetos de cristal en placas de 24 pocillos. La densidad celular en estos casos fue de 10000
células o más por pocillo. Inicialmente se procedió a eliminar cuidadosamente el medio de cultivo de
57
Material y métodos
los pocillos y se fijaron las células con paraformaldehido (PFA; Panreac) al 4% en PB, a 37°C
durante 20 min. Tras varios lavados con PB, se bloquearon las uniones inespecíficas con 0,2%
Triton X-100 al 0,2%, glicina 0,1 M (Sigma), 10% de suero bovino (CS; Sigma) y gelatina al 0,1%
(Panreac) en PB durante 30 min y agitación suave. Después se incubaron las células con el
anticuerpo primario correspondiente (ver Tabla 6) diluido en la solución de bloqueo anteriormente
mencionada, a 4°C durante toda la noche.
Tras el lavado del anticuerpo primario con PB en agitación, se incubaron los cubreobjetos con
el anticuerpo secundario fluorescente correspondiente (ver Tabla 7) diluido en la solución de
bloqueo, durante 1 h en agitación a temperatura ambiente y posterior lavado con PB. Para poder
detectar todas las células presentes en la preparación se tiñeron los núcleos con DAPI durante 5
min, se lavó la preparación con agua destilada y se realizó el montaje colocando unos 20 μl de
medio de montaje para fluorescencia (FluorSave) en el portaobjetos y depositando sobre este el
cubreobjetos con las células hacia el medio de montaje.
Alternativamente, para obtener una inmunocitoquímica para microscopio de campo claro se
utilizaron anticuerpos secundarios biotinilados, ABC peroxidasa y revelado con solución DAB al
0,05% con H2O2 al 0,003% en PB durante unos minutos, tal y como se describe en el apartado
3.2.2.
3.4. Cultivo de células PC12
3.4.1. Mantenimiento y tratamientos
La línea celular PC12 (Greene y Tischler, 1976) procede de un feocromocitoma de rata y ha
sido ampliamente utilizada como modelo de línea neural. Cuando se cultivan células PC12 en medio
con suero o en presencia de EGF (factor de crecimiento epidérmico), éstas presentan una
morfología redondeada y proliferan extensamente, de forma similar a células de la médula cromafín
inmaduras y a simpatoblastos. Cuando se las cultiva en presencia de NGF, las PC12 cesan su
división celular y extienden neuritas adoptando gradualmente características de neuronas
simpáticas maduras. En nuestros experimentos, las células PC12 se mantuvieron en condiciones de
proliferación con 10% HS y 5% FBS inactivados por calor en DMEM (Gibco) en placas de 100 mm
de diámetro, y transferidas a una nueva placa a densidad subconfluente. Las células PC12
utilizadas pertenecían a dos líneas celulares estables de PC12 en las que se había introducido el
vector pT7-7 conteniendo el gen reportero modificado eyfp (PC12-EYFP) o bien la construcción hαsyn-eyfp (PC12-EYFP-hα-SYN) (Martín-Clemente et al., 2004) generosamente cedidas por el
58
Material y métodos
laboratorio del Dr. José González Castaño, del Departamento de Bioquímica de la Universidad
Autónoma de Madrid.
Para los ensayos de supervivencia celular y para los de western blot las células se sembraron
en placas de 96 pocillos y placas de 100 mm de diámetro, respectivamente, a una densidad de 3 x
106 células/cm2 en DMEM con HS al 1,5%. A los dos días se trataron las células con MPP+ (0,2 y
0,5 mM), rottlerina (1, 3 y 5 µM) y las correspondientes combinaciones de MPP+ y rottlerina. Se
tuvieron en cuenta las concentraciones de DMSO utilizadas y se añadieron a los respectivos
controles.
3.4.2. Ensayos de viabilidad celular
Se realizaron ensayos de viabilidad celular a las 24, 48 y 72 h desde el inicio de los
tratamientos. Para determinar la viabilidad celular se empleó el ensayo de reducción de una sal de
tetrazolio (MTT, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio) (Mosmann, 1983). Para ello, se añadió
MTT (Sigma) al 0,2 mg/ml a cada pocillo y se incubaron las células durante 60 min a 37°C. Tras
lavado con PBS, el cristal de formazán de color azul oscuro e insoluble formado por la reducción por
las hidrogenasas mitocondriales de las células vivas se solubilizó con 200 µl de DMSO por pocillo y
se midió la absorbancia a 595-690 nm utilizando un lector colorimétrico de placas (Victor, PerkinElmer). Cada valor de absorbancia se relativizó respecto de su control sin tratamiento.
3.4.3. Inmunofluorescencia
El procedimiento fue el mismo que se describe en el apartado 3.3.5. de esta sección de
Material y métodos. Las células se sembraron sobre cubreobjetos de cristal en placas de 24 pocillos
a la misma densidad utilizada para los ensayos de viabilidad celular. A las 24 h de tratamiento se
fijaron las células con PFA al 4% en PB durante 20 min a 37°C y se realizó la detección
inmunofluorescente de algunos anticuerpos primarios que se indican en la Tabla 6. Para visualizar
la preparación se montaron los cubreobjetos sobre portaobjetos utilizando Fluorsave. Las
preparaciones se analizaron en el microscopio confocal para detectar la inmunofluorescencia y la
señal de la EYFP.
59
Material y métodos
3.5. Inmunodetección de proteínas por western blot
3.5.1. Extracción de proteínas
La extracción de proteínas a partir de cultivos celulares y tejidos se realizó en tampón de lisis
frío, consistente en Tris-HCl 50 mM a pH 7,4 (Sigma), NaCl 150 mM (Sigma), EDTA 5 mM (Sigma),
Triton X-100 al 1%, una mezcla de inhibidores de proteasas (complete Mini de Roche;
concentración según especificación del fabricante) y de fosfatasas con una solución de
ortovanadato sódico 1 mM (Sigma). Tanto en el caso de los cultivos primarios de neuronas
simpáticas y nodosas embrionarias como en el caso de los cultivos celulares de PC12, la extracción
se llevó a cabo 24 h tras el sembrado celular. Tras eliminar el medio de cultivo de las placas donde
se sembraron las células, se realizaron dos lavados con PBS estéril y frío, para eliminar restos del
medio de cultivo, y se añadió tampón de lisis. Tras realizar un barrido sobre la placa con un
rascador para recoger todas las células posibles se transfirieron éstas a un tubo eppendorf en el
que se dejó actuar el tampón de lisis durante 20 min en hielo. La extracción de la proteína de
corazón y ganglios se realizó tras la extracción de las muestras y limpieza en PBS estéril. Para ello,
se procedió a la disociación del tejido, utilizando un homogeneizador de cristal, en tampón de lisis
dejándolo actuar, posteriormente, 20 min en hielo. Tras la lisis, se centrifugó la muestra a 16000 g
durante 20 min y se recogió el sobrenadante cuidadosamente para evitar los restos celulares
sedimentados transfiriéndolo a un tubo nuevo. A partir de una curva patrón con concentraciones
conocidas de albúmina de suero bovino (BSA; Pierce) se determinó la concentración de proteína
mediante el método Biorad DC Protein Assay y su detección colorimétrica en un espectrofotómetro
(Victor, Perkin Elmer).
3.5.2. Electroforesis y transferencia
Los geles de poliacrilamida-SDS para proteínas y la transferencia a membranas se hicieron
según protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). Se utilizaron geles homogéneos de acrilamida
(Pronadisa) al 10% o 15% (p/v) en condiciones desnaturalizantes, y un gel de empaquetamiento al 4
% (p/v). Se cargaron entre 25-50 µg de proteína desnaturalizada (100 °C durante 5 min en un
termobloque) mezclada 2:1 con tampón de carga (volumen muestra: volumen tampón) (Tris-HCl 185
mM pH 6,8, SDS al 3,5%, glicerol al 30%, β-mercaptoetanol al 10% y azul de bromofenol al 0,25%)
y se añadió en una de las carreras un marcador de pesos moleculares preteñido (rango 20-120 pb,
Fermentas) y se sometió a electroforesis a 150 voltios hasta que el frente del marcador de pesos
moleculares llegaba al otro extremo del gel (equipo Bio-Rad, Mini-Protean II). El tampón de
60
Material y métodos
electroforesis constó de glicina 0,2 M (Sigma), Trizma base 25 mM (Sigma) y dodecilsulfato sódico
(SDS, Panreac) al 1%.
Para la electrotransferencia de las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa (Hybond
ECL, Amersham Pharmacia Biotech) se utilizó un aparato Trans Blot SD de Biorad, a 120 voltios
durante 1 h. El tampón de transferencia constó de Trizma-base 25 mM para electroforesis a pH 8,3,
glicina 0,192 M y metanol al 20%. Posteriormente se comprobó la eficiencia de la transferencia de
proteínas mediante tinción con rojo Ponceau (rojo Ponceau al 0,5% en ácido acético glacial al 1%,
Sigma).
3.5.3. Inmunodetección
Se lavaron varias veces las membranas con la solución salina Tris (Trizma HCl 100 μM pH
7,8 y NaCl al 0,9%) con Tween-20 (Sigma) al 0,1% (TBS-T), para eliminar los restos de rojo
Ponceau. Después, se bloquearon las membranas con tampón bloqueo (leche desnatada en polvo
al 5% en TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente y en agitación y se incubaron con los
anticuerpos primarios a la concentración correspondiente en tampón bloqueo durante toda la noche
a 4°C y agitación. Los anticuerpos primarios utilizados, dilución y casa comercial se especifican en
la siguiente tabla (Tabla 8).
Tabla 8. Anticuerpos primarios usados en inmunodetección de proteínas
Anticuerpo primario
dilución (concentración)
casa comercial
1:300 (67 µg/ml)
Pel-Freez
conejo anti-PGP9.5
1:1500 (no especif.)
UltraClone (RA95101)
ratón anti-β-actina
1:5000 (2400 µg/ml)
Sigma (clon AC-15)
ratón IgG anti-GAPDH
1:3000 (0,67 µg/ml)
Abcam
ratón IgG1 anti-sinucleína 1
1:1000 (250 µg/ml)
Transduction Labs
conejo anti-tirosina hidroxilasa
Tras lavarse las membranas varias veces con TBS-T, se incubaron con los anticuerpos
secundarios anti-ratón (1:2000, Chemicon), anti-conejo (1:50000, Amersham Biosciences)
conjugados con peroxidasa en tampón bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente y agitación.
Tras varios lavados con TBS-T seguido de uno con TBS, se reveló con luminol (Lumilight de
Roche o ECL Advance de Amersham Pharmacia Biotech, este último más sensible), y se capturó la
61
Material y métodos
señal luminiscente en un documentador de geles (Gel Logic 440 Imaging System, Kodak). Cuando
fue necesario cuantificar los niveles de las bandas de proteínas se determinaron con el programa
Quantity One de BioRad Laboratories utilizando como control la señal para β-actina o GAPDH.
3.6. Análisis estadístico
El programa de análisis estadístico utilizado ha sido el SPSS 12.0 para Windows (SPSS Inc.,
Chicago, EEUU; Statistical Product and Service Solutions). Se realizó un test para la normalidad
(test de Kolmogorov-Smirnov, Sokal y Rohlf, 1995) y otro para la homogeneidad de varianzas (test
Levene). Cuando los datos se distribuyeron normalmente y presentaron varianzas homogéneas se
les aplicó una prueba paramétrica (test t de Student entre genotipos o modelo lineal general
univariante entre tratamientos y genotipos; Sokal y Rohlf, 1995). En los casos de porcentajes se
aplicó la transformación arcsen(raíz(porcentaje)) antes de la aplicación de los tests estadísticos. En
los tests se utilizaron valores de α<0,05 para determinar la significatividad estadística.
62
4. RESULTADOS
63
Resultados
4.1. Estudio del patrón de expresión de la α-SYN en el SNP
4.1.1. Marcadores específicos para la α-SYN
A fin de establecer el patrón espacial y temporal de expresión de la α-SYN en el SNP
durante la embriogénesis utilizamos varios anticuerpos anti-α-SYN (ver Tabla 9), incluyendo
cuatro anticuerpos comerciales y cuatro anticuerpos (mAb α-SYN 1-4) cedidos por el laboratorio
del Dr. Arnon Rosenthal en Rinat Neuroscience Ltd., sobre cortes completos de embriones en
distintos días embrionarios (E) postconcepción, dentro del periodo de desarrollo de las distintas
subdivisiones del SNP.
Tabla 9. Anticuerpos anti-α-SYN
referencia
especie
procedencia
dilución
marcaje
inmunógeno
610787
ratón
α-SYN de rata (aa. 15-123)
ratón
0,5-2,5 ng/ml
1:1000
+++++
18-0215
Trans Labs
Zymed
+++
LB de pacientes con LB
AB5038
conejo
Chemicon
1:1000
+
α-SYN humana (aa. 111-131)
sc-7011 (C-20)
sc-7012 (N-19)
cabra
cabra
Santa Cruz
Santa Cruz
2 µg/ml
2 µg/ml
-
α-SYN humana (C-ter)
mAb α-SYN 1
ratón
A. Rosenthal
1 µg/ml
+
α-SYN humana (N-ter)
α-SYN humana
mAb α-SYN 2
ratón
A. Rosenthal
1 µg/ml
++++
α-SYN humana
mAb α-SYN 3
ratón
A. Rosenthal
1 µg/ml
+++
α-SYN humana
mAb α-SYN 4
ratón
A. Rosenthal
1 µg/ml
++
α-SYN humana
El anticuerpo que nos proporcionó mejores resultados fue el anticuerpo comercial de
Transduction Labs, aunque los resultados obtenidos con los distintos anticuerpos fueron
congruentes. Para analizar la especificidad de los anticuerpos se utilizaron controles positivos
consistentes en cortes de cerebro humano obtenidos post mortem de pacientes con demencia
con cuerpos de Lewy (generosamente cedidos por el Dr. Isidro Ferrer de la Universidad de
Barcelona), en los que aparecen agregados de α-SYN, y controles negativos consistentes en
cortes de embriones mutantes nulos para α-syn (datos no mostrados). Además, se realizaron
determinaciones mediante la técnica de western blot para confirmar que el anticuerpo utilizado
para los análisis inmunocitoquímicos reconocía, en homogenados procedentes de ganglios del
SNP, una sola banda correspondiente al tamaño descrito para la α-SYN en otras estructuras
(Figura 13). Utilizando este anticuerpo, realizamos un seguimiento del patrón de expresión desde
el estadio embrionario E10,5 hasta estadios postnatales (P) tempranos de ratón, identificando
qué estructuras aparecían marcadas y cómo variaba la expresión de α-SYN a lo largo del tiempo.
64
Resultados
Estudiamos tanto la distribución del marcaje como su intensidad, así como qué tipo/s celular/es
expresaba/n dicha proteína realizando dobles marcajes con diversos marcadores celulares.
NOD
+/+
SCG
-/-
+/+
-/-
α-SYN
β-actina
Figura 13. Detección de la proteína α-SYN (19 kDa) por western blot. Las muestras se obtuvieron a
partir de homogenados de los ganglios NOD y SCG (50 μg de proteína total por carril) de animales de
E14,5 de genotipo salvaje (+/+) y mutante nulo para α-syn (-/-).
4.1.2. La α-SYN se expresa abundantemente en el sistema sensorial y el
simpático
En embriones sólo se observa expresión de α-SYN en tejido neural, tanto en estructuras
del SNP como del SNC, aunque el momento de inicio de la expresión varía para cada estructura.
La expresión de la α-SYN se detecta muy pronto en el desarrollo embrionario del sistema
nervioso (Tabla 10). En E10,5 se observa por primera vez expresión en algunas estructuras
nerviosas y en E12,5 ya se puede observar expresión de α-SYN en diferentes regiones del SNC
como los bulbos olfatorios, la substantia nigra o las zonas adyacentes al cuarto ventrículo. Quizá
lo más sobresaliente en estos estadios es que la expresión de α-SYN es más abundante en
estructuras del SNP que en núcleos cerebrales (Figura 14 y Tabla 10). En el SNP la α-SYN se
localiza en diferentes ganglios, tanto sensoriales como autonómicos. A nivel craneal observamos
ganglios sensoriales inmunorreactivos para α-SYN como el trigémino (TRI), el complejo nodosopetroso (NOD), el complejo superior-yugular (SY) y el estato-acústico del oído interno (OI)
(Figura 14 A). En E13,5, la α-SYN se localiza, además, en el núcleo mesencefálico del trigémino
(TMN), que aunque localizado en el SNC está constituido por neuronas sensoriales primarias, y
en el recientemente formado ganglio cervical superior (SCG), de modalidad simpática. También
en este estadio comienza a observarse expresión de la α-SYN en los ganglios espinales de la
raíz dorsal (DRG) (Figura 14 B). En general, no encontramos ningún ganglio periférico que no
exprese α-SYN y la expresión de la proteína en estos ganglios es muy abundante y generalizada
en estadios en los que a nivel del SNC se encuentra restringida a muy pocas neuronas.
La expresión de α-SYN se mantiene a lo largo del tiempo una vez aparece en cada
estructura del SNP (ver Tabla 10). Al principio del desarrollo de cada estructura analizada
aparecen solamente algunas neuronas altamente inmunorreactivas y, posteriormente, la
expresión se generaliza al resto de neuronas del ganglio aunque con niveles de expresión más
bajos (Figura 14). A nivel celular, la α-SYN se localiza tanto en las fibras (Figura 14 B) como en
los somas de las neuronas periféricas (Figuras 14 C-E; 15). No hemos detectado expresión
65
Resultados
nuclear de esta proteína en ninguna de las células observadas en cortes histológicos. Por otro
lado, por la morfología y ubicación de las células que expresan α-SYN, así como por el momento
en que se muestran inmunorreactivas, parece tratarse de una proteína neuronal.
Tabla 10. Estructuras que expresan α-SYN en el SNC y SNP durante el desarrollo
E10,5
E11,5
E12,5
E13,5
E14,5
E15,5
E16,5
E17,5
+++
+++
+++
+++
++
++
+++
ganglio estato-acústico
+++
+++
+++
++
++
n.d.
complejo superior-yugular
+++
+++
+++
++
++
n.d.
+
++
++
++
++
++
+++
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
++
+++
+++
n.d.
n.d.
n.d.
++
++
+++
Sistema sensorial primario
ganglio trigémino
complejo nodoso-petroso
ganglios espinales
+++
TMN
Sistema simpático
ganglio cervical superior
ganglio estrellado
cadena simpática
Cerebro
cerebelo
corteza cerebral
-
-
estriado
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
++
-
-
-
+
++
hipocampo
substantia nigra
++
++
++
++
++
++
bulbos olfatorios
++
++
++
+
+++
+++
++
+
+
++
++
+
Médula espinal
+
+
Cualitativamente se indica la abundancia de expresión en las células que constituyen la estructura correspondiente con el
número de signos +, dependiendo de si sólo algunas células expresan α-SYN (+), aproximadamente un 50% lo expresa
(++) o prácticamente la totalidad la expresa (+++). Los signos (-) indican ausencia de expresión; n.d. no determinado;
TMN, núcleo mesencefálico del trigémino.
Dado que los ganglios NOD y SCG son de origen y modalidad diferentes, constituyen
estructuras técnicamente abordables y, sobre todo, expresan α-SYN durante todo su desarrollo,
realizamos un estudio más profundo del patrón de expresión de la α-SYN en estas estructuras.
Así, en el estadio E12,5, poco después de formarse el NOD, la α-SYN se empieza a expresar
66
Resultados
fuertemente en el citoplasma y prolongaciones de algunas células de morfología típicamente
neuronal, distribuidas por todo el ganglio (Figura 14 C). En el estadio E14,5 el número de células
positivas para la α-SYN aumenta y se encuentran, además, diferentes niveles de expresión
(Figura 14 D). En E16,5, el NOD presenta un marcaje más generalizado, aunque aún se
encuentran algunas células con niveles de expresión altos repartidas por el ganglio (Figura 15
C). En cuanto al SCG, en E12,5 y E14,5 se observa un marcaje heterogéneo, esto es, algunas
células negativas, otras con marcaje débil y otras con fuerte marcaje (Figura 14 E). En el SCG de
E16,5 la expresión de α-SYN se generaliza a la mayor parte de células que constituyen el
ganglio, pero se mantienen los diferentes niveles de expresión (Figura 15 A). Tanto en el NOD
como en el SCG del ratón postnatal temprano existe una expresión generalizada, y más baja, de
α-SYN en el citoplasma de las neuronas del ganglio, y unas pocas células siguen expresando
altos niveles de α-SYN (Figuras 15B, D).
E12 5
A
B
TMN
SN
TRI
OI
SN
SY
TRI
NOD
me
C
SCG
DRG
D
E
Figura 14. Expresión de la proteína α-SYN durante el desarrollo embrionario temprano de ratón
detectada por inmunohistoquímica. (A) Corte sagital de la cabeza de un embrión de E12,5 mostrando la
expresión de α-SYN en el SNC (predominante en la SN) y en el SNP donde se observa en múltiples
ganglios: trigémino (TRI), complejo nodoso-petroso (NOD) o complejo superior-yugular (SY). (B) Corte
sagital de la cabeza de un embrión de E13,5 con marcaje de α-SYN en ganglios periféricos como el ganglio
cervical superior (SCG) o los sensoriales de la raíz dorsal (DRG) en el SNP, además de en médula espinal
(me), núcleo mesencefálico del trigémino (TMN) o substantia nigra (SN) en el SNC. (C-D) Secciones de
NOD de E12,5 (C) y E14,5 (D), mostrando mayor inmunorreactividad en el estadio más avanzado. (E)
Sección de ganglio SCG de E14,5 con algunas células inmunorreactivas para α-SYN y con diferentes
niveles de inmunorreactividad entre ellas. Algunas secciones se contratiñeron con solución de Nissl (A, C,
D, E). La barra de escala es de 300 μm (A, B) y de 50 μm (C, D, E).
67
Resultados
A
SCG
E16,5
B
C
NOD
E16,5
D
SCG
P7
NOD
P7
Figura 15. Expresión de la α-SYN en los ganglios NOD y SCG durante el desarrollo embrionario
tardío y postnatal temprano de ratón detectada mediante inmunohistoquímica. Sección de SCG (A) y
NOD (C) en el estadio embrionario E16,5 y de SCG (B) y NOD (D) postnatales (P7). La barra de escala es
de 100 μm (A) y 50 μm (B, C, D).
4.1.3. La α-SYN se expresa en neuronas postmitóticas
Para identificar la naturaleza de las células que expresan α-SYN en ganglios periféricos se
realizaron dobles marcajes. Para determinar si las células tenían capacidad proliferativa,
realizamos la inyección y detección del marcador de proliferación BrdU. Para ello madres
gestantes en el estadio E13,5 fueron inyectadas con una dosis de 50 mg/kg peso de BrdU dos
horas antes de su sacrificio para la obtención de los embriones. En E13,5 se está produciendo la
proliferación de los progenitores neurales de los ganglios NOD y SCG. En el caso del SCG
proliferan tanto los progenitores neurales, derivados de la cresta neural, como los llamados
simpatoblastos, que tienen ya atributos neuronales, como expresión de neurofilamentos o de
enzimas de la ruta biosintética de neurotransmisores simpáticos, pero que todavía proliferan.
Tras doble inmunomarcaje fluorescente con anticuerpos anti-α-SYN y BrdU en secciones
sagitales de los embriones no se observó marcaje coincidente en las mismas células, ni del SCG
ni del NOD (Figura 16). Continuando con la caracterización de las células inmunorreactivas para
α-SYN, combinamos la expresión de α-SYN con la de un marcador glial como LSox5 mediante
anticuerpos anti-LSox5 generosamente cedidos por el Dr. Julio A. Barbas del Instituto Cajal
(CSIC) de Madrid. LSox5 es un factor de transcripción propio del linaje cartilaginoso que se
detecta también en células gliales y/o derivados de la cresta neural (Pérez-Alcalá et al., 2004).
En secciones de embriones de E12,5 observamos la ausencia de expresión de LSox5 en
68
Resultados
aquellas células positivas para α-SYN en los ganglios SCG y NOD (datos mostrados sólo para
NOD, Figuras 17 G-I), indicando que la α-SYN no se expresa en glía satélite o células de
Schwann. Utilizando anticuerpos anti-α-SYN y anti-neurofilamento (cadena pesada de 150 kDa)
se observó que todas las células inmunorreactivas para α-SYN eran neuronas (Figuras 17 A-C).
Estos datos sugieren que la α-SYN se expresa una vez la neurona ha iniciado su diferenciación y
abandonado el ciclo celular.
A
NOD
B
C
E
F
H
I
SCG
D
SCG E13,5
G
NOD
E13,5
α-SYN
BrdU
Figura 16. Expresión de la α-SYN en neuronas periféricas postmitóticas. Detección inmunofluorescente
de α-SYN (A, D, G), BrdU (B, E, H) y ambas (C, F, I) en NOD y SCG (A-C), SCG a mayor aumento (D-F) y
NOD a mayor aumento (G-I) de embriones de E13,5. Nótese la expresión de α-SYN en células con
morfología neuronal (flechas en G, I) y células que expresan BrdU (cabeza de flecha en H, I) en el ganglio.
La barra de escala es de 50 μm (A-C, D-F, G-I).
Para profundizar en el conocimiento del fenotipo de las neuronas inmunorreactivas para αSYN se analizó si estas células expresaban la enzima tirosina hidroxilasa (TH), implicada en la
síntesis de los neurotransmisores de la familia de las catecolaminas. El NOD presenta una
población relativamente minoritaria de neuronas catecolaminérgicas, que utilizan dopamina como
neurotransmisor (Kummer et al., 1993), mientras que todas las neuronas del SCG utilizan
noradrenalina como neurotransmisor y, por tanto, son TH-positivas. La expresión de α-SYN se
observó en todas las neuronas del NOD y, por tanto, la α-SYN no es un marcador específico de
las neuronas sensoriales de tipo catecolaminérgico (Figuras 18 A-F). La mayoría de células del
69
Resultados
SCG en E14,5 presentan una expresión baja de α-SYN, con algunas células que expresan
niveles más altos de esta proteína (Figura 18 A). La expresión de TH estaba prácticamente
generalizada a todas las células del SCG, con algunas células mostrando altos niveles de TH
(Figura 18 B). Cuando se combinaron ambos marcajes se observó la existencia tanto de células
que sólo expresaban α-SYN, células que expresaban α-SYN y TH, y células que parecían
expresar sólo TH (Figura 18 C). Así, la ausencia de α-SYN en células del SCG que están
incorporando BrdU, sugiere que la expresión de TH precede a la de α-SYN, ya que la primera se
encuentra en simpatoblastos mientras que la segunda no. En el SCG del ratón neonato todas las
neuronas expresan α-SYN y TH (Figura 18 I), aunque con niveles heterogéneos de expresión. La
combinación de los datos de expresión embrionaria y postnatal en el SCG indica que la α-SYN
sólo se expresa en neuronas postmitóticas. En conjunto, los patrones celulares de expresión
sugieren, además, que la α-SYN no es una molécula exclusiva de poblaciones de neuronas
catecolaminérgicas, al igual que sucede con las neuronas del SNC.
C
B
A
NOD
E14,5
α-SYN
NF
E
D
F
SCG
E14,5
G
α-SYN
NF
H
I
NOD
E12,5
α-SYN
LSox5
Figura 17. Expresión de la α-SYN en las neuronas de los ganglios periféricos embrionarios. Sección
de ganglios NOD (A-C) y SCG (D-F) de E14,5 con expresión de α-SYN (A, D), neurofilamento (B, E) y
ambos (C, F), detectados por inmunofluorescencia confocal. Nótese que el ganglio está constituido en su
mayoría por neuronas, las cuales expresan diferentes niveles de α-SYN. (G-I) Sección de NOD de E12,5
tras tinción inmunofluorescente para α-SYN (G), LSox5 (H) y ambos (I). La barra de escala es de 50 μm (AC, D-F, G-I).
70
Resultados
A
NOD
B
C
E
F
SCG
E14,5
D
α-SYN
TH
NOD
P0
H
G
I
SCG
P0
Figura 18. Expresión de α-SYN y de TH en los ganglios NOD y SCG detectadas por
inmunofluorescencia. (A-C) Expresión de α-SYN (A, D, G), de TH (B, E, H) y ambas (C, F, I) en los
ganglios NOD y SCG de E14,5 (A-C) y en NOD (D-F) y SCG (G-I) de neonato. Barra: 50 µm.
4.2. Fenotipo in vivo del SNP del mutante de α-syn
La llamativa expresión de α-SYN en los ganglios NOD y SCG durante el desarrollo sugería
una posible implicación de la α-SYN en la formación de estas estructuras nerviosas. Para
estudiar dicha posibilidad, se utilizó el ratón mutante nulo para la α-syn. La cepa de ratones
mutantes nulos para α-syn (α-syn-/-) utilizados en este estudio ya ha sido caracterizada a nivel de
ciertos aspectos del SNC (Abeliovich et al., 2000). Estos ratones son nulos completos y, por
tanto, carecen totalmente de α-SYN, también a nivel del SNP, como se comprobó en tinciones
inmunocitoquímicas realizadas con los diferentes anticuerpos en embriones mutantes (datos no
mostrados). Además, en western blot se observó que la banda específica de α-SYN que
aparecía en homogenados de ganglios NOD y SCG no se detectaba en muestras procedentes
de embriones mutantes (Figura 13). En esta cepa, por tanto, se podía analizar cuáles son las
funciones esenciales de la α-SYN en el desarrollo de estructuras del SNP en un contexto
fisiológico. En una inspección al microscopio óptico no se observaron diferencias aparentes en el
aspecto o grado de formación de los distintos ganglios entre embriones α-syn+/+ y α-syn-/- de
E14,5 por lo que decidimos realizar un análisis más profundo utilizando, para ello, dos ganglios
con fuerte expresión de α-SYN, el NOD de modalidad sensorial y el SCG, de modalidad
71
Resultados
simpática. Dado que a la formación de cualquier estructura nerviosa contribuyen procesos
celulares como la proliferación, la neurogénesis y diferenciación neuronal y la supervivencia
neuronal, entre otros, se trató de estudiar la posible implicación de la α-SYN en estos distintos
procesos en animales α-syn+/+ y α-syn-/-.
4.2.1. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal de la división sensorial
del SNP: complejo petroso-nodoso (NOD)
Se determinó el número de células que componían los ganglios nodosos de los embriones
E14,5 de genotipo salvaje y mutante en tinciones con hematoxilina de Gill (Figura 19 A y C),
aunque no se encontraron diferencias significativas entre los análisis realizados en animales αsyn+/+ y α-syn-/- (Figura 19 C). La actividad proliferativa del ganglio se estudió determinando el
número de células que habían incorporado BrdU dos horas antes del sacrificio de la madre
gestante (Figura 19 A), no detectándose diferencias en la incorporación total del nucleótido o en
la tasa proliferativa entre animales de distintos genotipos (Tabla 11). Este resultado estaba de
acuerdo con nuestros estudios de expresión que indicaban que las células proliferantes y las
células gliales no expresaban α-SYN. Este análisis se completó con un estudio del número de
neuronas al final del desarrollo embrionario, mediante el recuento de células con aspecto
neuronal en tinciones con violeta de cresilo (tinción de Nissl) en animales neonatos de los dos
genotipos. Tampoco en este estadio, en el que las neuronas son perfectamente reconocibles en
tinciones histológicas convencionales, se observaron alteraciones en el número final de
neuronas nodosas en los animales deficientes para α-SYN (Figuras 19 B, C).
