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Compilación y armado Sergio Pellizza biblioises Apoyatura Académica Bibliotecas digitales para todos Bacteriología Ba c t er io lo gía Gener a lida des > Espo r a s ba c ter ia na s ¿ Qué es una En do spo r a o Espor a Ba c t er ia na ? Las endosporas son formas de resistencia que desarrollan ciertos bacilos y cocos Gram positivos. Entre los bacilos formadores de endosporas se encuentran las especies Bacillus (aeróbicos), Sporolactobacillus (microaerófilos), Clostridium (anaeróbicos), Desulfotomaculum (anaeróbico reductor de sulfato), Sporohalobacter (anaeróbico halófilo) y Anaerobacter (anaeróbico fijador de nitrógeno), mientras que los cocos son de la especie Sporosarcina (aeróbicos). Fo r m a c ió n de una Endo spo r a en un Ba c ilo Gr a m Po sit ivo Etapa 0 La célula se encuentra en la etapa final de crecimiento exponencial y contiene dos cromosomas. Etapa 1 El DNA celular se hace más denso y ocupa el centro de la célula. Comienza un importante recambio intracelular de proteínas. Etapa 2 Se forma un tabique (septo) cerca del polo celular a causa de la invaginación de la membrana citoplasmática. El DNA es segregado en dos compartimentos (la espora en desarrollo y la célula madre). Etapa 3 El citoplasma de la espora en formación queda delimitado por dos membranas debido al crecimiento de la membrana citoplasmática alrededpr del protoplasto. La membrana más interna se transformará en la membrana citoplasmática de la espora en germinación Etapa 4 Comienza a formarse la corteza de la espora por el depósito de un peptidoglicano esporoespecífico entre la membrana externa e interna. La espora aparece como un cuerpo refractario, comienza a acumularse calcio, y a sintetizarse Acido Dipicolínico. Etapa 5 Aparece el exosporio. La membrana exterior se transforma en la capa cortical por la incorporación de proteínas ricas en cisteína. Esta etapa le confiere a la espora resistencia frente a los agentes antimicrobianos. Etapa 6 Maduración de la espora. Su citoplasma se vuelve homogéneo y electrodenso. La capa cortical se completa. Etapa 7 La endospora es liberada por la lisis de la célula. Resist e nc ia de la s Endo spo r a s Las esporas bacterianas comienzan a formarse durante la fase estacionaria de cremiento cuando se han agotado uno o más nutrientes del medio, pueden sobrevivir en ambientes adversos durante meses o años, y una vez que las condiciones de crecimiento sean apropiadas pueden germinar y desarrollarse para formar células vegetativas. Las endosporas se caracterizan por un bajo contenído de agua, no tienen un metabolismo detectable, y carecen de compuestos de alta energía como ATP y otros nucleósidos trifosfatos. Además, son altamente resistentes a la desecación, congelación, radiación y a la accion de ciertas sustancias químicas. Normalmente, el DNA de una célula procarionte sufre lesiones espontáneas debido a la depurinización, desaminación, alquilación y oxidacíón de los nucleótidos o al efecto de la radiación UV. Sin embargo, en las células vegetativas estos daños son rápidamente reparados por efectivos sistemas enzimáticos. En cambio, las esporas bacterianas no presentan actividad enzimática pero han desarrollado distintas estrategias que evitan la acumulación de daños potencialmente letales en su DNA durante el estado de latencia. Estas son: 1. El bajo contenido de agua retarda o altera las reacciones químicas que afectan al DNA. Este menor contenido de agua disminuye la tasa de depurinización y la fotoquímica del DNA frente al UV respecto a las de una célula vegetativa. La radiación UV no genera dímeros de timina en el DNA de una espora sino un producto denominado SP (spore photoproduct) que es un compuesto similar a una timinil-timina. 2. El DNA de la espora se encuentra unido a unas proteínas denominadas alfa/beta-SASP (small acid-soluble proteins) que disminuyen el daño térmico del DNA evitando la depurinización y cambian la reactividad fotoquímica del DNA frente al UV formando los SP. Estas proteínas se hallan altamente coservadas en los géneros Bacillus y Clostridium, y son sintetizadas durante la esporulación y degradadas durante la germinación. 3. El DNA alterado durante la latencia es reparado en los primeros momentos de la germinación. Las esporas presentan una elevada concentración de ácido dipicolínico que permite complejar grandes cantidades de calcio iónico (Ca2+). El ácido dipicolínico es una sustancia característica de la espora pero no se encuentra en la célula vegetativa. Ger m ina c ió n de la s Endo spo r a s La germinacion de una espora que lleva a la formación de una célula vegetativa consiste de tres fases secuenciales: 1. Activación: Es una proceso reversible que condiciona a la espora para germinar en un ambiente adecuado. Involucra la desnaturalización reversible de algunas proteínas. 