encefalopatía espongiforme bovina

CAPÍTULO 2.4.6.
ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA
RESUMEN
La encefalopatía espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurológica mortal, reconocida
por primera vez en 1986 en Inglaterra. Es la encefalopatía espongiforme transmisible o
enfermedad de los priones. El arquetipo de este grupo de enfermedades es el prurigo lumbar de
las ovejas y las cabras (véase el capítulo 2.7.13. Prurigo lumbar).
La epizootia de la EEB se puede explicar por la exposición oral a un agente semejante al del
prurigo lumbar en las proteínas derivadas de rumiantes que se incluían en los concentrados
cárnicos patentados como comida o en suplementos alimenticios. Los casos iniciales de EEB en
algunos países parecen ser el resultado de exportaciones de ganado infectado de Inglaterra o de
comida con derivados cárnicos contaminados, aunque ahora se implican también exportaciones de
otros países. Otros casos iniciales son claramente autóctonos, sin una relación clara con alimentos
cárnicos importados, lo que sugiere la existencia de casos previos no detectados. La epizootia está
en declive en muchos países como consecuencia de las medidas de control, Actualmente los
casos de EEB se dan en la mayor parte de Europa y también se han detectado en Asia y
Norteamérica.
Se ha demostrado la transmisibilidad experimental de la EEB al ganado tras exposiciones
parenterales y orales al tejido cerebral de ganado infectado. Se sospecha que el agente de la EEB,
es la fuente común, por la vía alimenticia, de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) en
otras especies de rumiantes y de félidos. Existe evidencia de una relación causal entre el agente
de la EEB y una nueva forma variante de EET, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ). Las
recomendaciones sobre medidas de seguridad en el manejo de material infectado con EEB se
basan en que esta enfermedad es una zoonosis y se le ha adscrito a la categoría 3 de contención
(con derogación).
Identificación del agente: En Inglaterra la EEB tuvo mayor incidencia en el ganado bovino de
entre 4 y 5 años. La duración clínica es variable pero puede prolongarse durante varios meses. Los
síntomas clínicos observados son lo bastante llamativos como para sospechar la existencia de la
enfermedad, particularmente si se eliminan otros diagnósticos diferentes. Los primeros síntomas
clínicos suelen ser sutiles y conductuales, y pueden llevar a la eliminación de animales afectados
antes de que se dispare la sospecha de EEB. En países con una política establecida contra la
enfermedad, los animales clínicamente sospechosos deben sacrificarse, analizarse los cerebros y
destruirse las correspondientes canales. Ahora la vigilancia activa en la mayoría de los países es
capaz de detectar el ganado infectado antes del reconocimiento de signos clínicos e incluso sin
dicho reconocimiento. En la actualidad no existe ninguna prueba de diagnóstico para la detección
del agente de la EEB en el animal vivo. La naturaleza de los agentes que causan las EET no está
clara. En la patogenia de estas enfermedades, presenta una importancia crítica una isoforma de
una proteína de membrana PrPc (originalmente denominada PrPsc) que es específica de la
enfermedad y parcialmente resistente a las proteasas, y que, según la hipótesis del prión,
constituye el único o el principal componente del agente infeccioso. La confirmación del
diagnóstico, que anteriormente se hacía mediante examen histopatológico del cerebro, se lleva a
cabo ahora mediante la aplicación de métodos inmunohistoquímicos (HIC) y/o inmunoquímicos al
tejido cerebral para la detección de PrPSc. La PrPSc se puede detectar en los loci neuroanatómicos
específicos en el SNC del ganado bovino afectado mediante métodos IHC en material fijado en
formalina o por inmunotransferencia u otros métodos de inmunoensayo en los que se usan
extractos de cerebro no fijados.
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
La transmisión desde los tejidos infectados, normalmente a ratones normales o transgénicos, es el
único método práctico disponible actualmente para detectar la infectividad y tiene un importante
papel en la confirmación o caracterización de las cepas causales. Se han detectado variantes o
formas atípicas de EEB en todos los continentes en los que ha ocurrido la EEB clásica. Mientras
que en la mayoría de los casos los fenotipos atípicos se han basado en modelos de bandas de
inmunotransferencia, la caracterización de algunos aislamientos mediante bioensayos proporciona
una evidencia inicial de la diversidad de cepas en las enfermedades priónicas que ocurren de
forma natural en el ganado.
Pruebas serológicas: En las EET no se han detectado respuestas inmunes específicas.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnóstico: En la actualidad no existen productos
biológicos disponibles. En muchos países se utilizan para el diagnóstico de la EEB kits
comerciales.
A. INTRODUCCIÓN
Se ha demostrado experimentalmente que la EEB puede transmitirse al ganado por vía parenteral y oral después
de la exposición a tejido cerebral de ganado afectado (20, 90). Estudios epidemiológicos británicos han revelado
un mayor riesgo en la descendencia de casos clínicos de EEB para desarrollar la enfermedad (27, 29, 30, 38,
98). No se ha establecido si esto se debe a una verdadera transmisión materna. Se considera que este riesgo no
es la causa del mantenimiento de la infección endémica de la población bovina en Inglaterra, y las estimaciones
de este riesgo se han revisado posteriormente a la baja (26).
