Análisis de las señales bioquímicas y moleculares involucradas en

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Universidad Nacional de Tucumán
Análisis de las señales bioquímicas y
moleculares involucradas en la
colonización de frutilla (Fragaria
ananassa) por Azospirillum brasilense
Lic. María Fernanda Guerrero Molina
2013
Facultad de Agronomía y Zootecnia
A Mis Padres
Universidad Nacional de Tucumán
Autoridades
RECTOR
C.P.N. Juan Alberto Cerisola
VICERRECTORA
Dra. Alicia Bardón
SECRETARIO ACADÉMICO
Dr. Edgardo Cutín
Facultad de Agronomía y Zootecnia
Autoridades
DECANO
Prof. Ing. Agr. José Ramón Garcia
VICEDECANO
Ing. Agr. M. Sc. Héctor Rolando Navarro
SECRETARIO ACADÉMICO
Ing. Agr. Carlos Arnaldo Latina
Doctorado en Ciencias Biológicas
Autoridades
DIRECTORA
Dra. Mercedes Lizarralde de Grosso
VICE-DIRECTORA
Dra. Marta Inés Bühler
COMITÉ ACADÉMICO
Dr. Raúl Ricardo Raya
Dr. Atilio Pedra Castagnaro
Dr. Alfredo Grau
Trabajo de postgrado para la obtención del
grado académico superior de
DOCTOR/A EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
CARRERA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Acreditado y Categorizado A ante la
Comisión Nacional de Acreditación Universitaria (CONEAU)
Resolución n°: 615/07
Trabajo de postgrado titulado:
“Análisis de las señales bioquímicas y moleculares
involucradas en la colonización de frutilla (Fragaria
ananassa) por Azospirillum brasilense”
Tesista
Lic. María Fernanda Guerrero Molina
Director
Dr. Raúl Osvaldo Pedraza
Director asociado
Dr. Juan Carlos Díaz Ricci
Comisión de supervisión
Especialista del tema
Dr. Gustavo Martín Martínez Zamora
Miembro de otra unidad académica
Dra. Viviana Andrea Rapisarda
El presente trabajo de Tesis Doctoral se realizó en la Cátedra de Microbiología
Agrícola, Departamento de Ecología, Facultad de Agronomía y Zootecnia de la Universidad
Nacional de Tucumán y en el Departamento de Bioquímica de la Nutrición del Instituto
Superior de Investigaciones Biológicas (INSBIO; CONICET-UNT) e Instituto de Química
Biológica de la Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia de la Universidad Nacional de
Tucumán. Con el apoyo financiero del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
Técnicas (CONICET), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y
Consejo de Investigaciones de la UNT (CIUNT).
AGRADECIMIETOS
Al Doctorado de Ciencias Biológicas de la UNT, a la Cátedra de Microbiología de la Facultad de
Agronomía y Zootecnia de la UNT y al Instituto Superior de Investigaciones Biológicas
(INSIBIO) por permitir el desarrollo de este trabajo de tesis doctoral.
A mis directores, Dres. Raúl Pedraza y Juan Díaz Ricci, por guiarme, por su dedicación y
paciencia, por la revisión crítica de mi trabajo, y sobretodo por darme libertad y confianza
para desarrollar mis ideas. Sus palabras, consejos y exigencias son los pilares de mi formación
profesional y los que me empujaron a buscar la excelencia dando lo mejor de mi en cada paso.
A la Dra. Beatríz Baca, por su generosidad para compartir sus conocimientos, por las largas
charlas de nuestro querido Azos y por contagiarme su pasión por la ciencia y la investigación.
A los miembros de mi comisión de supervisión, Dres. Viviana Rapisarda y Gustavo Martínez
Zamora, por sus consejos, sus enseñanzas, su constante apoyo y por los valiosos aportes
realizados durante el desarrollo de la tesis.
A mis amigos y compañeros de laboratorio de la FAZ y de INSIBIO, con quienes hemos logrado
construir un ambiente laboral agradable y estimulante. Son insuficientes las palabras para
agradecerles su amistad, sus consejos, toda su colaboración con el desarrollo experimental de
la tesis, por todos los mates y cafés, y por estos cinco años compartidos que quedarán
colmados de buenos recuerdos.
A mis Padres, Edgardo y Otilde, por todo… Quien fui, soy y seré se los debo a Uds.
A mi Fer, mis Sisters y los peques, por su paciencia y apoyo, por su amor incondicional y por las
risas y sonrisas de todos los días.
A mis Amiguitas, mis hermanas del alma y mis testigos en la vida, por alentarme en los
momentos difíciles y festejar conmigo mis logros.
¡Gracias!
Análisis de las señales bioquímicas y moleculares involucradas en la colonización de frutilla por Azospirillum brasilense
RESUMEN
La producción agrícola de frutilla posee gran importancia económico-social, y por
ser un cultivo intensivo, requiere grandes cantidades de fertilizantes y pesticidas para
aumentar los rendimientos, siendo estos peligrosos para el ambiente y la salud humana. Una
alternativa biotecnológica y ecológica para mejorar los rindes y disminuir los costos de
producción, es el uso de bacterias promotoras del crecimiento vegetal o PGPB (Plant GrowthPromoting Bacteria) como las pertenecientes al género Azospirillum.
Estudios previos han demostrado que Azospirillum brasilense, aislado a partir de
plantas de frutilla en la provincia de Tucumán y caracterizado en nuestro laboratorio, es capaz
de fijar N2, producir índoles y sideróforos, ejercer biocontrol frente a la antracnosis, presentar
quimiotaxis positiva hacia los exudados radiculares de frutilla e inducir el crecimiento de éste
cultivo, tanto en condiciones ambientales controladas como en el campo. Sin embargo, poco
se conoce respecto a los mecanismos que se desencadenan en las plantas durante el proceso de
colonización. Por ello en la presente tesis doctoral se estudiaron las señales bioquímicas,
estructurales y moleculares activadas en plantas de frutilla durante la colonización por
Azospirillum brasilense, las cuales permitirían el reconocimiento y el establecimiento de esta
asociación benéfica, no patogénica.
Se determinó que las cepas REC3 y PEC5 de Azospirillum brasilense fueron
capaces de asociarse benéficamente con las plantas de frutilla, promoviendo su crecimiento
sin causar síntomas de enfermedad. A. brasilense colonizó rizosférica y endofíticamente las
raíces de distintas variedades de frutilla (`Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´), y también colonizó
endofíticamente los estolones de plantas madre inoculadas e hijas no-inoculadas. La
obtención de la cepa transgénica A. brasilense REC3::gfp, con altos niveles de expresión del
gen gfp y gran estabilidad, permitió realizar el seguimiento de la colonización radicular.
La contribución de A. brasilense a la nutrición mineral de la frutilla se evaluó por
microscopía electrónica de barrido acoplada a la espectroscopia de dispersión de rayos-X,
determinando los siguientes elementos en los tejidos foliares: C, O, N, Na, K, P, Ca y Cu;
mientras que en raíces se determinó también Si y Cl, observándose un aumento del contenido
de P y una diminución de Cu en las raíces inoculadas. Además, A. brasilense promovió el
crecimiento de plantas de frutilla en condiciones hidropónicas, aumentando la biomasa total,
el índice de crecimiento y la proliferación de pelos radiculares, siendo este efecto más notorio
cuando las plantas crecieron en un medio limitado en nutrientes.
La señales estructurales, bioquímicas y moleculares activadas en las plantas de
frutilla por Azospirillum brasilense, como las deposiciones de calosa, el engrosamiento de las
paredes celulares, el aumento de compuestos fenólicos solubles totales, la diminución de la
peroxidación lipídica, la inducción de la síntesis de fitohormonas (ácido salicílico y ácido
indol-3-acético) y la expresión temprana de genes relacionados a la defensa vegetal, indicaron
que esta bacteria PGPB activa un “estado de alerta” o “priming” en las plantas de frutilla,
siendo éste un proceso importante de la resistencia sistémica inducida (ISR). Las señales
activadas durante el “priming” son altamente reguladas y pueden ser complementarias,
proporcionando una resistencia de larga duración y amplio espectro contra diferentes
fitopatógenos. Sin embargo, el análisis cuantitativo de la expresión génica indicó que A.
brasilense puede inducir también la resistencia sistémica adquirida (SAR), concluyendo que
el mismo es capaz de inducir mecanismos de defensa en plantas de frutilla por ambas vías,
SAR e ISR, que en última instancia mejoraría el rendimiento de las plantas.
En conjunto, los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al
conocimiento de la interacción benéfica que se establece entre plantas de frutillas y la especie
PGPB Azospirillum brasilense.
Índice
ÍNDICE GENERAL
CAPÍTULO 1:
INTRODUCIÓN GENERAL
1
1. Generalidades
2
2. Bacterias PGPB
3
3. El género Azospirillum
4
3. 1. Mecanismos de Azospirillum para la promoción del crecimiento vegetal
5
A. Síntesis de fitohormonas
5
B. Fijación biológica de Nitrógeno
7
C. Incremento en la absorción y/o biodisponibilidad de nutrientes
8
D. Síntesis de vitaminas y enzimas
9
E. Biocontrol
10
4. Hipótesis aditiva de los mecanismos de Azospirillum
11
5 Mecanismos de defensa vegetal
11
6. La frutilla
13
6. 1. Descripción de la planta
13
6. 2. Importancia del cultivo de frutilla
13
7. Interacción Azospirillum-frutilla
7. 1. Perspectivas del estudio de la interacción Azospirillum-frutilla
15
17
CAPÍTULO 2:
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
18
Hipótesis de trabajo
19
Objetivo General
20
Objetivos específicos
20
CAPÍTULO 3:
ANÁLISIS DE LA COLONIZACIÓN RIZOSFÉRICA Y/O ENDOFÍTICA DE AZOSPIRILLUM
BRASILENSE EN RAÍCES Y ESTOLONES DE PLANTAS DE FRUTILLA
21
Introducción
22
1. Los sitios de colonización de Azospirillum
22
2. Proceso de colonización de Azospirillum
22
i
Índice
3. Factores que intervienen en la colonización
24
3. 1. Componentes bacterianos que participan en la colonización
24
3. 2. Componentes vegetales que participan en la colonización
26
4. Objetivo del capítulo
Materiales y métodos
1. Microorganismos
26
27
27
1. 1. Medios de Cultivo
28
1. 2. Observaciones macroscópicas
29
1. 3. Observaciones microscópicas
29
1. 4. Estudios de la ultraestructura celular de A. brasilense
30
1.4.1. Microscopía electrónica de transmisión
30
1.4.2. Microscopía electrónica de barrido
30
1. 5. Obtención de una cepa transgénica A. brasilense REC3::gfp (green
fluorescent protein) por conjugación triparental
31
1.5.1. Microscopía de Fluorescencia
32
1.5.2. Control de estabilidad de la construcción A. brasilense REC3::gfp
33
1.5.3. Análisis estadístico
33
2. Material vegetal
34
3. Inoculación de plantas de frutilla con A. brasilense en soporte líquido
34
3. 1. Modelo Experimental
34
3. 2. Acondicionamiento de las plantas en soporte líquido
34
3. 3. Preparación del inóculo
35
3. 4. Inoculación
35
3.5. Estudios ultraestructurales. Microscopía Electrónica de Transmisión y Barrido
35
4. Inoculación de plantas de frutilla con A. brasilense en soporte sólido
36
4. 1. Modelo Experimental
36
4. 2. Inoculación
36
4. 3. Ensayos microbiológicos. Determinación del Número Más Probable (NMP)
de A. brasilense en distintos tejidos de plantas de frutilla
38
ii
Índice
4.3.1. Toma de muestras
38
4.3.2. Determinación del NMP
38
4. 4. Estudios ultraestructurales. Microscopía Electrónica de Transmisión
y de Barrido
4. 5. Estudios Moleculares.
39
39
4.5.1. Extracción de ADN de tejidos vegetales
40
4.5.2. Amplificación por PCR del gen nifD
41
4.5.3. Extracción de ADN bacteriano, amplificación por PCR del gen 16S ADNr y
restricción enzimática
42
4.5.4. Secuenciación automática del 16S ADNr
42
5. Inoculación de plantas de frutilla en condiciones hidropónicas con la cepa
transgénica A. brasilense REC3::gfp
43
5. 1. Optimización de las condiciones hidropónicas para plantas de frutilla
43
5. 2. Modelo Experimental
44
5. 3. Inoculación
44
5. 4. Observación por microscopía óptica de fluorescencia
44
Resultados
1. Estudios de la ultraestructura celular de Azospirillum brasilense
45
45
1. 1. Observaciones macroscópicas
45
1. 2. Observaciones microscópicas
45
1. 3. Microscopía electrónica
46
1. 4. Microscopía de fluorescencia
48
2. Estudios ultraestructurales de las raíces de plantas desarrolladas en
soporte líquido inoculadas con A. brasilense
50
3. Inoculación de plantas de frutilla con Azospirillum brasilense en
soporte sólido
59
3. 1. Ensayos microbiológicos. Determinación del NMP de Azospirillum brasilense
en tejidos de plantas de frutilla
60
3. 2. Estudios ultraestructurales de raíces y estolones de plantas en soporte
64
iii
Índice
sólido inoculadas con A. brasilense
3. 3. Estudios moleculares. Determinación del gen nifD
66
3. 4. Amplificación del gen 16S ADNr, ARDRA y secuenciación automática
67
4. Estudios de colonización por microscopía de fluorescencia
68
Discusión
70
Conclusiones
78
CAPÍTULO 4:
ANÁLISIS LA COMPOSICIÓN ELEMENTAL DE PLANTAS DE FRUTILLA INOCULADAS
CON A. BRASILENSE REC3 MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNIAC DE BARRIDO
ACOPLADA AL ANÁLISIS DE DISPERSIÓN DE RAYOS-X Y SUEFECTO EN LA
PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO
80
Introducción
81
1. Microscopía electrónica de barrido acoplada a la espectroscopia de energía
dispersiva de rayos-X
81
2. Objetivo del capítulo
82
Materiales y métodos
83
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
83
2. Microorganismos e inoculación
83
3. Diseño experimental
84
4. Determinación de peso seco
84
5. Microscopía electrónica de barrido acoplada a energía dispersiva de rayos-X
85
6. Análisis estadístico
85
Resultados
86
1. Promoción del crecimiento
86
2. Observaciones microscópicas
87
3. Microanálisis por MEB-EDS
88
Discusión
92
Conclusiones
96
iv
Índice
CAPÍTULO 5:
ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS ESTRUCTURALES PRODUCIDOS EN PLANTAS DE
FRUTILLA POR LA INOCULACIÓN CON AZOSPIRILLUM BRASILENSE REC3
97
Introducción
98
1. Mecanismos de defensa vegetal: barreras estructurales
2. Objetivos del capítulo
Materiales y métodos
98
100
100
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
100
2. Inóculo
100
3. Inoculación y diseño experimental
101
4. Tinción de calosa
101
5. Fortificación de la pared celular
102
Resultados
102
Discusión
104
Conclusiones
106
CAPÍTULO 6:
ANÁLISIS DE LAS SEÑALES BIOQUÍMICAS DISPARADAS EN PLANTAS DE FRUTILLA
INOCULADAS CON AZOSPIRILLUM BRASILENSE REC3
107
Introducción
108
1. Resistencia sistémica inducida
108
2. Mecanismos de defensa: señales bioquímicas
109
3. Objetivo del capítulo
110
Materiales y métodos
111
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
111
2. Inóculo
111
3. Inoculación y toma de muestras
112
4. Determinación histoquímica del radical superóxido y peróxido de hidrógeno
112
5. Extracción y cuantificación de compuestos fenólicos
114
6. Peroxidación lipídica
115
7. Diseño experimental y análisis estadístico
116
v
Índice
Resultados
1. Detección del estallido oxidativo
116
116
2. Cuantificación de compuestos fenólicos solubles totales y unidos a la pared
celular
119
3. Análisis de la peroxidación lipídica
122
Discusión
123
Conclusiones
129
CAPÍTULO 7:
EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LA PRODUCCIÓN DEL ÁCIDO SALICÍLICO Y ÁCIDO INDOL
3-ACÉTICO EN PLANTAS DE FRUTILLA INOCULADAS CON AZOSPIRILLUM BRASILENSE
130
Introducción
131
1. El sistema inmune vegetal: señalización hormonal
131
2. El ácido salicílico
132
3. El ácido indol-3-acético
135
3.1. Reciprocidad de señalización de AIA entre plantas y bacterias
4. Objetivo del capítulo
Materiales y métodos
138
138
139
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
139
2. Inoculación y diseño experimental
140
3. Obtención de los fluidos peciolares
140
4. Cuantificación simultánea de AS y AIA por RP-HPLC
141
Resultados
142
1. Patrones puros de AS y AIA
142
2. Contenido de AS e plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense y controles
145
3. Contenido de AIA en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense y controles
146
Discusión
148
Conclusiones
152
vi
Índice
CAPÍTULO 8:
ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA EXPRESIÓN DE GENES INVOLUCRADOS EN LA
INTERACCIÓN AZOSPIRILLUM-FRUTILLA
153
Introducción
154
1. Genes involucrados en la respuestas de defensa de las plantas de frutilla
154
3. Genes involucrados en la síntesis, percepción y transducción de señal del etileno
155
2. Genes involucrados en la depuración de especies reactivas del oxígeno
157
4. Objetivo del capítulo
158
Materiales y métodos
158
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
158
2. Inoculación y diseño experimental
140
3. Extracción de ARN total y retrotranscripción del ARNm
159
4. Diseño de cebadores para RT-qPCR
160
5. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
160
6. Análisis estadístico
161
Resultados
162
Discusión
166
Conclusiones
170
CAPÍTULO 9:
CONCLUSIONES GENERALES
171
Conclusiones generales
172
CAPÍTULO 10:
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
175
Referencias bibliográficas
176
vii
Capítulo 1
Capítulo 1
1
Capítulo 1
Introducción General
1. Generalidades
En las últimas décadas el interés por producir alimentos en menor tiempo y
mayor cantidad para suplir los requerimientos nutricionales de la creciente población
mundial, dio lugar a una tendencia universal que busca maximizar los rindes de las
explotaciones agrícolas. Sin embargo, la implementación de nuevas tecnologías y el uso
de agroquímicos pueden no sólo ser nocivos para el ambiente, sino también muy
costosos y difíciles de aplicar en países en vías de desarrollo, con economías débiles y
poco estables.
Los fertilizantes nitrogenados se obtienen industrialmente mediante la
reacción de Haber-Bosch en la cual el nitrógeno atmosférico (N2) es reducido a amonio
(NH4+) por el gas hidrógeno (H2) a temperatura y presiones muy elevadas
(aproximadamente 300ºC y 350 atm); motivo por el cual la fijación industrial lleva
aparejado un alto costo energético y económico, como así también un riesgo potencial
de contaminación y eutrofización de las aguas dulces por lixiviación de los nitratos en
los suelos (Paul y Clark, 1996).
De acuerdo a lo anterior, en los últimos años se ha planteado la necesidad de
incorporar un sistema productivo que sea económicamente rentable y sostenible en el
tiempo. Una alternativa posible para la disminución o sustitución de los fertilizantes
nitrogenados de síntesis química es la explotación de bacterias promotoras del
crecimiento vegetal (PGPB: Plant Growth-Promoting Bacteria) capaces de mejorar el
desarrollo y el rendimiento de numerosas especies vegetales.
La utilización de bacterias del género Azospirillum, pertenecientes al grupo
de las PGPB, como biofertilizante en la producción de distintos cultivos de importancia
agrícola, entre ellos la frutilla, se presenta como una alternativa biotecnológica factible,
2
Capítulo 1
económica y ecológicamente limpia, que permite aumentar los rendimientos y reducir
los costos de producción.
2. Bacterias PGPB
Las bacterias asociadas a plantas que son capaces de colonizar raíces son
llamadas rizobacterias y pueden ser clasificadas en grupos beneficiosos, deletéreos y
neutros sobre la base de su efecto sobre el crecimiento de la planta (Timmusk, 2003).
Las PGPB pertenecen a la categoría de bacterias benéficas que estimulan el crecimiento
vegetal (Kloepper et al., 1989; Lugtenberg y Kamilova, 2009) a través de diferentes
mecanismos como la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfatos, la producción
de fitohormonas, enzimas como la acc-desaminasa, vitaminas, y sideróforos, entre otros
(Dobbelaere et al., 2003; Bashan y de-Bashan, 2010).
Este grupo incluye bacterias pertenecientes a géneros muy diversos como
Azospirillum,
Azotobacter,
Azoarcus,
Klebsiella,
Beijerinckia,
Burkholderia,
Enterobacter, Herbaspirillum, Pseudomona y Paenibacillus (Dobbelaere et al., 2003).
Dentro de este grupo se destacan los diazótrofos (diazo=nitrógeno; trofos=nutrición),
bacterias que tienen la habilidad de reducir el nitrógeno atmosférico a amonio e
incorporarlo a su metabolismo para producir aminoácidos y sintetizar proteínas (Paul y
Clark, 1996). Consecuentemente, los diazótrofos presentan ventajas competitivas que
les permiten prosperar en ambientes ricos en carbono y pobres en nitrógeno (Döbereiner
y Pedrosa, 1987).
De la misma manera que los diazótrofos simbióticos, como los
pertenecientes al género Rhizobium se asocian con plantas fabaceas (ex leguminosas),
en la naturaleza se establecen también importantes interacciones entre plantas no
fabaceas y microorganismos fijadores de N2 de vida libre o asociativa, como
Azospirillum. Estos últimos no forman nódulos como los diazótrofos simbióticos, por
3
Capítulo 1
ello desarrollaron diferentes mecanismos para la protección de la enzima nitrogenasa
que es sensible al oxígeno. Estos mecanismos incluyen la formación de polímeros
extracelulares, exclusión metabólica, microaerofilia, anaerobiosis total, protección
respiratoria y conformacional, separación espacial de la nitrogenasa y barreras de
difusión, entre otras, que les permite el crecimiento en ambientes aeróbicos (Tchan,
1988). En este tipo de asociaciones la planta proporciona la fuente de energía orgánica
que necesitan las bacterias y un ambiente favorable para fijar nitrógeno, mientras que
las bacterias facilitan el nitrógeno fijado para el crecimiento vegetal (Madigan et al.,
2000).
3. El género Azospirillum
Las bacterias del género Azospirillum pertenecen a las alfaproteobacterias,
son Gram (-) y capaces de fijar nitrógeno (Okon y Vanderleyden, 1997; Steenhoudt y
Vanderleyden, 2000; Baca, 2004). Se encuentran en el suelo rizosférico y/o asociadas
con distintas plantas; han sido aisladas de la rizósfera de cereales y diversas plantas en
diferentes regiones del mundo con clima tropical o templado, incluyendo cultivos de
importancia agrícola como maíz, trigo, mijo, sorgo y legumbres (Baldani et al., 1983;
Pacovsky, 1990; Burdman et al., 1997; Dobbelaere et al., 2001; Saubidet et al., 2002;
Bashan et al., 2004). Las bacterias de este género fijan nitrógeno bajo condiciones
microaeróbicas, son móviles debido a la presencia de una flagelación mixta (un flagelo
polar y varios flagelos laterales), y presentan quimiotaxis hacia los exudados radiculares
(ricos en hidratos de carbono, entre otros compuestos; Bashan y Holguin, 1997;
Steenhoudt y Vanderleyden, 2000).
Se han descripto 18 especies: A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A.
halopraeferans, A. irakense, A. largomobile, A. doebereinerae, A. oryzae, A. melinis, A.
zeae, A. canadense, A. rugosum, A. palatum, A. picis, A. thiophilum, A. humicireducens,
4
Capítulo 1
A. formosense, A. fermentarium (Tarrand et al., 1978; Magalhaes et al., 1983; Reinhold
et al., 1987; Khammas et al.,1989; Sly y Stackebrandt, 1999; Eckert et al., 2001; Xie et
al., 2005; Peng et al., 2006; Mehnaz et al., 2007a, b; Young et al., 2008; Zhou et al.,
2009; Lin et al., 2009; Lavrinenko et al., 2010; Zhou et al., 2012; Lin et al., 2012, Lin et
al., 2013).
Azospirillum ejerce sus efectos positivos sobre el crecimiento de la planta,
ya sea directa o indirectamente a través de una combinación de mecanismos diferentes
que participan en forma simultánea, coordinada y cooperativamente en la asociación
planta-bacteria, causando un aumento del crecimiento vegetal cuando las condiciones
ambientales son apropiadas (Bashan y Levanony, 1990).
3.1. Mecanismos de Azospirillum para la promoción del crecimiento vegetal
Entre los mecanismos directos e indirectos que utiliza Azospirillum para
promover el desarrollo vegetal se encuentran:
A. Síntesis de fitohormonas
B. Fijación biológica de Nitrógeno
C. Incremento en la biodisponibilidad de nutrientes
D. Síntesis de vitaminas y enzimas
E. Biocontrol
A. Síntesis de Fitohormonas
La principal hipótesis para explicar la capacidad promotora del crecimiento
es su capacidad de producir varias fitohormonas que aumentan el crecimiento radicular
y la proliferación de pelos radicales, mejorando así la absorción de agua y minerales, lo
que eventualmente rendirá en plantas más grandes y, en muchos casos, más productivas
(Lambrecht et al., 2000; Martínez-Morales et al., 2003).
5
Capítulo 1
Las fitohormonas, tales como auxinas, giberelinas y citocininas (Horemans
et al., 1986; Janzen et al., 1992), son conocidas por su papel regulatorio en el desarrollo
de las plantas. Son sustancias orgánicas que en concentraciones muy bajas, afectan
procesos fisiológicos de la planta.
El ácido indol-3-acético (AIA) es la auxina sintetizada por Azospirillum más
conocida, mejor caracterizada y fisiológicamente más activa en plantas. Se ha
comprobado que esta fitohormona es la principal responsable del aumento producido en
el número de raíces laterales y pelos radiculares observado cuando las plantas de trigo
son inoculadas con Azospirillum brasilense (Harari et al., 1988; Costacurta y
Vanderleyden, 1995; Martínez-Morales et al., 2003).
Al igual que otras PGPB, Azospirillum spp. es capaz de sintetizar y
metabolizar giberelinas que promueven la elongación y división celular, por lo que se ha
sugerido que su efecto positivo en la promoción de crecimiento vegetal sería
parcialmente causado por la producción de éstas fitohormonas por parte de las bacterias
(Bottini et al., 2004).
En la agricultura se busca controlar los niveles de etileno en planta ya que
esta hormona es sintetizada como repuesta a estreses biológicos y ambientales,
causando marchitez y senescencia, y con ello significativas pérdidas económicas.
Algunas PGPB son capaces de degradar el 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC),
precursor de la síntesis de etileno, mediante la enzima ACC-desaminasa. Por lo tanto, la
modulación de los niveles de etileno de la planta, mediada por PGPB que posean la
ACC-desaminasa, puede ser considerada como un mecanismo potencial adicional de
promoción del crecimiento vegetal (Glick et al., 1999; 2007).
6
Capítulo 1
B. Fijación de Nitrógeno
La fijación biológica de nitrógeno es el mecanismo principal de aporte de
este elemento en los ecosistemas naturales y es muy importante en la agricultura del
trópico (Marschner, 1995). Los diazótrofos, como Azospirillum, catalizan la reducción
de nitrógeno por medio del complejo enzimático nitrogenasa, compuesto por las
subunidades nitrogenasa y nitrogenasa reductasa. Ambas son metaloenzimas que
contienen hierro; la nitrogenasa, además, contiene molibdeno (Madigan et al., 2000). El
complejo nitrogenasa fija nitrógeno a temperatura ambiente y presión atmosférica
utilizando energía proveniente de los procesos fotosintéticos (autótrofos) o de la
utilización de carbohidratos por respiración y/o fermentación (heterótrofos).
La
reacción es altamente endergónica (940 kJ/mol de nitrógeno fijado) y se expresa en la
siguiente ecuación:
N2 + 24 ATP + 10 H+ + 8 e‾
2 NH4+ + H2 + 24 ADP + 24 Pi
Además, la enzima está sometida a controles regulatorios muy estrictos; se
inactiva rápida e irreversiblemente en presencia de oxígeno y nitrógeno fijado,
incluyendo amoníaco (NH3), nitratos (NO3‾) y algunos aminoácidos (Hartmann et al.,
1986; Hartmann y Burris, 1987).
El complejo nitrogenasa está codificado por los genes nif. Galimand et
al. (1989) identificaron los genes de fijación de nitrógeno en A. brasilense y
demostraron la existencia de una región de ADN de 30 Kb que contiene los genes
nifHDKY, nifENX, nifUSV, nifW y fixABCX.
Inicialmente se asumió que la capacidad de Azospirillum para fijar nitrógeno
era el principal mecanismo por el cual promovía el crecimiento vegetal, pero al presente
esta característica es controversial debido a que el efecto de estimulación del desarrollo
de la planta es atribuido principalmente a la secreción de fitohormonas (Bashan y
Levanony, 1990; Bashan y Holguin, 1997; Bashan et al., 2004). Sin embargo,
7
Capítulo 1
numerosos experimentos realizados en invernadero y en campo han demostrado
reiteradamente que existe una contribución por parte de la fijación biológica de N2,
determinado en laboratorio por la transferencia de
15
N2 y mediante observaciones en
campo donde la inoculación con Azospirillum redujo significativamente las dosis de
fertilización nitrogenada en el cultivo de distintas especies vegetales (Bashan y deBashan, 2010).
C. Incremento en la absorción y/o biodisponibilidad de nutrientes
Las bacterias PGPB facilitan a las plantas la toma de agua y nutrientes como
nitrógeno (ej., NO3‾, NH4+), fósforo (ej., PO43‾), potasio y algunos micronutrientes (ej.,
hierro, zinc, molibdeno, etc.). Este efecto podría ser atribuido al aumento generalizado
del volumen del sistema radicular que está directamente relacionado con la secreción de
fitohormonas por parte de la bacteria; o bien a mecanismos específicos que actúan
incrementando la absorción de minerales (Morgenstern y Okon, 1987; Bashan y
Holguin, 1997).
El fósforo, un elemento fundamental para el crecimiento de la planta, se
presenta en la naturaleza como fósforo orgánico en la biomasa y como fósforo
inorgánico, asociado al hierro y aluminio en el suelo, siendo siempre insoluble o muy
poco soluble. Sin embargo, las bacterias del género Azospirillum son capaces de
solubilizar fosfatos insolubles que serán luego absorbidos por las plantas (El-Komy,
2005). Este fenómeno puede explicarse en parte por la acidificación del medio debido a
los protones y ácidos orgánicos sintetizados por Azospirillum spp. que favorecen la
solubilización de P; la naturaleza de los ácidos orgánicos producidos por las bacterias
depende directamente de los azúcares presentes en los exudados radiculares (Deubel et
al., 2000; Bashan y de-Bashan, 2010).
8
Capítulo 1
Por otro lado, la producción de sideróforos, compuestos de bajo peso
molecular que acomplejan la mayor parte de los iones férricos formando complejos
estables, constituye otra característica que permite a las plantas inoculadas con bacterias
productoras de sideróforos, beneficiarse en la competencia por nutrientes. Además de
otorgarle una ventaja competitiva en ambientes pobres en hierro,
los sideróforos
sintetizados por Azospirillum spp. pertenecientes al grupo de los catecoles presentaron
actividad antimicrobiana frente a varios aislados microbianos y fúngicos (Shah et al.,
1992; Tortora et al., 2011; 2012).
D. Síntesis de Vitaminas y Enzimas
Algunas cepas de Azospirillum son capaces de producir, en medios de
cultivo definidos, todas o algunas de las vitaminas solubles en agua del grupo B, tales
como niacina, ácido pantoténico, tiamina, riboflavina y biotina (Rodelas et al., 1993).
Las vitaminas son moléculas orgánicas que cumplen numerosas funciones en plantas
pero principalmente actúan como reguladores del crecimiento y antioxidantes
(DellaPenna y Pogson, 2006).
Entre las enzimas más importantes se encuentra la 1-aminociclopropano-1carboxilato (ACC) desaminasa que cataliza la escisión de ACC en amonio y
α-cetobutirato , y por lo tanto, es responsable de la inhibición de la síntesis de etileno
por la planta (Glick et al., 1999; Dobbelaere et al., 2003). Sin embargo, las cepas
salvajes de Azospirillum spp. no poseen ACC-desaminasa con la única excepción de
A.lipoferum 4B (Prigent-Combaret et al., 2008), descripta hasta el presente.
Azospirillum posee también una enzima nitrato reductasa (NR) asimilatoria
que contribuye, junto con las NRs localizadas en las raíces de las plantas, a la reducción
de nitrato (NO3-) a amonio (NH4+) que será luego incorporado a moléculas orgánicas
(Steenhoudt et al., 2001).
9
Capítulo 1
E. Biocontrol
El biocontrol es un mecanismo indirecto para promover el crecimiento
vegetal; consiste en disminuir o prevenir los efectos deletéreos producidos por los
microorganismos patógenos de plantas, mediante la síntesis de compuestos antibióticos,
ya sean bactericidas y/o fungicidas (Schippers et al., 1987).
En este sentido, se conoce que algunos aislados de Azospirillum producen
bacteriocinas que inhiben el crecimiento de distintas bacterias (Hartmann y Baldani,
2006) y que A. brasilense sintetiza ácido fenilacético, una molécula antimicrobiana del
tipo-auxina (Somers et al., 2005).
También se comprobó que la cepa REC3 de Azospirillum brasilense es
capaz de inducir una respuesta sistémica contra el agente causal de la antracnosis en
frutilla, Colletotrichum acutatum M11 (Tortora et al., 2012). La cepa REC3, que
sintetiza sideróforos con actividad antimicrobiana bajo condiciones limitantes de hierro,
redujo los síntomas de antracnosis en plantas infectadas con el hongo, y este efecto fue
mayor a medida que aumentaba el tiempo entre la inoculación bacteriana y la infección
con el hongo. Los estudios bioquímicos y transcripcionales revelaron que se produjo
una acumulación transitoria de ácido salicílico junto con la inducción de genes
relacionados a la defensa vegetal en las 96 horas posteriores a la inoculación. Además,
se demostró que este efecto de biocontrol ejercido sobre C. acutatum estuvo
directamente relacionado con modificaciones estructurales a nivel de la pared celular de
las hojas como consecuencia de la acumulación de calosa y el aumento de compuestos
fenólicos solubles totales (Tortora et al., 2012). Por lo tanto, se demostró que A.
brasilense REC3 confiere una repuesta sistémica a las plantas de frutilla contra C.
acutatum M11 mediante la activación directa de mecanismos de defensa (Tortora et al.,
2012).