2. Germinación: Es una proceso irreversible en el que participan enzimas que contiene la espora. En este etapa hay actividad metabólica, y se pierden las características de la espora como refractariedad y resistencia a agentes físicos y químicos. Crecimiento: Hay una alta actividad biosintética con síntesis de proteínas, RNA mensajero y componentes estructurales como en una célula vegetativa. Se desarrolla la pared celular. Se forma la célula vegetativa. Gener a lida des > Evo luc ió n Árbol Filogenético Universal Gener a lida des > M ic r o or ga nism o s Gr a m po sitivo s Las eubacterias Gram positivas son células con una gruesa pared celular de peptidoglicano. Estás células poseen una membrana citoplasmática con fosfolípidos y proteínas. Por fuera de la membrana citoplamática se encuentra la pared celular que está compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan. Estos puentes peptídicos son característicos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto más completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la célula, y evita que la célula estalle en medios hipotónicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula. La pared celular Gram positiva también contien ácidos teicoicos y ácidos lipoteicoicos. Los ácidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodiésteres, y están unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodiéster en el oxihidrilo del C6 del Nacetilmurámico. Los ácidos lipoteicoicos son polímeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmática y no están unidos al peptidoglicano. La función de estos compuestos sería estructural, pero existen evidencias que indican que también participarían en la regulación de las enzimas hidrolíticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que serían sitios de fijación de fagos. Esquema de las Envolturas de una Eubacteria Gram Positiva Gener a lida des > M ic r o or ga nism o s Gr a m nega t ivo s Las eubacterias Gram negativas son células con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa. Las células se encuentran envueltas por una membrana citoplasmática formada por una bicapa fosfolipídica y proteínas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoproteínas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipofílicas. Entre la membrana citoplasmática y la membrana externa queda delimitado el espacio periplásmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotónica respecto al citoplasma, isotonicidad que es mantenida mediante los oligosacáridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalíticos de suma importancia para la viabilidad celular. La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimétrica en donde la cara externa esta compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolípidos. Además, esta membrana es rica en proteínas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianos y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS está formado por tres regiones: el polisacárido O (Antígeno O), el polisacárido del centro (KDO) y el lípido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la célula una efectiva protección contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la célula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune específica por alteración de la superficie antigénica y adherirse a ciertas células del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no específicos que pueden ser atravesados por pequeñas moléculas hidrofílicas. En la membrana externa se encuentran otras proteínas que funcionan como canales de difusión específicos y facilitan el paso de di, tri y oligosacáridos. Esquema de las envolturas de una eubacteria Gram Negativa Gener a lida des > Ba c ilo s A c ido - A lc o ho l Resist ent es Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Acido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de Nacetilglucosamina. Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribución mundial pero con consecuencias devastadoras en los países en desarrollo. En el año 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS-WHO World Health Organization) declaró a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con el M. tuberculosis, y que en la próxima década serán infectadas más de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarán la enfermedad y 30 millones morirán por ella. Esquema de las envolturas de una eubacteria Acido-Alcohol Resistente Adaptado del minireview "Immunopathology of Tuberculosis: Roles of Macrophages and Monocytes" de M. J. Fenton y M. W. Vermeulen (Infection and Immunity. Marzo de 1996) Gener a lida des > Pept ido glic a no Esquema de la estructura del peptidoglicano del Staphylococcus aureus Esquema de la estructura del peptidoglicano de la Escherichia coli Entrecruzamiento del peptidoglicano A nt isépt ic o s A lc o ho les Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan proteínas celulares. Desorganizan la estructura fosfolipídica. No destruyen esporas y tienen una acción germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los más utilizados son el etanol e isopropílico. Iodo Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de proteínas y ácidos nucleicos. Inactiva proteínas y enzimas por oxidación de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar también grupos amino, indoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. Es efectivo contra esporas en una concentración de 1600 ppm de iodo libre. A g ent es ió nic o s y a nfó t er o s Son sustancias que lesionan la membrana celular debido a que desordenan la disposición de las proteínas y de los fosfolípidos, por lo que se liberan metabolitos desde la célula, se interfiere con el metabolismo energético y el transporte activo. No son esporicidas ni tubercolicidas aún en altas concentraciones. Su principales ventajas se hallan en que son inodoros, no tiñen, no son corrosivos de metales, estables, no tóxicos y baratos. Catiónicos: Sales de amonio cuaternarias. Tienen mayor actividad a pH alcalino y los Gram + son más susceptibles. Aniónicos: Jabones y ácidos grasos. Tienen mayor actividad a pH ácido y son eficaces contra Gram +. Anfóteros: Actúan como catiónicos o aniónicos según el pH. Or g a no M er c ur ia les Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las proteínas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgánicos se encuentran el metafen y el mertiolate. Per ó xido de H idr ó geno Es un antiséptico débil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. Actualmente, el peróxido de hidrógeno gaseoso se está utilizando como desinfectante de superficies o descontaminante de gabinetes biológicos debido a que no posee las propiedades tóxicas y cancerigenas del óxido de etileno y formaldehído. Co lo r a nt es Interfieren en la síntesis de acidos nucleicos y proteínas (acridina) o interfieren en la síntesis de la pared celular (derivados del trifenilmetano). La acridina se inserta entre dos bases sucesivas del DNA separándolas físicamente. Esto provoca errores en la duplicación del DNA. Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversión del ácido UDPacetilmurámico en UDP-acetilmuramil-péptido. R = HSO4- Verde Brillante R = Cl- Verde de Malaquita Violeta de Genciana Desinf ec t a nt es y/o Est er iliz a nt es Clo r o El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actúan sobre proteínas y ácidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina. El producto clorado más utilizado en desinfección es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y además es efectivo en un amplio rango de temperaturas. La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al ácido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua. La actividad germicida del ion hipocloroso es muy reducida debido a que por su carga no puede penetrar fácilmente en la célula a través de la membrana citoplamática. En cambio, el ácido hipocloroso es neutro y penetra fácilmente en la célula, mientras que el Cl2 ingresa como gas. El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50100 g/l de Cloro activo), a pH alcalino y en envases oscuros que favorecen su estabilidad, pero es inactivo como desinfectante. A causa de ésto, es que deben utilizarse soluciones diluidas en agua corriente (que tiene un pH ligeramente ácido), con el objeto de obtener ácido hipocloroso. Generalmente, se utilizan soluciones con una concentración del 0.1-0.5% de Cloro activo. Su actividad está influida por la presencia de materia orgánica, pues puede haber en el medio sustancias capaces de reaccionar con los compuestos clorados que disminuyan la concentración efectiva de éstos. A ld ehído s Son agentes alquilantes que actúan sobre proteínas, lo que provoca modificación irreversible de enzimas e inhibición de la actividad enzimática (Adición nucleofílica de grupos -NH2 y -SH). Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. El glutaraldehído es el único esterilizante efectivo en frío. El formaldehído como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehído gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehído (OH (CH2O)n-H), lo que produce las despolimerización de este compuesto y la liberación de formaldehído. El formaldehído tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados. Co m p uest o s Fe nó lic o s Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmática porque desordenan la disposición de las proteínas y fosfolípidos. Esto causa filtración de compuestos celulares, inactivación de enzimas y lisis. El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies. Los derivados del fenol más utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenílico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas. Ox id o de Et ilen o Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerigeno. Ba c t er io lo gía Est er iliz a c ió n > Filt r a c ió n Se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Hay que tener en cuenta que los filtros que se utilizan generalmente en los laboratorios no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. Existen tres tipos básicos de filtros: Filtros profundos o Filtros de profundidad: consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz. Membranas filtrantes: tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostáticos. Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo): son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas. Est er iliz a c ió n > Gener a lida de s Esterilización: eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia, y que se encuentran acondicionados de tal forma que no pueden contaminarse nuevamente. Sanitizante: agente que disminuye la carga microbiana total a un nivel el cual es seguro para la salud de la población. Sólo es aplicable sobre objetos inanimados. Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como habitaciones. Antiséptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patógenos sobre piel y/o mucosas (sólo pueden aplicarse externamente sobre seres vivos). A g ent es a nt iba c t er ia no s est er iliz a nt es y/o d esinf ec t a nt es 1. Provocan pérdida de la viabilidad en los microorganismos Físicos (calor, radiaciones) Químicos (óxido de etileno, formaldehído, agentes oxidantes, soluciones antisépticas.) 2. Provocan una separación de los microorganismos de la sustancia líquida Filtración (se eliminan los microorganismos presentes en un fluido). Ba c t er i o lo gía Est er iliz a c ió n > A gent es fís ic o s Ca lo r Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. La efectividad del calor como método de esterilización depende de: Temperatura Tiempo de exposición Ca lo r H úm edo El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se debe principalmente a dos razones: El agua es una especie quimica muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, proteínas, etc) son producidas por reacciones que elimi0nan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación. El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100°C. Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas. Presión [atm] Temperatura [°C] Descarga completa del aire Descarga de 2/3 del aire Descarga de 1/2 del aire Sin descarga del aire 1/3 109 100 90 72 2/3 115 109 100 90 1 121 115 109 100 4/3 126 121 115 109 5/3 130 126 121 115 2 133 130 126 121 Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave Ventajas Rápido calentamiento y penetración Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo No deja residuos tóxicos Hay un bajo deterioro del material expuesto Económico Desventajas No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos Ca lo r Se c o El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper por el calor seco. La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que el autoclave. La temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren al menos 2 horas de exposición. Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón no pueden ser esterilizados a más de 160°C. Ventajas No es corrosivo para metales e instrumentos. Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles. Desventajas Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor. Existen otras formas de eliminar microorganismos por calor seco. La incineración se utiliza para destruir material descartable contaminado. La acción directa de la llama elimina a los microorganismos cuando se lleva al rojo el material de metal como hansas, lancetas, agujas de disección. Ra d ia c io nes Su acción depende de: Tipo de radiación Tiempo de exposición Dosis I o niz a nt es Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas porque producen alteraciones de los componentes. Ult r a vio let a s Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies. Ba c t er io lo gía Est er iliz a c ió n > Co nc ept o est a díst ic o Cuando una población bacteriana es sometida a un proceso de esterilización que le provoca la pérdida de