La EEB es una enfermedad letal del ganado bovino, cuyos primeros casos se registraron en Gran Bretaña en
noviembre de 1986 (27, 37). Consiste en una encefalopatía espongiforme transmisible (EET) o enfermedad de
los priones, que originariamente se tipificó en el contexto de otras especies animales, tales como el prurigo
lumbar de las ovejas. Las enfermedades de los priones se definen por una acumulación patológica de una
isoforma anormal, parcialmente resistente a la proteasa, de una proteína de membrana codificada por el
hospedador y muy conservada (PrPC), que en un principio fue denominada como PrPSc, sobre todo en el sistema
nervioso central (SNC) y de forma más variable en el sistema linforeticular. No está claro cuál es la función de
PrPC. La PrPSc es la única macromolécula específica de la enfermedad identificada en las enfermedades de tipo
prurigo lumbar. También se la denomina de otras formas; como PrPres, para designar que la proteína anormal es
resistente a la proteinasa; PrPd para referirse a una determinada enfermedad; y PrPbse para referirse
concretamente a la EEB. En el presente texto utilizamos PrPSc en sentido genérico para referirnos a la isoforma
anormal PrPC. Una importante tendencia científica sostiene que el agente se compone solamente de una
isoforma PrP específica de la enfermedad y que la forma alterada es capaz de inducir la conversión de la forma
normal: es la hipótesis del “prión” o “solo proteína”. Menos evidentes son los datos que apoyan hipótesis
alernativas, como la que apunta a los orígenes víricos o bacterianos o la implicación de otros factores
coadyuvantes, como el desequilibrio de minerales. Permanecen inciertas las bases moleculares de la variación
de las cepas, pero, según la hipótesis del prión, las características de las cepas son codificadas en distintas
formas de proteína del prión.
La caracterización inicial de los aislamientos de EEB procedentes de Gran Bretaña mediante transmisión a
ratones demostró que, durante el curso principal de la epidemia, la enfermedad estaba causada por una única
cepa mayoritaria del agente que difiere de las caracterizadas para el agente del prurigo lumbar en las ovejas (4).
La uniformidad de la patología entre la mayor parte del ganado afectado también sirve de apoyo a la noción de
un fenotipo consistente de la enfermedad en el caso de la EEB (7, 30). Este modelo de neuropatología en la
especie hospedadora es una característica importante para definir un caso de EEB y para la confirmación de la
enfermedad. Los informes emitidos desde 2003 sobre los rasgos variables de la patología y/o las características
moleculares en varios países, han suscitado interrogantes sobre las posibles variaciones de la cepa causal de la
enfermedad de los priones en el ganado (3, 8, 21, 44). Independientemente de si tales hallazgos representan una
variación real del agente de la EEB o formas distintas de infección de los bovinos por los priones, tales hallazgos
deben ser verificados. Debido al hecho de que en la mayoría de los casos se han detectado mediante vigilancia
activa, se carece de historiales clínicos debidamente correlacionados y la mayoría se centran únicamente en
datos obtenidos por inmunotransferencia (3, 44). Las descripciones más exhaustivas, con datos sobre la
caracterización inmunohistoquímica (IHC), histopatológca y de inmunotransferencia corresponden a dos vacas
viejas de Italia (8). Se ha confirmado la posibilidad de transmitir ciertos aislamientos a ratones, con rasgos
diferentes a los de otros contagios de EEB anteriores. (2, 5). Se están realizando estudios sobre la transmisión
de otros aislamientos en el ganado. Un rasgo común de interés es que la mayor parte de estos aislamientos
proceden de ganado más viejo.
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Los primeros estudios epidemiológicos de la EEB en Gran Bretaña indicaron que aquella se presentaba en forma
de una epizootia de origen común, debida a la infección por un agente similar al del plurigo lumbar que se
trasmitía a través de la alimentación en los piensos a base de carne y de hueso como suplemento proteínico en
la alimentación (1, 39). Si bien los primeros casos registrados ocurrieron en el Reino Unido, (RU), la EEB ya se
han presentado, aunque con menos incidencia, en ganado importado o autóctono de muchos países. Lo más
probable es que tales casos se hayan debido directa o indirectamente a la exportación de ganado infectado o de
piensos a base de carne y de hueso procedentes de países con casos de EEB, incluido el RU. Es obvio que la
infección se ha propagado ulteriormente en países en los que se han dado casos cuya notoriedad se ha visto
aumentada por la evaluación del riesgo geográfico de la EEB (GBR) llevada a cabo en muchos países por el
Comité Directivo Científico de la Unión Europea (13). Es cierto que en algunos países los únicos casos
detectados reflejan una exposición autóctona en vez de una conexión directa con piensos de importación
contaminados (41). La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) proporciona estadísticas actualizada
sobre los brotes de EEB en todo el mundo (41).
No existe evidencia de transmisión horizontal de la EEB en el ganado bovino ni muchos datos que apoyen la
existencia de la transmisión materna (27). Los estudios epidemiológicos y de transmisión no han encontrado
evidencias de riesgo en el semen, en la leche ni a través de embriones (27).
A consecuencia de las medidas de control, la epizootia ha descendido en Inglaterra y otros muchos países, o
muestra los efectos del control en forma de cambios en la incidencia de la edad específica. En algunos países no
se han ejercido controles lo suficientemente largos como para reconocer los efectos. La interpretación del estado
de la epizootia se ha visto favorecida por la introducción de un seguimiento activo mediante pruebas de
diagnóstico rápido, que han detectado también animales infectados que no se habían reconocido como casos
clínicamente sospechosos. Mientras que la vigilancia activa es capaz de detectar una cierta cantidad de casos
preclínicos, la investigación retrospectiva en las granjas del origen de la enfermedad confirma, con frecuencia,
que se presentan algunos síntomas previos al sacrificio, pero no han despertado la consideración suficiente
como para establecer sobre ellos un diagnóstico clínico de la EEB.
Durante el transcurso de la epizootia de EEB se ha sospechado la existencia de EET en varias especies de
bóvidos y felinos exóticos mantenidos en cautividad y en gatos domésticos, y, respecto a varias especies
infectadas, se sabe que están causadas por el agente de la EEB (23). Se supone que la exposición tuvo lugar
por vía digestiva.
La aparición de la nueva forma de desorden de los priones en el hombre, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ), la llamada variante de ECJ (vECJ) en el RU (40) también se ha demostrado, mediante transmisión y
estudios moleculares (6, 10), que tiene una relación causal con el agente de la EEB. Se considera que la vía de
infección es la digestiva. En el pasado, no se ha establecido ninguna conexión entre la exposición del hombre a
los agentes causales de las encefalopatías espongiformes en animales y la existencia de la EET humana. La
EEB tiene como precedente la EET. De ahí que actualmente se recomiende que las medidas de seguridad para
el manejo del agente de la EEB se basen en la suposición de que la EEB se puede transmitir al hombre. La
epizootia vECJ en el RU en individuos homozigosos para el MM en el codón 129 del gen PrP, alcanzó el punto
culminante en el año 2000; en otros países se han producido números reducidos de casos.