10
Capítulo 1
4. Hipótesis aditiva de los mecanismos de Azospirillum
La hipótesis aditiva de los mecanismos de promoción de crecimiento
vegetal de Azospirillum considera la participación de múltiples mecanismos activados
simultánea o secuencialmente durante la asociación planta-bacteria, en lugar de un sólo
mecanismo responsable por el efecto positivo ejercido sobre el desarrollo vegetal
(Bashan y Holguin 1997; Bashan y de-Bashan, 2010). Se observó que la contribución de
un mecanismo aislado fue significativamente menor cuando se evaluó individualmente
(Bashan y Levanony, 1990), por lo que algunos investigadores proponen que es la suma
de distintas actividades llevadas a cabo por las PGPB, bajo las condiciones ambientales
adecuadas, la responsable de los cambios observados en el crecimiento vegetal (Bashan
y de-Bashan, 2010).
5. Mecanismos de defensa vegetal
Las
plantas
son
constantemente
atacadas
por
microorganismos
fitopatógenos, sin embargo sólo una pequeña proporción de ellos invade exitosamente a
la planta causando la enfermedad (Chrisholm et al., 2006). Esto ocurre gracias a que la
planta puede ser no hospedante, o bien, cuenta con mecanismos de defensa que le
permiten hacer frente a los potenciales invasores. Las plantas se defienden mediante
estructuras morfológicas que actúan como barreras físicas impidiendo la entrada del
patógeno y por medio de reacciones bioquímicas que tienen lugar en diferentes tejidos
vegetales generando condiciones que inhiben la entrada y crecimiento de los mismos en
la planta (Taíz y Zeiger, 2002).
De manera general, las plantas utilizan dos modos de reconocimiento para
detectar un microorganismo perjudicial. Primero ocurre la percepción de moléculas
microbianas conservadas comúnmente llamadas MAMPs (por sus siglas en inglés:
microbe associated molecular patterns), mediante receptores de reconocimiento de
11
Capítulo 1
patrón (PRR: pattern recognition receptos) que están localizados principalmente en la
superficie celular vegetal. Este reconocimiento inicial induce una resistencia basal en
plantas huésped y no-huésped, también llamada inmunidad inducida por MAMPs, que
actúa como una primera barrera para detener la infección patogénica (Zipfel et al.,
2004). En segundo lugar ocurre el reconocimiento, dentro de la célula, mediante los
productos de los genes de resistencia (R) de moléculas efectoras específicas
suministradas a la planta por los patógenos que han atravesado la primera barrera de
resistencia basal (Jones y Dangl, 2006). Esta respuesta es designada como inmunidad
inducida por el efector (ETI: effector-triggered inmunity) y está generalmente
acompañada por una respuesta de hipersensibilidad (HR: hipersensibility response) que
corresponde a una forma de muerte celular programada local que restringe la invasión
por el patógeno (Chrisholm et al., 2006; Jones y Dangl, 2006). Las respuestas inmune
inducidas por PRRs y por los productos de los genes R son muy similares. Sin embargo,
los componentes de defensa constitutiva y los eventos de señalización asociados pueden
ser diferentes. Generalmente, estas respuestas incluyen el flujo de iones a través de la
membrana plasmática, la generación de especies reactivas del oxígeno, el óxido nítrico,
las deposiciones de calosa, la activación de proteínas quinasas dependientes de calcio y
las activadas por mitógenos y la transcripción de numerosos genes de defensa, muchos
de los cuales son activados por la compleja red de señalización hormonal del ácido
salicílico (AS), ácido jasmónico (AJ) y etileno (ET) (Thomma et al., 2001; Jones y
Dangl, 2006; Pieterse et al., 2009; 2012).
Sin embargo, los patógenos también han evolucionado sus estrategias para
invadir los tejidos vegetales incluso mediante la inactivación de la defensa vegetal
(Lopez et al., 2008). Teniendo en cuenta que los microorganismos patogénicos y
benéficos utilizan mecanismos similares para colonizar las plantas, su estudio resulta de
gran importancia.
12
Capítulo 1
6. La Frutilla
6. 1. Descripción de la planta
La frutilla es una planta herbácea, estolonífera y de buen porte. Pertenece a
la familia Rosaceae, tribu Potentillae, clase Angiospermae – Dicotyledoneae, género
Fragaria, siendo Fragaria ananassa Duch. la especie más cultivada comercialmente
(Hancock et al., 1991; Hummer y Hancock, 2009).
El sistema radicular es fibroso y está formado por raíces principales
engrosadas, responsables del anclaje de la planta y del almacenamiento de reservas
junto con un sistema de raicillas más finas agrupadas en ramificaciones laterales. La
planta posee un tallo corto y engrosado llamado corona de donde emergen, desde los
nudos, las hojas y las yemas axilares a partir de las que pueden desarrollarse estolones.
Los estolones son tallos superficiales de crecimiento horizontal, de longitud y tamaño
variable. En la extremidad del estolón hay una serie de entrenudos cortos que
conforman la corona del futuro plantín, allí se encuentra también la yema axilar que
puede emitir un nuevo estolón y así sucesivamente (Darrow, 1966; Hummer y Hancock,
2009).
Los frutos son de tipo múltiple, cuyo receptáculo constituye la parte
comestible. Los aquenios, son frutos secos que se encuentran en la superficie del
receptáculo insertados superficialmente o en pequeñas depresiones denominadas criptas.
En la base del fruto se encuentra el cáliz con sépalos adherentes (Darrow, 1966;
Hummer y Hancock, 2009).
6. 2. Importancia del cultivo de frutilla
El cultivo de frutilla tiene una gran importancia comercial a nivel mundial y
es de gran interés social por la alta demanda de mano de obra, tanto en la producción en
13
Capítulo 1
campo como en el empaque y en la industria (Pérez y Mazzone, 2004; Rodriguez y
Pérez, 2013).
La producción mundial de frutilla estimada por la FAO en el año 2011 fue
de aproximadamente 4.349.498 toneladas, siendo Estados Unidos el primer productor
ya que aporta un 50% de la producción total (http://faostat3.fao.org).
En Argentina se produce frutilla durante todo el año, concentrándose en las
provincias de Santa Fe y Tucumán el 70% de la producción total del país (Rodriguez et
al., 2010). Tucumán es el segundo productor nacional debido a que presenta zonas con
excelentes condiciones agro-ecológicas para este cultivo que se produce prácticamente
los doce meses del año (Pérez y Mazzone, 2004).
A pesar de que este cultivo se realiza en suelos con buena fertilidad natural
en la provincia de Tucumán, igualmente se aplican fertilizantes químicos,
principalmente nitrógeno, en niveles superiores a 290 kg· ha-1· año-1, para incrementar
la producción (Pedraza et al., 2007). Tucumán posee ventajas respecto a otras zonas
productoras de frutilla en Argentina, tanto para la producción de fruta como para la de
plantines, ya que existen diferentes regiones agroclimáticas que permiten obtener fruta
primicia y poseer un período de cosecha más extenso que otros centros productores del
país.
La zona frutillera tradicional en Tucumán es el departamento de Lules que
actualmente cuenta con 230 hectáreas. Las características agroclimáticas de Lules son
óptimas para la producción de fruta en el invierno: esta estación carece de lluvias de
importancia, tiene un amplio período libre de heladas, los suelos son de pH neutro a
ácido y existe una abundante dotación de agua para riego, de muy buena calidad. La
otra región productora es el departamento de Tafí del Valle, donde se obtienen plantines
propagados asexualmente por fijación de estolones y también fruta fresca. En los valles
14
Capítulo 1
de altura existen unas 60 hectáreas cultivadas, con características agroecológicas
diferentes a las de Lules.
Las posibilidades de expansión de la actividad frutillera están dadas por la
demanda comercial (exportación a los Estados Unidos y a Europa), habiéndose
realizado con éxito experiencias en este sentido. Otra demanda importante es la del
sector industrial, que la emplea para la fabricación de algunos lácteos, mermeladas,
jugos, etc. Este segmento absorbe el 30% de la producción actual de la provincia
(http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/nuevositio/agricultura/cultivos/perfiles/frutilla).
Actualmente se conoce que la producción de frutilla es un cultivo intensivo
que requiere grandes cantidades de fertilizantes y pesticidas para aumentar los
rendimientos de frutos, lo que puede ser peligroso para el ambiente y la salud humana
cuando no se aplican correctamente (Ajwa et al., 2003). Por lo tanto, el uso de bacterias
PGPB como Azospirillum se presenta como una alternativa biotecnológica y ecológica
para mejorar los rindes y disminuir los costos de producción.
7. Interacción Azospirillum-Frutilla
En base a sus efectos en la planta, los microorganismos que interactúan con
las plantas se pueden clasificar como patógenos, saprofitos y benéficos. Los
microorganismos benéficos se utilizan a menudo como inoculantes (Bloemberg y
Lugtenberg, 2001) y pueden ser clasificados de acuerdo con el objetivo de su aplicación
en: biofertilizantes (como los rizobios, que se han aplicado en el mercado desde hace
más de un siglo), fitoestimulantes (como Azospirillum y otros género productores de
auxina que estimula el desarrollo radical), rizoremediadores (degradadores de
contaminantes que utilizan el exudado radicular como fuente de carbono) y
biopesticidas (Lugtenberg et al., 2002). Actualmente ninguna de las numerosas
interacciones microorganismo-planta está completamente dilucidada pero sí está claro
15
Capítulo 1
que sin importar si el microorganismo es benéfico o patógeno, a menudo utilizan los
mismos mecanismos, aunque en diferentes combinaciones y para diferentes propósitos
(Lugtenberg et al., 2002; Pieterse et al., 2009).
En estudios previos se han aislado y caracterizado cepas de Azospirillum
brasilense a partir de distintos tejidos de plantas de frutilla en la Provincia de Tucumán,
demostrando la asociación natural con plantas de frutilla y la naturaleza ubicua de ésta
especie (Pedraza et al. 2007). Tales cepas demostraron tener capacidad para fijar
nitrógeno atmosférico, sintetizar índoles, solubilizar fosfatos y presentar quimiotáxis
positiva hacía los exudados radiculares de frutilla, siendo éstas características
importantes dentro del grupo de las PGPB. Algunas cepas fueron inoculadas en plantas
de frutilla en condiciones ambientales controladas (fitotrón e invernadero), y en
condiciones de campo, observándose en todos los casos un efecto positivo sobre la
promoción del crecimiento vegetal ejercido por A. brasilense, aunque dependiente de
los genotipos planta-bacteria asociados (Pedraza et al., 2010). Además, como se
mencionó anteriormente, también se demostró que éstas cepas fueron capaces de ejercer
mecanismos de biocontrol contra la antracnosis a través de la producción de sideróforos,
la activación de la vía del ácido salicílico y el aumento de la expresión de genes de
defensa relacionados a la patogénesis (Pedraza et al., 2010; Tortora et al., 2011, 2012).
Sin embargo, no se obtuvieron evidencias morfológicas y moleculares de la
colonización de Azospirillum brasilense en tejidos de raíces y estolones de frutilla. Si
bien se han propuestos diferentes mecanismos para explicar la promoción del
crecimiento y el biocontrol mediado por Azospirillum, las señales bioquímicas,
fisiológicas, estructurales y moleculares que se activan durante la interacción
Azospirillum-frutilla todavía son poco conocidas.
16
Capítulo 1
7. 1. Perspectivas del estudio de la interacción Azospirillum-frutilla
Este trabajo de investigación nos permitirá avanzar en nuestro conocimiento
de la interacción Azospirillum-frutilla dilucidando los mecanismos desencadenados y
los genes activados en las plantas como respuesta a la inoculación. El mejor
entendimiento de la performance de los bioinoculates permitirá en un futuro cercano
mejorar los efectos de las cepas de Azospirillum, ya sea mediante la optimización de la
tecnología utilizada para su aplicación, o bien mediante modificación genética de las
cepas seleccionadas.
Por otro lado, el análisis de la efectiva colonización de Azospirillum desde
una planta madre inoculada a las plantas hijas no inoculadas a través de los estolones,
plantea la posibilidad de obtener plantines portadores de cepas seleccionadas de
Azospirillum brasilense con interesantes perspectivas de aplicación en el campo,
teniendo en cuenta que los cultivos de frutilla son de gran interés económico-social.
17
Capítulo 2
Capítulo 2
18
Capítulo 2
HIPÓTESIS DE TRABAJO
Azospirillum brasilense es capaz de asociarse benéficamente con plantas de
frutilla y ésta interacción desencadena señales bioquímicas y moleculares.
19
Capítulo 2
OBJETIVO GENERAL
Estudiar las señales bioquímicas, estructurales y moleculares que se generan
durante la interacción Azospirillum-frutilla, utilizando distintas cepas de Azospirillum
brasilense, capaces de asociarse en forma benéfica con plantas de frutilla (Fragaria
ananassa).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Analizar las distintas formas de asociación entre Azospirillum brasilense y raíces de
frutilla: rizosférica y/o endofítica, mediante microscopía electrónica de barrido y
transmisión, respectivamente; y mediante microscopía de fluorescencia utilizando
una cepa de A. brasilense marcada con el gen reportero gfp.
2. Determinar mediante estudios microbiológicos, ultraestructurales y moleculares la
colonización de Azospirillum brasilense a través de los estolones desde una planta
madre inoculada a las hijas sin inocular.
3. Evaluar la contribución de A. brasilense en la nutrición mineral de plantas de
frutilla y su efecto en la promoción del crecimiento.
4. Investigar a nivel de modificaciones estructurales las deposiciones de calosa y el
engrosamiento de la pared celular de hojas de frutilla inoculadas con Azospirillum.
5. Analizar la cinética del estallido oxidativo por determinación de peróxido de
hidrógeno (H2O2) y radical superóxido (O2•–), la peroxidación de lípidos y la
producción de compuestos fenólicos (solubles y unidos a la pared celular), en raíces
y hojas de plantas de frutilla inoculadas con Azospirillum y plantas control.
6. Evaluar la participación y cuantificar la producción de moléculas señales de frutilla
tales como el ácido salicílico y ácido indol-acético, durante la interacción con
Azospirillum.
7. Estudiar la expresión de genes/ EST (“Expressed Sequence Tags”) de frutilla que se
expresen como resultado del proceso de colonización de Azospirillum.
20
Capítulo 3
Capítulo 3
21
Capítulo 3
Análisis de la colonización rizosférica y/o endofítica de Azospirillum
brasilense en raíces y estolones de plantas de frutilla
INTRODUCCIÓN
1. Los sitios de colonización de Azospirillum
La colonización de la raíz es el factor clave en la exitosa interacción
Azospirillum-planta, la cual se sabe que afecta positivamente el crecimiento vegetal
(Okon, 1985; Bashan, 1986). Normalmente se puede encontrar a Azospirillum a lo
largo de todo el sistema radical, aunque está principalmente concentrado en las zonas de
elongación, de pelos radicales (Bashan et al., 1986; Okon y Kapulnik, 1986) y en la
zona de aparición de las raíces laterales (Patriquin et al., 1983). El hecho de que la
mayoría de las cepas de A. brasilense se adsorban en estas áreas, puede deberse a que
las regiones mencionadas están constantemente exudando compuestos que las atraen y
proveen nutrientes para esta asociación metabólicamente activa (Bashan et al., 1986).
2. Proceso de colonización de Azospirillum
La unión de Azospirillum a la raíz de la planta hospedera es un proceso que
se cumple en dos etapas, según el modelo propuesto por Michelis et al. (1991), cuyo
esquema se muestra en la Figura 1. El mismo consiste en una fase de adsorción seguida
de una fase de anclaje. En la etapa de adsorción, mediada por la flagelina del flagelo
polar, la bacteria se adhiere a la raíz como una célula individual en forma rápida, débil y
reversible. El flagelo polar glicosilado participa en la colonización como una adhesina
que permite la adhesión a la superficie radical y, en algunos casos, la especificidad de
tejido a través de un proceso de reconocimiento célula-tejido (Croes et al., 1993).
22
Capítulo 3
Figura 1. Proceso bifásico de unión de A. brasilense a la superficie de la planta hospedera. a.
Superficie de la planta hospedera; b. Células de A. brasilense; c. Flagelo polar; d. Flagelo
Laterales; e. Exopolisacáridos. (Tomado de Steenhoudt y Vanderleyden, 2000).
En la etapa de anclaje se forman agregados bacterianos que están firme e
irreversiblemente anclados a la raíz. Esta fase se caracteriza por la producción de largas
fibras bacterianas (Bashan et al., 1991).
La disposición final de las bacterias en el proceso de colonización
descrito, como agregados bacterianos anclados a la raíz por los exopolisacáridos,
sugiere que Azospirillum brasilense es capaz de formar biopelículas.
Las biopelículas son comunidades de microorganismos que suelen crecer
en una superficie abiótica o biótica (como la superficie radicular) y están embebidos en
una matriz extracelular que ellos mismos sintetizan. Las biopelículas pueden estar
formadas por una sola especie bacteriana, pero frecuentemente contienen otras especies
como así también hongos, algas, protozoarios y moléculas orgánicas e inorgánicas
(Ramey et al., 2004). El desarrollo de la biopelícula y la íntima interacción resultante
con las plantas, a menudo requieren de la comunicación célula a célula entre las
bacterias colonizadoras (Ramey et al., 2004).
La formación de biopelículas otorga varias ventajas a las bacterias que
los componen ya que promueven la resistencia a ciertos estreses ambientales, así como
la tolerancia antimicrobiana, la protección de la depredación por los protozoarios,
metabolismo concertado y/o la oportunidad para la transferencia horizontal de genes
23
Capítulo 3
(Danhorn y Fuqua, 2007). Su alta densidad demográfica proporciona la oportunidad de
realizar ciertos procesos que las células individuales no pueden lograr de manera
eficiente, como la excreción de metabolitos o exoenzimas que son efectivas sólo a partir
de un determinado umbral de concentración. La formación de biopelículas es un modo
de mantener una masa crítica de células en un lugar específico durante períodos
suficientemente largos para iniciar interacciones benéficas o antagónicas con plantas
hospederas (Danhorn y Fuqua, 2007).
3. Factores que intervienen en la colonización
Para alcanzar una colonización eficiente, se requiere que la bacteria posea
ciertas cualidades. Primeramente, la motilidad bacteriana es un prerrequisito para
responder quimiotácticamente y desplazarse hacia las raíces de la planta donde pueden
beneficiarse de los exudados radiculares. Una vez que llegan a las inmediaciones de la
raíz, se produce la adhesión a las células blanco de la superficie radical (Vanbleu y
Vanderleyden, 2003).
3. 1. Componentes bacterianos que participan en la colonización
Flagelos: la motilidad es necesaria para alcanzar el nicho más favorable y para competir
con otros microorganismos por esos nichos. Azospirillum es móvil debido a la presencia
de flagelos. El flagelo es una estructura cilíndrica fina, hueca y rígida, con aspecto
helicoidal que está constituido por subunidades idénticas de una proteína llamada
flagelina. Croes et al. (1993) han demostrado que además de las propiedades
locomotoras, el flagelo polar de A. brasilense posee propiedades adhesivas. Dentro del
género Azospirillum, A. brasilense, A. lipoferum, y A. irakense poseen flagelación
mixta: un flagelo polar cuando es cultivado en medio líquido y flagelos adicionales
laterales cuando es cultivado en medio sólido (Tarrand, 1978; Hall y Krieg, 1984;
24
Capítulo 3
Moens et al., 1996). El flagelo polar de A. brasilense rota en ambas direcciones tanto en
sentido horario como en sentido antihorario; esto permite al microorganismo el
movimiento natatorio (swimming) en medios líquidos (Zhulin, 1993). Los flagelos
laterales son más delgados y cortos, son inducidos en medios semigelificados y son
necesarios para el movimiento sobre superficies sólidas (motilidad superficial o
swarming) (Hall, 1983; Hall y Krieg, 1984). La motilidad natatoria en Azospirillum
interviene en el movimiento de la bacteria hacia las raíces de plantas siendo la
quimiotaxis hacia los exudados la etapa inicial de colonización (Zhulin, 1993). Sin
embargo, la motilidad superficial (swarming) a través de las superficies de las raíces
puede ser importante para la colonización a largo plazo (Alexandre, 1999).
Polisacáridos Extracelulares: se considera que la etapa irreversible de colonización de
Azospirillum en las raíces de las plantas está directamente relacionada con los
exopolisacáridos (EPS) producidos por la bacteria. Además, éstos juegan un papel
esencial en la interacción planta-bacteria (Vanbleu y Vanderleyden, 2003). Así como
los expolisacáridos posibilitan el anclaje de las células bacterianas a la superficie de la
raíz, también establecen conexiones entre células dentro de los agregados bacterianos
(Levanony y Bashan, 1991). Un rasgo único de la colonización de raíces por A.
brasilense es el anclaje bacteriano a través de una red de material fibrilar que cumple la
función de arraigar a las bacterias a la superficie radicular (Levanony y Bashan, 1991).
El material fibrilar puede estar compuesto por hebras simples o múltiples
proporcionando resistencia a la separación de las células. Gracias al mismo, las
bacterias son adsorbidas fuerte y permanentemente sobre las raíces y sobre las partículas
de suelo debido a que la red de material fibrilar proporciona resistencia contra fuerzas
físicas externas aplicadas, tales como el lavado y la agitación (Levanony y Bashan,
1991).
25
Capítulo 3
3. 2. Componentes vegetales que participan en la colonización
Lectinas: las lectinas son proteínas que reconocen y se unen reversiblemente a residuos
de azúcares específicos de moléculas glicosiladas. Se ha observado que las lectinas de
las raíces están involucradas en el proceso de colonización de Azospirillum (UmaliGarcia et al., 1980; Patriquin et al., 1983; Elmerich, 1984). Moens et al. (1995)
determinaron que la principal proteína del flagelo polar de Azospirillum brasilense es
una flagelina glicosilada (Fla1) y sugirieron que las lectinas presentes en las raíces
pueden unirse al segmento glicano de Fla1.
Exudados radicales: los exudados de las raíces están constituidos principalmente por
sustancias de bajo peso molecular (aminoácidos y azúcares) que están disponibles para
los microorganismos que se encuentren en la rizósfera, que es la zona del suelo
adyacente a las raíces donde existe una interacción dinámica con los microorganismos
(Sorensen, 1997). La producción de exudados implica un cierto costo para la planta, por
lo tanto debe proporcionar alguna ventaja selectiva a la misma. Los exudados pueden
brindar beneficios químicos y físicos para la planta; por ejemplo, los mucílagos de las
raíces reducen la fricción entre las puntas de las raíces y el suelo, minimizan la
desecación del ápice de la raíz, promueven la transferencia de nutrientes a la raíz y/o
afectan la interacción entre los microorganismos del suelo y las raíces (Russel, 1977).
Muchas bacterias son atraídas por las sustancias presentes en los exudados
(quimiotaxis) y al dirigirse hacia ellas se acercan a la superficie de las raíces donde
suele ocurrir la colonización (Vande Broek y Vanderleyden, 1995).
4. Objetivo del capítulo
En esta primera parte del presente trabajo de tesis doctoral se planteó un
estudio a nivel ultraestructural de la colonización rizosférica y endofítica de raíces de
plantas de frutilla por métodos microbiológicos, ultraestructurales y moleculares.
26
Capítulo 3
Asimismo, se analizó la posible colonización de Azospirillum desde una
planta madre de frutilla inoculada a sus plantas hijas no-inoculadas a través de los
estolones. A tal fin, se utilizaron técnicas de microscopía óptica y de fluorescencia,
microscopía electrónica de barrido y transmisión, cuantificación de bacterias viables por
el número más probable, y a nivel molecular se realizó la amplificación de un gen
marcador de bacterias diazotróficas, nifD (esencial para la fijación biológica de N2), y la
identificación de las bacterias mediante amplificación del gen 16S ADNr, ARDRA
(amplified 16S ribosomal DNA restriction analysis) y secuenciamiento del gen 16S
ADNr.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Microorganismos
Se emplearon dos cepas de Azospirillum brasilense aisladas del cultivar de
frutilla `Camarosa´ en la provincia de Tucumán:
 A. brasilense REC3 (FJ012319.1) (Raíz Estéril `Camarosa´- cepa endofítica de la raíz)
 A. brasilense PEC5 (Primer Estolón `Camarosa´- cepa endofítica de estolón).
Las mismas fueron caracterizadas microbiológica y molecularmente en un
trabajo previo de Pedraza et al. (2007). Dentro de las características PGPB que las
bacterias presentaron (como la fijación de nitrógeno, producción de indoles y
sideróforos), se consideró a la producción de indoles totales como la más importante y
como criterio de selección de las cepas.
27
Capítulo 3
1. 1. Medios de cultivo
El medio NFb sólido, semisólido y líquido se utilizó para el crecimiento y el
mantenimiento de las cepas puras de Azospirillum (Döbereiner, 1995). El medio NFb
semisólido carece de fuente nitrogenada y otorga un ambiente adecuado para el
crecimiento de las bacterias en condiciones microaeróbicas que permiten fijar nitrógeno.
Además, se utilizaron los medios de cultivo K-lactato, K-malato, y LB, cuyas
composiciones química se describen a continuación:
NFb semisólido: Ácido málico 5 g· l-1; MgSO4·7H2O 0,2 g· l-1; CaCl2·2H2O 0,02 g· l-1;
K2HPO4 0,5 g· l-1; NaCl 0,1 g· l-1; KOH 4,5 g· l-1; solución de micronutrientes 2 ml· l-1;
Fe-EDTA (sol. 1,64%) 2 ml· l-1; azul de bromotimol (sol. 0,5% KOH 0,2 N) 2 ml· l-1 y
agar 1,75 g· l-1; pH 6,8.
Solución de micronutrientes: CuSO4·5H2O 0,04 g· l-1; ZnSO4·7H2O 1,2 g· l-1; H3BO3
1,4 g· l-1; NaMoO4·2H2O 1 g· l-1; MnSO4·H2O 1,175 g· l-1.
NFb sólido: Posee la misma composición química que el anteriormente descrito aunque
la concentración de agar es mayor (15 g· l-1) y está suplementado con extracto de
levadura 0,5 g· l-1 y colorante rojo congo 15 ml· l-1 (solución acuosa 1/400 p/v); pH 6,8.
NFb líquido: Los componentes químicos son los mismos que para el medio NFb
semisólido pero suplementado con NH4Cl al 0,5 % (p/v) y sin azul bromotimol; pH 6,8.
K-Lactato: KH2PO4 0,87 g·l-1; K2HPO4 1,67 g·l-1; MgSO4·7H2O 0,29 g·l-1; NaCl 0,48
g·l-1; Lactato de sodio 0,38 g·l-1; NH4Cl 0,02 g·l-1; CaCl2 0,007 g·l-1; FeCl3 0,001 g·l-1;
NaMoO4·2H2O 0,0025 g·l-1; solución de oligoelementos 10 ml·l-1; agar 15 g·l-1; pH 6,9.
28
Capítulo 3
K-Malato: KH2PO4 0,87 g· l-1; K2HPO4 1,67 g· l-1; MgSO4·7H2O 0,29 g· l-1; NaCl 0,48
g· l-1; Ácido Málico 4,53 g· l-1; NH4Cl 0,02 g· l-1; CaCl2 0,007 g· l-1; FeCl3 0,001 g· l-1;
NaMoO4·2H2O 0,0025 g·l-1; solución de oligoelementos 10 ml·l-1; agar 15 g·l-1; pH 6,9.
Solución de oligoelementos: MgSO4·7H2O 0,25 g·l-1; ZnSO4·7H2O 0,07 g·l-1;
CoSO4·7H2O 0,014 g· l-1; CuSO4·7H2O 0,0125 g· l-1; H3BO3 0,003 g· l-1.
Medio LB (Luria Bertani): triptona 10 g·l-1, extracto de levadura 5 g·l-1; NaCl 10 g·l-1;
agar 15 g· l-1; pH 7,0.
Medio LB modificado: medio LB suplementado con CaCl2 2,5 mM y MgSO4 2,5 mM.
Todos los medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos.
1. 2. Observaciones macroscópicas
El desarrollo bacteriano se analizó en 5 ml de medio NFb semisólido
contenido en frasco de vidrio de 10 ml, considerando el viraje del indicador azul de
bromotimol, de azul a verde, y el desarrollo de una película blanquecina subsuperficial
luego de 48-72 h de incubación a 30ºC.
1. 3. Observaciones microscópicas
Las observaciones microscópicas se realizaron con un microscopio óptico
ZEISS Standar 25 (ZEISS, Alemania) sobre preparados de cultivos frescos con el fin de
analizar la morfología y motilidad de las bacterias. También se realizaron frotis y
coloración de la pared celular con el método de Gram, utilizando las soluciones de
coloración de Laboratorios Britania.
29
Capítulo 3
1. 4. Estudios de la ultraestructura celular de A. brasilense
Las cepas REC3 y PEC5 se cultivaron en medio NFb líquido, a partir de una
colonia pura, desarrollada previamente en medio NFb sólido. El volumen de cultivo fue
de 5 ml, con tres repeticiones por cada cepa, las que se incubaron a 30 ºC durante 48 h
con agitación (180 rpm). Finalizado este tiempo se colectaron las células (1 ml)
concentrándolas por centrifugación (14.000 rpm por 5 min) 5 veces hasta formar una
pastilla de aproximadamente 0,5 cm de espesor.
1. 4. 1. Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)
Las muestras de las bacterias colectadas en la etapa anterior fueron fijadas
en el fijador de Karnovsky (1965) durante 3 horas a 4 ºC, posteriormente lavadas tres
veces en tampón fosfato 0,1M pH 7,4, incluidas en agar y postfijadas durante toda la
noche en tetróxido de osmio (OsO4) al 1% a 4 ºC. Finalmente las muestras fueron
tratadas con una solución acuosa de acetato de uranilo al 2% durante 40 min. Después
de la fijación, fueron deshidratadas en una serie de graduación creciente de etanol 96°
(de 25 % a 100 %) seguida de acetona (100 %). La infiltración se llevó a cabo en una
mezcla de acetona y resina plástica Spurr y finalmente la inclusión en la resina pura. A
partir de los bloques obtenidos se realizaron cortes ultrafinos que se montaron en grillas
de cobre, se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo (Venable y
Coggeshall, 1965) y se examinaron en el microscopio electrónico de transmisión ZEISS
EM 109 (ZEISS, Alemania) del Centro Integral de Microscopía Electrónica (CIME,
UNT-CONICET).
1. 4. 2. Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)
Las muestras bacterianas fueron procesadas de igual manera que para MET
hasta la etapa de deshidratación; luego fueron desecadas por punto crítico, montadas
30
Capítulo 3
sobre un portaespecimen de aluminio empleando pintura de plata y finalmente
metalizadas con oro para su observación en los microscopios electrónicos de barrido
JEOL 35CF (JEOL, Alemania) y ZEISS SUPRA 55VP (ZEISS, Alemania) del Centro
Integral de Microscopía Electrónica (CIME, UNT-CONICET).
1. 5. Obtención de una cepa transgénica A. brasilense REC3::gfp (green fluorescent
protein) por conjugación triparental
Con el fin de obtener una construcción estable de A. brasilense que exprese
el gen gfp para monitorear la colonización de plantas de frutilla, se transformó la cepa
A. brasilense REC3 con el plásmido pRU1156-ChsA provisto por el Laboratorio de
Ciencias Microbiológicas de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, México.
Este es una fusión del plásmido pRU1156 (Karunakaran et al., 2005) que contiene las
secuencias que codifican los genes reporteros gfpmut3.1 y gusA sin promotor, al que se
le insertó el promotor del gen ChsA de A. brasilense Sp7 (ATCC 29145) corriente
arriba. Este plásmido además expresa constitutivamente genes de resistencia a
tetraciclina (Tc) y genes parADCDE responsables de la segregación de éstos plásmidos
durante la división celular.
La transformación se realizó por conjugación triparental utilizando una cepa
E. coli DH5α pRU1156-ChsA como donadora, la cepa E. coli HB101 que conteniene el
plásmido “helper” pRK2013 (Figurski y Helinski, 1979) y la cepa A. brasilense REC3
como receptora.
Alícuotas de 50 µl de cultivos frescos de cada cepa se hicieron crecer en 5
ml de medio líquido fresco (1:100) con agitación y con sus correspondientes
antibióticos (ATB):
 Cepa E. coli pRU1156-ChsA - Tc10 - medio LB, 18 h a 37ºC, 200 rpm
 Cepa E. coli pRK2013 - Km20 - medio LB, 18 h a 37ºC, 200 rpm
31
Capítulo 3
 Cepa A. brasilense REC3 - medio LB modificado, s/ATB, 24 h a 30ºC, 200 rpm
Posteriormente, 50 µl de estos precultivos se sembraron en 5 ml de medio
líquido fresco sin antibióticos:
 Cepa E. coli pRU1156-ChsA, medio LB, s/agitación, s/ATB, 2 h a 37ºC
 Cepa E. coli pRK2013, medio LB, s/agitación, s/ATB, 2 h a 37ºC
 Cepa A. brasilense REC3, medio Lb modificado, s/ATB, 6 h a 30ºC, 200 rpm
Luego de la incubación, se sembraron 10 µl de cada cultivo en una placa de
Petri con medio LB modificado sólido sin antibióticos, esperando 20 min entre cada
siembra y en el siguiente orden: E. coli pRK2013, E. coli pRU1156-ChsA y A.
brasilense REC3. Para conseguir la relación 1:1:10, se concentró la cepa receptora
mediante centrifugación de 1 ml de cultivo a 8.000 rpm por 2 min y posterior
resuspención en un volumen menor (15 µl).
Luego de 48 h de incubación se estrió la conjugación en una placa con
medio K-Lactato+Tc15. Este medio es selectivo para Azospirillum porque E. coli no
puede crecer con NH4Cl como fuente de N. Las colonias que crecieron en KLactato+Tc15 fueron purificadas mediante repiques periódicos en el mismo medio
líquido y sólido.
1. 5. 1. Microscopía de Fluorescencia
Se logró confirmar la expresión de la proteína GFP en los transconjugantes
de A. brasilense REC3::gfp utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51
equipado con un sistema de fluorescencia reflectiva U-LH100HG (Olympus, Japón).
Cuando la proteína es excitada con luz azul mediante el filtro U-MWB2 (420-490 nm)
la bacteria fluoresce verde y cuando es excitada con luz UV (filtro U-MWU2, 330-385
nm) la expresión de la proteína le otorga fluorescencia azul brillante a la bacteria.
