validación y aplicación de una técnica de reacción en cadena

VALIDACIÓN Y APLICACIÓN DE UNA TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE CIRCOVIRUS PORCINO
TIPO 2 (PCV-2) EN MUESTRAS DE SUERO PORCINO
LUISA FERNANDA VILLADIEGO MARMOLEJO
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
MEDICINA VETERINARIA
MEDICINA Y SALUD ANIMAL
BOGOTÁ
2007
VALIDACIÓN Y APLICACIÓN DE UNA TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE CIRCOVIRUS PORCINO
TIPO 2 (PCV-2) EN MUESTRAS DE SUERO PORCINO
LUISA FERNANDA VILLADIEGO MARMOLEJO
Código: 14012505
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
MEDICINA VETERINARIA
MEDICINA Y SALUD ANIMAL
BOGOTÁ
2007
VALIDACIÓN Y APLICACIÓN DE UNA TÉCNICA DE REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA DETECCIÓN DE CIRCOVIRUS PORCINO
TIPO 2 (PCV-2) EN MUESTRAS DE SUERO PORCINO
LUISA FERNANDA VILLADIEGO MARMOLEJO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial
para optar al título de Médico Veterinario
Director
PAULO EDUARDO BRANDÃO
Médico Veterinário, MsC, PhD
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
MEDICINA VETERINARIA
MEDICINA Y SALUD ANIMAL
BOGOTÁ
2007
Nota de aceptación
______________________________
Director
Jurado
Jurado
______________________________
Secretaria Académica
Bogotá, Enero 17 de 2007
A mi mamá, mi abuelo, mi abuela y
papaca, por el apoyo incondicional en todo
los momentos de mi vida.
Por el amor incondicional.
Sin ustedes nada de esto sería posible!
A minha mãe, vovó, vovô e papaca
pelo apoio em todos os
momentos de minha vida.
Pelo amor incondicional.
Sem vocês nada disso teria sido possível!
v
AGRADECIMIENTOS
A DIOS, por ponerme obstáculos para saltar y recordar que estoy viva.
A MI ABUELA BEATRIZ, quien estará viva siempre en mi corazón.
A MI MADRECITA y mi ABUELITO, no encontré palabras que expresen lo que yo
siento. LOS AMO.
AL DOCTOR PAULO E. BRANDÃO, que con su dedicación y sabiduría, dirijió y
apoyo, este trabajo; con su paciencia me incentivaba hacer varias veces las
.mismas cosas y con su humor me ayudó a reír cuando las cosas no salían como
debían. Valeu doc.
A la DOCTORA PILAR CALVO, gracias a ella el sueño de viajar, aprender y
conocer, se hizo realidad.
A la DOCTORA LAURA Y. VILLARREAL, quien me acogió y me dio fuerzas en
cada momento para seguir adelante y se convirtió en un modelo de superación y
lucha. Valeu tia.
A MI PAPACA, con sus consejos y apoyo. Sí mi mamá, mi abuelo y la nana no
quedaran en buenas manos yo nunca habría viajado, gracias por cuidar de lo mas
importante de mi vida.
A TODA MI FAMILIA, quienes estuvieron siempre pendiente de mis necesidades
morales y materiales.
A MAO, ANITA, PAO, DANI, CARMEN y WILLY, por estar a mi lado en los
momentos buenos y malos, en el estudio y en la rumba. Gracias amigos.
A MAO, FELIPE, EL PAPÁ y LA MAMÁ, por ser mi familia adoptiva, que después
de cinco años se volvió eterna.
A CAROLA, tus palabras no solo me cambiaron un día: me ayudaron a ver a mi
alrededor y encontrar colores que no sabia que existían.
vi
A SIBELE, por ajudar-me com o encontro comigo mesma. Pelos bate papos das
coisas visíveis e invisíveis. Pronta pra conhecer Sul América!, amanhã o mundo,.
A ALE, LETTICE, GUACYARA, SANDRA, SHEILA, FABIO, y todas las personas
que me ayudaron hacer de mi estadía en Brasil una experiencia inolvidable.
Al PROFESOR LEONARDO JOSÉ RICHTZENHAIN, por abrir las puertas del
laboratorio donde se realizaron los experimentos.
A TODOS OS PROFESSORES E FUNCIONÁRIOS DO VPS-USP, pela ajuda
durante o desenvolvimento desse trabalho. E por as festas, os churrascos e os
aniversários, que fizeram os dias mais legais.
A MIS PROFESORES Y DIRECTIVAS DE LA UNIVERSIDAD DE LA SALLE,
quienes me inculcaron desde un comienzo la convicción de que uno siempre logra
lo que se propone de verdad.
vii
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCIÓN
1
OBJETIVOS
3
1. CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2
4
1.1 HISTORIA
7
1.2 AGENTE ETIOLÓGICO
7
1.3 EPIDEMIOLOGÍA
8
1.4 SÍNDROME DEL DESMEDRO MULTISISTÉMICO
POSTDESTETE (PMWS)
9
1.4.1 Signos clínicos
1.4.2 Trastornos hematológicos y bioquímicos
1.4.3 Patogenia
1.4.4 Hallazgos en necropsia
1.4.5 Histopatología
10
12
12
13
15
1.5 TREMOR CONGÉNITO PORCINO (PCT).
16
1.6 SÍNDROME DERMATITIS NEFRITIS PORCINO
(PDNS)
17
1.7 ENTERITIS ASOCIADA A PCV-2
19
1.8 NEUMONÍA NECROTIZANTE PROLIFERATIVA
(PNP)
20
1.9 FALLA REPRODUCTIVA
20
1.10 PROFILAXIS Y CONTROL
21
2. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
22
2.1 ESTRUCTURA DEL ADN
22
viii
pág.
2.1.1 Estructura primaria
2.1.2 Estructura secundaria
2.1.3 Estructura terciaria y cuaternaria
23
23
24
2.2 EL PRINCIPIO DE LA PCR
24
2.3 PCR EN TEORIA
24
2.4 COMPONENTES DE LA PCR
26
2.4.1 Buffer de amplificación
2.4.2 Desoxinucleótidos trifosfatos
2.4.3 Cationes bivalentes
2.4.4 Primers
2.4.5 Taq-polimerasa
2.4.6 ADN molde o “template".
26
27
27
27
28
30
2.5 DISEÑO DE LOS PRIMERS PARA PCR
BASICA
31
2.6 TEMPERATURA DE FUSIÓN O ANNEALING
(Tm, “MELTING TEMPERATURE”)
32
2.7 CICLOS DE TEMPERATURA Y SU FUNCIÓN
33
2.7.1 Desnaturalización
2.7.2 Hibridación
2.7.3 Extensión
2.7.4 Número de ciclos
33
34
34
35
2.8 ADYUVANTES DE LA PCR
35
2.9 INHIBIDORES DE PCR
36
3. MATERIALES Y MÉTODOS
37
3.1 LOCALIZACIÓN
37
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
37
3.2.1 Muestras de tejido porcino
3.2.2 Muestras de suero porcino
37
37
3.3 VARIABLES
37
ix
pág.
3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
38
3.5 MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS
38
3.5.1 Extracción de ADN
3.5.2 Reacción en cadena de la polimerasa para
el gen de la proteína de capside (PCR-CAP)
3.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa para
la región entre los orfs 1 y 2 (PCR-U)
38
39
4. RESULTADOS DE LA VALIDACION Y APLICACIÓN
44
4.1 RESULTADOS DE LA REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA PARA EL GEN DE LA PROTEÍNA
DE CAPSIDE (PCR-CAP)
44
4.1.1 Condiciones 1
4.1.2 Condiciones 2
4.1.3 Condiciones 3
4.1.4 Condiciones 4
44
46
47
47
4.2 RESULTADOS DE LA REACCIÓN EN CADENA
DE LA POLIMERASA PARA LA REGIÓN ENTRE LOS
ORFS 1 Y 2 (PCR-U)
48
5. DISCUSIÓN
50
CONCLUSIONES
53
RECOMENDACIONES
54
BIBLIOGRAFÍA
55
x
42
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1 - Número teórico de ciclos requeridos para
generar 10 ng de un producto de PCR con
200 pb.
26
Tabla 2 - DNA polimerasas termolábiles: Tª óptima
de 37-42ºC.
29
Tabla 3 - DNA polimerasas termoestables: Tª óptima
de 74 ºC.
29
Tabla 4- Condiciones 1: Componentes,
concentraciones y volúmenes para PCR-CAP.
40
Tabla 5- Condiciones 1 del termociclador para PCR-CAP.
40
Tabla 6- Condiciones 2: Modificaciones en los volúmenes
para PCR-CAP.
41
Tabla 7- Condiciones 4: Modificación en el volumen de la
TAQ ADN polimerasa para PCR-CAP.
41
Tabla 8- Componentes, concentraciones y volúmenes para
PCR-U.
42
Tabla 9- Condiciones del termociclador para PCR-U.
42
xi
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1 – Numerosos cuerpos de inclusión
intracitoplasmáticos, en el centro germinal
de la tonsila de un cerdo con PWMS.
10
Figura 2 – Cerdo con PWMS (Izquierda).
Cerdo normal (Derecha).
11
Figura 3 – Linfadenopatía de los ganglios mesentéricos,
en un cerdo con PWMS.
11
Figura 4 – Linfadenopatía de los ganglios bronquiales
y pneumonía intersticial en un cerdo con PWMS.
14
Figura 5 – Atrofia hepática en un cerdo con PWMS.
14
Figura 6 – Corte de ganglio linfático de un cerdo con PMWS.
15
Figura 7 – Animal afectado por PDNS.
17
Figura 8 – Riñón hipertrofiado con hemorragias petequiales
generalizadas en el cortex.
18
Figura 9 –Hipertrofia de los ganglios inguinales superficiales
18
Figura 10 –Termociclador MJ Research.
33
Figura 11 –Centrífuga eppendorf 5804 R.
38
Figura 12 –Baño seco, Thermolyne. Type 16500 Dri-Bath.
39
Figura 13- Electroforesis de diluciones en SFB
de la muestra AL 08/04 con PCR-CAP.
44
Figura 14- Electroforesis de diluciones en ultrapura
de la muestra AL 08/04 con PCR-CAP.
45
Figura 15- Sueros porcinos 1 (Fase de aplicación PCR-CAP).
45
Figura 16- Sueros porcinos 2 (Fase de aplicación PCR-CAP).
46
xii
pág.
Figura 17- Electroforesis realizada con las condiciones 2.
46
Figura 18- Electroforesis realizada con las condiciones 4.