En consonancia con la aparición de la vECJ, se debería adoptar un análisis de de riesgo cuando se haya de
determinar un nivel de contención para la realización de necropsias en animales sospechosos de padecer EEB o
al manejar tejidos procedentes de tales animales, pero cualquier procedimiento que produzca aerosoles debe
llevarse a cabo según el nivel 3 de contención (véase el capítulo 1.1.2. Bioseguridad y protección humana en el
laboratorio veterinario de microbiología y en las instalaciones de los animales) y el laboratorio debe cumplir las
normas sobre bioseguridad y biocontención para proteger a los operarios de la exposición al agente patógeno.
Los procedimientos recomendados para la descontaminación pueden no ser completamente efectivos cuando se
trata con material de un título alto o cuando el agente se protege en el interior de materia orgánica seca. La
inactivación física que se recomienda es un tratamiento en autoclave a 134°C–138°C durante 18 minutos a una
presión de 18 libras por pulgada cuadrada. Sin embargo, la temperatura no es siempre totalmente eficaz y la
inactivación completa puede no alcanzarse en determinadas condiciones, como cuando el material problema se
presenta en forma de macerado. La desinfección se lleva a cabo con hipoclorito sódico que contenga un 2% de
cloro libre, o con hidróxido sódico 2 N, aplicado durante más de 1 hora en el caso de superficies o durante toda la
noche en el caso de equipos (33).
B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
1.
Identificación del agente
La manifestación clínica de la EEB clínica, tal y como apareció en la epidemia más importante, ocurre en ganado
adulto, y la mayoría de los casos se observaron en ganado de entre 4 y 5 años. Con el declive de la epidemia, el
impacto de los controles efectivos se refleja en la mayor edad de los animales que contraen la enfermedad
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clínica (27). El comienzo de los signos clínicos no es estacional ni se relaciona con una fase del ciclo
reproductor. El inicio de la EEB pasa desapercibido y es seguido por un curso progresivo y lento (24, 38). En
ocasiones, se presenta un caso con signos agudos seguidos de un rápìdo deterioro, aunque la frecuencia de la
observación se convierte en un factor importante a la hora de determinar la presencia de los signos clínicos. Los
signos clínicos, aunque son variables, incluyen cambios de comportamiento, aprensión e hiperactividad. Por
ejemplo, las vacas afectadas pueden mostrarse reacias a entrar la sala de ordeño o patean con fuerza durante el
ordeño. En las vacas que no son no lecheras, los primeros síntomas visibles son la descoordinación de
movimientos y la debilidad de sus patas traseras. Los signos neurológicos predominan durante el transcurso del
período clínico y pueden incluir muchos aspectos de un estado mental, posturas anormales y de movimiento y
sensaciones anormales, aunque los síntomas nerviosos más comunes son aprensión, ataxia de las patas
posteriores e hiperestesia al contacto y a los sonidos. El prurito intenso que es característico en algunas ovejas
con prurigo lumbar no es destacable en el ganado bovino con EEB, aunque en algunos casos manifiestan
tendencia a rozarse y rascarse. A veces los animales afectados se mantienen con la cabeza baja, el cuello
extendido y las orejas dirigidas hacia atrás. La anormalidad en el andar incluye la agitación de los cuartos
traseros y la extensión de las patas; estas características se aprecian mejor cuando el ganado está pastando. La
ataxia también puede afectar a las patas delanteras y, a medida que aumenta la gravedad de los síntomas
motores, el cuadro clínico está dominado por una debilidad generalizada que ocasiona caídas y postración.
Aunque no son síntomas específicos, los informes sobre la rumia reducida (3, 5), la braquicardia y las
alteraciones del ritmo cardíaco sugieren que las perturbaciones autónomas constituyen una característica de la
EEB. A medida que la enfermedad progresa, los síntomas nerviosos se acompañan de manifestaciones clínicas
generales, como pérdida del aspecto normal, reducción del peso corporal y disminución de la producción láctea.
No ha habido cambios en la descripción clínica de la EEB a lo largo de la epizootia en el Reino Unido (24, 38).
Los síntomas clínicos en otros países donde se ha presentado la EEB son esencialmente similares. El desarrollo
clínico, que se extiende por lo general a un período de semanas o meses, requiere eventualmente el sacrificio
por consideraciones sociales. Una política establecida para determinar el estatus de un país en relación con la
EEB exige la declaración obligatoria y la investigación diagnóstica de casos clínicamente sospechosos, su
sacrificio y el examen post mórtem del cerebro. Al principio de la enfermedad los síntomas pueden ser sutiles,
variables e inespecíficos, y pueden enmascarar el diagnóstico clínico en un examen inicial. La observación
continua de esos casos equívocos, junto a los procedimientos adecuados de patología clínica para eliminar los
diagnósticos diferenciales, en especial desórdenes metabólicos, permitirán establecer la progresión de los
síntomas esenciales. Algunos síntomas tempranos de la EEB son similares a manifestaciones de la cetosis
nerviosa, carencia de magnesio, listeriosis encefálicas y otras encefalitis. Los síntomas clínicos, que a veces
pasan desapercibidos, se manifiestan con mayor intensidad en condiciones de estrés, como el causado por el
transporte. En la página web de la Agencia de Laboratorios Veterinarios y de Laboratorios de Referencia de la
Comunidad para la EET (ALV), de la Comisión Europea (15) pueden descargarse video-clips de ganado
afectado. Hay DVD o videocintas sobre los signos clínicos disponibles en esa y otras fuentes (35).