32
Capítulo 3
1. 5. 2. Control de estabilidad de la construcción A. brasilense REC3::gfp
La estabilidad de esta construcción se comprobó haciendo crecer la cepa
transconjugante en medio líquido y sólido con y sin presión de selección (Tc) por
numerosas generaciones; el número de UFC se determinó por el método de
cuantificación de las gotas de Miles y Misra (1973). Para ello, se cultivó la cepa A.
brasilense REC3::gfp en dos condiciones distintas: medio Lb líquido con Tc15 y Lb sin
ATB,
a 30 ° C durante 24 h con agitación, y se la consideró como la primera
generación (G1). A partir de ésta se tomaron 50 µl y se inocularon nuevamente en 5 ml
de medio Lb con y sin Tc15 (G2); esto se repitió 10 veces cada 24 h de incubación. En
cada generación, se tomaron 100 µl de cultivo, se realizaron diluciones seriadas con
buffer fosfato de potasio (pH 6,8) y se sembraron 5 gotas de 10 µl de cada dilución (103
, 10-4, 10-5, 10-6) en medio NFb sólido con y sin Tc15 respectivamente. Las UFC·ml-1 se
determinaron de acuerdo a la siguiente fórmula, donde el volumen sembrado
corresponde a 50 µl (5 gotas de 10 µl):
La expresión de GFP fue controlada en cada generación por microscopia de
fluorescencia (U-MWU2, 330-385 nm).
1.5.3. Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos de UFC·ml-1 se realizó utilizando el
software Infostat (ver. 2008 para Windows) para el análisis de la varianza (ANOVA) y
las diferencias significativas utilizando el test de diferencias múltiples de Tukey con un
valor de p <0,05.
33
Capítulo 3
2. Material Vegetal
Se emplearon tres variedades de frutilla: `Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´, que
son cultivadas comercialmente en la provincia de Tucumán. Las plantas empleadas en
este trabajo fueron saneadas por cultivos in vitro y las mismas fueron facilitadas por el
Banco de Germoplasma Activo perteneciente al Instituto Superior de Investigaciones
Biológicas (INSIBIO). Se controló la esterilidad de las plantas saneadas por cultivo in
vitro sembrando un macerado de las mismas en placas de Petri con medio LB y se
incubaron a 30 ° C por 120 h.
3. Inoculación de plantas de frutilla con A. brasilense en soporte líquido
3. 1. Modelo experimental
Para evaluar ultraestructuralmente la colonización de las plantas de frutilla
con A. brasilense, se realizó un ensayo de inoculación; para ello se prepararon cultivos
puros de las cepas REC3 y PEC5 crecidas en el medio NFb líquido con una
concentración final de aproximadamente 106 UFC· ml-1.
Se emplearon en total 27 plantas de frutilla: 9 var. `Camarosa´, 9 var.
`Milsei´ y 9 var. `Selva´. En cada variedad de frutilla se realizaron tres tratamientos
cada uno de ellos por triplicado: (i) tres plantas fueron inoculadas con REC3, (ii) tres
plantas fueron inoculadas con PEC5 y (iii) tres plantas control sin inocular.
3. 2. Acondicionamiento de las plantas en soporte líquido
Las plantas se colocaron en tubos de vidrio estériles con un soporte de guata
y 20 ml de solución nutritiva de Hoagland diluida al 50% (Hoagland y Arnon, 1950)
como medio de cultivo hidropónico. La parte superior de los tubos se cerró con un film
plástico y se cubrió la parte inferior hasta la altura del soporte con papel de aluminio
con el objeto de proteger la zona radicular de la luz directa, simulando el área
34
Capítulo 3
correspondiente al suelo. Esta forma de cultivo permite realizar observaciones
microscópicas de la superficie de las raíces de plantas de frutilla sin la interferencia que
generan las partículas de suelo adheridas a ellas cuando se utiliza soporte sólido.
3. 3. Preparación del inóculo
Para el inóculo se prepararon cultivos puros de las cepas de A. brasilense
REC3 y PEC5, sembrando una colonia (1 UFC) de aproximadamente 0,5 mm de
diámetro en un tubo con 5 ml de medio de cultivo NFb líquido. Se incubaron durante 48
h a 30 ºC y 180 rpm. Se ajustó la concentración final del inóculo a DO560= 0,2 que
corresponde a aproximadamente 106 UFC· ml-1.
3. 4. Inoculación
Tres plantas de cada variedad de frutilla (`Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´)
fueron inoculadas por riego, y de forma independiente, con: (i) 1 ml de la suspensión
bacteriana REC3, (ii) 1 ml del inóculo de PEC5 y (iii) 1 ml de H2O destilada estéril que
correspondían al tratamiento control sin inoculación.
Todas las plantas se mantuvieron durante 13 días en cámara de cría en
condiciones controladas: 14 h de luz y 10 h de oscuridad, temperatura (25 ± 2) ºC y
80% de humedad relativa (HR).
3. 5. Estudios Ultraestructurales:
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y de Barrido (MEB)
Para estudiar la colonización superficial y endofítica de Azospirillum
brasilense se tomaron muestras de raíces de las plantas de frutilla cultivadas en soporte
líquido, las que fueron procesadas para su observación por microscopía electrónica de
acuerdo a la técnica explicada en la sección (1.1.4.). La única variante de la metodología
35
Capítulo 3
empleada en MET y en MEB, consistió en que las muestras una vez fijadas en la
solución de Karnovsky no fueron incluidas en agar.
4. Inoculación de plantas de frutilla con A. brasilense en soporte sólido
4. 1. Modelo experimental
La inoculación de plantas de frutilla en soporte sólido permitió evaluar por
métodos microbiológicos, ultraestructurales y moleculares la colonización de
Azospirillum brasilense. Con este fin, se realizó un ensayo de inoculación repitiendo el
modelo descrito en la sección (2.1).
4. 2. Inoculación
La inoculación se realizó sumergiendo las raíces de las plantas en la
suspensión bacteriana (106 UFC· ml-1) durante 20 min. Los inóculos utilizados en este
ensayo se prepararon de acuerdo a lo descrito en el ítem (2.3). Para el tratamiento
control las raíces fueron sumergidas en agua destilada estéril.
Las plantas de frutilla, tres por cada tratamiento, se plantaron
individualmente en macetas estériles (desinfectadas con etanol 70º) utilizando sustrato
estéril (compost orgánico: resaca de río: acículas de pino; 1: 1: 1). El sustrato se
esterilizó tres veces en autoclave a 121ºC durante 20 min, con períodos de 24 h entre
cada esterilización. El control de esterilización se realizó sembrando el sustrato
esterilizado en placas de Petri con medio Lb sólido; si al cabo de 48 h no había
crecimiento microbiano, se consideraba estéril y apto para el ensayo.
Las macetas (0,5 litros) se colocaron en bandejas plásticas y se taparon con
una película plástica para crear una cámara húmeda durante los primeros treinta días de
aclimatación. Para evitar la contaminación externa o cruzada entre los distintos
tratamientos, se utilizaron distintas bandejas para cada tratamiento.
36
Capítulo 3
Una vez aclimatadas, y durante los siguientes seis meses, todas las plantas
de frutilla se mantuvieron en un fitotrón en condiciones controladas: temperatura de 25
ºC ± 2 ºC, 70% de HR y 16 h de fotoperíodo. Las plantas se regaron con agua destilada
estéril por capilaridad dos o tres veces por semana. En esta etapa se produjo el
crecimiento y la reproducción vegetativa de las plantas; cuando ellas producían
estolones (con dos hojitas) se fijaban en otra maceta con sustrato estéril para formar
nuevas plantas hijas, sin cortar los estolones.
Cada planta de frutilla produce numerosos estolones, que darán lugar a
varias hijas, por lo tanto, a fin de simplificar el diseño experimental y reducir el número
de plantas a analizar, se siguió solamente una línea de plantas hijas hasta la segunda o
tercera generación, según se esquematiza en la Figura 2.
1°st estolón
1
Planta madre
(inoculada con
A. brasilense)
2°
2ndestolón
1° Planta hija
2° Planta hija
3° estolón
4° estolón
3° Planta hija
Figura 2. Representación esquemática de la propagación asexual de frutilla.
Al cabo de siete meses, cuando las plantas habían crecido lo suficiente,
teniendo como mínimo dos generaciones de plantas hijas cada una, se tomaron muestras
de raíces y estolones para realizar la determinación del número más probable de
diazótrofos, la extracción de ADN y los estudios ultraestructurales.
37
Capítulo 3
4. 3. Ensayos microbiológicos. Determinación del Número Más Probable (NMP)
de A. brasilense en distintos tejidos de plantas de frutilla
4. 3. 1. Toma de muestras
Las 27 plantas iniciales se reprodujeron dando lugar a numerosas plantas
hijas, de éstas se tomaron 55 muestras de raíces y estolones con distintos tratamientos.
De cada planta se cortaron raíces con una tijera esterilizada por flameado,
las que luego fueron lavadas con agua destilada estéril para eliminar el suelo adherido a
ellas. Los estolones se esterilizaron superficialmente con alcohol 70º.
4. 3. 2. Determinación del NMP
Se determinó el número más probable de bacterias diazotróficas por gramo
de raíces y de estolones utilizando la tabla de McCrady para tres repeticiones siguiendo
el método descrito por Döbereiner et al. (1995).
Se pesó 1 g de cada tejido vegetal (raíces y estolones) y se maceraron en un
mortero de porcelana con 9 ml de buffer fosfato (pH 6,8). A partir de esto, se realizaron
diluciones seriadas y se sembraron 100 μl de cada dilución en el medio de cultivo NFb
semisólido, por triplicado. Luego de incubar por 48 h a 30 ºC, se determinó el NMP.
Se realizaron también observaciones macroscópicas y microscópicas para
observar la morfología y motilidad característica de Azospirillum, a fin de poder
confirmar el reaislamiento de Azospirillum y no de otra bacteria. Para ello, se verificó si
los tubos presentaban crecimiento característico en el medio NFb semisólido y a partir
de los tubos con crecimiento positivo, se observaron muestras colocadas entre porta y
cubre objetos en el microscopio óptico ZEISS Standar 25 (ZEISS, Alemania) con un
objetivo 100x.
38
Capítulo 3
4. 4. Estudios ultraestructurales.
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y de Barrido (MEB)
Se utilizó la microscopia electrónica para investigar la presencia de
Azospirillum brasilense en los tejidos de raíces y estolones, y de esta manera,
comprobar la colonización bacteriana. El estudio ultraestructural de las raíces se realizó
por MET siguiendo la metodología descrita en la sección (1.1.4.1).
En el caso de los estolones, se tomaron muestras de aproximadamente 1 cm
de longitud de la parte media entre dos nudos, se procesaron de acuerdo a la técnica
descrita en la sección (1.1.4.2) y se cortaron longitudinalmente para observar los tejidos
internos en el microscopio electrónico de barrido ZEISS SUPRA 55VP (ZEISS,
Alemania) del Centro Integral de Microscopía Electrónica (CIME, UNT-CONICET).
4. 5. Estudios Moleculares
Los genes nif son propios de las bacterias diazotróficas y no están presentes
en el genoma de las plantas; son esenciales para los procesos biológicos de fijación de
N2 debido a que codifican para el complejo enzimático nitrogenasa.
A partir de muestras de tejidos vegetales, se extrajo el ADN y se amplificó
por la reacción en cadena de la enzima polimerasa (PCR) un fragmento del gen nifD que
codifica a la subunidad nitrogenasa lo que confirmaría la presencia de bacterias
diazotróficas en los tejidos vegetales.
La confirmación de la identidad de esas bacterias diazotróficas se realizó
mediante ARDRA (amplified 16S ribosomal DNA restriction analysis) y secuenciación
del gen 16S ADNr del ADN de las bacterias re-aisladas de raíces y estolones de frutilla.
39
Capítulo 3
4. 5. 1. Extracción de ADN de tejidos vegetales
La extracción del ADN molde para la reacción en cadena de la polimerasa
se hizo por el método del CTAB descrito por Doyle y Doyle (1987), adecuado para
pequeñas cantidades de material vegetal fresco.
Las muestras de raíces y estolones se molieron con nitrógeno líquido en un
mortero de porcelana. El material obtenido se colocó en microtubos y se sumergió en
CTAB caliente (65 º C). Posteriormente fue necesario sólo una extracción con
cloroformo: alcohol isoamílico (24 : 1) y una precipitación con isopropanol. Luego de
dos lavados de la pastilla con etanol 70º a 4 ° C y una precipitación con etanol absoluto.
Las muestras de ADN se resuspendieron en buffer TE (Tris HCl- EDTA) (Sambrook et
al. 1989).
A fin de eliminar cualquier tipo de interferencia y purificar las muestras de
ADN se realizó una ulterior limpieza con una mezcla de cloroformo: fenol (50:50; pH
8,0), seguida de dos extracciones- precitaciones con etanol absoluto y etanol 70º a 4 ° C.
Para verificar la presencia y calidad del ADN obtenido se realizó una
electroforesis horizontal sembrando alícuotas de 8 μl de ADN con 2 μl de buffer de
siembra (Biodynamics, Argentina) en un gel de agarosa al 1% en buffer TBE 1X (Trisácido borico- EDTA) (Sambrook et al. 1989). Los geles se tiñeron con bromuro de
etidio (0,5 μg ml-1) durante 10 min, se lavaron con agua destilada 5 min y se
visualizaron sobre luz UV (320 nm) en un transiluminador Vilber Lourmat TFX-20M
(Vilber Lourmat, Francia). Las fotografías se tomaron con un equipo de digitalización
de imágenes Kodak (EEUU).
40
Capítulo 3
4. 5. 2. Amplificación por PCR del gen nifD
Se amplificó por PCR un fragmento de 710 bp del gen nifD, usando los
cebadores y las condiciones descritas por
Potrich et al. (2001). Primer directo:
5´ATCATCGGTGACTACAAC 3´ (18 bp) y reverso: 5´ATCCATGTCGCGGCGAA
3´ (17 bp).
La mezcla de reacción se realizó en 25 μl de volumen final: 0,2 unidades de
la enzima ADN-Taq polimerasa (Promega, EE UU), 1 μl de dNTPs 10 mM, 1,5 μl de
MgCl2 1,5 mM, 5 μl de buffer de la enzima y 1 μl de cada cebador 10 μM; se trabajó
con distintas cantidades de ADN molde (2, 1 y 0,5 μl). En la reacción de PCR sólo fue
posible amplificar el fragmento esperado cuando se utilizó 0,5 μl de ADN molde en la
mezcla de reacción.
El programa de PCR utilizado consistió en: un calentamiento de
desnaturalización inicial a 95 º C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de
desnaturalización a 95 º C por 1 min, hibridación a 48 º C por 1 min y extensión a 72 º C
por 2 min. La reacción concluyó con un ciclo de extensión final a 72 º C durante 5 min
y luego las muestras se mantuvieron a 4 º C. Las amplificaciones se realizaron no menos
de 3 veces en un Termociclador Apollo ATC 201 (Apollo, EEUU).
En la reacción de PCR se incluyó un control positivo, cuyo ADN molde (1
μl) provino de la lisis térmica de la bacteria Azospirillum brasilense Sp7 (ATCC 29145)
utilizada como cepa de referencia, provista por EMBRAPA-Agrobiología, Brasil. Para
la disrupción térmica se suspendió una colonia de la cepa Sp7 en 30 μl en agua destilada
estéril a una temperatura de 95 ºC durante 10 min y luego se enfrió a temperatura
ambiente. El control negativo fue la mezcla de reacción con el agregado de agua
destilada estéril en lugar de ADN. Los productos de amplificación se analizaron por
electroforesis horizontal de acuerdo a la técnica descrita en la sección (4.5.1).
41
Capítulo 3
4. 5. 3. Extracción de ADN bacteriano, amplificación por PCR del gen 16S ADNr
y restricción enzimática
La amplificación por PCR del 16S ADNr se realizó directamente de
colonias bacterianas puras de los re-aislamientos obtenidos a partir de tejidos de frutilla,
que fueron sometidas a una lisis térmica (explicada anteriormente). Se incluyeron
también las cepas A. brasilense REC3, PEC5 y Sp7 como controles positivos.
Para amplificar un fragmento de 1450 bp del gen 16S ADNr se utilizaron los
primers universales 27f (5´-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3´) y 149r (5’CTACGGCTACCTTGTTACGA 3´) que tienen una temperatura de hibridación 60 ºC
(Grifoni et al., 1995).
La técnica de ARDRA (amplified 16S ribosomal DNA restriction analysis)
se basa en la amplificación por PCR y digestión enzimática del gen 16S ADNr. Para la
identificación de los aislados correspondientes a la especie A. brasilense, los amplicones
positivos de 16S ADNr (15 μl) fueron digeridos con 5 U de la enzima de restricción AluI
(Promega, EEUU) durante 3 h a 37 ° C. La reacción tuvo un volumen final de 30 μ1.
Finalmente, los fragmentos de la digestión se separaron por electroforesis en gel de
agarosa (1,5 % p/v) para obtener los perfiles de ARDRA (sección 4.5.1.).
4.5.4. Secuenciación automática del 16S ADNr
La secuenciación del gen 16S ADNr de cuatro aislamiento representativos
(bacterias aisladas de plantas madre, 1era, 2da y 3era hija) se realizó por el método de
dideoxi de Sanger et al., (1977). La reacción de secuenciación se llevó a cabo utilizando
un equipo de 4 capilares ABI 3130/Hitachi Genetic Analyzer (Applied Biosystems,
EEUU ) y los oligonucleótidos 27f y 149r previamente descriptos.
El análisis de secuencia se realizó por comparación con las secuencias
nucleotídicas disponibles en las bases de datos del GenBank, EMBL, DDBJ y PBD
42
Capítulo 3
utilizando el programa BLASTN 2.2.25 (Zhang et al., 2000) a través del servidor del
Centro Nacional de Información Biotecnologica (NCBI).
5. Inoculación de plantas de frutilla en condiciones hidropónicas con la cepa
transgénica A. brasilense REC3::gfp
Con el fin de monitorear la colonización de A. brasilense en raíces de
plantas de frutilla inoculadas se obtuvo la cepa transformada A. brasilense REC3::gfp y
se realizaron ensayos de inoculación en condiciones hidropónicas para estudiar la
colonización hasta los 28 días post-inoculación. En contraste con la microscopía
electrónica (MEB y MET), en la cual las muestras deben ser fijadas, deshidratadas y
contrastadas parar su observación, la microscopía de fluorescencia permite la
observación de las bacterias vivas y fisiológicamente activas.
5. 1. Optimización de las condiciones hidropónicas para plantas de frutilla
Se realizó un ajuste metodológico del cultivo de plantas de frutilla en
hidroponía para trabajar con un sistema radicular limpio, libre de sustancias que
pudieran interferir en las observaciones microscópicas. Manteniendo constante el
fotoperiodo (16 h), la temperatura (28 ° C) y la humedad relativa (70 % HR), se
probaron distintas soluciones minerales: solución de Hoagland al 100 %, 75 % y 50 %
(Hoagland y Arnon, 1950), solución de Hoagland modificada (Epstein, 1972) y medio
Vine sin hormonas (Vine, 1968). También se probaron distintos soportes para el medio
líquido como guata, telgopor (poliestireno expandido), arena inerte y un medio
agarificado (agar 0,6 % p/v), en distintos recipientes (tubos de ensayo, frascos y
bandejas), con y sin aireación (pO2= 20 kPa).
43
Capítulo 3
5. 2. Modelo Experimental
Para el cultivo de frutilla en condiciones hidropónicas se utilizaron bandejas
estériles que contenían solución de Hoagland modificada (Epstein, 1972) estéril con
soportes de telgopor, aireación contante (pO2= 20 kPa) y condiciones controladas
(fotoperíodo 16 h, 28 º C, 70 % HR), siendo este sistema el más adecuado para el
cultivo de hidropónico de frutilla durante períodos largos (alrededor de 2 meses).
Se inocularon con A. brasilense REC3::gfp ocho plantas de Fragaria
ananassa var. `Camarosa ´ saneadas por cultivo in-vitro y se incluyeron ocho plantas
no-inoculadas como control. Las plantas inoculadas y control se mantuvieron en
bandejas diferentes. Para las observaciones microscópicas, se tomaron muestras por
duplicado a distintos tiempos post-inoculación: 2, 7, 14 y 28 días.
5. 3. Inoculación
La inoculación se realizó sumergiendo las raíces de frutilla en una
suspensión bacteriana de A. brasilense REC3::gfp (106 UFC ·ml-1) durante 30 min. Al
cabo de ese tiempo las plantas retornaron a las bandejas aireadas con solución de
Hoagland (Epstein, 1972).
5. 4. Observación por microscopía óptica de fluorescencia
Las observaciones por microscopía de fluorescencia se realizaron montando
muestras de raíces inoculadas y controles (de 2 a 3 cm de longitud aproximadamente) en
portaobjetos para su directa observación utilizando un microscopio de fluorescencia
Olympus BX51/U-LH100HG (Olympus, Japón) con filtro U-MWB2 (420-490 nm) que
permite la visualización de la cepa transconjugante A. brasilense REC3::gfp.
44
Capítulo 3
RESULTADOS
1. Estudios de la ultraestructura celular de Azospirillum brasilense
1. 1. Observaciones macroscópicas
Las dos cepas de Azospirillum en estudio, REC3 y PEC aisladas de raíz
estéril y primer estolón de ˋCamarosa´ respectivamente, crecieron en el medio NFb
semisólido desarrollando una delgada película blanquecina subsuperficial al cabo de las
48 h de incubación y produciendo el viraje del indicador azul de bromotimol, de verde a
azul (Fig. 3).
Figura 3. Crecimiento de Azospirillum brasilense REC3 en medio NFb semisólido.
Luego de 48 h de incubación a 30 ºC se observa el viraje del indicador, de verde a azul y la
formación de una película blanquecina subsuperficial.
La película subsuperficial se formó a aproximadamente 1 mm por dejado de
la superficie del medio de cultivo donde se establece una condición microaeróbica y la
tasa de difusión del oxígeno está en equilibrio con la tasa de respiración de las bacterias.
1. 2. Observaciones microscópicas
Las observaciones realizadas en un microscopio óptico de los preparados
frescos de REC3 y PEC5 permitieron comprobar la morfología bacilar de las células no
agrupadas y que éstas se desplazan con movimientos espiralados, típicos de
Azospirillum.
La tinción de la pared celular por el método de Gram, mostró que la misma
es de color rosa intenso, correspondiendo a bacterias Gram (-).
45
Capítulo 3
1. 3. Microscopía electrónica
Se analizaron las características ultraestructurales de Azospirillum cuando
éste se presenta como una bacteria de vida libre (Fig. 4 a 6).
Las cepas REC3 y PEC5 exhibieron similares características morfológicas.
La microscopía electrónica de barrido muestra que Azospirillum brasilense presenta
forma de bacilos de 1,5 μ a 2 μ de longitud y 0,5 μ de ancho aproximadamente (Fig. 4).
1,0 µ
1,0 µm
Figura 4. Micrografía electrónica de barrido de A. brasilense (x15.000). Nótese que la
superficie es lisa y aparentemente no hay conexiones entre las células.
En las micrografías electrónicas de transmisión se observa que Azospirillum
brasilense exhibe características morfológicas típicas de bacterias Gram (-) (Fig. 5 y 6).
Estas presentan un sistema de membranas doble en el que la membrana plasmática está
rodeada por una membrana externa y separadas por un área electrolúcida que
corresponde al espacio periplásmico. En algunas imágenes es posible visualizar un
material de naturaleza fibrilar asociado a la membrana externa que se dispone en forma
radial y que correspondería a lipopolisacáridos (estructura lipídica compleja que
contiene azúcares poco frecuentes y ácidos grasos) (Fig. 5a). En la Figura 5b se
observan en el citoplasma celular estructuras electrolúcidas que corresponderían a
gránulos de β-polihidroxibutirato (material de reserva común en algunas células
procariotas).
46
Capítulo 3
a.
b.
Figura 5. Micrografías electrónicas de transmisión de Azospirillum brasilense.
a. microfibrillas cortas en forma radial (x82.640). b. las flechas señalan los gránulos de βpolihidroxibutirato (x33.300).
También se pudo observar que desde la superficie celular y en un extremo
de la bacteria se proyecta un flagelo polar (Fig. 6), necesario para la motilidad y
adhesión de la bacteria a la planta hospedera.
a.
b.
c.
Figura 6. a. Micrografías electrónicas de transmisión del flagelo polar de A. brasilense.
a. (x50.080). b. (x82.640). c. (x140.600).
47
Capítulo 3
1. 4. Microscopía de fluorescencia
Los transconjugantes de A. brasilense REC3::gfp positivos fueron
fácilmente observados e identificados mediante microscopía de fluorescencia.
La cepa A. brasilense REC3::gfp resultante es resistente a Tc15 y expresa la
proteína GFP que le otorga fluorescencia verde brillante bajo luz azul mediante el filtro
U-MWB2 (420-490 nm) como se muestra en la Fig. 7.
a.
b.
Figura. 7. Micrografía de A. brasilense REC3::gfp tomada mediante (a) microscopía óptica y
(b) de fluorescencia utilizando el filtro de luz azul (U-MWB2 420-490 nm). Magnificación 100x.
Se determinó que la construcción es genéticamente estable ya que el
plásmido se mantuvo dentro de la cepa transformada por más de 25 generaciones con y
sin presión de selección (Tc) y durante más de tres años de repiques periódicos en
nuestro laboratorio. En la Figura 8 se muestra los resultados del análisis de estabilidad
de la construcción A. brasilense REC3::gfp durante 10 generaciones en medio NFb con
y sin antibiótico, expresados en porcentaje de UFC ∙ml-1, y determinado por el método
de cuantificación de las gotas (drop-count) como se ilustra en la Fig. 9. A pesar que se
observó una disminución significativa del porcentaje de UFC∙ml-1 en todas las
generaciones cultivadas con Tc15 (p <0,05), el porcentaje de bacterias viables que
expresaban la resistencia a Tc, conferida por el plásmido pRU1156-ChsA, fue mayor al
50% en todas las generaciones analizadas indicando la estabilidad de la transconjugante.
48
Capítulo 3
Porcentaje de UFC ∙ml-1 en medio NFb con y sin Tc
Medio NFb sin Tc
Medio NFb con Tc
120,00
100,00
a
a
a
a
a
a
b
b
80,00
b
b
60,00
a
a
a
a
% UFC ∙ml-1
a
a
b
b
b
b
40,00
20,00
0,00
N1
N2
N3
N4
N5
N6
N7
N8
N9
N10
Generaciones
Figura 8. Porcentaje de Unidades Formadoras de Colonias (UFC ∙ml-1 ) en medio NFb sólido
con y son presión de selección (Tc) durante 10 generaciones (N1 a N10) determinado por el
método de cuantificación de las gotas. Prueba de diferencias por el test de Tuckey (p <0,05).
a
b
Figura 9. Método de cuantificación de células viables de A. brasilense REC3::gfp. por el método de
cuantificación de las gotas. En cada generación se sembró 50 µl de cada dilución (10-4, 10-5, 10-6,
10-7) en medio NFb sólido sin presión de selección (a) y medio NFb sólido con Tc15 (b). Las
colonias de Azospirillum presentan la coloración típica del género, rojo escarlata, cuando son
cultivadas en presencia del colorante Rojo Congo.
49
Capítulo 3
2. Estudios ultraestructurales de las raíces de plantas desarrolladas en soporte
líquido inoculadas con A. brasilense
Muestras de raíces de plantas madre inoculadas con Azospirillum brasilense,
de raíces de plantas hijas sin inocular y de estolones fueron estudiadas mediante
microscopía electrónica de barrido y de transmisión.
En las raíces se analizaron las zonas de alargamiento y el ápice de acuerdo
al esquema mostrado en la Figura 10.
a.
b.
100,0 µm
Figura 10. a. Representación esquemática de una raíz. b. Micrografía electrónica de
barrido de una raíz de frutilla inoculada con A. brasilense (x60).
La microscopía electrónica permitió confirmar la existencia de dos procesos
diferentes de colonización. En uno de ellos las bacterias se disponen inicialmente de
manera perpendicular a la superficie radicular. En una etapa posterior se posicionan de
manera horizontal, paralela a la superficie radical, a la vez que un material filamentoso
contribuye a un proceso de agregación que finalmente lleva a la formación de una
biopelícula (Fig. 11).
50
b.
1,0 µm
1,0 µm
e.
d.
1,0 µm
f.
1,0 µm
Figura 11. Proceso de adhesión y formación del biopelícula bacteriana. a. Superficie radicular de frutilla sin
inocular (x5.400). b. Azospirillum brasilense en estado de vida libre (x16.000). c. Flagelo polar (x140.600)
d. Azospirillum unido a un pelo radicular (x15.000) e. A. brasilense unido a la superficie radicular (x15.000).
f. Bacterias unidas a la superficie radicular y recubiertas por material fibrilar (x7.200). e. Biopelícula producida
por Azospirillum sobre la superficie de la raíz (x7.200)
1,0 µm
a.
1,0 µm
c.
g.
Capítulo 3
51
Capítulo 3
En un segundo mecanismo, algunas bacterias aisladas se adhieren
individualmente a la superficie radicular por uno de sus polos y pueden observarse
parcialmente incluidas en los tejidos superficiales. En esta modalidad de colonización
no se observó la asociación de bacterias entre sí, ni la presencia de material fibrilar que
las aglutine (Fig. 12).
b
.
a.
1,0 µm
1,0 µm
Figura 12. Micrografías electrónicas de barrido que muestran a Azospirillum en estrecha
asociación con los tejidos radiculares. a. y b. Bacterias dispuestas perpendiculamente a la
superficie radicular (a. x16.000) y parcialemente incluídas en la pared celular (b. x7.200).
Además del material segregado por las bacterias (Fig. 13a), la superficie
radicular presentó un material de aspecto granuloglobular (Fig. 13b). Fue en estas áreas
donde se observó una mayor concentración de bacterias asociadas.
También se visualizaron en algunas raíces zonas con baja densidad de
bacterias asociadas (Fig. 14 a), áreas que exhiben la formación de agregados bacterianos
(Fig. 14 b) y áreas con biopelículas que tapizan la superficie radicular (Fig. 14 c, d).
52
Capítulo 3
a.
b.
1,0 µm
1,0 µm
Figura 13. Micrografías electrónicas de barrido de bacterias adheridas a la superficie de la
zona de elongación de la raíz. a. material de naturaleza fibrilar sobre las bacterias (x7.200).
b. material granuloglobular sobre la superficie radicular (x15.000).
b
.
a
.
1,0 μm
1,0 μm
c
.
1,0 μm
d
.
10,0 µm
Figura 14. Micrografías electrónicas de barrido que muestran los distintos grados de
agregación bacteriana. a. bajo (x7.200). b. moderado (x13.000). c. alto (x7.200).
d. Nótese la formación de una biopelícula con alta densidad de bacterias (x600).
53
Capítulo 3
La microscopía electrónica de transmisión también mostró la formación de
biopelículas sobre las células epidérmicas de la raíz con numerosas bacterias en activa
división celular (Fig. 15).
a.
b.
Figura 15. Micrografías electrónicas de transmisión que muestra la biopelícula formada por las
bacterias sobre las células epidermicas de la raíz y sobre los pelos absorbentes.
a. (x10.950). b. (x10.950).
La figura 16 muestra las interacciones que se establecen entre las distintas
variedades de frutilla ensayadas con las dos cepas de Azospirillum inoculadas.
En las variedades `Camarosa´ y `Milsei´ se observó una mayor densidad de
bacterias de la cepa A. brasilense REC3 unidas a la superficie radicular (Fig. 16 b, e) en
comparación con la cepa PEC5 (Fig. 16 c, f). A diferencia de éstas dos variedades de
frutilla, en la variedad `Selva´ (Fig. 16 g, h, i), se observó cualitativamente mayor
número de bacterias de la cepa PEC5 adheridas a la superficie de las raíces (Fig. 16 i).
54
Figura 16. Micrografías electrónicas de barrido que muestran la superficie de raíces var. `Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´ sin inocular
(control) e inoculadas con las cepas de Azospirillum brasilense REC3 y PEC5. a. `Camarosa´-Control (x2.000). b. `Camarosa´-REC3
(x2.000). c. `Camarosa´-PEC5 (x2.400). d. `Milsei´-Control (x7.200). e. `Milsei´-REC3 (x7.200). f. `Milsei´-PEC5 (x7.200).
g. `Selva´-Control (x7.200). h. `Selva´-REC3 (x15.000). i. `Selva´-PEC5 (x15.000).
Capítulo 3
55
Capítulo 3
Por otra parte, las observaciones realizadas con bajo aumento permitieron
demostrar que en todas las raíces de las plantas inoculadas aumentó el número y la
longitud de los pelos radiculares en comparación con las plantas control (Fig. 17). Sin
embargo, este fenómeno fue más evidente en las variedades `Camarosa´ (Fig. 17 b) y
`Milsei´ (Fig. 17 d) inoculadas con la cepa REC3 y en la var. `Selva´ (Fig. 17 f) cuando
se asocia con PEC5.
Figura 17. Micrografías electrónicas de barrido de raíces de frutilla var. `Camarosa´, `Milsei´ y
`Selva´. a. Camarosa-Control (x200). b. Camarosa-REC3 (x200). c. Milsei -Control (x60). d. MilseiREC3 (x60). e. Selva-Control (x60). f. Selva-PEC5 (x60). Nótese que en las variedades `Camarosa´
y `Milsei´ las raíces inoculadas con la cepa REC3 presentan una mayor densidad de pelos en su
superficie, mientras que en la var. `Selva´ presentaron mejores resultados las inoculadas con PEC5.
56
Capítulo 3
La microscopía electrónica de transmisión permitió observar también la
presencia de bacterias en los tejidos internos de las raíces de todas las plantas
inoculadas. En la Figura 18 b se muestra la variedad de frutilla con mayor número de
bacterias asociadas, que corresponde a la var. `Camarosa´ inoculada con la cepa
REC3.En las plantas control no se detectó la presencia de bacterias (Fig. 18a).
a.
b.
Figura 18. Micrografías electrónicas de transmisión de los tejidos internos de las raíces.
a. `Camarora´-Control (x10.950). b. `Camarosa´-REC3. Nótese la gran densidad de
bacterias colonizando el interior de las raíces (x7.000).
De manera similar a lo observado cuando Azospirillum se encuentra en
estado de vida libre, éste presentó fibrillas cortas y entrelazadas íntimamente asociadas
a la membrana externa cuando estaba asociado a los tejidos internos de la raíz (Fig. 19).
57
Capítulo 3
Figura 19. Micrografía electrónica de transmisión de Azospirillum en los tejidos
internos de la raíz (x18.700). Nótese la disposición radial de las microfibrillas en la
superficie de la bacteria.
Por otra parte, las imágenes de microscopía electrónica de transmisión
muestran que tanto las bacterias individuales como las asociadas entre sí, exhiben a su
alrededor un material filamentoso dispuesto concéntricamente que no está en contacto
directo con la membrana celular externa (Fig. 20).
a.
b.