Por tanto, la α-SYN no parece jugar un papel en algunas funciones celulares básicas en el
desarrollo normal de los ganglios del sistema sensorial. No encontramos cambios en el número
de neuronas en los animales mutantes para la α-syn, que reflejen una función esencial de la αSYN en el proceso de neurogénesis o de muerte neuronal. Más aún, en un estadio E14,5 del
NOD, periodo de neurogénesis y de proliferación de células gliales (Dong et al., 1995), la
actividad proliferativa no se encuentra alterada en los mutantes, consistente con la aparente
ausencia de α-SYN en células que incorporan BrdU. Otros autores no han encontrado déficit en
el número de neuronas sensoriales en los ganglios trigéminos y espinales de ratones deficientes
en α-SYN pertenecientes a la misma cepa que la analizada aquí (Ninkina et al., 2003;
Papachroni et al., 2005).
72
Resultados
Tabla 11. Recuentos de proliferación y supervivencia celular en el NOD en E14,5
nº de células BrdU+
nº total de células
tasa proliferación (%)
+/+
1357 ± 95 (n = 4)
10837 ± 693 (n = 4)
13 ± 0
-/-
1158 ± 218 (n = 3)
10313 ± 460 (n = 3)
11 ± 2
α-syn
α-syn
Los datos se expresan como la media de los recuentos obtenidos en un número de animales
independientes indicado entre paréntesis (n) ± error estándar de la media (X ± SEM). No se
han encontrado diferencias significativas entre genotipos.
B
A
NOD
P0
NOD
E14,5
C
16000
20000
α-syn +/+
α-syn -/-
16000
12000
12000
8000
8000
4000
4000
0
número de neuronas
número de células
20000
0
E14,5
P0
Figura 19. Secciones de ganglios nodosos y recuentos celulares procedentes de animales α+/+
-/syn y α-syn . (A) Sección de NOD de E14,5 que muestra inmunohistoquímica para BrdU (células
marrones) y tinción con hematoxilina de Gill nº 2 (células azules). La barra de escala es de 50 μm.
(B) Sección de NOD neonatal de ratón teñida con solución de Nissl. (C) Histograma que muestra la
cuantificación del número total de células en E14,5 y del número de neuronas en P0 en ambos
genotipos. Los datos mostrados representan la media de los recuentos en distintos animales (n = 4
en cada caso) ± SEM. Sin diferencias significativas entre genotipos.
4.2.2. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal de la división simpática
del SNP: ganglio cervical superior (SCG)
La subdivisión autonómica del SNP era especialmente interesante en el contexto de la EP,
como ya se ha comentado en la Introducción, por la que decidimos analizar los SCGs de
animales α-syn+/+ y α-syn-/- durante la embriogénesis y desarrollo postnatal temprano. En una
73
Resultados
inspección al microscopio óptico del SCG en E14,5 no se observaron diferencias aparentes en el
aspecto o grado de formación del ganglio entre embriones α-syn+/+ y α-syn-/-. Tampoco se
observaron diferencias significativas cuando se determinó el número de células que componían
los ganglios de los animales de genotipo salvaje y mutante en tinciones con hematoxilina de Gill
(Figura 20 A; Tabla 12). La actividad proliferativa del ganglio se estudió determinando el número
de células que habían incorporado BrdU dos horas antes del sacrificio del embrión (Figura 20 A),
no detectándose diferencias en la incorporación total del nucleótido o en la tasa proliferativa
entre animales de distintos genotipos (Tabla 12). Este resultado no era sorprendente ya que
nuestros estudios de expresión indicaban que las células proliferantes no expresaban α-SYN y,
por tanto, ni siquiera los neuroblastos estarían afectados en este momento del desarrollo. Sin
embargo, la expresión restringida de α-SYN en neuronas que ya han abandonado el ciclo celular
podría sugerir la posibilidad de que esta proteína participase en el propio proceso de
diferenciación terminal. En este sentido, nuestros datos parecen excluir dicha posibilidad.
B
A
SCG
E14,5
SCG
P7
Figura 20. Secciones histológicas de ganglios SCG. (A) Sección de SCG de E14,5 que muestra una
inmunohistoquímica para BrdU (células marrones) y tinción con hematoxilina de Gill nº 2 (células azules).
(B) Sección de SCG neonatal teñida con solución de Nissl. La barra de escala es de 50 μm (A) y 100 μm
(B).
Tabla 12. Recuentos de proliferación y supervivencia celular del SCG de animales E14,5 salvajes y
mutantes nulos para α-syn
nº de células BrdU+
nº total de células
tasa proliferación (%)
+/+
3638 ± 309 (n = 4)
24398 ± 2339 (n = 4)
15 ± 0
-/-
4097 ± 444 (n = 3)
24639 ± 3321 (n = 3)
17 ± 3
α-syn
α-syn
Los datos se expresan como la media de los recuentos obtenidos en un número de animales
independientes indicado entre paréntesis (n) ± SEM. No hay diferencias significativas entre
genotipos.
La α-SYN sí parece expresarse en neuronas diferenciadas desde estadios tempranos del
desarrollo del ganglio y, por tanto, era posible que participase en la regulación de la
74
Resultados
supervivencia neuronal durante los periodos de muerte neuronal natural, que acontecen
perinatalmente en el desarrollo de los ganglios simpáticos. Por ello, se determinó el número de
neuronas en neonatos (Figura 20 B; Tabla 13), contando el número de células que, en
preparaciones teñidas con violeta de cresilo, presentaban características morfológicas propias de
neuronas, como son tamaño celular grande, citoplasma abundante y núcleo con nucleolo/s
evidente/s. Dado que el periodo de muerte neuronal programada en el SCG se completa hacia el
final de la primera semana postnatal, se realizó, además, una estimación del número de
neuronas, a través de la medida del tamaño del ganglio en animales P15, una vez terminado el
periodo de muerte celular programada. En ninguno de los casos, se observaron diferencias
significativas entre animales de genotipo salvaje y mutante para α-syn (Tabla 13).
Tabla 13. Recuentos de neuronas y estimaciones de volumen en el SCG de animales
neonatos/postnatales salvajes y mutantes nulos para α-syn
genotipo
nº neuronas en P0
volumen (mm3) en P15
α-syn+/+
38101 ± 5747 (n = 3)
0,08 ± 0,01 (n = 2)
-/-
42851 ± 6882 (n = 4)
0,08 ± 0,01 (n = 2)
α-syn
Los datos se expresan como la media de los recuentos obtenidos en un número de
animales independientes indicado en paréntesis (n) ± SEM. Diferencias estadísticamente
no significativas.
4.3. Fenotipo in vitro de las neuronas periféricas del mutante de α-syn
4.3.1. La α-SYN no modula la morfología o la respuesta neurotrófica de las
neuronas sensoriales en cultivo
Experimentos realizados mediante inyección intracelular de vectores de expresión con el
cDNA que codifica para la α-SYN humana en neuronas nodosas aisladas de ratón habían
demostrado que la sobreexpresión de la forma humana salvaje, no mutada, incrementaba la
apoptosis comparada con la condición en la que se inyectaba el vector vacío (Saha et al., 2000).
El efecto no parecía depender de la expresión de formas mutadas sino de la mera
sobreexpresión de la molécula ya que las formas que portaban las mutaciones, que en humanos
causan Parkinson, no incrementaban la apoptosis más que la forma salvaje. Esto sugería la
implicación de α-SYN en la supervivencia de neuronas sensoriales viscerales. Para comprobar si
una deficiencia en α-SYN puede producir algún efecto en la supervivencia de neuronas
sensoriales viscerales, como las del NOD, realizamos un estudio in vitro de la respuesta
neurotrófica de neuronas nodosas embrionarias obtenidas a partir de nuestros mutantes nulos.
75
Resultados
Las células nodosas de genotipo salvaje en cultivo presentaron principalmente dos tipos
de morfologías: células con soma grande, redondeado y refringente, y prolongaciones neuríticas
más o menos largas, identificadas como neuronas (Figuras 21 A-C) y células más aplanadas y
con prolongaciones más cortas y anchas identificadas como glía (Figura 21 A). A las 24 horas
después de sembradas, todas las neuronas nodosas expresaban α-SYN aunque con niveles
heterogéneos (Figura 21 D), tal como lo hacían in vivo. Se observó que la expresión de α-SYN
correspondía a neuronas y no a glía (Figuras 21 B, F). De manera similar, cuando se realizó la
inmunodetección de TH se encontró un número muy bajo de neuronas inmunopositivas (no
cuantificado), como sucedía in vivo (Figura 21 E).
A
B
D
E
α-SYN
C
F
α-SYN
TH
Figura 21. Caracterización de las neuronas nodosas de E14,5 en cultivo sobre laminina. (A) Aspecto
general del cultivo en contraste de fases donde se observan neuronas y células gliales (flecha). (B)
Neuronas que expresan α-SYN detectada mediante inmunoperoxidasa. (C) Ausencia de expresión α-SYN
-/en las células procedentes de animales α-syn . Detección inmunofluorescente de α-SYN (D), TH (E), y
ambas (F). Nótese la presencia de células gliales que no expresan ni α-SYN ni TH (flecha). La barra de
escala es de 50 μm (A, B, C) y 20 μm (D-F).
Dentro del grupo de las neuronas se encontraron diversos fenotipos morfológicos,
clasificados en función del número de neuritas que salían del cuerpo neuronal (Figura 22 B):
unipolar, pseudounipolar, bipolar, multipolar. De estos, los fenotipos mayoritarios fueron el
bipolar y el multipolar (Figura 22 C).
Las neuronas nodosas del estadio embrionario E14,5 fueron aisladas y cultivadas in vitro
utilizando BDNF para permitir su supervivencia. Todos los cultivos se sembraron a muy baja
densidad, siguiendo los protocolos y estrategias desarrolladas por el laboratorio del Dr. Alun
Davies (Davies et al., 1993). Este tipo de siembra minimiza los efectos tróficos auto/paracrinos
de las propias neuronas y garantiza el estudio de los efectos inducidos por los factores
neurotróficos que añade el propio investigador. Para establecer si la respuesta a BDNF podía ser
modulada por α-SYN, decidimos realizar una curva dosis-respuesta de supervivencia de las
76
Resultados
neuronas salvajes y mutantes frente a BDNF. Las curvas de supervivencia para las neuronas
nodosas de genotipo salvaje y mutante resultaron idénticas (Figura 22 A). Por lo tanto, la
supervivencia en cultivo de las neuronas nodosas embrionarias de mamífero, bajo un paradigma
de dependencia neurotrófica, no cambia en ausencia de α-SYN.
A la concentración máxima utilizada de BDNF (10 ng/ml) la apariencia de las neuronas
nodosas en cultivo procedentes de animales de genotipo salvaje o deficientes para α-syn era
similar. Cuando se analizó la posible implicación de la α-SYN en el establecimiento de estas
morfologías neuronales, no se observaron diferencias significativas en la frecuencia de los
distintos morfotipos (Figura 22 C). Aunque tampoco se observaron diferencias cualitativas en
tamaño o complejidad final de las neuronas entre genotipos, se analizó el crecimiento neurítico
inicial durante las dos primeras horas a partir del sembrado de las neuronas α-syn+/+ y α-syn-/-.
Para ello, se fotografiaron las neuritas de unas decenas de neuronas en diversos cultivos
procedentes de distintos embriones de cada uno de los genotipos en el microscopio confocal con
cámara incubadora a intervalos de 20 minutos (Figuras 23 A-F). Por ser el fenotipo mayoritario,
se estudió el crecimiento neurítico de las neuronas con morfología multipolar. Mediante dibujo en
papel de acetato de las fotografías del crecimiento de las neuritas y el empleo de un programa
de análisis de imagen se determinó el crecimiento neurítico y se comparó entre genotipos (Figura
23 G). El análisis mostró que la ausencia de α-SYN no altera el ritmo de crecimiento neurítico
temprano en neuronas nodosas embrionarias.
B
porcentaje de
supervivencia neuronal
100
80
α-syn+/+
α-syn-/-
60
40
20
0
0,001 0,01
0,1
1
10
concentración de BDNF (ng/ml)
C
porcentaje de neuronas
A
60
50
α-syn+/+
α-syn-/-
40
30
20
10
0
unip. pseudoun. bipolar multipolar
Figura 22. Supervivencia y morfología de las neuronas nodosas embrionarias en cultivo procedente
de animales deficientes en α-SYN. (A) Curva dosis-respuesta de la dependencia neurotrófica de las
+/+
-/neuronas nodosas aisladas de embriones α-syn (n = 18) y α-syn (n = 11) de E14,5 y cultivadas durante
48 h en presencia de distintas concentraciones de BDNF. (B) Dibujo ilustrativo de los morfotipos
característicos de las neuronas nodosas embrionarias en cultivo. (C) Cuantificación de los morfotipos de al
menos un centenar de neuronas nodosas procedentes de embriones α-syn+/+ (n = 3) y α-syn-/- (n = 3) de
E14,5 crecidas en presencia de 10 ng/ml de BDNF durante 24 h. El análisis estadísitico no mostró ninguna
diferencia significativa entre genotipos.
77
Resultados
4.3.2. La α-SYN no modula la morfología o la respuesta neurotrófica de las
neuronas simpáticas en cultivo
Nuestros datos in vivo indicaban que la α-SYN no es esencial para el desarrollo normal de
las poblaciones simpáticas. Sin embargo, realizamos experimentos para evaluar con más
precisión la respuesta neurotrófica de las neuronas simpáticas mutantes así como la posible
participación de la α-SYN en el establecimiento de la morfología de estas neuronas. Para ello, se
aislaron neuronas simpáticas tanto del estadio embrionario E14,5 como de animales postnatales
de siete días de edad (P7) y se estudiaron in vitro.
A
20 min
B
40 min
C
60 min
D
80 min
G
E
100 min
120 min
F
crecimiento neurítico (μm)
300
250
α-syn+/+
α-syn-/-
200
150
100
50
0
Figura 23. Crecimiento neurítico de neuronas nodosas embrionarias (E14,5) en cultivo. (A-F) Ejemplo
ilustrativo del crecimiento neurítico inicial de neuronas nodosas de genotipo salvaje mediante secuencias de
fotos tomadas a intervalos de 20 minutos durante 2 h. La barra de escala es de 20 μm. (G) Representación
del crecimiento neurítico promedio ± SEM (10 neuronas por animal; n = 8 animales en cada genotipo) para
animales α-syn+/+ y α-syn-/-. No hay diferencias significativas entre genotipos.
En microscopía de contraste de fases se identificaron diferentes morfologías celulares en
los cultivos de SCG de E14,5 sobre laminina: neuronas simpáticas, caracterizadas por tener un
soma redondeado y voluminoso, bastante refringente, del que partían una serie de
prolongaciones neuríticas relativamente largas; precursores neuronales (simpatoblastos), con el
soma más pequeño y ovalado que las neuronas y con prolongaciones más cortas y de trazado
78
Resultados
más tortuoso (Figura 24 A) y células con cuerpo celular plano, alargado o redondeado, sin
extensiones citoplasmáticas evidentes, que correspondían a células gliales periféricas,
difícilmente visibles en contraste de fases, aunque sí eran claramente evidenciables por la
ausencia de marcadores neuronales (no mostrado). Cuando se realizaba una tinción
inmunohistoquímica para la α-SYN en estos cultivos a las 24 h, las células inmunopositivas
poseían una clara morfología neuronal (Figuras 24 B, D), al igual que aquellas que eran positivas
para el marcador TH (Figuras 24 C, E). La tinción nuclear fluorescente con DAPI, que tiñe los
núcleos de todas las células presentes en el cultivo, indicaba la existencia de células gliales
próximas a las neuronales que no expresaban ni α-SYN ni TH (Figura 24 F). En
inmunofluorescencia se observaba que todas las neuronas simpáticas expresaban α-SYN y TH,
aunque cada célula mostraba un grado de intensidad variable para cada uno de los marcajes.
Por tanto, tal como se observaba in vivo, la proteína α-SYN en cultivo sólo se encontraba en
neuronas.
A
D
B
C
α-SYN
TH
E
F
α-SYN
TH
Figura 24. Caracterización de las células del SCG de E14,5 a las 24 h de cultivo. (A) En contraste de
fase se pueden observar neuronas con largas prolongaciones neuríticas (flecha larga), precursores
neuronales (cabeza de flecha) y glía (flecha corta). (B) Neuronas simpáticas expresando α-SYN (B) y TH
(C) mediante inmunoperoxidasa. (D-F) Inmunofluorescencia para α-SYN (D), TH (E) y combinación de
ambas (F). Nótese que las neuronas expresan niveles variables de α-SYN y que las células gliales no
expresan ni α-SYN ni TH (flecha en F). La barra de escala es de 50 μm (A-C) y 20 μm (D-F).
Aunque la supervivencia neuronal embrionaria y postnatal in vivo en el SCG no parecía
alterada por la falta de α-SYN, se realizó un estudio de dependencia trófica in vitro. Las neuronas
simpáticas de E14,5 responden tanto a NT-3 como a NGF y, por tanto, la supervivencia se
determinó para diferentes condiciones neurotróficas: NGF (10 ng/ml), NT-3 (10 ng/ml), NGF y
NT-3 combinadas (5 ng/ml de cada una) a las 48 h. Se observó que cualquiera de las
79
Resultados
condiciones tróficas era igualmente eficiente en mantener la supervivencia de las neuronas
sembradas (Tabla 14). Tanto NGF como NT-3 parecían mantener la misma población de
neuronas ya que se observaba la misma respuesta con ambas neurotrofinas y esta respuesta no
era aditiva. Esta respuesta máxima no se veía modificada por la ausencia de α-SYN, ya que la
respuesta era idéntica cuando se comparaban cultivos obtenidos a partir de embriones α-syn+/+ y
α-syn-/- (Tabla 14).
Tabla 14. Recuentos de supervivencia en cultivo de las neuronas de SCG E14,5
α-syn
NGF
NT-3
NGF + NT-3
+/+
85 ± 9 (n = 5)
92 ± 12 (n = 4)
79 ± 4 (n = 26)
-/-
93 ± 11 (n = 7)
79 ± 5 (n = 4)
75 ± 3 (n = 24)
α-syn
Neuronas simpáticas de embriones de E14,5 cultivados en tres condiciones neurotróficas
consistentes en NGF a 10 ng/ml (NGF), NT-3 a 10 ng/ml (NT-3) y 5 ng/ml de NGF más 5
ng/ml de NT-3 (NGF + NT-3), durante 48 h. En cada caso se calculó el porcentaje de
neuronas que sobrevivían con respecto al recuento inicial a las 6 h tras la siembra ± SEM.
Los datos se muestran como la media de dichos porcentajes en un número de experimentos
que se muestra entre paréntesis (n). Diferencias estadísticamente no significativas.
Se evaluó entonces la respuesta de supervivencia de las neuronas simpáticas de los dos
genotipos frente a un rango de concentraciones de NGF o de NT-3, realizando curvas dosisrespuesta. Todos los cultivos, independientemente de su genotipo, mostraron, por un lado, que
una parte de las neuronas simpáticas del estadio E14,5 sobreviven en ausencia de neurotrofinas
y, por otro, una respuesta de supervivencia relacionada con la concentración de neurotrofina
utilizada. Cuando se comparó el comportamiento de neuronas de distinto genotipo no se
observaron diferencias significativas en las curvas dosis-respuesta entre neuronas de genotipo
α-syn+/+ y α-syn-/- (Figuras 25 A, B).
El periodo de muerte neuronal natural de las neuronas simpáticas es perinatal y en esos
momentos todas las neuronas dependen de NGF para su supervivencia. Por ello, se analizó la
supervivencia de neuronas simpáticas obtenidas a partir de ratones P7 y mantenidas in vitro en
presencia de NGF. En estos cultivos, la tinción inmunohistoquímica para la α-SYN indicaba que,
al igual que en el caso de los ganglios embrionarios, se podía detectar la proteína desde el
primer día de cultivo, y que las células inmunopositivas poseían también una clara morfología
neuronal y que todas las neuronas simpáticas expresaban α-SYN y TH (Figuras 26 B-D).
80
Resultados
A
B
porcentaje de
supervivencia neuronal
NGF
120
120
100
100
80
80
60
60
NT-3
40
40
α-syn+/+
20
α-syn+/+
α-syn-/-
20
α-syn-/-
0
0
0 0,001 0,01 0,1
1
0 0,001 0,01 0,1
10
concentración de NGF (ng/ml)
1
10
concentración de NT-3 (ng/ml)
Figura 25. Supervivencia de las neuronas simpáticas embrionarias en diferentes condiciones
neurotróficas a partir de animales deficientes en α-SYN. Curva dosis-respuesta de la dependencia
+/+
-/neurotrófica de las neuronas simpáticas de animales E14,5 para NGF (α-syn n = 5, α-syn n = 7) (A) y
+/+
-/NT-3 (α-syn n = 4, α-syn n = 4) (B). Se muestra el porcentaje de neuronas que sobrevive tras 48 h a las
distintas concentraciones de neurotrofina ± SEM. No hay diferencias significativas.
A
B
SCG
P7
α-SYN
C
D
α-SYN
DAPI
TH
Figura 26. Caracterización de las células simpáticas postnatales (P7) del SCG en cultivo. (A) Aspecto
de una neurona simpática en contraste de fases. (B, C) Neuronas simpáticas mostrando expresión de αSYN (B) y TH (C) por inmunocitoquímica. La glía del cultivo no muestra inmunorreactividad para α-SYN
(flecha en B). (D) Neuronas simpáticas inmunofluorescentes para α-SYN. La barra de escala es de 20 μm
(A, C, D) y 50 μm (B).
Se realizaron curvas dosis-respuesta para NGF de neuronas simpáticas de P7 obtenidas
de animales α-syn+/+ y α-syn-/- en cultivos con concentraciones variables de NGF durante 48 h in
vitro. La respuesta de las neuronas fue equivalente independientemente del genotipo. Las
81
Resultados
neuronas de uno y otro genotipo eran incapaces de sobrevivir en ausencia completa de
neurotrofina y sobrevivían todas cuando se alcanzaba la concentración de 1 ng/ml. Las curvas
siguieron la misma cinética, independientemente de si las neuronas procedían de ratones αsyn+/+ o α-syn-/- (Figura 27 A). Además del estudio de supervivencia con las diferentes dosis de
NGF, se realizó un estudio de supervivencia a lo largo del tiempo en cultivo. Para ello se empleó
la concentración máxima de 10 ng/ml de NGF, y se realizaron recuentos neuronales a diferentes
tiempos in vitro (24, 48 y 72 h) (Figura 27 B). En ninguno de los tiempos estudiados se
observaron diferencias significativas entre las neuronas simpáticas postnatales de cada uno de
los genotipos. La ausencia de diferencias entre genotipos para estos dos estadios coincide con
lo descrito para neuronas simpáticas neonatales (Stefanis et al., 2004).
A
B
α-syn+/+
α-syn-/-
120
porcentaje de supervivencia
porcentaje de supervivencia
140
100
80
60
40
20
0
0
0,001 0,01
0,1
1
10
concentración de NGF (ng/ml)
α-syn+/+
α-syn-/-
100
80
60
40
20
0
24 h
48 h
72 h
tiempo en cultivo
Figura 27. Supervivencia de las neuronas simpáticas postnatales a diferentes concentraciones de
NGF y tiempo en cultivo a partir de animales deficientes en α-SYN . (A) Curva dosis-respuesta de la
+/+
-/dependencia neurotrófica de las neuronas simpáticas aisladas de animales α-syn (n = 5) y α-syn (n = 6)
de P7 y cultivados durante 48 h en presencia de distintas concentraciones de NGF. (B) Supervivencia de
neuronas de SCG de animales P7 α-syn+/+ (n = 5) y α-syn-/- (n = 20), durante 24, 48 y 72 horas en 10 ng/ml
de NGF. No se encontraron diferencias significativas entre genotipos.
Además de la supervivencia, analizamos la morfología que adoptaban las neuronas en
cultivo, igual que hicimos con las neuronas nodosas en el apartado anterior. Se estableció que
entre las 24 y 48 h de cultivo era un tiempo óptimo en el que la neurona estaba bien adherida al
sustrato y presentaba un crecimiento neurítico óptimo para su estudio. Siguiendo esta pauta, se
distinguieron los cuatro morfotipos neuronales observados para las neuronas sensoriales. El
porcentaje de cada uno de los fenotipos morfológicos, relativo al total de neuronas presentes,
permitió establecer que el fenotipo mayoritario entre las neuronas simpáticas postnatales en
cultivo era el multipolar, mientras que el fenotipo mayoritario en las neuronas simpáticas
82
Resultados
embrionarias era el unipolar (Figura 28). Cuando se analizó la posible implicación de la α-SYN en
el establecimiento de estas morfologías neuronales, se vio que en ninguno de los casos
analizados existieron diferencias significativas. En general, las proporciones neuronales de cada
uno de los fenotipos morfológicos fueron bastante similares entre genotipos (Figura 28).
B
porcentaje neuronal total
A
SCG E14,5
80
80
60
60
40
40
20
20
0
unip. pseudo. bipolar multip.
0
SCG P7
α-syn+/+
α-syn-/-
unip. pseudo. bipolar multip.
Figura 28. Cuantificación morfotípica de las neuronas simpáticas embrionarias y postnatales en
cultivo obtenida a partir de animales deficientes en α-SYN. Histograma de las diferentes morfologías
+/+
-/adoptadas por las neuronas en cultivo de SCG E14,5 (α-syn , n = 5 y α-syn , n = 2; 24 h) (A) y P7 (α+/+
-/syn , n = 3 y α-syn , n = 3; 48 h) (B). Como condición neurotrófica 5 ng/ml de NGF más 5 ng/ml de NT-3
para las neuronas embrionarias y 10 ng/ml de NGF para las postnatales. Sin diferencias significativas entre
genotipos.
Para estudiar el crecimiento neurítico más temprano se utilizaron las neuronas
embrionarias dado su relativo pequeño tamaño. Se realizaron cultivos primarios de neuronas
simpáticas a baja densidad para poder distinguir las neuritas pertenecientes a cada neurona en 5
ng/ml de NGF y de NT-3. Se determinó el morfotipo y se midió la longitud de las neuritas a las 2
y 6 h desde el sembrado de las células. Los resultados no mostraron diferencias entre cultivos de
distinto genotipo, sugiriendo que la α-SYN no es esencial para el crecimiento neurítico inicial
(Figura 29 A). Cuando se restringió el análisis a las neuronas de fenotipo mayoritario, las
unipolares, se observó que el crecimiento neurítico también se mantenía equivalente entre las
neuronas simpáticas embrionarias α-syn+/+ y α-syn-/- (Figura 29 B). Conociendo el crecimiento
neurítico de cada neurona en cada intervalo de tiempo determinamos la velocidad de crecimiento
por neurita y por neurona. Vimos que la velocidad de crecimiento neurítico permanecía constante
independientemente del número de neuritas por neurona y cuando comparamos dicho parámetro
entre neuronas simpáticas embrionarias α-syn+/+ y α-syn-/- no se observaron diferencias
significativas (datos no mostrados).
83
Resultados
crecimiento neurítico (μm)
A
B
250 NEURONAS
GLOBALES
200
250
150
150
100
100
50
50
0
2h
200
0
6h
tiempo in vitro
α-syn+/+
α-syn-/-
NEURONAS
UNIPOLARES
2h
6h
tiempo in vitro
C
D
E
F
Figura 29. Análisis del crecimiento neurítico de neuronas simpáticas embrionarias en cultivo.
Crecimiento neurítico promedio por neurona a las 2 y 6 h desde el sembrado inicial de neuronas simpáticas
embrionarias (E14,5) de todos los morfotipos (globales) (A) y de fenotipo unipolar (B). Se ha representado
el promedio del crecimiento neurítico de n = 2 cultivos independientes en cada caso ± SEM. No hay
diferencias significativas entre genotipos. Fotografías de neuronas simpáticas fijadas a las 2 h (C) y a las 6
h (E) y su correspondiente dibujo (D y F).
4.3.3. La α-SYN modula la vía de supervivencia de las PLCγ1/PKCδ, pero no la de
la PI3K/Akt
La supervivencia neuronal depende de la activación simultánea de diversas vías
intracelulares de transducción de la señal. A partir de los receptores Trk para las distintas
neurotrofinas se activan la vía de Ras/Raf/MEK/ERK, la vía PI3K/Akt y la vía de la PLCγ1/PKCδ
(Patapoutian y Reichardt, 2001). La α-SYN tiene interacciones con lípidos por lo que decidimos
analizar las dos últimas en la condición mutante mediante un abordaje farmacológico, dado que
los ensayos bioquímicos en cultivos de tan bajo rendimiento como los primarios de SNP son
demasiado costosos.
84
Resultados
La vía de señalización PI3K/Akt se ha implicado en supervivencia celular y en muchos
sistemas celulares constituye la vía principal activada a partir de la interacción de las
neurotrofinas con sus receptores Trk (Crowder y Freeman, 1999; Reichardt, 2006). En nuestros
cultivos de neuronas simpáticas se activa la vía PI3K/Akt como puede comprobarse mediante el
marcaje inmunofluorescente con anticuerpos que reconocen sustratos celulares fosforilados por
el Akt activado (Figuras 30 A-C). Con la idea de investigar si la α-SYN podía jugar algún papel en
la supervivencia mediada a través de la ruta PI3K/Akt en neuronas simpáticas utilizamos un
inhibidor farmacológico específico de esta enzima, el LY294002. Dicho inhibidor se une
reversiblemente a la subunidad catalítica p110 de la PI3K con una IC50 de 1,4 μM inhibiéndola,
sin afectar a otras proteínas quinasas como la proteína quinasa activada por mitógenos (MAP
quinasa o MAPK) o la proteína quinasa C (PKC), incluso a dosis más altas. En primer lugar se
realizó un estudio de las concentraciones y tiempos efectivos en disminuir la supervivencia de las
neuronas simpáticas procedentes de SCGs de E14,5. Así, se añadieron concentraciones de
LY294002 de 2, 10, 20 y 50 μM, a la placa de cultivo 6 h a partir del sembrado de la suspensión
celular y se realizaron recuentos del número de neuronas supervivientes tras 24 y 48 h in vitro. El
estudio se realizó en presencia de 5 ng/ml de NGF y 5 ng/ml de NT-3. El porcentaje de
supervivencia en cada caso se refirió a su control interno con sulfóxido de dimetilo (DMSO) que
era el vehículo de disolución para el antagonista. Se comprobó que, cuando se añadía
solamente el vehículo, éste no producía un efecto significativo sobre la supervivencia de las
neuronas ni a las 24 h (control: 95 ± 3%, n = 8, DMSO: 98 ± 5%, n = 8) ni a las 48 h (control: 85 ±
4%, n = 8, DMSO: 87 ± 6%, n = 8). La concentración de 50 μM de LY294002 fue la única que
produjo una disminución significativa, aunque muy moderada, de la supervivencia de las
neuronas simpáticas tanto a las 24 como a las 48 h (Figura 30 D). Curiosamente, las neuronas
simpáticas embrionarias no parecen ser muy dependientes de la vía PI3K/Akt para su
supervivencia en respuesta a NT-3 y NGF. Las neuronas simpáticas postnatales, obtenidas de
animales de P7 y mantenidas en 10 ng/ml de NGF, fueron algo más sensibles a la inhibición de
esta ruta aunque la vía sólo explique una pequeña parte de la supervivencia total, igual que
ocurre en las embrionarias. Al igual que con las neuronas simpáticas embrionarias se comprobó
que el uso del vehículo del inhibidor farmacológico en las células postnatales en cultivo no
producían efecto significativo sobre la supervivencia neuronal ni a las 24 h (control: 98 ± 5%, n =
3; DMSO: 100 ± 6%, n = 3) ni a las 48 h (control: 94 ± 5%, n = 3; DMSO: 94 ± 5%, n = 3) ni a las
72 h (control: 88 ± 6%, n = 3, DMSO: 88 ± 6%, n = 3) de tiempo de cultivo.
