AVALIACAO DA EFICIENCIA REPRODUCTIVA DO CACHACO

Rev. Bras. Reprod. Anim., Belo Horizonte, v.37, n.2, p.207-212, abr./jun. 2013. Disponível em www.cbra.org.br
Criopreservación de semen porcino: desafíos y perspectivas
Swine semen cryopreservation: challanges and perspectives
S. Williams
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, Argentina.
Correspondencia: [email protected]
Palabras-clave: criopreservación semen, verraco.
Keywords: boar, cryopreservation, semen.
Introducción
La criopreservación espermática es una biotecnología de gran trascendencia ya que tiene un papel
relevante en la conservación y difusión de recursos genéticos.
La gran desventaja de la inseminación artificial con semen refrigerado (IAR) respecto a la inseminación
artificial con semen congelado (IAC) es la limitación de la conservación de las dosis, siendo que en la primera se
pueden mantener de 2 a 8 días. Esto lleva a que los centros de inseminación deban ofrecer una producción y
reparto de dosis refrigeradas muy agilizado; logrando un menor rendimiento en la utilización de los animales
más selectos, debido a una limitación en el transporte de las dosis a grandes distancias, y una pérdida de un 10 a
un 30% de dosis seminales por caducidad.
En el caso del semen congelado, su conservación podría ser permanente, permitiendo el intercambio de
material genético a larga distancia y durante un período muy largo (años). Además, este período de tiempo puede
ser crucial para efectuar un control sanitario o genético del semen antes de su uso.
La congelación permite la creación de bancos de semen; de interés evidente en el caso de la
preservación de razas en peligro de extinción y de grandes posibilidades para la conservación de líneas o extirpes
de especial interés. Esto es importante desde el punto de vista comercial para asegurar la conservación de líneas
genéticas valiosas ante posibles situaciones desfavorables (epizootia, incapacidad para recogida,
infertilidad/subfertilidad por altas temperaturas).
A nivel práctico permite introducir material genético de gran valor sin los riesgos derivados de la
introducción de animales al establecimiento.
Los beneficios del uso de semen congelado son:
1. Una racionalización económica del eyaculado.
2. Realizar la recogida del semen solo en las épocas reproductivas más favorables.
3. El comercio internacional de dosis.
4. Mejor aprovechamiento de los verracos élite.
5. Mayor uniformidad de los animales producidos.
6. Suministro de material genético a granjas con dificultades de abastecimiento de semen fresco/refrigerado.
Como desventajas se pueden citar:
1. La reducida fertilidad y prolificidad de los espermatozoides criopreservados debido a los cambios
estructurales y funcionales que sufren los espermatozoides durante el proceso de criopreservación.
2. La disminución de la funcionalidad que dichos espermatozoides tienen en el tracto genital de las cerdas.
3. Las peculiares características anatómicas del aparato genital de la hembra que dificulta a los
espermatozoides el poder llegar al oviducto.
4. La mala calidad de los embriones producidos que condicionan su posterior viabilidad.
Las particularidades que tiene el espermatozoide del porcino hacen que sea muy sensible al choque por frío,
que produce una alteración de funcionalidad de la membrana espermática y la viabilidad celular se ve comprometida.
Esto provoca un acortamiento de la sobrevida del mismo y por ende de su período fértil. Se dice que sufren una
precapacitación con disminución de su vida útil en el tracto genital de las hembras. A esto se le suma la característica
de las hembras porcinas de tener un celo muy largo, con un período prolongado de ovulaciones en comparación con
otras especies, dificultando más la fecundación y prolificidad logradas con semen congelado.
Uno de los problemas a solucionar es el mayor costo que presentan las muestras seminales congeladas,
esto se debe a:
• El número de espermatozoides por dosis es sensiblemente mayor en el caso de semen congelado frente al
refrigerado para asegurar unos buenos resultados reproductivos (5-6 x 109 esp. vs. 2-3 x 109 esp.
respectivamente). Así de un solo eyaculado se pueden producir la mitad de dosis inseminantes.
• La producción de las dosis es más costosa en tiempo y materiales, requiere en equipamiento sofisticado y oneroso.