Figura 20. Micrografías electrónicas de transmisión de Azospirillum en los tejidos internos
radiculares. a. (x82.640). b. (x18.700). Nótese el material fibrilar dispuesto en forma
concéntrica indicado con flechas.
58
Capítulo 3
3. Inoculación de plantas de frutilla con Azospirillum brasilense en soporte sólido:
En un análisis macroscópico cualitativo de las plantas de frutilla a los 40
días de ser inoculadas con Azospirillum brasilense se observó que éstas presentaban un
mayor desarrollo que las plantas no inoculadas (Fig. 21).
b
.
a.
c.
Figura 21. Plantas de frutilla a los 40 días de ser inoculadas con A. brasilense.
a. Control (no-inoculadas). b. Inoculadas con REC3. c. Inoculadas con PEC5.
En la Figura 22 se muestran las plantas de frutilla luego de 6 meses de
haber sido inoculadas con ambas cepas de A. brasilense y las plantas control no
inoculadas. Estas últimas presentaron menor desarrollo y en algunos casos clorosis,
mientras que las plantas inoculadas no mostraron clorosis y su tamaño fue mayor.
a
.
b
.
c
.
Figura 22. Plantas de frutilla a los seis meses de ser inoculadas con A. brasilense. a. Control.
b. Inoculadas con REC3. c. Inoculadas con PEC5. Nótese que algunas plantas control muestran
clorosis (hojas amarillas) mientras que las inoculadas con A. brasilense se presentan sanas.
Al cabo de siete meses desde la inoculación, la mayoría de las plantas
madres produjeron numerosas plantas hijas, mediante la producción de estolones, de las
59
Capítulo 3
que se tomaron 56 muestras de raíces y estolones. En la Tabla 1 se indican las
variedades de frutilla, los tratamientos aplicados y los diferentes tejidos a partir de los
cuales
se
tomaron
las
muestras
para
posteriores
análisis
microbiológicos,
ultraestructurales y moleculares.
Tabla 1. Variedades de frutilla con los tratamientos aplicados y tejidos a partir de los cuales se
tomaron muestras para los ensayos microbiológicos, ultraestructurales y moleculares.
Control
Cepa
REC3
Cepa
PEC5
Camarosa
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
Milsei
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
3º Estolón
Raíz 3º Planta Hija
4º Estolón
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
3º Estolón
Raíz 3º Planta Hija
4º Estolón
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
Selva
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
3º Estolón
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
3º Estolón
Raíz 3º Planta Hija
Raíz Planta Madre
1º Estolón
Raíz 1º Planta Hija
2º Estolón
Raíz 2º Planta Hija
3º Estolón
Raíz 3º Planta Hija
3. 1. Ensayos microbiológicos:
Determinación del NMP de A. brasilense en tejidos de plantas de frutilla
La cuantificación de bacterias en los distintos tejidos de la planta (raíces y
estolones) se realizó con el método del Número Más Probable (NMP), utilizando la
tabla de McCrady para tres repeticiones.
Finalizado el tiempo de incubación de las muestras sembradas en medio
60
Capítulo 3
NFb semisólido, se observó macroscópicamente el desarrollo característico de
Azospirillum en dicho medio, por el viraje del indicador (de verde a azul), y por la
formación de una película blanquecina subsuperficial en los viales correspondientes a
las diluciones 10-1 a 10-6 (Fig. 23). A los viales con tales características se los consideró
positivos para la determinación del número característico de ingreso a la tabla de
McCrady.
Las
observaciones
microscópicas
realizadas
sobre
los
desarrollos
bacterianos de los viales positivos ratificaron la presencia de Azospirillum debido a que
se pudo observar su distintiva motilidad, forma y tamaño.
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
10
-10
Figura 23. Viales conteniendo medio de cultivo NFb semisólido sembrado con diluciones
decimales (10-1 a 10-10) de los macerados de raíces para determinar el NMP,
al cabo de 48 h de incubación a 30 º C.
Tanto el reaislamiento de Azospirillum como la determinación de su NMP
fue posible en todas las muestras de raíces provenientes de las plantas madre inoculadas,
de las plantas hijas sin inocular y de sus estolones. En todos los casos se pudo observar
que los valores obtenidos a partir de raíces fueron mayores que los de estolones,
observando en algunos casos diferencias del orden de 100.000 bacterias. En las plantas
sin inocular (control) de las tres variedades no se detectó la presencia de bacterias.
En la Tabla 2 se presentan los resultados de la cuantificación de bacterias
por el método del NMP en las tres variedades de frutilla estudiadas.
61
Tabla 2. Número Más Probable de Azospirillum en raíces y estolones de las variedades `Camarosa´, `Milsei´ `Selva´.
La prueba de diferencia se realizó aplicando el Test de Tuckey (p <0,05). n.d.: no detectado
Capítulo 3
62
Capítulo 3
Para la var. `Camarosa´, el valor máximo de bacterias por gramo de tejido
vegetal fresco se encontró en las raíces de la planta madre inoculada con la cepa REC3
(1,6 x 105), mientras que el tercer estolón proveniente de plantas tratadas con la misma
cepa presentó un valor mínimo de 7,5 x 101. Por otro lado, pudo observarse una
respuesta marcadamente diferente para las plantas inoculadas con las cepas REC3 y
PEC5, siendo mejor con la cepa REC3: mayor título, mayor número de plantas hijas
(hasta una tercera hija) y más estolones (hasta un cuarto estolón).
De manera similar, las plantas de la var. `Milsei´ tratadas con REC3
produjeron mayor cantidad de estolones, mayor número de plantas hijas y títulos
bacterianos más altos que aquellas inoculadas con PEC5. El máximo valor de
microorganismos por gramo de tejido vegetal encontrado fue 9,5 x 105 en las raíces de
la segunda planta hija cuya madre fue inoculada con REC3, mientras que la menor
concentración de bacterias (1,1 x 101), se pudo observar en el primer estolón de las
plantas tratadas con la cepa PEC5.
En el caso de las plantas de frutilla de la variedad `Selva´, el máximo valor
obtenido en la cuantificación fue de 1,5 x 106 bacterias por gramo de raíz que
corresponde a las raíces de la tercera planta hija tratada con la cepa de Azospirillum
brasilense PEC5. El mínimo, de 2,5 x 101 bacterias por gramo de estolón, se obtuvo en
el primer estolón de las plantas tratadas con la cepa REC3. Las plantas de ésta variedad
tratadas con las cepas PEC5 y REC3 dieron igual número de plantas hijas y estolones,
pero las concentraciones de microorganismos fueron mayores en las raíces y estolones
de las plantas tratadas con PEC5. A diferencia de lo observado en las otras dos
variedades, la variedad `Selva´ presentó mayor afinidad por la cepa A. brasilense PEC5.
Asimismo, en los estolones de esta variedad se pudo constatar una tendencia creciente
en la concentración de bacterias desde el primer al último estolón:
63
Capítulo 3
 Estolones provenientes de plantas inoculadas con REC3:
1º Estolón (2,5 x 101); 2º Estolón (9,5 x 101); 3º Estolón (1,5 x 102).
 Estolones provenientes de plantas inoculados con PEC5:
1º Estolón (4,5 x 102); 2º Estolón (4,5 x 103); 3º Estolón (4,5 x 104).
3. 2. Estudios ultraestructurales de raíces y estolones de plantas desarrolladas en
soporte sólido inoculadas con A. brasilense
La colonización de Azospirillum brasilense desde la planta madre a sus hijas
a través de los estolones se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión y
barrido. Se observó la presencia de bacterias en los tejidos radiculares internos de las
plantas madres inoculadas y de sus plantas hijas sin inocular (Figura 24).
a.
c.
b.
d.
Figura 24. Micrografías electrónicas de raíces de plantas de la var. `Camarosa´ desarrolladas en soporte
sólido. a. Planta madre inoculada con la cepa REC3 (x7.500). b. Primera planta hija (x33.300).
c. Segunda planta hija (33.300). d. Tercera planta hija (x18.700).
Nótese la presencia de bacterias en la primera, segunda y tercera planta hija no inoculada.
64
Capítulo 3
La microscopía electrónica de barrido permitió la visualización de bacterias
individuales y agrupadas en la zona de los haces vasculares de los estolones (Fig. 25).
Cuando se encuentran agrupadas (Fig. 25 b) las bacterias están inmersas en un material
a la manera de una cápsula. Esta imagen se corresponde con lo observado a nivel de
microscopía electrónica de transmisión en la Figura 25 c.
b.
a.
c.
d.
Figura 25. a. Micrografías electrónicas de barrido que muestran a Azospirillum brasilense colonizando el
interior del estolón. b. detalle a mayor aumento. c. Micrografía electrónica de transmisión de bacterias
inmersas en una matriz formada por un material dispuesto concéntricamente (X18.700).
d. Micrografía de barrido con falso color donde las bacterias están representadas en color rosa intenso y los
tejidos internos del estolón se encuentran en color verde.
65
Capítulo 3
Conforme a lo anterior, se determinó que las bacterias encapsuladas
observadas en el interior del estolón poseían características ultraestructurales similares
a las colonias puras de Azospirillum brasilense cultivadas en NFb sólido (Fig. 26),
reafirmando su identidad.
Figura 26. Micrografía electrónica de barrido de una colonia pura de Azospirillum brasilense
cultivada en medio NFb sólido. a. A. brasilense PEC5; b. Magnificación de (a) que muestra a
las bacterias agrupadas y envueltas por un material fibrilar formando una cápsula.
3. 3. Estudios Moleculares. Determinación del gen nifD.
En la Figura 24 se muestran los productos de la amplificación por PCR de
un fragmento del gen nifD a partir de ADN extraído de raíces (Fig. 27 a) y estolones
(Fig. 26 b) de frutilla. Además se incluyó al control positivo que correspondía a la
amplificación a partir de ADN de la cepa de referencia A. brasilense Sp7 (Fig. 27 a,
calle 12). En todos los casos de plantas inoculadas con Azospirillum se observó la
presencia de una banda específica de 710 bp. En la misma figura, también se observa la
falta de producto amplificado de nifD en los casos de plantas no inoculadas.
66
Capítulo 3
a.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1,000 bp
700 bp
500 bp
b.
710 bp
M
1
2
1,000 bp
700 bp
500 bp
3
4
5
6
7
710 bp
Figura 27. a. Productos de la amplificación del gen nifD a partir del ADN extraído de raíces de
frutilla. Calles: 1. Planta Madre `Camarosa´-REC3; 2. Primera Hija `Camarosa´-REC3; 3.
`Camarosa´-Control; 4. Planta Madre `Milsei´-REC3; 5. Primera Hija `Milsei´-REC3; 6.
Primera Hija `Milsei´-PEC5; 7. `Milsei´-Control; 8. Planta Madre `Selva´-PEC5; 9. Primera
Hija `Selva´-PEC5; 10. Segunda Hija `Selva´-PEC5; 11. `Selva´-Control; 12. Control
Positivo Azospirillum brasilense Sp7; M. Marcador de Peso Molecular (DirecLoad Wide
Range DNA Marker 50_10.000 bp Sigma).
b. Productos de amplificación del gen nifD a partir de ADN extraído de estolones de frutilla.
Calles: 1. Primer Estolón `Camarosa´-REC3; 2. Estolón `Camarosa´-Control; 3. Primer
Estolón `Milsei´-REC3; 4. Estolón `Milsei´-Control; 5. Primer Estolón `Selva´-REC3; 6.
Estolón `Selva´-Control; 7. Control Positivo Azospirillum brasilense Sp7; M. Marcador de
Peso Molecular (DirecLoad Wide Range DNA Marker 50_10.000 bp - Sigma).
3. 4. Amplificación del gen 16S ADNr, ARDRA y secuenciación automática
Los productos de amplificación del gen 16S ADNr de las cepas de A.
brasilense REC3, PEC5 y Sp7, y de los re-aislamientos de plantas madres e hijas
colonizadas por Azospirillum, mostraron un banda específica de 1450 bp (Fig. 28 a).
Los perfiles de restricción del ADNr 16S obtenidos por digestión con la
endonucleassa AluI de los controles positivos (REC3, PEC5 y Sp7) y de las bacterias reaisladas de los distintos tejidos de frutilla fueron idénticos (Fig. 28 b). Estos resultados
confirman que los reaislamientos también correspondían a la especie Azospirillum
brasilense (identidad nivel de especie).
67
Capítulo 3
a.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
2,000 bp
1,500 bp
1,450 bp
1,000 bp
b.
3,000 bp
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
2,000 bp
1,000 bp
500 bp
100 bp
Figura 28. a. Productos de amplificación del gen 16S ADNr. Calles 1 a 3 corresponden a
controles positivos: 1. A. brasilense REC3; 2. A. brasilense PEC5; 3. A. brasilense Sp7;
Calles 4 a 11 corresponden a cepas re-aisladas de raíces y estolones de frutilla: 4. Raíz planta
madre `Camarosa´-REC3; 5. Raíz 1era hija `Milsei´-REC3; 6. 1er estolón `Camarosa´REC3; 7. Raíz planta madre `Milsei´- REC3; 8. Raíz 1era hija `Milsei´-PEC5; 9. 1er estolón
`Milsei´-REC3; 10. Raíz 2da hija `Selva´-PEC5; 11. 1er estolón `Selva´-PEC5; M. Marcador
de peso molecular (100 bp DNA Ladder; Genbiotech).
b. Perfiles de ARDRA. Digestión enzimática con Alu1 del producto de amplificación del
ADNr 16S. Calles 1 a 11 y M: como se indicó anteriormente.
Adicionalmente, el análisis de las secuencias parciales del 16S ADNr (500 bp)
confirmó que los re-aislamientos secuenciados pertenecían a Azospirillum brasilense
con un porcentaje de similitud ≥99 %.
4. Estudios de colonización por microscopía de fluorescencia
Se estudió la colonización radicular de A. brasilense en raíces de plantas de
frutilla utilizando la cepa transgénica A. brasilense REC3::gfp. La utilización de esta
cepa permitió monitorear la colonización de A. brasilense durante 28 días debido a su
estabilidad y fácil identificación, ya que la expresión de la proteína GFP le otorga
fluorescencia verde brillante cuando es excitada con luz azul mediante el filtro UMWB2 (420-490 nm). La figura 29 muestra plantas control e inoculadas con la cepa
68
Capítulo 3
transconjugante a los 2, 7, 14 y 28 días post-inoculación (dpi). Se observaron bacterias
no agrupadas adheridas a la superficie radicular a partir de los 2 dpi, localizadas
principalmente en los espacios intercelulares que constituyen zonas ricas en nutrientes.
En tiempos mayores se observó un incremento en el número de bacterias sobre la
superficie radicular alcanzando un máximo a los 28 dpi.
Figura. 29. Micrografías de raíces de plantas de frutilla var. `Camarosa´ controles e inoculadas
con la cepa transconjugante A. brasilense REC3::gfp tomadas mediante microscopía de
fluorescencia (U-MWB2, 420-490 nm) a los 2, 7, 14 y 28 días post-inoculación (dpi).
Nótese un incremento en la densidad de células bacterianas asociadas a la superficie radicular a
medida que transcurre el tiempo post-inoculación alcanzando un máximo en los 28 dpi.
69
Capítulo 3
DISCUSIÓN
En forma paralela a la determinación del NMP de bacterias, también se
pudo reaislar Azospirillum de raíces de las plantas madre (inoculadas), raíces de plantas
hijas (no inoculadas) y de los estolones de las tres variedades de frutilla analizadas; la
presencia de Azospirillum en los dos últimos tejidos confirmaría que éste es capaz de
colonizar distintas plantas de frutilla a través de los estolones.
La cuantificación reveló una gran diferencia entre la cantidad de bacterias
presentes en las raíces y los estolones, demostrando que las raíces constituyen un nicho
ecológico más favorable para el desarrollo de las mismas debido a que es una región
rica en nutrientes y que proporciona las condiciones microaeróbicas adecuadas para
llevar a cabo la fijación de nitrógeno (Baldani et al. 1986). De acuerdo a los resultados
obtenidos en el presente trabajo, Azospirillum tendría una preferencia natural en
colonizar las raíces de las plantas de frutilla, mientras que utilizaría a los estolones
como una vía de paso en su camino a las nuevas plantas hijas.
En general, se encontraron títulos bacterianos altos tanto en las raíces de las
plantas tratadas con la cepa REC3 como en las inoculadas con la cepa PEC5, respecto
de los valores determinados para estolones, lo que corrobora la preferencia rizosférica
de Azospirillum, según lo informado en trabajos anteriores (Umali-García et al., 1980;
Gafni et al., 1986; Bashan y Levanony, 1987; Okon y Vanderleyden, 1997).
Sin embargo, las tres variedades de frutilla interaccionaron desigualmente
con cada una de las cepas, lo que demuestra que el éxito de una mejor colonización
depende de la interacción entre genotipos específicos de la bacteria y de la planta.
La var. `Camarosa´ mostró una mayor afinidad por la cepa REC3 lo cual se
manifestó por el mayor número de bacterias aisladas por gramo de tejido vegetal. En el
mismo tiempo, las plantas inoculadas con esta cepa, produjeron un mayor número de
estolones y plantas hijas, lo que indicaría que esta variedad presenta una mejor respuesta
70
Capítulo 3
a la inoculación con la cepa homóloga REC3 de A. brasilense. Un comportamiento
parecido al de `Camarosa´ se observó entre la var. `Milsei´ y REC3, reflejado en una
mayor producción de estolones, mayor número de plantas hijas y títulos más altos que
aquellas inoculadas con PEC5. Y contrariamente, las plantas de frutilla de la variedad
`Selva´ tendrían mayor afinidad por la cepa homóloga de A. brasilense PEC5, en donde
se observaron títulos más altos que con REC3.
Sin embargo, se constató que en las tres variedades, tanto las plantas
inoculadas con Azospirillum como en las plantas control, el número de estolones
producidos, y consecuentemente, el número de plantas hijas fue similar, de manera que
estas características serían propias de las plantas y no estarían asociadas a su interacción
con Azospirillum.
Por otro lado, el hecho de haber observado una tendencia creciente del título
de Azospirillum entre el primer y último estolón en la var. `Selva´, indicaría que la
colonización ocurre más fácilmente en el tejido en desarrollo con un activo
metabolismo, en donde la colonización bacteriana acompañaría al crecimiento del
estolón. Esto podría apoyarse en el hecho de que los tejidos radiculares en activo
desarrollo son los lugares de preferencia asociativa de Azospirillum, según lo informado
en otros trabajos (Bashan et al., 1986; Bilal et al., 1993; Vande-Broek et al., 1993;
Vanbleu y Vanderleyden, 2003). Además esta observación estaría de acuerdo con Sturz
et al. (1999), quienes informaron que las bacterias endófitas no son sólo huéspedespecíficas, sino que también serían sensibles del tejido vegetal a colonizar.
No obstante, el hecho de observar una menor cantidad de Azospirillum en
los primeros estolones, respecto a los últimos, también podría deberse a que éstos eran
de mayor edad y lignificación, con actividad metabólica menor, constituyendo de este
modo un nicho ecológico menos apto para el desarrollo de Azospirillum. Una
consideración similar podría hacerse sobre los valores de NMP determinados entre las
71
Capítulo 3
plantas madres inoculadas con Azospirillum (con NMP menor), respecto de las plantas
hijas (con NMP mayor).
Los estudios ultraestructurales con MEB y MET permitieron evidenciar en
raíces y estolones de plantas de frutilla la colonización rizosférica y endofítica de A.
brasilense. Además, la microscopía de fluorescencia permitió la observación de la cepa
transconjugante A. brasilense REC3::gfp viva y fisiológicamente activa, de manera tal
que permitió monitorear la colonización de las raíces de frutilla desde los 2 hasta los 28
días post-inoculación.
En éste trabajo se observaron dos aspectos que deben considerarse en el
proceso de interacción bacteria-planta. El primero es el modo de adhesión de las
bacterias a la superficie de la planta y el segundo es el modo de colonización que
emplean las bacterias para asociarse con los tejidos de la planta.
Analizando morfológicamente el modo de adhesión de Azospirillum, este
presentó un modelo unicelular de adhesión a la superficie radicular, en el que participan
bacterias individuales y aisladas y un modelo pluricelular donde Azospirillum se
dispone formando agregados bacterianos. Estos modelos son similares a los descritos
previamente por Bashan y Levanony (1989).
Los agregados bacterianos pueden ser el resultado de una activa división
celular o producto de la confluencia de bacterias hacia un determinado sitio de la raíz,
probablemente debido a la quimiotaxis positiva que presenta Azospirillum brasilense
hacia los exudados de las plantas (Barak et al., 1983; Vande Broek y Vanderleyden,
1995).
El material de naturaleza fibrilar observado tanto con MEB como con MET
sobre la superficie celular de las bacterias en estudio, cumpliría un papel importante en
la adhesión de las mismas a las raíces, permitiendo el anclaje y estableciendo
conexiones entre ellas para conformar los denominados agregados bacterianos, de
72
Capítulo 3
acuerdo a lo informado en otros estudios (Bashan, 1986; Levanony y Bashan, 1991). El
material fibrilar de referencia estaría formado por polisacáridos extracelulares
(Michielis et al., 1990; Burdman et al., 2000a, b), como así también por proteínas de la
membrana externa de la bacteria (Burdman et al., 1999).
En los procesos de adhesión de las bacterias a las plantas también estarían
implicadas lectinas específicas que participarían en los procesos de reconocimiento
bacteria-planta y también los exudados producidos y secretados por la propia planta
(Zhulim y Armitage, 1993; Vande-Broek et al., 2000). El material granuloglobular que
se observó en la superficie de los tejidos vegetales correspondería a dichos exudados
vegetales y/o rizodeposiciones.
Los cúmulos de bacterias asociadas a la raíz, en muchos casos, pueden
desarrollar agregados celulares diferenciados y especializados, llamados también `fase a
base de enjambres´ donde todas las células se mueven coordinadamente, lo que revela
la naturaleza dinámica de las biopelículas. Adicionalmente, la formación de biopelículas
facilitaría la colonización, ya que protegen a las bacterias benéficas de las respuestas de
defensa de las plantas (Danhorn y Fuqua, 2007).
Uno de los procesos de colonización de Azospirillum observados en
nuestros estudios ultraestructurales coincide con el mecanismo bifásico descrito por
Steenhoudt y Vanderleyden (2000). El otro mecanismo observado, en el que las
bacterias ingresarían de manera individual hacia los tejidos internos de la raíz, hasta el
presente no ha sido descrito en la literatura.
Nuestros resultados mostraron que las células bacterianas se encontraron
adheridas mayoritariamente a la superficie radicular y en menor proporción sobre los
pelos radiculares, como lo proponen Bashan y Levanony (1989). La disposición
horizontal de las bacterias brindaría una mayor superficie de contacto entre éstas y la
planta.
73
Capítulo 3
La microscopía electrónica de transmisión permitió observar a las bacterias
dentro de las células vegetales, en tanto que Levanony y Bashan (1991) sólo
demostraron que ocupan los espacios intercelulares del cortex de las raíces de trigo.
Para explicar este suceso hay que recordar que en este trabajo todas las observaciones se
realizaron en la zona de alargamiento y el ápice de la raíz, que son zonas en desarrollo
con una activa división celular; probablemente esto permite a la bacteria colonizar fácil
y masivamente el citoplasma vegetal. El que las células bacterianas esten presentes
dentro de las células vegetales, indicaría que las mismas han sido capaces de atravesar
la barrera impuesta por la pared celular por un mecanismo que hasta el presente no
hemos podido dilucidar.
Las microfibrillas capsulares con una disposición concéntrica que muestran
las micrografías electrónicas de transmisión alrededor de un grupo de bacterias, sólo se
presentan cuando las mismas están asociadas endofíticamente a la planta. Esta pseudocápsula crearía un ambiente adecuado para que las bacterias fijen nitrógeno, pues la
expresión de los genes nif, que codifican para la enzima nitrogenasa, está estrictamente
regulada por concentraciones de oxígeno y amonio intracelular (Elmerich, 1997, Zhang
et al., 1993).
Las estructuras capsulares sobre las bacterias se han observado
principalmente cuando éstas colonizan el interior de los estolones, lo que indicaría que
Azospirillum ha desarrollado estrategias especiales para protegerse de concentraciones
elevadas de oxígeno, como así también de las condiciones de estrés sufridas por la
limitación de nutrientes. Por lo tanto, esto demuestra que los estolones no constituyen el
mejor hábitat para la bacteria.
En todos los casos analizados, la inoculación aumentó el número, la
densidad y la longitud de los pelos radiculares. Este fenómeno fue observado
previamente en cereales y otras plantas gramíneas por otros autores (Umali-Garcia et
74
Capítulo 3
al., 1980; Jain y Patriquin, 1984; Bashan y Levanony, 1989). Kapulnik et al. (1985 a, b)
han propuesto que estos cambios mejoran la absorción de minerales y de agua en las
plantas inoculadas con Azospirillum.
Las variedades de frutilla estudiadas presentaron diferentes afinidades por
las dos cepas de A. brasilense. Las variedades `Camarosa´ y `Milsei´ presentaron una
mejor interacción cuando fueron inoculadas con la cepa REC3, lo que se manifestó en
un mayor desarrollo de los pelos radiculares, una mayor densidad de células adheridas a
la superficie radicular y un importante número de bacterias endofíticas asociadas a los
tejidos internos y superficiales. Por otra parte, la variedad `Selva´ presentó una mayor
afinidad por la cepa bacteriana PEC5, que se manifestó de manera similar: una mayor
proliferación de pelos radiculares y una alta densidad bacteriana colonizando superficial
y endofíticamente las raíces. Estas observaciones mostraron un paralelismo con los
resultados obtenidos en la cuantificación de bacterias por métodos microbiológicos.
La diversidad de respuestas que presenta la inoculación de cada variedad de
frutilla con distintas cepas bacterianas indica que existe una fuerte interacción entre los
genomas bacterianos y vegetales y esta interacción es la que determina la respuesta de la
planta a la inoculación. Por tal motivo, la especificad entre los genomas es un aspecto
importante que deberá tenerse en cuenta para la selección de cepas que se utilizarán
como biofertilizantes.
La cepa transconjugante A. brasilense REC3::gfp presentó gran estabilidad
en medios de cultivos con y sin presión de selección durante numerosas generaciones.
Esto se debería a la expresión de los genes parADCDE responsables de la segregación
de éstos plásmidos durante la división celular (Karunakaran et al., 2005). Teniendo en
consideración que la transformación de Azospirillum no es una tarea fácil (Steenhoudt y
Vanderleyden, 2000) se debe destacar la exitosa obtención de la cepa transconjugante
75
Capítulo 3
A. brasilense REC3::gfp que expresa constitutivamente los genes gfpmut3.1 y gusA ya
que se encuentran corriente debajo del promotor ChsA de A. brasilense Sp7.
En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio por Tortora et al.
(2012), fue posible obtener una cepa de Azospirillum transconjugante a partir de una
mutante de A. brasilense REC3 resistente a rifampicina (Rf), la que fue transformada
con el plásmido pHRGFPTC que contenía el gen gfpmut3 bajo el control del promotor
constitutivo pgen de E. coli (Ramos et al., 2002). Sin embargo, la construcción obtenida
mediante la transformación de A. brasilense con éste plásmido no fue estable: ésta
transconjugante perdía la expresión del plásmido durante sucesivos repiques
(aproximadamente 3) en medio de cultivo con presión de selección y no permitía el
monitoreo de la colonización por tiempos mayores a 20 días debido a la pérdida de
fluorescencia por la falta de expresión de la proteína GFP.
Por lo anteriormente expuesto, la utilización de la cepa A. brasilense
REC3::gfp, obtenida en este estudio, sería apropiada para realizar estudios ecológicos,
como el seguimiento de la colonización bacteriana en diferentes tejidos vegetales y en
distintos cultivos durante períodos más prolongados de tiempo, debido a su gran
estabilidad y sus altos niveles de expresión.
El monitoreo de la colonización en raíces de frutilla con A. brasilense
REC3::gfp mostró una mayor colonización de la superficie radicular a los 28 dpi donde
se observó una mayor densidad de células adheridas a las raíces. Estas observaciones
confirmaron los resultados obtenidos mediante microscopía electrónica de barrido.
La presencia endofítica de Azospirillum en el interior de las plantas madres
inoculadas con la bacteria, en sus plantas hijas no inoculadas y en sus estolones, se
ratificó mediante la amplificación por PCR de los genes nifD (nitrogenasa) y
la
amplificación, digestión y secuenciación del gen 16S ADNr. La utilización de estos
métodos moleculares confirmaron la naturaleza endofítica de las cepas de A. brasilense
76
Capítulo 3
REC3 y PEC5 demostrado anteriormente sólo mediante técnicas microbiológicas por
Pedraza et al. (2007).
Mientras que la detección por PCR del gen nifD a partir de ADN de tejidos
vegetales indicó la presencia de bacterias diazotróficas en raíces y estolones de plantas
madres inoculadas e hijas no-inoculadas, la confirmación de la identidad de esos
aislamientos se realizó mediante ARDRA y secuenciación del ADN. Los perfiles de
ARDRA indicaron que éstos correspondían a la especie Azospirillum brasilense y el
análisis de secuencias del 16S ADNr confirmaron su pertenencia a esta especie
(similitud ≥99 %).
En nuestros ensayos microbiológicos se pudo determinar el NMP de
Azospirillum a partir de 22 muestras de raíces y 18 muestras de estolones colonizados
por las cepas REC3 y PEC5. Pero sólo fue posible amplificar por PCR el fragmento de
710 bp del gen nifD a partir del ADN extraído de 11 muestras (8 de raíces y 3 de
estolones). Esto podría deberse a que las muestras de ADN fueron extraídas de material
vegetal en el cual es común la presencia de aceites vegetales, polisacáridos, polifenoles
y otros metabolitos secundarios que pueden unirse a los ácidos nucleicos formando
complejos que obstaculizan o inhiben la reacción de amplificación llevada a cabo por la
Taq polimerasa (Guillemaut y Maréchal-Drouard, 1992).
En el presente trabajo sólo se detectó la presencia del gen nifD dentro de las
raíces y estolones de frutilla, pero otros investigadores probaron también la expresión de
los genes nif de Azoarcus BH72 dentro de las raíces de arroz indicando que la bacteria
es metabólicamente activa dentro de los tejidos de la planta (Miché et al., 2006).
77
Capítulo 3
CONCLUSIONES
 Las cepas REC3 y PEC5 de Azospirillum brasilense utilizadas en este estudio
colonizan rizosférica y endofíticamente las raíces de las plantas de frutilla de las
variedades `Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´.
 Las cepas REC3 y PEC5 de A. brasilense colonizan endofíticamente los estolones de
las plantas de frutilla y se traslocan a través de ellos desde la planta madre inoculada
a las plantas hijas no inoculadas.
 Según los valores del NMP, las raíces de las plantas de frutilla constituyen el mejor
hábitat para la instalación y proliferación de las cepas de A. brasilense estudiadas,
mientras que los estolones son utilizados sólo como una vía de paso en su camino a
las plantas hijas.
 De acuerdo con los estudios microbiológicos y ultraestructurales, las variedades de
frutilla `Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´ presentan diferentes afinidades por las cepas
REC3 y PEC5.
 Los estudios ultraestructurales permitieron establecer que Azospirillum coloniza las
raíces mediante dos mecanismos diferentes: un proceso bifásico en el que las
bacterias se adhieren a la superficie radicular y luego forman biopelículas sobre las
mismas y un segundo proceso en el que las bacterias individuales penetran los tejidos
radiculares.
 La inoculación de las plantas de frutilla con A. brasilense aumenta la proliferación de
los pelos radiculares.
 La cepa transconjugante A. brasilense REC3::gfp obtenida presentó altos niveles de
expresión del gen gfp y gran estabilidad en medios de cultivos con y sin presión de
selección durante numerosas generaciones.
78
Capítulo 3
 La utilización de la cepa A. brasilense REC3::gfp permitió el seguimiento de la
colonización radicular de plantas de frutilla durante al menos 28 días postinoculación.
 La amplificación del gen nifD a partir de ADN extraído de raíces y estolones de
plantas de frutilla colonizadas por A. brasilense, confirmó la naturaleza endofítica de
las cepas utilizadas y evidenciaron su presencia en los tejidos analizados.
 Los perfiles de ARDRA permitieron la identificación de los reaislamientos
bacterianos como Azospirillum brasilense y el análisis de secuencias del 16S ADNr
confirmaron su pertenencia a dicha especie.
79
Capítulo 4
Capítulo 4
80
Capítulo 4
Análisis de la composición elemental de plantas de frutilla inoculadas con
A. brasilense REC3 mediante microscopía electrónica de barrido acoplada
al análisis de dispersión de rayos X y su efecto en la promoción del crecimiento
INTRODUCCIÓN
1. Microscopía electrónica de barrido acoplada a la espectroscopia de energía
dispersiva de rayos-X (MEB-EDS)
La microscopía electrónica de barrido (MEB) acoplada a la espectroscopia de
energía dispersiva de rayos-X (EDS) es un potente método basado en el análisis de la
dispersión de rayos-X producida por cada elemento contenido en una muestra que puede
producir información cualitativa y cuantitativa de los elementos presentes en ella. Por lo
tanto, además de la observación microscópica, permite la comparación y caracterización de
diferentes materiales (Goldstein et al., 2003). Los fotones de rayos-X que salen del
espécimen bajo análisis tienen energías específicas de los elementos presentes en la
muestra; estos son los rayos-X característicos que proporcionan las capacidades analíticas
del SEM-EDS (Goldstein et al., 2003).
Convencionalmente el estudio de la nutrición de las plantas se lleva a cabo por
métodos que requieren extracciones químicas, homogeneización y disolución de los
componentes vegetales para cuantificar un único elemento a la vez, por ejemplo, el
contenido total de N o de C orgánico que suelen ser determinado por los métodos de
Kjeldahl (Bremner y Mulvaney, 1982) y Walkey-Black (Nelson y Sommers, 1982),
respectivamente. Incluso, existen métodos que permiten la cuantificación de varios
elementos a la vez, como la espectrometría de masa inductivamente acoplada a plasma
(Esitken et al., 2010) y la espectroscopia de absorción atómica (Rojas- Tapias et al., 2012);
81
Capítulo 4
sin embargo, las muestras necesitan de todas formas ser sometidas a incineración,
extracción húmeda y otros procedimientos de digestión, que no facilitan la metodología.
La técnica de MEB-EDS requiere una pequeña muestra sólida, es relativamente
rápida, no destructiva y permite la determinación de los diferentes elementos químicos
simultáneamente (Szynkowska et al., 2011). Esta técnica se utilizó en los tejidos vegetales
principalmente para estudiar la bioacumulación, biodegradación, la inmovilización del
metal y la biodisponibilidad (Küpper et al., 2000; Rivera-Becerril et al., 2002; Chen et al.,
2007).