El diagnóstico laboratorial de la EEB ha evolucionado en consonancia con el progreso de los conocimientos
sobre la enfermedad y los adelantos técnicos. (17). A falta de métodos in vitro para el aislamiento del agente
causal, la confirmación convencional del diagnóstico de este grupo de enfermedades ha sido la demostración de
las características morfológicas de la encefalopatía espongiforme mediante el examen histopatológico. Este
sigue siendo, por definición, el único método con el que se puede diagnosticar esta patología vacuolar. El
diagnóstico original de la EEB se basaba en los aspectos histopatológicos de la encefalopatía espongiforme
similar al prurigo lumbar y la demostración por microscopía electrónica de fibrillas, denominadas fibrillas
asociadas a prurigo lumbar (SAF), que están fundamentalmente compuestas de PrPSc, en extractos de
detergente de cerebro afectado. El material examinado siempre procedía de casos clínicos sospechosos. En
vista de la rápida expansión de la epizootia en GB a finales de los años ochenta, el diagnóstico basado en el
examen de una única sección de la médula oblonga tomada a nivel del óbex fue validado frente a un examen
más extenso del tallo cerebral (34). Este enfoque simple propició la modificación del muestreo de cerebro fresco;
en lugar de la extracción del cerebro completo, se tomaba la sección adecuada del tallo cerebral extrayéndola
por agujero occipital con instrumentos especiales. Con el reconocimiento creciente de la especificidad
diagnóstica de PrPSc y, con la disponibilidad de anticuerpos adecuados y la eficacia creciente de los métodos de
detección, se utilizaron, para la confirmación del diagnóstico, métodos inmunoquímicos para detectar la
presencia de la PrP específica de la enfermedad, incluidas las técnicas de IHC e inmunotransferencia de SAF,
además de la histopatología. El uso de métodos in-vitro más rápidos para la detección de PrPSc propició la
implementación de diversas pruebas rápidas de enzimoinmunooensayo (ELISA) con muestras de médula
oblonga; estas pruebas constituyen el principal enfoque para el diagnóstico en la vigilancia activa. Permiten un
examen preliminar cuyos resultados positivos o dudosos se someten a examen por métodos de IHC o
inmunotransferencia. La estrategia de las pruebas rápidas se ha convertido en el principal enfoque para la
detección de casos y existe un amplio consenso para su utilización como parte del proceso de confirmación (15).
El uso de cada método particular depende del propósito del diagnóstico aplicado en el contexto epidemiológico y
de su validación a dichos efectos. Estos propósitos varían desde la confirmación del diagnóstico clínico en el
control de la enfermedad epizoótica al análisis de poblaciones sanas para evidenciar la enfermedad encubierta o
preclínica. La definición adoptada del caso patológico también variará en función del método de diagnóstico
aplicado para la confirmación de un caso clínico o para el muestreo de una población. Debe tenerse cuidado con
la interpretación de los datos de diagnóstico utilizando metodologías que no resistan una referencia cruzada con
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
los estándares para el diagnóstico confirmativo que se definen aquí. Esto es particularmente importante respecto
a la definición de cepa. Sin una comparación apropiada con criterios previamente publicados para la definición
del fenotipo de la EEB, y a falta de estudios de transmisión, los resultados por los que se reivindica la
identificación de una nueva cepa quizás sean prematuros. El control de calidad (CC) y la calidad de la
determinación (CD) son partes esenciales de los procedimientos de las pruebas y se puede obtener asistencia
de los laboratorios de referencia de la OIE (15, 42). Para la detección de animales infectados con EEB tanto por
vigilancia pasiva como por la activa, una buena práctica es detectar y confirmar la enfermedad mediante un
combinado de al menos dos métodos de prueba. La prueba primaria puede ser una de las pruebas de
confirmación descritas más adelante o una prueba rápida, pero es conveniente aplicar una prueba secundaria
para confirmar un resultado positivo o dudoso de la prueba primaria. Cuando los resultados de las pruebas
primaria y la secundaria sean contradictorios entre sí se deben aplicar pruebas adicionales utilizando la
inmunohistoquímica o la inmunotransferencia de fibrillas asociadas a prurigo lumbar (SAF) (o una alternativa
autorizada), o se deben enviar las muestras a un laboratorio de referencia para que emita una resolución.
a)
Simple preparation
La estrategia de muestreo se verá influenciada por el estatus de un país con respecto a la EEB, la relativa
implementación de programas de vigilancia activa o pasiva y los métodos de diagnóstico empleados.
En un país donde no se haya descrito la presencia de EEB, o esta es de baja incidencia, en todos los
casos de control pasivo de la enfermedad neurológica del ganado bovino adulto, se recomienda que los
casos clínicamente sospechosos se sometan a un enfoque neuropatológico estándar en el que se
examinen áreas representativas de todo el cerebro. Es más, debe tomarse la precaución de conservar
muestras de cerebro fresco para la detección inmunohistoquímica e inmunoquímica de PrPSc. El
incumplimiento de ese enfoque puede llevar a una caracterización inadecuada del caso a la hora de
confirmar si se trata de un caso típico de EEB. El ganado sospechoso de tener la enfermedad debe
sacrificarse con una inyección intravenosa de una solución concentrada de barbiturato, después de sedarlo
si es necesario. Tras la muerte del animal, debe extraerse el cerebro lo antes posible por métodos
estándares.
En principio, los tratamientos por histopatología e IHC se realizan sobre una única pieza (de entre 0,5 y
1 cm de anchura) cortada a nivel del óbex de la medula oblonga (fig. 1a y b, donde el nivel A–A representa
el bloque a examinar), que debe seleccionarse para fijarlo durante al menos 5 días en solución de
formaldehído al 4% (i.e. tampón salino con 10% de formol o formalina tamponada normal al 10% [NBF]) y
procesarse por histología mediante métodos convencionales de inclusión del tejido nervioso en parafina.
Al principio debe utilizarse material fresco para su uso en inmunotransferencia confirmativa para la
detección de la PrP específica de la enfermedad; el material debe consistir en una sección transversal
completa de la médula (2–4 g) inmediatamente craneal o caudal al bloque de óbex extraído para su fijación.