la viabilidad, se observa una disminución progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente esterilizante. La muerte microbiana sigue un comportamiento de tipo exponencial, por lo que se hace asintótico y nunca se llega a un número de microorganismos igual a cero. N = N0 . e - Kt Donde N es el número de microorganismos viables, N0 es el número de microorganismos viables iniciales, k es la tasa de muerte (min-1) y t es el tiempo de exposición al agente. El coeficiente k es función de las condiciones de esterilización (temperatura, tenor de humedad, concentración del agente químico) y de la resistencia del microorganismo al proceso de esterilización. Si esta ecuación se transforma a base 10 resulta: N = N0 . 10 - t / D En donde D (min) se denomina Tiempo de reducción decimal, esto es el tiempo requerido para reducir la población microbiana un 90% o un orden de magnitud. El valor de D se deduce cuando t=D y por lo tanto N=0.1 N0. Comparando las ecuaciones anteriores se llega a que: D = ln 10 / K = 2.303 / K Esto significa que D está inversamente relacionado con k. Entonces, menores valores de D significan una mayor tasa de muerte o una muerte más rápida. Graficando el logarítmo del número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición a un determinado agente esterilizante se obtiene una recta. La pendiente está dada por -1/D y la ordenada al origen es log N0. Por lo explicado anteriormente, la pendiente de la recta está determinada por las condiciones de esterilización y de la resistencia del microorganismo. Cuando el log del número de sobrevivientes es menor a cero se habla de probabilidad de sobrevivencia. Por lo tanto cuando el valor de la probabilidad sea -1 significa que hay 0.1 microorganismos viables por unidad, o correctamente expresado una unidad contaminada por cada 10 unidades idénticas procesadas. Un producto se considera estéril cuando la probabilidad de encontrar unidades contaminadas es menor o igual a 10-6, esto es una unidad contaminada cada millón de unidades idénticas procesadas. A mayor número de microorganismos y/o resistencia de la población se necesitará mayor tiempo de esterilización, o lo que es lo mismo mayor tiempo para alcanzar la probabilidad de sobrevivencia. Durante el proceso de esterilización por calor debe tenerse en cuenta que el tiempo de esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o estufa) y que generalmente el contenido de un autoclave puede requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura de esterilización. Est er iliz a c ió n > Co nt r o les en est er ilz a c ió n Controles de Esterilización Controles fisico-químicos Monitorean el proceso de esterilización Controles biológicos Controles de Esterilidad Transferencia a medios de cultivo Monitorean el material esterilizado Test de promoción del crecimiento Test de bacteriostásis Filtración por membranas Co nt r o les de Es t er iliz a c ió n Son controles que se realizan sobre el método de esterilización. Monitorean o controlan si el proceso de esterilización funciona correctamente. Controles Biológicos Utiliza indicadores biológicos como controles del proceso de esterilización. Estos indicadores son preparaciones estandarizadas de microorganismos relativamente resistentes al método de esterilización que se emplea. Los indicadores se procesan en forma conjunta con el material a esterilizar y el número de microorganismos presentes en el indicador es mayor que el que se encuentra en el material. Una vez concluido el proceso de esterilización los indicadores son inoculados en medios de cultivo adecuados e incubados durante un determinado período de tiempo. Si el proceso de esterilización fue correctamente empleado y funciona bien no debe observarse desarrollo del indicador incubado. Controles fisicoquímicos Termocuplas: son métodos directos que registran la temperatura a la que se desarrolla la esterilización. Sustancias de punto de fusión conocido: se utilizan en autoclaves generalmente, son sustancias con un punto de fusión similar al de la temperatura de esterilización del proceso. Estas sustancias están mezcladas con un colorante y al fundir indican si se alcanzó la temperatura óptima de esterilización y el tiempo que se mantuvo. Co nt r o les de Es t er ilida d Permite controlar en forma probabilística si el material quedó completamente esterilizado pues se testea un porcentaje representativo de todo el material. Transferencia Directa a Medios de Cultivo Se transfiere una parte de la muestra a medios de cultivos apropiados que permitan el crecimiento de cualquier contaminante. Tioglicolato para anaerobios y aerobios (37°C) Tripticasa-Soja para aerobios (25°C) Las