La bibliografía disponible sobre el uso de microanálisis MEB-EDS para el
estudio de la nutrición vegetal es escasa. Sin embargo, éste método se ha utilizado con éxito
para examinar la composición química de plantas de arándanos, pepino y medicinales
(Samuels et al., 1991; Morikawa y Saigusa, 2004; Muruganantham et al., 2009). También
existe un trabajo previo que utiliza MEB-EDS en plantas de trigo y soja inoculadas con
diferentes cepas de Azospirillum (Bashan et al., 1990), pero hasta el momento no se realizó
este microanálisis para el estudio de la interacción frutilla- Azospirillum, asociado al efecto
promotor del crecimiento vegetal.
2. Objetivo del capítulo
El objetivo del presente capítulo fue analizar la composición elemental de plantas
de frutilla inoculadas y no-inoculados con A. brasilense REC3 mediante la técnica de
microscopía electrónica de barrido acoplada al análisis de la energía dispersiva de rayos-X
(SEM-EDS); a fin de evaluar la contribución de A. brasilense a la nutrición mineral de las
plantas de frutilla y su efecto en la promoción del crecimiento.
82
Capítulo 4
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria ananassa) variedad `Macarena´
saneadas por cultivos in vitro cultivadas en macetas con sustrato sólido estéril (humus:
perlome, 2:1) y condiciones controladas en fitotrón (28 º C, humedad relativa 70 %,
fotoperíodo de 16 h a 250 µmol fotones m2 s−1) durante 2 meses. Luego de este tiempo las
plantas fueron cuidadosamente removidas de sus macetas, se lavaron las raíces con agua
destilada estéril para remover las partículas de suelo adheridas a las raíces y se
transplantaron a bandejas desinfectadas y aireadas (pO2 = 20 kPa) que contenían solución
de Hoagland optimizada (Epstein, 1972) al 100 % o 50 %, correspondientes a un medio
hidropónico con concentraciones de nutrientes óptimas o limitantes, respectivamente.
La solución de Hoagland optimizada (Epstein, 1972) fue la siguiente: 6 mM
KNO3; 4 mM Ca(NO3)2·4H2O; 2 mM NH4H2PO4; 1 mM MgSO4·7H2O; 50 µM KCl; 25
µM H3BO3; 2 µM MnSO4·H2O; 2 µM ZnSO4·7H2O; 0.5 µM CuSO4·5H2O; 0.5 µM
Na2MoO4; 26 µM FeEDTA.
Durante todo el ensayo el volumen del medio hidropónico fue medido
periódicamente y se mantuvo constante añadiendo agua destilada para conservar la
concentración de nutrientes de acuerdo a los parámetros descriptos.
2. Microorganismos e inoculación
Al cabo de 10 días posteriores al trasplante al medio hidropónico (tiempo
requerido para la adaptación de las plantas al nuevo ambiente), 10 plantas fueron
inoculadas sumergiendo las raíces 20 min en una suspensión de Azospirillum brasilense
83
Capítulo 4
REC3 (aproximadamente 106 UFC ∙ml-1) mientras que las raíces de otras 10 plantas control
se sumergieron en agua destilada estéril.
3. Diseño experimental
El experimento consistió de 4 tratamientos con 5 plantas por tratamiento que
fueron colocadas en diferentes bandejas: i- Control- 100 % Hoagland; ii- REC3- 100 %
Hoagland; iii- Control- 50 % Hoagland; iv- REC3- 50 % (Fig. 30). El ensayo concluyó
luego de 10 días posteriores a la inoculación.
Figura 30. Plantas de frutilla cv. `Macarena´ en bandejas aireadas con medio hidropónico. Los
diferentes tratamientos aplicados fueron: i- Control- 100 % Hoagland; ii- A.brasilense REC3- 100
% Hoagland; iii- Control- 50 % Hoagland; iv- A. brasilense REC3- 50 %
4. Determinación de peso seco
Cumplido el tiempo del cultivo hidropónico las plantas fueron cosechadas, se
separaron hojas de raíces, se secaron en horno a 65 º C durante 72 h (hasta peso constante)
y se determinó el peso seco de cada tejido. Se determinó la biomasa total como la suma del
peso seco de hojas y raíces, y el índice de crecimiento fue calculado de acuerdo a la
siguiente fórmula:
(
)
84
Capítulo 4
5. Microscopía electrónica de barrido acoplada a energía dispersiva de rayos-X
Se tomaron pequeñas muestras frescas de raíces y hojas jóvenes que fueron
fijadas en glutaraldehído 3 % (v/v) para su análisis por MEB-EDS de acuerdo a lo descrito
en el capítulo 3. Las micrografías de barrido y los espectros de EDS fueron obtenidos con
un microscopio electrónico ZEISS SUPRA 55VP (Carl Zeiss Co., Germany) equipado con
un espectrómetro de energía dispersiva de rayos-X OXFORD (INCA, EEUU). La energía
utilizada para incidir la muestra fue de 20 keV.
Los valores de la composición química elemental determinados en este ensayo
corresponden al promedio de tres repeticiones de espectros para cada tejido y cada
tratamiento. Cabe aclarar que ésta es una determinación relativa y la cantidad de cada
elemento corresponde a un porcentaje relativo a los otros elementos detectados en la
muestra (expresado como % del Peso); consecuentemente, la suma de todos los elementos
es igual a 100 %.
6. Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos (ANOVA) se llevó a cabo con el software
Infostat (ver. 2008 para Windows) y las diferencias significativas se determinaron con un
valor de p<0,05 utilizando el test de diferencias múltiples de Tukey. Los datos se
expresaron como la media ± desviación estándar.
85
Capítulo 4
RESULTADOS
1. Promoción del crecimiento
El valor promedio del peso seco de las raíces de las plantas cultivadas en
Hoagland 50 % e inoculadas con A. brasilense REC3 fue mayor que los otros tratamientos
(Fig. 31 a; p<0,05). Los valores de peso seco de hojas (Fig. 31 b) fueron 4 veces (75 %)
mayores que los valores de raíces (Fig. 31 a); y por ello los valores del peso seco de hojas
tuvieron mayor influencia en la determinación de biomasa total e índice de crecimiento
(Fig. 31 c). Además, las medias de la biomasa de las hojas de frutilla fueron
significativamente mayor en las plantas inoculadas con A. brasilense REC3 cuando las
mismas fueron cultivadas en ambas concentraciones de la solución de Hoagland (50% o
100 %) (Fig. 31 b; p<0,05). Entre las plantas control no-inoculadas (Control-100% y
Control-50 %), aquellas que fueron cultivadas en Hoagland 100 % presentaron mayor masa
de hoja que en Hoagland 50 % (Fig. 1 b; p<0,05); este resultado era esperado considerando
que la primera solución (100 %) es un medio rico en nutrientes mientras que el segundo
tenía sólo la mitad de los nutrientes considerados como óptimos para el crecimiento
vegetal. Esta diferencia no fue observada entre los tratamientos inoculados (REC3- 50 % y
REC3- 100 %), que fueron estadísticamente similares en ambas concentraciones de
Hoagland (Fig. 31 b; p<0,05).
Azospirillum brasilense REC3 promovió el crecimiento vegetal en ambas
concentraciones de medio hidropónico, aunque el efecto de la inoculación bacteriana fue
más evidente en solución de Hoagland 50 % donde las plantas inoculadas con REC3
crecieron 80 % más que sus controles, mientras que en el tratamiento REC3- Hoagland
100% sólo se observó un aumento igual a 45 % respecto a su control Hoagland 100 %.
86
Capítulo 4
Figura 31. Peso seco de (a) raíces y (b) hojas de plantas de frutilla control e inoculadas con A.
brasilense REC3, cultivadas en la solución de Hoagland 50 % y 100 %. (c) índice de crecimiento y
el porcentaje de incremento de crecimiento por la inoculación con REC3.
p <0,05; * comparación entre los controles, p <0,05.
2. Observaciones microscópicas
En el análisis microscópico se observó que la concentración de la solución de
Hoagland no afectó la capacidad de colonización de Azospirillum. Las bacterias se
adhirieron a la superficie radicular de las plantas de frutilla de manera similar en ambas
concentraciones de Hoagland 50 % y 100 % como se muestra en la Figura 32 c. Así
también, independientemente de la concentración del medio hidropónico, se observó un
aumento de los pelos radiculares en plantas inoculadas (Fig. 32 b) respecto a los controles
no inoculados (Fig. 32 a).
87
Capítulo 4
Figura 32. (a). Micrografías electrónicas de barrido de raíz de control no inoculada. (b). MEB de
raíz inoculada con REC3 mostrando la proliferación de pelos radiculares en las plantas cultivadas
en medio pobre en nutrientes (Hoagland 50 %). (c). Aumento de (b); nótese las bacterias adheridas
a la superficie de la raíz de las plantas inoculadas (se observó un patrón similar en medio rico en
nutrientes correspondiente a Hoagland 100 %).
3. Microanálisis por SEM-EDS
Los resultados del microanálisis por MEB-EDS de hojas y raíces de plantas
inoculadas con A. brasilense REC3 y plantas control, que fueron cultivadas en dos
concentraciones de solución de Hoagland (50 % y 100 %) y cosechadas 10 días después de
la inoculación se muestran en las Figuras 33 y 34. Los espectros de MEB-EDS mostraron
la composición elemental de hojas y raíces de frutilla, mientras que los mapas de MEBEDS permitieron observar la distribución relativa de los macro y micronutrientes en los
tejidos de frutilla.
Los espectros de EDS no sólo permitieron la cuantificación de los siguientes
elementos: C, O, N, Na, P, K, Ca, Cu, Si y Cl, sino además el mapeo por EDS permitió el
estudio de la distribución relativa de estos elementos y otros nutrientes no determinados por
88
Capítulo 4
el espectro, como Fe y Zn. Se determinó que todos los elementos eran ubicuos y estaban
uniformemente distribuidos en ambos tejidos.
Figura 33. MEB-EDS microanálisis de la composición mineral de hojas de plantas de frutilla
inoculadas con Azospirillum y plantas control no inoculadas cultivadas en 50% y 100% de la
solución de Hoagland (promedio de tres repeticiones). (a) Fracción orgánica representada por C, O
y N; (b) Fracción mineral representado por Na, P, K, Ca y Cu. * p <0,05; NS no significativo.
(c) micrografía de barrido de área foliar analizado (1000 x). (d -l) Mapeo de EDS de la distribución
relativa de los elementos en las hojas de frutilla inoculadas con Azospirillum: (d) C; (e) O; (f) P, (g)
Na, (h) N, (i) Fe, (j) Zn, (k) K, (l) Ca.
89
Capítulo 4
Figura 34. MEB-EDS microanálisis de la composición mineral de raíces de plantas de frutilla
inoculadas con Azospirillum y plantas control no inoculadas cultivadas en 50% y 100% de la
solución de Hoagland (promedio de tres repeticiones). (a) Fracción orgánica representada por C, O
y N; (b) Fracción mineral representado Na, Si, P, Cl, K, Ca y Cu. * p <0,05; NS no significativo.
(c) micrografía de barrido de área foliar analizada (1000 x). (d -l) Mapeo de EDS de la distribución
relativa de los elementos en las raíces de frutilla inoculadas con Azospirillum: (d) C; (e) O; (f) P, (g)
Na, (h) N, (i) Fe, (j) Zn, (k) K, (l) Ca.
Los espectros de EDS mostraron una composición química similar en hojas y
raíces y no se observaron diferencias significativas en las medias del contenido de cada
90
Capítulo 4
elemento, expresada como % del peso. Sin embargo, cualitativamente fue posible observar
diferencias en la composición elemental de estos dos tejidos: las hojas estaban compuestas
por C, O, N, Na, K, Ca y Cu, mientras que las raíces tenían también Si y Cl.
La fracción orgánica, representada por los elementos no-minerales, C, O y N,
fueron significativamente mayores que los otros macro- y micro-nutrientes en ambos
tejidos, siendo las medias de C y O mucho mayores que las de N. Sin embargo, para cada
uno de estos elementos no se observaron diferencias que puedan atribuirse a los
tratamientos de inoculación con Azospirillum ni a la concentración de la solución mineral
(Fig. 33 a y 34 a; p<0.05). De acuerdo con los espectros de EDS, sólo estos tres elementos
sumaban el 96,3 % del total de la composición mineral de la planta.
Los micronutrientes Na, Ca y P, fueron encontrados tanto en tejidos de hojas
como de raíces, siendo sus valores promedios mayores en hojas. El sodio fue el elemento
mineral más abundante en las hojas y raíces de frutilla (Fig. 33 b, 34 b). En hojas, el Na fue
11,36 %, 28,84 %, 9,65 % y 7,46 % mayor que el P, K, Ca y Cu respectivamente, y en
raíces fue 19,45 %, 24,43 %, 26,90 %, 7,88 %, 26,52 % y 29,89 % mayor que el P, K, Ca,
Cu, Si y Cl, respectivamente. El valor más alto del porcentaje de P fue encontrado en
plantas inoculadas con REC3 y cultivadas en Hoagland 50 % en ambos tejidos (p<0.05;
Fig. 33 b, 34 b). Los valores de las medias de P en plantas inoculadas fueron 34,33 % y
42,26 % mayores que sus respectivos controles en raíces y hojas, respectivamente.
El potasio fue detectado en ambos tejidos, pero sin diferencias respecto a los
tejidos o el tratamiento, mientras que el silicio fue detectado sólo en las raíces y su
contenido fue mayor en raíces inoculadas con REC3.
El micronutriente Cu fue observado en hojas y raíces, sin embargo, el análisis
estadístico de este elemento mostró un descenso significativo de éste en raíces inoculadas
91
Capítulo 4
con REC3, equivalente a 35,16 % menos que en plantas control (Fig. 34 b). Mientras que
no se observó diferencias significativas en el porcentaje de Cu en las hojas por efecto de
los tratamientos.
DISCUSIÓN
De acuerdo a los resultados obtenidos, el máximo valor de biomasa de raíces
observado en plantas inoculadas con A. brasilense REC3 y crecidas en Hoagland 50% se
debe probablemente al incremento del área radicular por el aumento del número y longitud
de los pelos radiculares. Esto coincide con trabajos previos realizados en plantas de frutilla
var. `Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´, en donde la cepa REC3 aumentó el peso seco de las
raíces y el área radicular por estimulación de la proliferación de los pelos radiculares en
sustrato sólido (Pedraza et al., 2010). Este efecto fue observado también en otros cultivos
inoculados con Azospirillum (Okon y Kapulnik, 1986; Morgenstern y Okon, 1987).
Además, debido a que en este trabajo se observó la proliferación de pelos radiculares en
REC3- Hoagland 50% y REC3- Hoagland 100%, se concluye que este efecto es
independiente de la concentración del medio mineral y que estaría directamente relacionado
con la capacidad de Azospirillum para sintetizar auxinas. Así también, la capacidad de
colonización de Azospirillum resultó ser independiente de la concentración de Hoagland
utilizada, ya que en ambas concentraciones se observó una densidad similar de células
bacterianas adheridas a la superficie radicular.
También se observó que hubo una mejor respuesta de las plantas a la
inoculación bacteriana, expresada como una mayor promoción del crecimiento, en el medio
limitado en nutrientes (Hoagland 50 %). Resultados similares fueron observados en el
campo con suelos pobres en nutrientes donde REC3 tuvo un mayor efecto en la promoción
92
Capítulo 4
del crecimiento vegetal en comparación con un suelos rico sin limitaciones de nutrientes
(Lovaisa et al., 2012). También existen otros estudios que indican que en suelos
erosionados las inoculaciones con Azospirillum presentaron un mejor efecto en la
promoción del crecimiento vegetal (Cakmacki et al., 2006; Bacilio et al., 2006).
Los espectros de EDS de hojas mostraron una composición química similar que
las muestras de raíces y no se observaron diferencias significativas en las medias del
contenido de cada elemento, expresada como % del peso. La imposibilidad de determinar
diferencias entre las medias de la composición elemental de hojas y raíces probablemente
se debe a la limitación de la técnica, ya que los resultados son presentados como valores
relativos (% Peso) en lugar de números absolutos.
La fracción orgánica fue la mayoritaria en estas determinaciones. Como bien se
sabe, las plantas obtienen el C, O e H del agua y del dióxido de carbono, conformando estos
el 95 % de la composición elemental vegetal. El hidrógeno no fue identificado en este
análisis debido a que el detector de EDS no es capaz de registrar elementos con número
atómico menor de seis (Goldstein et al., 2003; Kutchko y Kim, 2006).
Los espectros de EDS mostraron la presencia de N pero en menor proporción
de la esperada, considerando que A. brasilense REC3 es una bacteria fijadora de nitrógeno.
Para explicar este fenómeno se debe tener en cuenta que los experimentos fueron llevados a
cabo en bandejas con cultivo hidropónico aireado (pO2= 20 kPa), lo cual probablemente
estaría inhibiendo la fijación de N2 debido a que la actividad nitrogenasa es negativamente
regulada por la presencia de N combinado y de O2 (cuando la pO2 es superior a 7 kPa;
Hartman y Burris, 1987). Las condiciones hidropónicas de cultivo utilizadas en este trabajo
fueron ajustadas de manera tal de favorecer el crecimiento vegetal sin consideración de la
estricta regulación bajo la que se encuentra la enzima bacteriana nitrogenasa; la cual se
93
Capítulo 4
encontraría probablemente inhibida bajo estas condiciones. También, Kapulnik et al.
(1985a) reportaron que no hubo actividad fijadora de nitrógeno en raíces de trigo
inoculadas con Azospirillum brasilense bajo condiciones hidropónicas. Sin embargo, las
pequeñas diferencias observadas en este trabajo entre el contenido de nitrógeno de las
raíces inoculadas y no-inoculadas, pueden quizás deberse a la mejora en la toma de
nutrientes como consecuencia de la promoción del crecimiento en raíces inoculadas con
Azospirillum.
El azufre es un elemento presente en todos los tejidos orgánicos como
componente de algunas proteínas; sin embargo, en este estudio no fue detectado. En este
ensayo las muestras para MEB fueron metalizadas con oro, en lugar de carbono, lo cual se
recomienda cuando se analizan muestras orgánicas por EDS (Goldstein et al., 2003). Por lo
tanto, dicho cambio metodológico pudo hacer interferido en la detección de azufre.
El sodio fue el elemento mineral que se encontró en mayor proporción en hojas
y raíces. Aun cuando el Na ha sido clasificado como un elemento benéfico (Epstein, 1972)
y no como un nutriente esencial para el crecimiento de las plantas, éste fue muy acumulado
por las plantas de frutillas. Este requerimiento de Na fue observado por Esitken et al.,
(2010) en plantas de frutilla cv. ˋFernˊ; ellos determinaron mediante espectrometría de
masas inductivamente acoplada a plasma, que las plantas de frutilla acumulaban dicho
elemento en gran medida, incluso en plantas controles no inoculadas (841,6 mg l-1). Se
conoce que cuando las plantas se encuentran expuestas a cantidades excesivas de Na se
vuelven cloróticas y necróticas y su crecimiento no puede continuar (Marschner, 2011). Sin
embargo, estos síntomas no fueron observados en las plantas de frutilla utilizadas en este
trabajo a pesar del alto contenido de Na reportado. La frutilla es considerada como un
cultivo muy sensible a la salinidad; no obstante, Martínez Barroso y Alvarez (1997) han
94
Capítulo 4
reportado que los síntomas tóxicos observados en plantas de frutilla var. ˋToroˊ y ˋDouglasˊ
irrigadas con diferentes contenidos salinos (NaCl, KCl, Na2SO4, NaHCO3), se debían a la
acción específica del ion Cl- en lugar del Na+. La toxicidad fue consecuencia de niveles
excesivos de este anión en hojas y no se vio intensificado por la presencia de Na+. Por lo
tanto, esto explicaría la alta tolerancia de las plantas de frutilla al Na. Aún más, en un
estudio realizado por Saied (2005) se determinó que el Na+ ejerció efectos benéficos en el
crecimiento de plantas de frutilla var. ˋKoronaˊ bajo estrés salino. Esto estaría relacionado
con efecto de sustitución de K+ por Na+ que ayuda a la osmorregulación, contribuyendo a
mantener un alto contenido de agua en los tejidos vegetales, y que en última instancia,
aumenta el peso fresco vegetal (Thuran y Eris, 2004).
El incremento de P en ambos tejidos y de Si en raíces de frutilla inoculadas con
A. brasilense en comparación con sus controles, se explicaría por la estimulación del
crecimiento radicular ejercido por las auxinas producidas por Azospirillum. Cuanto más
grande sea el sistema radicular, la captación de nutrientes estará más favorecida. Esitken et
al. (2010) observaron un incremento similar de la captación de P en plantas de frutilla
inoculadas con otras cepas PGPB: Pseudomonas BA-8, Bacillus OSU-142 y Bacillus M-3.
Como se mencionó en el capítulo 3 y de acuerdo a lo reportado previamente por Bashan y
de-Bashan (2010), Azospirillum coloniza principalmente los tejidos radiculares y produce
su mayor efecto a este nivel, aumentando el área radicular y por lo tanto mejorando la
nutrición mineral de la planta.
Respecto al contenido de cobre determinado en este trabajo, recientemente se
ha reportado que dos bacterias de referencia de Azospirillum brasilense, Sp7 y Sp245,
fueron capaces de crecer en presencia de Cu II (0,1 mM Cu2+), y que este elemento indujo
la biosíntesis de poli-3-hidroxybutirato (PHB) en la cepa Sp7 (Kamnev et al. 2012). En
95
Capítulo 4
concordancia con esto, se infiere que la cepa A. brasilense REC3 podría también ser capaz
de tomar el Cu y competir con la planta por este elemento, lo cual explicaría la disminución
de Cu observada en las raíces de las plantas inoculadas con Azospirillum.
Cabe mencionar que durante el período que duró el ensayo las plantas de
frutilla no mostraron ningún síntoma visible de deficiencia de nutrientes.
CONCLUSIONES
 La inoculación con Azospirillum brasilense REC3 aumentó la biomasa y el índice de
crecimiento de las plantas de frutilla en comparación con los controles no inoculados,
especialmente cuando las plantas fueron cultivadas en solución de Hoagland 50%.
 Se observó que tanto la estimulación de la proliferación de pelos radiculares ejercido por
A. brasilense REC3, como la capacidad de colonización de la cepa REC3, son procesos
independientes de la concentración de nutrientes en el medio hidropónico.
 La microscopía electrónica de barrido acoplada a la espectroscopia de energía dispersiva
de rayos-X permitieron estudiar la nutrición mineral de plantas de frutilla inoculadas con
A. brasilense REC3 y cultivadas en dos concentraciones de la solución de Hoagland.
 La fracción orgánica (C, O y N) representó el 96,3% del contenido químico elemental
total en hojas y raíces.
 Cualitativamente hubieron diferencias en la composición elemental de los tejidos
analizados: las hojas estuvieron compuestas por C, O, N, Na, K, P, Ca y Cu, mientras
que las raíces también tuvieron Si y Cl.
 Las raíces de las plantas inoculadas mostraron un aumento en el contenido de P y una
disminución en el contenido de Cu respecto a las plantas control sin inocular con
Azospirillum.
96
Capítulo 5
Capítulo 5
97
Capítulo 5
Análisis de los cambios estructurales producidos en plantas de frutilla
por la inoculación con Azospirillum brasilense REC3
INTRODUCCIÓN
1. Mecanismos de defensa vegetal: barreras estructurales
En su hábitat natural, las plantas están rodeadas de un enorme número de
potenciales enemigos como virus, bacterias, hongos, nematodos, ácaros, insectos,
mamíferos y otros animales herbívoros. En el caso de los fitopatógenos, las plantas se
defienden de estos a través de estructuras morfológicas, que actúan como barreras
físicas que inhiben la entrada y desarrollo del patógeno; o bien lo hacen a través de
reacciones bioquímicas que tienen lugar en los diferentes tejidos de la planta y que
producen sustancias tóxicas para el patógeno generando condiciones que inhiben su
entrada y crecimiento en la planta (Van Etten et al., 1994; Taiz y Zeiger, 2002). Entre
las barreras físicas preformadas se encuentran estructuras como la cutícula (capa
exterior de cera), la peridermis (tejido protector secundario), paredes celulares
lignificadas, paredes impregnadas con suberina, y la forma/tamaño de los estomas, etc.
(Manners, 1993).
Todas las partes de las plantas expuestas a la atmósfera están recubiertas
con capas de material lipídico que reducen la pérdida de agua y ayudan a bloquear la
entrada de patógenos. Los principales tipos de recubrimientos son la cutina, suberina y
ceras. La cutina, principal constituyente de la cutícula, se encuentra en la mayoría de las
partes aéreas mientras que la suberina está presente en las partes subterráneas, tallos
leñosos y heridas cicatrizadas (Taiz y Zeiger, 2002). Además, existen metabolitos
secundarios que participan en la defensa, ya sea por su naturaleza tóxica para los
98
Capítulo 5
organismos invasores o porque actúan como soporte estructural bloqueando físicamente
su propagación, como es el caso de la lignina (Taiz y Zeiger, 2002).
Muchas especies reaccionan a la invasión por hongos o bacterias mediante
la síntesis de lignina o calosa. La calosa se forma en la placa celular normalmente como
parte de los procesos básicos del desarrollo vegetal, como la formación de nuevas
paredes en células que se encuentran en división. La calosa es sintetizada en la
membrana plasmática y se deposita entre ésta y la pared celular. También se localiza en
los granos y tubos de polen, elementos muertos del floema, plasmodesmatas y
traqueidas
(Kauss, 1992). Sin embargo, la deposición de 1,3-β-glucano de calosa
también puede ser activada como una respuesta de defensa que a menudo se asocia con
el “estado de alerta” o “priming” inducido por las PGPB durante el desarrollo de la
resistencia sistémica inducida (ISR induced systemic resistance) (Benhamou et al.,
2000; Van Loon et al., 1998; Pieterse et al., 2009;). Además, puede contribuir a la
resistencia a enfermedades mediante el refuerzo de la pared celular vegetal por debajo
de los sitios de penetración de hongos (Kauss, 1992).
Entre los cambios que pueden observarse en las paredes celulares de las
plantas sometidas a un estrés biótico está el engrosamiento de la pared en el apoplasto,
que ocurre con el fin de impedir la penetración del patógeno en las interacciones
incompatibles hongo-planta (Sherwood y Vance, 1980). Esto se ha reportado en
numerosas especies de poaceas como cebada, trigo, avena, centeno, sorgo y maíz
(Sherwood y Vance, 1980); y en plantas de frutilla también se observaron respuestas de
este tipo a cortos tiempos post-infección con el hongo avirulento Colletotrichum
fragariae F7. Este fue capaz de inducir el engrosamiento de la pared celular y la
acumulación de pigmentos y cristales amorfos (Salazar et al., 2007).
99
Capítulo 5
2. Objetivo del capítulo
Analizar los cambios estructurales producidos en las plantas de frutilla a
distintos tiempos posteriores a la inoculación con Azospirillum brasilense REC3
mediante observaciones microscópicas de las deposiciones de calosa y el engrosamiento
de la pared celular.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria ananassa, Duch) var. `Camarosa´
micropropagadas in vitro y que se obtuvieron del Banco de Germoplasma Activo de
Frutilla de la Universidad Nacional de Tucumán. Las plantas se cultivaron en macetas
desinfectadas con sustrato estéril (humus: perlome; 2:1) durante tres meses; al cabo de
este tiempo se desenterraron y lavaron sus raíces con agua destilada estéril y se
trasplantaron a bandejas de plástico que contenía solución nutritiva de Hoagland estéril
modificada según Epstein (1972) con aireación constante (pO2= 20 KPa), y se
mantuvieron en cámara de crecimiento durante 10 días a 28 ° C, humedad relativa 70 %
y 16 h de fotoperiodo (250 µmol photons m2 s−1).
2. Inóculo
Como inóculo se utilizó un cultivo puro de Azospirillum brasilense REC3.
La suspensión bacteriana se preparó en NFb líquido a partir de una colonia aislada
tomada del medio NFb sólido (ver composición de los medios en capítulo 3). El cultivo
se incubó a 28 ° C durante 48 h, y posteriormente se ajustó a una densidad óptica
(DO560) igual a 0,2 correspondiente a una concentración celular de 106 UFC·ml-1.
100
Capítulo 5
3. Inoculación y diseño experimental
Se inocularon 15 plantas de frutilla (3 plantas por cada tiempo de muestreo)
en cultivo hidropónico con A. brasilense REC3 sumergiendo las raíces en la suspensión
bacteriana (106 CFU·ml-1) durante 20 min y luego se colocaron nuevamente en las
bandejas de plástico con solución hidropónica estéril y aireación constante. Las 15
plantas control se sumergieron 20 min en agua destilada estéril.
Muestras de hojas fueron tomadas en las 12, 24, 48, 72 y 96 horas postinoculación (hpi) para las observaciones de calosa y la pared celular. Hojas de tres
plantas por tratamiento fueron seleccionadas al azar en cada tiempo de muestreo.
4. Tinción de calosa
Se analizaron las deposiciones de calosa en la pared celular de las hojas de
plantas de frutilla control e inoculadas con REC3 a las 12, 24, 48, 72 y 96 hpi de
acuerdo con el método descrito por Currier y Strugger (1956). Luego del aclarado y
deshidratación de las hojas con etanol absoluto (100 % v/v) durante 12 h, éstas se
rehidrataron secuencialmente a través de concentraciones crecientes de buffer K2HPO4
67 mM (pH 12) desde 0 % hasta 100 % (v/v). Las muestras hidratadas fueron teñidas
con azul de anilina 0,01 % (p/v) (Sigma-Aldrich, Bélgica) en K2HPO4 67 mM (pH 12)
durante 1 hora a 25 ° C en oscuridad. El material teñido se montó en portaobjetos con
glicerol 30 % para su observación bajo luz UV (filtro UV U-MWU2, 330-385 nm)
utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 (Olympus, Japón). Las
deposiciones de calosa se identificaron como puntos de color verde brillante bajo la luz
fluorescente. Todos los experimentos que se muestran en este estudio se realizaron al
menos tres veces con resultados similares, las imágenes que se muestran como
resultados son representativas de la observación de al menos tres hojas de cada planta.
101
Capítulo 5
5. Fortificación de la pared celular
Para evaluar la fortificación de las paredes celulares, se tomaron muestras
de hojas a las 24, 48, 72, 96 hpi, se fijaron en FAA (formaladehído- alcohol- ácido
acético) y se diafanizaron. Para esto, se decoloraron en etanol 96 % (v/v) hirviendo, se
rehidrataron en dos etapas de 30 minutos cada una, primero con KOH 10% (p/v): etanol
96% (v/v) 50:50 y posteriormente con KOH 10% (p/v) y finalmente fueron aclaradas
con HClO 50% (v/ v) por 1 min. Para lograr un mejor contraste, se tiñeron las hojas con
safranina por 1 min y se lavaron con agua destilada. Las muestras se montaron en
portaobjetos con glicerol 30% y las observaciones se realizaron con un microscopio
Olympus BX51 (Olympus, Japón). Las imágenes que se muestran como resultados son
representativas de la observación de al menos tres hojas de cada planta.
RESULTADOS
En la Figura 35 se muestran las micrografías de las hojas de plantas control
(no inoculadas) e inoculadas con A. brasilense REC3, teñidas con azul de anilina 0,01%
a las 12, 24, 48 y 96 h post-inoculación (hpi). Las observaciones mostraron que REC3
estimuló la síntesis de calosa en las paredes celulares de las hojas de frutilla con un
máximo de acumulación a las 72 hpi, persistiendo este efecto hasta las 96 hpi. En los
tejidos de plantas control no se observó deposiciones de calosa en ningún tiempo
evaluado.
102
Capítulo 5
Figura 35. Deposiciones de calosa en hojas de frutilla (indicado por las flechas; Magnificación
40x). Las micrografías corresponden a las plantas inoculadas con A. brasilense REC3
(106 UFC·ml-1) y plantas control no-inoculadas, tomadas a las 12, 24, 48, 72 y 96 horas
post-inoculación (hpi). Las barras de la escala equivalen 100 μm.
El análisis microscópico de las secciones paradermales de las hojas
inoculadas con Azospirillum (Fig. 36) mostró un engrosamiento de las paredes celulares
103
Capítulo 5
a las 72 hpi en comparación con las plantas de control no inoculadas, como
consecuencia del engrosamiento/aumento de los espacios intercelulares.
Figura 36. Observaciones microscópicas del engrosamiento de la pared celular en hojas de
frutilla (indicado por las flechas; Magnificación 100x). Las micrografías corresponden a las
plantas inoculadas con A. brasilense REC3 (106 UFC· ml-1) y plantas control no-inoculadas,
tomadas a las 24, 48, 72 y 96 horas post-inoculación (hpi).
DISCUSIÓN
Los estudios histológicos realizados mostraron acumulación de calosa en las
hojas de las plantas de frutilla var. `Camarosa´ inoculadas con la cepa REC3 a partir de
las 72 hpi y esto coincidió con los datos reportados por Tortora et al. (2012), quien
observó la deposición de calosa en el mismo cultivar de frutilla 3 días después de la
104
Capítulo 5
inoculación con A. brasilense. Esta modificación estructural de las paredes celulares ha
sido muy investigada ya que puede constituir un importante mecanismo asociado con la
resistencia sistémica adquirida (SAR) y el “priming” de las plantas. Kohler et al. (2002)
informaron que el pretratamiento con benzotiadiazol o con ácido salicílico alerta a las
plantas de Arabidopsis para mejorar la inducción de ciertas respuestas de defensa como
la formación de calosa y la inducción inmediata del gen PAL que codifica para la
enzima fenilalanina-amonio-liasa.
La otra característica morfológica estudiada fue el engrosamiento de las
paredes celulares de plantas de frutilla inoculadas con la cepa REC3 y plantas controles.
Se observó que A. brasilense REC3 indujo un aumento de los espacios intercelulares de
la pared celular a las 72 hpi, coincidente con el tiempo de máximo nivel de deposición
de calosa observado. Esto sugiere que existiría una activación de mecanismos de
defensa estructurales inducidos por Azospirillum brasilense en plantas de frutilla. De
manera similar, Salazar et al. (2007) observaron la activación de la fortificación de la
pared celular en plantas de frutilla desafiadas con una cepa no virulenta del hongo
Colletotrichum fragariae F7 como uno de los mecanismos de la respuesta SAR que
participa en la protección contra la cepa virulenta de Colletotrichum accutatum M23.