47
Figura 19- Electroforesis realizada con las condiciones 4,
para diluciones 1:10 y 1:100 en H2O y 1:100,
1:1.000, 1:10.000, 1:20.000 en SFB.
48
Figura 20- Electroforesis PCR-U, para diluciones 1:10 y
1:100 1:100 en H2O y 1:100, 1:1.000, 1:10.000,
1:20.000 en SFB.
49
Figura 21- Electroforesis PCR-U 1 para diluciones
1:10.000, 1:20.000 y 1:100.000 en H2O y
1:100.000 en SFB.
49
xiii
RESUMEN
La porcicultura es una parte importante del sector pecuario colombiano,
contribuyendo para la economía nacional y ofreciendo una importante fuente de
proteínas para consumo humano.
Así, el estudio de enfermedades porcinas, como la circovirosis, una enfermedad
de interés emergente mundialmente, es fundamental para la cuantificación del
impacto de la misma sobre la porcicultura nacional. Además, la complejidad de los
síntomas, el escaso conocimiento acerca de la distribución geográfica en
Colombia y la falta de un profundo conocimiento de la patogenia del circovirus tipo
2 (PCV-2) hacen de la circovirosis un tema de interés prioritario a nivel de
investigación.
En este sentido, se justificó la validación de una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) para el diagnóstico del PCV-2 en sueros de porcinos por la
posibilidad de la detección de animales infectados que estén vivos y sobre los
cuales se pueda tomar decisiones, como, por ejemplo, el descarte o separación
del rebaño, sin la necesidad de esperar hasta el sacrificio para la detección.
Además, la toma de sueros es poco invasiva y se hace en forma rutinaria en la
cría de porcinos, siguiendo el protocolo propuesto en el presente proyecto, sin la
generación de trastornos a los criadores.
La técnica de PCR fue de elección para el diagnóstico de PCV-2 por ser sensible,
específica y no necesitar de reactivos inmunológicos, difíciles de obtener para este
tipo de virus.
Por lo tanto, los objetivos de este proyecto eran validar una técnica de PCR para
detección de PCV-2 en sueros de porcinos, utilizando sueros negativos para PCV2 artificialmente contaminados con muestras de ADN de PCV-2 y la aplicación de
la técnica validada en muestras de sueros de porcinos para detección del PCV-2.
Para la realización de este proyecto, la metodología se dividió en dos grandes
fases. En la primera, o fase de validación, se tomaron macerados de tejidos de
porcinos (hígado, bazo y nódulos linfáticos) previamente evaluados como positivos
por PCR y disponibles en el laboratorio; acto seguido estas muestras fueron
diluidas en muestras negativas, previamente evaluadas por PCR como negativas.
Estas diluciones fueron valoradas por PCR y se observó la especificidad y
sensibilidad analíticas.
Hecho esto, la fase siguiente, o aplicación, estuvo constituida por el muestreo de
sueros de porcinos, disponibles en el Departamento de Medicina Veterinaria
Preventiva y Salud Animal (VPS), de la Faculdad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia (FMVZ), de la Universidad de São Paulo (USP). A estas muestras se
aplicó la PCR previamente validada.
Se esperaban como resultados, la positividad de las muestras artificialmente
contaminadas y en cuanto a las muestras de campo se espera que la PCR permita
la detección de PCV-2 o la comprobación del su negatividad.
xiv
Se encontró, después de la aplicación de 2 diferentes PCRs, un 100% de
animales negativos a PCV-2; además, la PCR dirigida a una región entre las ORF
1 y 2 del virus se presentó como más sensible al ser comparada a otra PCR
dirigida al gen de la proteína de cápside.
Se concluyó que la PCR es una técnica válida para la detección de PCV-2 en
sueros porcinos y que la población muestreada era libre del virus.
xv
ABSTRACT
Swine production is an important part of the Colombian livestock sector,
contributing to the national economy and offering an important protein source for
human consumption.
Thus, the study of swine diseases, like circovirosis, a disease of emergent worldwide interest, is fundamental for quantifying the impact of the same on the national
swine production. In addition, the complexity of the symptoms, the little knowledge
about the geographic distribution in Colombia and the lack of a deep knowledge on
the pathogenesis of Porcine Circovirus type 2 (PCV-2) make the circovirosis a
subject of high-priority interest at level of investigation.
In this sense, the validation of a PCR (Polymerase Chain Reaction) for the
diagnosis of the PCV-2 in pigs serum is justified by the possibility of detection in
live animals on which decisions can be made, like, for example, the discarding or
separation from the flock, without waiting until the slaughter for detection.
In addition, the collection of sera is little invasive and, following the protocol
proposed in this project, is routinely made in young pigs, without upheavals to
breeders.
The PCR technique is of choice for the PCV-2 diagnosis due to its sensitivity and
specificity and because it doesn’t need immunological reagents, so difficult to
obtain for this type of virus.
Therefore, the objectives of this project were to validate a PCR technique for
detection of porcine circovirus type 2 (PCV-2) in swine sera, using negative for
PCV-2 sera artificially contaminated with PCV-2 DNA samples, and the application
of the technique validated in swine sera samples for detection of the PCV-2.
For the carrying out of this project, the methodology was divided in two great
phases. In the first, or validation phase, macerated pigs tissues (liver, spleen and
lymphatic nodes) previously evaluated as positive by PCR and available in the
laboratory were taken; immediately afterwards these samples were diluted in
negative samples, previously evaluated by PCR as negative.
These dilutions were valued by PCR and they were observed for analytic specificity
and sensitivity.
Once this was done, the following phase, or application phase, was constituted by
the taking of pig’s serum samples, of the Departamento de Medicina Veterinaria
Preventiva e Saúde Animal (VPS), da Faculdade de Medicina Veterinária y
Zootecnia (FMVZ), de la Universidade de São Paulo (USP). On these samples, the
previously validated PCRs were applied.
The expected results were: the positivity of the samples artificially contaminated
and, regarding the field samples, the expectations were that the PCR allows the
detection of PCV-2 or the verification of the their negativity.
After the application of 2 PCRs, 100% of the samples were found negative to PCV2; furthermore, the PCR targeted to a region between ORFS 1 and 2 of the virus
showed a higher sensitivity when compared to another PCR targeted to the capsid
protein gene.
xvi
We concluded that the PCR is a valid technique for the detection of PCV-2 in swine
sera and that the sampled population was free of the virus.
xvii
INTRODUCCIÓN
Desde su descubrimiento y caracterización en el occidente de Canadá en 1995, la
distribución del Síndrome de Desmedro Post-Destete (SDPD), ha crecido y ahora
es innegablemente reconocido mundialmente. Recientemente, se ha dado un alto
interés a una gran cantidad de condiciones relacionadas, incluyendo, al Síndrome
Dermatitis y Nefropatía Porcina (SDNP), Neumonía Necrótica Proliferativa Porcina,
Tremor Congénito Porcino (TCP), miocarditis perinatal, fallas reproductivas y
enteritis.
El circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) está presente tanto en animales sanos como
enfermos. Además, recientes estudios serológicos demostraron que no existe una
diferencia significativa en la IgG específica de PCV-2 entre los casos clínicos de
SDPD y los no clínicos. Claramente, los factores que activan la expresión clínica,
la transmisión, la epidemiología y la patogenia, son pobremente entendidas.
Con estas incertidumbres en mente, el objetivo de este trabajo fue la validación y
aplicación de una técnica diagnóstica, rápida, de gran sensibilidad y especificidad,
que permitiera la detección del agente, ya que este sería el punto de partida para
comenzar otras investigaciones, tales como secuenciamiento, filogenesis y
epidemiología, entre otras.
En busca de esto, la validación de una Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR) fue el método de elección.
Ya existen investigaciones anteriores que demuestran la superioridad de la técnica
en tejidos, sin embargo estas sirven después del sacrificio del animal. La
validación de una PCR en suero, nos da la posibilidad de tomar medidas en las
piaras, tales como, apartar animales, mejorar las prácticas de manejo, para
prevenir la aparición de un brote o como barrera biosanitaria.
Para la realización de este trabajo se realizó una revisión bibliográfica detallada
del agente y de la técnica a realizar. Se utilizaron las instalaciones, muestras de
tejido de porcinos y reactivos del Laboratorio de Biología Molecular y Serología
(LABMAS) de la Universidad de Sao Paulo (USP), Brasil.
Para la validación de la prueba se muestrearon aleatoriamente sueros porcinos
donados por Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva y Salud Animal
1
(VPS), de la Faculdad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ), de la
Universidad de São Paulo (USP, sin tener en cuenta los antecedentes de estos.
Se esperó que este trabajo sirva como incentivo a la realización de investigación
en enfermedades porcinas y que dicha técnica también pueda ser validada en
Colombia, para el mejoramiento y conocimiento del sector porcícola.
2
OBJETIVOS
GENERALES
•
Validar y aplicar técnicas de reacción en cadena por la polimerasa (PCR)
para detección de circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) en sueros de porcinos.
ESPECIFICOS
•
Analizar por medio de PCR tejidos (bazo, hígado, nódulo linfático, etc.)
macerados de porcinos, para que sean tomados como control positivo en la
reacción.
•
Realizar diluciones en suero y agua de un tejido positivo para observar la
sensibilidad de la prueba y comprobar que no exista ninguna posible
interferencia con la detección en suero de PCV-2.
•
Obtener un porcentaje de animales positivos y negativos, aunque esto no
signifique la presencia de circovirosis en la granja.
3
1. CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2
La circovirosis porcina es un síndrome infecto-contagioso, causada por el
Circovirus Porcino tipo 2 (PCV-2), que se manifiesta principalmente como una
enfermedad de lechones recién destetados, en esta dolencia se presentan
dermatitis, neuropatías, fallas reproductivas, neumonía y encefalitis.
El género Circovirus comprende las especies Virus de la enfermedad del pico y las
plumas de psitacíde, Circovirus de canarios, Circovirus de gansos, Circovirus de
palomos y Circovirus porcino. Y junto con el género Gyrovirus, donde se encuentra
el Virus de anemia de las gallinas, el género Circovirus constituye la familia
Circoviridae (Van Regenmortel et al, 2000).
La primera enfermedad asociada con PCV-2 fue el síndrome del desmedro
multisistémico post-destete, conocida por sus siglas en ingles como PMWS (PostWeaning Multisystemic Wasting Syndrome) (Staebler et al., 2005). Los signos
fundamentales de PMWS incluyen caquexia, disnea, hipertrofia de los nódulos
linfáticos, diarrea, palidez e ictericia, se presenta con mayor frecuencia en
porcinos entre 7 y 15 semanas de edad, en la fase post-destete (Harding, 2004).