Para comprobar si la α-SYN jugaba algún papel diferencial sobre la supervivencia mediada
a través de PI3K, se compararon los efectos del LY294002 entre genotipos. La supervivencia
neuronal que se encontró tras el tratamiento con 50 μM de LY294002 de células simpáticas
embrionarias de genotipo salvaje y mutante nulo para α-syn no variaba significativamente entre
85
Resultados
genotipos, tal como se muestra para las 48 h de tiempo de cultivo (Figura 30 D). Al igual que
para las neuronas embrionarias, a la concentración de 50 μM, ni a las 48 ni 72 h se detectaron
diferencias significativas en la supervivencia de neuronas simpáticas postnatales entre animales
de tipo salvaje y mutantes nulos para α-syn (Figura 30 E). Por tanto, la α-SYN no participa en la
supervivencia celular mediada a través de la vía PI3K/Akt en las neuronas simpáticas
embrionarias ni postnatales en cultivo.
A
B
C
SCG
P7
α-SYN
P-AKT
D
E
SCG E14,5
supervivencia neuronal
100
80
n.s.
*
n.s.
SCG P7
100
*
80
60
60
40
40
20
20
n.s.
n.s.
α-syn+/+
α-syn-/-
***
***
0
0
24 h
48 h
48 h
72 h
tiempo del cultivo
tiempo del cultivo
Figura 30. Supervivencia de las neuronas simpáticas a través de la vía PI3K/Akt en presencia y
ausencia de α-SYN. Inmunocitoquímica fluorescente confocal para α-SYN (A), sustratos fosforilados de
fosfo-Akt (B) y la combinación (C) en neuronas simpáticas postnatales (P7). La barra de escala mide 20 μm
(A-C). (D, E) Supervivencia neuronal en porcentaje tras tratamiento con LY294002 (50 μM) en neuronas
simpáticas embrionarias (D) y postnatales (E). El tratamiento disminuyó significativamente la supervivencia
neuronal, *p<0,05 (E14,5) y ***p<0,001 (P7), aunque no se encontraron diferencias significativas entre
genotipos (n.s.).
La activación del receptor del NGF, TrkA, conduce también a la activación de la fosfolipasa
Cγ (Patapoutian y Reichardt, 2001) lo que induce la producción de inositol-trifosfato y
diacilglicerol que activan a la proteína quinasa C delta (PKCδ), una quinasa del grupo de las PKC
noveles (novel PKCδ) que ha sido implicada tanto en inducir como en prevenir apoptosis
dependiendo del contexto celular (Jackson y Foster, 2004). Además, se ha demostrado que la αSYN es capaz de inhibir la actividad PKC en la línea celular 293 (Ostrerova et al., 1999). La
86
Resultados
detección inmunocitoquímica reveló que, en nuestros cultivos de neuronas simpáticas
embrionarias, tanto las neuronas (Figuras 31 B-C, E-F) como las células gliales (Figura 32 E)
tenían niveles detectables de PKCδ. Subcelularmente, la expresión neuronal de PKCδ se
localizó en el citoplasma y a lo largo de las neuritas, de forma muy coincidente con la expresión
de α-SYN (Figuras 30 A, C).
Con la idea de investigar si la α-SYN podría jugar algún papel en la supervivencia mediada
a través de la PKCδ se utilizó el inhibidor farmacológico rottlerina, que inhibe específicamente la
actividad enzimática de la PKCδ a concentraciones de 3 a 6 μM. Se evaluaron diferentes dosis
de rottlerina, 10, 3, 1 y 0,1 μM, y se determinó la supervivencia en presencia de 5 ng/ml de NGF
más 5 ng/ml de NT-3 a dos tiempos en cultivo, 24 y 48 h. Cuando se analizaron las
concentraciones que producían un efecto sobre la supervivencia neuronal, se vio que las
concentraciones de 1 y 3 μM de rottlerina disminuían significativamente la supervivencia
neuronal tanto a 24 como a 48 h de cultivo siendo, además, los valores de supervivencia en
estos dos tiempos bastante similares entre sí, por lo que se muestran sólo los correspondientes
a 24 h (Figura 31 G). Cuando se añadió 10 μM de rottlerina al cultivo se produjo una muerte
cuantiosa (no mostrado). También se analizó mediante inmunocitoquímica si la inhibición de esta
molécula producía algún cambio sobre su localización subcelular. Sin embargo, cuando se
trataron las células en cultivo con rottlerina 1 μM durante 2 h, y hasta 24 h, no se observó ningún
tipo de cambio en la expresión y/o localización de dicha proteína. Como control, la adición
durante 2 h del ester de forbol (acetato de forbol miristato o PMA), activador no selectivo de
PKC, a 0,1 μM, indujo una reubicación de la enzima PKCδ a la membrana plasmática (Figuras
31 E-F), como había sido descrito anteriormente (ver revisión de Steinberg et al., 2004).
Dado que la inhibición específica de la PKCδ disminuía la supervivencia neuronal, aunque
no producía cambios en la localización de la molécula, se analizó si la α-SYN podía jugar un
papel en la respuesta diferencial a la inhibición de PKCδ. Así, se cuantificó la supervivencia de
neuronas embrionarias simpáticas en presencia de 0,1, 1 y 3 μM de rottlerina entre animales αsyn+/+ y α-syn-/- pero no se observaron diferencias significativas entre genotipos a las
concentraciones efectivas en disminuir la supervivencia ni a las 24 ni a las 48 h de cultivo. Dado
que los recuentos son bastante equivalentes entre estos dos tiempos de cultivo, se muestran
aquellos correspondientes a las 24 h de cultivo (Figura 31 G).
87
Resultados
A
B
CF
D
E
F
porcentaje de
supervivencia neuronal
G
120
n.s.
100
α-SYN
PKCδ
α-syn+/+
α-syn-/-
**
80
n.s.
60
***
40
20
0
0,1
1
3
concentración de rottlerina (μM)
Figura 31. Expresión de PKCδ en neuronas simpáticas embrionarias y supervivencia tras inhibición
de PKCδ en animales deficientes en α-SYN. Inmunofluorescencia confocal para α-SYN (A, D), PKCδ (B,
E) y combinadas (C, F). (F) Traslocación de PKCδ a membrana plasmática en presencia de PMA (2 h, 0,1
+/+
µM). La barra de escala mide 10 μm. (G) Supervivencia in vitro de neuronas simpáticas α-syn (n = 6) y α-/syn (n = 8) tratadas con distintas concentraciones de rottlerina durante 24 h en presencia de 5 ng/ml de
NGF y 5 ng/ml de NT-3. Se ha representado el porcentaje del número de células que han sobrevivido al
tratamiento respecto al número de neuronas sin tratar (100%). Sólo las concentraciones de 1 y 3 μM de
rottlerina resultaron significativamente diferentes, **p<0,01 (1 μM) y ***p<0,001 (3 μM), a la hora de
disminuir la supervivencia neuronal. No hay diferencias significativas (n.s.) entre genotipos.
La expresión de PKCδ en neuronas del SCG postnatal también se observa en
citoplasma y neuritas (Figura 32 A-F). Cuando se ensayó la inhibición de PKCδ por rottlerina
también en neuronas simpáticas de individuos postnatales se observó un grado similar de
afectación de la supervivencia neuronal al observado para los cultivos embrionarios (datos no
mostrados). Por ello, se analizó en neuronas de ambos genotipos la respuesta a la
concentración de 1 μM de rottlerina. Cuando se comparó la respuesta a esta dosis entre
88
Resultados
neuronas de genotipo salvaje y mutante se observó que la ausencia de α-SYN eliminaba el
efecto de la rottlerina, sugiriendo que la α-SYN actúa, de alguna forma, sobre el estado de la
proteína PKCδ (Figura 32 G).
A
B
C
D
E
F
G
porcentaje de supervivencia
120
**
**
α-SYN
PKCδ
α-syn+/+
α-syn-/**
100
***
***
***
80
60
40
20
0
24 h
48 h
72 h
tiempo en cultivo
Figura 32. Expresión de PKCδ en neuronas simpáticas postnatales y supervivencia tras inhibición
de PKCδ en animales deficientes en α-SYN. Inmunofluorescencia confocal para α-SYN (A, D), PKCδ (B,
E) y combinadas (C, F) en neuronas simpáticas disociadas (A-C) y SCG explantados (D-F) mediante
microscopía confocal. La glía expresa PKCδ pero no α-SYN (cabeza de flecha en E). La barra de escala
+/+
-/mide 20 μm (A-C) y 60 μm (D-F). (G) Supervivencia de neuronas simpáticas α-syn (n = 6) y α-syn (n = 5)
tratadas con rottlerina (1 μM) a diferentes tiempos en cultivo. Se utilizó 10 ng/ml de NGF en el cultivo. La
supervivencia disminuyó significativamente (***p<0,001) con el tratamiento. Nótese que la falta de α-SYN
protege significativamente de la inhibición de PKCδ.
89
Resultados
4.4. Estudio de la implicación de la α-SYN en apoptosis inducida en neuronas
simpáticas
4.4.1. La α-SYN no participa en la apoptosis inducida por daño genético
Dado que existen evidencias de que la α-SYN pudiera estar implicada en procesos
celulares asociados a la supervivencia neuronal en respuesta al estrés (El Agnaf et al., 1998; da
Costa et al., 2000; Saha et al., 2000; Zhou et al., 2000; Iwata et al., 2001; Lee et al., 2001;
Hashimoto et al., 2002; Zhou et al., 2002; Prasad et al., 2004), decidimos estudiar si la ausencia
de α-SYN podía causar una respuesta diferencial frente a un daño genotóxico, mediante el
tratamiento con drogas que dañan el DNA de neuronas simpáticas de los dos genotipos. Para
ello se utilizó el agente citotóxico citosina arabinósido (ara-C). Como el efecto del ara-C es dosis
y tiempo dependiente, se estudió el efecto en supervivencia a dos dosis, 0,1 y 1 mM, a las 24 y
48 h in vitro para las neuronas embrionarias y 24, 48 y 72 h para las neuronas postnatales.
Dichas concentraciones han sido ampliamente utilizadas para producir la muerte de neuronas
simpáticas en cultivo (Martin et al., 1990; Tomkins et al., 1994). A las 24 h de tratamiento con el
tóxico se observó una reducción dependiente de dosis en el número de neuronas embrionarias
simpáticas (Figura 33 C). Además, las neuronas tratadas presentaban un aspecto atrófico y
menos refringente, con neuritas fragmentadas, en comparación con las no tratadas (Figuras 33
A, B). A las 48 h la muerte era masiva, quedando muy pocas neuronas vivas en el cultivo.
Cuando se analizaron los efectos en neuronas procedentes de embriones de cada uno de los
genotipos no se observaron diferencias significativas en la respuesta al estímulo apoptótico
(Figura 33 C). Las dos dosis de ara-C utilizadas fueron igualmente efectivas y equivalentes a la
hora de disminuir la supervivencia de las neuronas simpáticas postnatales, aunque el efecto
deletéreo se obtenía más tarde. Al igual que en el caso de las embrionarias, se comprobó que la
falta de α-SYN no cambiaba la supervivencia producida por el daño genotóxico en las neuronas
postnatales simpáticas de animales de tipo salvaje y los mutantes nulos para α-syn (Figura 33
D).
La sobreexpresión de α-SYN en líneas celulares reduce la vulnerabilidad celular en
respuesta a agentes genotóxicos como el etopósido (da Costa et al., 2000). Sin embargo,
neuronas sensoriales de los ganglios trigéminos de ratones neonatos deficientes en α-syn
responden frente a etopósido igual que las neuronas de genotipo salvaje (Ninkina et al., 2003).
Nosotros hemos utilizado el ara-C también en neuronas sensoriales nodosas en cultivo
obteniendo efectos similares a los producidos en las neuronas simpáticas y ninguna diferencia
significativa entre genotipos (ver Tabla 15). Por lo tanto, parece que un fondo genético nulo para
90
Resultados
α-SYN no parece modular la respuesta apoptótica al daño en el DNA ni en neuronas sensoriales
ni en neuronas simpáticas.
A
control
100
80
60
n.s.
***
n.s.
***
40
20
0
0,1
ara-C
D
SCG E14,5
24 h
SCG P7
0,1 mM ara-C
n.s.
porcentaje de
supervivencia neuronal
porcentaje de
supervivencia neuronal
C
B
100
n.s.
80
**
α-syn+/+
α-syn-/-
60
n.s.
40
***
20
0
1
**
concentración de ara-C (mM)
24 h
48 h
72 h
tiempo in vitro
Figura 33. Supervivencia de las neuronas simpáticas en cultivo tras tratamiento con ara-C a partir de
+/+
animales deficientes en α-SYN. Aspecto de las neuronas simpáticas embrionarias α-syn sin tratamiento
(A) y con tratamiento de ara-C (0,1 mM) (B). Nótese la presencia de células apoptóticas (cabeza de flecha
en B). La barra de escala es de 100 μm (A) y 50 μm (B). (C, D) Supervivencia tras tratamiento con 0,1 y 1
+/+
-/mM de ara-C a las 24 h de neuronas simpáticas embrionarias α-syn (n = 4) y α-syn (n = 4) (C) y tras
+/+
-/tratamiento con ara-C (0,1 mM) en neuronas postnatales α-syn (n = 3) y α-syn (n = 3) a distintos tiempos
(D). Se ha representado el porcentaje del número de células que han sobrevivido al tratamiento respecto al
número de neuronas sin tratar (100%). Se indica el porcentaje de supervivencia neuronal promedio ± SEM.
+/+
Los tratados resultaron significativamente diferentes respecto de los controles sin tratar en α-syn ,
***p<0,001 y **p<0,01, pero no se detectaron diferencias significativas (n.s.) entre genotipos.
Tabla 15. Recuentos de supervivencia tras tratamiento in vitro con diferentes dosis de ara-C de
neuronas nodosas de E14,5 durante 24 h
n
0,1 mM
1 mM
+/+
α-syn
3
42 ± 1***
27 ± 2***
α-syn-/-
3
31 ± 5***
20 ± 4***
La supervivencia se ha representado como el porcentaje del número de neuronas
vivas a las 24 h respecto al número inicial. La condición neurotrófica utilizada ha
sido 10 ng/ml de BDNF. “n” indica el número de cultivos independientes utilizados
en el análisis. Existen diferencias significativas en el tratamiento (***p<0,001) pero
no entre genotipos.
91
Resultados
4.4.2. La ausencia de α-SYN no modifica la muerte inducida por la droga
parkinsoniana MPP+
Las neuronas simpáticas, al igual que las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra,
son susceptibles de intoxicación con MPTP/MPP+ (Luthman y Jonsson, 1986; Luthman y
Sundstrom, 1990; Takatsu et al., 2000). La neurotoxicidad selectiva del MPP+ se debe a que
utiliza el mecanismo de recaptación de las catecolaminas para su entrada en las neuronas
(Javitch et al., 1985). En el caso de las neuronas de la substantia nigra, el MPP+ entra a través
del transportador de dopamina (DAT) y en otras poblaciones neuronales catecolaminérgicas
utiliza otros transportadores de catecolaminas como el transportador de noradrenalina (NAT),
presente en neuronas simpáticas, o de serotonina (SERT).
Dada la relación entre la α-SYN y el SNP, así como los síntomas autonómicos que se
presentan en pacientes con EP, decidimos estudiar si la presencia o ausencia de α-SYN podía
afectar la respuesta de las neuronas simpáticas a la intoxicación con la neurotoxina
parkinsoniana MPP+. Para ello, inicialmente se trataron neuronas simpáticas de genotipo salvaje,
tanto embrionarias como postnatales, con distintas concentraciones de MPP+ añadido a la placa
de cultivo 6 h tras el sembrado inicial y se determinó la supervivencia a distintos tiempos. La
respuesta máxima de muerte neuronal, que se observó tanto a las 24 como a las 48 h, se
obtenía a una dosis de 1 μM de MPP+ aunque a las 48 h se morían muchas más neuronas
(Figura 34 A). Según datos de nuestro propio laboratorio, la dosis que causa un 50% de muerte
en cultivos de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo embrionario a las 48 h es de 2 μM
(Miguel Milán y Francisco Pérez Sánchez; comunicación personal). Por tanto, las neuronas del
SCG embrionario son notablemente sensibles al MPP+. Por lo que respecta a las neuronas
simpáticas postnatales se estableció también una curva dosis-respuesta. Todas las
concentraciones de MPP+ que se ensayaron disminuyeron significativamente la supervivencia a
partir de las 48 h de cultivo (Figura 34 B). El aumento de la concentración del tóxico causa un
aumento en la muerte producida, que se acentúa con el tiempo de exposición, pero lo más
característico de las curvas es que parece haber una población de neuronas resistente al tóxico,
sugiriendo que la respuesta al MPP+ no es homogénea para todas las neuronas del ganglio.
El aspecto morfológico que presentan las neuronas simpáticas tratadas con MPP+ es el
típico de una neurona en proceso de apoptosis, con el cuerpo neuronal menos refringente y
redondeado, y con neuritas discontinuas, fragmentadas (no mostrado). Más aún, se observa una
mayor frecuencia de núcleos condensados y fragmentados en tinciones con DAPI (Figura 35 B,
datos no mostrados). La detección inmunocitoquímica de caspasa 3 activada en neuronas
simpáticas embrionarias, a las 12 h tras la adición del MPP+ (Figura 35 A), sugiere que el
92
Resultados
proceso de muerte inducido por el tóxico consiste en una apoptosis dependiente de caspasa 3.
Aunque ha sido descrito que la intoxicación con MPTP/MPP+ aumenta los niveles de expresión
de α-SYN (Vila et al., 2000; Gómez-Santos et al., 2002; Kalivendi et al., 2004), no hemos
observado una mayor inmunofluorescencia para α-SYN en los cultivos tratados con el tóxico (no
mostrado).
A
porcentaje de
supervivencia neuronal
120
E14,5
100
80
24 h
48 h
60
***
***
***
***
***
***
40
20
0
0
B
1
10
50
+
dosis de MPP (μM)
***
100
P7
120
porcentaje de
supervivencia neuronal
***
100
80
60
40
20
0
***
***
***
***
***
***
***
***
24 h
48 h
72 h
0
1
10
50
100
dosis de MPP+ (μM)
Figura 34. Efecto del MPP+ sobre la supervivencia de neuronas simpáticas en cultivo. Porcentaje de
supervivencia de neuronas simpáticas embrionarias (A) y postnatales (B) en cultivo a distintos tiempos tras
tratamiento respecto a las no tratadas a distintas concentraciones de MPP+ (n = 8 en cada caso). El medio
de cultivo contenía 5 ng/ml de NGF más 5 ng/ml NT-3 para las neuronas embrionarias y 10 ng/ml de NGF
para las postnatales. Los tratamientos resultaron significativamente diferentes respecto de sus controles sin
tratar en las neuronas embrionarias (***p<0,001) y las postnatales a partir de las 48 h de cultivo
(***p<0,001).
Aunque existen evidencias de que el MPP+ es un buen sustrato para los sistemas de
captación de catecolaminas (Javitch et al., 1985), se quiso comprobar que, efectivamente, en
neuronas simpáticas éste era el modo de entrada del MPP+. Para ello, se trataron las neuronas
simpáticas
embrionarias
con
desipramina
93
(DMI),
un
bloqueador
farmacológico
de
Resultados
transportadores de catecolaminas, con una Ki de 4 nM para el transportador NAT y de 61 nM
para el SERT. Tratamos las neuronas simpáticas embrionarias con dos dosis diferentes de MPP+
(1 y 10 μM) añadido al medio de cultivo a partir de las 6 h desde el sembrado de las células y se
combinaron estos tratamientos con dos estrategias distintas de administración del bloqueante
desipramina (Bhave et al., 1996). El tratamiento 1 consistió en tratar las neuronas con una alta
concentración de DMI (10 μM) 30 min antes de la aplicación del neurotóxico. El tratamiento 2
consistió en el mismo procedimiento que el tratamiento 1, pero lavando el DMI antes de la
aplicación del neurotóxico y añadiendo nuevamente DMI a una concentración baja y constante (4
nM) junto con el MPP+ y manteniéndolo durante todo el resto del experimento, con la idea de
conseguir un bloqueo constante del NAT. El DMI por sí mismo no afectaba la supervivencia de
las neuronas simpáticas en cultivo (datos no mostrados). Tanto el tratamiento 1 como el 2
previnieron la muerte inducida por MPP+ a 1 o 10 μM, tanto a las 24 h (Figura 36) como a las 48
h (datos no mostrados). En neuronas simpáticas postnatales se obtuvo el mismo tipo de
resultado. Así, los efectos de la dosis de 1 μM de MPP+ a las 72 h de cultivo fueron
contrarrestados con el tratamiento con el DMI (valores de supervivencia neuronal: 100% en el
control sin tratar, 73 ± 6% MPP+ (n = 3), 100 ± 8 % en el tratamiento 1 (n = 3), 100 ± 0 % en el
tratamiento 2 (n = 3)). Por tanto, el pretratamiento con el bloqueador de la entrada de
noradrenalina antagoniza los efectos neurotóxicos del MPP+, indicando que el mecanismo de
entrada del tóxico es el NAT.
A
SCG
E14,5
MPP+
B
caspasa 3
C
D
α-SYN
+
Figura 35. Apoptosis en neuronas simpáticas embrionarias tras tratamiento con MPP (1 μM, 12 h).
Inmunofluorescencia para la detección de caspasa 3 activada (A) y α-SYN (C), y combinada (D) en
neuronas simpáticas de E14,5. Marcaje nuclear de contraste con DAPI (B). Nótese los cuerpos apoptóticos
(cabeza de flecha en D). La barra de escala es de 20 μm (A-D).
94
Resultados
Para investigar la relación entre la intoxicación con MPP+ y la α-SYN se trataron con el
tóxico neuronas simpáticas procedentes de animales α-syn+/+ y α-syn-/-. En el caso de las
neuronas embrionarias simpáticas cuando se comparó la supervivencia a las 24 h entre animales
de genotipo salvaje y mutante nulo se observó que la muerte neuronal era equivalente entre
neuronas de ambos genotipos a todas las concentraciones de MPP+ ensayadas (Figura 37 A).
Cuando se intoxicaron con MPP+ neuronas simpáticas postnatales procedentes de animales αsyn+/+ y α-syn-/-, tampoco se observaron diferencias significativas en la vulnerabilidad neuronal
entre genotipos a las 72 h de tratamiento con distintas dosis de MPP+ (Figura 37 B). Por tanto, la
falta de α-SYN no confiere ninguna alteración en la supervivencia frente a la intoxicación por
MPP+ en neuronas simpáticas, bien de edad embrionaria bien de edad postnatal, lo que
contrasta con la observación de que las neuronas dopaminérgicas mesencefálicas deficientes en
α-SYN presentan una protección, bien total bien parcial frente al tóxico MPP+ (Dauer et al., 2002;
Schlüter et al., 2003; Robertson et al., 2004; Klivenyi et al., 2006; Miguel Milán y Francisco
Pérez-Sánchez, comunicación personal).
porcentaje de
supervivencia neuronal
140
120
**
sin tratamiento
tratamiento 1
tratamiento 2
**
100
*
*
80
60
40
20
0
1
10
+
concentración de MPP (μM)
Figura 36. El bloqueo del transportador NAT previene la intoxicación de las neuronas simpáticas
embrionarias en cultivo. Cultivo de neuronas simpáticas de E14,5 (n = 3) tratadas con MPP+ y uso de dos
tratamientos con desipramina significativamente efectivos en evitar la intoxicación (**p<0,01, *p<0,05; ver
texto). El cultivo se mantuvo durante 24 h utilizando como condiciones neurotróficas 5 ng/ml de NGF y 5
ng/ml de NT-3.
95
Resultados
A
SCG
E14,5
porcentaje de
supervivencia neuronal
100
80
60
40
20
α-syn+/+
α-syn-/-
0
0
1
10
50
+
dosis de MPP (μM)
B
SCG
P7
120
porcentaje de
supervivencia neuronal
100
100
80
60
40
α-syn+/+
α-syn-/-
20
0
0
1
10
50
100
dosis de MPP+ (μM)
+
Figura 37. Efecto del MPP sobre la supervivencia de neuronas simpáticas en cultivo en animales
deficientes en α-SYN. Porcentaje de supervivencia neuronal simpática procedente de animales α-syn+/+ y
α-syn-/- de E14,5 a las 24 h de cultivo (A) y de P7 a las 48 h de cultivo (B) tras adición de MPP+ al cultivo a
las concentraciones indicadas. Porcentaje de supervivencia referido al inicial (% ± SEM) (n = 8 cultivos
independientes para α-syn+/+, embrionario y postnatal, n = 7 α-syn-/- embrionario y n= 5 α-syn-/- postnatal).
La supervivencia neuronal entre genotipos no resultó significativamente diferente.
4.4.3. La sobreexpresión de α-SYN no modifica la muerte inducida por la droga
parkinsoniana MPTP/MPP+
Para profundizar un poco más en la interacción entre intoxicación con MPP+ y α-SYN, se
decidió evaluar la respuesta al tóxico parkinsoniano en neuronas simpáticas embrionarias
procedentes de animales que sobreexpresaban la α-syn humana bajo el promotor del gen TH.
En esta cepa transgénica (TH-hα-syn tg o tg+), observamos expresión del transgén en todas
96
Resultados
aquellas poblaciones neuronales que expresan TH incluyendo las del SNP. Así, la proteína
humana, reconocible por anticuerpos específicos que no reconocen la forma murina (Tabla 9) se
expresa en el SCG embrionario de los animales transgénicos (tg+) (Figura 38 G) pero no en
neuronas simpáticas procedentes de los animales que no portan el transgén (tg-) (Figura 38 C).
Se realizó la misma caracterización en neuronas simpáticas embrionarias en cultivo (Figuras 38
A-F), observándose que el transgén se expresa en la totalidad de las células con una morfología
típica neuronal pero no en la glía (Figuras 38 A-B), como corresponde a la actividad del
promotor. Además, se confirmó que las neuronas que expresan el transgén son
catecolaminérgicas por detección de la TH mediante inmunocitoquímica (Figuras 38 D-F). La
inmunorreactividad para la α-SYN humana se localizó de forma difusa por toda la neurona, tanto
en el citoplasma, como en neuritas e incluso en el núcleo (Figuras 38 B, D).
En esta cepa transgénica, el transgén se mantuvo siempre en heterocigosis por lo que en
el momento de realizar los cultivos se desconocía el genotipo de los embriones. Esto obligó a
que los cultivos se realizasen a partir de un solo embrión, utilizando los dos SCGs de cada uno
de ellos, y manteniendo los cultivos de cada embrión por separado hasta conocer el genotipo.
Dado el bajo rendimiento de este tipo de cultivos, se ensayó una única dosis de MPP+, 1 μM, y
se realizó el recuento correspondiente de supervivencia a las 24 h. A esta concentración, se
observó el mismo porcentaje de pérdida neuronal que en los ensayos realizados para valorar la
respuesta de los deficientes nulos en α-syn. En este último caso, el fondo genético en el que se
encuentra la mutación es mixto entre las cepas 129/SvJ × C57BL/6J, mientras que la cepa en la
que se introdujo el transgén era una C57Bl6 pura, lo que sugiere que las neuronas simpáticas en
cultivo son sensibles a la intoxicación con MPP+ independientemente del fondo genético. Cuando
se analizó la intoxicación entre animales transgénicos (tg+) y no transgénicos (tg-) no se observó
ninguna diferencia en cuanto a la pérdida neuronal (Figura 38 H). Por tanto, ni la falta de α-SYN
ni la sobreexpresión parecen modificar la respuesta de las neuronas simpáticas a la intoxicación
por MPP+.
Para estudiar si una sobreexpresión más fuerte podía modificar la respuesta a la
intoxicación utilizamos células PC12, de una línea de feocromocitoma de rata modificadas
adecuadamente. Estas células proceden de la transformación de células cromafines, productoras
de adrenalina, que comparten origen embrionario con las neuronas simpáticas y son sensibles a
MPP+. En el laboratorio del Dr. José González Castaño de la Universidad Autónoma de Madrid
se establecieron líneas estables de células PC12 que expresaban o bien el reportero eyfp o bien
la construcción α-syn humana-eyfp (PC12-hα-syn) bajo el control del promotor de uno de los
genes del virus del citomegalovirus (Figuras 39 A-D). En estas células se ensayó el efecto del
tóxico MPP+, aunque fue necesario utilizar concentraciones más elevadas de tóxico que en los
cultivos primarios, en el rango mM, y alargar los tiempos de intoxicación, a fin de obtener un
97
Resultados
porcentaje significativo de pérdida celular. Se utilizaron dosis de 0,2 y 0,5 mM que a las 48 h tras
la intoxicación causan, respectivamente, una pérdida celular de aproximadamente un 30 y un
50%, medido por la técnica del MTT de determinación de la viabilidad celular (Figura 39 E).
Cuando se ensayaron en estas mismas condiciones de intoxicación las células PC12
transducidas con la construcción para la proteína de fusión o para la proteína EYFP se comprobó
que la sobreexpresión de la α-SYN humana no alteraba la respuesta al tóxico (Figura 39 F). Por
tanto, la sobreexpresión de la α-SYN no altera la supervivencia tras intoxicación con MPP+ ni en
neuronas simpáticas ni en células cromafines.
B
C
D
E
F
G
H
SCG
E13,5 tg+
porcentaje de
supervivencia neuronal
A
hα-SYN
TH
80
n.s.
60
***
n.s.
40
***
***
***
20
0
tgtg+
α-syn+/+
α-syn-/cepa pura cepa pura cepa mixta cepa mixta
Figura 38. Expresión del transgén de la α-syn humana in vitro e in vivo y supervivencia neuronal tras
intoxicación con MPP+. Expresión de la α-SYN humana en neuronas simpáticas en cultivo por
inmunocitoquímica visible (A-B) y ausencia en células no transgénicas (C) y en glía (flechas en B y C)
además de por inmunofluorescencia de α-SYN humana (D) en células embrionarias simpáticas, TH (E) y la
imagen combinada (F). Presencia de la α-SYN humana en el SCG (G) de un embrión transgénico de E13,5
por inmunoperoxidasa. La barra de escala es de 50 μm (A, G), 30 μm (B, C) y 10 μm (D-F). (H)
Supervivencia neuronal tras intoxicación con MPP+ (1 μM) durante 24 h de neuronas simpáticas E14,5 de
+
+/+
-/animales tg y tg y animales α-syn y α-syn . Se ha representado el porcentaje del número de neuronas
vivas tras intoxicación respecto al de no intoxicadas (100%). El MPP+ consiguió disminuir significativamente
la supervivencia neuronal (***p<0,001) pero no se encontraron diferencias significativas entre animales de
diferente genotipo.
98
Resultados
A
C
EYFP
B
PC12
D
DAPI
E
F
100
80
***
***
60
***
***
40
***
20
0
100
0,2 mM
0,5 mM
porcentaje de
supervivencia celular
porcentaje de
supervivencia celular
120
24 h
48 h
PC12
PC12-hα-syn
80
60
40
20
0
72 h
0,2
0,5
+
concentración de MPP (mM)
tiempo in vitro
Figura 39. Aspecto de las células PC12 y valores de supervivencia tras tratamiento con MPP+.
Células PC12 de genotipo salvaje en cultivo por contraste de fases (A, B), con expresión de la proteína
EYFP (C) y contraste nuclear con DAPI (D). La barra de escala mide 100 μm (A), 60 μm (B) y 20 μm (C, D).