El refuerzo de las paredes celulares observado en este trabajo probablemente
se debe a la formación de enlaces cruzados entre la pectina, la lignina y otros
componentes insolubles de la pared celular, contrariamente a las deposiciones de calosa
que son constituidas como el resultado de la polimerización de residuos de azúcar
(Kauss, 1992). Ambos procesos permiten a las plantas defenderse de potenciales
invasores porque constituyen una barrera física que impide su entrada.
La acumulación de calosa y el engrosamiento de paredes celulares en hojas
de plantas inoculadas radicularmente con REC3, sugiere que A. brasilense REC3 sería
capaz de inducir respuestas estructurales en tejidos foliares cuando se asocia con las
105
Capítulo 5
raíces de frutilla; y teniendo en cuenta que la inoculación se realizó en las raíces de las
plantas, las modificaciones estructurales observadas en los tejidos foliares confirman la
capacidad de la cepa REC3 para desencadenar respuestas sistémicas (en tejidos
distantes al tejido inoculado).
CONCLUSIONES
 La cepa Azospirillum brasilense REC3 activó mecanismos de defensa estructurales
como la deposición de calosa y el engrosamiento de las paredes celulares en hojas de
plantas de frutilla inoculadas radicularmente.
 Azospirillum brasilense REC3 indujo respuestas estructurales sistémicas en las
plantas de frutilla var. `Camarosa´.
106
Capítulo 6
Capítulo 6
107
Capítulo 6
Análisis de las señales bioquímicas disparadas en plantas de frutilla
inoculadas con Azospirillum brasilense REC3
INTRODUCCIÓN
1. Resistencia sistémica inducida
Numerosas bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB), como
Azospirillum brasilense, son capaces de inducir respuestas de defensa a enfermedades en
plantas, exhibiendo éstas niveles aumentados de resistencia a un amplio espectro de
patógenos mediante la previa activación de vías de defensa genéticamente programadas
(Vleesschauwer et al., 2006). La inoculación radicular con PGPB puede elicitar un tipo de
inmunidad sistémica en plantas llamada resistencia sistémica inducida (ISR, induced
systemic resistance) (Van Loon et al., 1998; Pieterse et al., 2009). Cuando las plantas
reconocen diferentes patrones asociados a microorganismos benéficos (MAMP microbeassociated molecular patterns), una débil pero efectiva respuesta inmune es activada en
tejidos sistémicos (Pieterse et al., 2009). Además, las plantas que expresan ISR pueden
reaccionar más rápido y/o fuerte al ataque por un patógeno mediante la activación de un
“estado de alerta” denominado “priming”, mejorando su habilidad para activar repuestas de
defensa celulares (Conrath et al., 2006). Esta sensibilización de los tejidos vegetales debido
al priming inducido por bacterias PGPB, mejora la expresión de defensa y es una
característica común de la ISR que permite explicar su efectividad contra un amplio
espectro de microorganismos fitopatógenos (Conrath et al., 2006).
108
Capítulo 6
2. Mecanismos de defensa: señales bioquímicas
Uno de los primeros eventos en la respuesta de defensa sistémica es la
producción de un estallido del metabolismo oxidativo que lleva a la generación del anión
radical superóxido (O2•–) y del peróxido de hidrógeno (H2O2) (Pieterse et al., 2009). Debido
a su reactividad química estas especies reactivas del oxígeno (ERO) pueden actuar
directamente protegiendo contra los microorganismos invasores, o indirectamente a través
de la activación de la biosíntesis de fitoalexinas, la producción enlaces cruzados oxidativos
en los componentes de la pared celular y/o la inducción de numerosos genes de defensa
(Mittler et al., 2004; Møller et al., 2007; Foyer y Noctor, 2005, 2009). Sin embargo, la
acumulación de estas ERO puede perturbar seriamente el metabolismo normal a través del
daño oxidativo generado en lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Møller et al., 2007). Un
indicador común de la peroxidación de lípidos de membrana es el contenido de ácido
malonaldehido (MDA, malonaldehyde acid), un producto secundario de la oxidación de
ácidos grasos poliinsaturados, que generalmente aumenta durante condiciones de estrés
como ser la infección patogénica (Møller et al., 2007).
Con el fin de regular los niveles de ERO, las células vegetales han desarrollado
mecanismos enzimáticos y no-enzimáticos, como los sistemas antioxidantes depuradores de
ERO y numerosas clases de metabolitos reductores (Mittler et al., 2004; Møller et al.,
2007).
En sintonía con lo anterior, se sabe que los polifenoles son antioxidantes
cruciales para el funcionamiento y desarrollo vegetal. Estos juegan roles estructurales en
distintos tejidos de soporte o protección, están involucrados en estratégicas de defensa y
tienen propiedades como señalizadores, particularmente en las interacciones entre las
plantas y su ambiente (Boudet, 2007; Huda-Faujan et al., 2009). Estos metabolitos
109
Capítulo 6
secundarios son antioxidantes especialmente importantes debido a su elevado potencial
redox, que permite su acción como agentes reductores, donadores de hidrógeno y
depuradores de oxígeno singlete (Kähkönen et al., 1999).
El refuerzo del metabolismo fenólico en plantas está frecuentemente asociado
con fenómenos de resistencia inducida contra numerosas bacterias, hongos y virus
causantes de enfermedades vegetales (Boudet, 2007). En este sentido, los compuestos
fenólicos pueden actuar como compuestos solubles antimicrobianos y antialimentarios, o
bien, pueden formar enlaces cruzados con calosa, proteínas y polisacáridos dentro de las
paredes celulares frenando la penetración de patógenos y la absorción de nutrientes por
éstos (Hukkanen et al., 2007).
3. Objetivos del capítulo
El presente capítulo tuvo como objetivo evaluar fenómenos bioquímicos
activados durante la interacción Azospirillum-frutilla, como la ocurrencia de estallido
oxidativo, la síntesis de compuestos fenólicos solubles y unidos a las paredes celulares, y la
peroxidación de lípidos de membrana.
110
Capítulo 6
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria ananassa, Duch) var. `Camarosa´
micropropagadas in vitro, que se obtuvieron del Banco de Germoplasma Activo de Frutilla
de la Universidad Nacional de Tucumán. Todo el ensayo fue llevado a cabo en condiciones
de esterilidad y se controló la ausencia de microorganismos en las plantas saneadas por
cultivo in vitro sembrando un macerado de las mismas en placas de Petri con medio LB
(composición capítulo 3) que se incubaron a 30 °C por 120 h. Cumplido este tiempo, los
lotes que estaban libre de desarrollo microbiano se consideraron para los ensayos.
Las plantas se cultivaron en macetas desinfectadas con sustrato estéril (humus:
perlome; 2:1) durante tres meses, al cabo de este tiempo se lavaron sus raíces con agua
destilada estéril y se trasplantaron a bandejas de plástico con solución nutritiva de
Hoagland estéril modificada según Epstein (1972) y aireación constante (pO2= 20 KPa).
Las mismas se mantuvieron en cámara de crecimiento durante 10 días a 28 ° C, humedad
relativa 70% y 16 h de fotoperiodo (250 µmol fotones m2 s−1).
2. Inóculo
Para el preparar el inóculo se sembró una colonia aislada de Azospirillum
brasilense REC3 en medio NFb líquido (composición en capítulo 3) y se incubó durante 48
h a 28 ° C y 600 rpm. Concluido el tiempo de incubación, se ajustó la concentración de la
suspensión bacteriana en aproximadamente 106 UFC·ml-1 (DO560 =0,2).
111
Capítulo 6
3. Inoculación y toma de muestras
Se inocularon 35 plantas de frutilla (5 plantas por cada tiempo de muestreo) en
cultivo hidropónico sumergiendo las raíces en la suspensión de A. brasilense REC3 (106
CFU·ml-1) durante 20 min y luego se colocaron nuevamente en las bandejas de plástico con
solución hidropónica estéril y aireación constante. Por otro lado, como control se
sumergieron las raíces de 35 plantas durante 20 min en agua destilada estéril.
Las raíces y hojas de cinco plantas por tratamiento fueron seleccionadas al azar
en cada tiempo de muestreo: 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-inoculación (hpi). De
cada planta se tomaron muestras sólo una vez para evitar eventuales efectos debidos al
corte. El pool de hojas de cinco plantas muestreado a cada tiempo se utilizó para evaluar el
estallido oxidativo, el contenido de compuestos fenólicos y la peroxidación lipídica.
4. Determinación histoquímica del radical superóxido y peróxido de hidrógeno
La capacidad de Azospirillum para inducir un estallido oxidativo de forma local
o sistémica se evaluó mediante tinciones hitoquímicas en raíces y hojas de frutilla,
respectivamente, de manera tal de detectar la producción de peróxido de hidrogeno y/o
radical superóxido.
Las hojas y raíces de plantas control e inoculadas con REC3, muestreadas en
distintos tiempos post-inoculación (0, 12, 24, 48, 72, 96, 120 hpi), se tiñeron con nitro-blue
tetrazolio (NBT; Sigma-Aldrich, Bélgica) para la detección de superóxido (GrelletBournoville y Díaz- Ricci, 2011). Los tejidos vegetales se enjuagaron con agua destilada y
se incubaron en una solución de NBT 0,1 % (p/v) y azida de sodio 10 mM preparada en
buffer fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) durante 8 h, en oscuridad y a 25 °C. La
112
Capítulo 6
producción de superóxido se visualizó como un depósito de formazan púrpura sobre los
tejidos.
Similarmente, se utilizó la tinción con 3,3-diaminobencidina (DAB; SigmaAldrich, Bélgica) para evaluar la acumulación de peróxido de hidrógeno en hojas y raíces
(Vleesschauwer et al., 2006). Luego del lavado suave con agua destilada, las raíces se
sumergieron en una solución que contenía DAB 0,1 % (p/v) y Triton-X-100 0,01% (v/v)
durante 12 h, en oscuridad y a 25 °C. El mismo procedimiento se realizó en hojas
desprendidas simplemente sin Triton-X-100. Como resultado positivo se observó la
producción de un precipitado de color marrón-rojizo por la reacción del DAB con el H2O2
catalizada por peroxidasas.
Los controles positivos de la tinción con NBT se prepararon sumergiendo los
tejidos vegetales en buffer fosfato de potasio 50 mM (pH 7,8) que contenía riboflavina 27
mM y metionina 17 mM durante 1 h, a 25 °C y con luz blanca. Para la reacción positiva de
DAB, los tejidos vegetales se sumergieron en H2O2 10 mM durante 30 min a 25 °C, y para
el control negativo de DAB, los tejidos se sumergieron en ácido ascórbico 10 mM
(depurador de peróxidos).
Luego de la fijación del colorante (NBT o DAB), las hojas fueron clarificadas
por calentamiento en etanol 95% (v/v) y posterior inmersión en una solución de ácido
láctico: glicerol: H2O (3:3:4) por 24 h.
113
Capítulo 6
5. Extracción y cuantificación de compuestos fenólicos
Para la extracción de compuestos fenólicos solubles totales, se pesó 1 g de
hojas o raíces frescas y se homogeneizaron con 20 ml de etanol: agua (80:20; v/v). Los
extractos se centrifugaron a 3.000 g durante 10 min y el sobrenadante, conteniendo la fase
alcohólica rica en compuestos fenólicos solubles, fue sonicada durante 30 min a 4 °C.
La extracción de compuestos fenólicos unidos a la pared celular, hidrolizables
con NaOH, se realizó por el método descrito por Hukkanen et al. (2007). Para ello, el
precipitado restante de la extracción anterior se lavó una vez con metanol 100% para
eliminar las trazas de compuestos fenólicos solubles residuales. A continuación, se añadió 1
ml de NaOH 1 M cada 20 mg de tejido fresco, se hidrolizaron a 70 ° C durante 1 h, y se
centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes se neutralizaron con un
volumen de HCl 1 M, se evaporaron al vacío a 25 °C y se resuspendieron en 1 ml de etanol:
agua (80:20; v/v). Para los controles positivos se utilizaron plantas irradiadas con luz UV
durante 1 h y plantas sumergidas en H2O2 10 mM durante 30 min.
El contenido total de fenoles de los extractos obtenidos, correspondientes a
compuestos fenólicos solubles o unidos a la pared celular, se determinó utilizando el
reactivo de Folin-Ciocalteu según el método de Singleton y Rossi (1965). De cada extracto
se tomaron 100 µl y se mezclaron con 2,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu 0,2 N y 2 ml
de Na2CO3 7,5 % (p/v), por triplicado. Luego de incubar a 25 °C durante 10 min, se midió
la absorbancia de todas las muestras a 765 nm. Los resultados se expresaron en miligramos
de equivalentes de ácido gálico (GA) por gramo de peso fresco de hojas o raíces, calculados
a partir de una curva patrón de GA puro.
114
Capítulo 6
6. Peroxidación lipídica
La peroxidación lipídica se determinó midiendo la concentración de ácido
malondialdehído (MDA) de acuerdo con el método TBARS (thiobarbituric acid reactive
species) que mide las sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBA; thiobarbituric
acid) según lo descripto por Hodges et al. (1999). A tal fin, se pesó 1 g (peso fresco) de
tejido de hoja o raíz y se homogeneizó con 20 ml de etanol: agua (80:20; v/v), seguido por
una centrifugación a 3.000 g durante 10 min. Se tomaron dos alícuotas de 0,5 ml del
extracto alcohólico (sobrenadante): una alícuota se mezcló con 0,5 ml de la solución
denominada “+TBA” (ácido tricloroacético 20 %; p/v), hidroxitolueno butilado 0,01 %
(p/v) y TBA 0,65% (p/v), y la otra alícuota se mezcló con la solución denominada “-TBA”
con una composición similar a la anterior, pero sin TBA. Las mezclas se calentaron a 95 ºC
durante 25 min, se enfriaron y después se centrifugaron a 4.000 g durante 10 min. Las
absorbancias se midieron a 450 nm, 532 nm y 600 nm en un espectrofotómetro Beckman
DU Modelo #640 (Beckman Coulter Inc., EEUU). Los equivalentes de MDA se calcularon
de acuerdo con las siguientes fórmulas (Hodges et al., 1999):
1) A= [(Abs 532 +TBA – Abs 600 +TBA) – (Abs 532 –TBA – Abs 600 –TBA)]
2) B= [(Abs 440 +TBA – Abs 600 +TBA) 0,0571]
3) MDA (nmol ·ml-1) = [(A-B/157000)106]
La máxima absorbancia del complejo MDA-TBA se registra a 532 nm; la
absorbancia medida a 600 nm corresponde a la corrección de turbidez no específica; la
absorbancia de 440 nm mide sacarosa; 0,0571 es la relación de absorbancia molar de
sacarosa a 532 nm y 440 nm, respectivamente; y 157.000 es el coeficiente de extinción
molar de MDA.
115
Capítulo 6
Plantas que fueron irradiadas con luz UV durante 1 h y plantas sumergidas en
H2O2 10 mM durante 30 min también se utilizaron como controles positivos.
7. Diseño experimental y análisis estadístico.
Se utilizó un diseño factorial con bloques completamente aleatorios de dos
tratamientos (inoculados con REC3 y controles no inoculados) con 35 plantas por cada
tratamiento y 7 tiempos de muestreo (0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 hpi), de manera tal que
hubo cinco plantas/tiempo/tratamiento. El análisis estadístico de los datos se procesó
mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la significancia estadística de las medias
aritméticas se evaluaron mediante la prueba de diferencias múltiple LSD Fisher utilizando
el programa Infostat (versión 2008 para Windows). Las diferencias entre tratamientos se
consideraron significativas si p<0,05.
RESULTADOS
1. Detección del estallido oxidativo
La producción del radical superóxido y de peróxido de hidrógeno en raíces y
hojas de plantas de frutilla cultivadas hidropónicamente fueron evaluados con NBT y DAB,
respectivamente, en diferentes tiempos post-inoculación: 12, 48, 72, 96 y 120 hpi.
Las hojas de las plantas no-inoculadas e inoculadas radicularmente con
Azospirillum brasilense REC3 no mostraron tinción positiva con DAB ni con NBT en los
tiempos evaluados (Fig. 37).
116
Capítulo 6
Controles
positivos
Figura 37. Estallido oxidativo en hojas de plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3
(106 UFC·ml-1) y controles no–inoculadas muestreadas a las 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas postinoculación. El reactivo 3,3-diaminobencidina (DAB) se utilizó para evaluar la acumulación de
H2O2 y el Nitro-blue tetrazolio (NBT) para la detección del radical O2•-.
La columna “controles” corresponde a las reacciones positivas de NBT y DAB.
De manera similar, las raíces inoculadas mostraron la misma cantidad de
precipitados de DAB y NBT que las raíces de plantas control no-inoculadas (Fig. 38), lo
que confirma la incapacidad de REC3 para inducir el aumento de H2O2 y O2•- en los
tiempos del experimento.
117
Capítulo 6
Controles
positivos
Figura 38. Estallido oxidativo en raíces de plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3
(106 UFC·ml-1) y controles no–inoculadas muestreadas a 24, 48, 72 y 96 horas post-inoculación.
El reactivo 3,3-diaminobencidina (DAB) se utilizó para evaluar la acumulación de H2O2
y el Nitro-blue tetrazolio (NBT) para la detección del radical O2•-.
La columna “controles” corresponde a las reacciones positivas de NBT y DAB.
Sin embargo, se observó una fuerte acumulación de H2O2 y O2•- en las raíces y
hojas previamente tratados con H2O2 (control positivo de DAB) o riboflavina-metionina
(control positivo de NBT), respectivamente, confirmando la especificidad de las tinciones
realizadas (Fig. 37 y 38). También se incluyeron controles negativos que consistieron en
hojas y raíces tratadas previamente con un depurador de H2O2 como el ácido ascórbico
donde no se observaron precipitados.
118
Capítulo 6
2. Cuantificación de compuestos fenólicos solubles totales y unidos a la pared celular
La Figura 39 muestra la cuantificación de compuestos fenólicos solubles totales
de hojas y raíces de plantas de frutilla controles (no-inoculadas) e inoculadas con A.
brasilense REC determinados en las 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 hpi y expresados como mg
de ácido gálico (GA) ·g-1 peso fresco. Los datos corresponden a las medias ± desvío
estándar de tres repeticiones.
La prueba de diferencia estadística LSD Fisher mostró que la inoculación con
A. brasilense REC3 aumentó los niveles de compuestos fenólicos solubles en hojas y raíces
a partir de las12 hpi (p<0,05; Fig. 39). Sin embargo, no hubo diferencias entre las medias
por efecto del tiempo.
Los valores promedio de los controles positivos de plantas irradiadas con luz
UV fueron: 3,83 ± 0,24 mg GA· g-1 hojas y 2,03 ± 0,13 mg GA· g-1 raíces; y en plantas
tratadas con H2O2 los valores fueron: 5,89 ± 0,16 mg GA· g-1 hojas, y y 2,49 ± 0,15 mg
GA· g-1 raíces.
119
Capítulo 6
Figura 39. Compuestos fenólicos solubles totales de hojas (a) y raíces (b) de plantas de frutilla
controles (no-inoculadas) e inoculadas con A. brasilense REC3 (106 cfu·ml-1) determinados a las 0,
12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-inoculación (hpi) y expresados como mg de ácido gálico (GA)
·g-1 peso fresco. Los datos corresponden a las medias ± desvío estándar de cinco repeticiones. El
análisis de la varianza tiene un nivel de significación: p <0,05 (*) y las pruebas de diferencias con el
test LSD Fisher se llevaron a cabo por separado para cada uno de los tejidos vegetales.
En comparación con los compuestos fenólicos solubles, las concentraciones de
fenólicos unidos a la pared celular (hidrolizables con NaOH) fueron 10 veces más bajas
(Fig. 40). Cualitativamente, hubo una disminución del contenido de compuestos fenólicos
ligados a la pared celular en plantas inoculadas con REC3 durante las primeras 96 hpi. Sin
120
Capítulo 6
embargo, el análisis de ANOVA de estos datos indicó que no hubo diferencias
significativas entre las medias de los tejidos inoculados y los controles no-inoculados
(p<0,05; Fig. 40).
Figura 40. Compuestos fenólicos unidos a pared celular de hojas (a) y raíces (b) de plantas de
frutilla controles (no-inoculadas) e inoculadas con A. brasilense REC3 (106 cfu·ml-1) determinados
a las 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-inoculación (hpi) y expresados como mg de ácido gálico
(GA) · g-1 peso fresco. Los datos corresponden a las medias ± desvío estándar de cinco repeticiones.
El análisis de la varianza tiene un nivel de significación: p <0,05 (*) y las pruebas de diferencias
con el test LSD Fisher se llevaron a cabo por separado para cada uno de los tejidos vegetales.
121
Capítulo 6
3. Análisis de la peroxidación lipídica
El contenido de MDA (ácido malonaldehído) es un indicador de la
peroxidación lipídica y el daño oxidativo de las membranas. La Figura 41 muestra los
resultados de las concentraciones de MDA en tejidos de plantas de frutilla controles e
inoculadas con A. brasilense REC3 expresados como nmoles de MDA·g-1 peso fresco.
Figura 41. Peroxidación lipídica expresada en nmol de ácido malondialdehído (MDA) ·g-1 peso
fresco de hojas (a) o raíces (b) de plantas de frutilla controles (no-inoculadas) e inoculadas con A.
brasilense REC (106 cfu·ml-1) y determinada a las 0, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas post-inoculación
(hpi). Los datos corresponden a las medias ± desvío estándar de cinco repeticiones. El análisis de la
varianza tiene un nivel de significación: p <0,05 (*) y las pruebas de diferencias con el test LSD
Fisher se llevaron a cabo por separado para cada uno de los tejidos vegetales.
122
Capítulo 6
Los resultados mostraron una tendencia similar en ambos tejidos analizados. Se
observó que durante las primeras 48 h posteriores a la inoculación (hpi) con Azospirillum,
hubo una disminución de TBARS (especies reactivas del ácido tiobarbitúrico) en las hojas
y raíces de frutilla; mientras que a las 96 y 120 hpi la inoculación con Azospirillum causó
un incremento en el contenido de MDA en comparación con las plantas control. Se observó
un punto de inflexión en las 72 hpi cuando los tejidos del control e inoculados mostraron
concentraciones de MDA similares. La prueba de diferencia múltiple LSD Fisher mostró
que la inoculación con REC3 disminuyó significativamente la peroxidación lipídica de las
hojas y raíces en las 24 hpi (Fig. 41; p<0,05). En contraste, el contenido de MDA de hojas
inoculadas aumentó significativamente en las 120 hpi, en comparación con los tejidos de
control, y lo mismo se observó en las raíces a las 96 hpi (Fig. 41; p<0,05).
Resumiendo, el daño oxidativo a los lípidos de membrana en plantas inoculadas
con Azospirillum disminuyó durante las primeras 48 hpi, tuvo un punto de inflexión a las
72 hpi y aumentó después de las 96 hpi.
DISCUSIÓN
Las plantas han desarrollado estrategias sofisticadas para percibir y defenderse
de los diferentes tipos de patógenos mediante el disparo de una gran diversidad de señales.
Estas respuestas de defensa incluyen el estallido de especies reactivas de oxígeno que
culminan en una muerte celular llamada respuesta hipersensible (RH), la fortificación de la
pared celular a través de la síntesis de calosa y lignina, la producción de metabolitos
secundarios antimicrobianos y la acumulación de proteínas relacionadas con patogénesis
(PR) (Pieterse et al., 2009).
123
Capítulo 6
En este capítulo se muestra que la inoculación de plantas de frutilla con A.
brasilense REC3 indujo la acumulación de compuestos fenólicos solubles en las raíces y las
hojas a partir de las 12 hpi hasta las 120 hpi. Una inducción similar se ha observado en
plantas de betel (Piper betel L.) luego de la inoculación con la cepa PGPB Serratia
marcescens NBRI1213, donde hubo un aumento de la cantidad y diversidad de compuestos
fenólicos debido a la activación de la ruta de los fenilpropanoides (Lavania et al., 2006). Se
conoce que en plantas biotizadas, el incremento de los compuestos fenólicos solubles
podría actuar como barreras antimicrobianas que conducirían a una mayor resistencia
contra diversos fitopatógenos (Hukkanen et al., 2007; Tortora et al., 2012). Por su lado,
Cowan (1999) informó que los compuestos fenólicos solubles también pueden ser tóxicos
para algunos microorganismos en diferentes modos: por alteración de las membranas
bacterianas, unión a proteínas o sustratos, o bien, afectando la actividad de algunas
enzimas. Además, los cambios en los compuestos fenólicos unidos a las paredes celulares
vegetales estarían involucrados en procesos de defensa debido a la formación de enlaces
cruzados entre los compuestos fenólicos y otros materiales insolubles de las paredes
celulares, afectando la capacidad de penetración de los agentes patógenos (Hukkanen et al.,
2007). Estos mismos autores, observaron que el tratamiento con benzotiodiazol aumentó la
acumulación de fenoles solubles y unidos a pared celular en las hojas de plantas de frutilla,
mejorando la resistencia a la infección por oidio en condiciones de invernadero.
A nivel molecular, algunos autores han resaltado la correlación de manera
directa del aumento de la expresión génica y actividad de la enzima fenilalanina-amoniacoliasa (PAL) con el aumento de los compuestos fenólicos en respuesta a diferentes estímulos
(Boudet 2007, Ruíz-Sánchez et al., 2011). Un ejemplo de esta correlación se observó
anteriormente en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3, donde el aumento
124
Capítulo 6
de la expresión de PAL a las 96 hpi ocurrió en paralelo con el aumento del contenido de
polifenoles totales (Tortora et al., 2012). Además, PAL es una enzima clave en la ruta del
fenilpropanoide que conduce a una variedad de metabolitos secundarios de plantas
relacionados con la defensa, tales como el ácido salicílico, fitoalexinas y polímeros como la
lignina (Hahlbrock y Scheel, 1989). Por lo tanto, el papel de los polifenoles como
moléculas señales debe ser considerado de gran importancia debido a su participación en
procesos de crecimiento y desarrollo, así como también en la activación de respuestas de
defensa (Foyer y Noctor, 2009).
Además de su actividad antimicrobiana, los polifenoles pueden funcionar como
sistemas antioxidantes no enzimáticos permitiendo mejorar la tolerancia de las plantas al
estrés oxidativo (Huda-Faujan et al., 2009.).
El estallido oxidativo inducido por estrés y su señalización redox asociada son
procesos muy complejos y a menudo implican eventos de producción de ERO aislados,
provenientes de diferentes fuentes dentro de la célula vegetal, algunas locales y otras
alejadas del lugar donde se produjo el estímulo inicial, seguido por olas de señales
amplificadas (Foyer y Noctor, 2005). En este trabajo, el análisis histoquímico de hojas de
plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3 reveló que no hubo acumulación de
H2O2/O2•- a nivel local ni sistémico en los tiempos ensayados. Por lo tanto, se infiere que
los compuestos fenólicos solubles, que fueron incrementados por la inoculación con
Azospirillum, podría actuar como depuradores de ERO inhibiendo el estallido oxidativo en
los tejidos de frutilla. Esto mejoraría la sostenibilidad y rendimiento del cultivo gracias a su
mayor tolerancia al estrés.
Las técnicas de tinción con DAB y NBT son ampliamente conocidas y
utilizadas para identificar ERO, pero en este estudio dichas especies no fueron detectadas.
125
Capítulo 6
Teniendo en cuenta que las reacciones de control positivo mostraron tinción positiva en los
tejidos tratados previamente con sustancias generadoras de ERO, la incapacidad para
detectar el estallido oxidativo no puede ser atribuido a la falta de precisión del método
utilizado. Entonces, la ausencia de estallido oxidativo probablemente se deba al estricto
control de las reacciones oxido-reducción llevado a cabo por las plantas, donde la
intensidad, duración y localización de las diferentes señales de ERO son el resultado de la
sincronización entre las tasas de producción y depuración de las mismas (Mittler et al.,
2004). Además, esta red de señalización es muy dinámica, dificultando la detección y
cuantificación de ERO debido a su inestabilidad y movilidad (Foyer y Noctor, 2005). Y
aunque el H2O2 es el menos reactivo de estas especies, es aún muy difícil de evaluar ya que
es generado continuamente a lo largo de la vía de señalización, o bien hay una señal móvil
que es inducida por el H2O2 en un punto de partida y genera H2O2 en un punto de llegada
(Foyer y Noctor, 2009).
Los resultados negativos de la tinción de NBT y DAB de este trabajo sugieren
que hay un nivel reducido de estrés oxidativo en plantas de frutilla inoculadas con la cepa
REC3, de manera similar a lo informado por Weyens et al. (2012) en plantas de álamo
inoculado con la cepa PGPB Pseudomonas putida W619. Estos autores observaron una
disminución de la actividad de la glutatión reductasa en las raíces y de la superóxido
dismutasa en raíces y hojas de plantas inoculadas. Este resultado no descarta la hipótesis de
que la supresión de la acumulación de ERO puede deberse a una reacción específica del
huésped como un mecanismo evasivo que permitiría a A. brasilense colonizar tejidos
vegtales y escapar al sistema inmune innato de la planta.
Aunque no se pudo detectar efectivamente el estallido oxidativo, se pudo
cuantificar una señal más estable de la producción de ERO como es la peroxidación lipídica
126
Capítulo 6
de las membranas celulares de hojas y raíces de frutilla. En primer lugar, se esperaba
encontrar una disminución en el contenido de MDA, producto secundario de la degradación
oxidativa de lípidos, en plantas inoculadas con Azospirillum debido al incremento de los
compuestos fenólicos y su acción antioxidante. Sin embargo, esto fue cierto sólo durante
las primeras 24 hpi, cuando los valores de peroxidación lipídica de las plantas colonizadas
por REC3 fueron significativamente menores que en los tejidos de los controles.
Posteriormente, se observó un aumento del contenido de MDA en las 96 hpi en plantas
inoculadas con Azospirillum, en comparación con las plantas control no-inoculadas. Si bien
la peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados podría resultar perjudicial para las células
vegetales debido a que disminuye la fluidez de la membrana y aumenta su permeabilidad
(Moller et al., 2007), desde un punto de vista energético, esto podría ser ventajoso ya que
una molécula lipídica dañada (como un ácido poliinsaturado) es más simple de eliminar y
reemplazar que una molécula proteica (Moller et al., 2007).
Recientemente, Ruiz Sánchez et al. (2011) también observaron incrementos en
el contenido de MDA en plantas de arroz a los 30 días posteriores a la inoculación con
Azospirillum brasilense; ellos explicaron este efecto afirmando que las plantas inoculadas
eran más grandes, y por lo tanto, se verían más afectadas por el estrés impuesto. En el
presente trabajo, el incremento de MDA también podría explicarse teniendo en cuenta las
cantidades reducidas de compuestos fenólicos unidos a la pared celular en plantas
inoculadas y a la reducida capacidad de amortiguación redox del apoplasto vegetal (Foyer y
Noctor, 2005).
En general, el estallido oxidativo en el protoplasto ha sido estudiado en relación
al estrés abiótico principalmente, mientras que las ERO generadas en la membrana
plasmática se asocia a menudo con una respuesta a estreses bióticos mediada por una
127
Capítulo 6
NADPH-oxidasa (Bolwell et al., 2002). Por lo tanto, la posible acumulación de ERO en las
membranas celulares y las cantidades reducidas de compuestos fenólicos unidos a la pared
celular en plantas inoculadas con A. brasilense REC3, así como también la menor
capacidad amortiguadora de redox del apoplasto, podrían explicar el incremento del
contenido de MDA observado en este trabajo durante los últimos tiempos de muestreo. Por
el contrario, la disminución del daño oxidativo observado durante las primeras 48 hpi
estaría en concordancia con el incremento de compuestos fenólicos solubles y con la
aparente ausencia de acumulación de ERO.
Por otro lado, debido a que el contenido de oxígeno es significantemente más
alto en las células fotosintéticas, respecto al resto de las células heterotróficas de la planta,
las mayores concentraciones de MDA y compuestos fenólicos determinados en los tejidos
foliares en comparación con las raíces, puede estar relacionado con el mayor efecto de las
ERO en respuesta al estrés en los tejidos fotosintéticos (Foyer y Noctor, 2009).
La ausencia de diferencias entre las concentraciones de compuestos fenólicos
unidos a la pared celular de plantas inoculadas y controles, se debería al corto tiempo de
ensayo (120 h), lo cual no sería suficiente para sintetizar nuevos compuestos estructurales
de la pared celular.
Los compuestos fenólicos unidos a la pared celular no presentaron diferencias
significativas entre las plantas inoculadas y controles en todos los tiempos analizados; este
resultado se explicaría teniendo en cuenta el método utilizado para la extracción de los
compuestos unidos a la pared celular y la naturaleza química de los mismos. La técnica
descrita por Hukkanen et al. (2007) y utilizada en este trabajo, se centra en compuestos
fenólicos unidos mediante enlaces éster a los polisacáridos de la pared celular, y no
considera los polímeros fuertemente unidos a la pared, tales como la lignina. Los
128
Capítulo 6
compuestos determinados por este método se consideran que derivan de los materiales con
uniones éster, ya que son liberados durante la primera hora de hidrólisis con una base débil
como NaOH (1 M) y temperatura moderada (70 ºC); mientras que la lignina y otros
compuestos unidos mediante enlaces éter no son fácilmente liberados de la matriz de la
pared, y por lo tanto, deben utilizarse condiciones de hidrólisis más fuertes para su
extracción (von Röpenack et al., 1998; Martens, 2002).
CONCLUSIONES
 La cepa Azospirillum brasilense REC3 no indujo una señal de estallido oxidativo local
ni sistémica en las plantas de frutilla entre las 12 hpi y 120 hpi.
 La inoculación de las plantas de frutilla con A. brasilense REC3 produjo un aumento en
los niveles de compuestos fenólicos solubles totales en hojas y raíces a partir de las 12
hpi hasta las 120 hpi, actuando como factores antioxidantes y/o antimicrobianos.
 Los niveles de compuestos fenólicos unidos a la pared celular no mostraron diferencias
significativas entre los tejidos de plantas de frutilla inoculadas y controles noinoculados.
 La peroxidación de lípidos disminuyó significativamente durante las primeras 24 h en
raíces y hojas de plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3.
 La señales bioquímicas activadas por A. brasilense REC3, como la ausencia de estallido
oxidativo, el aumento de compuestos fenólicos solubles totales y la diminución de la
peroxidación de lípidos de membrana, indicaron la activación de un “estado de alerta” o
“priming” en plantas de frutilla inoculadas, siendo éste un proceso importante de la
resistencia sistémica inducida de plantas.