En su forma endémica el PMWS presenta bajas morbilidades y mortalidades, no
obstante en brotes epidémicos se pueden elevar en tres o cuatro veces en la fase
post-destete (Harding, 2004). Esta enfermedad fue reportada en porcinos en
Canadá, Estados Unidos de América, México, Argentina, Brasil, Corea del Sur,
Japón y en diversos países de Europa (Castro et al, 2004; Chae, 2004). Aunque
en Colombia existen rumores de la presencia de PCV-2, no se encuentran
publicaciones científicas sobre la situación actual en nuestro país.
Los patrones de lesiones histopatológicas encontradas en caso de PMWS,
incluyen una inflamación granulomatosa, que sugiere que la patogenia y la
progresión de la enfermedad están asociadas con infiltración por monócitos y
macrófagos (Chae 2004).
El Síndrome de Nefropatía y Dermatitis Porcino (PDNS, Porcine Dermatitis and
Nephropathy Syndrome), descrita por primera vez en el Reino Unido (Smith et al.,
1993; White y Higgins, 1993) y caracterizada por un proceso patológico vascular
inmunomediado, acompañada por una dermatitis se manifiesta con lesiones en
piel de color rojo o púrpura, que forman placas o parches en la piel (infartos
multifocales) de forma irregular o circular.
4
Las lesiones inician normalmente en los miembros posteriores, abdomen y se
desarrollan posteriormente hacia el tórax, flancos y orejas. Los cerdos afectados
generalmente tienen fiebre y presentan anorexia. En los riñones, la infección con
PVC-2 lleva a hipertrofia, palidez y petequias, afectando porcinos en las fases de
crecimiento y terminación (Duran et al, 1997; Drolet et al, 1999; Thompson et al,
2000; Gresham et al, 2002).
Los disturbios en la reproducción causados por PCV-2 ocurren de modo
esporádico durante brotes de PMWS, se manifiestan en forma de abortos y
aumento de las tasas de mortinatos y momias, pudiendo encontrar PCV-2 en
diversos tejidos fetales, sugiriendo la posibilidad de transmisión vertical o el
desarrollo de inmunotolerancia en los lechones (Harms, 1999; Jolie et al., 2000;
Harding, 2004).
Los procesos patológicos del tracto respiratório de porcinos causados por PCV-2
sin la ocurrencia de los signos clásicos de PMWS reciben el nombre de Complejo
Respiratório Porcino (PRDC, Porcine Respiratory Disease Complex),
caracterizado morfológicamente por neumonía proliferativa necrotisante (PNP). La
PNP, histopatológicamente, se caracteriza por una bronquiolitis necrotisante que
se presenta en los cerdos en la etapa del destete y en la fase de terminación
(Morin et al, 1990; Harding, 2004). La PRDC es un síndrome respiratorio
multietiológico, que envuelve PCV-2, PRRS (Síndrome Reproductivo Y
Respiratorio Porcino), virus de influenza porcina, Mycoplasma hyopneumoniae y
Pneumocistis carinii (Ellis et al., 1998; Harms et al, 2001).
Una forma diferente de manifestación de la infección por PCV-2 son los procesos
patológicos del sistema nervioso central; en las neuronas cerebelares, encefálicas
y medulares, el PCV-2 conlleva a tremores congénitos y lesiones en meninges
(Stevenson, 1999; Wellenberg, 2000).
En porcinos en la fase de crecimiento-terminación, una manifestación clínica de
infección por PCV-2 distinta al PMWS es la enteritis granulomatosa, caracterizada
por infiltración de macrófagos y células gigantes multinucleadas en placas de
Peyer, con inclusiones citoplasmáticas en células inflamatorias (Kim et al., 2004).
En fetos abortados y mortinatos, relacionados a casos de disturbios reproductivos
asociados a PCV-2, un hallazgo común es la miocarditis, aunque también se
puede encontrar en neonatos (Mikami et al., 2005).
Esta diversidad de manifestaciones clínicas de infección por PCV-2 se originan, no
solamente, en las diferentes edades de los animales, sino también en las co5
infecciones observadas y en las asociaciones intrínsecas del PCV-2 con otros
patógenos. Por ejemplo, en el caso de PMWS, ocurre sinergismo entre o PCV-2 y
parvovirus porcino (PPV), posiblemente por la potencialización de la replicación de
PCV-2 en macrófagos (Ellis et al., 2004). En disturbios reproductivos, hay también
la asociación PCV-2 y PPV, además de PRRS y virus de encefalomiocarditis
(O’Connor et al., 2001).
En casos de procesos entéricos, hepáticos y renales a los cuales puede estar
relacionado el PCV-2 con PRRS, Aujeszky, virus de hepatitis E y PPV (Ellis et al.,
2004). Además de esto, como ya ha sido descrito, la patogenia del PRDC y la
asociación de PCV-2 con otros virus, bacterias o protozoarios (Ellis et al., 1998;
Harms et al, 2001).
En la actualidad el conocimiento acerca de la compleja patogenia, los múltiples
factores de riesgo, como, por ejemplo, edades susceptibles, la cadena de
transmisión y las interacciones microecológicas con PCV-2 en cerdos permite
comprender solo en parte el verdadero impacto de las circovirosis en porcinos.
Las infecciones mixtas por PCV y coronavirus, también se han descrito (Bersano
et al, 2003), lo que demuestra a complejidad epidemiológica de la patología de
circovirosis porcina.
Los diagnósticos de las enfermedades asociadas a PCV-2 deben siempre
basarse, no solo en la detección del virus o de su ADN en un animal, sino que es
obligatorio relacionarlo siempre con la presencia de síntomas clínicos de la
enfermedad en cuestión y las lesiones histopatológicas (Chae, 2004). Basándose
en técnicas como ELISA, imunofluorescencia directa e imunoperoxidasa (Allan et
al., 1999; Blanchard et al., 2003; Nawagitgul et al., 2002; Rodriguez-Arrioja et al.,
2000), realizaron un diagnóstico indirecto de circovirosis porcina por medio de la
detección de anticuerpos
séricos como herramienta de estudios
seroepidemiológicos (Allan et al, 1999).
El diagnóstico directo de circovirosis puede ser realizado con hibridización in situ e
imunohistoquímica, las cuales permiten la asociación entre la presencia de PCV y
lesiones del tejido (Choi y Chae, 2000; Segalés et al., 2004) y reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), que puede ser aplicada para la detección del virus en
muestras de suero, tejido y heces (Liu et al; 2002; Shibata et al., 2003; Calsamiglia
et al., 2002).
6
1.1 HISTORIA
En 1974, un circovirus porcino (circovirus porcino -PCV) fue aislado de una línea
de cultivo células de riñón cerdo (PK-15) usadas en investigaciones de laboratorio.
Este tipo particular de PCV, fue identificado como circovirus porcino tipo 1 (PCV-1)
y ha sido investigada a fondo desde su descubrimiento. A la fecha, los
investigadores no han podido establecer ninguna significancia clínica a PCV-1; no
se ha comprobado que sea responsable de causar enfermedad en porcinos.
Los exámenes serológicos (análisis de sangre) para PCV-1, en Alemania (1974),
Canadá (1989), Nueva Zelandia(1991), Gran Bretaña (1994), Irlanda del Norte
(1994) y Estados Unidos de América (1995), indican que el virus se encuentra muy
diseminado a través de las granjas de cerdos y la mayoría se han expuesto, sin
embargo debe estudiarse mas a fondo ya que en otros estudios se mostró que
existen reacciones cruzadas entre PCV-1 y PCV-2, usando inmunofluorescencia
indirecta (Dulac, G. 1989; Calsamiglia et al., 2002) e inmunoperoxidasa
monoclonal (Rodríguez-Arrioja, G. M.; 2000) Cómo PCV-1 se transmite a través
de la población porcina y cuando los cerdos se infectan, en este momento, no se
sabe.
Otro circovirus porcino fue descrito (PCV-2) fue identificado por los investigadores
en la universidad de Saskatchewan(Clark, Ellis, Harding, West) a mediados de los
años noventas, en la "asociación" con un nuevo y distinto problema de salud en
cerdos llamaron a PMWS (post-weaning multi-systemic wasting syndrome). La
primera referencia que se encuentra de esta enfermedad fue hecha en Canadá
1991(Clark 1997), su trabajo comenzaba a establecer, con una cierta certeza que
PCV-2 era capaz de causar PMWS. Inmediatamente otros autores confirmaron las
observaciones, principalmente en Norte América, Europa y Asia.
Desde ese momento el PCV-2 se ha relacionado a muchas enfermedades, entre
ellas: PDNS, PRDC, PCT (Porcine Congenital Tremor) y se ha demostrado su
asociación en enfermedades como: PRRS, PNP, fallas reproductivas y enteritis.
1.2 AGENTE ETIOLÓGICO
Los circovirus porcinos se caracterizan por ser pequeños, con ADN de cadena
sencilla (KIM et al. 2003), de aproximadamente 17 nm (nanometros) de diámetro,
icosaédricos, circulares, sin envoltura, con densidad de 1,33-1,34 en CsCI (Tischer
et al. 1974) y por poseer uno de los dos menores genomas entre los virus que
infectan vertebrados, con aproximadamente 1.760 nucleotideos (Todd 2000). El
7
genoma de los circovirus tiene 6 o 7 ORFs (open reading frames) y ausencia de
regiones intergénicas.
Por ser el primer virus animal en presentar un genoma de ADN circular, su nombre
fue propuesto y paso a constituir un nuevo género, denominado Circovirus
(Tischer et al. 1982, Lukert et al. 1995). En 1995 el agente fue agrupado por el
Comité Internacional de Taxonomia Viral, en una nueva familia de virus ADN,
denominada Circoviridae.
El circovirus resiste medios ambientes ácidos (pH 3), a cloroformo, a temperaturas
entre 56 ºC y 70 ºC (Allan et al. 1994c), al congelamiento, a la luz ultra-violeta y a
desinfectante (Shibata et al. 2003). El agente permanece estable en secreciones
respiratorias y heces (Shibata et al. 2003).
El PCV fue dividido en tipo 1 (PCV-1), el cual se conoció por infectar células de
riñón porcino (pk15) para investigación de virus y producción de vacunas,
apatogénico para porcinos. Y tipo 2 (PCV-2), citopatogénico.