Supervivencia celular tras tratamiento con dos dosis de MPP+ a diferentes tiempos en cultivo de PC12
salvajes (E) y a las 48 h entre células PC12 salvajes y PC12 hα-syn (F). Todas las condiciones afectaron
significativamente la supervivencia celular (***p<0,001) excepto la dosis de 0,2 mM a las 24 h. No existen
diferencias significativas entre las dos cepas de células PC12.
4.4.4. Los niveles de α-SYN no modifican la respuesta del sistema simpático a la
intoxicación in vivo con MPTP
A fin de analizar si la respuesta del sistema simpático al tóxico MPTP administrado in vivo
podía estar afectada por la α-SYN se realizó un análisis de inervación simpática cardiaca en
animales α-syn+/+ y α-syn-/- tras intoxicación con 200 mg/kg de MPTP (5 dosis de 40 mg/kg, una
cada día durante 5 días consecutivos). Esta dosis ya había sido ensayada previamente y se
había visto que resultaba eficaz a la hora de afectar los terminales dopaminérgicos en el SNC de
estos animales (Miguel Milán, trabajo de tesis doctoral).
99
Resultados
Inicialmente se evaluaron diversos parámetros de inervación simpática del corazón de
animales de genotipo salvaje expuestos o no al tóxico. Se determinaron los niveles de proteína
TH en homogenados de tejido cardiaco mediante western blot, normalizados con los valores de
la proteína constitutiva GAPDH. Los resultados mostraron que el régimen de intoxicación
utilizado no causaba una disminución de los niveles de TH/GAPDH (Figuras 40 A y B). Tampoco
los niveles relativos de PGP9.5, como marcador de inervación, se encontraban alterados en los
animales intoxicados (datos no mostrados). Consistente con esto, aunque no observamos
cambios
aparentes
en
la
cantidad
de
TH
(observación
cualitativa)
en
tinciones
inmunocitoquímicas de aorta tras intoxicación con MPTP sí que observamos alteraciones en la
distribución de la inmunorreactividad para la TH, aunque las observaciones fueron similares
entre ambos genotipos (Figura 41).
Como algunos autores mantienen que el tratamiento sistémico con MPTP no produce
desinervación sino tan solo depleción de los niveles de noradrenalina (Kawamura et al., 1999),
decidimos evaluar los niveles de noradrenalina cardiaca en los animales intoxicados. La
noradrenalina, principal neurotransmisor que emplean las neuronas simpáticas cardiacas
(Kaplan et al., 1994), y la determinación de su concentración permitía establecer un índice de la
inervación simpática cardiaca. Estos valores de noradrenalina cardiaca fueron medidos mediante
HPLC por el Dr. Santiago Ambrosio de la Universidad de Barcelona, a partir de muestras de
corazón procedentes de animales inyectados con 200 mg/kg de MPTP o con suero salino, como
controles. Los resultados mostraron que la intoxicación con MPTP disminuye significativamente
los niveles de noradrenalina cardiaca aunque no cambia los niveles de noradrenalina detectables
en la glándula adrenal (Figura 40 C).
Para estudiar la posible implicación de la α-SYN en la respuesta de la noradrenalina
cardiaca a la intoxicación se determinaron sus niveles en animales controles e intoxicados de
genotipo salvaje y mutante nulo para α-syn. Las determinaciones del nivel de TH en las muestras
por inmunoblot, de nuevo, no reveló cambios detectables entre genotipos ni en los niveles
basales de TH ni en los niveles tras intoxicación (Figura 42 A). Cuando se determinaron los
niveles de noradrenalina cardiaca se observó que tanto los niveles normales en los animales
controles, como los niveles disminuidos por la administración del tóxico, no diferían en los
animales de distinto genotipo (Figura 42 B). Para comprobar si la sobreexpresión de α-SYN
podía alterar la respuesta, se midió también la noradrenalina cardiaca en animales tg+, que
sobreexpresaban la α-syn humana bajo el promotor del gen de la TH, y tg-, sin sobreexpresión
del transgén, sin hallarse diferencias significativas entre estos dos genotipos en la respuesta al
tóxico (Figura 42 C). Por tanto, estos resultados indican que ni la falta ni la sobreexpresión de αSYN afectan los niveles de noradrenalina cardiaca tras intoxicación con MPTP.
100
Resultados
A
B
TH/GAPDH
TH
GAPDH
n.s.
0,08
salino MPTP
salino
MPTP
0,06
0,04
0,02
0
α-syn+/+
C
α-syn-/-
noradrenalina
(pmol/mg tejido)
6
4
salino
MPTP
***
2
0
corazón
glándula adrenal
Figura 40. Efectos de la administración de MPTP sobre diferentes tejidos. (A) Detección por
inmunoblot de TH y GAPDH en homogenados de corazón de animales α-syn+/+ adultos tras inyección
intraperitoneal de 200 mg/kg de MPTP (n = 4) o solución salina (n = 4). (B) Cuantificación de los niveles
relativos de proteína TH en animales α-syn+/+ (n = 4 salinos, n = 4 MPTP) y α-syn-/- (n = 4 salinos, n = 5
MPTP) salinos e intoxicados sin obtener diferencias significativas (n.s.). (C) Cuantificación de los niveles de
noradrenalina expresados en pmol por mg de tejido homogeneizado a partir de corazón o glándula adrenal
de animales de genotipo salvaje (n = 3 salinos, n = 6 MPTP). Obsérvese que la noradrenalina cardiaca
(***p<0,001), pero no la cromafín, están afectadas por la intoxicación.
α-syn+/+
B
C
salino
A
α-syn-/-
α-SYN
TH
E
F
MPTP
D
α-SYN
TH
Figura 41. Efecto de la intoxicación con MPTP sobre la inervación simpática de la aorta de ratones
+/+
-/adultos. (A, B, D, E) Inmunocitoquímica para TH en aorta de animales α-syn y α-syn controles (salino) y
tratados con MPTP. Nótese cómo se altera la distribución de la inmunorreactividad para TH en fibras nerviosas
en la condición intoxicada. (C, F) Expresión de α-SYN y TH en nervios simpáticos de la aorta a distintos
aumentos obtenida mediante inmunofluorescencia confocal. La barra de escala mide 10 μm (A-E) y 5 μm (F).
101
Resultados
B
A
α-syn-/-
noradrenalina cardiaca
(pmol/mg tejido)
α-syn+/+
salino MPTP salino MPTP
TH
GAPDH
C
n.s.
2
*
1
**
0
α-syn+/+
α-syn-/-
n.s.
5
noradrenalina cardíaca
(pmol/mg tejido)
3
4
salino
MPTP
3
*
**
2
1
0
tg-
tg+
Figura 42. Efecto de la intoxicación con MPTP en inervación y contenido de noradrenalina en
corazones de animales de genotipo α-syn+/+, α-syn-/-, tg- y tg+. (A) Inmunoblot representativo que
+/+
-/muestra los niveles de TH y GAPDH en muestras de corazón de animales α-syn y α-syn intoxicados o
no con MPTP (α-syn+/+ n = 5 animales salinos, n = 6 MPTP y (α-syn-/- n = 3 para cada tratamiento), y (B)
+/+
-/niveles relativos de noradrenalina cardiaca en ratones adultos de genotipo α-syn y α-syn y de (C)
+
animales tg (n = 3 salinos, n = 6 MPTP) y tg (n = 3 salinos, n = 4 MPTP) tras administración de 200 mg/kg
de MPTP y sus respectivos controles salinos. Los valores de noradrenalina se dan como el promedio
obtenido del número de animales indicados ± SEM. La cantidad de noradrenalina cardiaca resultó
significativamente diferente entre condiciones (**p<0,01 y *p<0,05) pero no entre genotipos.
Por tanto, no hemos podido detectar una interacción entre niveles de α-SYN y respuesta al
tóxico parkinsoniano MPP+/MPTP en neuronas del sistema simpático, ni en experimentos in vivo
ni en los ensayos in vitro. Estas observaciones contrastan con los efectos beneficiosos que la
ausencia de α-SYN tiene en la respuesta de las neuronas catecolaminérgicas de la substantia
nigra a MPP+/MPTP.
102
5. DISCUSIÓN
103
Discusión
El trabajo de esta tesis partía de la hipótesis de que la α-SYN podría estar implicada en la
vulnerabilidad de las neuronas de la subdivisión autonómica del SNP, sobre todo en aquellos
paradigmas experimentales que remedan parkinsonismo o que inducen muerte neuronal
apoptótica u otras formas de neurodegeneración. Los supuestos en los que se fundamentaba
esta hipótesis eran: 1) los paralelismos neuroquímicos de las neuronas simpáticas con otras
neuronas catecolaminérgicas, que las hace sensibles a tóxicos como el MPTP/MPP+ o la 6OHDA y 2) las afectaciones autonómicas que se encuentran en enfermos de Parkinson, también
en aquellos que muestran alteraciones en α-syn. Nuestro resultado inicial de que, además, la αsyn se expresa abundantemente en estructuras del SNP, desde estadios muy tempranos del
desarrollo, contribuyó a reforzar nuestra idea de que esta molécula podría jugar un papel
esencial en el SNP, incluso durante la embriogénesis. A pesar de todas las indicaciones previas,
los datos obtenidos en este trabajo sugieren que la eliminación del gen α-syn en ratón no causa
ningún fenotipo aparente en el SNP, al menos al nivel de los análisis que hemos realizado.
Nuestros mutantes nulos muestran un desarrollo de los ganglios periféricos, de tipo simpático y
sensorial, aparentemente normal y las neuronas periféricas aisladas y cultivadas in vitro no
responden a los factores neurotróficos, ni a la inhibición farmacológica de las rutas de
señalización intracelular activadas a partir de sus receptores, de manera distinta a las neuronas
competentes para α-syn, ni en cuanto a supervivencia ni en cuanto a crecimiento neurítico.
Además, los estímulos que causan apoptosis en estas neuronas, tales como compuestos
genotóxicos o tóxicos mitocondriales como el MPP+, tampoco parecen causar un efecto distinto,
en cuanto a supervivencia, en neuronas que no expresan α-syn frente a sus equivalentes de
genotipo salvaje. En este trabajo nos hemos detenido más en el análisis de la respuesta de las
neuronas simpáticas al tóxico MPTP/MPP+, por los supuestos que antes hemos mencionado. En
el caso de este tóxico, hemos estudiado la respuesta in vitro de neuronas simpáticas, tanto
embrionarias como postnatales, sin encontrar una mayor o menor vulnerabilidad dependiente de
genotipo. Dado que las alteraciones en funciones autonómicas que se encuentran en enfermos
de Parkinson posiblemente no están causadas por una muerte de las neuronas simpáticas, sino
por alteraciones en la inervación, analizamos también si, en ausencia de α-SYN, la inyección in
vivo de MPTP alteraba de forma diferencial la inervación y los niveles de noradrenalina
cardíacos, aunque tampoco encontramos diferencias entre genotipos. Tampoco un aumento de
los niveles de α-SYN, como el que se encuentra en neuronas simpáticas obtenidas de nuestros
ratones transgénicos para el cDNA de α-syn humana bajo el control del promotor de la TH,
supuso ningún cambio en vulnerabilidad frente al MPTP/MPP+, ni in vitro ni in vivo. El único
cambio estadísticamente significativo que hemos detectado en este trabajo ha sido una
respuesta de supervivencia diferencial de las neuronas deficientes para α-SYN frente al bloqueo
farmacológico del enzima PKCδ, aunque el cambio es relativamente pequeño.
104
Discusión
Los datos derivados de nuestro estudio de la expresión de la α-syn indican que se trata
de una proteína de expresión temprana en el desarrollo embrionario, y que se localiza
inicialmente en el citoplasma y el axón de las neuronas jóvenes, mientras están creciendo sus
proyecciones. Pero lo que más llamó nuestra atención fue la fuerte expresión en neuronas
periféricas, tanto simpáticas como sensoriales, de embriones de ratón sugerente de que la αSYN podría jugar un papel en el desarrollo de estas estructuras (ver, también, Ninkina et al.,
2003). Además, poco antes del inicio de esta tesis, se describió que la sobre-expresión de α-syn
humana en neuronas nodosas en cultivo, transducidas mediante microinyección, causaba un
aumento en la apoptosis, un efecto que no era suprimido por la expresión simultánea de Akt
activa, pero sí por BclXL, una molécula pro-supervivencia neuronal de la familia de los Bcl-2
(Saha et al., 2000). A pesar de la abundante expresión de la molécula y del efecto descrito en
neuronas nodosas, nuestro análisis histológico de los ganglios SCG y NOD no reveló ninguna
diferencia aparente entre animales α-syn-/- y α-syn+/+ durante la embriogénesis. Durante la
realización de este trabajo, se publicaron dos trabajos sobre descripciones de otras estructuras
del SNP en estos y otros mutantes de la familia de las sinucleínas en los que también se
describía una ausencia de fenotipo periférico (Ninkina et al., 2003; Papachroni et al., 2005). En la
misma cepa de ratones que la nuestra se ha comprobado que no hay déficit en el número de
neuronas sensoriales a nivel de los ganglios sensoriales espinales y que neuronas disociadas de
ganglio trigémino no muestran diferencias, en cuanto a supervivencia en cultivo, al compararlas
con las de genotipo salvaje (Ninkina et al., 2003; Papachroni et al., 2005). En uno de estos
estudios también se analizó el posible papel de la γ-SYN (BCSG1/persina) en el desarrollo del
SNP. Esta otra sinucleína muestra un grado de similitud aminoacídica con la α-SYN bastante
elevado en la región de las repeticiones KTK del extremo N-terminal y propiedades similares a
las de la α-SYN en cuanto a presentar un estado conformacional desplegado en soluciones
fisiológicas, una unión reversible a vesículas lipídicas y una localización eminentemente
presináptica (Buchman et al., 1998; Lavedan et al., 1998; Tiunova et al., 2000; Kuhn et al., 2007).
En mutantes dobles para estas dos sinucleínas tampoco se encontraron alteraciones en el
desarrollo y viabilidad de neuronas periféricas sensoriales (Papachroni et al., 2005). La
explicación más sencilla para nuestros resultados y los de otros grupos es que, a pesar de los
elevados niveles de expresión en el SNP, la α-SYN no es esencial para el desarrollo y
funcionalidad de neuronas sensoriales o simpáticas. Una posibilidad alternativa es que la α-SYN
tenga funciones vitales y que, por tanto, se hayan desarrollado mecanismos de protección
compensatorios de su posible pérdida. No hay que olvidar que existen tres sinucleínas en
vertebrados, que comparten algunas similitudes estructurales y de función (Lavedan et al., 1998),
pero que ningún laboratorio ha generado un mutante triple para los tres genes.
105
Discusión
A pesar de la falta de fenotipo en condiciones de desarrollo normal, el hecho de que
alteraciones en α-SYN puedan conducir a una disfunción de las neuronas simpáticas adultas en
humanos nos indujo a evaluar la funcionalidad de las neuronas autonómicas deficientes en αSYN en condiciones de estrés celular. En este trabajo hemos empleado varias situaciones de
estrés celular, inicialmente en cultivo, consistentes en la privación trófica, el empleo de moléculas
que causan apoptosis por inducción de daño genotóxico y, por último, el uso de MPP+, por
razones obvias en el contexto de la EP y porque nos servía como agente que induce daño
celular por aumento del estrés oxidativo. Todos estos estímulos pueden evocar apoptosis en
neuronas simpáticas aunque las vías apoptóticas activadas en cada caso no son
necesariamente las mismas, a pesar de que compartan muchos elementos moleculares
comunes (Park et al., 1998). La razón, por tanto, de analizar cada uno de ellos en neuronas
deficientes para α-syn era averiguar si alguno de los estímulos apoptóticos específicos ponía de
manifiesto la actuación de esta molécula. No hay que olvidar que la α-SYN ha sido implicada en
procesos de apoptosis en diversos sistemas celulares experimentales, aunque no está claro si
como protectora o facilitadora del proceso de muerte celular. Así, por ejemplo, en algunas líneas
celulares la sobreexpresión de α-SYN parece disminuir la respuesta apoptótica dependiente de
p53 (da Costa et al., 2002) o protege de estrés oxidativo mediante, por ejemplo, la inactivación
de la quinasa JNK o la activación de ruta PI3-quinasa/Akt (Seo et al., 2002; Hashimoto et al.,
2002; Manning-Bog et al., 2003) mientras que, en otras, la sobreexpresión de la α-syn humana
causa disfunción mitocondrial, aumento del estrés oxidativo y mayor vulnerabilidad celular a la
toxicidad por dopamina (Zhang et al., 2000; Iwata et al., 2001; Junn y Mouradian, 2002). En este
contexto, se ha observado que la falta de α-SYN en neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo
ventral parece proteger a estas neuronas del daño causado por MPTP (Dauer et al., 2002;
Schlüter et al., 2003; Drolet et al., 2004; Robertson et al., 2004; Klivenyi et al. 2006; Miguel Milán,
trabajo de tesis doctoral. A pesar de todos estos datos, nosotros no hemos encontrado ninguna
diferencia entre genotipos en los paradigmas experimentales de inducción de apoptosis
analizados, ni en los cultivos de neuronas simpáticas embrionarias ni en los de postnatales.
Dado que las mutaciones en humanos causan la neurodegeneración por una ganancia de
función, podría ser que un fondo nulo no alterase necesariamente los procesos de apoptosis.
Aun así, tampoco hemos observado afectación diferencial frente al tóxico MPP+ en neuronas
simpáticas embrionarias transgénicas para el gen de la α-syn humana, si bien es cierto que, en
este caso, puede ser que los niveles de expresión no sean suficientes o que fuese necesario
sobre-expresar formas mutadas del gen.
Para analizar la respuesta de las neuronas simpáticas a un paradigma de privación trófica
cultivamos las neuronas procedentes de SCG embrionarios con NGF y/o NT-3 y las de SCG
postnatales con NGF. Los estudios clásicos de dependencia neurotrófica de las neuronas
106
Discusión
simpáticas ya habían demostrado hacía tiempo que las neuronas simpáticas obtenidas de
neonatos o de animales postnatales tempranos dependían enteramente de NGF para sobrevivir
en cultivo (Chun y Patterson, 1977). Diversos trabajos publicados a principios de los 90 habían
indicado, además, que los neuroblastos simpáticos eran dependientes de NT-3 para su
supervivencia (DiCicco-Bloom y Black, 1988; Dechant et al., 1993; DiCicco-Bloom et al., 1993;
Verdi y Anderson, 1994). Esta dependencia neurotrófica de los precursores simpáticos descrita
in vitro parecía apoyada por los estudios sobre la dinámica en el patrón de expresión de los
receptores quinasa para las neurotrofinas (Birren et al., 1993; Wyatt y Davies, 1995). TrkC,
principal receptor para NT-3, se expresa en los precursores simpáticos en división y su expresión
desciende hasta niveles casi indetectables hacia el nacimiento (Barbacid, 1994; Bothwell, 1995),
mientras que el mRNA que codifica para TrkA, principal receptor para NGF, se detecta a partir de
E13,5 en el ratón y aumenta hacia el nacimiento (Birren et al., 1993; DiCicco-Bloom et al., 1993;
Wyatt y Davies, 1995; Fagan et al., 1996; Wyatt et al., 1997). Así, el modelo que se propuso era
que las neuronas simpáticas responderían a NT-3, a través de TrkC, durante las primeras fases
de desarrollo de los ganglios, mientras que en etapas posteriores del desarrollo lo harían a NGF
a través de TrkA (Birren et al., 1993). El análisis de los mutantes nulos para estas neurotrofinas y
sus receptores probó que, efectivamente, ambas neurotrofinas eran esenciales a lo largo del
desarrollo para tener un complemento neuronal normal en los ganglios simpáticos pero,
contrariamente a lo predicho, no lo eran de forma secuencial. Así, ratones deficientes de ngf
tienen una reducción del 80% en el volumen del ganglio simpático (Crowley et al., 1994), y la
deficiencia en nt-3 causa una reducción del 50% del número de neuronas en el SCG (Ernfors et
al., 1994; Fariñas et al., 1994), pero estas deficiencias se producen de forma casi simultánea
(Francis et al., 1999). Para comprender como se produce esta situación es necesario tener en
cuenta el fenotipo de los mutantes de los receptores. Así, ratones mutantes nulos para TrkA
carecen totalmente de neuronas en el ganglio SCG (Smeyne et al., 1994; Fagan et al., 1996)
mientras que el número de neuronas no se ve alterado tras la deficiencia en el dominio quinasa
del receptor de TrkC (Fagan et al., 1996) o de todo el receptor TrkC (Tessarollo et al., 1997). Por
tanto, NGF y NT-3 son esenciales para mantener la supervivencia de las mismas neuronas
actuando sobre el receptor TrkA aunque algunas neuronas simpáticas sólo dependen de NGF
(Francis et al., 1999). Se ha demostrado también que la respuesta mediada por TrkA a cada una
de las dos neurotrofinas depende de p75 (Brennan et al., 1999). En nuestros experimentos,
realizamos cultivos de neuronas simpáticas embrionarias en un momento en el que el ganglio
presenta tanto expresión de TrkC como ciertos niveles de TrkA, lo que podría explicar la
respuesta similar en supervivencia que observamos tras exposición a NT-3, NGF o ambas. La
falta de aditividad de las curvas para cada una de las neurotrofinas sugiere que ambas actúan
sobre la misma población de neuronas. En concordancia, además, hemos mostrado que la
107
Discusión
supervivencia de una buena parte de las neuronas simpáticas inmaduras o precursores
simpáticos en cultivo procedentes de animales E14,5 es independiente de NGF y NT-3.
Nuestros resultados indican que la falta de α-SYN no hace más vulnerables a las
neuronas simpáticas frente a un paradigma de privación trófica. El genotipo tampoco modificó la
curva de dosis-respuesta de la supervivencia de las neuronas nodosas cultivadas en presencia
de distintas concentraciones de BDNF. Resultados similares han sido obtenidos por Stefanis et
al. (2004). Por otro lado, la inhibición de la vía PI3K/Akt (Patapoutian y Reichardt, 2001) no
modificó la supervivencia de las neuronas carentes de α-SYN respecto de las salvajes. Un
trabajo reciente ha descrito resultados equivalentes en neuronas sensoriales postnatales
aisladas de ratones dobles mutantes nulos α-syn/γ-syn en las que se observó que la carencia de
α-SYN tampoco se traduce en una supervivencia alterada tras inhibición de las vías PI3K/Akt o
JNK (Papachroni et al., 2005). Por tanto, la α-SYN no parece ejercer ningún papel ni pro- ni
antiapoptótico en la supervivencia de las neuronas simpáticas tras la privación trófica.
Como comentábamos anteriormente, la única diferencia entre neuronas de distinto
genotipo para α-syn encontrada fue una respuesta de supervivencia diferencial frente a la
inhibición farmacológica de la PKCδ, aunque tan sólo en las neuronas simpáticas maduras. A
pesar de que la diferencia entre genotipos era muy moderada, la significación sugiere que, de
alguna manera, un fondo nulo para α-syn altera el estado de este enzima. Las proteínas
quinasas C de tipo serina/treonina (PKC) regulan distintos procesos celulares, incluidos el
crecimiento celular, la neuritogénesis o la apoptosis, tanto como moléculas anti-apoptóticas
como pro-apoptóticas (Brodie y Blumberg, 2003; Jackson y Foster, 2004). La familia comprende
al menos a 12 isoformas distintas, que comparten un dominio catalítico común pero que difieren
en su regulación (Nishizuka, 1992; Dempsey et al., 2000). Según esta regulación, las PKCs se
dividen en tres grupos: convencionales, nuevas y atípicas. Las isoformas convencionales (PKC
α, βI, βII, γ) son sensibles a Ca2+ y diacilglicerol (DAG) mientras que las nuevas (PKC δ, ε, η, θ,
μ) son independientes de Ca2+ pero requieren DAG para su activación. Las isoformas atípicas
(PKC λ/ι, ζ), por su parte, no requieren ni Ca2+ ni DAG y son reguladas por proteolisis o
fosforilación (Jaken, 1996; Gschwendt, 1999).
La PKCδ pertenece al grupo de las PKCs nuevas y tiene efectos en proliferación,
induciendo parada de ciclo al inhibir la expresión de ciertas ciclinas, así como en supervivencia y
en crecimiento neurítico (Watanabe et al., 1992; Mischak et al., 1993; Fukumoto et al., 1997;
Battaini, 2001). En el caso de la activación de TrkA por NGF, PLCγ se une a la tirosina
fosforilada Y785 y se activa, hidrolizando fosfoinositol-4,5-bifosfato para producir DAG e inositol3-fosfato que a su vez activan a las PKCs (Loeb et al., 1994; Pierchala et al., 2004). La
108
Discusión
activación de PKCδ en este contexto se había asociado clásicamente con la emisión de neuritas
por parte de células PC12 en respuesta a NGF (Obermeier et al., 1994; Stephens et al., 1994).
La implicación de PKCδ en supervivencia mediada por NGF en neuronas simpáticas se ha
descrito recientemente (Pierchala et al., 2004). Así, la activación por ésteres de forbol es capaz
de rescatar la muerte de neuronas simpáticas privadas de NGF y parece ser que las PKCs
activadas por la acción de la neurotrofina cooperan con la vía PI3K/Akt para promover la
supervivencia de las neuronas simpáticas, inhibiendo entre las dos la fosforilación del factor de
transcripción pro-apoptótico c-jun (Pierchala et al., 2004). En relación con la α-SYN, se ha
descrito que ésta puede inhibir múltiples actividades enzimáticas (Jenco et al., 1998; Iwata et al.,
2001; Perez et al., 2002). Se conoce que la α-SYN interacciona con PKCδ y que inhibe su
actividad (Ostrerova et al., 1999; Kaul et al., 2005).
A nivel molecular, se piensa que la estimulación de PKCδ, a partir de la acción de PLCγ,
modula la supervivencia por su acción sobre la activación de diferentes moléculas corriente
arriba de MEK en la vía Ras/Raf/MEK/MAPK. Está descrito que la activación de la vía de las
MAPK por parte de PKCδ tiene lugar en diferentes puntos, a) corriente arriba de Ras
(Keshamouni et al., 2002), b) corriente abajo de Ras pero corriente arriba de Raf (Ueda et al.,
1996), y c) corriente abajo de Raf pero corriente arriba de MEK (Corbit et al., 1999; Jackson et
al., 2001), aunque se desconocen los mecanismos específicos (ver Jackson y Foster, 2004) y si
estas activaciones tendrían lugar en nuestras condiciones y tipos celulares. En el trabajo de
Keshamouni et al. (2002) se muestra que la activación extracelular por estrógenos en una línea
celular se traduce en la activación intracelular de las ERK1/2 mediada por PKCδ que se
localizaría corriente arriba de Ras, pero no se menciona si tendría lugar de modo directo o no.
Aunque en el trabajo de Ueda et al. (1996) se observa que PKCδ está implicada en la
señalización con un éster de forbol (TPA) y la consiguiente activación intracelular de
Raf/MEK/ERK e independiente de Ras, se desconoce si PKCδ activaría directamente a Raf. En
el trabajo de Corbit et al. (1999) se muestra que la activación de la vía de supervivencia de las
MAPK/ERK tras un estímulo como el factor neurogénico NGF requiere de PKCδ (Corbit et al.,
1999; ver Patapoutian y Reichardt, 2001). En este trabajo se observa que la inhibición de PKCδ,
con rottlerina u oligonucleótidos, consigue eliminar la activación a MEK (MAPK quinasa) y ERK
(o MAPK) inducida por NGF, sin eliminar la activación de ERK por MEK. Sin embargo, no está
descrito el mecanismo por el cual PKCδ regularía la activación de MEK. En este mismo trabajo,
se barajan posibles mecanismos de activación como la a) fosforilación directa de MEK por PKCδ,
b) la fosforilación indirecta a través de un mecanismo como la inactivación de fosfatasas
mediada por PKCδ o c) la actuación de PKCδ como proteína de anclaje que condujera a MEK y
su activación a la localización celular apropiada. Se ha comprobado también que PKCδ puede
activar indirectamente las ERKs, fosforilando a RasGRP3, factor intercambiador de Ras/Rap1
109
Discusión
(Brodie et al., 2004), y de ahí que una inhibición de PKCδ podría conducir a una ausencia de
activación de la cascada de las ERKs disminuyendo la supervivencia celular. También se ha
visto que PKCδ actúa sobre las otras MAPK, inhibiendo a SAP-K/JNK (Morino et al., 2001) y
activando a p38 MAPK (Ryer et al., 2005), las cuales forman parte de vías apoptóticas que se
activan ante diferentes tipos de estrés. Alternativamente, se podría plantear que PKCδ y α-SYN
regularan su acción sobre una misma molécula que a su vez activara la vía Ras/Raf/MEK/MAPK.
Este es el posible caso de la fosfolipasa D2 (PLD2), cuya acción es inhibida por la α-SYN (Jenco
et al., 1998) y es fosforilada y activada por PKCδ (Lee et al., 2000; Han et al., 2002). Aplicado a
nuestro caso de las neuronas simpáticas salvajes en la situación donde PKCδ está inhibida, ésta
no activaría a PLD2 ni esta a su vez a la vía de las MAPK, acción reforzada por la presencia de
α-SYN que inhibiría PLD2 y ésta no activaría (tanto) la vía de las MAPK y de ahí el descenso en
supervivencia. El rescate en supervivencia visto en las neuronas α-syn-/- con la PKCδ inhibida se
explicaría al contrarrestarse las acciones de PKCδ y α-SYN sobre la PLD2 por lo que la PLD2
podría mediar la traslocación de la Raf-1 a la membrana plasmática y activar la vía de las MAPK,
tal y como ya ha sido descrito (Rizzo et al., 1999). A pesar de todas estas observaciones, es
posible que el efecto diferencial que observamos nosotros no tenga que ver con la activación de
la vía MEK/MAPK, ya que el trabajo de Papachroni et al. (2005) muestra que neuronas
sensoriales postnatales carentes de α-syn/γ-syn se comportan de manera equivalente a las
salvajes tras la inhibición farmacológica de MEK. Aun así, no pueden descartarse diferencias a
este nivel en cuanto al tipo celular.
La PKCδ está claramente implicada en el efecto del NGF sobre los procesos de
diferenciación de células PC12 (O´Driscoll et al., 1995), así como en el efecto diferenciador pero
no mitogénico del FGF en células hipocampales (Corbit et al., 1999). De forma más específica, la
inducción de la neuritogénesis, al menos en células de neuroblastoma, parece ser dependiente
de la subunidad reguladora del enzima y no de su actividad quinasa, por su acción negativa
sobre RhoA (Ling et al., 2004). Algunos trabajos han indicado, además, que la propia α-SYN
podría regular el crecimiento neurítico. Así, células de la línea neuronal de rata B103
transfectadas con α-syn humana muestran una reducción del crecimiento neurítico asociado a
alteraciones en adhesión (Takenouchi et al., 2001; Tsuboi et al. 2005). Por otro lado, existen
numerosos trabajos que sugieren una relación funcional, al menos en cuanto a causas de
neurodegeneración, entre α-SYN y la proteína tau de estabilización de microtúbulos, y se ha
descrito que la α-SYN estimula la fosforilación de residuos específicos de serina de tau por PKA
(Jensen et al., 1999). Además, la γ-SYN es capaz de modular la integridad del citoesqueleto
neuronal ya que incrementa la susceptibilidad de ciertas subunidades de neurofilamentos a la
proteolisis (Buchman et al., 1998). A nivel subcelular se observa una desestabilización del tráfico
dependiente de los microtúbulos (Lee et al., 2006) mientras que a nivel molecular se observa un
110
Discusión
aumento de la expresión de quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) mediando este
crecimiento neurítico alterado (Hashimoto et al., 2003). Todos estos datos nos llevaron a
investigar si nuestras neuronas deficientes para α-syn tenían un crecimiento neurítico alterado.