Como alternativa, se puede semi-seccionar la medula a nivel del óbex, tal como se ha descrito en relación
con la vigilancia activa (véase más adelante). El resto de las zonas del cerebro deben dividirse en dos
porciones mediante un corte sagital paramedial (a 0,5 cm de la mediana). La pieza más pequeña se reserva
para la detección de PrPSc por métodos inmunohistoquímicos (ej. Inmunotransferencia de SAF) y se guarda
congelada antes de la pruebas (en caso de que no se realice la prueba inmediatamente después de tomar
la muestra). Tras el muestreo de la región del óbex para fijación y el muestreo de tejido fresco, se coloca
intacta la pieza grande de tejido en aproximadamente 4–6 litros de fijador que contenga 10% de formol, que
debe cambiarse dos veces por semana. Tras la fijación durante dos semanas, se corta el cerebro en
porciones transversales. Puede reducirse el tiempo de fijación cortando en trozos transversales más
pequeños el tallo cerebral fresco (separado del resto del cerebro), de forma similar a la extracción inicial de
la región del óbex, pero dejando intactas las áreas transversales que son importantes para el diagnóstico a
nivel de los pedúnculos cerebelares y los culículos rostrales (figura 1a y b. niveles B–B y C–C
respectivamente). El tiempo de fijación de estas pequeñas porciones de tallo cerebral puede reducirse a 2–
5 días, dependiendo de otros factores (temperatura, agitación, espesor de la porción de tejido y el uso de
microondas). No obstante es necesario que la evaluación de los efectos de este tipo de procesamiento
sobre los protocolos de IHC posteriores se ajuste a los estándares para las pruebas de suficiencia. Después
de completer las dos semans estándar de fijación, las otras partes del cerebro fijadas con formol pueden
utilizarse para un diagnóstico diferencial.
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
Fig. 1. Tallo cerebral después de retirar el cerebelo, a) vista dorsal, y b) vista lateral.
Niveles recomendados para tomar las secciones:
A—A = médula en el obex; B–B = médula a través de los pedúnculos cerebelares caudales;
C–C = cerebro medio a través de los culículos rostrales.
Cuando en un país en particular se detecta la presencia de EEB en la población de ganado bovino
autóctono, con evidencias de que la distribución de las lesiones y otros determinantes fenotípicos
coinciden con los de los cerebros del ganado en la epizootia de Inglaterra, es adecuado , aunque no idel
extraer tan solo el tallo cerebral a efectos de control .
Esto se puede realizar por el agujero occipital sin extraer el calvario (fig. 2). Este procedimiento reduce la
cantidad de fijador utilizado así como el tiempo y equipo necesarios, disminuyendo costes y aumentando la
seguridad. De esta manera se pueden mantener las principales áreas que son objeto del examen
histológico. Este método permite la recogida y el tratamiento de un gran número de muestras para la
vigilancia pasiva o para un programa de vigilancia activa en los mataderos. Se disecciona la médula a
través del agujero occipital, sin abrir el cráneo, por medio de una cuchara especialmente diseñada, de
bordes afilados en su parte cóncava (fig. 2). Ese tipo de instrumento, de plástico o de metal, está disponible
en el mercado. Cuando el instrumento tiene diferentes formas, es posible que sea preciso variar la técnica,
incluida la orientación, lo que implica la necesidad de formar al operador sobre el uso del equipo convenido.
En condiciones de matadero, se ha demostrado la posibilidad de expulsar intacto el tallo cerebral por el
agujero occipital, proporcionando así un buen material histológico, mediante la aplicación de agua o aire a
presión (20) a través de la herida de entrada en el cráneo que se produce para dejar inconsciente al animal
durante el sacrificio. Es obvio que la viabilidad y eficacia de este método dependen del método de sacrificio,
y que su adopción para uso rutinario deberá someterse a un análisis de riesgo.
En zonas donde se identifica el índice de casos por vigilancia activa, puede carecerse de las áreas del
cerebro necesarias para una caracterización fenotípica completa. En la mayoría de los países, solo se
recoge el tallo cerebral (véase más adelante), incluso antes de la primera confirmación de EEB. En teoría,
se deben recoger cabezas muestreadas en el transcurso de la vigilancia activa hasta disponer de las
primeras pruebas. Esto facilita un muestreo amplio de cerebros de animales positivos y permite el enfoque
recomendado para la caracterización de los casos. Tal hecho es particularmente importante si se utilizan
pruebas que no están validadas y cuando se reivindica la identificación de nuevos fenotipos en ausencia de
comparaciones con los métodos aquí descritos.
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
Fig. 2. Después de separar la cabeza del cuerpo mediante un corte entre la vértebra atlas y los cóndilos occipitales
del cráneo, se coloca en un soporte con la superficie ventral hacia arriba (A), con el extremo caudal del tallo
cerebral (médula oblonga) visible por el agujero occipital (véase B, un dibujo agrandado del cráneo). Se inserta el
instrumento (C) a través del agujero occipital entre la paquimeninge y el aspecto ventral/dorsal (dependiendo del
enfoque específico) de la médula y se mueve hacia delante en sentido craneal, manteniendo la parte convexa del
instrumento apoyada contra el hueso craneal y realizando con ella un movimiento rotatorio de un lado a otro. Con
ello se separan las raíces del nervio craneal sin dañar el tejido cerebral. De este modo se hace avanzar al
instrumento en sentido rostral hasta una distancia de aproximadamente 7 cm en esa dirección y luego se realiza un
movimiento angular abrupto (i.e. hacia el plano dorsal/ventral del tallo cerebral, dependiendo del enfoque) cortando
y separando la médula oblonga (con algunos fragmentos del cerebelo) del resto del cerebro. A continuación, el
instrumento, mantenido en posición inclinada hacia abajo, se retira a del cráneo para que el tejido se deslice hacia
afuera pasando por el agujero occipital.