El virus puede ser detectado por imunohistoquímica (Ellis et al. 1998),
hibridização "in situ" (Nawagaitgul et al 2000), imunofluorescencia indirecta (Allan
& Ellis 2000), reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Larochelle et al. 1999,
Calsamiglia et al. 2002) y por aislamiento viral (Tischer et al. 1982).
Los “primers” (segmentos de ADN) utilizados para la realización de la técnica de
PCR fueron escogidos por ser específicos para PCV-2, contienen una secuencia
de nucleotidos para el ORF 2, que codifica para las proteínas formadoras de
cápside (Fenaux et al. 2000).
1.3 EPIDEMIOLOGÍA
Estudios epidemiológicos indican que la distribución es amplia en Europa y
Estados Unidos, pudiendo llegar de un 20 a un 80% de los animales en algunas
piaras.
En campo, la seroconversión ocurre en lechones entre las 3 (tres) y 4 (cuatro)
semanas de edad (Allan; Ellis, 2000). La viremia ocurre entre la séptima y
dieciseisava semana de edad, esto conduciría a una baja prevalencia en las
madres.
8
Los anticuerpos maternos desaparecen entre al octava y novena semana después
del parto, los anticuerpos séricos, por contacto con cepas de campo pueden ser
detectados entre la semana 13 y la 15, esto nos indicaría una exposición al agente
entre la 11 y 13, este momento corresponde al traslado de animales a las
unidades de ceba.
Considerando la variación individual, en la detección de ADN de PCV-2 puede
realizarse de la semana 5 a la 21, demostrando con esto que algunos porcinos
pueden desarrollar una viremia persistente (Segalés et al. 2002).
La detección de PCV-2 en hisopados nasales, tonsilar, bronquiolar, urinario y
fecal, lleva a algunos autores a postular la transmisión del agente por vía oronasal, fecal y urinaria.
El aislamiento del agente, en fetos abortados a término y mortinatos e
inoculaciones experimentales, demostraría la capacidad del virus de replicarse y
causar, en diferentes fases de la gestación, anormalidades (West 1999 y Lyoo
2001). Con lo cual, se puede hablar de una transmisión horizontal y vertical
(transplacentaria).
1.4 SÍNDROME DEL DESMEDRO MULTISISTÉMICO POSTDESTETE (PMWS)
La presentación clínica de PMWS se caracteriza por retraso en el crecimiento
corporal, palidez, algunas veces ictericia y finalmente la muerte. En algunos
animales se puede observar un aumento en el tamaño de los nódulos linfáticos
superficiales. La edad de los animales afectados con PMWS suele oscilar más
comúnmente entre las 5 y las 12 semanas. La morbilidad y la mortalidad son muy
variables, y se sugieren valores de 5% a 50% y > 90%, en los animales que
presentan los síntomas (Morozov et al. 1998), respectivamente, en cerdos
destetados (ver más en el numeral 1.3).
En algunas investigaciones se considera al circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) como
el único agente infeccioso necesario para el desarrollo del PMWS (Allan et al.
2000, Kennedy et al. 2000, Krakowka et al. 2001).
Aunque el ADN del virus se replica en el núcleo celular (Tischer et al. 1987), los
cuerpos de inclusión se encuentran generalmente en el citoplasma (Figura 1) y
sólo raramente en el núcleo de macrófagos.
9
Figura 1 – Numerosos cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos, en
el centro germinal de la tonsila de un cerdo con PWMS.
th
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18 2000
Si bien no existe evidencia suficiente para demostrar si los materiales víricos
observados corresponden a una infección vírica productiva en macrófagos o bien
a fagocitosis de materiales víricos producidos en otras localizaciones (Gilpin et al.
2001), el hallazgo de materiales víricos en el núcleo de macrófagos, hepatocitos y
células epiteliales y endoteliales sugiere que estos tipos celulares podrían jugar un
papel importante en la replicación viral (Kennedy et al. 2000, Rosell et al. 2000 y
Rovira et al. 2002).
Otros aspectos referidos a la patogenia del PMWS son también inciertos. Algunos
reportes sugieren que la infección por PCV-2 no seria suficiente, siendo necesaria
la coinfección con otros agentes como parvovirus porcino (PPV) (Allan et al. 1999,
Krakowka et al. 2000), virus de la enfermedad de Aujeszky (Rodríguez-Arrioja et
al. 1999) o virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (Allan et al. 2000,
Quintana et al. 2001, Rovira et al. 2002, Segalés et al. 2002) para producir PMWS.
Otros autores sugieren que la sola inmunoestimulación puede ser decisiva en la
presentación del síndrome aunque una vez que los animales enfermaron hay
evidencias de que ocurre una inmunosupresión. La infección por patógenos
oportunistas en cerdos con PMWS y las coinfecciones bacterianas en los animales
afectados con el PMWS, suelen ser importantes desde un punto de vista clínico.
La enfermedad es emergente en Colombia, no existiendo información suficiente
referida a la extensión y características de su presentación en nuestro país.
1.4.1 Signos clínicos. Existen seis signos fundamentales en PMWS, los cuales
forman la base de un diagnóstico clínico preliminar. En orden de frecuencia, son:
adelgazamiento progresivo, disnea, aumento de tamaño de los nódulos linfáticos,
diarrea (acuosa), palidez e ictericia (Harding 1997) (Figura 2). Los nódulos
linfáticos que se ven afectados con mayor frecuencia son los inguinales
superficiales y los mesentéricos (Rosell et al. 1999) (Figura 3).
10
Figura 2 – Cerdo con PWMS (Izquierda). Cerdo normal
(Derecha).
th
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18 2000
Figura 3 – Linfadenopatía de los ganglios mesentéricos, en
un cerdo con PWMS.
th
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18 2000
Aunque no todos los signos se presentan en un solo animal, las granjas afectadas
presentaran, sino todos, sí la gran mayoría, en un periodo de tiempo, otros signos
menos frecuentes, también se han reportado, entre ellos: tos, pirexia, úlcera
gástrica, meningitis y muerte súbita (Harms 1999a, Wellenberg et al. 2000). Entre
los disturbios del sistema nervioso central se encuentran: tremores, desordenes
locomotores, postración, convulsiones y depresión (Nielsen et al. 2003, Choi et al.
2002). Algunos de ellos son causados en parte por infecciones secundarias.
Los signos clínicos de PMWS se encuentran únicamente en los grupos de postdestete, particularmente lactancia tardía y destete temprano, típicamente
afectando animales entre las 7 y 15 semanas de edad (Harding 1997).
11
1.4.2 Trastornos hematológicos y bioquímicos. En animales que presentan
PMWS, los linfocitos se encuentran significativamente bajos y los neutrófilos y
monocitos aumentados, también se encontra una inversión en la proporción entre
linfocitos y neutrófilos. No se ve diferencias en el número de leucocitos.
Generalmente, los cerdos afectados, presentan anemia normocítica hipocrómica
(con un leve aumento de glóbulos rojos (GR) en el momento inicial de la
infección).
Las proteínas de fase aguda de PMWS (MAP-pig) y la haptoglobina se encuentran
aumentadas (Segalés et al. 2003). Es probable que esto se encuentre relacionado
al aumento en el número de GR y la disminución del Volumen Corpuscular Medio
de hemoglobina e hierro sérico. Lo anteriormente dicho, mostraría a la anemia
como el resultado de un proceso inflamatorio crónico, con el secuestro de hierro
sérico en el sistema retículo-endotelial (Darwich et al. 2003).
1.4.3 Patogenia. Se piensa que la entrada del virus a la célula puede presentarse
por dos mecanismos, el primero de ellos, la existencia de un receptor para PCV-2
en la superficie de los macrófagos (no identificado) y el segundo la fagocitosis de
otra célula infectada (endocitosis), o por los dos mecanismos(Darwich et al. 2004).
La forma exacta por la cual el PCV-2 es capas de replicarse, todavía no se
conoce, sin embargo se mencionan como requisitos para ella, la síntesis de ADN
celular nuevo y el tropismo que el virus posee por células de origen histiocítico
(Kim et al. 2003). No obstante se sabe que otros circovirus dependen de
polimerasas en el núcleo de la célula y que se realiza en la fase S, haciendo más
eficiente la replicación en tejidos con alta mitosis.
Aunque algunos autores postulaban la incapacidad del PCV-2 para causar por sí
sola PMWS y señalaban a otros patógenos (PPV y PRRS) de brindar las
condiciones optimas para la replicación ya que estimulaban la migración y
proliferación de células histiocíticas y la síntesis de ADN y citoquinas. No obstante
estudios recientes (Fenaux et al.2002), demostraron que PCV-2 es capaz de
causar la enfermedad, sin la ayuda de otros patógenos y que las co-infecciones
solo agravarían las lesiones (Fenaux et al.2002), por las condiciones
anteriormente mencionadas.
La patogénesis de la infección esta asociada a la disfunción inmune por la
proliferación del virus en monocitos, histiocitos, macrófagos y macrófagos
presentadores de antígeno en pulmón, timo y bazo. También se ha demostrado
que la disminución en la proliferación linfocitaria mediada por macrófagos, post12
infección y el efecto directo de destrucción en los macrófagos, disminuirían la
respuesta inmune.
También se implica la replicación vírica dentro de los macrófagos, al sugerirse que
la infección de macrófagos es una consecuencia de la fagocitosis de partículas
virales en restos de linfocitos apoptóticos (Shibahara et al. 2000).
El período de incubación del virus, en condiciones experimentales es de 2 a 4
semanas y cuanto mayores sean las cantidades de antígeno vírico, mayor es la
depleción linfoide.
El grado de depleción parece estar relacionado con el estado de infección, siendo
así que en la fase inicial ocurre un aumento de células mononucleares fagocíticas,
esto atribuido a la pérdida de células linfoides en las zonas interfoliculares de los
nódulos linfáticos y a la infiltración por macrófagos. Y en los estados finales se
observa una reducción en los linfocitos T y B y en el linaje de células macrófagas.
Al parecer, el PCV-2 estimula los macrófagos epiteloides y a las células gigantes a
producir MCP-1 (Proteína-1 quimiotáctica para monocitos) en los nódulos
linfáticos, atrayendo de esta manera nuevas células mononucleares (Kim y Chae
2003). Las células gigantes son conocidas como las iniciadoras y continuadoras
del proceso granulomatoso.
Kim et al 2003, muestra la persistencia de ADN vírico, en la sangre, en los
porcinos por largo tiempo, sin signos clínicos; esto jugaría un papel importante en
la transmisión adulto-joven.
1.4.4 Hallazgos en necropsia. Al realizar la necropsia es evidente el desmedro del
animal, por la perdida de grasa corporal y muscular. La piel se puede encontrar
con ictericia y pálida en un 20% de los casos.