Realizamos experimentos de medidas en neuronas fijadas e incluso medidas en neuronas
durante las primeras fases de extensión de neuritas mediante video-microscopía y no
observamos diferencias en extensión de neuritas entre neuronas de distinto genotipo. También
utilizamos el inhibidor de la PKCδ, rottlerina, que tenía un efecto diferencial en la supervivencia
de las neuronas simpáticas postnatales, y estudiamos el crecimiento de las neuritas. Aunque
observamos una reducción del crecimiento en presencia del inhibidor en un ensayo preliminar
(alrededor de un 25% de reducción a las 2 h con 1 µM rott), esta reducción era la misma
independientemente del genotipo de la neurona. Estos datos no han sido mostrados en los
Resultados de la tesis ya que fueron realizados con neuronas embrionarias, en las que no
habíamos detectado efectos en supervivencia mediada por PKCδ, pero sugieren que la falta de
α-SYN no modula el papel de PKCδ en neuritogénesis. Este resultado estaría de acuerdo con la
observación de que el tratamiento de la línea B103 con el éster de forbol PMA no restaura la
extensión neurítica en las células que sobreexpresan α-syn humana (Takenouchi et al., 2001).
También utilizamos el inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK) con el mismo resultado,
esto es, que las células redujeron su crecimiento neurítico en etapas iniciales (13% reducción, 2
h, 1,6 nM) pero sin diferencias entre genotipos. En conclusión, y a pesar de los datos previos en
la bibliografía, nosotros no hemos observado ningún efecto de la falta de α-SYN en la
morfología, crecimiento o adhesión de nuestras neuronas.
Hemos analizado especialmente el papel de la α-SYN en un modelo donde se afecta la
supervivencia de las neuronas catecolaminérgicas tras intoxicación con MPP+. Nuestros
resultados muestran que este neurotóxico entra selectivamente en la neurona simpática a través
del transportador de noradrenalina, como ya había sido descrito en neuronas simpáticas de pollo
utilizando una aproximación farmacológica de bloqueo del NAT similar a la nuestra (Bhave et al.,
1996) y que las neuronas simpáticas son muy sensibles a este tóxico si se las compara con las
clásicas dopaminérgicas de la SN. En nuestros experimentos también hemos comprobado que
las neuronas simpáticas embrionarias son mucho más sensibles al MPP+ que las postnatales. No
está claro a que puede ser debida la diferencia pero en experimentos con MPP+ en cultivos de
neuronas simpáticas de pollo se comprobó que con el tiempo in vitro las neuronas desarrollaban
una resistencia al fármaco que, en ese caso, parecía ser debida a un aumento en los niveles de
glutatión, aunque también se ha propuesto que neuronas maduras, con mayores niveles de
transportadores vesiculares del tipo VMAT2 serían más resistentes a las acciones del MPP+ al
secuestrar un mayor número de moléculas del neurotóxico al interior de las vesículas sinápticas
111
Discusión
y reduciendo así los niveles que alcanzan la mitocondria (Bhave et al., 1996). Es posible que
neuronas ontogenéticamente más maduras sean más resistentes por la misma razón.
En nuestro estudio hemos comprobado como la falta o la sobreexpresión de α-SYN en
neuronas simpáticas en cultivo no se traduce en una supervivencia neuronal alterada respecto
de las neuronas salvajes tras intoxicación con MPP+. Esto contrasta con los resultados obtenidos
en supervivencia de neuronas del SNC tras intoxicación con MPTP in vivo y con MPP+ en cultivo.
Neuronas dopaminérgicas de la SN de diferentes cepas de ratones de genotipo mutante nulo
para α-syn muestran tanto resistencia total (Dauer et al., 2002) como parcial (Schlüter et al.,
2003; Drolet et al., 2004; Robertson et al., 2004; Klivenyi et al. 2006; Miguel Milán, trabajo de
tesis doctoral) a la intoxicación con MPTP. Las líneas de ratones transgénicos, sin embargo, han
mostrado fenotipos variables. Se ha encontrado tanto una mayor susceptibilidad a la intoxicación
con MPTP en ratones que sobreexpresan α-syn en su forma salvaje (Song et al., 2004) o en su
forma mutada A30P (Nieto et al., 2006) como un idéntico comportamiento en otros ratones que
sobreexpresan la mutación A30P (Rathke-Hartlieb et al., 2001) o la A53T (Dong et al., 2002).
Estos resultados tan variables podrían estar relacionados con el nivel de expresión de la α-syn
en los animales transgénicos. Así, también en nuestro caso, la observación de que la
sobreexpresión de la α-syn humana bajo el control del promotor de la TH no haga más
susceptible a la célula simpática se podría explicar porque los niveles sobreexpresados de αSYN no fueran suficientes.
Se ha visto que ciertas proteínas quinasa podrían jugar un papel importante en los
procesos neurodegenerativos (ver trabajo de Gandhi y Wood, 2005), como lo sugieren las
mutaciones en el gen PINK1 y en el gen LRKK2 en enfermos de EP (Valente et al., 2004;
Paisán-Ruiz et al., 2004). PKCδ podría ser un buen candidato implicado en la patología de la EP
ya que se expresa abundantemente en cerebro (Leibersperger et al., 1991), particularmente en
regiones dopaminérgicas, incluyendo estriado y SNpc (Kanthasamy et al., 2003) y dicha
expresión aumenta con la edad (Goldberg y Steinberg, 1996). Diversos estímulos apoptóticos
inducen la activación y translocación de PKCδ (Brodie y Blumberg, 2003). De forma más
concreta, y con implicaciones para el presente estudio, está el hecho de que diversas toxinas
dopaminérgicas, como el MMT, la dieldrina o el MPP+ inducen la activación de este enzima por
proteolisis (Anantharam et al., 2002; Kaul et al., 2003; Kitazawa et al., 2003). En algunas células
en proceso de apoptosis, la PKCδ es hidrolizada por caspasa 3 lo que genera un dominio
regulador de 38 kDa (RD) y un fragmento catalítico activo de 40kDa que es capaz de inducir la
condensación de la cromatina, la fragmentación nuclear y la muerte celular (Emoto et al., 1995;
1996; Ghayur et al., 1996). El inhibidor selectivo rottlerina, también utilizado en nuestros
experimentos, así como formas dominante/negativas de PKCδ pueden, por el contrario, atenuar
112
Discusión
el proceso apoptótico. En estas condiciones se observa además una inhibición de la propia
caspasa 3 lo que sugiere la existencia de un bucle regulatorio entre caspasa 3 y PKCδ
(Anantharam et al., 2002). En la línea celular dopaminérgica N27, se ha comprobado
recientemente que la sobre-expresión de α-syn humana rescata las células de la apoptosis
inducida por MPP+, atenuando la activación proteolítica de la PKCδ, mientras que la forma
mutada A53T aumenta la activación y causa más apoptosis (Kaul et al., 2005). Debido a este
contexto, nosotros hemos utilizado el inhibidor rottlerina en combinación con MPP+ en nuestros
cultivos, aunque los resultados no han sido tampoco incluidos en la sección de Resultados, ya
que no hemos obtenido ningún cambio significativo. Ni siquiera hemos observado que el
tratamiento con rottlerina sea capaz de prevenir la intoxicación de las neuronas simpáticas, como
ha sido descrito para líneas celulares dopaminérgicas (Anantharam et al., 2002).
Los enfermos de EP muestran una pérdida de inervación simpática noradrenérgica al
corazón detectada mediante ensayos neuroquímicos durante cateterización cardiaca o mediante
la visualización de la unión de radioligandos como el 123I-MIBG o la 18F-fluorodopamina. Además,
se ha observado una disminución en la inmunorreactividad para TH en muestras de epicardio
procedentes de autopsias de enfermos con EP (Orimo et al., 2002; 2003; Goldstein et al., 2003).
Los efectos parecen especialmente importantes a nivel del corazón, frente a otros órganos y los
cambios en catecolaminas en plasma en pacientes con EP sugieren que en EP con hipotensión
ortostática se produce una disfunción de la inervación simpática sin afectación adrenomedular
(Goldstein et al., 2003). La misma deficiencia en inervación se ha observado en ratones tratados
con MPTP (Takatsu et al., 2000), estudiando el radiomarcaje con MIBG, incluso a dosis que no
causan parkinsonismo. Otros estudios han mostrado como el MPTP causa una depleción de
catecolaminas cardíacas (Wallace et al., 1984; Ambrosio y Mahy, 1989; Fuller et al., 1989). De
hecho, tras administración del MPTP, la concentración mayor de MPP+ se encuentra en el
corazón (Fuller et al., 1988). Esta disfunción causa una reducción en la fuerza y velocidad de la
contracción cardíaca (Ren et al. 2004). En nuestras intoxicaciones con MPTP no hemos
observado cambios en la cantidad total de TH cardíaca aunque sí una redistribución de la misma
en las fibras que inervan el corazón y la aorta. En estas mismas condiciones de intoxicación,
datos de nuestro laboratorio muestran que tampoco se produce un descenso en los niveles de
TH estriatal (Miguel Milán, trabajo de tesis doctoral). Aunque un régimen de intoxicación
consistente en la administración de 80 mg/kg en un solo día sí causa disminución de la cantidad
total de TH estriatal (Miguel Milán, trabajo de tesis doctoral), este mismo régimen tampoco causa
un descenso de TH cardíaca (datos no mostrados). La posibilidad de que la actividad TH esté
afectada por el tratamiento con MPTP sin cambios de nivel en la proteína no son descartables y
se han descrito en trabajos anteriores, tanto tras el tratamiento con 20 mg/kg de MPTP
(Ambrosio y Mahy 1989), como tras tratamiento con 6-OHDA (Kawamura et al., 1999). La
113
Discusión
posibilidad alternativa de que la posible desinervación simpática pudiera haberse recuperado tras
el régimen tóxico empleado parece descartada, ya que sí que vemos que la cantidad de
noradrenalina está disminuida tras la intoxicación. Esto coincide con descripciones previas en
ratones adultos en los que la administración de MPTP producía una depleción de noradrenalina y
un descenso transitorio en la recaptación del neurotransmisor sin cambios aparentes de
inervación (Luthman y Johnson, 1986). En este mismo trabajo se describe como el MPP+ sí
parece causar una desorganización de las fibras simpáticas que inervan el iris, algo similar a lo
que nosotros observamos en el corazón tras la intoxicación con MPTP. En resumen, aunque
existe una disfunción en las fibras simpáticas que inervan el corazón no hay cambios aparentes
en la cantidad de TH presente en las fibras.
La reducción observada en los niveles de noradrenalina cardiaca en los animales
intoxicados puede deberse a una reducción en la síntesis del neurotransmisor o a una
liberación/recaptación alterada. Aunque se sabe que el mantenimiento de la noradrenalina en el
terminal sináptico se debe principalmente al reciclaje de la noradrenalina liberada más que a la
síntesis (ver Eisenhofer et al., 2004), nuestra medida de noradrenalina no permite distinguir entre
ellos. Se sabe que el MPP+ puede actuar sobre la cadena de transporte electrónico, alterando el
equilibrio rédox de la célula y consecuentemente el de las enzimas dependientes de este estado.
Así por ejemplo, la dopamina-β-hidroxilasa (DBH), enzima tipo oxigenasa que requiere oxígeno
molecular y ascorbato como cofactores para catalizar su reacción de dopamina a noradrenalina,
podría verse afectada por la intoxicación con el MPP+. También una acción que aumentara la
actividad de las enzimas que degradan la noradrenalina, como la monoaminaoxidasa B (MAO-B)
o la COMT, podría hacer disminuir los niveles de noradrenalina tras la intoxicación. Además de la
acción sobre las enzimas de síntesis o de degradación, o indirectamente sobre el estado rédox
celular, el MPP+ podría actuar sobre los sistemas de entrada de la noradrenalina a la célula o de
internalización a las vesículas. Así, por ejemplo, Fukumitsu et al. (2006) muestran una reducción
en noradrenalina cardiaca así como una reducción en la densidad de NAT tras intoxicar roedores
con MPTP. También se podría pensar en una entrada de MPP+ al terminal sináptico que
desplazara la de noradrenalina.
En los últimos años, algunos trabajos han sugerido que alteraciones en el transporte
axonal de vesículas sinápticas pueden subyacer a los déficit de diversas enfermedades
neurodegenerativas (Mandelkow y Mandelkow, 2002; Hirokawa y Takemura, 2003). La idea es
que el bloqueo del transporte axonal sería una causa primaria que iniciaría un proceso
degenerativo del axón, distinto al de una apoptosis celular y que, en sus primeras fases causaría
disfunción sináptica (Coleman, 2005). En enfermedades neurodegenerativas no son, de hecho,
raros los hinchamientos axonales con acúmulos anómalos de moléculas cargo y proteínas del
114
Discusión
citoesqueleto, junto con vesículas sinápticas y otros orgánulos. Por ejemplo, ya se ha mostrado
para la enfermedad de Alzheimer que estos hinchamientos se encuentran en las fases más
iniciales de la enfermedad (Stokin et al., 2005). Este tipo de disfunción axonal privaría a las
sinapsis de elementos funcionales y, por tanto, alteraría la fisiología sináptica normal
conduciendo, posteriormente, a una degeneración retrógrada del propio axón, en un proceso que
recibe el nombre de “dying back”, cuyo curso temporal lento encaja con el perfil progresivo de la
mayoría de enfermedades neurodegenerativas (Coleman y Perry, 2002; Raff et al., 2002;
Mandelkow et al., 2003). En el caso de la EP, se puede observar daño axonal y visualización de
neuritas distróficas de Lewy, con acúmulos anormales de α-SYN monomérica o agregada (Duda
et al., 2002). También, en el mutante gad (gracile axonal dystrophy), los axones motores
degeneran progresivamente hasta causar una parálisis completa del animal (Mukoyama et al.,
1989) y esta mutación espontánea consiste en una deleción del gen UCHL1 (Saigoh et al.,
1999), uno de los genes cuyas mutaciones causan EP en humanos. Aunque no existe consenso
en cuanto a la secuencia de eventos que conduce a la disfunción neuronal en la EP, los estudios
de neuroimagen sugieren que la pérdida de terminales sinápticos precede a la pérdida neuronal
en la SN (Bernheimer et al., 1973). En este contexto, podemos reevaluar las acciones del MPTP.
Este tóxico, o su metabolito activo MPP+, ha sido considerado, clásicamente, como un agente
que induce muerte neuronal a través de su acción sobre la mitocondria, lo que conduciría a la
producción de especies reactivas de oxígeno que, directa o indirectamente, causarían apoptosis
dependiente de caspasas (Viswanath et al., 2001; Kaul et al., 2003). En este modelo tóxico
celular se han descrito alteraciones en moléculas relacionadas con el proceso de apoptosis,
como Bcl-2, MAP quinasas o PARP (Choi et al., 1999; Mandir et al., 1999; Hartmann et al., 2000;
Xia et al., 2001) y, más recientemente, la activación de PKCδ por proteolisis mediada por
caspasa 3 (Anantharam et al., 2002; Kaul et al., 2003; Kitazawa et al., 2003). En el contexto de
neuronas en cultivo tratadas con MPP+ éste es, posiblemente, el mecanismo por el cual se
produce la muerte de las neuronas afectadas. Ahora bien, en un individuo adulto, el MPTP puede
causar efectos en la liberación de neurotransmisores sin aparente afectación del número de
neuronas Muy recientemente se ha comprobado que la inyección directa de MPP+ en la sinapsis
gigante del calamar interfiere con el suministro de vesículas de neurotransmisor a los terminales
sinápticos al modificar significativamente el sistema de transporte axonal rápido (Serulle et al.,
2007). La desregulación de la movilidad vesicular produce un incremento en el transporte
retrógrado y un descenso en el movimiento anterógrado, lo que supone una reducción neta de la
disponibilidad vesicular en el terminal sináptico. Curiosamente, los efectos son revertidos cuando
el MPP+ es coinyectado con inhibidores de caspasas o con PKCδ (Morfini et al., 2007). Estos
resultados sugieren que la EP también podría producirse por una desregulación del transporte
vesicular necesario para el mantenimiento del extremo más distal del axón. En este sentido, hay
que recordar que el MPP+/MPTP no produce déficit en adrenalina a nivel de la médula cromafín,
115
Discusión
como hemos observado también en el presente estudio, a pesar de que estas células también
acumulan MPP+ (Reinhard y Daniels, 1992). Quizá, porque en estas células la liberación de
adrenalina no depende de transporte axonal.
Teniendo en cuenta que el MPP+ puede afectar a las vesículas de neurotransmisor y que
la α-SYN parece estar íntimamente asociada a ellas (Lotharius y Brundin, 2002), analizamos la
cantidad de noradrenalina cardiaca tras intoxicación en animales α-syn-/- y animales tg+ para la αSYN humana y sus respectivos controles de genotipo salvaje. Encontramos que ni la falta ni la
sobreexpresión de α-SYN alteran la cantidad de este neurotransmisor en corazón. En contraste,
otros trabajos en los que se analiza la cantidad de dopamina estriatal encuentran una reducción
tanto en los animales α-syn-/- (Abeliovich et al., 2000; Cabin et al., 2002) como en los ratones que
sobreexpresan la forma salvaje de la α-SYN (Masliah et al., 2000; Richfield et al., 2002;
Thiruchelvam et al., 2004). Además, tanto la carencia de la α-SYN como la presencia de la
mutación A30P causan una reducción en el número de vesículas de reserva en el hipocampo
(Murphy et al., 2000; Cabin et al., 2002; Yavich et al., 2006). Por tanto, es posible que estudios
morfológicos y funcionales de liberación de noradrenalina presináptica más detallados en el SNP
pudieran revelar diferencias entre animales de diferente genotipo y, consecuentemente, la
implicación de la α-SYN en estos mecanismos.
En conclusión, a pesar de la abundante expresión de la α-syn en el SNP de roedores y de
las claras afectaciones autonómicas en pacientes con EP esporádico y en aquellos con EP
familiar causado por mutaciones en α-syn, nuestros análisis en ratones mutantes nulos para αsyn o que sobreexpresan la forma humana salvaje no revelan ningún fenotipo aparente. No
puede descartarse, por supuesto, que otros tipos de análisis distintos a los realizados aquí
puedan revelar la implicación de esta molécula en la funcionalidad de las neuronas periféricas.
116
6. CONCLUSIONES
117
Conclusiones
1. La α-SYN se expresa abundantemente en neuronas de los ganglios del sistema nervioso
periférico, tanto de modalidad simpática como sensorial, durante el desarrollo embrionario y
postnatal temprano del ratón. La expresión de α-SYN en estas neuronas no se restringe a las de
tipo catecolaminérgico.
2. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal, durante la embriogénesis, de neuronas
sensoriales primarias, como las del complejo nodoso-petroso. La falta de α-SYN no altera ni la
neurogénesis ni la supervivencia neuronal en este complejo. La falta de α-SYN tampoco afecta el
establecimiento de la morfología de estas neuronas ni el crecimiento neurítico.
3. La α-SYN no es esencial para el desarrollo normal, durante la embriogénesis, de neuronas
autonómicas de tipo simpático, como las del ganglio cervical superior. La falta de α-SYN no altera ni
la neurogénesis ni la supervivencia neuronal en este ganglio. La falta α-SYN tampoco parece
afectar el establecimiento de la morfología de estas neuronas ni el crecimiento neurítico.
4. Aunque las neuronas del sistema nervioso periférico deficientes en α-SYN muestran, in vitro,
curvas de supervivencia dependiente de neurotrofinas con una cinética normal, la actividad de la vía
PLCγ1/PKCδ, pero no la PI3K/Akt, está alterada en las neuronas simpáticas carentes de α-SYN.
5. Las neuronas simpáticas son susceptibles de intoxicación con MPP+, que entra en las neuronas a
través del transportador de noradrenalina y produce muerte apoptótica dependiente de caspasa 3.
La α-SYN no participa en la respuesta in vitro de las neuronas simpáticas a la droga parkinsoniana
MPP+, ya que ni la deficiencia ni la sobreexpresión de α-SYN modifican la supervivencia de las
neuronas expuestas a la droga.
6. El tóxico parkinsoniano MPTP administrado in vivo causa una depleción de los niveles de
noradrenalina cardíaca, pero no causa una disminución de los niveles de adrenalina en la glándula
adrenal, indicando que las neuronas simpáticas noradrenérgicas, pero no las células cromafines,
son susceptibles de intoxicación con el tóxico. La disminución en noradrenalina cardiaca no se
acompaña de una disminución en los niveles de TH aunque sí de una redistribución del enzima en
las fibras. La respuesta al tóxico no se altera ni en ratones deficientes nulos para α-syn ni en
ratones que sobreexpresan la forma salvaje de la α-syn humana.
118
7. BIBLIOGRAFIA
119
Bibliografía
Abeliovich A, Schmitz Y, Farinas I, Choi-Lundberg D, Ho WH, Castillo PE, Shinsky N, Verdugo JM, Armanini
M, Ryan A, Hynes M, Phillips H, Sulzer D, Rosenthal A (2000) Mice lacking alpha-synuclein display
functional deficits in the nigrostriatal dopamine system. Neuron 25: 239-252.
Abou-Sleiman PM, Healy DG, Quinn N, Lees AJ, Wood NW (2003) The role of pathogenic DJ-1 mutations in
Parkinson's disease. Ann Neurol 54: 283-286.
Airaksinen MS, Saarma M (2002) The GDNF family: signalling, biological functions and therapeutic value.
Nat Rev Neurosci 3: 383-394.
Alam M, Schmidt WJ (2002) Rotenone destroys dopaminergic neurons and induces parkinsonian symptoms
in rats. Behav Brain Res 136: 317-324.
Albers KM, Wright DE, Davis BM (1994) Overexpression of nerve growth factor in epidermis of transgenic
mice causes hypertrophy of the peripheral nervous system. J Neurosci 14: 1422-1432.
Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P, Hemmings BA (1996) Mechanism of
activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J 15: 6541-6551.
Alessi DR, James SR, Downes CP, Holmes AB, Gaffney PR, Reese CB, Cohen P (1997) Characterization
of a 3-phosphoinositide-dependent protein kinase which phosphorylates and activates protein kinase
Balpha. Curr Biol 7: 261-269.
Alkadhi KA, Hogan YH (1992) Effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroxypyridine (MPTP) on
ganglionic transmission. J Auton Pharmacol 12: 15-23.
Altman J, Bayer SA (1982) Development of the cranial nerve ganglia and related nuclei in the rat. Adv Anat
Embryol Cell Biol 74: 1-90.
Alves dC, Paitel E, Vincent B, Checler F (2002) Alpha-synuclein lowers p53-dependent apoptotic response
of neuronal cells. Abolishment by 6-hydroxydopamine and implication for Parkinson's disease. J Biol Chem
277: 50980-50984.
Ambrosio S, Blesa R, Mintenig GM, Palacios-Araus L, Mahy N, Gual A (1988) Acute effects of 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) on catecholamines in heart, adrenal gland, retina and caudate
nucleus of the cat. Toxicol Lett 44: 1-6.
Ambrosio S, Mahy N (1989) Acute peripheral catecholaminergic changes in rat after MPTP and MPP+
treatment. Rev Esp Fisiol 45: 157-161.
Amino T, Orimo S, Itoh Y, Takahashi A, Uchihara T, Mizusawa H (2005) Profound cardiac sympathetic
denervation occurs in Parkinson disease. Brain Pathol 15: 29-34.
Anantharam V, Kitazawa M, Wagner J, Kaul S, Kanthasamy AG (2002) Caspase-3-dependent proteolytic
cleavage of protein kinase Cdelta is essential for oxidative stress-mediated dopaminergic cell death after
exposure to methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl. J Neurosci 22: 1738-1751.
Anderson DJ (1999) Lineages and transcription factors in the specification of vertebrate primary sensory
neurons. Curr Opin Neurobiol 9: 517-524.
Anderson DJ, Groves A, Lo L, Ma Q, Rao M, Shah NM, Sommer L (1997) Cell lineage determination and
the control of neuronal identity in the neural crest. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 62: 493-504.
Andrew R, Watson DG, Best SA, Midgley JM, Wenlong H, Petty RK (1993) The determination of
hydroxydopamines and other trace amines in the urine of parkinsonian patients and normal controls.
Neurochem Res 18: 1175-1177.
Angeletti PU, Levi-Montalcini R (1970) Sympathetic nerve cell destruction in newborn mammals by 6hydroxydopamine. Proc Natl Acad Sci U S A 65: 114-121.
120
Bibliografía
Angeletti PU, Levi-Montalcini R (1971) Growth regulation of the sympathetic nervous system:
immunosympathectomy and chemical sympathectomy. Rev Eur Etud Clin Biol 16: 866-874.
Arai K, Kato N, Kashiwado K, Hattori T (2000) Pure autonomic failure in association with human alphasynucleinopathy. Neurosci Lett 296: 171-173.
Arevalo JC, Wu SH (2006) Neurotrophin signaling: many exciting surprises! Cell Mol Life Sci.
Auluck PK, Chan HY, Trojanowski JQ, Lee VM, Bonini NM (2002) Chaperone suppression of alphasynuclein toxicity in a Drosophila model for Parkinson's disease. Science 295: 865-868.
Axelrod J, HERTTING G, PATRICK RW (1961) Inhibition of H3-norepinephrine release by monoamine
oxidase inhibitors. J Pharmacol Exp Ther 134: 325-328.
Baltic S, Perovic M, Mladenovic A, Raicevic N, Ruzdijic S, Rakic L, Kanazir S (2004) Alpha-synuclein is
expressed in different tissues during human fetal development. J Mol Neurosci 22: 199-204.
Baluk P (1995) Structure of autonomic ganglia. In: Autonomic ganglia (McLachlan E, ed), pp 13-71.
Bandopadhyay R, Kingsbury AE, Cookson MR, Reid AR, Evans IM, Hope AD, Pittman AM, Lashley T,
Canet-Aviles R, Miller DW, McLendon C, Strand C, Leonard AJ, Abou-Sleiman PM, Healy DG, Ariga H,
Wood NW, de Silva R, Revesz T, Hardy JA, Lees AJ (2004) The expression of DJ-1 (PARK7) in normal
human CNS and idiopathic Parkinson's disease. Brain 127: 420-430.
Banister R, Mathias CJ (1999) Clinical features and evaluation of the primary chronic autonomic failure
syndromes. In: Autonomic failure: A Textbook of Clinical Disorders of the Autonomic Nervous System pp
307-316. 4th ed. Oxford University Press, New York.
Barbacid M (1994) The Trk family of neurotrophin receptors. J Neurobiol 25: 1386-1403.
Barbeau A, Dallaire L, Buu NT, Poirier J, Rucinska E (1985) Comparative behavioral, biochemical and
pigmentary effects of MPTP, MPP+ and paraquat in Rana pipiens. Life Sci 37: 1529-1538.
Bates G (2003) Huntingtin aggregation and toxicity in Huntington's disease. Lancet 361: 1642-1644.
Battaini F (2001) Protein kinase C isoforms as therapeutic targets in nervous system disease states.
Pharmacol Res 44: 353-361.
Benarroch EE (1997) Overview of the organization of the central autonomic network. In: Central autonomic
network: Functional Organization and Clinical Correlations pp 3-28. Futura Publishing Company, Inc.,
Armonk, NY.
Bernheimer H, Birkmayer W, Hornykiewicz O, Jellinger K, Seitelberger F (1973) Brain dopamine and the
syndromes of Parkinson and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. J Neurol
Sci 20: 415-455.
Betarbet R, Sherer TB, Greenamyre JT (2002) Animal models of Parkinson's disease. Bioessays 24: 308318.
Betarbet R, Sherer TB, MacKenzie G, Garcia-Osuna M, Panov AV, Greenamyre JT (2000) Chronic systemic
pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease. Nat Neurosci 3: 1301-1306.
Bhave SV, Johannessen JN, Lash LH, Wakade TD, Wakade AR (1996) Age-dependent sensitivity of
cultured peripheral sympathetic neurons to 1-methyl-4-phenylpyridinium: role of glutathione. J Neurochem
67: 557-565.
Bibel M, Barde YA (2000) Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous
system. Genes Dev 14: 2919-2937.
121
Bibliografía
Bilen J, Bonini NM (2005) Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet
39: 153-171.
Birren SJ, Lo L, Anderson DJ (1993) Sympathetic neuroblasts undergo a developmental switch in trophic
dependence. Development 119: 597-610.
Bohlen und HO (2004) Synucleins and their relationship to Parkinson's disease. Cell Tissue Res 318: 163174.
Bonifati V, Rizzu P, Squitieri F, Krieger E, Vanacore N, van Swieten JC, Brice A, van Duijn CM, Oostra B,
Meco G, Heutink P (2003) DJ-1( PARK7), a novel gene for autosomal recessive, early onset parkinsonism.
Neurol Sci 24: 159-160.
Borchardt RT, Reid JR, Thakker DR (1976) Catechol O-methyltransferase. 9. Mechanism of inactivation by
6-hydroxydopamine. J Med Chem 19: 1201-1209.
Bothwell M (1995) Functional interactions of neurotrophins and neurotrophin receptors. Annu Rev Neurosci
18: 223-253.
Braak H, Ghebremedhin E, Rub U, Bratzke H, Del Tredici K (2004) Stages in the development of
Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res 318: 121-134.
Brady R, Zaidi SI, Mayer C, Katz DM (1999) BDNF is a target-derived survival factor for arterial baroreceptor
and chemoafferent primary sensory neurons. J Neurosci 19: 2131-2142.
Brennan C, Rivas-Plata K, Landis SC (1999) The p75 neurotrophin receptor influences NT-3
responsiveness of sympathetic neurons in vivo. Nat Neurosci 2: 699-705.
Brodie C, Blumberg PM (2003) Regulation of cell apoptosis by protein kinase c delta. Apoptosis 8: 19-27.
Brodie C, Steinhart R, Kazimirsky G, Rubinfeld H, Hyman T, Ayres JN, Hur GM, Toth A, Yang D, Garfield
SH, Stone JC, Blumberg PM (2004) PKCdelta associates with and is involved in the phosphorylation of
RasGRP3 in response to phorbol esters. Mol Pharmacol 66: 76-84.
Brooks AI, Chadwick CA, Gelbard HA, Cory-Slechta DA, Federoff HJ (1999) Paraquat elicited
neurobehavioral syndrome caused by dopaminergic neuron loss. Brain Res 823: 1-10.
Brunet A, Bonni A, Zigmond MJ, Lin MZ, Juo P, Hu LS, Anderson MJ, Arden KC, Blenis J, Greenberg ME
(1999) Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell 96:
857-868.
Buchman VL, Adu J, Pinon LG, Ninkina NN, Davies AM (1998) Persyn, a member of the synuclein family,
influences neurofilament network integrity. Nat Neurosci 1: 101-103.
Cabin DE, Shimazu K, Murphy D, Cole NB, Gottschalk W, McIlwain KL, Orrison B, Chen A, Ellis CE, Paylor
R, Lu B, Nussbaum RL (2002) Synaptic vesicle depletion correlates with attenuated synaptic responses to
prolonged repetitive stimulation in mice lacking alpha-synuclein. J Neurosci 22: 8797-8807.
Canet-Aviles RM, Wilson MA, Miller DW, Ahmad R, McLendon C, Bandyopadhyay S, Baptista MJ, Ringe D,
Petsko GA, Cookson MR (2004) The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteinesulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 9103-9108.