•
Muestreo de la médula oblonga para la vigilancia activa utilizando pruebas rápidas
El muestreo y procesamiento de tejido cerebral para uso en pruebas rápidas debe ajustarse estrictamente a
las especificaciones proporcionadas por el proveedor o fabricante del método o kit de la prueba. Los
detalles de ese procedimiento varían de un método a otro, pero tales cambios no deben aplicarse sin datos
de validación facilitados por el fabricante que avalen la variación de la metodología. La muestra preferida
para el enzimoinmunoensayo debe estar en el óbex o a 1 cm de distancia anterior o posterior del mismo,
situado en la zona anteroposterior a los lugares clave a estudiar (fig. 33) para la demostración de cúmulos
de PrPSc y la valoración del muestreo para las pruebas rápidas. Para la elección de los lugares diana debe
tenerse en cuenta el método ulterior de confirmación. Se debe fijar al menos una semisección de médula a
nivel del óbex para la inmunohistoquímica/histología. El muestreo de la medula anterior o posterior al óbex
para pruebas rápidas no compromete el examen por medios histológicos o inmunohistoquímicos. Sin
embargo, para obtener muestras que se puedan comparar de cara a la utilización de pruebas rápidas y
confirmativas, es preferible el muestreo por semisección de la médula a nivel del óbex. Aunque puede
disminuir la capacidad de valoración de la simetría en los cambios vacuolares, tal necesidad es menor si se
aplica un examen mediante una prueba más importante, como es la IHC. No obstante, si se adopta la
semisección, entonces resultará crítico asegurarse de que no estén dañados los lugares elegidos en
cualquiera de las dos muestras. Por ejemplo, el núcleo del tracto solitario y el núcleo motor dorsal del nervio
vago (áreas lesionadas en ganado con EEB) son pequeños y están situados relativamente cerca de la línea
media (fig. 3). Si se autolisa el tejido de muestra hasta el punto de resultar imposible la orientación
anatómica, aún así puede tomarse y probarse una alícuota. En tales casos, un resultado positivo seguirá
siendo positivo, pero un resultado negativo no se podrá considerar como indicador de un animal negativo,
debiéndose interpretar con precaución y ha de comunicarse con la debida cualificación.
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
Fig 3. Sección transversal de tallo cerebral bovino a nivel del óbex con identificación de los sitios clave a observar
para el diagnóstico de la EEB por histopatología e inmunohistoquímica (Esos sitios son fundamentalmente el núcleo
del tracto solitario [1] y el núcleo del tracto espinal del nervio trigémino [2]; pero también el núcleo motor dorsal del
nervio vago [3]. Se sobreentiende que el material utilizado en pruebas rápidas debe incluir esas áreas.
Una semisección puede ocasionar fácilmente la pérdida completa del área objetivo en la prueba
confirmativa y reducir, por tanto, la eficacia del programa de vigilancia. El muestreo inadecuado de las áreas
objetivo puede estar provocado por la manipulación errónea de los instrumentos de muestreo adecuados.
Tal enfoque debe basarse en una política clara y un programa de control de formación y de garantía de
calidad de los procedimientos de muestreo. Debido a la distribución de PrPres como objetivo específico, el
tamaño y localización de la muestra debe ser el especificado en el kit de diagnóstico, y, si no está
especificado, debe ser al menos de 0,5 g, tomados de las áreas objetivo de diagnóstico, en todas las
pruebas confirmativas, tal como se detalla en la figura 3. Las características de realización de algunas de
las pruebas puede verse afectadas por la autolisis, sobre todo debido a la pérdida de capacidad para
asegurar la representación muestral de todas las áreas que son objetivo del diagnóstico y que se detallan
en la figura 3.
b)
Examen para el diagnóstico
i)
Examen histológico
La histopatología ya no es el método preferido para la investigación de animales sospechosos, o el examen
de poblaciones sanas. Sin embargo, es importante tener en cuenta los cambios histopatológicos, a fin de
facilitar la detección de casos durante la realización de exámenes histológicos de los cerebros del ganado.
Para el diagnóstico diferencial, se cortan secciones de la médula–óbex de 5 µm de espesor y se tiñen con
hematoxilina y eosina (H&E). Si la cualidad del tejido lo permite, el examen histopatológico de secciones de
H&E permite la confirmación de los cambios neuropatológicos típicos de la EEB (30, 36) por los que la
enfermedad se detectó por primera vez como encefalopatía espongiforme. Esos cambios influyen, sobre
todo, en el cambio espongiforme y la vacuolización neuronal, y son muy similares a los de otras EET de los
animales, pero la gran frecuencia de la vacuolización neuroparenquimal en ciertos núcleos anatómicos de
la médula oblonga a nivel del óbex proporciona una forma satisfactoria de establecer un diagnóstico
histopatológico sobre una sola sección de la médula en casos clínicos sospechosos (34). Tal como ocurre
con otras especies, los cambios vacuolares en los cerebros del ganado, sobre todo las vacuolas que se
hallan dentro de los pericarios neuronales en los núcleos rojos y oculomotores del cerebro medio,
constituyen un hallazgo accidental (18). De ahí que el diagnóstico histopatológico de la EEB no deba
basarse solamente en la presencia de neuronas vacuolazas, sobre todo en esos lugares anatómicos.
El diagnóstico puede confirmarse si hay cambios morfológicos típicos en la médula a nivel del óbex, pero,
independientemente del diagnóstico histopatológico, también se emplea la inmunohistoquímica de forma
rutinaria, dado que hay evidencia no publicada de que el 5% de los casos clínicos sospechosos (que son
negativos tras el examen por H&E de los cambios vacuolares en el óbex) pueden diagnosticarse mediante
un examen por IHC. Está claro que este protocolo, que se limita al examen de la médula–óbex, no permite
un examen neuropatológico completo para alcanzar un diagnóstico diferencial, ni permite una
caracterización fenotípica plena de ninguna EET. Esa es la razón por la que se recomienda que se
extraigan cerebros enteros de los animales clínicamente sospechosos.