muestras representativas se incuban en estos medios durante un período de 14 días, al cabo del cual no se debe observar ningún tipo de crecimiento. Puede ocurrir que la muestra no se encuentre estéril pero que no se produzca crecimiento durante la incubación por algún motivo inherente al medio o a la muestra, por ejemplo presencia de algún inhibidor, etc. Test de Promoción del Crecimiento Es un testigo del control de esterilidad. Son testigos que se utilizan para los medios de crecimiento del control ya que estos medios tienen capacidad de promover el crecimiento. Para estos testigos se utilizan microorganismos con exigencias nutri cionales. Los medios deben ser inoculados con un bajo número de microorganismos, se incuban durante 7 días, al cabo de los que se debe observar un abundante crecimiento. Test de Bacteriostasis Es un control que se realiza para determinar si la muestra supuestamente estéril no posee propiedades bacteriostáticas. De esta forma se previenen falsos negativos pues no se produce crecimiento habiendo en la muestra microorganismos viables. Para este test se toman los medios de cultivo con microorganismos de ensayo y se siembran en las muestras a testear. Se incuban durante 7 días. Si se produce crecimiento esto indica que el material no contenía inhibidores. Filtración por Membranas Se utiliza para determinar la esterilidad de medios de cultivo, soluciones de antibióticos, etc. Se filtran los medios y se procesa el filtro como en un control de esterilidad para determinar si hay microorganismos presentes. Fisio lo gía ba c ter ia na > Reque r im ient o s quím ic o s Ca r b o no Este elemento puede aportarse a los microorganismos en forma muy diversa dependiendo del tipo de metabolismo que posean. El carbono es utilizado por los microorganismos para sintetizar los compuestos orgánicos requeridos para las estructuras y funciones de la célula. Los microorganismos se pueden dividir en categorías nutricionales en base a dos parámetros: naturaleza de la fuente de energía y naturaleza de la fuente principal de carbono (Estas propiedades metabólicas fueron seleccionadas arbitrariamente y no brinda una descripción completa de las necesidades nutricionales de un organismo). Fototrofos: utilizan luz como fuente de energía. Quimiotrofos: la fuente de energía es química. Autotrofos: utilizan como fuente de carbono al CO2 y a partir del cual sintetizan los esqueletos carbonados de los metabolitos orgánicos. Heterotrofos: utilizan compuestos orgánicos como fuente de C y electrones. Combinándose estos dos parámetros se pueden establecer cuatro categorías principales de organismos: Fotoautotrofos: dependen de la luz como fuente de energía y utilizan CO2 como principal fuente de carbono. Vegetales superiores, bacterias fotosintéticas, algas eucarióticas, etc. Fotoheterotrofos: utilizan luz como fuente de energía y emplean compuestos orgánicos como fuente de carbono. Algunas bacterias fotosintéticas y algas eucarióticas. Quimioautotrofos: utilizan CO2 como fuente de carbono y emplean fuentes de energía química proveniente generalmente de compuestos inorgánicos reducidos (H2, S2-, NH4+, etc). Quimioheterotrofos: utilizan compuestos orgánicos como fuente de carbono y energía. Los compuestos orgánicos también se comportan como fuente de electrones. Este grupo está integrado por animales superiores, hongos, protozoos y la mayoría de las bacterias. N it r ó geno El nitrógeno es utilizado por las bacterias para formar aminoácidos, pirimidinas, purinas, etc, y puede provenir de fuentes diferentes. Asimilación de NH3 y sales de amonio: el nitrógeno es transferido con este estado de oxidación a los aminoácidos por la vía de la glutamato/glutamina. Fijación de Nitrógeno: el N2 es reducido dentro de la célula a NH4+ y metabolizado. Reducción asimiladora de Nitratos: los nitratos son reducidos dentro de la célula por la vía de los nitritos a NH3 y metabolizado. Hidrolizados proteicos: los microorganismos incapaces de asimilar el nitrógeno de sales inorgánicas, lo obtienen a través de compuestos orgánicos nitrogenados como los hidrolizados proteicos. Estos compuestos proteicos son a su vez hidrolizados por enzimas bacterianas, fuera de la célula, a aminoácidos, los que después son metabolizados dentro de la célula. Ox íg eno Basados en los requerimientos de oxígeno molecular las bacterias se pueden dividir en 5 grupos: Aerobios obligados: requieren oxígeno para el crecimiento pues dependen de este elemento para cubrir sus necesidades energéticas. El oxígeno es el aceptor final de electrones en la cadena respiratoria. Anaerobios obligados: crecen en ausencia total de oxígeno porque necesitan un medio muy reductor. Utilizan respiración anaerobia donde los aceptores finales de electrones pueden ser generalmente SO42-, Fumarato2- o CO32-. Anaerobios facultativos: pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Utilizan al oxígeno como aceptor final de electrones en la cadena respiratoria cuando está disponible, y en ausencia de oxígeno la energía la obtienen por fermentación o respiración anaerobia (generalmente el NO3- es un aceptor final de electrones en las enterobacterias). Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de oxígeno, pero la energía la obtienen por fermentación. Microaerofilos: sólo pueden crecer con bajas tensiones de oxígeno porque las altas tensiones son tóxicas para este tipo de microrganismos (1 a 12% de O2 en la fase gaseosa). La energía la obtienen por respiración aeróbica, cuando no hay aceptores electrónicos terminales alternativos, o anaeróbica. A z ufr e El azufre puede ingresar en la célula reducido (grupos sulfhidrilos), como sulfato (debe ser reducido dentro de la célula para metabolizarse) o como aminoácidos azufrados. El azufre es utilizado para la síntesis de aminoácidos azufrados como la cisteína o metionina, que tienen un papel muy importante en la estructura terciaria de las proteínas (formación de puentes S-S) y en el sitio catalítico de enzimas. Fa c t o r es de Cr ec im ient o Son compuestos orgánicos que el microorganismo es incapaz de sintetizar a partir de los nutrientes y son fundamentales para la maquinaria metabólica de la célula. Son vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc. En relación al requerimiento de factores de crecimiento los microorganismos se pueden dividir en: Protótrofos: microorganismos que sintetizan sus propios factores de crecimiento. Auxótrofos: microorganismos que requieren una fuente exógena de factores de crecimiento debido a que son incapaces de sintetizarlos. I o nes I no r gá nic o s Son esenciales para el crecimiento porque estabilizan los compuestos biológicos como enzimas, ribosomas, membranas, etc. Los iones requeridos para el crecimiento bacteriano son aportados en el medio a través de sales que contienen K+, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Na+, PO43-, Fe2+, Fe3+ y trazas de Cu2+, Co2+ y Zn2+. Fisio lo gía ba c ter ia na > Reque r im ient o s físic o s Tem p er a t ur a Todos los microorganismos tienen una temperatura óptima de crecimiento. Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de duplicación (o la velocidad de crecimiento poblacional) de los microorganismos es mayor. Hay que tener en cuenta que no todos los microorganismos crecen en el mismo rango de temperaturas: Clasificación Rango Optima Termófilos 25 - 80 °C 50 - 60 °C Mesófilos 10 - 45 °C 20 - 40 °C Psicrófilo -5 - 30 °C 10-20 °C La temperatura afecta la estabilidad de las proteínas celulares porque induce cambios conformacionales que alteran la actividad biológica de estos compuestos, especialmente la de enzimas. pH La mayoría de los microorganismos crecen en pH cercanos a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que existan microorganismos que puedan soportar pH extremos y se desarrollen. Según el rango de pH del medio en el cual se desarrollan pueden dividirse en: Clasificación pH externo Acidófilos 1.0 - 5.0 6.5 Neutrófilos 5.5 - 8.5 pH interno 7.5 Alcalófilos 9.0 - 10.0 9.5 Los microorganismos regulan su pH interno mediante un sistema de transporte de protones que se encuentra en la membrana citoplasmática, que incluye una bomba de protones ATP dependiente. El rango de pH óptimo para el desarrollo de los microorganismo es estrecho debido a que frente a un pH externo muy desfavorable se requiere un gran consumo de energía para mantener el pH interno. A c t ivida d de Agua El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones químicas y enzimáticas de la célula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos. La actividad de agua (aW) del medio representa la fracción molar de las moléculas de agua totales que están disponibles, y es igual a relación que existe entre la presión de vapor de la solución respecto a la del agua pura (p/po). El valor mínimo de aW en el cual las bacterias pueden crecer varía ampliamente, pero el valor óptimo para muchas especies es mayor a 0.99. Algunas bacterias halófilas (bacterias que se desarrollan en altas concentraciones de sal) crecen mejor con aW = 0.80. Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composición celular y la actividad metabólica de la bacteria, debido a que si no disponen de suficiente cantidad de agua libre (no asociada a solutos, etc) en el medio necesitaran realizar más trabajo para obtenerla y disminuirá el rendimiento del crecimiento. Po t enc ia l de O xido - Reduc c ió n El Potencial de Oxido-Reducción es una medida de la tendencia del medio a donar o recibir electrones. Es crítico para el crecimiento de los microorganismos y generalmente está asociado con la presencia de oxígeno molecular disuelto en el medio el cual es muy oxidante. En medios que contienen oxígeno, en condiciones similares a las atmosféricas, el potencial redox varía entre 0,2 y 0,4 Voltios. Los anaerobios estrictos necesitan una atmósfera sin oxígeno pues deben crecer en medios reductores donde el potencial no sea mayor a -0,2 Voltios. Sin embargo, potenciales redox positivos creados por la presencia de otras sustancias químicas no afectan el crecimiento de los anaerobios más estrictos, aunque muchos anaerobios estrictos son inhibidos por potenciales mayores a -0.100 mV. Fisio lo gía ba c ter ia na > Cic lo de c r ec im ient o Un cultivo bacteriano simple y homogéneo tiene un ciclo de crecimiento como el que se representa a continuación. Este ciclo tiene una morfología y una división de células asincrónica. Se divide en cuatro fases: Fase de Latencia: Es la fase de adaptación al medio, existe aumento de la masa celular pero no hay aumento en el número de células. Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento exponencial del número de microorganismos. Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de energía. Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminución exponencial del número de microorganismos. La fase de latencia puede ser inducida por un rápido cambio en las condiciones del cultivo. En un medio fresco, el largo de la fase de latencia va a depender del tamaño del inóculo, de la edad del inóculo, y de los cambios en la composición y concentración de los nutrientes que experimenten las células. Un pequeño volumen de inóculo transferido a un gran volumen de medio fresco va a producir una salida por difusión de iones, vitaminas y cofactores que son indispensables para la actividad de muchas enzimas intracelulares. Si las células provenientes de un medio rico son inoculadas en un medio mínimo, el tiempo de latencia puede estar afectado por el tamaño del inóculo como un resultado de los nutrientes remanentes del medio original. La edad del inóculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulación de materiales tóxicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la célula durante el crecimiento anterior. En general, inóculos viejos alargan la fase de latencia. Cambios en la composición y concentración de nutrientes entre el cultivo del inóculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulación de la actividad enzimática dentro de las células o la diferenciación morfológica, como la formación de esporas. Si las células son transferidas de un medio simple a un medio rico, se van a necesitar más tiempo y nutrientes para incrementar la concentración de enzimas necesarias para el metabolismo. Fisio lo gía ba c ter ia na > M edio s de c ult ivo Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones adecuadas y con condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral; fuente de carbono, nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios. Medio sintetico: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para el estudio de requerimientos nutricionales y para obtener resultados reproducibles. Medio minimo: son los medios que presentan la minima cantidad de nutrientes capaz de permitir el desarrollo de los microorganismos. Medio complejo: medios que contienen nutrientes de composición química variable o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de sustancias. Se forman a partir de extractos animales, vegetales, etc. Se utilizan cuando se necesita obtener una amplia gama de microorganismos. Medio enriquecido: medio que tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. No pueden ser selectivos. Agar chocolate, agar cerebro-corazón, etc. Medio selectivo: medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos Staphilococcus). Medio diferencial: medio que permite revelar características fisiológicas de los microorganismos. Levine (permite visualizar la fermentación de lactosa por viraje de un indicador ácido-base), Agar sangre (permite visualizar la síntesis de hemolisinas). Enriquecimiento: Es una técnica que permite el desarrollo de un grupo de microorganismos a partir de una muestra que contiene una gran variedad de microorganismos. Se utiliza un medio selectivo líquido para favorecer la competencia entre los organismos y se incuba bajo determinadas condiciones. Aquellos microorganismos para los que el ambiente sea más favorable crecerán más que los otros y finalmente serán predominantes.