Causing CG, Gloster A, Aloyz R, Bamji SX, Chang E, Fawcett J, Kuchel G, Miller FD (1997) Synaptic
innervation density is regulated by neuron-derived BDNF. Neuron 18: 257-267.
Chandra S, Chen X, Rizo J, Jahn R, Sudhof TC (2003) A broken alpha -helix in folded alpha -Synuclein. J
Biol Chem 278: 15313-15318.
122
Bibliografía
Chandra S, Fornai F, Kwon HB, Yazdani U, Atasoy D, Liu X, Hammer RE, Battaglia G, German DC, Castillo
PE, Sudhof TC (2004) Double-knockout mice for alpha- and beta-synucleins: effect on synaptic functions.
Proc Natl Acad Sci U S A 101: 14966-14971.
Chartier-Harlin MC, Kachergus J, Roumier C, Mouroux V, Douay X, Lincoln S, Levecque C, Larvor L,
Andrieux J, Hulihan M, Waucquier N, Defebvre L, Amouyel P, Farrer M, Destee A (2004) Alpha-synuclein
locus duplication as a cause of familial Parkinson's disease. Lancet 364: 1167-1169.
Chaudhuri KR, Healy DG, Schapira AH (2006) Non-motor symptoms of Parkinson's disease: diagnosis and
management. Lancet Neurol 5: 235-245.
Chen X, de Silva HA, Pettenati MJ, Rao PN, George-Hyslop P, Roses AD, Xia Y, Horsburgh K, Ueda K,
Saitoh T (1995) The human NACP/alpha-synuclein gene: chromosome assignment to 4q21.3-q22 and TaqI
RFLP analysis. Genomics 26: 425-427.
Chiba K, Trevor A, Castagnoli N, Jr. (1984) Metabolism of the neurotoxic tertiary amine, MPTP, by brain
monoamine oxidase. Biochem Biophys Res Commun 120: 574-578.
Chiba-Falek O, Touchman JW, Nussbaum RL (2003) Functional analysis of intra-allelic variation at NACPRep1 in the alpha-synuclein gene. Hum Genet 113: 426-431.
Choi J, Levey AI, Weintraub ST, Rees HD, Gearing M, Chin LS, Li L (2004) Oxidative modifications and
down-regulation of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1 associated with idiopathic Parkinson's and
Alzheimer's diseases. J Biol Chem 279: 13256-13264.
Choi WS, Canzoniero LM, Sensi SL, O'Malley KL, Gwag BJ, Sohn S, Kim JE, Oh TH, Lee EB, Oh YJ (1999)
Characterization of MPP(+)-induced cell death in a dopaminergic neuronal cell line: role of macromolecule
synthesis, cytosolic calcium, caspase, and Bcl-2-related proteins. Exp Neurol 159: 274-282.
Chun LL, Patterson PH (1977) Role of nerve growth factor in the development of rat sympathetic neurons in
vitro. I. Survival, growth, and differentiation of catecholamine production. J Cell Biol 75: 694-704.
Clark DW, Laverty R, Phelan EL (1972) Long-lasting peripheral and central effects of 6-hydroxydopamine in
rats. Br J Pharmacol 44: 233-243.
Clayton DF, George JM (1998) The synucleins: a family of proteins involved in synaptic function, plasticity,
neurodegeneration and disease. Trends Neurosci 21: 249-254.
Cleeter MW, Cooper JM, Schapira AH (1992) Irreversible inhibition of mitochondrial complex I by 1-methyl4-phenylpyridinium: evidence for free radical involvement. J Neurochem 58: 786-789.
Cohen G (1984) Oxy-radical toxicity in catecholamine neurons. Neurotoxicology 5: 77-82.
Coleman M (2005) Axon degeneration mechanisms: commonality amid diversity. Nat Rev Neurosci 6: 889898.
Coleman MP, Perry VH (2002) Axon pathology in neurological disease: a neglected therapeutic target.
Trends Neurosci 25: 532-537.
Conover JC, Erickson JT, Katz DM, Bianchi LM, Poueymirou WT, McClain J, Pan L, Helgren M, Ip NY,
Boland P, . (1995) Neuronal deficits, not involving motor neurons, in mice lacking BDNF and/or NT4. Nature
375: 235-238.
Conway KA, Lee SJ, Rochet JC, Ding TT, Williamson RE, Lansbury PT, Jr. (2000) Acceleration of
oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset
Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 571-576.
Cookson MR (2005) The biochemistry of Parkinson's disease. Annu Rev Biochem 74: 29-52.
123
Bibliografía
Cooper AA, Gitler AD, Cashikar A, Haynes CM, Hill KJ, Bhullar B, Liu K, Xu K, Strathearn KE, Liu F, Cao S,
Caldwell KA, Caldwell GA, Marsischky G, Kolodner RD, Labaer J, Rochet JC, Bonini NM, Lindquist S (2006)
{alpha}-Synuclein Blocks ER-Golgi Traffic and Rab1 Rescues Neuron Loss in Parkinson's Models. Science.
Corbit KC, Foster DA, Rosner MR (1999) Protein kinase Cdelta mediates neurogenic but not mitogenic
activation of mitogen-activated protein kinase in neuronal cells. Mol Cell Biol 19: 4209-4218.
Coulom H, Birman S (2004) Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in
Drosophila melanogaster. J Neurosci 24: 10993-10998.
Courbon F, Brefel-Courbon C, Thalamas C, Alibelli MJ, Berry I, Montastruc JL, Rascol O, Senard JM (2003)
Cardiac MIBG scintigraphy is a sensitive tool for detecting cardiac sympathetic denervation in Parkinson's
disease. Mov Disord 18: 890-897.
Crowder RJ, Freeman RS (2000) Glycogen synthase kinase-3 beta activity is critical for neuronal death
caused by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase or Akt but not for death caused by nerve growth factor
withdrawal. J Biol Chem 275: 34266-34271.
Crowley C, Spencer SD, Nishimura MC, Chen KS, Pitts-Meek S, Armanini MP, Ling LH, McMahon SB,
Shelton DL, Levinson AD, . (1994) Mice lacking nerve growth factor display perinatal loss of sensory and
sympathetic neurons yet develop basal forebrain cholinergic neurons. Cell 76: 1001-1011.
da Costa CA, Ancolio K, Checler F (2000) Wild-type but not Parkinson's disease-related ala-53 --> Thr
mutant alpha -synuclein protects neuronal cells from apoptotic stimuli. J Biol Chem 275: 24065-24069.
Dahlqvist A, Forsgren S (1992) Expression of catecholamine-synthesizing enzymes in paraganglionic and
ganglionic cells in the laryngeal nerves of the rat. J Neurocytol 21: 1-6.
Darios F, Corti O, Lucking CB, Hampe C, Muriel MP, Abbas N, Gu WJ, Hirsch EC, Rooney T, Ruberg M,
Brice A (2003) Parkin prevents mitochondrial swelling and cytochrome c release in mitochondria-dependent
cell death. Hum Mol Genet 12: 517-526.
Datta SR, Katsov A, Hu L, Petros A, Fesik SW, Yaffe MB, Greenberg ME (2000) 14-3-3 proteins and
survival kinases cooperate to inactivate BAD by BH3 domain phosphorylation. Mol Cell 6: 41-51.
Dauer W, Kholodilov N, Vila M, Trillat AC, Goodchild R, Larsen KE, Staal R, Tieu K, Schmitz Y, Yuan CA,
Rocha M, Jackson-Lewis V, Hersch S, Sulzer D, Przedborski S, Burke R, Hen R (2002) Resistance of alpha
-synuclein null mice to the parkinsonian neurotoxin MPTP. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 14524-14529.
Davies AM, Lee KF, Jaenisch R (1993) p75-deficient trigeminal sensory neurons have an altered response
to NGF but not to other neurotrophins. Neuron 11: 565-574.
Davies AM, Lumsden A (1990) Ontogeny of the somatosensory system: origins and early development of
primary sensory neurons. Annu Rev Neurosci 13: 61-73.
de Champlain J (1971) Degeneration and regrowth of adrenergic nerve fibers in the rat peripheral tissues
after 6-hydroxydopamine. Can J Physiol Pharmacol 49: 345-355.
de Lau LM, Breteler MM (2006) Epidemiology of Parkinson's disease. Lancet Neurol 5: 525-535.
Dechant G, Barde YA (2002) The neurotrophin receptor p75(NTR): novel functions and implications for
diseases of the nervous system. Nat Neurosci 5: 1131-1136.
Dechant G, Rodriguez-Tebar A, Kolbeck R, Barde YA (1993) Specific high-affinity receptors for
neurotrophin-3 on sympathetic neurons. J Neurosci 13: 2610-2616.
del Tredici K, Rub U, de Vos RA, Bohl JR, Braak H (2002) Where does parkinson disease pathology begin
in the brain? J Neuropathol Exp Neurol 61: 413-426.
124
Bibliografía
Dempsey EC, Newton AC, Mochly-Rosen D, Fields AP, Reyland ME, Insel PA, Messing RO (2000) Protein
kinase C isozymes and the regulation of diverse cell responses. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 279:
L429-L438.
Di Monte DA (2003) The environment and Parkinson's disease: is the nigrostriatal system preferentially
targeted by neurotoxins? Lancet Neurol 2: 531-538.
DiCicco-Bloom E, Black IB (1988) Insulin growth factors regulate the mitotic cycle in cultured rat sympathetic
neuroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A 85: 4066-4070.
DiCicco-Bloom E, Friedman WJ, Black IB (1993) NT-3 stimulates sympathetic neuroblast proliferation by
promoting precursor survival. Neuron 11: 1101-1111.
Dong Z, Brennan A, Liu N, Yarden Y, Lefkowitz G, Mirsky R, Jessen KR (1995) Neu differentiation factor is a
neuron-glia signal and regulates survival, proliferation, and maturation of rat Schwann cell precursors.
Neuron 15: 585-596.
Dong Z, Ferger B, Feldon J, Bueler H (2002) Overexpression of Parkinson's disease-associated alphasynucleinA53T by recombinant adeno-associated virus in mice does not increase the vulnerability of
dopaminergic neurons to MPTP. J Neurobiol 53: 1-10.
Doran JF, Jackson P, Kynoch PA, Thompson RJ (1983) Isolation of PGP 9.5, a new human neuronespecific protein detected by high-resolution two-dimensional electrophoresis. J Neurochem 40: 1542-1547.
Doupe AJ, Landis SC, Patterson PH (1985) Environmental influences in the development of neural crest
derivatives: glucocorticoids, growth factors, and chromaffin cell plasticity. J Neurosci 5: 2119-2142.
Dowell RT (1976) Myocardial contractile function and myofibrillar adenosine triphosphatase activity in
chemically sympathectomized rats. Circ Res 39: 683-689.
Drolet RE, Behrouz B, Lookingland KJ, Goudreau JL (2004) Mice lacking alpha-synuclein have an
attenuated loss of striatal dopamine following prolonged chronic MPTP administration. Neurotoxicology 25:
761-769.
Duda JE, Giasson BI, Mabon ME, Lee VM, Trojanowski JQ (2002) Novel antibodies to synuclein show
abundant striatal pathology in Lewy body diseases. Ann Neurol 52: 205-210.
Duffy PE, Tennyson VM (1965) Microscopic observations of Lewy bodies and melanin granules in
substantia nigra and locus ceruleus in Parkinson's disease. J Neuropathol Exp Neurol 24: 398-414.
Dunnett SB, Bjorklund A (1999) Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's
disease. Nature 399: A32-A39.
Edgar D, Timpl R, Thoenen H (1984) The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on
neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J 3: 1463-1468.
Egea J, Espinet C, Soler RM, Dolcet X, Yuste VJ, Encinas M, Iglesias M, Rocamora N, Comella JX (2001)
Neuronal survival induced by neurotrophins requires calmodulin. J Cell Biol 154: 585-597.
Eisenhofer G, Kopin IJ, Goldstein DS (2004) Catecholamine metabolism: a contemporary view with
implications for physiology and medicine. Pharmacol Rev 56: 331-349.
El Agnaf OM, Jakes R, Curran MD, Middleton D, Ingenito R, Bianchi E, Pessi A, Neill D, Wallace A (1998)
Aggregates from mutant and wild-type alpha-synuclein proteins and NAC peptide induce apoptotic cell death
in human neuroblastoma cells by formation of beta-sheet and amyloid-like filaments. FEBS Lett 440: 71-75.
Emoto Y, Kisaki H, Manome Y, Kharbanda S, Kufe D (1996) Activation of protein kinase Cdelta in human
myeloid leukemia cells treated with 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine. Blood 87: 1990-1996.
125
Bibliografía
Emoto Y, Manome Y, Meinhardt G, Kisaki H, Kharbanda S, Robertson M, Ghayur T, Wong WW, Kamen R,
Weichselbaum R, . (1995) Proteolytic activation of protein kinase C delta by an ICE-like protease in
apoptotic cells. EMBO J 14: 6148-6156.
English J, Pearson G, Wilsbacher J, Swantek J, Karandikar M, Xu S, Cobb MH (1999) New insights into the
control of MAP kinase pathways. Exp Cell Res 253: 255-270.
Erickson JT, Brosenitsch TA, Katz DM (2001) Brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived
neurotrophic factor are required simultaneously for survival of dopaminergic primary sensory neurons in
vivo. J Neurosci 21: 581-589.
Erickson JT, Conover JC, Borday V, Champagnat J, Barbacid M, Yancopoulos G, Katz DM (1996) Mice
lacking brain-derived neurotrophic factor exhibit visceral sensory neuron losses distinct from mice lacking
NT4 and display a severe developmental deficit in control of breathing. J Neurosci 16: 5361-5371.
Ernfors P, Lee KF, Jaenisch R (1994) Mice lacking brain-derived neurotrophic factor develop with sensory
deficits. Nature 368: 147-150.
Ernfors P, Lee KF, Kucera J, Jaenisch R (1994) Lack of neurotrophin-3 leads to deficiencies in the
peripheral nervous system and loss of limb proprioceptive afferents. Cell 77: 503-512.
Fagan AM, Zhang H, Landis S, Smeyne RJ, Silos-Santiago I, Barbacid M (1996) TrkA, but not TrkC,
receptors are essential for survival of sympathetic neurons in vivo. J Neurosci 16: 6208-6218.
Farinas I, Cano-Jaimez M, Bellmunt E, Soriano M (2002) Regulation of neurogenesis by neurotrophins in
developing spinal sensory ganglia. Brain Res Bull 57: 809-816.
Farinas I, Jones KR, Backus C, Wang XY, Reichardt LF (1994) Severe sensory and sympathetic deficits in
mice lacking neurotrophin-3. Nature 369: 658-661.
Farinas I, Yoshida CK, Backus C, Reichardt LF (1996) Lack of neurotrophin-3 results in death of spinal
sensory neurons and premature differentiation of their precursors. Neuron 17: 1065-1078.
Farrer M, Kachergus J, Forno L, Lincoln S, Wang DS, Hulihan M, Maraganore D, Gwinn-Hardy K, Wszolek
Z, Dickson D, Langston JW (2004) Comparison of kindreds with parkinsonism and alpha-synuclein genomic
multiplications. Ann Neurol 55: 174-179.
Farrer M, Maraganore DM, Lockhart P, Singleton A, Lesnick TG, de Andrade M, West A, de Silva R, Hardy
J, Hernandez D (2001) alpha-Synuclein gene haplotypes are associated with Parkinson's disease. Hum Mol
Genet 10: 1847-1851.
Feany MB, Bender WW (2000) A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature 404: 394-398.
Finch L, Haeusler G, Thoenen H (1973) A comparison of the effects of chemical sympathectomy by 6hydroxydopamine in newborn and adult rats. Br J Pharmacol 47: 249-260.
Fleming SM, Fernagut PO, Chesselet MF (2005) Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and
limitations. NeuroRx 2: 495-503.
Forno LS (1986) Lewy bodies. N Engl J Med 314: 122.
Forno LS, Langston JW, DeLanney LE, Irwin I, Ricaurte GA (1986) Locus ceruleus lesions and eosinophilic
inclusions in MPTP-treated monkeys. Ann Neurol 20: 449-455.
Francis N, Farinas I, Brennan C, Rivas-Plata K, Backus C, Reichardt L, Landis S (1999) NT-3, like NGF, is
required for survival of sympathetic neurons, but not their precursors. Dev Biol 210: 411-427.
126
Bibliografía
Frech M, Andjelkovic M, Ingley E, Reddy KK, Falck JR, Hemmings BA (1997) High affinity binding of inositol
phosphates and phosphoinositides to the pleckstrin homology domain of RAC/protein kinase B and their
influence on kinase activity. J Biol Chem 272: 8474-8481.
Fukumitsu N, Suzuki M, Fukuda T, Kiyono Y, Kajiyama S, Saji H (2006) Reduced 125I-metaiodobenzylguanidine uptake and norepinephrine transporter density in the hearts of mice with MPTPinduced parkinsonism. Nucl Med Biol 33: 37-42.
Fukumoto S, Nishizawa Y, Hosoi M, Koyama H, Yamakawa K, Ohno S, Morii H (1997) Protein kinase C
delta inhibits the proliferation of vascular smooth muscle cells by suppressing G1 cyclin expression. J Biol
Chem 272: 13816-13822.
Fuller RW, Hemrick-Luecke SK, Kindt MV, Heikkila RE (1988) Different effects of monoamine oxidase
inhibition on MPTP depletion of heart and brain catecholamines in mice. Life Sci 42: 263-271.
Fuller RW, Hemrick-Luecke SK, Perry KW (1989) Tissue concentrations of MPTP and MPP+ in relation to
catecholamine depletion after the oral or subcutaneous administration of MPTP to mice. Life Sci 45: 20772083.
Gabella G (1995) Autonomic nervous system. In: The Rat Nervous System (Paxinos G, ed), pp 81-103. San
Diego.
Gandhi S, Wood NW (2005) Molecular pathogenesis of Parkinson's disease. Hum Mol Genet 14: 27492755.
George JM, Jin H, Woods WS, Clayton DF (1995) Characterization of a novel protein regulated during the
critical period for song learning in the zebra finch. Neuron 15: 361-372.
Gerfen CR (2006) Indirect-pathway neurons lose their spines in Parkinson disease. Nat Neurosci 9: 157158.
German DC, Nelson EL, Liang CL, Speciale SG, Sinton CM, Sonsalla PK (1996) The neurotoxin MPTP
causes degeneration of specific nucleus A8, A9 and A10 dopaminergic neurons in the mouse.
Neurodegeneration 5: 299-312.
Ghayur T, Hugunin M, Talanian RV, Ratnofsky S, Quinlan C, Emoto Y, Pandey P, Datta R, Huang Y,
Kharbanda S, Allen H, Kamen R, Wong W, Kufe D (1996) Proteolytic activation of protein kinase C delta by
an ICE/CED 3-like protease induces characteristics of apoptosis. J Exp Med 184: 2399-2404.
Giasson BI, Duda JE, Murray IV, Chen Q, Souza JM, Hurtig HI, Ischiropoulos H, Trojanowski JQ, Lee VM
(2000) Oxidative damage linked to neurodegeneration by selective alpha-synuclein nitration in
synucleinopathy lesions. Science 290: 985-989.
Giasson BI, Duda JE, Quinn SM, Zhang B, Trojanowski JQ, Lee VM (2002) Neuronal alpha-synucleinopathy
with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron 34: 521-533.
Giasson BI, Forman MS, Higuchi M, Golbe LI, Graves CL, Kotzbauer PT, Trojanowski JQ, Lee VM (2003)
Initiation and synergistic fibrillization of tau and alpha-synuclein. Science 300: 636-640.
Giasson BI, Murray IV, Trojanowski JQ, Lee VM (2001) A hydrophobic stretch of 12 amino acid residues in
the middle of alpha-synuclein is essential for filament assembly. J Biol Chem 276: 2380-2386.
Giasson BI, Uryu K, Trojanowski JQ, Lee VM (1999) Mutant and wild type human alpha-synucleins
assemble into elongated filaments with distinct morphologies in vitro. J Biol Chem 274: 7619-7622.
Gibb WR, Lees AJ (1988) The relevance of the Lewy body to the pathogenesis of idiopathic Parkinson's
disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 51: 745-752.
127
Bibliografía
Gispert S, Del Turco D, Garrett L, Chen A, Bernard DJ, Hamm-Clement J, Korf HW, Deller T, Braak H,
Auburger G, Nussbaum RL (2003) Transgenic mice expressing mutant A53T human alpha-synuclein show
neuronal dysfunction in the absence of aggregate formation. Mol Cell Neurosci 24: 419-429.
Goetz CG, Lutge W, Tanner CM (1986) Autonomic dysfunction in Parkinson's disease. Neurology 36: 73-75.
Goldberg M, Steinberg SF (1996) Tissue-specific developmental regulation of protein kinase C isoforms.
Biochem Pharmacol 51: 1089-1093.
Goldberg MS, Fleming SM, Palacino JJ, Cepeda C, Lam HA, Bhatnagar A, Meloni EG, Wu N, Ackerson LC,
Klapstein GJ, Gajendiran M, Roth BL, Chesselet MF, Maidment NT, Levine MS, Shen J (2003) Parkindeficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. J Biol Chem 278: 4362843635.
Goldberg MS, Pisani A, Haburcak M, Vortherms TA, Kitada T, Costa C, Tong Y, Martella G, Tscherter A,
Martins A, Bernardi G, Roth BL, Pothos EN, Calabresi P, Shen J (2005) Nigrostriatal dopaminergic deficits
and hypokinesia caused by inactivation of the familial Parkinsonism-linked gene DJ-1. Neuron 45: 489-496.
Goldstein DS (2003) Dysautonomia in Parkinson's disease: neurocardiological abnormalities. Lancet Neurol
2: 669-676.
Goldstein DS (2004) Functional neuroimaging of sympathetic innervation of the heart. Ann N Y Acad Sci
1018: 231-243.
Goldstein DS, Li ST, Holmes C, Bankiewicz K (2003) Sympathetic innervation in the 1-methyl-4-phenyl1,2,3,6-tetrahydropyridine primate model of Parkinson's disease. J Pharmacol Exp Ther 306: 855-860.
Goldstein DS, Li ST, Kopin IJ (2001) Sympathetic neurocirculatory failure in Parkinson disease: Evidence for
an etiologic role of alpha-synuclein. Ann Intern Med 135: 1010-1011.
Goldstein DS, Robertson D, Esler M, Straus SE, Eisenhofer G (2002) Dysautonomias: clinical disorders of
the autonomic nervous system. Ann Intern Med 137: 753-763.
Gomez-Isla T, Irizarry MC, Mariash A, Cheung B, Soto O, Schrump S, Sondel J, Kotilinek L, Day J,
Schwarzschild MA, Cha JH, Newell K, Miller DW, Ueda K, Young AB, Hyman BT, Ashe KH (2003) Motor
dysfunction and gliosis with preserved dopaminergic markers in human alpha-synuclein A30P transgenic
mice. Neurobiol Aging 24: 245-258.
Gómez-Santos C, Ferrer I, Reiriz J, Vinals F, Barrachina M, Ambrosio S (2002) MPP+ increases alphasynuclein expression and ERK/MAP-kinase phosphorylation in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Brain
Res 935: 32-39.
Gómez-Santos C, Ferrer I, Santidrian AF, Barrachina M, Gil J, Ambrosio S (2003) Dopamine induces
autophagic cell death and alpha-synuclein increase in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. J Neurosci
Res 73: 341-350.
Greenamyre JT, Sherer TB, Betarbet R, Panov AV (2001) Complex I and Parkinson's disease. IUBMB Life
52: 135-141.
Grewal SS, York RD, Stork PJ (1999) Extracellular-signal-regulated kinase signalling in neurons. Curr Opin
Neurobiol 9: 544-553.
Gschwendt M (1999) Protein kinase C delta. Eur J Biochem 259: 555-564.
Guillemot F, Lo LC, Johnson JE, Auerbach A, Anderson DJ, Joyner AL (1993) Mammalian achaete-scute
homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell 75: 463-476.
Hague K, Lento P, Morgello S, Caro S, Kaufmann H (1997) The distribution of Lewy bodies in pure
autonomic failure: autopsy findings and review of the literature. Acta Neuropathol (Berl) 94: 192-196.
128
Bibliografía
Hague S, Rogaeva E, Hernandez D, Gulick C, Singleton A, Hanson M, Johnson J, Weiser R, Gallardo M,
Ravina B, Gwinn-Hardy K, Crawley A, George-Hyslop PH, Lang AE, Heutink P, Bonifati V, Hardy J,
Singleton A (2003) Early-onset Parkinson's disease caused by a compound heterozygous DJ-1 mutation.
Ann Neurol 54: 271-274.
Hall AK, Landis SC (1991) Principal neurons and small intensely fluorescent (SIF) cells in the rat superior
cervical ganglion have distinct developmental histories. J Neurosci 11: 472-484.
Hall AK, Landis SC (1992) Division and migration of satellite glia in the embryonic rat superior cervical
ganglion. J Neurocytol 21: 635-647.
Han JM, Kim JH, Lee BD, Lee SD, Kim Y, Jung YW, Lee S, Cho W, Ohba M, Kuroki T, Suh PG, Ryu SH
(2002) Phosphorylation-dependent regulation of phospholipase D2 by protein kinase C delta in rat
Pheochromocytoma PC12 cells. J Biol Chem 277: 8290-8297.
Hardy J, Gwinn-Hardy K (1998) Genetic classification of primary neurodegenerative disease. Science 282:
1075-1079.
Hartmann A, Hirsch EC (2001) Parkinson's disease. The apoptosis hypothesis revisited. Adv Neurol 86:
143-153.
Hartmann A, Hunot S, Michel PP, Muriel MP, Vyas S, Faucheux BA, Mouatt-Prigent A, Turmel H, Srinivasan
A, Ruberg M, Evan GI, Agid Y, Hirsch EC (2000) Caspase-3: A vulnerability factor and final effector in
apoptotic death of dopaminergic neurons in Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 2875-2880.
Hartog Jager WA, Bethlem J (1960) The distribution of Lewy bodies in the central and autonomic nervous
systems in idiopathic paralysis agitans. J Neurol Neurosurg Psychiatry 23: 283-290.
Hashimoto M, Hsu LJ, Rockenstein E, Takenouchi T, Mallory M, Masliah E (2002) alpha-Synuclein protects
against oxidative stress via inactivation of the c-Jun N-terminal kinase stress-signaling pathway in neuronal
cells. J Biol Chem 277: 11465-11472.
Hashimoto M, Takenouchi T, Rockenstein E, Masliah E (2003) Alpha-synuclein up-regulates expression of
caveolin-1 and down-regulates extracellular signal-regulated kinase activity in B103 neuroblastoma cells:
role in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurochem 85: 1468-1479.
Hatano Y, Li Y, Sato K, Asakawa S, Yamamura Y, Tomiyama H, Yoshino H, Asahina M, Kobayashi S,
Hassin-Baer S, Lu CS, Ng AR, Rosales RL, Shimizu N, Toda T, Mizuno Y, Hattori N (2004) Novel PINK1
mutations in early-onset parkinsonism. Ann Neurol 56: 424-427.
Haywood AF, Staveley BE (2004) Parkin counteracts symptoms in a Drosophila model of Parkinson's
disease. BMC Neurosci 5: 14.
Healy DG, Abou-Sleiman PM, Casas JP, Ahmadi KR, Lynch T, Gandhi S, Muqit MM, Foltynie T, Barker R,
Bhatia KP, Quinn NP, Lees AJ, Gibson JM, Holton JL, Revesz T, Goldstein DB, Wood NW (2006) UCHL-1
is not a Parkinson's disease susceptibility gene. Ann Neurol 59: 627-633.
Hedrich K, Marder K, Harris J, Kann M, Lynch T, Meija-Santana H, Pramstaller PP, Schwinger E, Bressman
SB, Fahn S, Klein C (2002) Evaluation of 50 probands with early-onset Parkinson's disease for Parkin
mutations. Neurology 58: 1239-1246.
Heikkila RE, Mytilineou C, Cote L, Cohen G (1973) Evidence for degeneration of sympathetic nerve
terminals caused by the ortho- and para-quinones of 6-hydroxydopamine. J Neurochem 20: 1345-1350.
Hetman M, Cavanaugh JE, Kimelman D, Xia Z (2000) Role of glycogen synthase kinase-3beta in neuronal
apoptosis induced by trophic withdrawal. J Neurosci 20: 2567-2574.
129
Bibliografía
Hilker R, Klein C, Hedrich K, Ozelius LJ, Vieregge P, Herholz K, Pramstaller PP, Heiss WD (2002) The
striatal dopaminergic deficit is dependent on the number of mutant alleles in a family with mutations in the
parkin gene: evidence for enzymatic parkin function in humans. Neurosci Lett 323: 50-54.
Hiltunen, J. Neurotrophic factors in rodent heart: from development to pathophysiology. 2001. University of
Helsinki; Institute of Biotechnology and Departament of Biosciences, Division of Animal Phisiology, Faculty
of Science.
Ref Type: Thesis/Dissertation
Hippenmeyer S, Kramer I, Arber S (2004) Control of neuronal phenotype: what targets tell the cell bodies.
Trends Neurosci 27: 482-488.
Hirokawa N, Takemura R (2003) Biochemical and molecular characterization of diseases linked to motor
proteins. Trends Biochem Sci 28: 558-565.
Hirsch EC, Hoglinger G, Rousselet E, Breidert T, Parain K, Feger J, Ruberg M, Prigent A, Cohen-Salmon C,
Launay JM (2003) Animal models of Parkinson's disease in rodents induced by toxins: an update. J Neural
Transm Suppl 89-100.
Hoglinger GU, Feger J, Prigent A, Michel PP, Parain K, Champy P, Ruberg M, Oertel WH, Hirsch EC (2003)
Chronic systemic complex I inhibition induces a hypokinetic multisystem degeneration in rats. J Neurochem
84: 491-502.
Holgado-Madruga M, Emlet DR, Moscatello DK, Godwin AK, Wong AJ (1996) A Grb2-associated docking
protein in EGF- and insulin-receptor signalling. Nature 379: 560-564.
Holgado-Madruga M, Moscatello DK, Emlet DR, Dieterich R, Wong AJ (1997) Grb2-associated binder-1
mediates phosphatidylinositol 3-kinase activation and the promotion of cell survival by nerve growth factor.
Proc Natl Acad Sci U S A 94: 12419-12424.
Hsu LJ, Mallory M, Xia Y, Veinbergs I, Hashimoto M, Yoshimoto M, Thal LJ, Saitoh T, Masliah E (1998)
Expression pattern of synucleins (non-Abeta component of Alzheimer's disease amyloid precursor
protein/alpha-synuclein) during murine brain development. J Neurochem 71: 338-344.
Huang EJ, Reichardt LF (2001) Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu Rev
Neurosci 24: 677-736.
Huang EJ, Reichardt LF (2003) Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem 72:
609-642.
Huang Y, Cheung L, Rowe D, Halliday G (2004) Genetic contributions to Parkinson's disease. Brain Res
Brain Res Rev 46: 44-70.
Ibáñez P, Bonnet AM, Debarges B, Lohmann E, Tison F, Pollak P, Agid Y, Durr A, Brice A (2004) Causal
relation between alpha-synuclein gene duplication and familial Parkinson's disease. Lancet 364: 1169-1171.
Imai Y, Soda M, Inoue H, Hattori N, Mizuno Y, Takahashi R (2001) An unfolded putative transmembrane
polypeptide, which can lead to endoplasmic reticulum stress, is a substrate of Parkin. Cell 105: 891-902.