• El mantenimiento de las dosis en tanques de nitrógeno líquido es costoso.
•
Requiere una adaptación de los productores a una nueva técnica y capacitación del personal para el manejo
de semen congelado.
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Recebido: 19 de fevereiro de 2013
Aceito: 9 de abril de 2013
Williams. Criopreservación de semen porcino: desafíos y perspectivas.
Efecto de la criopreservación sobre la funcionalidad y estructura espermática
El proceso de la criopreservación incluye una serie de pasos, que producen alteraciones estructurales de
las membranas, alteración de la motilidad, modificación del medio interno, efecto sobre el citoesqueleto y
efectos sobre el núcleo:
1. Alteración estructural de las membranas (plasmática, acrosómica y mitocondrial): se produce una pérdida de
enzimas intracelulares y trastornos en el balance iónico, un detrimento de la permeabilidad selectiva del
plasmalema y trastornos en el metabolismo aeróbico y glucólisis anaeróbica, comprometiendo todas
aquellas funciones celulares energético-dependientes como la motilidad.
Se produce pérdida de enzimas responsables de la metabolización de los ROS (radicales del stress oxidativo)
y la disminución de los compuestos antioxidantes en el medio extracelular tras la dilución y/o centrifugación
previa a la congelación.
Las diferencias en la composición química de la membrana espermática podrían explicar la variabilidad
individual al congelado-descongelado.
2. Modificación del medio interno: alteraciones en el balance iónico de sodio, zinc, calcio que se acumulan en
el espacio intracelular, y del potasio y magnesio que salen masivamente de la célula. Esto se debe a que las
proteínas de la membrana que funcionan como bomba de iones disminuyen su actividad con el descenso de
temperatura.
3. Efecto sobre el citoesqueleto: se afecta su función estabilizadora del plasmalema, debido al comportamiento
de despolimerización y repolimerización dependientes de la temperatura.
4. Efectos sobre el núcleo: supercondensación de la cromatina nuclear con incremento en la fragmentación del
ADN del núcleo de los espermatozoides porcinos tras el proceso de congelación-descongelación.
Echegaray, afirma que para congelar semen de verraco es absolutamente necesario realizar una
selección previa de los animales que se van a utilizar: 1. Selección de los verracos por buena calidad seminal
(motilidad superior al 80%, vigor mayor a 4, y 80% de acrosomas normales), 2. Selección de verracos por buena
congelabilidad, considerándose como un mínimo exigible que las dosis descongeladas de los mismos presenten
al menos un 35% de motilidad individual.
Diferentes métodos para la evaluación de la integridad del acrosoma en semen diluido
Para evaluar la fertilidad potencial de un verraco, el análisis mínimo necesario para evaluar la calidad
del semen comprende el análisis de la concentración, motilidad y morfología; como estos parámetros tienen
limitaciones, otros análisis incluyen la evaluación de la membrana de espermatozoides y la integridad de la
acrosoma, que es esencial para la fecundación de ovocitos. Es importante determinar la capacidad de diferentes
métodos para evaluar la integridad del acrosoma (Williams et al., 2009a).
La evaluación mediante el uso de microscopio de contraste de fase distingue acrosomas intactos y
dañados, pero no el grado de daño. El Pisum sativum aglutinina es una aglutinina de arveja comestible que se
une glicoconjugados del acrosoma; tiene afinidad para los residuos de α-D-glucosil y α-D-mannosyl terminales
de glicoproteínas y se une específicamente a la α-manosido de azúcar que se encuentra en el contenido
acrosomal. El fluorocromo PSA tiñe los acrosomas dañados con un color amarillo-verdosos, y permite la
diferenciación entre espermatozoides intactos y espermatozoides sin acrosoma, con acrosoma dañado y con el
acrosoma presente sólo en la región ecuatorial. Basado en nuestros resultados, la técnica PSA mostró que este
procedimiento tiene una mayor capacidad para detectar grados de acrosoma dañado.