Los pulmones no se colapsan, se hallan firmes o con sensación de goma y con
áreas de congestión (Clark 1997, Morozov et al. 2002, Rosell et al. 1999). Grandes
áreas de consolidación son comunes en el lóbulo craneal y mediastínico. Algunas
veces se puede observar neumonía intersticial con infección bacteriana
secundaria (Figura 4).
En la mayoría de los casos el hígado no presenta alteraciones, sin embargo es
posible encontrar un aumento en el tejido conectivo interlobular y algunas veces
un color rojo-amarillento (hepatitis intersticial) (Figura 5) o pálido.
13
Figura 4 – Linfadenopatía de los ganglios bronquiales y
pneumonía intersticial en un cerdo con PWMS.
th
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18 2000
Figura 5 – Atrofia hepática en un cerdo con PWMS.
th
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18 2000
Al examinar los nódulos linfáticos, en especial los superficiales inguinales, los
mesentéricos, los mediastínicos y los traqueo-bronquiales, se encontraron de 3 a 4
veces aumentados de tamaño y en la superficie de corte homogéneamente
pálidos (Kim et al. 2003).
El bazo puede encontrarse congestionado, carnoso al corte y aumentado de
tamaño. En los riñones se observa, en algunos casos, palidez, edema y focos
blanquecinos en la superficie subcapsular. Al examinar cavidad abdominal, la
región esofágica puede presentar úlceras, también hemorragias y necrosis
cutáneas como en PDNS, o poliserocitis fibrinosa. Petequias e hiperemias, se
encuentran con cierta frecuencia en el colon en espiral (Lukert y Allan 1999) y el
contenido diarréico, al igual que la dilatación, son notables en el ciego.
En un estudio realizado en Japón, el intestino mostraba una enteritis fibrinosa
necrotizante, al igual que meningitis y poliserocitis fibrinosas y linfadenopatía
generalizada.
14
1.4.5 Histopatología. Entre las lesiones típicas, se puede mencionar un infiltrado
inflamatorio granulomatoso multifocal en: bazo, tonsilas, placas de Peyer, timo y
nódulos linfáticos. Compuesto por células gigantes multinucleadas (Figura 6) y
macrófagos epiteloides (Clark 1997, Rossel et al. 1999 y Kim et al. 2003). Los
corpúsculos de inclusión basofílicos (Clark 1997, Rossel et al. 1999) o anfofílicos
intracitoplasmáticos e intracelulares, aunque estos no se presentan en todos los
casos su hallazgo en signo patognomónico de PCV-2.
Figura 6 – Corte de ganglio linfático de un cerdo con PMWS. Células
gigantes multinucleadas (café) y macrófagos. Lisoenzima (rosado).
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18th 2000
En un corte de nódulo linfático, es evidente, la depleción linfoide de linfocitos
maduros en los centros foliculares, la necrosis o los detritos celulares en la zona
folicular y en la paracortical, se puede hallar depleción de pequeños linfocitos. La
depleción linfoide peri-arteriolar e inflamación de las células histiocíticas, es común
en el bazo.
En las tonsilas y placas de Peyer, se encuentra depleción linfoide en la zona
interfolicular y central. En la lámina propia de las vellosidades intestinales, es
posible encontrar células sinsitiales.
Los cortes de pulmón muestran neumonía linfohistiocítica intersticial, multifocal o
difusa (Rossel et al. 1999), hiperplasia de pneumocitos tipo II. En bronquios,
bronquíolos o espacio peri-bronquial infiltrado macrofágico difuso.
Nefritis intersticial linfohistiocítica multicofal, pielitis y vasculitis del cortex son
vistos en los riñones y glomerulitis exudativa aguda con cilios de fibrina, pueden
ser encontrados en el espacio de Bwmann y lumen de los túbulos contorneados
proximales.
15
En el hígado es notable, tumefacción hepatocelular, colapso sinusoidal y necrosis
multifocal de hepatocitos o hepatitis intersticial linfohistiocítica periportal o difusa
asociada a vascularización.
También se puede presentar perivasculitis granulomatosa segmental, al realizar
cortes de serosas, cerebro, ojos y piel.
1.5 TREMOR CONGÉNITO PORCINO (PCT).
La mioclonía congénita o PTC se caracteriza por tremores de los miembros y la
cabeza en los recién nacidos (Edwards y Mulley 1999). Se han reportado dos tipos
de PCT, basándose en la deficiencia (tipo A) o no (tipo B) de mielina en el sistema
nervioso central y periférico.
El tipo A, se ha dividido en 5 subtipos, en número romanos (I, II, III, IV, V, con la
anteposición de la letra A), estos están asociados a infección uterina por algún
virus, anormalidades genéticas e intoxicación por tricloformo en fase intra-uterina.
El subtipo asociado a virus no identificados es el AII, sin embargo en 1994, se
sugirió que el PCV-2 era el agente causal de este subtipo de PCT (Stevenson et
al. 2001). Otros autores, Lukert y Allan (1999), también reportaron esta asociación
cuando son introducidas hembras primerizas a una piara y expuestas al virus,
cuando ellas son sero-negativas.
Los tremores bilaterales que afectan la musculatura esquelética, caracterizan la
enfermedad y ocurren en los primeros días de vida, además son altamente
variables y su intensidad varía de leve a fuerte. Los tremores disminuyen cuando
los animales duermen y pueden ser acentuados o iniciados por estímulos
externos.
La mortalidad es bastante baja y la mayor parte de ellas, se da por la incapacidad
de los lechones para mamar; los animales que sobreviven se recuperan en 3
semanas. Aunque algunos productores comentan que hay animales que nunca se
recuperan completamente y continúan con los tremores hasta el sacrificio.
A la necropsia no se encuentra ningún hallazgo. Por otra parte se ha reportado la
deposición de mielina en el cordón espinal y la disminución de mielina de los
nervios espinales en animales con 13 días de edad.
16
En 1994, Hines aisló PCV de células renales de un cerdo con tremor congénito. El
virus fue usado para infectar 4 cerdas sero-negativas durante la gestación, por vía
intranasal, oral y sub-cutanea; la mayoría de los lechones, mostraban tremores
que persistieron por 2 o 3 semanas. El virus pudo ser reaislado de células de
ciego, riñón, colon e intestino delgado.
Por hibridación “in situ” fue detectado ácido nucléico en tejidos neurales e hígado,
en animales con PCT. Sin embargo, en Europa no se ha evidenciado ningún caso
de PCT asociado a PCV-2. Por esto debe ser estudiado, para en el futuro aclarar
la posible relación entre PCV-2 y PCT. Un mayor estudio de PCT AII, tal vez
pudiese llegar a explicar la muerte súbita en algunos casos de PMWS (Harding
2004).
1.6 SÍNDROME DERMATITIS NEFRITIS PORCINO (PDNS)
En 1993, fue reportada por primera por Smith y colaboradores. Su etiología no se
encuentra bien determinada, pero ha sido asociada al virus del PRRS, PCV-2 y
Pasteurella multocida (Thompson et al. 2001).
Figura 7 – Animal afectado por PDNS, en el que se
observan lesiones necróticas generalizadas.
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18th 2000
Como signos clínicos se encuentra primeramente lesiones en piel (Figura 7),
pérdida de peso y edema en los miembros, en cerdos en crecimiento; en precebos y en la fase inicial de engorde, la presentación es esporádica. Los animales
severamente afectados, pueden presentar fiebre, claudicación o anorexia y rara
vez muerte súbita. Esta enfermedad no responde a terapias antimicrobianas.
Al realizar la necropsia, se pueden encontrar lesiones en varios órganos como:
estómago, pulmones, riñones (Figura 8), cavidades corporales y nódulos linfáticos
17
(Figura 9). Se pueden observar grandes placas y máculas, redondeadas, rojizas,
en el área perineal, miembros, tórax ventral, orejas y abdomen. Los riñones están
aumentados de tamaño, con petequias en el cortex y pálidos. También se han
reportado, úlcera gástrica, neumonía, aumento en el tamaño de los nódulos
linfáticos, efusión serosa en cavidad peritoneal y pleura. Una vasculitis
necrotizante sistémica, principalmente en vasos de calibre pequeño y glomérulo
nefritis, son encontrados microscópicamente, al igual que necrosis epitelial y
hemorragias dermales.
Figura 8 – Riñón hipertrofiado con
hemorragias petequiales generalizadas en el
cortex. Notese el incremento de tamaño
tambien el en ganglio perirenal.
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18th
2000
Figura 9 –Hipertrofia de los ganglios
inguinales superficiales, los cuales se ven
de color rojo oscuro en el colon.
Fuente: MERIAL. PMWS Symposium. Melboure. 18
2000
th
Algunos autores, toman el PDNS, como una enfermedad inmunomediada que
afecta principalmente riñones y piel, ya que las lesiones microscópicas son
características de hipersensibilidad tipo 3, causada por complejos inmunes.
Saoulidis y colaboradores, en 2002 demostraron la presencia de PCV-2, por
inmuno-histoquímica e hibridación “in situ”, en nódulos mesentéricos, de animales
afectados con PDNS.
En la actualidad se sugiere a PDNS como diagnóstico diferencial de Erysipelothrix
rhusiopathiae y Actinobacillus suis, especialmente en Europa donde este es un
problema significativo.
18
1.7 ENTERITIS ASOCIADA A PCV-2
Como ya se sabe, el PCV-2, puede asociarse a un gran número de
manifestaciones clínicas, entre ellas la enteritis. Sin embargo, se deben tener muy
claros los criterios para diagnosticar una enfermedad como enteritis asociada a
PCV-2, ya que tomar individualmente los parámetros no es diagnóstico de ella, un
punto de vista que hay que considerar para todas las enfermedades asociadas al
PCV-2. El diagnóstico de enteritis asociada a PCV-2, debe cumplir con: 1)
presencia de diarrea, 2) presencia de lesiones microscópicas características en las
placas de Peyer, pero NO en los nódulos linfáticos y 3)presencia de PCV-2 con
estas lesiones (ADN).
Se considera que la enteritis asociada a PCV-2 puede ser una manifestación
clínica diferente de PCV-2. En un estudio realizado por Kim et al. 2004, se
describe el diagnóstico de la enfermedad, en seis animales sin PMWS por
histopatología, aislamiento viral e hibridación “in situ”. Inflamación granulomatosa
afectando las placas de Peyer, fue encontrada como única lesión, caracterizada
por células gigante multinucleadas e infiltración de macrófagos epiteloides. Fueron
observados en el citoplasma de células gigantes multinucleadas e histiocitos,
cuerpos de inclusión intra-citoplasmáticos, múltiples, grandes, en forma de uva,
basófilos o anfofílocos. No se encontraron lesiones en bazo, nódulos linfáticos o
tonsilas. Al realizar hibridización en muestras de intestino se encontró una fuerte
senal para PCV-2 en las placas de Peyer (citoplasma de células gigantes e
histiocitos).