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Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
ii)
Detección de formas de PrP específicas de la enfermedad
El uso universal hoy en día de los métodos de detección de la PrP proporcionan un medio específico para
el diagnóstico de la enfermedad independiente de los cambios morfológicos determinados por el enfoque
histopatológico. De ahí que en la actualidad muchos laboratorios hayan mejorado o reemplazado el examen
histopatológico con IHC y otros métodos para la detección de PrP. La detección de cúmulos de PrPSc es el
método preferido para los programas de vigilancia y el diagnostico confirmativo. Es posible (aunque no
deseable) realizar la inmunohistoquímica para la PrP con material que se ha congelado antes de fijarlo (12).
La congelación antes de la fijación no influirá en la inmunoreactividad de la muestra, pero puede puede
influir en la identificación de los lugares objetivo que se han de examinar para poder registrar un resultado
negativo.
•
Métodos inmunohistoquímicos (IHC)
El examen de IHC para detectar la acumulación de PrPSc se aplica a secciones del mismo material de
médula cortado a la altura del óbex, fijado con formalina e incluido en parafina, que el utilizado para el
diagnóstico histopatológico (36). Se han utilizado con éxito varios protocolos para la detección de PrPSc
mediante IHC para el diagnóstico de la EEB, y, aunque sería de desear una armonización para conseguir
un método rutinario de diagnóstico por IHC plenamente validado, la experiencia nos enseña que es mucho
más importante el reconocimiento de métodos robustos que logren un resultado estandarizado, que estén
controlados mediante la participación en los ensayos de pruebas de eficiencia y la comparación con los
resultados de un método estandarizado modélico en un laboratorio de referencia. La técnica no requiere
necesariamente que la fijación de tejidos sea larga, aunque, por razones de precisión, son de aplicación las
directrices establecidas para la histopatología, y, si el tejido se puede procesar de forma adecuada por
histología, esa técnica es eficiente con tejidos autolisados cuya evaluación histológica ya no es posible (11,
25). Sin embargo, se requiere habilidad para reconocer la anatomía de la muestra a fin de determinar si las
áreas objetivo están representadas en la misma. Esto es esencial para un diagnóstico negativo, y también
puede ser crucial para interpretar con precisión un inmunomarcaje dudoso. La detección de acumulaciones
de PrPSc por IHC tiene es tan sensible como la inmunotransferencia para la detección de PrPSc (28). En
combinación con buenas preparaciones histológicas, la IHC permite detectar las acumulaciones de PrP
anormal. Como estas acumulaciones, de modo similar a lo que ocurre con la patología vacuolar, presentan
un modelo típico de distribución y apariencia, su detección supone una prueba simultánea o confirmativa
del fenotipo de la enfermedad. Existen métodos actualizados disponibles en los laboratorios de referencia
de la OIE (15, 42).
A diferencia de lo que ocurre con del diagnóstico del prurigo lumbar en las ovejas, la detección limitada de
la EEB en tejidos linfáticos no proporciona ninguna base para la utilización de dichos tejidos para el
diagnóstico preclínico mediante técnicas de biopsia.
•
Métodos de inmunotransferencia
Las técnicas de inmunotransferencia se realizan con tejido fresco no fijado, y se pueden aplicar con éxito
incluso con tejido autolisado. (19). La inmunotransferencia de SAF (15) fue el primer método de esas
características utilizado para el diagnóstico de la EEB. Es tan sensible como las técnicas de IHC, siendo el
método preferido, junto con la inmunohistoquímica, para la confirmación o descarte ante un caso
sospechoso de EEB. En la última década se han elaborado métodos menos costosos y con mayor rapidez
de aplicación. En la mayor parte de esas técnicas se utiliza un precipitado de PrPSc usando ácido
fosfotúngstico (PTA) u otras sustancias químicas, algunas de las cuales están disponibles en el mercado.
Si bien la metodología basada en la inmunotransferencia es de uso generalizado, la sensibilidad analítica
de la detección de PrPSc varía según los métodos empleados y los laboratorios. Cuando, a efectos de
confirmación, se prefieren los métodos internos a los publicados, es importante que los primeros se
sometan a una evaluación a fin de comprobar si son adecuados para el fin perseguido y que se evalúen con
la intervención de un laboratorio de referencia de la OIE.
•
Métodos de pruebas rápidas
Se han elaborado técnicas de inmunotransferencia y ELISA automatizadas para el análisis de un gran
número de muestras de cerebro que están disponibles en el mercado. Dichas técnicas se pueden aplicar en
pocas horas (véanse las evaluaciones de pruebas rápidas para la detección de la EEB en grupos de
muestras con resultados positivos y negativos por IHC llevadas a cabo por la CE [14]).
Mientras que muchos países y el grupo ad hoc de la OIE para la EEB aceptan la aprobación de la UE como
paso previo para la realización de la prueba, otros han establecido sus propios mecanismos de evaluación,
sobre todo los EE.UU. de América, Canadá y Japón (14, 26). La OIE también tiene su propio proceso de
aprobación y los protocolos para dichas evaluaciones están incluidos en la página web de la OIE (43),
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habiéndose aceptado la aprobación de la UE como el estándar de preferencia para las evaluaciones futuras
de la sensibilidad y la especificidad.
Aún está por determinar la sensibilidad relativa de las pruebas rápidas, la inmunohistoquímica y otros
métodos de confirmación. Es importante reconocer ese extremo al evaluar la realización de pruebas rápidas
cuando se ensayen animales que no presentan signos clínicos de la EEB. Las evaluaciones realizadas en
la UE se limitaron a comparar el examen de la muestra de cerebros de ganado identificado como animales
clínicamente sospechosos, con cambios histopatológicos típicos de la EEB, y una muestra de cerebros de
ganado de Nueva Zelanda que no había estado expuesto a la EEB y que era negativo por histopatología.
