CONTROL BIOLÓGICO DE GREMMENIELLA ABIETINA CON ENDÓFITOS EN PLÁNTULAS DE PINO CARRASCO EN INVERNADERO Carmen Romeralo Tapia 1 Leticia Botella Sánchez 2 Oscar Santamaría Becerril 3 Julio Javier Diez Casero 1 1 Instituto Universitario de Investigación g en Gestión Forestal Sostenible,, Universidad de Valladolid-INIA, Palencia, España. 2 Universidad de Mendel, Brno, República Checa. 3 Universidad de Extremadura, Badajoz, Cáceres, España. Vitoria, 13 de Junio de 2013 Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet Masa de 50ha de Pino silvestre afectada por G. abietina en Suecia (Jesper Witzell) Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet • Destrucción ó de plantaciones y bosques naturales de confíeras fí por todo el mundo: en el centro y norte de Europa, NorteAmérica y Japón. • Hospedantes: géneros Pinus, Picea, Abies y Larix. • En España aislado de pies sintomáticos de Pinus Pin s halepensis. halepensis • No ha habido brotes epidémicos. • Aislado por primera vez en pino carrasco en 1999 (Santamaria et al. 2001) Área afectada Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet • • Síntomas: í Apariencia: Defoliación copas Picnidios Esporas Distorsión ramillos Micelio Gremmeniella abietina (Lagerberg) Morelet • C Control ld de la l enfermedad: f d d 1. Químico. Fungicidas: Maneb, Ziram, Cloralonil. 2. Medias selvícolas. Evitar la dispersión de la enfermedad (claras, eliminación de los árboles muertos, reducción de fuentes de inóculo). 3. Mejora genética: hospedantes/árboles resistentes. 4. Biológico: antagonistas; i.e., Phaeotheca dimorphospora, Trichoderma, Gliocladium sp. Control biológico • • Método Mét d alternativo lt ti de d control t l de d enfermedades f d d de d las l plantas. l t Los L productos d t químicos í i van en detrimiento por su peligroso efecto en el medio ambiente. Los principales mecanismos de control biológico se basan en diferentes tipos de interacción entre el organismo y su antagonista (HEYDARI & PESSARAKLI, 2010 ): 1)Micoparasitismo. 2)Antibiosis. 3)Producción de metabolitos. 4)Competición por nutrientes. 5)Inducción de la resistencia. Defensa de las plantas a los patógenos 1)) Defensas p preformadas o p preexistentes (y (ya están en la p planta antes del ataque q o contacto con el patógeno). 1.1. Estructurales (cutícula tricomas, (cutícula, tricomas células lignificadas) lignificadas). 1 1) 1.2. Químicas preformadas (metabolitos secundarios). secundarios) Defensas f inducidas (se activan como consecuencia del contacto con el patógeno). 2.1. Estructurales (cambios en la estructura y función de la pared celular). 2.2. Bioquímicas (mayor concentración de compuestos, liberación de compuestos fungitóxicos…etc). Metabolitos secundarios Funciones: • Defensa contra predadores y patógenos. • Agentes alelopáticos. • Atrayentes de polinizadores o a los dispersores de las semillas • Ejemplo: la presencia de altos niveles de compuestos fenólicos en algunas maderas ha explicado su protección natural contra la pudrición. Hongos endófitos • Los endófitos óf incluyen a cualquier organismo que vive dentro de la planta que resulte neutral beneficioso o perjudicial para su hospedante. • Están presentes en todas las plantas, muy extendidos en la naturaleza. • Han sido registrados como agentes de control biológico (e.g. (e g Trichoderma). Trichoderma) • Son capaces de activar el sistema de defensa inducido de la planta mediante la activación ó de las rutas metabólicas ó secundarias, produciendo compuestos fenólicos que protegen a la planta. • Pero también 1)Micoparasitismo. Micoparasitismo 2)Antibiosis. 3)Producción de metabolitos. 4)Competición por nutrientes. 