A demás de estas pruebas los tejidos de los animales fueron analizados para virus
como: PPV, PRRS y Fiebre Porcina Clásica (FPC), y para patógenos bacteriales
como: Salmonella sp., Brachyspira pilosicoli y Brachyspira hyodysenteriae. Todas
las pruebas para estos patógenos fueron negativas.
La presencia de diarrea, colitis y enteritis granulomatosa, con abundante PCV-2
ADN asociado con lesiones microscópicas, puede sugerir al médico veterinario
enteritis asociada a PCV-2. Es importante recordar que no se deben encontrar en
los nódulos, ni depleción linfoide, ni inflamación granulomatosa y se debe
distinguir de PMWS, tanto en los signos como en histopatología.
La enteritis granulomatosa asociada a PCV-2, debe ser considerada como
diagnóstico diferencial cerdos en fase de crecimiento y finalización, con diarrea
que no responda a antibióticos.
19
1.8 NEUMONÍA NECROTIZANTE PROLIFERATIVA (PNP)
Fue reportada por primera vez en Canadá, como una enfermedad asociada a
problemas respiratorios, en crecimiento y engorde. Su diagnóstico se basa en
hallazgos histopatológicos, que incluyen necrosis bronquial y bronquiolar, células
necróticas, grandes macrófagos, material protéico en alvéolos, proliferación de
pneumocitos tipo II y bronquiolitis necrotizante.
Larochelle et al. 1994, considero al virus del PRRS como el agente primario o
predisponente. Recientemente Harding 2004, demostró la presencia de antígenos
para PCV en lesiones microscópicas típicas de PNP, sugiriendo un papel de gran
importancia en la enfermedad.
Pesch et al.2000, sugiere que la co-infección de PCV-2 y PRRS resultaría en la
aparición de la enfermedad. No obstante, Drolet et al. 2003, en su trabajo observó
la presencia de PRRS en el 92% de los casos y solo en el 42% se halló PCV-2,
así mismo, no se encontró PCV-2 en pulmones de animales con PNP en lactancia,
solo fue encontrado concomitantemente con PRRS. Es por esto, que Drolet,
acredita la presencia constante de PCV-2, en casos de PNP, es solo un reflejo de
la alta incidencia del agente en cerdos, sin presencia de signos. Y que la
presencia de circovirus no es esencial para la presentación de PNP, aunque
pueden contribuir a aumentar las lesiones.
Sin embargo, la presencia de PCV-2 en el núcleo de células epiteliales
bronquiales y bronquiolares, parece estar asociada a las lesiones en PNP.
Cuando el PCV-2 y el virus del PRRS se asocian, las lesiones macroscópicas del
primero no son distinguibles, pero la presencia de células epiteliales tumefactas en
las vías aéreas, infiltración linfohistiocítica y fibroplastia en la mucosa y
submucosa, son consideradas características de la infección por PCV-2 (Clark
1997).
1.9 FALLA REPRODUCTIVA
En Canadá, Estados Unidos de América y Europa, ya existen trabajos que asocian
el PCV-2 a la generación de fallas reproductivas, reportando: momia y abortos,
con cantidad variable de antígeno para el virus, en tejidos y en lesiones cardiacas
(miocarditis). También, se sugirió una posible transmisión vertical.
20
Por estudios retrospectivos, se llegó a la conclusión, que ésta podría ser una
nueva manifestación clínica de la enfermedad y que la transmisión vertical no es el
mecanismo primario para la diseminación del virus.
Al parecer el tropismo celular del virus muda dependiendo de la edad de infección,
es así que, a los 57 días de gestación, existen grandes cantidades del virus en
miocitos cardiacos y en menor cantidad en macrófagos y hepatocitos. Por otro
lado, en la fase final o después del nacimiento, se encuentra principalmente en
macrófagos y escaso en otros tejidos.
En lechones el antígeno de PCV-2 fue encontrado en el citoplasma de
macrófagos, monocitos y células de antígeno (Kupffer y dendréticas), raramente
se halló en el núcleo.
Al parecer, la infección intra-uterina en el momento del cruzamiento, debe ser de
importancia para el desenvolvimiento de los desordenes reproductivos, sin
embargo, Cariolet et al.2001, observó que, en inoculaciones intra-traqueales e
intra-musculares, el agente no cruzó la barrera transplacentaria.
Estudios con PCV-2 en fetos, soportan que el corazón debe jugar un papel
fundamental en la patogénesis de la infección. Sin embargo la falta de toma de
muestras en la necropsia de mortinatos y abortos, no permite la detección de
agentes y resultados histopatológicos.
Esto nos lleva a comprometernos, como médicos veterinarios e investigadores a la
toma de muestras y hallazgo de los agentes relacionados.
1.10 PROFILAXIS Y CONTROL
El único y más efectivo método de control, es la optimización de las medidas de
manejo, como la reducción de estrés y cualquier factor que pueda conllevar a la
alteración del estado inmunológico del animal, realización apropiada de vacíos
sanitarios, mejorar la nutrición, la utilización correcta del espacio (respetar los
metros cuadrados por animal, dependiendo de la fase en que se encuentren),
utilización correcta de desinfectantes apropiados con el tipo de virus, disminuir la
mezcla de animales de diversas edades, estas son solo algunas de las medidas
que pueden tomarse, es necesario realizar un examen preliminar en la granja con
un médico veterinario y encontrar donde se esta fallando, para prevenir la
circovirosis.
21
2. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años
ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus
siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction), la cual permite amplificar más de un
millón de veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma,
siempre y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta
técnica fue ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de
Química en 1993 por dicho invento.
Sin embargo, se debe hablar primero de biología molecular; esta es una ciencia
cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos procesos celulares
que contribuyen a que la información genética se transmita eficientemente de uno
ser a otro y se exprese en los nuevos individuos; este conocimiento nos permite
cruzar las barreras naturales que existen entre las especies y “colocar” genes de
un organismo otro llamado hospedero, empleando técnicas de ingeniería genética.
Gracias a este avance, se pueden producir fragmentos de ácidos nucleicos a gran
escala, abriendo así las puertas a la secuenciación de los ácidos nucleicos y por
ende a nuevas disciplinas como el diagnóstico molecular, la terapia génica o la
obtención de organismos superiores recombinantes.
Si pudiésemos regresar en el tiempo, nos encontraríamos con hechos que
contribuyeron en forma decisiva en el desarrollo de la biología molecular, por
ejemplo: en 1866 Mendel publica sus experimentos conducentes a los principios
de segregación y clasificación independiente de los genes. En 1869 Frederick
Miescher, científico suizo, descubre en el núcleo de las células una sustancia de
carácter ácido a la que llamó nucleína. En los años veinte el químico alemán
Robert Feulgen, utilizando una tinción específica descubrió que el ADN estaba
situado en los cromosomas. En 1944 Avery McCleod y Mc Carty comprueban que
el ADN es el portador de la información genética. En 1953 Watson y Crick
deducen la estructura del ADN
Este último hecho dio la pauta para nuevos descubrimientos que conducirían a lo
que se llama tecnología del ADN Recombinante
2.1 ESTRUCTURA DEL ADN
Hablando específicamente de ADN según el modelo de Watson y Crick, la
molécula está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos con polaridad
22
opuesta, unidas entre sí formando una doble hélice. Cada nucleótido está formado
por (Lewin 2004):
•
•
•
Molécula de azúcar (desoxirribosa).
Base orgánica nitrogenada: bases pirimidínicas (Citosina, Timina), bases
púricas (Adenina, Guanina).
Grupos fosfato.
Los nucleótidos se enlazan entre sí a través del grupo fosfato formando cadenas
muy largas, quedando las bases nitrogenadas en la parte central unidas cada una
al carbono 1 del azúcar formando un ángulo recto con su eje.
Las cadenas de polinucleótido que constituyen una molécula de ADN se
mantienen unidas entre sí gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre
las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que quedan
enfrentadas (Hillis, Moritz y Mabel 1996).
2.1.1 Estructura primaria. La estructura primaria viene dada por la secuencia de
nucleótidos. Cuando se quiere representar la secuencia de un oligonucleótido o de
un ácido nucleico, se representa mediante la terminología de cada una de las
bases. Por ejemplo: 5' -ATCCCAGCCCGATTAAAGCC-3’
Esta secuencia representa un oligonucleótido con veinte bases, de las cuales seis
son Adenina (A), tres son Timina (T), ocho son Citosinas (C) y tres son Guanina
(G).
El orden de la secuencia es muy importante, ya que en él reside la información
contenida en el ácido nucleico; la orientación viene dada en el sentido 5’ a 3’ o 3’
a 5’ ; el 5’ representa el extremo terminal del fosfato y el 3’ el extremo final del
átomo de carbono de la desoxirribosa (Lewin 2004).
2.1.2 Estructura secundaria. El DNA es una doble hélice antiparalela ya que el
enfrentamiento entre las bases nitrogenadas es constante; la Adenina siempre se
enfrenta con la Timina formando dos puentes de hidrógeno y la Guanina siempre
se enfrenta con la Citosina formando tres puentes de hidrógeno. Esta
característica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos
cadenas de la doble hélice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5’
a 3’, la otra lo hace en sentido 3’ a 5’ (Hillis, Moritz y Mabel 1996).
23
2.1.3 Estructura terciaria y cuaternaria. Recordemos que, una vez que la longitud
de una hebra de DNA humano es de varios metros, por necesidad debe adoptar
otras estructuras para poder estar en el interior de las células. Estas estructuras,
terciaria y cuarternaria, permiten el empaquetamiento del DNA formando los
cromosomas. En las células eucariotas existen varios cromosomas y en los
procariotas, existe un DNA empaquetado denominado pseudocromosoma (Bento,
S. 1997).
2.2 EL PRINCIPIO DE LA PCR
Como ya se sabe, muchas de las técnicas clásicas de la ingeniería genética
estaban encaminadas a resolver el complejo problema de cómo clonar o localizar
un gen o un segmento de ADN concreto "perdido" en la inmensidad del genoma.