Medición de parámetros de calidad seminal según etapas durante el proceso de criopreservación
Desde los primeros estudios sobre la conservación del semen, se ha comprobado que el espermatozoide
del cerdo tiene mayor sobrevivencia a la conservación al estado líquido y refrigerado (15ºC) que a la
preservación por congelación. Con el descenso de la temperatura, hay una inevitable reducción de la proporción
de espermatozoides que mantiene la normal integridad de membrana, su ultraestructura y la composición
bioquímica. El proceso de congelación de semen porcino, comprende una serie de etapas que responden a las
características propias de la especie. Nuestro objetivo ha sido analizar las variaciones de la calidad espermática
de muestras de semen porcino, en respuesta a las etapas durante la congelación (Williams et al., 2009b).
Las variaciones en la motilidad y el vigor se estudiaron en semen: 1) fresco, 2) a 23ºC; 3) a 15ºC, 4)
previo al enfriamiento (a 5ºC, una vez diluido en medio comercial, Boarciphos A, IMV®) y 5) una vez
finalizado el enfriamiento y antes de la congelación (previa dilución con medio comercial Boarciphos B, IMV®)
La vitalidad y la integridad del acrosoma fueron analizados en fresco, y a los 23ºC y 15ºC. Todas las muestras
fueron descongeladas y analizadas, previa dilución en medios comerciales de descongelación. Los datos
obtenidos, se utilizaron para confeccionar curvas y demostrar las variaciones de la calidad de semen durante el
proceso de la criopreservación.
En la Fig. 1 puede observarse como desciende la calidad del movimiento y el vigor de todas las
muestras durante las diferentes etapas, previas a la congelación. La motilidad muestra una disminución del 13%
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(de 76 a 69%), luego del primer descenso térmico a 23ºC, sin embargo, se mantiene estable, hasta luego del
enfriamiento. La curva de vigor muestra una variación similar, observándose un descenso al principio, pero
estabilizándose durante el proceso. Sin embargo, la calidad del semen desciende marcadamente luego de la
descongelación, observándose que la motilidad disminuye casi un 25%, siendo más marcada el descenso en el
vigor (96%). El efecto deletéreo de la congelación-descongelación puede observarse sobre la vitalidad y la
integridad del acrosoma (Fig. 2) disminuyendo un 34 y 26%, respectivamente, luego de la descongelación. El
mayor daño se produciría con el descenso de las temperaturas, posiblemente por cambios en la estructura lipídica
de la membrana plasmática de la célula espermática (Maxwell y Johnson, 1997; Watson, 2000) Asimismo, la
cristalización del agua del medio e intracelular durante la congelación, provoca daños irreversibles, puestos de
manifiesto en la disminución de los parámetros estudiados (Courtens y Paquignon, 1985).
4,5
4,5
80
80
Vigor
Vigor
4,0
4,0
%
% de
de motilidad
motilidad
Vigor
Vigor
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
2,5
70
70
65
65
60
60
55
55
2,0
2,0
1,5
1,5
Motilidad
Motilidad
75
75
50
50
Fresco
23ºCC 15º
15ºC
23º
Fresco
C
5ºC A
5ºC B
B
5ºC
A 5ºC
Thaw
Thaw
45
45
Fresco
23ºCC 15º
15ºCC 5ºC
5ºC AA 5ºC
5ºC B
B
23º
Fresco
Momento de
de medición
medición
Momento
Thaw
Thaw
Momento de
de medición
medición
Momento
Figura 1. Variaciones de la motilidad y del vigor para semen porcino, según etapas del proceso de
criopreservación.
Vitalidad e integridad del acrosoma
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Fresco
23ºC
Vitalidad
15ºC
Thaw
Acrosomas
Figura 2. Variaciones de la vitalidad y la integridad del acrosoma para semen
porcino, según etapas del proceso de criopreservación.