Irizarry MC, Kim TW, McNamara M, Tanzi RE, George JM, Clayton DF, Hyman BT (1996) Characterization
of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central
nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 55: 889-895.
Itier JM, Ibáñez P, Mena MA, Abbas N, Cohen-Salmon C, Bohme GA, Laville M, Pratt J, Corti O, Pradier L,
Ret G, Joubert C, Periquet M, Araujo F, Negroni J, Casarejos MJ, Canals S, Solano R, Serrano A, Gallego
E, Sanchez M, Denefle P, Benavides J, Tremp G, Rooney TA, Brice A, Garcia dY (2003) Parkin gene
inactivation alters behaviour and dopamine neurotransmission in the mouse. Hum Mol Genet 12: 22772291.
130
Bibliografía
Iwai A, Masliah E, Yoshimoto M, Ge N, Flanagan L, de Silva HA, Kittel A, Saitoh T (1995) The precursor
protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central
nervous system. Neuron 14: 467-475.
Iwanaga K, Wakabayashi K, Yoshimoto M, Tomita I, Satoh H, Takashima H, Satoh A, Seto M, Tsujihata M,
Takahashi H (1999) Lewy body-type degeneration in cardiac plexus in Parkinson's and incidental Lewy body
diseases. Neurology 52: 1269-1271.
Iwata A, Maruyama M, Kanazawa I, Nukina N (2001) alpha-Synuclein affects the MAPK pathway and
accelerates cell death. J Biol Chem 276: 45320-45329.
Jackson DN, Foster DA (2004) The enigmatic protein kinase Cdelta: complex roles in cell proliferation and
survival. FASEB J 18: 627-636.
Jackson-Lewis V, Jakowec M, Burke RE, Przedborski S (1995) Time course and morphology of
dopaminergic neuronal death caused by the neurotoxin 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine.
Neurodegeneration 4: 257-269.
Jaim-Etcheverry G, Zieher LM (1971) Permanent depletion of peripheral norepinephrine in rats treated at
birth with 6-hydroxydopamine. Eur J Pharmacol 13: 272-276.
Jaken S (1996) Protein kinase C isozymes and substrates. Curr Opin Cell Biol 8: 168-173.
Jakes R, Spillantini MG, Goedert M (1994) Identification of two distinct synucleins from human brain. FEBS
Lett 345: 27-32.
Javitch JA, Snyder SH (1984) Uptake of MPP(+) by dopamine neurons explains selectivity of parkinsonisminducing neurotoxin, MPTP. Eur J Pharmacol 106: 455-456.
Jellinger KA (1991) Pathology of Parkinson's disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Mol
Chem Neuropathol 14: 153-197.
Jenco JM, Rawlingson A, Daniels B, Morris AJ (1998) Regulation of phospholipase D2: selective inhibition of
mammalian phospholipase D isoenzymes by alpha- and beta-synucleins. Biochemistry 37: 4901-4909.
Jensen PH, Hager H, Nielsen MS, Hojrup P, Gliemann J, Jakes R (1999) alpha-synuclein binds to Tau and
stimulates the protein kinase A-catalyzed tau phosphorylation of serine residues 262 and 356. J Biol Chem
274: 25481-25489.
Jeon BS, Jackson-Lewis V, Burke RE (1995) 6-Hydroxydopamine lesion of the rat substantia nigra: time
course and morphology of cell death. Neurodegeneration 4: 131-137.
Johannessen JN, Goldstein DS, Oliver J, Markey SP (1990) Prolonged changes in plasma concentrations of
catecholamine metabolites following a single infusion of an MPTP analog. Life Sci 47: 1895-1901.
Jonsson G (1983) Chemical lesioning techniques: monoamine neurotoxins. In: Handbook of chemical
neuroanatomy. Methods in chemical neuroanatomy (Bjorklund A, Hokfelt T, eds), pp 463-507. Amsterdam:
Elsevier Science Publishers B.V.
Jonsson G, Nwanze E, Luthman J, Sundstrom E (1986) Effect of MPTP and its pyridinium metabolites on
monoamine uptake and on central catecholamine neurons in mice. Acta Physiol Scand 128: 187-194.
Junn E, Mouradian MM (2002) Human alpha-synuclein over-expression increases intracellular reactive
oxygen species levels and susceptibility to dopamine. Neurosci Lett 320: 146-150.
Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Muller V, Jacobsen H, Schindzielorz A, Okochi M, Leimer U, van der PH,
Probst A, Kremmer E, Kretzschmar HA, Haass C (2000) Subcellular localization of wild-type and Parkinson's
disease-associated mutant alpha -synuclein in human and transgenic mouse brain. J Neurosci 20: 63656373.
131
Bibliografía
Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Muller V, Jacobsen H, Spooren W, Fuss B, Mallon B, Macklin WB,
Fujiwara H, Hasegawa M, Iwatsubo T, Kretzschmar HA, Haass C (2002) Hyperphosphorylation and
insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Rep 3: 583-588.
Kalivendi SV, Cunningham S, Kotamraju S, Joseph J, Hillard CJ, Kalyanaraman B (2004) Alpha-synuclein
up-regulation and aggregation during MPP+-induced apoptosis in neuroblastoma cells: intermediacy of
transferrin receptor iron and hydrogen peroxide. J Biol Chem 279: 15240-15247.
Kanthasamy AG, Kitazawa M, Kanthasamy A, Anantharam V (2003) Role of proteolytic activation of protein
kinase Cdelta in oxidative stress-induced apoptosis. Antioxid Redox Signal 5: 609-620.
Kao S, Jaiswal RK, Kolch W, Landreth GE (2001) Identification of the mechanisms regulating the differential
activation of the mapk cascade by epidermal growth factor and nerve growth factor in PC12 cells. J Biol
Chem 276: 18169-18177.
Kaplan DR, Miller FD (2000) Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol
10: 381-391.
Kaplan ML, Cheslow Y, Vikstrom K, Malhotra A, Geenen DL, Nakouzi A, Leinwand LA, Buttrick PM (1994)
Cardiac adaptations to chronic exercise in mice. Am J Physiol 267: H1167-H1173.
Kaufmann H, Nahm K, Purohit D, Wolfe D (2004) Autonomic failure as the initial presentation of Parkinson
disease and dementia with Lewy bodies. Neurology 63: 1093-1095.
Kaul S, Anantharam V, Kanthasamy A, Kanthasamy AG (2005) Wild-type alpha-synuclein interacts with proapoptotic proteins PKCdelta and BAD to protect dopaminergic neuronal cells against MPP+-induced
apoptotic cell death. Brain Res Mol Brain Res 139: 137-152.
Kaul S, Kanthasamy A, Kitazawa M, Anantharam V, Kanthasamy AG (2003) Caspase-3 dependent
proteolytic activation of protein kinase C delta mediates and regulates 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)induced apoptotic cell death in dopaminergic cells: relevance to oxidative stress in dopaminergic
degeneration. Eur J Neurosci 18: 1387-1401.
Kawamura M, Schwartz JP, Nomura T, Kopin IJ, Goldstein DS, Huynh TT, Hooper DR, Harvey-White J,
Eisenhofer G (1999) Differential effects of chemical sympathectomy on expression and activity of tyrosine
hydroxylase and levels of catecholamines and DOPA in peripheral tissues of rats. Neurochem Res 24: 2532.
Keshamouni VG, Mattingly RR, Reddy KB (2002) Mechanism of 17-beta-estradiol-induced Erk1/2 activation
in breast cancer cells. A role for HER2 AND PKC-delta. J Biol Chem 277: 22558-22565.
Kim RH, Smith PD, Aleyasin H, Hayley S, Mount MP, Pownall S, Wakeham A, You T, Kalia SK, Horne P,
Westaway D, Lozano AM, Anisman H, Park DS, Mak TW (2005) Hypersensitivity of DJ-1-deficient mice to 1methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyrindine (MPTP) and oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A 102:
5215-5220.
Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, Shimizu
N (1998) Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 392: 605608.
Kitamura Y, Shimohama S, Akaike A, Taniguchi T (2000) The parkinsonian models: invertebrates to
mammals. Jpn J Pharmacol 84: 237-243.
Kitazawa M, Anantharam V, Kanthasamy AG (2003) Dieldrin induces apoptosis by promoting caspase-3dependent proteolytic cleavage of protein kinase Cdelta in dopaminergic cells: relevance to oxidative stress
and dopaminergic degeneration. Neuroscience 119: 945-964.
Klein R, Parada LF, Coulier F, Barbacid M (1989) trkB, a novel tyrosine protein kinase receptor expressed
during mouse neural development. EMBO J 8: 3701-3709.
132
Bibliografía
Klivenyi P, Siwek D, Gardian G, Yang L, Starkov A, Cleren C, Ferrante RJ, Kowall NW, Abeliovich A, Beal
MF (2006) Mice lacking alpha-synuclein are resistant to mitochondrial toxins. Neurobiol Dis 21: 541-548.
Kopito RR (2000) Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell Biol 10: 524-530.
Korczyn AD (1990) Autonomic nervous system disturbances in Parkinson's disease. Adv Neurol 53: 463468.
Kruger R, Kuhn W, Muller T, Woitalla D, Graeber M, Kosel S, Przuntek H, Epplen JT, Schols L, Riess O
(1998) Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease. Nat Genet 18: 106108.
Kuhn M, Haebig K, Bonin M, Ninkina N, Buchman VL, Poths S, Riess O (2007) Whole genome expression
analyses of single- and double-knock-out mice implicate partially overlapping functions of alpha- and
gamma-synuclein. Neurogenetics 8: 71-81.
Lamballe F, Klein R, Barbacid M (1991) trkC, a new member of the trk family of tyrosine protein kinases, is a
receptor for neurotrophin-3. Cell 66: 967-979.
Landis SC, Damboise S (1986) Neuron Birthdays in the Paravertebral Sympathetic Chain of the Rat.
Anatomical Record 214: A71.
Landis SC, Patterson PH (1981) Neural Crest Cell Lineages. Trends in Neurosciences 4: 172-175.
Lang AE, Lozano AM (1998) Parkinson's disease. First of two parts. N Engl J Med 339: 1044-1053.
Lang AE, Lozano AM (1998) Parkinson's disease. Second of two parts. N Engl J Med 339: 1130-1143.
Langley JN (1921) The autonomic nervous system. Part I.
Langston JW, Ballard PA, Jr. (1983) Parkinson's disease in a chemist working with 1-methyl-4-phenyl1,2,5,6-tetrahydropyridine. N Engl J Med 309: 310.
Lavedan C (1998) The synuclein family. Genome Res 8: 871-880.
Le Douarin NM, Kalcheim C, Teillet M (1992) The cellular and mollecular basis of early sensory ganglion
development. In: Sensory neurons. Diversity, development, and plasticity (Scott SA, ed), pp 143-170. New
York.
Lee HJ, Choi C, Lee SJ (2002) Membrane-bound alpha-synuclein has a high aggregation propensity and the
ability to seed the aggregation of the cytosolic form. J Biol Chem 277: 671-678.
Lee HJ, Khoshaghideh F, Lee S, Lee SJ (2006) Impairment of microtubule-dependent trafficking by
overexpression of alpha-synuclein. Eur J Neurosci 24: 3153-3162.
Lee M, Hyun D, Halliwell B, Jenner P (2001) Effect of the overexpression of wild-type or mutant alphasynuclein on cell susceptibility to insult. J Neurochem 76: 998-1009.
Lee SD, Lee BD, Kim Y, Suh PG, Ryu SH (2000) Bradykinin activates phospholipase D2 via protein kinase
cdelta in PC12 cells. Neurosci Lett 294: 130-132.
Leibersperger H, Gschwendt M, Gernold M, Marks F (1991) Immunological demonstration of a calciumunresponsive protein kinase C of the delta-type in different species and murine tissues. Predominance in
epidermis. J Biol Chem 266: 14778-14784.
Leroy E, Boyer R, Auburger G, Leube B, Ulm G, Mezey E, Harta G, Brownstein MJ, Jonnalagada S,
Chernova T, Dehejia A, Lavedan C, Gasser T, Steinbach PJ, Wilkinson KD, Polymeropoulos MH (1998) The
ubiquitin pathway in Parkinson's disease. Nature 395: 451-452.
133
Bibliografía
Levi-Montalcini R (1987) The nerve growth factor 35 years later. Science 237: 1154-1162.
Li YJ, Scott WK, Hedges DJ, Zhang F, Gaskell PC, Nance MA, Watts RL, Hubble JP, Koller WC, Pahwa R,
Stern MB, Hiner BC, Jankovic J, Allen FA, Jr., Goetz CG, Mastaglia F, Stajich JM, Gibson RA, Middleton LT,
Saunders AM, Scott BL, Small GW, Nicodemus KK, Reed AD, Schmechel DE, Welsh-Bohmer KA,
Conneally PM, Roses AD, Gilbert JR, Vance JM, Haines JL, Pericak-Vance MA (2002) Age at onset in two
common neurodegenerative diseases is genetically controlled. Am J Hum Genet 70: 985-993.
Ling M, Troller U, Zeidman R, Lundberg C, Larsson C (2004) Induction of neurites by the regulatory domains
of PKCdelta and epsilon is counteracted by PKC catalytic activity and by the RhoA pathway. Exp Cell Res
292: 135-150.
Liou HH, Chen RC, Tsai YF, Chen WP, Chang YC, Tsai MC (1996) Effects of paraquat on the substantia
nigra of the wistar rats: neurochemical, histological, and behavioral studies. Toxicol Appl Pharmacol 137: 3441.
Liu X, Ernfors P, Wu H, Jaenisch R (1995) Sensory but not motor neuron deficits in mice lacking NT4 and
BDNF. Nature 375: 238-241.
Loeb DM, Stephens RM, Copeland T, Kaplan DR, Greene LA (1994) A Trk nerve growth factor (NGF)
receptor point mutation affecting interaction with phospholipase C-gamma 1 abolishes NGF-promoted
peripherin induction but not neurite outgrowth. J Biol Chem 269: 8901-8910.
Lotharius J, Brundin P (2002) Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alphasynuclein. Nat Rev Neurosci 3: 932-942.
Lu B, Pang PT, Woo NH (2005) The yin and yang of neurotrophin action. Nat Rev Neurosci 6: 603-614.
Lücking CB, Chesneau V, Lohmann E, Verpillat P, Dulac C, Bonnet AM, Gasparini F, Agid Y, Durr A, Brice
A (2003) Coding polymorphisms in the parkin gene and susceptibility to Parkinson disease. Arch Neurol 60:
1253-1256.
Lücking CB, Durr A, Bonifati V, Vaughan J, De Michele G, Gasser T, Harhangi BS, Meco G, Denefle P,
Wood NW, Agid Y, Brice A (2000) Association between early-onset Parkinson's disease and mutations in
the parkin gene. N Engl J Med 342: 1560-1567.
Luthman J, Brodin E, Sundstrom E, Wiehager B (1990) Studies on brain monoamine and neuropeptide
systems after neonatal intracerebroventricular 6-hydroxydopamine treatment. Int J Dev Neurosci 8: 549-560.
Luthman J, Fredriksson A, Sundstrom E, Jonsson G, Archer T (1989) Selective lesion of central dopamine
or noradrenaline neuron systems in the neonatal rat: motor behavior and monoamine alterations at adult
stage. Behav Brain Res 33: 267-277.
Luthman J, Jonsson G (1986) Effects of the parkinsonism-inducing neurotoxin MPTP and its metabolite
MPP+ on sympathetic adrenergic nerves in mouse iris and atrium. Med Biol 64: 95-102.
Luthman J, Sundstrom E (1990) No apparent difference in the effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine (MPTP) on the sympathetic system in NMRI and C57 BL/6 mice. Toxicol Lett 54: 83-92.
Ma Q, Fode C, Guillemot F, Anderson DJ (1999) Neurogenin1 and neurogenin2 control two distinct waves of
neurogenesis in developing dorsal root ganglia. Genes Dev 13: 1717-1728.
Madrid LV, Wang CY, Guttridge DC, Schottelius AJ, Baldwin AS, Jr., Mayo MW (2000) Akt suppresses
apoptosis by stimulating the transactivation potential of the RelA/p65 subunit of NF-kappaB. Mol Cell Biol
20: 1626-1638.
Mandelkow E, Mandelkow EM (2002) Kinesin motors and disease. Trends Cell Biol 12: 585-591.
134
Bibliografía
Mandelkow EM, Stamer K, Vogel R, Thies E, Mandelkow E (2003) Clogging of axons by tau, inhibition of
axonal traffic and starvation of synapses. Neurobiol Aging 24: 1079-1085.
Mandir AS, Przedborski S, Jackson-Lewis V, Wang ZQ, Simbulan-Rosenthal CM, Smulson ME, Hoffman
BE, Guastella DB, Dawson VL, Dawson TM (1999) Poly(ADP-ribose) polymerase activation mediates 1methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced parkinsonism. Proc Natl Acad Sci U S A 96:
5774-5779.
Manning-Bog AB, McCormack AL, Li J, Uversky VN, Fink AL, Di Monte DA (2002) The herbicide paraquat
causes up-regulation and aggregation of alpha-synuclein in mice: paraquat and alpha-synuclein. J Biol
Chem 277: 1641-1644.
Manning-Bog AB, McCormack AL, Purisai MG, Bolin LM, Di Monte DA (2003) Alpha-synuclein
overexpression protects against paraquat-induced neurodegeneration. J Neurosci 23: 3095-3099.
Maraganore DM, Farrer MJ, Hardy JA, Lincoln SJ, McDonnell SK, Rocca WA (1999) Case-control study of
the ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 gene in Parkinson's disease. Neurology 53: 1858-1860.
Maraganore DM, Lesnick TG, Elbaz A, Chartier-Harlin MC, Gasser T, Kruger R, Hattori N, Mellick GD,
Quattrone A, Satoh J, Toda T, Wang J, Ioannidis JP, de Andrade M, Rocca WA (2004) UCHL1 is a
Parkinson's disease susceptibility gene. Ann Neurol 55: 512-521.
Marín I (2006) The Parkinson Disease Gene LRRK2: Evolutionary and Structural Insights. Mol Biol Evol 23:
2423-2433.
Marín I, Vallejo J (2005) Parkinson Disease: From Cellular and Animal Models to Genomics. Current
Genomics 6: 241-250.
Maroteaux L, Campanelli JT, Scheller RH (1988) Synuclein: a neuron-specific protein localized to the
nucleus and presynaptic nerve terminal. J Neurosci 8: 2804-2815.
Maroteaux L, Scheller RH (1991) The rat brain synucleins; family of proteins transiently associated with
neuronal membrane. Brain Res Mol Brain Res 11: 335-343.
Marsden CD (1983) Neuromelanin and Parkinson's disease. J Neural Transm Suppl 19: 121-141.
Martí MJ, Tolosa E, Campdelacreu J (2003) Clinical overview of the synucleinopathies. Mov Disord 18 Suppl
6: S21-S27.
Martin DP, Wallace TL, Johnson EM, Jr. (1990) Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons in a fashion
resembling trophic factor deprivation: evidence that a deoxycytidine-dependent process may be required for
nerve growth factor signal transduction. J Neurosci 10: 184-193.
Martin ER, Scott WK, Nance MA, Watts RL, Hubble JP, Koller WC, Lyons K, Pahwa R, Stern MB, Colcher
A, Hiner BC, Jankovic J, Ondo WG, Allen FH, Jr., Goetz CG, Small GW, Masterman D, Mastaglia F, Laing
NG, Stajich JM, Ribble RC, Booze MW, Rogala A, Hauser MA, Zhang F, Gibson RA, Middleton LT, Roses
AD, Haines JL, Scott BL, Pericak-Vance MA, Vance JM (2001) Association of single-nucleotide
polymorphisms of the tau gene with late-onset Parkinson disease. JAMA 286: 2245-2250.
Martin-Zanca D, Oskam R, Mitra G, Copeland T, Barbacid M (1989) Molecular and biochemical
characterization of the human trk proto-oncogene. Mol Cell Biol 9: 24-33.
Marusich MF, Weston JA (1991) Development of the neural crest. Curr Opin Genet Dev 1: 221-229.
Masliah E, Rockenstein E, Veinbergs I, Mallory M, Hashimoto M, Takeda A, Sagara Y, Sisk A, Mucke L
(2000) Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for
neurodegenerative disorders. Science 287: 1265-1269.
135
Bibliografía
Matsuoka Y, Vila M, Lincoln S, McCormack A, Picciano M, LaFrancois J, Yu X, Dickson D, Langston WJ,
McGowan E, Farrer M, Hardy J, Duff K, Przedborski S, Di Monte DA (2001) Lack of nigral pathology in
transgenic mice expressing human alpha-synuclein driven by the tyrosine hydroxylase promoter. Neurobiol
Dis 8: 535-539.
Mayer RA, Kindt MV, Heikkila RE (1986) Prevention of the nigrostriatal toxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine by inhibitors of 3,4-dihydroxyphenylethylamine transport. J Neurochem 47: 1073-1079.
McCormack AL, Di Monte DA (2003) Effects of L-dopa and other amino acids against paraquat-induced
nigrostriatal degeneration. J Neurochem 85: 82-86.
McEvilly RJ, Erkman L, Luo L, Sawchenko PE, Ryan AF, Rosenfeld MG (1996) Requirement for Brn-3.0 in
differentiation and survival of sensory and motor neurons. Nature 384: 574-577.
Meakin SO, MacDonald JI, Gryz EA, Kubu CJ, Verdi JM (1999) The signaling adapter FRS-2 competes with
Shc for binding to the nerve growth factor receptor TrkA. A model for discriminating proliferation and
differentiation. J Biol Chem 274: 9861-9870.
Meco G, Pratesi L, Bonifati V (1991) Cardiovascular reflexes and autonomic dysfunction in Parkinson's
disease. J Neurol 238: 195-199.
Meulener MC, Graves CL, Sampathu DM, Armstrong-Gold CE, Bonini NM, Giasson BI (2005) DJ-1 is
present in a large molecular complex in human brain tissue and interacts with alpha-synuclein. J Neurochem
93: 1524-1532.
Micieli G, Tosi P, Marcheselli S, Cavallini A (2003) Autonomic dysfunction in Parkinson's disease. Neurol Sci
24 Suppl 1: S32-S34.
Miller DW, Hague SM, Clarimon J, Baptista M, Gwinn-Hardy K, Cookson MR, Singleton AB (2004) Alphasynuclein in blood and brain from familial Parkinson disease with SNCA locus triplication. Neurology 62:
1835-1838.
Mischak H, Pierce JH, Goodnight J, Kazanietz MG, Blumberg PM, Mushinski JF (1993) Phorbol esterinduced myeloid differentiation is mediated by protein kinase C-alpha and -delta and not by protein kinase
C-beta II, -epsilon, -zeta, and -eta. J Biol Chem 268: 20110-20115.
Mizuno Y, Hattori N, Mori H, Suzuki T, Tanaka K (2001) Parkin and Parkinson's disease. Curr Opin Neurol
14: 477-482.
Moore DJ, Zhang L, Troncoso J, Lee MK, Hattori N, Mizuno Y, Dawson TM, Dawson VL (2005) Association
of DJ-1 and parkin mediated by pathogenic DJ-1 mutations and oxidative stress. Hum Mol Genet 14: 71-84.
Morfini G, Pigino G, Opalach K, Serulle Y, Moreira JE, Sugimori M, Llinas RR, Brady ST (2007) 1-Methyl-4phenylpyridinium affects fast axonal transport by activation of caspase and protein kinase C. Proc Natl Acad
Sci U S A 104: 2442-2447.
Morin X, Cremer H, Hirsch MR, Kapur RP, Goridis C, Brunet JF (1997) Defects in sensory and autonomic
ganglia and absence of locus coeruleus in mice deficient for the homeobox gene Phox2a. Neuron 18: 411423.
Morino K, Maegawa H, Fujita T, Takahara N, Egawa K, Kashiwagi A, Kikkawa R (2001) Insulin-induced cJun N-terminal kinase activation is negatively regulated by protein kinase C delta. Endocrinology 142: 26692676.
Mukoyama M, Yamazaki K, Kikuchi T, Tomita T (1989) Neuropathology of gracile axonal dystrophy (GAD)
mouse. An animal model of central distal axonopathy in primary sensory neurons. Acta Neuropathol (Berl)
79: 294-299.
136
Bibliografía
Murphy DD, Rueter SM, Trojanowski JQ, Lee VM (2000) Synucleins are developmentally expressed, and
alpha-synuclein regulates the size of the presynaptic vesicular pool in primary hippocampal neurons. J
Neurosci 20: 3214-3220.
Nagatsu T, Levitt M, Udenfriends S (1964) Tyrosine hydroxylase. The initial step in norepinephrine
biosynthesis. J Biol Chem 239: 2910-2917.
Nakajo S, Omata K, Aiuchi T, Shibayama T, Okahashi I, Ochiai H, Nakai Y, Nakaya K, Nakamura Y (1990)
Purification and characterization of a novel brain-specific 14-kDa protein. J Neurochem 55: 2031-2038.
Nakajo S, Tsukada K, Omata K, Nakamura Y, Nakaya K (1993) A new brain-specific 14-kDa protein is a
phosphoprotein. Its complete amino acid sequence and evidence for phosphorylation. Eur J Biochem 217:
1057-1063.
Neumann M, Muller V, Gorner K, Kretzschmar HA, Haass C, Kahle PJ (2004) Pathological properties of the
Parkinson's disease-associated protein DJ-1 in alpha-synucleinopathies and tauopathies: relevance for
multiple system atrophy and Pick's disease. Acta Neuropathol (Berl) 107: 489-496.
Nicklas WJ, Youngster SK, Kindt MV, Heikkila RE (1987) MPTP, MPP+ and mitochondrial function. Life Sci
40: 721-729.
Nieto M, Gil-Bea FJ, Dalfo E, Cuadrado M, Cabodevilla F, Sanchez B, Catena S, Sesma T, Ribe E, Ferrer I,
Ramirez MJ, Gomez-Isla T (2006) Increased sensitivity to MPTP in human alpha-synuclein A30P transgenic
mice. Neurobiol Aging 27: 848-856.
Nimnual AS, Yatsula BA, Bar-Sagi D (1998) Coupling of Ras and Rac guanosine triphosphatases through
the Ras exchanger Sos. Science 279: 560-563.
Ninkina N, Papachroni K, Robertson DC, Schmidt O, Delaney L, O'Neill F, Court F, Rosenthal A, FleetwoodWalker SM, Davies AM, Buchman VL (2003) Neurons expressing the highest levels of gamma-synuclein are
unaffected by targeted inactivation of the gene. Mol Cell Biol 23: 8233-8245.
Nishie M, Mori F, Fujiwara H, Hasegawa M, Yoshimoto M, Iwatsubo T, Takahashi H, Wakabayashi K (2004)
Accumulation of phosphorylated alpha-synuclein in the brain and peripheral ganglia of patients with multiple
system atrophy. Acta Neuropathol (Berl) 107: 292-298.
Nishizuka Y (1992) Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C.
Science 258: 607-614.
Nosaka Y, Arai A, Miyasaka N, Miura O (1999) CrkL mediates Ras-dependent activation of the Raf/ERK
pathway through the guanine nucleotide exchange factor C3G in hematopoietic cells stimulated with
erythropoietin or interleukin-3. J Biol Chem 274: 30154-30162.
O'Driscoll KR, Teng KK, Fabbro D, Greene LA, Weinstein IB (1995) Selective translocation of protein kinase
C-delta in PC12 cells during nerve growth factor-induced neuritogenesis. Mol Biol Cell 6: 449-458.
Obermeier A, Bradshaw RA, Seedorf K, Choidas A, Schlessinger J, Ullrich A (1994) Neuronal differentiation
signals are controlled by nerve growth factor receptor/Trk binding sites for SHC and PLC gamma. EMBO J
13: 1585-1590.
Olanow CW, Tatton WG (1999) Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annu Rev Neurosci 22:
123-144.
Orimo S, Amino T, Itoh Y, Takahashi A, Kojo T, Uchihara T, Tsuchiya K, Mori F, Wakabayashi K, Takahashi
H (2005) Cardiac sympathetic denervation precedes neuronal loss in the sympathetic ganglia in Lewy body
disease. Acta Neuropathol (Berl) 109: 583-588.
Orimo S, Amino T, Takahashi A, Kojo T, Uchihara T, Mori F, Wakabayashi K, Takahashi H (2006) Cardiac
sympathetic denervation in Lewy body disease. Parkinsonism Relat Disord.
137
Bibliografía
Orimo S, Oka T, Miura H, Tsuchiya K, Mori F, Wakabayashi K, Nagao T, Yokochi M (2002) Sympathetic
cardiac denervation in Parkinson's disease and pure autonomic failure but not in multiple system atrophy. J
Neurol Neurosurg Psychiatry 73: 776-777.
Orimo S, Ozawa E, Nakade S, Hattori H, Tsuchiya K, Taki K, Takahashi A (2003) [123I] metaiodobenzylguanidine myocardial scintigraphy differentiates corticobasal degeneration from Parkinson's
disease. Intern Med 42: 127-128.
Orimo S, Ozawa E, Oka T, Nakade S, Tsuchiya K, Yoshimoto M, Wakabayashi K, Takahashi H (2001)
Different histopathology accounting for a decrease in myocardial MIBG uptake in PD and MSA. Neurology
57: 1140-1141.
Ostrerova N, Petrucelli L, Farrer M, Mehta N, Choi P, Hardy J, Wolozin B (1999) alpha-Synuclein shares
physical and functional homology with 14-3-3 proteins. J Neurosci 19: 5782-5791.
Paisán-Ruíz C, Jain S, Evans EW, Gilks WP, Simón J, van der BM, López dM, Aparicio S, Gil AM, Khan N,
Johnson J, Martínez JR, Nicholl D, Carrera IM, Peña AS, de Silva R, Lees A, Martí-Massó JF, Pérez-Tur J,
Wood NW, Singleton AB (2004) Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked
Parkinson's disease. Neuron 44: 595-600.
Papachroni K, Ninkina N, Wanless J, Kalofoutis AT, Gnuchev NV, Buchman VL (2005) Peripheral sensory
neurons survive in the absence of alpha- and gamma-synucleins. J Mol Neurosci 25: 157-164.
Park DS, Morris EJ, Stefanis L, Troy CM, Shelanski ML, Geller HM, Greene LA (1998) Multiple pathways of
neuronal death induced by DNA-damaging agents, NGF deprivation, and oxidative stress. J Neurosci 18:
830-840.
Parkinson J (2002) An essay on the shaking palsy. 1817. J Neuropsychiatry Clin Neurosci 14: 223-236.
Patapoutian A, Reichardt LF (2001) Trk receptors: mediators of neurotrophin action. Curr Opin Neurobiol 11:
272-280.
Paterna JC, Leng A, Weber E, Feldon J, Bueler H (2007) DJ-1 and Parkin Modulate Dopamine-dependent
Behavior and Inhibit MPTP-induced Nigral Dopamine Neuron Loss in Mice. Mol Ther.
Perez FA, Palmiter RD (2005) Parkin-deficient mice are not a robust model of parkinsonism. Proc Natl Acad
Sci U S A 102: 2174-2179.
Perez RG, Waymire JC, Lin E, Liu JJ, Guo F, Zigmond MJ (2002) A role for alpha-synuclein in the regulation
of dopamine biosynthesis. J Neurosci 22: 3090-3099.
Pérez-Sánchez F, Milán M, Fariñas I (2002) Animals Models of α−Synucleopathies. In: Neurodegenerative
Disorders Associated with α−Synuclein Pathology pp 23-36. Ars Medica.
Petersen K, Olesen OF, Mikkelsen JD (1999) Developmental expression of alpha-synuclein in rat
hippocampus and cerebral cortex. Neuroscience 91: 651-659.