129
Capítulo 7
Capítulo 7
130
Capítulo 7
Evolución temporal de la producción del ácido salicílico y ácido indol-3-acético
en plantas de frutilla inoculadas con Azospirillum brasilense
INTRODUCCIÓN
1. El sistema inmune vegetal: señalización hormonal
Las fitohormonas son moléculas pequeñas que en bajas concentraciones regulan
procesos vitales en las plantas como el crecimiento, desarrollo, reproducción y respuestas a
distintos estímulos de origen biótico y abiótico. Las principales hormonas que inducen
respuestas a través de las vías de señalización hormonal son el ácido salicílico (AS), ácido
jasmónico (AJ) y etileno (ET) (Bari y Jones, 2009; Pieterse et al., 2009, 2012). No obstante,
numerosos estudios han demostrados que otras hormonas, como las auxinas, giberelinas,
citocininas, ácido absícico, oxilipinas y brasinoesteroides, también juegan roles importantes
en la defensa vegetal (Bari y Jones, 2009; Pieterse et al., 2012).
Luego del ataque por un fitopatógeno, las plantas modifican los niveles
hormonales, y la expresión de los genes asociados, para activar respuestas de defensa
efectivas permitiendo su supervivencia. Por otro lado, los patógenos pueden contraatacar
esta estrategia interfiriendo con los cambios hormonales vegetales, y a tal fin, ellos mismos
producen fitohormonas como parte de su estrategia de invasión (López et al., 2008).
Para inducir la inmunidad vegetal es crítico que ocurra una apropiada
relocalización de recursos hacia las respuestas de defensa que es energéticamente costoso,
en lugar de satisfacer los requerimientos para el crecimiento y reproducción. El
mantenimiento de un equilibrio entre estos procesos es fundamental para la supervivencia
vegetal y la efectiva competencia con otras especies de plantas (Taiz y Zeiger, 2002).
131
Capítulo 7
Abundantes datos fisiológicos sugieren que todas las hormonas vegetales
interactúan con una o más hormonas adicionales. Dependiendo del contexto, la interacción
hormonal puede implicar cambios en el nivel de la distribución hormonal o en la respuesta
de defensa, ya que interactúan a nivel de la expresión génica (Santner et al., 2009); por lo
tanto, modulando las vías de señalización hormonal las plantas controlan procesos vitales
para la resistencia (López et al., 2008).
Por otro lado, las relaciones antagónicas o sinérgicas entre señalizaciones
hormonales permiten regular en forma precisa la respuesta de una planta a un determinado
estrés. Se ha demostrado que la acumulación de AS endógeno antagoniza la activación de
defensas dependientes de AJ (Koornneef et al., 2008) y a la vez este efecto es regulado por
ET (Leon-Reyes et al., 2009). Existe una estricta regulación conservada durante la
evolución entre las vías dependientes de AS y AJ. Sin embargo, existen datos
contradictorios respecto a su interacción; mientras algunos autores afirman que existe una
relación antagónica entre las mencionadas vías, debido al efecto supresor de AS sobre los
genes inducidos por AJ (Koornneef et al., 2008), otros describieron efectos sinérgicos entre
las mismas (Van Wees et al., 2000; Mur et al., 2006).
2. El ácido salicílico
El ácido salicílico (AS) es la hormona vegetal más conocida por su papel
central en la defensa (Delaney et al., 1994; Kawano et al., 2004; Vlot et al., 2009) y está
involucrada en numerosos procesos vegetales como la geminación de semillas, desarrollo
de plántulas, crecimiento celular, respiración, respuesta de estomas, senescencia,
nodulación en fabáceas, producción de frutos y termogénesis (Vlot et al., 2008). Es un
compuesto fenólico formado por un grupo hidroxilo unido a un anillo aromático que se
132
Capítulo 7
sintetiza a partir del corismato (metabolito primario) a través de la vía del isocorismato en
dos pasos catalizados por las enzimas isocorismato sintasa (ICS) e isocorismato piruvato
liasa (IPL); o a través de la fenilalanina que es transformada en ácido cinámico por la
fenilalanina-amonio liasa (PAL) (Fig. 42; Garcion y Métraux, 2006; Vlot et al., 2009).
Figura 42. Ruta biosintética del ácido salicílico y sus derivados a través de las vías del
fenilpropanoide y del isocorismato en plantas superiores. Abreviaciones: PAL, fenilalanina amonio
liasa; ICS, isocorismato sintasa; IPL, isocorismato piruvato liasa; BA2H, ácido benzoico-2hidroxilasa; SA, ácido salicílico (AS); SAGT, AS glucosiltransferasa; SAMT, AS metiltransferasa;
aa, aminoácidos; SABP2, proteína de unión a AS 2; MES, metil esterasa; SGE, éster de glucosa
saliciloil; SAG, AS O-β-glucósido; MeSA, metil salicilato; MeSAG, O-β-glucósido de metil
salicilato. Traducciones: Phenylalanine, fenilalanina; Cinnamic acid, ácido cinámico; O-cumaric
acid, ácido O-cumárico; Benzoate intermediates, intermediarios benzoatos; Chorismate, corismato;
Isochorismate, isocorismato; SA-aa conjugates, conjugados de AS-aa. Tomado de Vlot et al., 2009.
El AS participa como molécula señal en la inducción de una vía de defensa que
proporciona protección sistémica, perdurable y contra una amplia gama de fitopatógenos,
conocida como resistencia sistémica adquirida o SAR (systemic acquired resistance;
Delaney et al., 1994; Durrant y Dong, 2004). La infección de las plantas por distintos
fitopatógenos resulta en un aumento de los niveles de AS, tanto en el sitio de la infección
133
Capítulo 7
como en tejidos distantes (Vlot et al., 2008). Esta respuesta parece requerir la síntesis, en el
sitio de la infección, de un compuesto volátil llamado metil-salicilato (MeSA). Santner et
al. (2009) sugieren que el MeSA se mueve entonces a otras partes de la planta, incluso a
veces hacia plantas vecinas, en donde es convertido nuevamente en AS por la proteína de
unión a AS, SABP2 (salicylic acid biding protein 2).
Muchos de los detalles de la señalización y percepción del AS no han sido
elucidados aún; no obstante, está claro que la respuesta de AS depende de una proteína
NPR1 (nonexpresor of PR genes). Cuando aumentan los niveles de AS, NPR1 se transloca
al núcleo donde promueve la transcripción de una gran familia de genes relacionados a
patogénesis llamados PR (pathogenesis related). Algunas proteínas PR tienen actividad
antimicrobiana, pero, en general, la función de estas proteínas no ha sido claramente
definida (Santner et al., 2009).
Así como la SAR, dependiente de AS, es disparada luego de la infección por un
patógeno, existe una vía dependiente de AJ/ET llamada resistencia sistémica inducida o
ISR (induced systemic resistance) que es activada por rizobacterias no patogénicas, como
es el caso de las PGPB (Van Wees et al., 2001; Pieterse et al., 2009). Sin embargo, se ha
informado que las bacterias del género Azospirillum (A. lipoferum y A. brasilense) son
capaces de producir sideróforos del grupo de los catecoles bajo condiciones limitantes de
hierro y entre éstos se encuentra el AS (Saxena et al., 1986; Shah et al., 1992; Tortora et al.,
2011). Por tal motivo, se ha propuesto que las bacterias productoras de AS podrían inducir
mecanismos de defensa en plantas mediante esta vía de señalización, a pesar del
controversial rol de AS producido por las PGPB en la resistencia sistémica inducida
(Siddiqui y Shaukat, 2005; Cornelis y Matthisj, 2007). Sin embargo, Van Wees et al.
(2000) han demostrado que las vías de SAR e ISR son compatibles y que su activación
134
Capítulo 7
simultanea resultó en un efecto aditivo a nivel de la protección inducida contra
Pseudomona syringae pv. tomato. Entonces, el AS sintetizado por bacterias tiene una doble
función, ya que puede actuar como sideróforo, mejorando la nutrición vegetal y
disminuyendo la disponibilidad del hierro para los organismos invasores (Tortora et al.,
2011; 2012), o como molécula señal induciendo en las plantas una resistencia sistémica de
amplio espectro (Delaney et al., 1994; Van Wees et al., 1997; 2000).
3. El ácido indol-3-acético
La principal auxina natural es el ácido indol-3-acético (AIA). El AIA está
implicado en prácticamente todos los aspectos del crecimiento y desarrollo de las plantas,
así como en las respuestas de defensa. Entre otros procesos, promueve la elongación y
división celular, la formación de raíces adventicias, induce el crecimiento en tallos y
coleoptilos, favorece la dominancia apical (espigamiento), retarda la absición de hojas,
flores y frutos jóvenes y es un regulador central en formación del brote floral y desarrollo
del fruto (Taiz y Zeiger, 2002). Esta diversidad de funciones se refleja en la extraordinaria
complejidad de sus vías de síntesis, transporte y señalización. Se han propuesto cinco vías
principales para la biosíntesis vegetal de AIA: una independiente del triptófano (Trp) y
cuatro vías dependientes de Trp. Las vías Trp-dependiente han sido denominadas a partir de
sus precursores: (i) indol-3-acetamida (IAM), (ii) ácido indol-3-pirúvico (IPA), (iii) la
triptamina (TAM) y (iv) indol-3-acetaldoxima (IAOX) (Fig. 43; Mano y Nemoto, 2012). Al
menos en Arabidopsis thaliana, los estudios indican que estas vías tienes funciones
entrecruzadas, porque las plantas deficientes en cualquiera de ellas presentan deficiencias
de crecimiento, y todo esto sugiere que los niveles de auxina son altamente regulados, lo
que es coherente con su papel central en el crecimiento vegetal (Mano y Nemoto, 2012).
135
Capítulo 7
Figura 43. Ruta biosintética del ácido indol-3-acético en plantas superiores a través de la vía
independiente del triptófano (Trp) y las cuatro vías Trp-dependientes: (i) el indol-3-acetamida (IAM),
(ii) el ácido indol-3-pirúvico (IPA), (iii) la triptamina (TAM) y (iv) el indol-3-acetaldoxima (IAOX).
Abreviaciones: IAA, ácido indol-3-acético (AIA); IAD, indol-3-acetaldehído; IAM, indol-3-acetamida;
IAN, indol-3-acetonitrilo; IAOX, indol-3-acetaldoxima; IPA, ácido indol-3-pirúvico.
Las flechas verdes indican la ruta de síntesis del triptófano en el cloroplasto. Una flecha negra discontinua
delgada indica la ruta de biosíntesis de AIA independiente de Trp. Las flechas azules indican los pasos de
la ruta biosintética de AIA Trp-dependiente para los que el gen y su función enzimática son conocidos.
Las flechas rojas indican las rutas biosintéticas del indol-alcaloide y la serotonina. Las flechas de color
ocre indican la vía de síntesis específica de especies Brassicaceae. Las letras mayúsculas en cursiva
muestran los genes implicados en el proceso de síntesis y las letras minúsculas en cursiva indican los
genes bacterianos implicados. Tomado de Mano y Nemoto, 2012.
Una vez sintetizada, la auxina se distribuye por toda la planta a través de un
sofisticado sistema de transporte de célula a célula, de manera tal que ésta será sintetizada
localmente o en gradiente, de acuerdo a los requerimientos de la planta. Por ejemplo, el
136
Capítulo 7
inicio de las hojas en el flanco de la yema apical requiere acumulación local de la auxina en
el lugar de formación del primordio del órgano (Taiz y Zeiger, 2002).
La fuente primaria de auxinas exógenas en plantas superiores proviene de la
flora microbiana rizosférica. Muchas especies bacterianas, como Azospirillum brasilense,
son capaces de sintetizar auxinas y se observó que hay un alto grado de similitud entre las
vías biosintéticas de AIA en plantas y bacterias (Spaepen et al., 2007). Las vías de síntesis
bacterianas también se clasificaron en base a su dependencia del precursor Trp; existen 4
vías Trp-dependiente: (i) la ruta del indol-3-acetonitrilo (IAN), (ii) indol-3-acetamida
(IAM), (iii) indol-3-piruvato (IPyA) y (iv) triptamina (TAM), así como una vía Trpindependiente o vía del antranilato (Fig. 44; Spaepen et al., 2007). Las 4 últimas fueron
descriptas en Azospirillum (Spaepen et al., 2007; Spaepen y Vanderleyden, 2011).
IAN
IAM
IPyA
TAM
Figura 44. Ruta biosintética del ácido indol-3-acético en bacterias a través de la vía independiente
del triptófano (Trp) y las vías Trp-dependientes: IAN, indol-3-acetonitrilo; IAM, indol-3-
acetamida; IPyA, indol-3-piruvato; TAM, triptamina. El intermedio subrayado con una
línea discontinua hace referencia al nombre de la vía. Otras abreviaciones: IAAld, indol-3acetaldehído; IPDC, indol-3-piruvato descarboxilasa. Tomado de Spaepen et al., 2007.
137
Capítulo 7
3.1. Reciprocidad de señalización de AIA entre plantas y bacterias
La mayoría de los sustratos para la actividad microbiana en el rizósfera derivan
de las plantas; estos pueden representar hasta el 40% de la materia seca producida por las
plantas, dependiendo de la especie vegetal y de las condiciones ambientales (Lambrecht et
al., 2000). Los sustratos incluyen aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, vitaminas,
nucleótidos, enzimas y otros metabolitos de plantas, incluyendo las auxinas. La presencia
de AIA de origen vegetal en la rizósfera podría ser suficiente para que A. brasilense
aumente la expresión del gen ipdC, lo que aumentará la síntesis bacteriana de AIA, debido
a que hay cantidades suficientes de precursores disponibles, como Trp (Vande Broek et al.,
1999). El AIA bacteriano estimulará entonces la proliferación de las raíces y pelos
radiculares de las plantas. Sin embargo, se sabe que por encima de cierta concentración de
AIA suministrado exógenamente, el desarrollo radicular es inhibido (Fallik et al., 1994).
Por lo tanto, la producción de AIA en las raíces colonizadas por A. brasilense es controlado
por diversos factores. Algunos autores sugieren que la regulación podría estar en el nivel de
la concentración del precursor de AIA, y habría controles adicionales a nivel del
transcriptoma regulando la expresión de genes involucrados en sus vías de síntesis; además,
la compensación de niveles muy altos de AIA estaría a nivel de la regulación de su
metabolismo (Lambrecht et al., 2000; Vande Broek et al., 2005).
4. Objetivo del capítulo
El objetivo de este capítulo fue evaluar la capacidad de Azospirillum
brasilense de modular la síntesis de ácido salicílico y ácido indol-3-acético en plantas de
frutilla. Para ello se evaluó la evolución temporal de la producción de ambas fitohormonas
en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3 y controles no-inoculados
138
Capítulo 7
mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC: reverse
phase- high pressure liquid cromatography).
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria ananassa, Duch) var. `Camarosa´
micropropagadas in vitro, que se obtuvieron del Banco de Germoplasma Activo de Frutilla
de la Universidad Nacional de Tucumán. Todo el ensayo fue llevado a cabo en condiciones
de esterilidad y se controló la ausencia de microorganismos en las plantas saneadas por
cultivo in vitro sembrando un macerado de las mismas en placas de Petri con medio LB
(composición capítulo 3) y se incubaron a 30 °C por 120 h. Cumplido este tiempo, en
aquellos lotes de plantas en que no se observó desarrollo microbiano fueron considerados
para los ensayos.
Las plantas se cultivaron en macetas desinfectadas con sustrato estéril (humus:
perlome; 2:1) durante tres meses; al cabo de este tiempo se lavaron sus raíces con agua
destilada estéril y se trasplantaron a bandejas de plástico con solución nutritiva de
Hoagland estéril modificada según Epstein (1972) y aireación constante (pO2= 20 KPa).
Las mismas se mantuvieron en cámara de crecimiento durante 10 días a 28 °C, humedad
relativa 70% y 16 h de fotoperiodo (250 µmol fotones m2 s−1).
139
Capítulo 7
2. Inoculación y diseño experimental
El inóculo se preparó sembrando una colonia aislada de Azospirillum brasilense
REC3 en medio NFb líquido (composición en capítulo 3) y se incubó durante 48 h a 28 °C
y 600 rpm. Concluido el tiempo de incubación, se ajustó la concentración de la suspensión
bacteriana en aproximadamente 106 UFC·ml-1 (DO560 =0,2).
Se inocularon 21 plantas de frutilla (3 plantas por cada tiempo de muestreo) en
cultivo hidropónico sumergiendo las raíces en la suspensión de A. brasilense REC3 (106
CFU·ml-1) durante 20 min y luego se colocaron nuevamente en las bandejas de plástico con
solución hidropónica estéril y aireación constante. Por otro lado, se sumergieron las raíces
de 21 plantas durante 20 min en agua destilada estéril (control).
Las mediciones de AS y AIA por RP-HPLC se realizaron en las 0, 12, 24, 48,
72, 96 y 120 horas post-inoculación (hpi), por triplicado. El ensayo completo se realizó 2
veces con diferentes lotes de plantas de la misma variedad: Camarosa´.
3. Obtención de los fluidos peciolares
Para la cuantificación de AS y AIA, se colectó el fluido de los pecíolos de tres
hojas centrales y completamente expandidas de cada planta por extrusión de los mismos y
con ayuda de una micropipeta (20 µl) provista de un capilar fino. Los fluidos peciolares
fueron mezclados inmediatamente en 1 ml de etanol absoluto a 4 °C y acidificados con HCl
concentrado a pH 2,0 para producir la precipitación de azúcares y otros compuestos de alto
peso molecular. Luego se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min y el sobrenadante se
recuperó en un nuevo microtubo y se llevó a sequedad bajo vacío para concentrarlos
utilizando un equipo Model SVC 200 Speed Vac Sample Concentrator (Savant Instruments
140
Capítulo 7
Co., EEUU) a fin de obtener el peso seco de cada muestra. Estas se resuspendieron con 100
µl de metanol 20% (v/v) para el análisis por cromatografía líquida.
2. Cuantificación simultánea de AS y AIA por RP-HPLC
Los extractos de los fluidos peciolares se analizaron mediante cromatografía
liquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) utilizando una columna de fase
reversa C18 (Prodigy 5 ODS-2, Phenomenex, EEUU) en un gradiente de ácido acético
(CH3COOH) 0,1 % (solvente A) y metanol (CH3OH) 100% (solvente B), ambos con ácido
trifluoroacético 0,01% (v/v). La rampa del gradiente se realizó en 20 min desde A:B 80:20
(v/v) hasta B 100%, seguida de una fase isocrática con B 100% (v/v) durante 10 min más;
ambos pasos se realizaron a una velocidad de flujo de 0,5 ml·min-1.
La elución de la columna fue monitoreada midiendo la absorbancia a dos
longitudes de onda: λAIA 280 nm y λAS 303 nm. Las cuantificaciones se realizaron mediante
el método del estándar externo utilizando curvas de calibración (curva de AS puro de 0,025
µg a 5 µg; curva de AIA puro de 0,25 µg a 5 µg).
Las fracciones conteniendo AS fueron seleccionadas de acuerdo al tiempo de
retención de estándares puros de AS. Estas se colectaron, se secaron al vacío, se
resuspendieron en CH3OH 20% (v/v) y se cuantificaron mediante espectrometría de
fluorescencia (λex= 296 nm, λem= 408 nm) en un espectrofluorómetro (Multidimensional
Fluorescence Spectrometer equipado con software VINCI; ISS, EEUU). Cada valor
obtenido correspondió al promedio de 20 lecturas de fluorescencia adquiridas en 20 seg.
En el caso de AIA, las concentraciones fueron determinadas directamente
mediante la integración del área del pico correspondiente, obtenido del cromatograma y
posterior comparación con la curva patrón.
141
Capítulo 7
El contenido de AS o AIA se expresó en ng·mg-1 de peso seco (PS) de fluído
peciolar. Además se calculó la tasa de cambio para referir los resultados obtenidos en
plantas inoculadas a su control no-inoculado, para cada tiempo de ensayo, de acuerdo a la
siguiente fórmula siendo T1= control y T2 = A. brasilense REC3:
(
)
Los valores obtenidos para cada una de las muestras analizadas corresponden al
promedio de tres repeticiones y se utilizaron tres plantas por cada tratamiento.
RESULTADOS
1. Patrones puros de AS y AIA
En las Figuras 45, 46 y 48 se muestran los cromatogramas obtenidos a partir de
los estándares puros de AS, AIA y una mezcla de ambos, respectivamente. Se demostró que
fue posible llevar a cabo la cuantificación simultánea de ambas hormonas, utilizando la
técnica aquí descripta, debido a que los compuestos analizados fueron eluídos en fracciones
diferentes. Además, en la Fig. 47 se muestra el cromatograma de la mezcla de triptófano
(Trp), AIA y ácido indol-3-butírico (AIB) confirmando la elución de AIA en una única
fracción separado de compuestos muy similares.
142
Capítulo 7
Figura 45. Cromatograma del patrón de AS analizado mediante RP-HPLC. Condiciones: columna
Prodigy C18 (Phenomenex); en gradiente de CH3OH 100% (A): CH3COOH 0,1 % (B) (v/v) (con
TFA 0,01%) desde 20:80 v/v (gradiente 20 min) hasta metanol 100% (isocrático 10 min); velocidad
de flujo 0,5 ml min-1.
λ= 280 nm;
λ= 303 nm; ---- A: CH3COOH 0,1%; ---- B: CH3OH 100%
Figura 46. Cromatograma del patrón de AIA analizado mediante RP-HPLC. Condiciones: columna
Prodigy C18 (Phenomenex); en gradiente de CH3OH 100% (A): CH3COOH 0,1 % (B) (v/v) (con
TFA 0,01%) desde 20:80 v/v (gradiente 20 min) hasta metanol 100% (isocrático 10 min); velocidad
de flujo 0,5 ml min-1.
λ= 280 nm;
λ= 303 nm; ---- A: CH3COOH 0,1%; ---- B: CH3OH 100%
143
Capítulo 7
Figura 47. Cromatograma de la mezcla de patrones de Trp, AIA y AIB analizado mediante RPHPLC. Condiciones: columna Prodigy C18 (Phenomenex); en gradiente de CH3OH 100% (A):
CH3COOH 0,1 % (B) (v/v) (con TFA 0,01%) desde 20:80 v/v (gradiente 20 min) hasta metanol
100% (isocrático 10 min); velocidad de flujo 0,5 ml min-1.
λ= 280 nm; λ= 303 nm;
---- A: CH3COOH 0,1%; ---- B: CH3OH 100%
Figura 48. Cromatograma de la mezcla de patrones de AIA y AS analizado mediante RP-HPLC.
Condiciones: columna Prodigy C18 (Phenomenex); en gradiente de CH3OH 100% (A): CH3COOH
0,1 % (B) (v/v) (con TFA 0,01%) desde 20:80 v/v (gradiente 20 min) hasta metanol 100%
(isocrático 10 min); velocidad de flujo 0,5 ml min-1.
λ= 280 nm;
λ= 303 nm;
---- A: CH3COOH 0,1%; ---- B: CH3OH 100%
144
Capítulo 7
2. Contenido de AS en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense y controles
Las plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3 mostraron un
aumento en el contenido de AS en las 12, 24 y 48 hpi respecto a los controles no
inoculados; notando un máximo en las 24 horas post-inoculación (hpi) con un valor
equivalente a 164,7 ng de AS ·mg-1 peso seco () de fluido peciolar (Fig. 49). El mayor
incremento en el nivel relativo de AS en plantas inoculadas respecto a los controles noinoculados fue igual a 107 % en las 24 hpi (Fig. 50). También se observó que luego de las
72 hpi hubo una disminución del nivel relativo de AS (menores a 40%) indicando que en
esos tiempos las plantas controles e inoculadas presentaban contenidos similares de esta
hormona (Fig. 50).
Cuantifícación de AS en plantas frutilla
CONTROL
200
REC3
ng de AS ·mg-1 PS
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
12
24
48
72
96
120
hpi
Figura 49. Contenido de ácido salicílico en el fluido peciolar de plantas de frutilla inoculadas con A.
brasilense REC3 y plantas control no inoculadas. hpi: horas post-inoculación.
145
Capítulo 7
120
% Tasa de cambio
100
80
60
40
107 %
20
0
0
12
24
48
72
96
120
hpi
Figura 50. Nivel relativo de la concentración de AS en plantas de frutilla inoculadas con
A. brasilense REC3 respecto a plantas control no inoculadas. hpi: horas post-inoculación.
%= (T2-T1)/T1)*100; T1: valor de [AS] en plantas control; T2: valor de [AS] en plantas REC3.
3. Contenido de AIA en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense y controles
Se observó también un incremento en el contenido de AIA en los fluidos
peciolares de las plantas inoculadas con A. brasilense respecto de las plantas controles a
partir de las 12 hpi y con una tendencia creciente hasta las 120 hpi. Las plantas inoculadas
presentaron un máximo de 404,5 ng de AIA ·mg-1 peso seco (PS) de fluido peciolar en las
120 hpi (Fig. 51) y el análisis de los porcentajes de tasa de cambio mostró una misma
tendencia con un incremento de AIA respecto al control equivalente a 136 % en el mismo
tiempo (Fig. 52). Sin embargo, se observó que a las 12 hpi también hubo un incremento
significativo del nivel relativo de AIA igual a 104 % (Fig. 52).
Aunque los valores de AIA fueron mayores en plantas inoculadas en todos los
tiempos evaluados, en las 72 hpi se observó que los valores del control e inoculado estaban
más próximos, y por lo tanto, hubo una disminución en la tasa de cambio en este tiempo
(50%).
146
Capítulo 7
Cinética de producción de AIA en plantas frutilla
CONTROL
REC3
ng de AIA ·mg-1 PS
500
400
300
200
100
0
0
12
24
48
72
96
120
hpi
Figura 51. Niveles de ácido salicílico en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense REC3 y
plantas control no inoculadas. hpi: horas post-inoculación.
% Tasa de cambio
160
140
120
100
80
60
136 %
40
20
0
0
12
24
48
72
96
120
hpi
Figura 52. Nivel relativo de la concentración de AIA en plantas de frutilla inoculadas con
A. brasilense REC3 en comparación con plantas control no inoculadas. hpi: horas post-inoculación.
%= (T2-T1)/T1)*100; T1: valor de [AIA] en plantas control; T2: valor de [AIA] en plantas REC3.
En general, las plantas no inoculadas utilizadas como control, no presentaron
modificaciones significativas en los niveles endógenos de AS o AIA.
147
Capítulo 7
DISCUSIÓN
A fin de establecer si el AS y/o AIA están implicados entre los mecanismos
disparados en plantas de frutilla por la inoculación con Azospirillum brasilense, se estudió
la evolución temporal de estas hormonas en plantas inoculadas y controles no-inoculados a
diferentes horas post-inoculación.
En este trabajo se observó un rápido aumento en los niveles de AS y AIA luego
de la inoculación con la cepa Azospirillum brasilense REC3; se observaron incrementos de
ambas homonas a partir de las 12 hpi. El máximo incremento de los niveles de AS en las
plantas inoculadas respecto a las plantas control ocurrió en las primeras 24 h después de la
inoculación. Por su lado, el contenido de AIA presentó un incremento significativo de su
nivel relativo al control en las 12 hpi mientras que el máximo de los tiempos evaluados se
observó a las 120 hpi (en concordancia con la tendencia creciente observada). Se consideró
que el rápido aumento de los niveles de ambas en el fluido peciolar ocurrió debido a la
liberación de AS y AIA que se encuentra conjugado en los tejidos vegetales y no por una
síntesis de novo de éstas hormonas, requiriendo la última más tiempo. Se conoce que en las
plantas ambos ácidos se encuentran conjugados con azúcares y aminoácidos; de ésta
manera, evitan la degradación y permiten su almacenamiento, transporte y homeostasis
(Bari y Jones, 2009). Esta explicación es soportada por la ausencia de una expresión
aumentada de la enzima de síntesis de AS, PAL, como se muestra en el siguiente capítulo.
La conjugación reversible de hormonas en las plantas es un modo esencial de
regulación de los niveles endógenos de las fitohormonas biológicamente activas. Los
conjugados de ácido salicílico, auxinas, giberelinas y citocininas son ampliamente
reconocidos por su función de almacenamiento que sirve para la rápida movilización o
148
Capítulo 7
inmovilización de estas fitohormonas, dependiendo de una amplia variedad de factores
ambientales, de desarrollo y fisiológicos (Kleczkowski et al., 1995).
La mayor parte del contenido total de auxinas en plantas se encuentra en su
forma conjugada y constituye un importante mecanismo regulatorio para la activación e
inactivación de AIA (Bari y Jones, 2009). En Arabidopsis thaliana se ha descripto que
existen varios genes GH3 que codifican AIA-amido sintasas responsables de la síntesis de
conjugados de AIA con los aminoácidos (aa) Ala, Asp, Phe y Trp, los cuales ayudan a
mantener la homeostasis de auxina mediante la conjugación del exceso de AIA con aa
(Staswick et al., 2005). Además, se ha demostrado que el producto del gen GH3.5 es un
modulador dual de las vías de señalización de AS y auxinas durante la infección por
patógenos (Zhang et al., 2007). La enzima GH3.5 es capaz de llevar a cabo también la
conjugación AS-aa, afectando la funcionalidad de AS, y por lo tanto, la resistencia a
enfermedades (Staswick et al., 2005), lo cual revela la existencia de una fina regulación de
ambas vías a este nivel.
Por otro lado, el AS producido por la planta también es convertido en AS O-βglucósido (SAG: salicylic acid O-β-glucoside) o en éster de glucosa saliciloil (SGE:
salicyloyl glucose ester), a través de la AS glucosiltransferasa (SAGT: salicylic acid
glucosyltransferase) inducida por patógenos (Dean y Mills, 2004; Dean et al., 2005; Dean y
Delaney, 2008). De acuerdo a lo informado por Wildermuth et al., (2001), el AS es
sintetizado en los cloroplastos; mientras que la enzima SAGT está localizada en el citosol
(Dean et al., 2005). Entonces, el SAG sería transportado desde el citosol hasta las vacuolas,
donde es almacenado en su forma inactiva pudiendo ser convertido nuevamente en AS
(Hennig et al., 1993; Dean et al., 2005).
149
Capítulo 7
Es importante remarcar que existe otro nivel de diálogo cruzado entre estas
hormonas: se ha observado que el AS reprime la expresión local y sistémica de genes que
responden a auxinas para promover la resistencia a patógenos (Wang et al., 2007). Estos
genes incluyen un importador auxina AUX1, un exportador auxina PIN7, los receptores de
auxinas TIR1 y AFB1, y genes inducidos por auxinas pertenecientes a las familias SAUR y
Aux/IAA (Wang et al., 2007). Del mismo modo, se encontró que la mayoría de estos genes
auxina-inducibles también fueron reprimidos en los tejidos sistémicos después de la
inducción de SAR, indicando que la respuesta SAR implica la regulación negativa de genes
de respuesta a auxinas. Sin embargo, los niveles de auxina libre (no conjugada) no
cambiaron después del tratamiento con AS (Wang et al., 2007).
Por otro lado, la acumulación de auxina podría causar la activación de
expansinas que debilitan la pared celular vegetal de modo tal de promover la extensibilidad
de las células y el crecimiento vegetal (Ding et al., 2008). Sin embargo, el debilitamiento de
las paredes celulares debido a elevados niveles de auxina, reduciría la capacidad del
huésped para defenderse, favoreciendo la susceptibilidad durante el ataque por patógenos
(Navarro et al., 2006; Ding et al., 2008); en consecuencia, ante una infección por patógenos
se activa la respuesta SAR y el AS reprime la señalización de AIA con el fin de reducir la
susceptibilidad vegetal (Wang et al., 2007).
En sintonía con los estudios que muestran una relación antagónica entre AS y
AIA, en este trabajo observamos que también habría una interacción entre estas hormonas:
los resultados obtenidos mostraron una tendencia creciente en los niveles de AIA en plantas
inoculadas en todos los tiempos, no obstante los valores promedios alcanzaron sus valores
máximos luego de las 72 hpi que coincide con la finalización del pico de AS cuando los
valores de éste disminuyen.
150
Capítulo 7
Estos resultados sugieren que habría interacción entre estas hormonas pero
como es ampliamente conocido que cuando ocurre la colonización de diferentes especies de
plantas con bacterias PGPB, se desencadena la activación de las respuestas de defensa del
tipo ISR dependientes de AJ/ET, que conducen a la supresión de las respuestas de defensa
dependientes de AS, permitiendo la efectiva colonización por parte de las bacterias
benéficas para las plantas (Pieterse et al., 2009; 2012). Otro mecanismo regulador negativo
de la señalización de AS es la producción de deposiciones de calosa que induce la
activación de la vía de defensa dependiente del AJ (Nishimura et al., 2003). Esto explicaría
la disminución de AS a las 72 hpi coincidente con el máximo de deposiciones de calosa
observado en el capítulo 5.
Los niveles de AIA en plantas inoculadas con A. brasilense REC3 fueron
significativamente mayores que en las plantas control en todos los tiempos ensayados,
excepto a las 72 hpi. La cepa REC3 fue seleccionada en base a su capacidad productora de
AIA, que induce el crecimiento radicular (mejorando la absorción de nutrientes), y que a su
vez estimularía la síntesis de AIA vegetal, lo que explicaría los incrementos observados.
Sin embargo, como se mencionó anteriormente, cantidades excesivas de AIA pueden
resultar deletéreos para la planta, inhibiendo el crecimiento (Fallik et al., 1994); por ello, las
plantas modulan el contenido endógeno de AIA libre, siendo este control esencial para la
promoción del crecimiento (Spaepen et al., 2007; Pieterse et al., 2012). La compensación
de los niveles de AIA parecería ocurrir a las 72 hpi en nuestros resultados, pero se
requerirían más estudios para analizar si esta regulación ocurre a nivel metabólico o de
regulación génica. Además, las bacterias también podrían regular la concentración de AIA
por conjugación con aa, pero hasta el momento sólo se ha descripto una especie PGPB,
151
Capítulo 7
Pseudomonas savastanoi, capaz de formar conjugados AIA-aa (Glass y Kouge, 1988;
Spaepen y Vanderleyden, 2011).
CONCLUSIONES
 Fue posible realizar la cuantificación simultánea de ácido salicílico y ácido indol-3acético, dos importantes hormonas vegetales, en plantas de frutilla por cromatografía
liquida de alta resolución en fase reversa.
 El contenido de ácido salicílico en plantas inoculadas con Azospirillum brasilense REC3
fue mayor que en plantas controles en las 12, 24 y 48 hpi con un máximo 164,7 ng de
AS·mg-1 peso seco de fluido peciolar en las 24 horas post-inoculación.