Sin embargo, esas técnicas son a menudo largas y tediosas, y no es raro que no
den resultados. La PCR ha venido a cambiar el panorama, ya que permite en
principio producir in vitro grandes cantidades de una secuencia de ADN concreta
sin recurrir a la clonación en un organismo huésped. Esencialmente la técnica
permite la amplificación selectiva de cualquier trecho de ADN, supuesto que se
conocen las secuencias que lo flanquean. Como alguien ha dicho, "es una técnica
que consigue encontrar la aguja en el pajar, al tiempo que produce un pajar de
agujas por amplificación selectiva" (Einstein 1990).
Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos
que son complementarios a las zonas molde de la región que se quiere amplificar.
Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en inglés,
"primers") actúan como primeres para la síntesis in vitro de ADN la cual está
habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha enzima
se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus aquaticus, que es capaz
de crecer a temperaturas elevadas (> 85 º C). A esta temperatura, dicha enzima
es capaz de mantener una media de extensión de más de 60 nucleótidos por
segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura optima a la que actúa
la Taq polimerasa permite el uso de elevadas temperaturas para la unión de los
primers y para la extensión, de esta manera se aumenta el nivel de exigencia de la
reacción y se reduce la extensión de los primers unidos inespecíficamente al ADN.
2.3 PCR EN TEORIA
Cuando se amplifica un pequeño segmento de una cadena doble de ADN, el
primer fragmento deseado solo aparece en el tercer ciclo de PCR. La amplificación
del producto se realiza exponencialmente, como se describe en la ecuación 1
(Keohavong et al. 1989):
24
Nf = N0 (1+Y)n
Donde Nf es el numero de copias de la secuencia amplificada, después de n ciclos
de amplificación, N0 es el numero de copias iniciales del segmento albo en el ADN
muestra y Y es la eficiencia de la amplificación por ciclo.
Esta ecuación solo se aplica a la fase exponencial, la cual continua hasta que uno
de los componentes de la reacción se convierta en limitante. En una PCR
estándar, que contenga ~1 unidad de ADN polimerasa termoestable, la enzima se
vuelve limitante cuando el numero de copias de la secuencia albo, se aproxima a
1012. En este punto, la eficiencia de la reacción cae precipitadamente y el producto
se acumula geométricamente. Conociendo la cantidad de producto amplificado en
la fase exponencial, la eficiencia de esta reacción puede ser calculada por la
ecuación 2 (Sambrook y Russell 2001):
Y = [Nf / N0 ] 1/n – 1
Donde Y es la eficiencia de amplificacion por ciclo y Nf - N0 son el numero de
moleculas amplificadas producidas en n ciclos de la fase exponencial.
Conociendo el numero de copias inicial y la eficiencia de la reacción, el numero de
ciclos para obtener, un cierto numero de copias (ejemplo. 1012), puede ser
calculado. Por ejemplo cuando:
N0 = 3 x 1015 ;
Nf = 1012
y
Y = 70 %
La ecuación se convierte en:
Nf = N0 (1+Y)n
1012 = 3 x 1015 (1+0,7)n
Resolviendo la ecuación para n, el resultado son 28,6 (veintiocho) ciclos de la fase
exponencial son necesarios para generar 1012 moléculas del producto.
25
La eficiencia de la PCR esta determinada por la cualidad de la enzima, por la
naturaleza geométrica de la PCR, y las consecuencias de pocas cantidades de la
enzima son graves.
2.4 COMPONENTES DE LA PCR
2.4.1 Buffer de amplificación. Los buffer de PCR que se utilizan normalmente
contienen Tris –HCl, el cual da un pH entre 8.3 y 8.8 a temperatura ambiente; en
una PCR estándar es incluida a 10 mM. Cuando es incubada a 72ºC (temperatura
comúnmente de extensión en la reacción de PCR), el pH del mix cae más de una
unidad completa, produciendo un buffer con pH de ~7.2 (Sambrook y Russell
2001).
Tabla 1 - Número teórico de ciclos requeridos para generar 10 ng de un producto
de PCR con 200 pb.
NUMERO TEORICO DE CICLOS REQUERIDOS POR PCR
NUMERO DE SEGMENTO DE ADN INICIAL
Y
1
10
100
1000
10000
100000
1,00
34
30
27
24
20
17
0,95
35
32
28
25
21
18
0,90
36
33
29
26
22
18
0,85
38
34
30
27
23
19
0,80
40
36
32
28
24
20
0,75
42
38
33
29
25
21
0,70
44
40
35
31
27
22
0,65
46
42
37
33
28
23
0,60
49
45
40
35
30
25
0,55
53
48
43
37
32
27
0,50
57
52
46
40
35
29
0,45
62
56
50
44
38
31
0,40
69
62
55
48
42
35
0,35
77
70
62
54
47
39
0,30
88
79
71
62
53
44
0,25
104
93
83
73
62
52
0,20
127 114 102
89
76
64
0,15
165 149 132
116
99
83
0,10
242 218 194
170
145
121
Normalmente, estas soluciones contienen cationes monovalentes, en la mayoría
de los casos, 50 mM KCl, el cual trabaja bien para productos de PCR > 500 pb
(pares de bases) (Entrala 2000).
26
2.4.2 Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs). Las reacciones estándar contienen
cantidades equivalentes de dATP, dTTP, dCTP y dGTP. Las concentraciones que
suelen usarse están en torno a 200 - 250 µM para cada uno de ellos (Sambrook y
Russell 2001), en reacciones con Taq polimerasa contando con 1.5 mM MgCl2
(Sambrook y Russell 2001). En un volumen de reacción de 50 µl, con esta
concentración de dNTPs, se sintetizarían entre 6-6.5 µg de ADN. La concentración
de dNTPs y de MgCl2 va relacionada ya que el Mg se une a los dNTPs con lo que
concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la reacción al no tener la Taq
polimerasa suficiente Mg como para incorporar dNTPs (Prezioso 2006).
2.4.3 Cationes bivalentes. Todas las ADN polimerasas termoestables requieren
cationes bivalentes libres, usualmente MgCl2. El MgCl2 es el componente que más
influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son
necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como
cofactores de la polimerasa (Sambrook y Russell 2001).
La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean
concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es
necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo
origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente
hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.
Para optimizar la reacción, es sugerido comparar series de 10 PCRs que
contengan concentraciones de Mg2+ desde 0.5 mM a 5.0 mM, con incrementos de
0.5 mM. Algunas veces una segunda ronda de optimización es necesaria, usando
esta vez rangos de Mg2+, con incremento de 0.2 mM (Sambrook y Russell 2001).
2.4.4 Primers.
De los diferentes factores que influencian la eficiencia y
especificidad de la reacción de amplificación, el más crucial es el diseño de los
oligonucleotidos. La elaboración cuidadosa de los primers es necesaria para
obtener alta producción del producto deseado, suprimir amplificación de
secuencias indeseadas y facilitar la manipulación del producto amplificado. Dada
la importancia de los primers en el éxito o fracaso de la técnica, es irónico, que la
guía para la realización sea basada más en sentido común, que en el
entendimiento completo de la termodinámica o principios estructurales (Prezioso
2006).
La reacción estándar contiene entre 0.1 – 0.5 µM de cada primer (6 x 1012 a 3 x
1013 moléculas). Esta cantidad es suficiente para al menos 30 ciclos de
amplificación de un segmento con 1 kb. Concentraciones mas altas favorecen la
reacciones inespecíficas (Sambrook y Russell 2001).
27
A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado fragmento de ADN
hay una serie de reglas a seguir: La longitud de cada uno de los primers debe
estar comprendida entre 18 y 24 bases ya que se ha comprobado que primers de
mayor longitud (30-35 bases) no aumentan el rendimiento y los primers cortos
carecen de suficiente especificidad. Ambos primers deben tener una temperatura
de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”) similar (como mucho la
diferencia entre ambas temperatura debe ser < 5ºC). La relación bases púricas:
bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%). La secuencia de los
primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases púricas. Para evitar la formación
de dímeros de primers es necesario comprobar que los primers no contengan
secuencias complementarias entre sí (Prezioso 2006).
Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud
es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es
extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman
estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que
primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que
el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos
complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil
actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir
nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede
producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena
oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo 3'
con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero (Sambrook y
Russell 2001).
2.4.5 Taq-polimerasa. Las polimerasas son enzimas capaces de sintetizar DNA o
RNA “in Vitro”. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una
molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor
frecuencia son: DNA polimerasa I de E. Coli, el fragmento de Klenow,
transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para producir DNA), la DNA
polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y
T3 y la Taq polimerasa. La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño
cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a
partir de ese punto.
La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade
nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Existen
diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicación del ADN,
siguiendo el mismo método de síntesis. Se pueden clasificar como está descrito
en las tablas 2 y 3):
28
•
Tabla 2 - DNA polimerasas termolábiles: Tª óptima de 37-42ºC. Se
desnaturalizan con el calor (Mas et al.2001).
TIPO
5´-> 3´
polimerasa
5´-> 3´
exonucleasa
3´-> 5´
exonucleasa
•
DNA
polimerasa
(E. coli)
Fragmento
Klenow de
DNA
polimerasa (E.
coli)
T4 DNA
polimerasa
(E. coli)
DNA polimerasa
dependiente de
RNA (retrovirus)
Sí (baja)
Sí (baja)
Sí (medio)
Sí
Sí
No
No
Exorribonucleasa
Sí (baja)
Sí (baja)
Sí (alta)
Exorribonucleasa
Tabla 3 - DNA polimerasas termoestables: Tª óptima de 74 ºC. Resiste
durante 40-50´a 96ºC(Mas et al.2001).
Tipo
Taq DNA
polimeras (94
Kda)
Taq DNA
polimeras (61
Kda)
Replicasa
Tth
polimerasa
5´-> 3´
polimerasa
Sí
Sí
Sí
Sí
Sí
No
?
?
No
No
No
?
5´-> 3´
exonucleasa
3´-> 5´
exonucleasa
Inicialmente se usó el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y
cols., 1985) la cual posee actividad 3´-> 5´ exonucleasa que le proporciona la
capacidad de cambiar el nucleótido que ha sido erróneamente incorporado. La
importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicación
del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolábil por lo que no
soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR.
Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa. Es una enzima
termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas
temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la técnica de la
PCR, ya que ha permitido su automatización (desarrollo del termociclador).
Como se observa en las tablas anteriormente descritas, las polimerasas
termoestables, como la Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa,
lo que las hace menos seguras a la hora de comparar las fidelidades, pero,
actualmente, nuevas formas comerciales de DNA polimerasas termoestables
29
tienen dicha actividad correctiva 3´-> 5´. Por lo tanto, hay que intentar conseguir
las mejores condiciones para que ésta aumente.