Variaciones individuales en el perfil de ácidos grasos de espermatozoides porcinos
En los organismos aeróbicos el oxígeno es esencial para la vida, pero puede ser tóxico cuando se
presentan situaciones desfavorables en las cuales hay una producción exagerada de especies reactivas del
oxígeno (Hicks, 2001). Las membranas de los espermatozoides son ricas en ácidos grasos polinosaturados y son
sensibles al daño oxidativo mediado por el proceso de peroxidación lipídica (Sheweita et al., 2005). La
peroxidación lipídica es causa potencial de infertilidad en machos de numerosas especies. Los niveles en los
cuales los espermatozoides pierden movilidad in vitro se correlacionan con la tasa de peroxidación lipídica que
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sufren. Los espermatozoides porcinos son muy sensibles al proceso de congelación-descongelación (Watson,
1995), por lo cual es importante determinar el perfil de ácidos grasos y la susceptibilidad a la peroxidación
lipídica en muestras de semen porcino al estado fresco (Marmunti et al., 2009).
Las variaciones individuales en el perfil de ácidos grasos observadas en las muestras analizadas podrían
influir en la supervivencia del semen porcino de diferentes individuos al proceso de congelación-descongelación.
Se considera que la composición química de la membrana plasmática del espermatozoide es responsable de la
susceptibilidad al congelado entre especies (Parks y Lynch, 1992) Sin embargo diferencias intra especies podrían
contribuir a la variabilidad individual (Medrano y Holt, 1998).
Nuestros resultados indican que el semen porcino contiene grandes cantidades de ácidos grasos no
saturados, los cuales fueron vulnerables a la peroxidación lipídica. La alteración en la composición de los
mismos sería la base común de diferentes procesos degenerativos.
Efecto antioxidante de lycospersicum esculentum en ensayos con semen porcino
Quimioluminiscencia total (cpm x 10-3)
Los antioxidantes son sustancias que cuando se encuentran presentes en bajas concentraciones respecto
a los sustratos oxidables, retrasan o anulan la oxidación de dicho sustrato (Faudale et al., 2008) Existen
evidencias de que los carotenoides podrían actuar como antioxidantes para la prevención de muchas
enfermedades. El licopeno se halla casi exclusivamente en el tomate y sus productos. Se trabajó con muestras de
semen porcino durante las diferentes etapas del proceso de criopreservación: 1) a 15ºC, 2) 15ºC + medio
Boarciphos A (previo al enfriamiento), 3) a 5ºC + medio Boarciphos A y 4) a 5ºC + medio Boarciphos A + B
(Prenna et al., 2012a).
Los valores de emisión lumínica de las diferentes etapas del proceso de criopreservación (Figura 3)
fueron estadísticamente significativos cuando se compararon las muestras controles con las que contenían
ascorbato. Comparando los valores de la emisión lumínica de las muestras con ascorbato, se observó que en
presencia del antioxidante los valores fueron más bajos. Durante el proceso de peroxidación lipídica, se observó
que el porcentaje de ácidos grasos (AG) no saturados de las muestras tratadas con ascorbato (31,3%) disminuyó
significativamente con respecto a los controles (53,73%). El porcentaje de AG no saturados de las muestras con
el antioxidante fue de aproximadamente 62,03% siendo este valor similar al de las muestras controles (Prenna et
al., 2012a).
1200
control
ascorbato
1000
antioxidante
800
600
400
200
0
15
15+A
5+A
5+A+B
Figura 3. Valores de emisión lumínica de las diferentes etapas del proceso de
criopreservación.
Los antioxidantes previenen la lipoperoxidación utilizando diferentes mecanismos. El licopeno posee
una elevada capacidad in vitro para ligarse al oxígeno singulete. Nuestros resultados indican que la
lipoperoxidación podría ser uno de los mecanismos bioquímicos responsables de los cambios fisiológicos
durante la criopreservación. El licopeno ejerció un efecto protector ya que los principales AG no saturados no
fueron afectados por el proceso de lipoperoxidación.
Criopreservación de semen porcino utilizando distintas concentraciones de glicerol y
dodecil sulfato de sodio
Durante el proceso de congelación, con el descenso de la temperatura, hay una inevitable reducción de
la proporción de espermatozoides que mantiene la normal integridad de membrana, su ultraestructura y la
composición bioquímica, siendo el espermatozoide del cerdo el de mayor susceptibilidad respecto a otras
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especies. Para disminuir estas alteraciones, se utiliza el glicerol como crioprotector más un agente surfactante
como el dodecil sulfato de sodio (SDS: por sus siglas en inglés) con un efecto beneficioso al producir la
solubilización de las membranas y sus componentes (Peña et al., 1998). Se analizaron distintas concentraciones
de glicerol y de SDS para evaluar el impacto en la calidad espermática durante el proceso de congelacióndescongelación (Miglio et al., 2012).