 Los niveles de ácido indol-3-acético mostraron una tendencia creciente con valores
mayores en plantas inoculadas con Azospirillum brasilense REC3, respecto a plantas
controles no-inoculadas. El máximo valor determinado fue de 404,5 ng de AIA·mg-1
peso seco de fluido peciolar al final del experimento, 120 hpi.
 Existiría un diálogo cruzado entre ácido salicílico y ácido indol-3-acético en plantas de
frutilla var. ˋCamarosa´ inoculadas con la cepa PGPB Azospirillum brasilense REC3.
152
Capítulo 8
Capítulo 8
153
Capítulo 8
Análisis cuantitativo de la expresión de genes involucrados en la
interacción Azospirillum-frutilla
INTRODUCCIÓN
Las plantas han desarrollado una gran variedad de estrategias defensivas
para poder sobrevivir a los continuos ataques de los microorganismos fitopatógenos. La
rapidez y eficiencia con la que se desencadenen los mecanismos de defensa
determinarán si la interacción de la planta con el patógeno es compatible (planta
susceptible) o incompatible (planta resistente) (Jones y Dangl, 2006).
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) pueden estimular
el crecimiento ya sea directamente por fijación de nitrógeno, producción de
fitohormonas, solubilización de minerales, etc, o indirectamente protegiéndolas del
ataque de diferentes patógenos mediante la síntesis de compuestos con actividad
antimicrobiana como sideróforos, enzimas o antibióticos, o bien, induciendo
mecanismos de resistencia sistémicos (Lugtenberg y Kamilova, 2009).
1. Genes involucrados en las respuestas de defensa de las plantas de frutilla
La resistencia sistémica inducida (ISR) por las bacterias PGPB se
caracteriza por conferir a las plantas una capacidad incrementada para resistir posibles
ataques de patógenos, proceso conocido como „priming‟ (Conrath et al. 2006; Ahn et
al., 2007). La ISR se caracterizó como una vía dependiente de la señalización por ácido
jasmónico (AJ) y etileno (ET), por lo que la inducción de esta vía de defensa está
relacionada con un elevado nivel de expresión de los genes luego de la infección con el
patógeno (Pieterse et al., 2012).
Por otro lado, ante el ataque por un patógeno, las plantas pueden responder
mediante la activación de la resistencia sistémica inducida (SAR), que es una vía de
154
Capítulo 8
defensa mediada por el ácido salicílico (AS). Entre las modificaciones bioquímicas y
moleculares que se inducen en la planta después del ataque del patógeno se encuentran
la producción de EROs, el reforzamiento de las paredes celulares a través de la
acumulación de lignina y calosa (Ramamoorthy et al., 2000; Ahn et al., 2007) y el
aumento en la síntesis de proteínas de defensa relacionadas a la patogénesis (PRs),
quitinansas y glucanasas (Timmusk and Wagner, 1999; Ramamoorthy et al., 2000). En
frutilla algunos genes codificantes de este tipo de proteínas se identifican como: FaPR1,
FaChi2.1, FaChi2.2, FaBG2-3, FaOGBG5 (Yong et al., 2009; Martínez Zamora et al.,
2012).
Si bien la vía de defensa mediada por el AS, o SAR, está asociada a la
interacción de las plantas con microorganismos patógenos, muchos autores han
demostrado que en algunas interacciones planta-PGPB existiría un aumento en los
niveles endógenos de AS y una acumulación de la proteína de defensa PR1 (Maurhofer
et al., 1994; Chen et al., 1999; De Meyer y Hofte 1999), mecanismos indicadores de la
respuesta SAR.
2. Genes involucrados en la síntesis, percepción y transducción de señal del etileno
El etileno (ET) es una fitohormona que participa en diversos procesos del
desarrollo vegetal tales como la maduración de frutos, la epinastía foliar, la
germinación, favorece la senescencia de las hojas (balance hormonal con citoquininas)
y la abscisión de hojas y frutos (balance hormonal con auxinas) (Taiz y Zeiger, 2002).
También juega un papel importante en la señalización de las interacciones plantasbacterias: en la formación de nódulos en la simbiosis rizobios/leguminosas (Penmetsa y
Cook, 1997) y en la defensa de patógenos (Ohme-Takagi et al., 2000). La diversidad de
funciones del ET y su especificidad de acción implica una gran complejidad en su vía
de señalización (Chen et al., 2005).
155
Capítulo 8
El ET se forma a partir del aminoácido metionina a través de S-adenosilmetionina (SAM), que se convierte en ácido 1-amino-ciclopropano-1-carboxílico
(ACC) por la enzima ACC sintasa. El ACC es posteriormente hidrolizado por la ACC
oxidasa (ACO) (Wang et al., 2002). Esta hormona es percibida por una familia de
receptores de membrana integral similar a las histidinas quinasas bacterianas de dos
componentes. En Arabidopsis thaliana hay al menos cinco receptores de etileno: ETR1
y ETR2, receptor de etileno 1 y 2; ERS1 y ERS2, sensor de respuesta de etileno 1 y 2;
y EIN4, etileno insensible 4 (Guo y Ecker, 2004). Trainotti et al. (2005) han reportado
homólogos de estos receptores en plantas de frutilla (F. ananassa cv. Chandler):
FaERS1, FaETR1 y FaETR2 así como también dos enzimas biosintéticas de ET:
FaACO1 y FaACO2.
La señalización dependiente de etileno está regulada por la proteína CTR1
(respuesta triple constitutiva 1). En condiciones normales (atmosfera de aire), los
receptores de etileno mantienen a CTR1 en un estado activo que sirve para reprimir las
respuestas de ET, como se muestra en la Figura 53. En presencia de etileno (C2H4), la
represión se libera y la unión de ET inactiva los receptores, de modo tal que inactiva
CTR1. Y como resultado, EIN2 se activa y se inicia una cascada transcripcional que
implica a los factores de transcripción EIN3/EIL y ERF. Ambas familias de factores de
transcripción están implicadas en la regulación de las respuestas de etileno. El nivel de
proteína de EIN3 es más bajo en ausencia de ET (que en la presencia de ET), debido a
la degradación por la vía de la ubiquitina-proteosoma. La Figura 53 también incorpora
componentes sobre los que se han reportado datos contradictorios, como un módulo de
funcionamiento de MAPK cuesta abajo de CTR1 y una vía de señalización de dos
componentes (AHP y ARR) que funcionarían independientemente de la vía mediada
por CTR1 (Chen et al. 2005).
156
Capítulo 8
AIRE
C2H4
Receptores de etileno
Transportadores de membrana
EIN3/EIL
factores de transcripción
ERF
factores de transcripción
Respuestas de etileno
Figura 53. Modelo de la transducción de señal del etileno que incorpora características
bioquímicas de los componentes de la ruta de ET. Los dominios de proteína solubles se
muestran como círculos y las estructuras transmembrana se muestran como líneas.
Adaptado de Chen et al., 2005.
3. Genes involucrados en la depuración de especies reactivas del oxígeno
La enzima ascorbato peroxidasa (APX) existe al menos en tres isoformas en
las plantas superiores: citosólicas, del estroma y unidas a la membrana tilacoide. La
APX citosólica (APXc) de frutilla ha sido hallada y caracterizada por Kim y Chung
(1998). Ésta es una enzima depuradora de peróxido de hidrógeno con una alta
especificidad por el ascorbato, agente reductor que cataliza la siguiente reacción:
2 ascorbato + H2O 2  2 monodehidroascorbato + 2 H2O
En distintas especies de plantas sometidas a varios tipos de estrés como la
sequía (Mittler y Zilinskas, 1994), el ozono (Kubo et al., 1995) y la infección
microbiana (Hammond-Kosack y Jones, 1996) se ha observado el aumento de los
157
Capítulo 8
niveles de ARNm de la APX y, en menor grado, de su actividad. La APX citosólica de
frutilla es codificada por el gen FaAPXc y fue descripta por Kim y Chung (1998).
4. Objetivo del capítulo
El presente capítulo tuvo como fin analizar cuantitativamente por PCR en
tiempo real (RT-qPCR: real time -quantitative polymerase chain reaction) la expresión
de los siguientes genes involucrados en la interacción Azospirillum-frutilla: FaGAPDH1
(gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), FaActin (Actina-1), FaPR1 (proteína PR1),
FaChi2.1 (quitinasa CHI2.1), FaChi2.2 (quitinasa CHI2.2), FaOGBG5 (endo-β-1,3glucanasa), FaPAL3 (fenilalanina amonio-liasa 3), FaAPXc (ascorbato peroxidasa
citosólica), FaEtr1(receptor de etileno ETR1), FaEin1(factor de transcripción EIN1),
FaErs1 (sensor de respuesta de etileno ERS1), FaACO1 (ACC oxidasa1) y FaACO2
(ACC oxidasa2). Estos fueron evaluados luego de 24 h y 48 h post-inoculación.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal y condiciones de cultivo
Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria ananassa, Duch) var. `Camarosa´
micropropagadas in vitro, que se obtuvieron del Banco de Germoplasma Activo de
Frutilla de la Universidad Nacional de Tucumán. Las plantas se cultivaron en macetas
desinfectadas con sustrato estéril (humus: perlome; 2:1) durante tres meses, al cabo de
éste tiempo se lavaron sus raíces con agua destilada estéril y se trasplantaron a bandejas
de plástico con solución nutritiva de Hoagland estéril modificada según Epstein (1972)
y aireación constante (pO2= 20 KPa). Las mismas se mantuvieron en cámara de
crecimiento durante 10 días a 28 °C, humedad relativa 70% y 16 h de fotoperiodo (250
µmol fotones m2 s−1).
158
Capítulo 8
2. Inoculación y diseño experimental
El inóculo se preparó sembrando una colonia aislada de Azospirillum
brasilense REC3 en medio NFb líquido (composición en capítulo 3) y se incubó durante
48 h a 28 °C y 600 rpm. Concluido el tiempo de incubación, se ajustó la concentración
de la suspensión bacteriana en aproximadamente 106 UFC·ml-1 (DO560 = 0,2).
Se inocularon 6 plantas de frutilla (3 plantas por cada tiempo de muestreo)
en cultivo hidropónico sumergiendo las raíces en la suspensión de A. brasilense REC3
(106 CFU·ml-1) durante 20 min y luego se colocaron nuevamente en las bandejas de
plástico con solución hidropónica estéril y aireación constante. Por otro lado, se
sumergieron las raíces de 12 plantas control durante 20 min en agua destilada estéril.
El análisis de la expresión génica se realizó en hojas de plantas control e
inoculadas. Las muestras se tomaron en las 24 h y 48 h post-inoculación y fueron
inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -70 °C hasta su
evaluación.
2. Extracción del ARN total y retrotranscripción del ARNm
El ARN total se obtuvo a partir de 100 mg de hojas (peso fresco) usando el
kit RNAqueous-4PCR (Ambion, EEUU). Las muestras de ARN crudo se trataron con
DNasa I (Ambion, EE.UU.) para eliminar la contaminación de ADN genómico antes de
la reacción de transcripción reversa. La cantidad y calidad del ARN total obtenido se
determinó por espectrofotometría a 230 nm, 260 nm y 280 nm de longitud de onda
(Sambrook et al., 1989).
Las reacciones de retrotranscripción del ARN total (5 µg) se realizaron
usando los cebadores Oligo(dT)18 y la retrotramscriptasa M-MuLV (Thermo, EEUU),
para obtener el ADNc utilizado como molde en las reacciones de PCR.
159
Capítulo 8
4. Diseño de cebadores para RT-qPCR
La Tabla 4 muestra los cebadores diseñados a partir de secuencias de
Fragaria ananassa disponibles en GenBank (NCBI: National Center for Biotechnology
Information) mediante el software Primer Express 3.0 (Applied Biosystems, EEUU).
Tabla 4. Secuencias de los cebadores utilizados para el análisis de la expresión génica.
Nombre del
Primer
FaGAPDH1
FaActin
FaPR1
FaChi2.1
FaChi2.2
FaOGBG5
FaPAL3
FaAPXc
FaETR1
FaEIN1
FaERS1
FaACO1
FaACO2
Secuencia del cebador directo
Secuencia del cebador reverso
GCCGAGGAGCTGCTCAGA
GAACTTTTCCAACAGCCTTTGC
Th*
(° C)
59
CCCAGAAGAGCACCCAGTTC
CACGATTAGCCTTGGGATTCA
59
TGGCCCTTATGGTGAAAACC
CACAGCAGATGTGCCTGATAAGT
58
CGGCACCACCGGAAGTC
TGAGCAAGAAATGCTGCAATCT
59
CCTCAGGGAAACAAACCATCA
CGCAGATGGATTCCAACGT
58
CCTCGGTGTCCCAAACTCA
CCACTTTTGCGCATTGGAA
59
TCGCCTACATTGACGATCCTT
TTGCCTTAGCCTTTGCATCA
58
CGCTCACGGCGCTAACA
GCTCCTTGATCGGCTCCAA
59
CAGTTTATGCGATTGGTGATGAA
ACAGCATTCCCAACAACATTTAGA
59
GGTTTCAAACTCGACCATCCA
TGCTCTGATGATCCTCCAGGTT
58
AACTGTTGCCATCGTGATGACT
AGTGCTGTTGCACATGACACAA
58
AGCACCTTCTACCTCAAACACCTT
CGTCGAGATCTGGGACTTCTG
58
GGGACTTGGGAAATGTTGGA
58
GGACTGGGAAAGCACCTTCTT
Th: temperatura de hibridación
*
5. PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR)
La PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) es una variante de la PCR
convencional utilizada para amplificar y, simultáneamente, cuantificar de forma
absoluta y/o relativa el producto de amplificación del ADN(c) con una mayor
sensibilidad y precisión.
La amplificación del ADNc se llevó a cabo en un termociclador 7500 RealTime PCR System (Applied Biosystems, EEUU), utilizando la master-mix iQ SYBR
Green Supermix (BioRad, EEUU) que contiene el fluorocromo SYBR Green (λexcitación=
160
Capítulo 8
488 nm; λemisión= 522 nm). Cada reacción se realizó por triplicado y se incluyeron
controles negativos (sin ADNc) en cada ocasión.
Se determinó la eficiencia de amplificación de cada gen mediante la
realización de curvas estándar con cada par de cebadores y concentraciones crecientes
de ADNc (12,5; 25; 50 y 100 ng·µl-1). Siendo la Eficiencia (E) ideal igual a 2, que
corresponde al 100%, se aplicaron las siguientes fórmulas, donde m corresponde a la
pendiente de la recta:
E = 10 -1/m
% E = (E - 1)*100
Mediante el software BestKeeper (versión 1; Pfaffl et al., 2004) se
determinó cuál de los genes endógenos (de referencia), FaGAPDH1 (gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa) o FaActin (Actina-1), era el más apropiado para el análisis de la
cuantificación relativa.
La expresión génica relativa (RQ: relative quantity) se calculó utilizando el
método 2-ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001), de acuerdo a las siguientes fórmulas:
∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
∆𝐶𝑡𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
= 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡, 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐶𝑡𝑒𝑛𝑑ó𝑔𝑒𝑛𝑜, 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
= 𝐶𝑡𝑡𝑎𝑟𝑔𝑒𝑡, 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜 − 𝐶𝑡𝑒𝑛𝑑ó𝑔𝑒𝑛𝑜, 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
∆∆𝐶𝑡
2
∆∆
= ∆𝐶𝑡𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − ∆𝐶𝑡𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑜
= 𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑜 𝑅𝑄 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑒 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑡𝑦
6. Análisis estadístico
Los datos se procesaron mediante análisis de la varianza (ANOVA) y la
significancia estadística de las medias aritméticas se evaluaron mediante la prueba de
diferencias múltiple de Dunnett utilizando el programa Infostat (versión 2008 para
Windows). Las diferencias entre tratamientos se consideraron significativas si p<0,05.
Las pruebas de diferencias se realizaron por separado para cada gen. Los datos
161
Capítulo 8
presentados en las Figuras 54-57 corresponden a las medias ± desvío estándar de tres
repeticiones técnicas y tres biológicas.
RESULTADOS
Los patrones de expresión de los genes de frutilla: FaGAPDH1
(gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), FaActin (Actina-1), FaPR1 (proteína PR1),
FaChi2.1 (quitinasa CHI2.1), FaChi2.2 (quitinasa CHI2.2), FaOGBG5 (endo-β-1,3glucanasa), FaPAL3 (fenilalanina amonio-liasa 3), FaAPXc (ascorbato peroxidasa
citosólica), FaEtr1(receptor de etileno ETR1), FaEin1(factor de transcripción EIN1),
FaErs1 (sensor de respuesta de etileno ERS1), FaACO1 (ACC oxidasa1) y FaACO2
(ACC oxidasa2), fueron investigados en repuestas a la asociación con Azospirillum
brasilense REC3. Todos los pares de cebadores mostraron valores de eficiencia entre
95% y 105% lo que se considera aceptable para el análisis por RT-qPCR, con excepción
de FaACO1, del cual no se consiguió la amplificación efectiva, requiriéndose el diseño
y síntesis de nuevos cebadores para lograr su amplificación. Por otro lado, se determinó
que el gen codificante de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, FaGAPDH1, fue
el más adecuado para ser utilizado como gen endógeno en los análisis de cuantificación
relativa.
Los resultados de la PCR cuantitativa mostraron que la inoculación de
plantas de frutilla con la cepa REC3 de Azospirillum brasilense produce cambios en la
expresión de los genes relacionados con la inmunidad vegetal. En el caso de los genes
FaPR1, FaChi2.1 y FaChi2.2, codificantes de la proteína relacionada a la patogénesis
PR1 y las quitinasas CHI2.1 y CHI2.2, respectivamente, se observó una gran inducción
en las 24 hpi; no obstante, los mismos fueron luego significativamente reprimidos en las
48 hpi (Fig. 54). Por otro lado, el gen FaOGBG5 que codifica una endo-β-1,3-glucanasa
162
Capítulo 8
y está también relacionado a la defensa, fue fuertemente inducido en las 24 hpi y 48 hpi
(Fig. 54).
Figura 54. Expresión relativa (RQ) de los genes FaPR1, FaChi2.1, FaChi2.2 y FaOGBG5 en
hojas de plantas de frutilla control (plantas no inoculadas) y en plantas inoculados con A.
brasilense REC3 a las 24 y 48 h post-inoculación. Nivel de significancia estadística: p
<0,05.
El gen FaPAL3, codificante de la fenilalanina amonio-liasa 3, una enzima
involucrada en la vía síntesis de ácido salicílico, y por lo tanto, en la señalización de
ésta vía, no aumentó su expresión en ningún tiempo analizado (24 hpi y 48 hpi; Fig.
55).
163
Capítulo 8
Figura 55. Expresión relativa (RQ) del gen FaPAL3 en hojas de plantas de frutilla control
(plantas no inoculadas) y en plantas inoculados con A. brasilense REC3 a las 24 y 48 horas
post-inoculación. Nivel de significancia estadística: p <0,05.
El producto de la traducción del gen FaAPXc es una ascorbato peroxidasa
citosólica de F. ananassa que participa en la depuración de peróxido de hidrógeno y que
mostró un incremento de su expresión en las 24 hpi (Fig. 56); similarmente a lo
ocurrido con las proteínas relacionadas a la defensa, fue fuertemente inhibido en las 48
hpi.
Figura 56. Expresión relativa (RQ) del gen FaAPXc en hojas de plantas de frutilla control
(plantas no inoculadas) y en plantas inoculados con A. brasilense REC3 a las 24 y 48 horas
post-inoculación. Nivel de significancia estadística: p <0,05.
164
Capítulo 8
A su vez, se observaron modificaciones en la expresión de los genes
implicados en la vía de defensa dependiente de etileno. Los genes que codifican para los
receptores de etileno FaETR1, FaEIN1 y FaERS1 presentaron una expresión diferencial
(Fig. 57): FaETR1 aumentó su expresión en plantas inoculadas en ambos tiempos,
FaEIN1 aumentó en las 24 hpi y disminuyó en las 48 hpi mientras que FaERS1
presentó un comportamiento inverso. El gen FaACO2, implicado en la síntesis de
etileno a partir de su precursor el ácido 1-aminociclopropano carboxílico (ACC),
aumentó su expresión sólo en las 24 hpi, mientras que en las 48 hpi su expresión fue
igual al control no inoculado con Azospirillum.
Figura 57. Expresión relativa (RQ) de los genes FaETR1, FaERS1, FaEIN1 y FaACO2 en hojas
de plantas de frutilla control (plantas no inoculadas) y en plantas inoculados con A. brasilense
REC3 a las 24 y 48 h post-inoculación. Nivel de significancia estadística: p <0,05.
165
Capítulo 8
DISCUSIÓN
Fue posible estudiar a nivel molecular los patrones de expresión de algunos
genes de la planta de frutilla que estarían involucrados en diferentes procesos durante su
interacción con Azospirillum. Para ello se realizó un análisis cuantitativo por PCR en
tiempo real (qRT-PCR) con el fin de evaluar la expresión génica en tejidos foliares de
plantas de frutilla inoculadas con A. brazilense REC3 y los controles no-inoculados a
las 24 y 48 h post-inoculación.
Considerando el incremento de los niveles endógenos de AS en plantas de
frutilla inoculadas con Azospirillum brasilense REC3 (determinado en el capítulo 6), se
analizó la expresión de genes relacionados a la vía de defensa dependiente de AS. En
primer lugar, se evaluó la expresión del gen FaPR1, codificante de la proteína PR1 que
es la indicadora por excelencia de la respuesta de defensa de tipo SAR (respuesta
sistémica adquirida), y se observó un aumento de la expresión del mismo en las 24 h
posteriores a la inoculación con REC3, que estaría en sintonía con el máximo
incremento en los niveles de AS endógeno observado en las 24 hpi (capítulo 6). Ambos
resultados permiten inferir que la cepa REC3 produce la activación temprana de la vía
de señalización dependiente de AS. Sin embargo, ésta sería una señal transitoria que es
rápidamente apagada en las 48 hpi si se considera la represión del gen FaPR1 y la
disminución del contenido de AS observado en este tiempo.
Por otro lado, la ausencia de la inducción temprana de los transcriptos del
gen FaPAL3, correspondiente a la enzima que cataliza el primer paso de la vía de
síntesis del AS a partir de la fenilalanina (Vlot et al., 2008), confirmaría la hipótesis
esbozada en el capítulo 6; donde se planteó que el rápido aumento del contenido de AS
observado en los fluidos peciolares de plantas inoculadas con REC3, provendría de la
movilización del AS conjugado y no a partir de la síntesis de novo a través de la vía de
la fenilalanina, que sería más lenta.
166
Capítulo 8
Los genes FaChi2.1 y FaChi2.2 están implicados en la síntesis de
quitinasas y en este trabajo se observó un incremento de su expresión en las 24 h
posteriores a la inoculación con la cepa REC3 de A. brasilense. Coincidentemente,
Tortora et al., (2012) observaron aumento de la expresión de estos genes en plantas de
frutilla inoculadas con A. brasilense en los 3, 4 y 5 días post-inoculación; mientras que
Bellone et al. (1995) observaron un incremento en la actividad de las quitinasas en
plantas de frutilla inoculadas con la misma especie bacteriana (Bellone et al., 1995). En
el presente trabajo se determinó que el gen FaOGBG5, que codifica una endo-β-1,3glucanasa y está también relacionado a la defensa, fue fuertemente inducido por la
inoculación con Azospirillum en las 24 hpi y 48 hpi; este dato es consistente con el
aumento de la expresión de un gen codificante de una glucanasa, FaBG2-2, inducida
por la inoculación con A. brasilense en las 72, 96 y 120 hpi (Tortora et al., 2012). La
inducción de quitinasas y glucanasas vegetales ha sido asociada con la resistencia
sistémica inducida por PGPB contra hongos fitopatógenos (Benhamou et al., 1996,
2000; Saravanakumar et al., 2007), ya que la acumulación de enzimas hidrolíticas en el
lugar de penetración de las hifas del hongo resultaría en la degradación de las paredes
celulares fúngicas (Benhamou et al., 2000). Mientras que la fuerte inducción de la
glucanasa FaOGBG5 coincide con lo reportado por Martínez Zamora et al. (2012),
quienes observaron una fuerte inducción de la misma luego del tratamiento de plantas
de frutilla con un hongo virulento (Collectotrichum acutatum), un avirulento
(Collectotrichum fragariae) y con las hormonas AS y ET, por lo que la endo-β-1,3glucanasa estaría implicada en respuestas de defensa contra estreses bióticos y abióticos.
Otro gen que fue activado rápida y transitoriamente luego de la inoculación
con REC3 fue el de la ascorbato peroxidasa citosólica, FaAPXc, encargada de la
depuración de peróxido de hidrógeno. Esta inducción podría explicar la ausencia del
fenómeno de estallido oxidativo en plantas de frutilla inoculadas con REC3 observada
167
Capítulo 8
en este trabajo (capítulo 5). Particularmente, este gen se ve sobreexpresado a las 24 hpi
y posteriormente a las 48 hpi es fuertemente inhibido, lo que permite inferir que si
hubiera una generación de ERO luego de la colonización por Azospirillum, éstas serían
rápidamente depuradas durante las primeras horas post-inoculación y luego ya no sería
necesaria su acción debido a la ausencia de peróxidos. Soportan esta explicación los
datos informados por otros autores (Szechynska-Hebda et al., 2010), quienes afirmaron
que la ascorbato peroxidas citosólica de Arabidopsis, APX2, actúa como un mecanismo
de protección contra la acumulación de ERO de origen cloroplastídico inducida por
exceso de luz.
Debido a que las bacterias PGPB inducen la respuesta de defensa del tipo
ISR dependiente de ET, se evaluó la modificación de la expresión de genes asociados a
ésta vía en plantas de frutilla luego de la inoculación con REC3.
Según el modelo regulatorio aceptado, cuando hay ET en el ambiente, esta
hormona se une al receptor inactivando a CTR1 y se produce la transducción de señal
por acción de EIN2 (etileno insensibles 2) en plantas de Arabidopsis (Guo y Ecker,
2004). EIN2 estimula la actividad de varios factores de transcripción, incluyendo EIN3;
y a su vez, EIN3 induce la transcripción de otros genes implicados en las respuestas de
etileno (Guo y Ecker, 2004). El gen FaEIN1 de F. ananassa es un análogo de EIN2 de
A. thaliana. En el presente trabajo se observó que en las plantas inoculadas con REC3
también habría una transducción de señal similar: FaEIN1 es sobreexpresado en las 24
hpi, estimulando el posterior aumento de la transcripción de FaERS1 en las 48 hpi,
mientras que FaETR1 aumentó su expresión en ambos tiempos. Además, se observó un
aumento de la expresión de FaACO2, implicado en la síntesis de etileno, en las 24 hpi.
De estos resultados se concluye que estos genes involucrados en la respuesta de ET
parecerían estar altamente regulados y funcionarían de manera coordinada para activar
respuestas dependientes de ET en plantas de frutilla inoculadas con Azospirillum. La
168
Capítulo 8
activación de esta vía se deduce por un incremento rápido de la transcripción de una
enzima de síntesis, ACO2, el aumento del receptor de ET en ambos tiempos analizados
y el disparo de la transducción de señal desde FaEIN1a FaERS1 aquí propuesto.
Conforme a esto, en un estudio realizado en plantas de tomate inoculado con
A. brasilense se determinó que la promoción del crecimiento inducida por la cepa PGPB
requeriría la activación de la vía dependiente de ET, y que éste se comporta como
regulador positivo del desarrollo radicular en respuesta a la inoculación (Ribaudo et al.,
2006). Por otro lado, los mismos autores afirmaron que en las plantas inoculadas con A.
brasilense, los niveles de auxina y etileno serían regulados paralelamente. Entonces, la
activación de la vía de ET observada en el presente capítulo y la inducción del aumento
de los niveles de ácido indol-3-acético observado e informado en el capítulo 7 estarían
directamente relacionados.
Finalmente, la inducción temprana de los genes involucrados en la defensa
vegetal en tiempos tan cortos como 24 h post-inoculación confirman la inducción del
estado de alerta o “priming” disparado en plantas de frutilla por la bacteria promotora
del crecimiento vegetal A. brasilense REC3. Es probable que este efecto de “priming”,
juegue un papel importante activando las respuestas de defensas endógenas de las
plantas de frutilla proporcionando una resistencia de larga duración y amplio espectro;
que en última instancia mejoraría el rendimiento de la planta.
169
Capítulo 8
CONCLUSIONES
 La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) permitió el estudio a nivel molecular
de la expresión de algunos genes de frutilla involucrados durante el establecimiento
de la asociación Azospirillum-frutilla.
 La sobreexpresión de genes de frutilla relacionados a la defensa vegetal, como
FaPR1, FaChi2.1, FaChi2.2 y FaOGBG5, luego de la inoculación con A. brasilense
REC3, indicaron que la inoculación con Azospirillum activó la resistencia sistémica
adquirida (SAR) dependiente del ácido salicílico.
 La ausencia de una expresión diferencial del gen FaPAL3 en plantas inoculas con A.
brasilense REC3 y controles no-inoculados, sugiere que el incremento de los niveles
de ácido salicílico no se deben a su síntesis de novo a través de la vía de la
fenilalanina, aunque no se puede descartar la vía de ISC cloroplastídica.
 La activación temprana post-inoculación con REC del gen FaAPXc, sugirió la
activación de un mecanismo de protección contra la acumulación de ERO.
 El aumento de la expresión de los genes FaEIN1, FaERS1, FaETR1 y FaACO2 a
posteriori de la inoculación con A. brasilense REC3, confirmaron que Azospirillum
es capaz de activar la resistencia sistémica inducida (ISR) dependiente de etileno.
 La activación de genes de frutilla en los tiempos cortos posteriores a la inoculación
con Azospirillum brasilense (24 y 48 hpi) demostró que las vías de señalización
estudiadas probablemente son activadas en las etapas iniciales de la colonización
vegetal por Azospirillum.
170
Capítulo 9
Capítulo 9
171
Capítulo 9
CONCLUSIONES GENERALES
La hipótesis planteada en la presente tesis doctoral fue confirmada
cumpliendo satisfactoriamente con todos los objetivos específicos programados. Este
trabajo constituye el primer estudio de las señales bioquímicas, estructurales y
moleculares desencadenadas durante la interacción Azospirillum brasilense –frutilla
(Fragaria ananassa); aportando datos valiosos al conocimiento de ésta interacción que
podría tener una relevante aplicación biotecnológica considerando el gran interés
económico-social del cultivo de frutilla.
Las conclusiones generales surgidas de esta tesis son las siguientes:
 Azospirillum brasilense fue capaz de asociarse benéficamente con las plantas de
frutilla promoviendo su crecimiento y sin causar síntomas visibles de enfermedad. Se
determinó que A. brasilense coloniza rizosférica y endofíticamente las raíces de
distintas variedades de frutilla (`Camarosa´, `Milsei´ y `Selva´). Asimismo, se
determinó la colonización endofítica de los estolones de plantas madre inoculadas e
hijas no-inoculadas.
 Se obtuvo la cepa transgénica A. brasilense REC3::gfp con altos niveles de expresión
del gen gfp y gran estabilidad que permitió realizar el seguimiento de la colonización
radicular de plantas de frutilla durante un largo período de tiempo.
 La microscopía electrónica de barrido acoplada a la espectroscopia de energía
dispersiva de rayos-X permitieron evaluar la nutrición mineral de plantas de frutilla
inoculadas con Azospirillum brasilense y cultivadas en un medio óptimo o limitado
en nutrientes. En las hojas se cuantificaron los siguientes elementos: C, O, N, Na, K,
P, Ca y Cu; mientras que en las raíces se pudo determinar también Si y Cl. La
inoculación con A. brasilense produjo un aumento del contenido de P y la
diminución de Cu en las raíces.
172
Capítulo 9
 Azospirillum brasilense promovió el crecimiento de plantas de frutilla en condiciones
hidropónicas, aumentando la biomasa total, el índice de crecimiento y la
proliferación de pelos radiculares, siendo este efecto más notorio cuando las plantas
crecieron en un medio limitado en nutrientes.
 La inoculación de las raíces de plantas de frutilla con Azospirillum brasilense activó
mecanismos de defensa estructurales sistémicas, como la deposición de calosa y el
engrosamiento de las paredes celulares en las hojas de dichas plantas.
 Entre las señales bioquímicas activadas por Azospirillum brasilense se observó el
aumento de los niveles de compuestos fenólicos solubles totales, en todos los
tiempos evaluados, y la diminución de la peroxidación lipídica de membranas
vegetales durante las primeras 24 hpi, en raíces y hojas de plantas de frutilla. Sin
embargo, en plantas de frutilla inoculadas con A. brasilense no se determinó una
señal de estallido oxidativo local ni sistémica entre las 12 hpi y 120 hpi.
 En plantas de frutilla inoculadas con Azospirillum brasilense se determinó la
existencia de un diálogo cruzado entre dos importantes fitohormonas, el ácido
salicílico (AS) y el ácido indol-3-acético (AIA). La inoculación aumentó el
contenido de AS durante los primeros tiempos (12 hpi a 48 hpi), mientras que los
niveles máximos de AIA se determinaron en tiempos posteriores (entre 96 hpi y 120
hpi) cuando los niveles del primero disminuían.
 El estudio a nivel molecular indicó que ocurriría una regulación de la expresión
génica de las plantas de frutilla como respuesta a la colonización por Azospirillum
brasilense. La inoculación produjo la sobreexpresión de genes relacionados a la
defensa vegetal (FaPR1, FaChi2.1, FaChi2.2 y FaOGBG5) que son marcadores de
la resistencia sistémica adquirida (SAR) dependiente del ácido salicílico; así como
también activó la expresión de genes indicadores de la resistencia sistémica inducida
(ISR) dependiente de etileno (FaEIN1, FaERS1, FaETR1 y FaACO2). De lo que se
concluye que Azospirillum brasilense es capaz de inducir mecanismos de defensa en
plantas de frutilla por ambas vías, SAR e ISR, y las mismas sería activadas en cortos
tiempos posteriores a la inoculación (entre 24 hpi y 48 hpi).
173
Capítulo 9
 La señales estructurales, bioquímicas y moleculares activadas por Azospirillum
brasilense, como las deposiciones de calosa, el engrosamiento de las paredes
celulares, el aumento de compuestos fenólicos solubles totales, la diminución de la
peroxidación lipídica, la inducción de la síntesis de fitohormonas y la activación de
la expresión temprana de genes relacionados a la defensa vegetal, indicaron que esta
bacteria PGPB activa un “estado de alerta” o “priming” en las plantas de frutilla,
siendo éste un proceso importante de la resistencia sistémica inducida.
 En conjunto, los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al
conocimiento de la interacción benéfica que se establece entre plantas de frutillas y la
especie PGPB Azospirillum brasilense.
174
Capítulo 10
Capítulo 10
175
Capítulo 10
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