5)Inducción de la resistencia. Objetivos Evaluar el efecto de la presencia de varios endófitos ó en la infección ó producida por el patógeno Gremmeniella abietina en plántulas bajo condiciones de invernadero. Nuestra hipótesis: ¿Podrán los endófitos reducir o inhibir el crecimiento del patógeno?. Materiales y Métodos • Plántula á de pino carrasco de 2 años ñ de edad : Altura: 17,03 ± 3,22cm Diámetro: 3,23 ± 1,03mm • Seis aislados de Gremmeniella abietina. • Cinco endófitos aislados de pies sanos de pino carrasco : - Trichoderma sp. sp - Aureobasidion pullulans - Aureobasidion sp. - Dothiomycete sp. - Endófito 20.3 (no encontrado enGenBank). Inoculaciones - En Diciembre para imitar el patrón de comportamiento del hongo. Proceso: 10 cm del ápice Quitar acículas • • • • • Pinus halepensis. Combinación (aislado*endófito) x 8. En total: 336 plántulas. Todo el experimento repetido (x2). Variables respuesta: Longitud relativa de la necrosis, Contenido en fenoles totales. Bisturí Micelio Cubrir con Parafilm Corte por la mitad con bisturí Medición de la plántula La longitud relativa de la necrosis se calculó: Longitud delanecrosis LRN Longitud g dela p plántula Medición de la necrosis Fenoles totales (Singleton & Rossi 1965; Robles et al. 2003) (1) Cortar un trozo de 10cm de la plantula (4) Extraer los fenoles con methanol al 70%. 70% Reacción colorimétrica (2) Secar en estufa a 40ºC 1 semana (3) Moler hasta polvo fino (5) Cuantificar el contenido en fenoles con un espectofotómetro (absorbancia a 760nm) Re aislamiento de G.abietina (1) Cortar un trozo de 2cm con necrosis (2) Liofilizar durante 24h (3) Moler a polvo fino Mycol. Res. 104 (5) : 527–532 (May 2000) PCR detection of Gremmeniella abietina, abietina the causal agent of Scleroderris canker of pine Richard C. HAMELIN, Martin BOURASSA, Jimmy RAIL, Mathieu DUSABENYAGASANI Volker JACOBI and Gaston LAFLAMME DUSABENYAGASANI,Volker (4) Extracción de ADN (5) PCR Anidada cebadores específicos NSGrem 3-4-5-6 específicos. 3456 Re e aislamiento a s a e to de G G. ab abietina: et a PCR C a anidada dada Región 18S del ADN ribosómico Cebadores (primers) empleados: 1ª Ronda)) NS Grem 3// NSGrem 4 2ª Ronda) NS Grem 5/ NSGrem 6 BMC Microbiology Microbiolog 2005 5 5:65 65 Specific and sensitive detection of the conifer pathogen Gremmeniella abietina by nested PCR Qi Yi Zeng, Qing-Yin Z P Hansson Per H and d Xiao-Ru Xi R W Wang Res ltados Resultados Seis meses después de las inoculaciones todos los endófitos redujeron la necrosis comparados d con los l controles. t l Longitu ud relativa de la a necrosis 0,3 a 0,25 b 02 0,2 b b b b 0,15 0,1 0,05 0 Aureobasidion sp. Aureobasidion pullulans Endófito 20.3 Endófito Dothiomycete sp. Trichoderma sp. Control Contenido en Fenoles totales 0,8 R² = - 0,64 p < 0,001 N= 112 Longgitud relativa de la necrosiss 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 500 1000 1500 2000 Contenido en fenoles totales (Equivalentes en ácido gálico/peso seco) 2500 • Correlación Pearson p=0,05. • Plantas con mayor necrosis tenían menor contenido en fenoles totales. p • Activación del sistema de resistencia inducido de la planta. 3000 Re aislamiento de G. G abietina • Cuerpos de fructificación: el 41,86% de las plantas mostraron picnidios. PCR anidada: resultados preliminares M Gel electroforesis 2% Agarosa 120V, 70 minutos 850 pb b Detección de G. abietina con cebadores específicos. C C C Conclusiones 1 1. La presencia en las plántulas á de los hongos endófitos óf redujo la necrosis producida por Gremmeniella abietina de forma significativa en comparación con las plantas control. Todos los endófitos produjeron esta reducción. 2. El contenido en fenoles totales estuvo relacionado de forma inversamente proporcional a la longitud de la necrosis; es decir las plantas con menos necrosis presentaron mayor contenido en fenoles totales lo que coincide con la bibliografía y sugiere la activación del sistema de defensa inducida de la planta por parte de los hongos endófitos. 3. El método más apropiado para comprobar qué hongo estaba produciendo las necrosis en nuestro experimento fue la extracción de ADN y la amplificación mediante 2 rondas de PCR de una región específica de G. abietina mediante dos cebadores de la especie. Agradecimientos Proyecto del Ministerio AGL2008 AGL2008-03622 03622 Control Biológico de Gremmeniella abietina en España Contacto [email protected]; [email protected]