Luego del enfriamiento a 5°C, cada eyaculado fue dividido en 4 alícuotas y diluidas en medios con
diferente concentración de glicerol y SDS: I) 4% de glicerol y 1% de SDS; II) 4% de glicerol y 0,5 % de SDS;
III) 2% de glicerol y 1% de SDS y IV) 2% de glicerol y 0,5% de SDS. Durante el proceso de congelación, se
tomaron muestras para contrastar la calidad seminal: 1) diluido a 23ºC; 2) a 15ºC, 3) a 15ºC, diluido en medio
comercial A (20% de yema de huevo); 4) 5ºC con medio A; 5) al finalizar el enfriamiento a 5ºC y con el
agregado del medio comercial B (yema de huevo, y glicerol+SDS en sus diferentes concentraciones) y 6)
descongelado diluido en medio comercial de descongelación. Se evaluaron en cada etapa motilidad (0-100%),
vigor (escala 0-5), vitalidad (tinción vital de eosina-nigrosina) e integridad del acrosoma (tinción fluorescente de
pisum sativum agglutinin). Se calcularon los índices de congelabilidad (coeficiente entre el valor de la muestra
descongelada/valor en cada paso del proceso, para cada uno de los parámetros), y la comparación entre los
medios I; II; III y IV se realizó por análisis de varianza (procedimiento CATMOD de SAS®, 2002).
Comparando los distintos valores de calidad evaluados, con los medios con glicerol al 4% (I y II) se
obtienen valores aceptables en todos los parámetros estudiados, resultados similares a los obtenidos por Corcuera
et al. (2007), quienes compararon distintas concentraciones de glicerol en el medio de congelación. Con respecto
a la concentración de SDS, los mejores resultados se obtuvieron con la menor concentración, resultando la mejor
combinación la de 4% de glicerol y 0,5% de SDS, coincidente con la utilizada por Córdoba-Izquierdo et al.
(2006).
Si bien sólo el medio IV mostró diferencias significativas en motilidad, considerando en conjunto los
demás parámetros (vitalidad y fundamentalmente acrosomía), se puede concluir que el medio II reúne las
mejores condiciones de protección a los espermatozoides a la injuria durante el proceso de criopreservación.
Daño ultraestructural en la membrana de espermatozoides porcinos durante el proceso de
congelación-descongelacion
Las alteraciones del espermatozoide porcino durante el proceso de congelación-descongelación pueden
ser diagnosticadas mediante el microscopio óptico, pudiéndose complementar con la microscopía electrónica
para evaluar el daño ultraestructural que sufre la célula espermática durante el proceso de congelación. Previo al
enfriamiento se prepararon dos alícuotas, las que fueron diluidas con diferentes volúmenes de los diluyentes de
enfriamiento, lo cual hizo que la concentración final de cada pajuela (0.5 ml) fuera de 300 ó 750 x 106
espermatozoides (T300 y T750 respectivamente). Se tomaron muestras pos-enfriamiento (5ºC) y al momento de
la descongelación (T300 y T750), las que fueron centrifugadas y fijadas para ser remitidas al Servicio de
Microscopía Electrónica. Se analizaron el grado de deformación de la membrana citoplasmática, a razón de 3
medidas en la cabeza/espermatozoide, expresadas en micras. El promedio de la separación entre membranas fue
de 0.05 ± 0,01; 0.28 ± 0,13, y 0.61 ± 0.42 a los 5ºC y a la descongelación para T300 y T750, respectivamente,
hallándose diferencias estadísticamente significativas (P < 0.01) entre 5ºC y T750. De los datos obtenidos se
puede concluir que la microscopía electrónica es una herramienta útil para confirmar el daño ultraestructural, y
pone en evidencia el efecto deletéreo del aumento del número de espermatozoides por pajuela (Prenna et al.,
2012b).
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