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LISA KIT PSA TOTAL
Inmunoensayo de la Enzima para la Determinación Cuantitativa del
Antígeno Prostático Específico (PSA) en el Suero Humano
Solo para diagnóstico In Vitro
Para uso exclusivo en laboratorios clínicos o de gabinete
Conservar entre 2°C a 8°C
NOMBRES COMUNES Y DE PROPIEDAD
Inmunoensayo de la Enzima de PSA
USO DESTINADO
LisaKIT PSA es un test en microplaca para la detección y cuantificación
del antígeno prostático específico total (PSA) en suero.
INTRODUCCIÓN
El antígeno prostático específico es una proteína de unos 34.000 daltons
de peso molecular (en estado libre) y con actividad enzimática tipo serínproteasa que cumple un papel destacado en los procesos de licuefacción-gelificación del semen.
La utilidad de la detección del PSA radica en el hecho de ser uno de los
pocos marcadores tumorales cuya detección por encima de determinada
concentración presenta utilidad clínica en el diagnóstico y monitorización
del cáncer de próstata, segundo cáncer masculino en importancia y el
más significativo en edades avanzadas. Concentraciones bajas de PSA
son normales en adultos sanos pero se incrementan en la patología prostática, concretamente en la hiperplasia benigna de próstata y en el cáncer
de próstata.
LisaKIT PSA puede usarse como test de serodiagnóstico cuantitativo,
confirmatorio y/o suplementario a los resultados obtenidos con test de
exploración digital rectal o con los derivados de la ultrasonografía transrectal.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
El PSA presente en el suero reacciona con los anticuerpos monoclonales
específicos contra PSA que recubren los pocillos de la microplaca. Este
complejo de anticuerpos-PSA es reconocido por los anticuerpos monoclonales contra PSA existentes en el conjugado inmunoenzimático. Posteriormente se produce una reacción coloreada que cuantifica el PSA
existente en la muestra según la concentración en la que se encuentra, valorado espectrofotométricamente de acuerdo a una curva de calibración que proporciona el set de calibradores incluidos en el kit.
REACTIVOS
Materiales abastecidos con el equipo de prueba:
1. Pozos de MicroElisa recubiertos con Anticuerpo Monoclonal Murino
Anti-PSA Humana, con 96 pozos.
2. Estándares de referencia de PSA, que contienen: 0.0, 0.8, 4, 10, 20,
100 ng/mL. Líquido
3. Reactivo de Conjugado, Líquido
4. Solución de Sustrato TMB. 1 Frasco
5. Solución de Paro. 1 Frasco
Cat. OP-7004-001
VER.1
Materiales requeridos pero no abastecidos
1. Pipetas de precisión variable.
2. Puntas para pipetas desechables.
3. Agua destilada o desionizada
4. Mezclador Vórtex o equivalente.
5. Papel absorbente o toalla de papel
6. Papel cuadriculado
7. Un lector de MicroElisa.
METODOLOGIA
PASOS PREVIOS
1. Atemperar todos los reactivos a Tª ambiente antes de ser usados.
2. Sacar el nº de dobles tiras necesarias para el nº de muestras a procesar, e inmediatamente cerrar de nuevo la bolsa que contiene el resto
de los pocillos no utilizados y los desecantes para minimizar el contacto
con la humedad. Tener mucho cuidado de no agujerear o rasgar la bolsa.
Si se usa un lavador de placas rellenar el soporte con dobles tiras no
pegadas o inhabilitadas.
ADVERTENCIA: La exposición de los pocillos a la humedad o contaminación por polvo u otras partículas puede originar la degradación del
anticuerpo monoclonal y la obtención de resultados erróneos. Por este
motivo, cuando no se utilice la totalidad de la microplaca y sobren dobles
tiras de pocillos, deben cerrarse junto al silicagel o desecante y sellarse
dentro de la bolsa utilizando la cremallera o zip suministrada para evitar
la degradación por efecto de la humedad.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Etapa 1
Etapa 2
Calibradores
Muestras
25 µL
25 µL
Conjugado
TMB
Sol. Paro
75 µL
Incubación 1 hora a 37°C
Lavar 6 veces con agua destilada o desionizada
Etapa 3
100 µL
Incubar 15 minutos a T° ambiente
Etapa 4
100 µL
Leer a 450 nm, 405 nm y 620 nm
1. Adición de la muestra. Pipetear 25 μL de cada uno de los calibradores
y muestras, por duplicado, a Los pocillos correspondientes.