Pierchala BA, Ahrens RC, Paden AJ, Johnson EM, Jr. (2004) Nerve growth factor promotes the survival of
sympathetic neurons through the cooperative function of the protein kinase C and phosphatidylinositol 3kinase pathways. J Biol Chem 279: 27986-27993.
Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Dutra A, Pike B, Root H, Rubenstein J, Boyer
R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A, Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM,
Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI, Nussbaum RL (1997) Mutation in the alpha-synuclein gene identified in
families with Parkinson's disease. Science 276: 2045-2047.
Porter CC, Stone CA (1967) Biochemical mechanisms of drug action. Annu Rev Pharmacol 7: 15-38.
138
Bibliografía
Porter CC, Totaro JA, Burcin A (1965) The relationship between radioactivity and norepinephrine
concentrations in the brains and hearts of mice following administration of labeled methyldopa or 6hydroxydopamine. J Pharmacol Exp Ther 150: 17-22.
Porter CC, Totaro JA, Stone CA (1963) Effect of 6-hydroxydopamine and some other compounds on the
concentration of norepinephrine in the hearts of mice. J Pharmacol Exp Ther 140: 308-316.
Prasad JE, Kumar B, Andreatta C, Nahreini P, Hanson AJ, Yan XD, Prasad KN (2004) Overexpression of
alpha-synuclein decreased viability and enhanced sensitivity to prostaglandin E(2), hydrogen peroxide, and
a nitric oxide donor in differentiated neuroblastoma cells. J Neurosci Res 76: 415-422.
Price KS, Farley IJ, Hornykiewicz O (1978) Neurochemistry of Parkinson's disease: relation between striatal
and limbic dopamine. Adv Biochem Psychopharmacol 19: 293-300.
Przedborski S, Jackson-Lewis V (1998) Experimental developments in movement disorders: update on
proposed free radical mechanisms. Curr Opin Neurol 11: 335-339.
Przedborski S, Tieu K, Perier C, Vila M (2004) MPTP as a mitochondrial neurotoxic model of Parkinson's
disease. J Bioenerg Biomembr 36: 375-379.
Raff MC, Whitmore AV, Finn JT (2002) Axonal self-destruction and neurodegeneration. Science 296: 868871.
Rajput AH, Rozdilsky B (1976) Dysautonomia in Parkinsonism: a clinicopathological study. J Neurol
Neurosurg Psychiatry 39: 1092-1100.
Rajput AH, Rozdilsky B (1976) Postural hypotension in idiopathic Parkinson's disease. Etiopathology. Neurol
Neurocir Psiquiatr 17: 269-284.
Rathke-Hartlieb S, Kahle PJ, Neumann M, Ozmen L, Haid S, Okochi M, Haass C, Schulz JB (2001)
Sensitivity to MPTP is not increased in Parkinson's disease-associated mutant alpha-synuclein transgenic
mice. J Neurochem 77: 1181-1184.
Reichardt LF, Farinas I (1997) Neurotrophic factors and their receptors. Roles in neuronal development and
function. In: Molecular and Cellular Approaches to Neural Development (WM Cowan, TM Jessell, SL
Zipyrsky, eds), pp 220-263. New York: Oxford Univ. Press.
Reinhard JF, Jr., Daniels AJ (1992) Subcellular compartmentation of 2'methyl MPP+ can explain differences
in toxicity to adrenal chromaffin cells. Ann N Y Acad Sci 648: 323-325.
Ren J, Porter JE, Wold LE, Aberle NS, Muralikrishnan D, Haselton JR (2004) Depressed contractile function
and adrenergic responsiveness of cardiac myocytes in an experimental model of Parkinson disease, the
MPTP-treated mouse. Neurobiol Aging 25: 131-138.
Riccio A, Ahn S, Davenport CM, Blendy JA, Ginty DD (1999) Mediation by a CREB family transcription
factor of NGF-dependent survival of sympathetic neurons. Science 286: 2358-2361.
Richfield EK, Thiruchelvam MJ, Cory-Slechta DA, Wuertzer C, Gainetdinov RR, Caron MG, Di Monte DA,
Federoff HJ (2002) Behavioral and neurochemical effects of wild-type and mutated human alpha-synuclein
in transgenic mice. Exp Neurol 175: 35-48.
Rizzo MA, Shome K, Vasudevan C, Stolz DB, Sung TC, Frohman MA, Watkins SC, Romero G (1999)
Phospholipase D and its product, phosphatidic acid, mediate agonist-dependent raf-1 translocation to the
plasma membrane and the activation of the mitogen-activated protein kinase pathway. J Biol Chem 274:
1131-1139.
Rizzu P, Hinkle DA, Zhukareva V, Bonifati V, Severijnen LA, Martinez D, Ravid R, Kamphorst W, Eberwine
JH, Lee VM, Trojanowski JQ, Heutink P (2004) DJ-1 colocalizes with tau inclusions: a link between
parkinsonism and dementia. Ann Neurol 55: 113-118.
139
Bibliografía
Robertson DC, Schmidt O, Ninkina N, Jones PA, Sharkey J, Buchman VL (2004) Developmental loss and
resistance to MPTP toxicity of dopaminergic neurones in substantia nigra pars compacta of gammasynuclein, alpha-synuclein and double alpha/gamma-synuclein null mutant mice. J Neurochem 89: 11261136.
Rockenstein E, Mallory M, Hashimoto M, Song D, Shults CW, Lang I, Masliah E (2002) Differential
neuropathological alterations in transgenic mice expressing alpha-synuclein from the platelet-derived growth
factor and Thy-1 promoters. J Neurosci Res 68: 568-578.
Rordorf-Nikolic T, Van Horn DJ, Chen D, White MF, Backer JM (1995) Regulation of phosphatidylinositol 3'kinase by tyrosyl phosphoproteins. Full activation requires occupancy of both SH2 domains in the 85-kDa
regulatory subunit. J Biol Chem 270: 3662-3666.
Ross CA (1997) Intranuclear neuronal inclusions: a common pathogenic mechanism for glutamine-repeat
neurodegenerative diseases? Neuron 19: 1147-1150.
Ross OA, Farrer MJ (2005) Pathophysiology, pleiotrophy and paradigm shifts: genetic lessons from
Parkinson's disease. Biochem Soc Trans 33: 586-590.
Roux PP, Barker PA (2002) Neurotrophin signaling through the p75 neurotrophin receptor. Prog Neurobiol
67: 203-233.
Rubin E (1985) Development of the rat superior cervical ganglion: ganglion cell maturation. J Neurosci 5:
673-684.
Ruffy R, Leonard M (1997) Chemical cardiac sympathetic denervation hampers defibrillation in the dog. J
Cardiovasc Electrophysiol 8: 62-67.
Ryer EJ, Sakakibara K, Wang C, Sarkar D, Fisher PB, Faries PL, Kent KC, Liu B (2005) Protein kinase C
delta induces apoptosis of vascular smooth muscle cells through induction of the tumor suppressor p53 by
both p38-dependent and p38-independent mechanisms. J Biol Chem 280: 35310-35317.
Saha AR, Ninkina NN, Hanger DP, Anderton BH, Davies AM, Buchman VL (2000) Induction of neuronal
death by alpha-synuclein. Eur J Neurosci 12: 3073-3077.
Saigoh K, Wang YL, Suh JG, Yamanishi T, Sakai Y, Kiyosawa H, Harada T, Ichihara N, Wakana S, Kikuchi
T, Wada K (1999) Intragenic deletion in the gene encoding ubiquitin carboxy-terminal hydrolase in gad mice.
Nat Genet 23: 47-51.
Sarbassov DD, Guertin DA, Ali SM, Sabatini DM (2005) Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the
rictor-mTOR complex. Science 307: 1098-1101.
Schlossmacher MG, Frosch MP, Gai WP, Medina M, Sharma N, Forno L, Ochiishi T, Shimura H, Sharon R,
Hattori N, Langston JW, Mizuno Y, Hyman BT, Selkoe DJ, Kosik KS (2002) Parkin localizes to the Lewy
bodies of Parkinson disease and dementia with Lewy bodies. Am J Pathol 160: 1655-1667.
Schluter OM, Fornai F, Alessandri MG, Takamori S, Geppert M, Jahn R, Sudhof TC (2003) Role of alphasynuclein in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced parkinsonism in mice. Neuroscience 118:
985-1002.
Schuler F, Casida JE (2001) The insecticide target in the PSST subunit of complex I. Pest Manag Sci 57:
932-940.
Seo JH, Rah JC, Choi SH, Shin JK, Min K, Kim HS, Park CH, Kim S, Kim EM, Lee SH, Lee S, Suh SW, Suh
YH (2002) Alpha-synuclein regulates neuronal survival via Bcl-2 family expression and PI3/Akt kinase
pathway. FASEB J 16: 1826-1828.
140
Bibliografía
Serulle Y, Morfini G, Pigino G, Moreira JE, Sugimori M, Brady ST, Llinas RR (2007) 1-Methyl-4phenylpyridinium induces synaptic dysfunction through a pathway involving caspase and PKCdelta
enzymatic activities. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 2437-2441.
Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, Abeliovich A (2004) DJ-1 is a redox-dependent molecular
chaperone that inhibits alpha-synuclein aggregate formation. PLoS Biol 2: e362.
Sherer TB, Betarbet R, Stout AK, Lund S, Baptista M, Panov AV, Cookson MR, Greenamyre JT (2002) An in
vitro model of Parkinson's disease: linking mitochondrial impairment to altered alpha-synuclein metabolism
and oxidative damage. J Neurosci 22: 7006-7015.
Sherer TB, Betarbet R, Testa CM, Seo BB, Richardson JR, Kim JH, Miller GW, Yagi T, Matsuno-Yagi A,
Greenamyre JT (2003) Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci 23:
10756-10764.
Sherer TB, Kim JH, Betarbet R, Greenamyre JT (2003) Subcutaneous rotenone exposure causes highly
selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation. Exp Neurol 179: 9-16.
Sherman MY, Goldberg AL (2001) Cellular defenses against unfolded proteins: a cell biologist thinks about
neurodegenerative diseases. Neuron 29: 15-32.
Shimizu K, Ohtaki K, Matsubara K, Aoyama K, Uezono T, Saito O, Suno M, Ogawa K, Hayase N, Kimura K,
Shiono H (2001) Carrier-mediated processes in blood--brain barrier penetration and neural uptake of
paraquat. Brain Res 906: 135-142.
Shimura H, Hattori N, Kubo S, Mizuno Y, Asakawa S, Minoshima S, Shimizu N, Iwai K, Chiba T, Tanaka K,
Suzuki T (2000) Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a ubiquitin-protein ligase. Nat Genet 25:
302-305.
Shimura H, Hattori N, Kubo S, Yoshikawa M, Kitada T, Matsumine H, Asakawa S, Minoshima S, Yamamura
Y, Shimizu N, Mizuno Y (1999) Immunohistochemical and subcellular localization of Parkin protein: absence
of protein in autosomal recessive juvenile parkinsonism patients. Ann Neurol 45: 668-672.
Shimura H, Schlossmacher MG, Hattori N, Frosch MP, Trockenbacher A, Schneider R, Mizuno Y, Kosik KS,
Selkoe DJ (2001) Ubiquitination of a new form of alpha-synuclein by parkin from human brain: implications
for Parkinson's disease. Science 293: 263-269.
Shults CW (2006) Lewy bodies. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 1661-1668.
Sieber-Blum M (1989) Commitment of neural crest cells to the sensory neuron lineage. Science 243: 16081611.
Sieber-Blum M (1989) Inhibition of the adrenergic phenotype in cultured neural crest cells by norepinephrine
uptake inhibitors. Dev Biol 136: 372-380.
Silos-Santiago I, Fagan AM, Garber M, Fritzsch B, Barbacid M (1997) Severe sensory deficits but normal
CNS development in newborn mice lacking TrkB and TrkC tyrosine protein kinase receptors. Eur J Neurosci
9: 2045-2056.
Singleton A, Gwinn-Hardy K, Sharabi Y, Li ST, Holmes C, Dendi R, Hardy J, Singleton A, Crawley A,
Goldstein DS (2004) Association between cardiac denervation and parkinsonism caused by alpha-synuclein
gene triplication. Brain 127: 768-772.
Singleton AB, Farrer M, Johnson J, Singleton A, Hague S, Kachergus J, Hulihan M, Peuralinna T, Dutra A,
Nussbaum R, Lincoln S, Crawley A, Hanson M, Maraganore D, Adler C, Cookson MR, Muenter M, Baptista
M, Miller D, Blancato J, Hardy J, Gwinn-Hardy K (2003) alpha-Synuclein locus triplication causes
Parkinson's disease. Science 302: 841.
141
Bibliografía
Skipper L, Farrer M (2002) Parkinson's genetics: molecular insights for the new millennium. Neurotoxicology
23: 503-514.
Smeyne RJ, Klein R, Schnapp A, Long LK, Bryant S, Lewin A, Lira SA, Barbacid M (1994) Severe sensory
and sympathetic neuropathies in mice carrying a disrupted Trk/NGF receptor gene. Nature 368: 246-249.
Smith WW, Pei Z, Jiang H, Moore DJ, Liang Y, West AB, Dawson VL, Dawson TM, Ross CA (2005)
Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) interacts with parkin, and mutant LRRK2 induces neuronal
degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 18676-18681.
Soares-da-Silva P (1988) Evidence for dopaminergic co-transmission in dog mesenteric arterial vessels. Br
J Pharmacol 95: 218-224.
Sokal RR, Rohlf FJ (1995) Biometry. The principles and practice of statistics in biological research. San
Francisco.
Solano SM, Miller DW, Augood SJ, Young AB, Penney JB, Jr. (2000) Expression of alpha-synuclein, parkin,
and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 mRNA in human brain: genes associated with familial
Parkinson's disease. Ann Neurol 47: 201-210.
Sone M, Yoshida M, Hashizume Y, Hishikawa N, Sobue G (2005) alpha-Synuclein-immunoreactive structure
formation is enhanced in sympathetic ganglia of patients with multiple system atrophy. Acta Neuropathol
(Berl) 110: 19-26.
Song DD, Shults CW, Sisk A, Rockenstein E, Masliah E (2004) Enhanced substantia nigra mitochondrial
pathology in human alpha-synuclein transgenic mice after treatment with MPTP. Exp Neurol 186: 158-172.
Sonsalla PK, Heikkila RE (1986) The influence of dose and dosing interval on MPTP-induced dopaminergic
neurotoxicity in mice. Eur J Pharmacol 129: 339-345.
Specht CG, Schoepfer R (2001) Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred
mice. BMC Neurosci 2: 11.
Spillantini MG, Crowther RA, Jakes R, Hasegawa M, Goedert M (1998) alpha-Synuclein in filamentous
inclusions of Lewy bodies from Parkinson's disease and dementia with lewy bodies. Proc Natl Acad Sci U S
A 95: 6469-6473.
Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM, Trojanowski JQ, Jakes R, Goedert M (1997) Alpha-synuclein in Lewy
bodies. Nature 388: 839-840.
Stefanis L, Larsen KE, Rideout HJ, Sulzer D, Greene LA (2001) Expression of A53T mutant but not wildtype alpha-synuclein in PC12 cells induces alterations of the ubiquitin-dependent degradation system, loss
of dopamine release, and autophagic cell death. J Neurosci 21: 9549-9560.
Stefanis L, Wang Q, Oo T, Lang-Rollin I, Burke RE, Dauer WT (2004) Lack of alpha-synuclein does not alter
apoptosis of neonatal catecholaminergic neurons. Eur J Neurosci 20: 1969-1972.
Stephens RM, Loeb DM, Copeland TD, Pawson T, Greene LA, Kaplan DR (1994) Trk receptors use
redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC-gamma 1 to mediate NGF responses.
Neuron 12: 691-705.
Stokin GB, Lillo C, Falzone TL, Brusch RG, Rockenstein E, Mount SL, Raman R, Davies P, Masliah E,
Williams DS, Goldstein LS (2005) Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's
disease. Science 307: 1282-1288.
Stokoe D, Stephens LR, Copeland T, Gaffney PR, Reese CB, Painter GF, Holmes AB, McCormick F,
Hawkins PT (1997) Dual role of phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate in the activation of protein kinase B.
Science 277: 567-570.
142
Bibliografía
Sundstrom E, Luthman J, Goldstein M, Jonsson G (1988) Time course of MPTP-induced degeneration of
the nigrostriatal dopamine system in C57 BL/6 mice. Brain Res Bull 21: 257-263.
Sundstrom E, Samuelsson EB (1997) Comparison of key steps in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine (MPTP) neurotoxicity in rodents. Pharmacol Toxicol 81: 226-231.
Sundstrom E, Stromberg I, Tsutsumi T, Olson L, Jonsson G (1987) Studies on the effect of 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) on central catecholamine neurons in C57BL/6 mice. Comparison
with three other strains of mice. Brain Res 405: 26-38.
Sveinbjornsdottir S, Hicks AA, Jonsson T, Petursson H, Gugmundsson G, Frigge ML, Kong A, Gulcher JR,
Stefansson K (2000) Familial aggregation of Parkinson's disease in Iceland. N Engl J Med 343: 1765-1770.
Taira T, Saito Y, Niki T, Iguchi-Ariga SM, Takahashi K, Ariga H (2004) DJ-1 has a role in antioxidative stress
to prevent cell death. EMBO Rep 5: 213-218.
Takatsu H, Nishida H, Matsuo H, Watanabe S, Nagashima K, Wada H, Noda T, Nishigaki K, Fujiwara H
(2000) Cardiac sympathetic denervation from the early stage of Parkinson's disease: clinical and
experimental studies with radiolabeled MIBG. J Nucl Med 41: 71-77.
Takenouchi T, Hashimoto M, Hsu LJ, Mackowski B, Rockenstein E, Mallory M, Masliah E (2001) Reduced
neuritic outgrowth and cell adhesion in neuronal cells transfected with human alpha-synuclein. Mol Cell
Neurosci 17: 141-150.
Tanner CM (1992) Epidemiology of Parkinson's disease. Neurol Clin 10: 317-329.
Tanner CM, Ottman R, Goldman SM, Ellenberg J, Chan P, Mayeux R, Langston JW (1999) Parkinson
disease in twins: an etiologic study. JAMA 281: 341-346.
Tatton NA, Kish SJ (1997) In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and
acridine orange staining. Neuroscience 77: 1037-1048.
Tatton WG, Chalmers-Redman R, Brown D, Tatton N (2003) Apoptosis in Parkinson's disease: signals for
neuronal degradation. Ann Neurol 53 Suppl 3: S61-S70.
Tellioglu T, Robertson D (2001) Genetic or acquired deficits in the norepinephrine transporter: current
understanding of clinical implications. Expert Rev Mol Med 2001: 1-10.
Tessarollo L, Tsoulfas P, Donovan MJ, Palko ME, Blair-Flynn J, Hempstead BL, Parada LF (1997) Targeted
deletion of all isoforms of the trkC gene suggests the use of alternate receptors by its ligand neurotrophin-3
in neuronal development and implicates trkC in normal cardiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 1477614781.
Thiruchelvam M, Richfield EK, Baggs RB, Tank AW, Cory-Slechta DA (2000) The nigrostriatal dopaminergic
system as a preferential target of repeated exposures to combined paraquat and maneb: implications for
Parkinson's disease. J Neurosci 20: 9207-9214.
Thiruchelvam MJ, Powers JM, Cory-Slechta DA, Richfield EK (2004) Risk factors for dopaminergic neuron
loss in human alpha-synuclein transgenic mice. Eur J Neurosci 19: 845-854.
Thoenen H, Tranzer JP (1968) Chemical sympathectomy by selective destruction of adrenergic nerve
endings with 6-Hydroxydopamine. Naunyn Schmiedebergs Arch Exp Pathol Pharmakol 261: 271-288.
Tiunova AA, Anokhin KV, Saha AR, Schmidt O, Hanger DP, Anderton BH, Davies AM, Ninkina NN,
Buchman VL (2000) Chicken synucleins: cloning and expression in the developing embryo. Mech Dev 99:
195-198.
143
Bibliografía
Tomkins CE, Edwards SN, Tolkovsky AM (1994) Apoptosis is induced in post-mitotic rat sympathetic
neurons by arabinosides and topoisomerase II inhibitors in the presence of NGF. J Cell Sci 107 ( Pt 6):
1499-1507.
Tsuboi K, Grzesiak JJ, Bouvet M, Hashimoto M, Masliah E, Shults CW (2005) Alpha-synuclein
overexpression in oligodendrocytic cells results in impaired adhesion to fibronectin and cell death. Mol Cell
Neurosci 29: 259-268.
Uéda K, Fukushima H, Masliah E, Xia Y, Iwai A, Yoshimoto M, Otero DA, Kondo J, Ihara Y, Saitoh T (1993)
Molecular cloning of cDNA encoding an unrecognized component of amyloid in Alzheimer disease. Proc
Natl Acad Sci U S A 90: 11282-11286.
Ueda Y, Hirai S, Osada S, Suzuki A, Mizuno K, Ohno S (1996) Protein kinase C activates the MEK-ERK
pathway in a manner independent of Ras and dependent on Raf. J Biol Chem 271: 23512-23519.
Unoki M, Nakamura Y (2001) Growth-suppressive effects of BPOZ and EGR2, two genes involved in the
PTEN signaling pathway. Oncogene 20: 4457-4465.
Uversky VN (2003) A protein-chameleon: conformational plasticity of alpha-synuclein, a disordered protein
involved in neurodegenerative disorders. J Biomol Struct Dyn 21: 211-234.
Uversky VN, Li J, Fink AL (2001) Pesticides directly accelerate the rate of alpha-synuclein fibril formation: a
possible factor in Parkinson's disease. FEBS Lett 500: 105-108.
Vaillant AR, Mazzoni I, Tudan C, Boudreau M, Kaplan DR, Miller FD (1999) Depolarization and
neurotrophins converge on the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway to synergistically regulate
neuronal survival. J Cell Biol 146: 955-966.
Valente EM, Abou-Sleiman PM, Caputo V, Muqit MM, Harvey K, Gispert S, Ali Z, Del Turco D, Bentivoglio
AR, Healy DG, Albanese A, Nussbaum R, Gonzalez-Maldonado R, Deller T, Salvi S, Cortelli P, Gilks WP,
Latchman DS, Harvey RJ, Dallapiccola B, Auburger G, Wood NW (2004) Hereditary early-onset Parkinson's
disease caused by mutations in PINK1. Science 304: 1158-1160.
Valette H, Syrota A, Deleuze P, Crouzel C, Delforge J, Fuseau C, Loisance D (1995) Late sympathetic
reinnervation and normalization of canine myocardial beta-adrenergic receptor density following
denervation. J Nucl Med 36: 1727.
van der PH, Wiederhold KH, Probst A, Barbieri S, Mistl C, Danner S, Kauffmann S, Hofele K, Spooren WP,
Ruegg MA, Lin S, Caroni P, Sommer B, Tolnay M, Bilbe G (2000) Neuropathology in mice expressing
human alpha-synuclein. J Neurosci 20: 6021-6029.
van Duijn CM, Dekker MC, Bonifati V, Galjaard RJ, Houwing-Duistermaat JJ, Snijders PJ, Testers L,
Breedveld GJ, Horstink M, Sandkuijl LA, van Swieten JC, Oostra BA, Heutink P (2001) Park7, a novel locus
for autosomal recessive early-onset parkinsonism, on chromosome 1p36. Am J Hum Genet 69: 629-634.
Vanhaesebroeck B, Leevers SJ, Ahmadi K, Timms J, Katso R, Driscoll PC, Woscholski R, Parker PJ,
Waterfield MD (2001) Synthesis and function of 3-phosphorylated inositol lipids. Annu Rev Biochem 70: 535602.
Verdi JM, Anderson DJ (1994) Neurotrophins regulate sequential changes in neurotrophin receptor
expression by sympathetic neuroblasts. Neuron 13: 1359-1372.
Vetter ML, Martin-Zanca D, Parada LF, Bishop JM, Kaplan DR (1991) Nerve growth factor rapidly stimulates
tyrosine phosphorylation of phospholipase C-gamma 1 by a kinase activity associated with the product of
the trk protooncogene. Proc Natl Acad Sci U S A 88: 5650-5654.
Vila M, Przedborski S (2003) Targeting programmed cell death in neurodegenerative diseases. Nat Rev
Neurosci 4: 365-375.
144
Bibliografía
Vila M, Vukosavic S, Jackson-Lewis V, Neystat M, Jakowec M, Przedborski S (2000) Alpha-synuclein upregulation in substantia nigra dopaminergic neurons following administration of the parkinsonian toxin
MPTP. J Neurochem 74: 721-729.
Viswanath V, Wu Y, Boonplueang R, Chen S, Stevenson FF, Yantiri F, Yang L, Beal MF, Andersen JK
(2001) Caspase-9 activation results in downstream caspase-8 activation and bid cleavage in 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease. J Neurosci 21: 9519-9528.
von Coelln R, Thomas B, Savitt JM, Lim KL, Sasaki M, Hess EJ, Dawson VL, Dawson TM (2004) Loss of
locus coeruleus neurons and reduced startle in parkin null mice. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 1074410749.
Wakabayashi K, Engelender S, Yoshimoto M, Tsuji S, Ross CA, Takahashi H (2000) Synphilin-1 is present
in Lewy bodies in Parkinson's disease. Ann Neurol 47: 521-523.
Wakabayashi K, Matsumoto K, Takayama K, Yoshimoto M, Takahashi H (1997) NACP, a presynaptic
protein, immunoreactivity in Lewy bodies in Parkinson's disease. Neurosci Lett 239: 45-48.
Wakabayashi K, Takahashi H (1997) Neuropathology of autonomic nervous system in Parkinson's disease.
Eur Neurol 38 Suppl 2: 2-7.
Wallace RA, Boldry R, Schmittgen T, Miller D, Uretsky N (1984) Effect of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6
tetrahydropyridine (MPTP) on monoamine neurotransmitters in mouse brain & heart. Life Sci 35: 285-291.
Watanabe T, Ono Y, Taniyama Y, Hazama K, Igarashi K, Ogita K, Kikkawa U, Nishizuka Y (1992) Cell
division arrest induced by phorbol ester in CHO cells overexpressing protein kinase C-delta subspecies.
Proc Natl Acad Sci U S A 89: 10159-10163.
Weinreb PH, Zhen W, Poon AW, Conway KA, Lansbury PT, Jr. (1996) NACP, a protein implicated in
Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry 35: 13709-13715.
Whitworth AJ, Wes PD, Pallanck LJ (2006) Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for
Parkinson's disease. Drug Discov Today 11: 119-126.
Wilkinson KD, Lee KM, Deshpande S, Duerksen-Hughes P, Boss JM, Pohl J (1989) The neuron-specific
protein PGP 9.5 is a ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Science 246: 670-673.
Wyatt S, Davies AM (1995) Regulation of nerve growth factor receptor gene expression in sympathetic
neurons during development. J Cell Biol 130: 1435-1446.
Wyatt S, Pinon LG, Ernfors P, Davies AM (1997) Sympathetic neuron survival and TrkA expression in NT3deficient mouse embryos. EMBO J 16: 3115-3123.
Xia XG, Harding T, Weller M, Bieneman A, Uney JB, Schulz JB (2001) Gene transfer of the JNK interacting
protein-1 protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S
A 98: 10433-10438.
Xing J, Kornhauser JM, Xia Z, Thiele EA, Greenberg ME (1998) Nerve growth factor activates extracellular
signal-regulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways to stimulate CREB serine 133
phosphorylation. Mol Cell Biol 18: 1946-1955.
Yamada M, Ohnishi H, Sano S, Nakatani A, Ikeuchi T, Hatanaka H (1997) Insulin receptor substrate (IRS)-1
and IRS-2 are tyrosine-phosphorylated and associated with phosphatidylinositol 3-kinase in response to
brain-derived neurotrophic factor in cultured cerebral cortical neurons. J Biol Chem 272: 30334-30339.
Yamazaki K, Wakasugi N, Tomita T, Kikuchi T, Mukoyama M, Ando K (1988) Gracile axonal dystrophy
(GAD), a new neurological mutant in the mouse. Proc Soc Exp Biol Med 187: 209-215.
145
Bibliografía
Yan KS, Kuti M, Yan S, Mujtaba S, Farooq A, Goldfarb MP, Zhou MM (2002) FRS2 PTB domain
conformation regulates interactions with divergent neurotrophic receptors. J Biol Chem 277: 17088-17094.
Yavich L, Jakala P, Tanila H (2006) Abnormal compartmentalization of norepinephrine in mouse dentate
gyrus in alpha-synuclein knockout and A30P transgenic mice. J Neurochem.
Yokota T, Sugawara K, Ito K, Takahashi R, Ariga H, Mizusawa H (2003) Down regulation of DJ-1 enhances
cell death by oxidative stress, ER stress, and proteasome inhibition. Biochem Biophys Res Commun 312:
1342-1348.
Zareparsi S, Camicioli R, Sexton G, Bird T, Swanson P, Kaye J, Nutt J, Payami H (2002) Age at onset of
Parkinson disease and apolipoprotein E genotypes. Am J Med Genet 107: 156-161.
Zarranz JJ, Alegre J, Gomez-Esteban JC, Lezcano E, Ros R, Ampuero I, Vidal L, Hoenicka J, Rodriguez O,
Atares B, Llorens V, Gomez TE, Del Ser T, Munoz DG, De Yebenes JG (2004) The new mutation, E46K, of
alpha-synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia. Ann Neurol 55: 164-173.
Zhang JM, Dix J, Langtimm-Sedlak CJ, Trusk T, Schroeder B, Hoffmann R, Strosberg AD, Winslow JW,
Sieber-Blum M (1997) Neurotrophin-3- and norepinephrine-mediated adrenergic differentiation and the
inhibitory action of desipramine and cocaine. J Neurobiol 32: 262-280.
Zhang JM, Sieber-Blum M (1992) Characterization of the norepinephrine uptake system and the role of
norepinephrine in the expression of the adrenergic phenotype by quail neural crest cells in clonal culture.
Brain Res 570: 251-258.
Zhang Y, Dawson VL, Dawson TM (2000) Oxidative stress and genetics in the pathogenesis of Parkinson's
disease. Neurobiol Dis 7: 240-250.
Zhang Y, Gao J, Chung KK, Huang H, Dawson VL, Dawson TM (2000) Parkin functions as an E2dependent ubiquitin- protein ligase and promotes the degradation of the synaptic vesicle-associated protein,
CDCrel-1. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13354-13359.
Zhou W, Hurlbert MS, Schaack J, Prasad KN, Freed CR (2000) Overexpression of human alpha-synuclein
causes dopamine neuron death in rat primary culture and immortalized mesencephalon-derived cells. Brain
Res 866: 33-43.
Zhou W, Schaack J, Zawada WM, Freed CR (2002) Overexpression of human alpha-synuclein causes
dopamine neuron death in primary human mesencephalic culture. Brain Res 926: 42-50.
Zhuo H, Ichikawa H, Helke CJ (1997) Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog Neurobiol 52: 79-107.
Zimprich A, Muller-Myhsok B, Farrer M, Leitner P, Sharma M, Hulihan M, Lockhart P, Strongosky A,
Kachergus J, Calne DB, Stoessl J, Uitti RJ, Pfeiffer RF, Trenkwalder C, Homann N, Ott E, Wenzel K, Asmus
F, Hardy J, Wszolek Z, Gasser T (2004) The PARK8 locus in autosomal dominant parkinsonism:
confirmation of linkage and further delineation of the disease-containing interval. Am J Hum Genet 74: 1119.
146