Las pruebas rápidas proporcionan un medio de examen preliminar de animales durante los últimos meses
del periodo de incubación, como, por ejemplo, en los exámenes del material post mórtem recogido de
ganado sacrificado en la forma habitual. En los países que tenían vigilancia para la detección de la primera
aparición de la EEB y en los países en los que se consideró necesaria la valoración de la prevalencia de la
EEB, independientemente de cuál fuese el sistema de notificación de los casos sospechosos, estas
pruebas de reconocimiento constituyen un enfoque eficaz. Desde la introducción de las mencionadas
pruebas en Europa en enero de 2001 para el análisis activo, a ellas se debe la identificación de la mayor
parte de los animales infectados por EEB. Debido a la rapidez con la que se obtienen los resultados, las
pruebas rápidas son las preferidas como pruebas primarias en algunos países, pero lo ideal es que la
confirmación del diagnóstico de la EEB se realice bien por examen de cerebro fijado por histopatología y/o
inmunohistoquímica o por la aplicación de un protocolo de inmunotransferencia adecuado. No obstante, en
2006 la OIE aceptó que mediante su utilización en programas de vigilancia, las pruebas rápidas disponibles
en el mercado han demostrado ser muy eficaces y fiables, siempre que se realicen por personal
debidamente formado. Ciertamente, a veces pueden ser superiores a las pruebas estándar reconocidas
para la comparación si la formación y la experiencia relativas a estas últimas son deficientes. En tales
circunstancias, se considera aceptable o incluso ideal el uso de un combinado de pruebas rápidas para el
examen primario en programas de vigilancia activa o pasiva o para la confirmación ulterior. Sin embargo, es
esencial garantizar que las pruebas primarias y secundarias elegidas son compatibles, y no conllevan el
peligro de generar positivos falsos a causa de los reactivos que comparten. Como consecuencia, en la
página web de la VLA se mantiene un algoritmo de las combinaciones de pruebas preferidas para ayudar a
quienes decidan seguir este enfoque en lugar de utilizar la histopatología y la inmunohistoquímica o la
inmunotransferencia de SAF como confirmación (15). La VLA no cambiará esta página web sin informar a la
OIE. Las combinaciones ideales deben incluir los métodos ELISA y la inmunotransferencia ya que estos
generan datos complementarios útiles para la caracterización fenotípica de la muestra a falta del examen de
tejido fijado.
En determinadas circunstancias, puede utilizarse una prueba rápida autorizada por la UE o la OIE para la
confirmación de la EEB en bovinos tras un resultado reactivo inicial de una prueba rápida autorizada. Dicha
aprobación depende de una supervisión de los reactivos utilizados en cada prueba rápida a fin de
garantizar que los pares de pruebas utilizados son compatibles entre sí. Sobre la base de los datos
confidenciales revelados por fabricantes de pruebas, existe ahora un procedimiento disponible que se
detalla a continuación:
1.
2.
3.
4.
5.
La confirmación siempre debe llevarse a cabo en un laboratorio nacional de referencia (LNR) para las
EET.
La segunda prueba debe incluir un control negativo y una muestra de de EEB bovina como control
positivo.
La segunda prueba debe ser una prueba diferente (en otras palabras, dos resultados positivos de una
misma prueba son insuficientes para la confirmación).
Si se utiliza una inmunotransferencia como primera prueba, ese resultado debe documentarse y
entregarse al LNR.
Uno de los dos métodos debe ser la inmunotransferencia.
La combinación de las dos pruebas rápidas solamente puede utilizarse para la confirmación de un caso de
EEB. El resultado negativo de una segunda prueba es insuficiente para dictaminar un caso como negativo
tras la aparición de un resultado positivo de una primera prueba. Se deben investigar los resultados
conflictivos de las pruebas rápidas en relación con los casos sospechosos de EEB utilizando la
inmunotransferencia de SAF (o una alternativa autorizada) o IHC para la demostración de PrPSc, o, si no se
dispone de estos métodos, la histopatología. Si no se puede confirmar el resultado reactivo inicial por
histopatología, deben enviarse las muestras al laboratorio de referencia de la OIE para su ulterior examen.
Aunque los programas de evaluación de las pruebas realizadas en Europa se realizaron en apoyo de la
legislación europea respecto al seguimiento de la EEB, las consecuencias son también relevantes para
otros países. La aparición de resultados falsos positivos y negativos es tan elevada que la introducción de
nuevas pruebas debería basarse antes en una cuidadosa evaluación de la prueba y de su realización. Las
pretensiones de los fabricantes deberían basarse en datos, evaluados preferiblemente de modo
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Capítulo 2. 4. 6. — Encefalopatía espongiforme bovina
independiente. Hay que destacar que el proceso de una validación completa de todos estos métodos de
diagnóstico de la EEB está limitado por la ausencia de un verdadero estándar de oro y por la consiguiente
necesidad de aplicar estándares de comparación que están basados en relativamente pocos estudios. Por
tanto, persiste la necesidad de que se publiquen estudios a gran escala sobre realización de las pruebas ya
que ninguno de los datos publicados hasta la fecha cumple los procedimientos reconocidos para la
validación de las pruebas de otras enfermedades.
d)
Otras pruebas de diagnóstico
Existe la necesidad de una prueba para la EEB que pueda aplicarse al animal vivo y que tenga una
sensibilidad capaz de detectar PrPSc a niveles bajos, como ocurre en las primeras fases del periodo de
incubación de la enfermedad. Aún no se ha demostrado la efectividad de los enfoques potenciales. La CE
sigue comprometida con las pruebas in-vivo, e indica los protocolos para la evaluación de tales pruebas
(16). La detección de ciertos marcadores de proteínas de la neurodegeneración, incluida la apoliproteína E
(Apo E), la proteína 14-3-3 y las proteínas S-100 en el líquido cerebroespinal no ha sido útil para el
diagnóstico de casos sospechosos de EEB. No se ha investigado para el diagnóstico de la EEB el potencial
diagnóstico de la observación de las cadenas ligeras de IgG como marcador de la infección por priones en
la orina (22, 29).
2.
Pruebas serológicas
Los agentes infecciosos de las enfermedades de priones no son fáciles de cultivar in vitro y no inducen una
respuesta inmune significativa en el hospedador.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNÓSTICO
En la actualidad no hay productos biológicos disponibles. Tal como se argumentó anteriormente, se han
autorizado kits de diagnóstico para su uso en muchos países.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la encefalopatía espongiforme bovina (véase el cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la lista más actualizada en la página web de la
OIE: www.oie.int).
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