2. Se recomienda que la dispensación de las muestras y los calibradores
se haga lo más rápidamente posible.
3. Inmediatamente después, pipetear 75 μL del conjugado a cada uno de
los pocillos.
4. Incubar los pocillos 1 hora a 37 ºC tapándolos con el plástico adhesivo.
5. Lavar 6 veces con 250-350 μL de agua destilada o desionizada con en
el lavador de placas, y si no se tiene, manualmente.
6. Aplicar 100 μL de la solución sustrato-cromógeno a cada uno de los
pocillos.
7. Incubar 15 minutos, en oscuridad.
8. Frenar la reacción dispensando 100 μL de la solución de frenado.
9. Leer la absorbancia a 450 nm, y si es posible a una longitud de onda
Distribuido por:
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1
entre 620 y 690 nm (para minimizar las interferencias debidas a las
imperfecciones de la placa y suciedad) y a 405 nm (para calcular la concentración en aquellas muestras cuyo valor a 450 nm supere el rango de
absorbancia máxima del equipo). Efectuar estas lecturas antes de que
hayan transcurrido 30 minutos desde el frenado.
ADVERTENCIA: La adición de los volúmenes descritos debe ser lo más
exacta posible para garantizar el valor correcto del resultado.
LAVADO
El proceso de lavado es crítico. Una placa lavada incorrectamente implica
unos resultados inexactos y con altos ruidos de fondo.
El lavado manual se realiza de la siguiente forma:
1. Verter el contenido de los pocillos a un contenedor adecuado.
2. Sacudir los pocillos sobre papel absorbente seco.
3. Añadir entre 250 y 350 μl de agua destilada o desionizada a cada
uno de los pocillos con una pipeta multicanal.
4. Agitar con cuidado la microplaca sobre una superficie plana.
5. Repetir este proceso tantas veces como número de lavados haya en
el protocolo de trabajo, en este caso 6 veces.
PRECAUCIONES
1. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo descrito en estas
instrucciones, de no ser así, no se pueden garantizar la fiabilidad y
repetitividad de los resultados.
2. Utilizar todos los reactivos para uso únicamente in vitro.
3. Hacer un esquema identificativo en un papel sobre la correcta
posición de las muestras y los calibradores antes de usar el test.
4. Las muestras de los pacientes (sueros) pueden contener agentes
infecciosos y deberán ser tratadas y desechadas como materiales
biológicos potencialmente peligrosos.
5. Evitar la formación de burbujas y evitar tocar con la punta de pipeta
el fondo y/o paredes del pocillo de la microplaca en la dispensación
de Los reactivos y muestras del test.
6. No intercambiar los componentes de kits con distinto número de lote.
7. Antes de usarlos, dejar que todos los componentes del kit y muestras
alcancen la temperatura ambiente, pues reactivos y/o muestras fríos
pueden reducir la funcionalidad y sensibilidad del test. Se recomiendan de 20 a 30 minutos para alcanzar la temp. ambiente.
8. No usar los componentes del kit después de las fechas de caducidad.
9. La solución sustrato-cromógeno no se debe exponer a luz, agua,
oxidantes y metales.
10. En caso de rotura del envase, el producto puede ser utilizado si ninguno de los componentes ha sido dañado.
11. El producto usado debe desecharse conforme a la legislación vigente.
12. Algunos reactivos del kit contienen azida de sodio y/o ProClinTM 300
como agente conservante.
13. La azida sódica (NaN3) es altamente tóxica y reactiva en forma pura.
A las concentraciones en que se encuentra en el producto no es peligrosa. A pesar de ello, se recomienda utilizar prácticas de laboratorio
prudentes.
14. Cuando se desechen productos que contengan ProClinTM 300, dejar correr abundante agua para diluir el componente por debajo de
los niveles activos.
15. ProClinTM 300 es una marca registrada de Rohm and Haas Corp.
Philadelphia. PA
16. La solución de frenado contiene HCl 0,2 N. Evitar el contacto con
piel y ojos.
17. Se debe realizar una nueva curva de calibrado en cada análisis.
18. Evitar tocar el fondo de los pocillos con los dedos, pues ocasiona
resultados anómalos de absorbancia.
19. Evitar el secado de la microplaca después de la etapa de lavado. Proceder inmediatamente a la adición de la solución sustrato-cromógeno.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
• Se debe conservar refrigerado, a temperaturas comprendidas entre
2 y 8ºC (es imprescindible almacenarlo en nevera). Su fecha de caducidad está impresa en la envoltura.
• Una vez abierto debe consumirse antes de 6 meses.
MUESTRAS
• Pueden usarse muestras de sueros frescos y libres de turbidez. Las
muestras pueden guardarse en el refrigerador durante 1 o 2 días.
Para una conservación más prolongada, deben guardarse en el congelador a -20ºC. En este caso, la muestra será descongelada totalmente, llevada a temperatura ambiente y homogeneizada antes de
analizarla.
• El empleo de muestras con elevados grados de lipemia, hemólisis y
turbidez puede ocasionar resultados anómalos
RESULTADOS: CALCULOS
1. Calcular la absorbancia media a 450 nm para cada duplicado.
2. Restarle la absorbancia media de la lectura entre 620 y 690 nm.
3. Restarle a ese valor el correspondiente al blanco o CAL 0 (calculado
según los pasos anteriores).
(Abs450 muestra – Abs(620-690) muestra) – (Abs450 blanco – Abs(620-690) blanco)
4.
5.
6.
Haciendo uso de un software apropiado de ajuste de curvas obtener
la curva de calibración mediante las relaciones matemáticas Cuatro
Parámetros Logísticos o Función Sigmoidal Logística . Si no se dispone de dicho software representar gráficamente los valores así obtenidos para los patrones frente a sus respectivas concentraciones
en papel semilogarítmico, o haciendo uso de un software validado.
La concentración de PSA en la muestra se calcula por interpolación,
preferentemente en la zona lineal, de la curva de calibración.
La absorbancia de alguna de las muestras y calibradores puede ser
superior a 2, en tal caso, pueden estar fuera del rango de medida
del lector de microplacas. Por este motivo es necesario hacer una
lectura a 405 nm (longitud de onda de un hombro del pico de absorción) además de la de 450 nm (máximo del pico de absorción) y de la
lectura entre 620 y 690 nm (filtro de referencia usado para minimizar
las interferencias debidas a suciedad de la placa). Para calcular la
concentración de PSA de dichas muestras se procede de la misma
forma que en los pasos 1, 2, 3 y 4 pero realizando los cálculos con la
lectura a 405 nm, en lugar de la lectura a 450 nm.
Todas aquellas muestras cuyos valores de absorbancia estén por encima del rango lineal (incluida la absorbancia a 405 nm) deberán ser
diluidas. Como diluyente se usará un suero salino (ClNa al 0,9 %) no
suministrado en el kit.
VALORES DE REFERENCIA
Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal,
basado en grupos de población, técnica y equipos utilizados.
Los valores normales en varones sanos suelen ser menores de 4 ng/ml.
Valores Esperados
Ejemplo de una lectura típica de la curva de calibración.
2
ng/mL
450 nm
405 nm
620 nm
A450 - A620
A405 - A620
100
4.180
2.782
0.131
4.049
20
1.834
0.662
0.078
1.756
4
0.358
0.174
0.067
0.800
0.108
0.094
0.160
0.080
0.086
0
0.073
0.079
MUESTRA
N°
LisaKIT PSA (ng/mL)
SD
CV %
2.651
A
28
1.12
0.063
5.68
0.584
B
3.58
0.144
4.25
0.291
0.107
C
8.56
0.419
4.89
0.070
0.038
0.024
0.072
0.008
0.014
0.072
0.001
0.007
CONTROL DE CALIDAD
El ensayo será válido siempre y cuando el valor de la absorbancia a 450
nm del calibrador de 0 ng/ml sea inferior a 0,150. En este caso, comprobar visualmente la solución sustrato-cromógeno. Un color azul indica que
la solución está deteriorada debido a su incorrecto manejo o a que se ha
alcanzado la fecha de caducidad. Si no es así, dicho resultado se puede
deber a incorrectos tiempos de incubación. En este caso, repetir el análisis ciñéndose estrictamente al protocolo de trabajo detallado en estas
hojas de instrucciones.
ADVERTENCIA: Se recomienda la inclusión de un control de concentración conocida para asegurar que los datos obtenidos son correctos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Los resultados del test deben usarse en conjunto con informaciones
disponibles de la evaluación clínica del paciente y otros procedimientos de diagnóstico.
2. A pesar de que en la elaboración de este kit LisaKIT PSA se ha
tenido un cuidado máximo en la eliminación de las interferencias debidas a anticuerpos heterófilos, HAMA’s y factor reumatoide no se
descarta la posibilidad de obtener falsos positivos en muestras de
estos pacientes.
3. Para todas aquellas muestras cuyo valor de absorbancia sea superior al rango de trabajo, incluso realizando los cálculos con los valores
de la lectura a 405 nm, se recomienda diluirla con suero salino.
4. Los límites de cuantificación bajo y alto de LisaKIT PSA son 0.3 ng/
mL y 100 ng/mL
SENSIBILIDAD
El límite de detección de este kit se calculó de la siguiente manera:
– cálculo de la media y la desviación estándar de los resultados de una
muestra estadísticamente significativa de blancos.
– la suma de dos veces la desviación estándar a la media es la absorbancia que corresponde a la mínima concentración de PSA detectable que se
puede diferenciar del valor del blanco.
El kit LisaKIT PSA tiene un límite de detección de 0.050 ng/mL.
ESPECIFICIDAD Y EQUIMOLARIDAD
Los anticuerpos monoclonales utilizados en el test presentan una especificidad única para PSA, sin reacciones cruzadas con otras proteínas
del suero humano, pero a pesar de ello no se descarta la posibilidad de
obtener falsos positivos en muestras de pacientes con anticuerpos heterófilos, HAMA’s y factor reumatoide.
LisaKIT PSA detecta tanto PSA total, tanto PSA libre como PSA acomplejado con ACT (alpha-1- antiquimotripsina) de forma equimolar, realizando
diferentes mezclas con los standards W.H.O. de PSA libre 96/668 y de
PSA-ACT (90:10) 96/670 todas las cuantificaciones se encuentran en un
rango del ±15 %
REPETIBILIDAD - PRECISIÓN INTRAENSAYO
Se ensayan tres muestras repetidas 28 veces, de diferentes concentraciones para el cálculo de la repetibilidad, obteniendo CV < 6 %.
REPRODUCIBILIDAD
PRECISIÓN INTERDÍA
N=20
(NC)
SD
(NC)
CV
(NC)
(LPC)
SD
(NC)
CV
(NC)
(PC)
SD
(NC)
CV
LisaKit
PSA
1.14
0.104
9.12
4.15
0.297
7.15
9.48
0.595
6.27
Acces
Beckman
Coulter
1.16
4.18
9.70
Tres muestras de diferentes concentraciones son ensayadas durante 20
días para determinar la reproducibilidad respecto a la concentración asignada por Access de Beckman Coulter consiguiendo precisión y concordancia elevadas.
PRECISION INTERLOTE
La variación interlote obtenida es inferior al 30 %. Dos muestras fueron
analizadas con 5 lotes distintos obteniéndose los siguientes resultados:
LOTES
Muestras
001
002
003
004
005
Media
SD
CV
M1
6.25
9.02
7.75
7.36
8.79
7.834
1.124
14.35 %
M2
1.09
1.95
1.82
1.42
1.94
1.644
0.377
22.94 %
CORRELACION
Se han realizado estudios de correlación entre LisaKIT PSA y varios métodos de análisis de PSA obteniéndose los siguientes coeficientes de correlación:
Immulite ONE (DPC): R 0,952 Architect (Abbott): R 0,977 Diamed: R 0,973 Human: R 0,967 Access-2 (Beckman-Coulter)R 0,983 N es el nº de muestras incluídas en el estudio
N 283
N 32
N 77
N 74
N 98
EFECTO HOOK
Muestras tan elevadas en concentración como 20.000 ng/mL no poseen
efecto hook. Para una correcta cuantificación, muestras superiores al rango lineal es conveniente diluirlas.
RANGO LINEAL
LisaKIT PSA presenta un rango lineal entre 0.8 y 100 ng/mL.
SUSTANCIAS INTERFERENTES
Las sustancias indicadas en la tabla no producen interferencias en LisaKIT PSA a las concentraciones indicadas.
SUSTANCIAS
CONCENTRACIÓN
Acido Folico
20 µg/mL
Niacina
1 mg/mL
Acetaminofen
Aspirina
Ibuprofeno
1 mg/mL
2.5 mg/mL
2 mg/mL
3
Cafeína
500 µg/mL
Hemoglobina
0.75 mg/mL
Bilirrubina
0.24 mg/mL
Trigliceridos
8.57 mg/mL
hCG
500 UI/mL
Flutamida
500 µg/mL
Metotrexato
Etanol
20 µg/dL
5 g/dL
Tripsina
5 µg/mL
Alfa-quimotripsina
5 µg/mL
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FABRICADO POR:
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Camino Del Plano 19 E-50410
Cuarte de Huerva
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