Podemos citar Mas et al.2001:
•
•
•
No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al
número de estos.
La concentración de los deoxinucleótidos (dNTPs) debe ser igual para los 4
y debe ser la más baja posible para que permita conseguir la cantidad de
ADN necesaria.
Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.
Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias para la síntesis de ADN
están alrededor de 0.5 – 2.5 unidades por estándar 25 - 50 µl de volumen final de
reacción. La actividad especifica, de la mayoría de las preparaciones comerciales
de Taq es de ~80,000 unidades/mg de proteína. Comúnmente una PCR contiene
de 2 x 1012 a 10 x 1012 moléculas de enzima. Normalmente la eficiencia de la
extensión del primer con Taq polimerasa es generalmente ~0.7, la enzima se ve
limitada cuando, 1.4 x 1012 a 7 x 1012 moléculas, del producto se acumulan en la
reacción (Sambrook y Russell 2001).
La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración de dNTPs, de
Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas
de los mismos inhiben dicha actividad.
Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética de
la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de 50
mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que
se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq. Por
ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas
concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de
etanol (Sambrook y Russell 2001).
2.4.6 ADN molde o “template". Es el ADN del cual se quiere copiar un
determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como
molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas (Entrala 2000). La
cantidad de ADN necesaria para la PCR depende de varios factores:
•
Secuencia para Amplificar: Hay secuencias cuyos primers son más
específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor
optimizadas que las de otros. Por esta razón puede darse el caso que cierta
30
cantidad de ADN (sobre todo cuando se tiene con cantidades mínimas)
amplifique para unos marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en
un laboratorio se va a utilizar un nuevo marcador es necesario hacer un
estudio de validación en él que se incluye un estudio de sensibilidad. De
dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusión cuál es la
mínima cantidad de ADN que amplifica en condiciones estándar.
•
Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no
suele haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por
encima e incluso por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados (Entrala
2000). El problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la
idónea, bien porque esté degradado o bien porque dicho ADN vaya ligado a
una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la
polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de
restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a
depender de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no (Entrala
2000). En el caso de tener ADN sin degradar pero unido a una serie de
contaminantes habría que intentar diluir al máximo la muestra para
disminuir dichos contaminantes, pero siempre dentro de un rango de ADN
que no esté por debajo del límite de sensibilidad de la PCR.
2.5 DISEÑO DE LOS PRIMERS PARA PCR BASICA
El objetivo principal de los primers es la especificidad, la cual es dada solo cuando
cada miembro de los primers se une establemente a la secuencia albo del ADN a
examinar, por este motivo es crucial siempre tener en cuenta las siguientes
condiciones.
•
Composición de las bases. El contenido de G+C debe ser entre el 40% y el
60%, con distribución de las 4 bases a lo largo del primer, evitando de esta
manera trayectos polipurinicos o polipirimidinicos y repetición de
dinucleótidos (Prezioso 2006).
•
Largo. El primer debe tener entre 18 – 25 nucleotidos. Y entre los dos
primers no debe haber más de 3 pb de diferencia.
•
Repetición y secuencia autocomplementaria. No se deben encontrar
secuencias invertidas repetidas o secuencias autocomplementarias con
más de 3 pb (Prezioso 2006). Las secuencias de este tipo tienden a formar
31
estructuras “hairpin”, la cual no permitirá la unión del oligonucleotido al
ADN.
•
Complementariedad entre los primers. La secuencia terminal 3’ de los
primers no debe tener la posibilidad de unirse a ningún lugar del otro
primer. Ya que al encontrarse en grandes cantidades en la reacción de
PCR, una leve complementariedad llevará a la amplificación del primer, o
hasta la supresión de la amplificación del ADN blanco (Sambrook y Russell
2001).
•
Temperatura de fusión o annealing (Tm, “melting temperature”). Los
valores calculados de Tm entre los primers no deben diferir en > 5 ºC
(Prezioso 2006). La Tm del producto amplificado no debe diferir de la Tm de
los primers en >10 ºC.
•
Segmento terminal 3’. Este segmento es crucial y de preferencia debe ser
G o C. Primers con …NNCG o …NNGC 3’ terminal, no son deseables, ya
que promueve la formación de “hairpin”.
2.6 TEMPERATURA DE
TEMPERATURE”)
FUSIÓN
O
ANNEALING
(Tm,
“MELTING
Existen muchas ecuaciones para calcular Tm entre los primers y su segmento
complementario de ADN. Puesto que ninguno de éstos son perfectos, la opción
entre ellos es en gran parte una cuestión de preferencia personal. Sin embargo la
Tm de los primers debe ser calculada por la misma ecuación (Sambrook y Russell
2001).
•
The Wallace Rule (Suggs et al. 1981; Thein y Wallace 1986): Una ecuación
empírica y conveniente, que puede ser usada para duplicados perfectos de
15 – 20 nucleótidos de largo, en solventes altamente iónicos (ej. 1M NaCl):
Tm (in ºC) = 2 (A+T) + 4 (G+C)
Donde (A+T) es la suma de A y T en el oligonucleótido y (G+C) es la suma
de G y C en el oligonucleótido.
32
•
Ecuación de Bolton y McCarthy (1962) y modificada posteriormente por
Baldino et al. (1989), resuelve de una manera razonable la Tm de los
oligonucleótidos, con una cantidad entre 14 -17 nucleótidos y
concentraciones catiónicas de 0.4M o menos:
Tm (in ºC) = 81.5 ºC + 16.6 (log10[K+]) + 0.41 (%[G+C]) – (675/n)
Donde n es el número de bases en el oligonucleótido. Esta ecuación
también puede ser usada para calcular la Tm de un producto amplificado
del que se conozcan su secuencia y tamaño (Sambrook y Russell 2001).
2.7 CICLOS DE TEMPERATURA Y SU FUNCIÓN
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos, cada uno de los cuales incluye
tres fases o pasos: desnaturalización del ADN molde, unión de los primers al
segmento deseado en la cadena simple y extensión del primer unido por parte de
la polimerasa termoestable.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de
rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a
otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza
automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de
termocicladores (Figura 10) este factor se ha ido optimizando para hacerlo
mínimo.
Figura 10 –Termociclador MJ
Fuente: Research. PTC 200. Peltier
Thermal Cycle
2.7.1 Desnaturalización. Para que comience la reacción es necesario que el ADN
molde se encuentre en forma de cadena sencilla. La desnaturalización de esta
cadena, se encuentra en parte, determinada por la cantidad de uniones de G + C
que contenga (Shand 2003) Entre mayor sea la proporción de G + C, mayor
temperatura deberá ser utilizada para la separación de las cadenas. Dependiendo
33
de la longitud de la molécula de ADN, se requiere mayor o menor tiempo en esta
temperatura, para la separación completa de la cadena. Si el tiempo es muy corto
o la temperatura muy baja, solo las regiones ricas en A + T, se desnaturalizarán y
tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de
los primers y una posterior extensión (Shand 2003).
En PCRs catalizadas por la Taq ADN polimerasa, este proceso se lleva acabo de
94 a 95ºC, esta temperatura es la máxima que la enzima puede resistir por 30
ciclos o más, sin daño sustancial. En el primer ciclo, la temperatura se puede
sostener por 5 minutos para aumentar la probabilidad de separación de moléculas
grandes. Este tiempo es importante cuando se habla de virus con ADN circular o
con regiones ricas en G + C (>55%) (Shand 2003).
2.7.2 Hibridación. Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de
emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se
pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm,
“melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica
para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la
designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para
calcular Tm es la siguiente (Sambrook y Russell 2001).
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T)
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para
determinar su temperatura de annealing específica ya que si la temperatura es
muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es muy alta no se producirá
una unión completa.
Sin embargo, para optimizar las condiciones de unión se pueden realizar PCRs
con rangos de temperatura de 2 a 10ºC, por debajo del Tm calculada para los
primers.
2.7.3 Extensión. Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos en el
extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN previamente
desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de
72 - 78ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su máxima
actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para
34
fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de
1.2Kb (Shand 2003).
En los primeros dos ciclos, la extensión a partir de un primer procede la secuencia
complementaria al sitio obligatorio del otro. En el ciclo siguiente, se producen las
primeras moléculas de longitud igual al segmento del ADN delimitado por el sitio
obligatorio de los primers. Del tercer ciclo hacia adelante, este segmento del ADN
se amplifica geométricamente, mientras que los productos de la amplificación se
acumulan aritméticamente (Mullis y Faloona 1987).
El rango de polimerización de la Taq polimerasa es ~2000 nucleótidos/minuto a
una temperatura óptima (72 – 78 °C), y como regla general, la extensión se realiza
durante 1 minuto para cada 1000 pb del producto.
2.7.4 Número de ciclos. El número de ciclos requeridos para amplificación
dependen del número de copias del ADN molde, presentes al principio de la
reacción y de la eficiencia del primer y la Taq. Una vez está establecida la fase
geométrica, la reacción prosigue hasta que uno de los componentes se vuelva
limitante. En este punto, la amplificación del producto es máxima. Este es el caso
generalmente después de ~30 ciclos en PCRs que contengan ~105 copias de la
secuencia molde y una eficiencia de la Taq de ~ 0.7. Al menos 25 ciclos son
requeridos par tener un nivel aceptable de copias sencillas de la secuencia.
2.8 ADYUVANTES DE LA PCR
Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. Aunque
algunos autores han recomendado el uso del DMSO (Dimetil Sulfoxido) y del
glicerol, el adyuvante más extendido y utilizado es el BSA. A concentraciones por
encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una
proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
(Sambrook y Russell 2001).
La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las técnicas de análisis
genético utilizadas con anterioridad, como son: Su capacidad para obtener
resultados en casos en los que la cantidad de ADN es mínima o en casos en los
que el ADN esté parcialmente degradado (Gibbs 1990). Genera en un espacio
corto de tiempo un elevado número de copias de la secuencia de ADN que es
objeto de estudio, lo cual permite utilizar técnicas de visualización más sencillas y
rápidas que el uso de sondas marcadas radioactivamente (Erlich et al. 1991).
Permite la determinación y agrupación alélica en clases discretas, lo que facilita la
35
elaboración de bases de datos al ser la estandarización inmediata y posibilitar la
aplicación de métodos bioestadísticos y programas elaborados.
El uso de marcadores microsatélites de pequeño peso molecular aumenta las
probabilidades de obtener resultados positivos de amplificación cuando el ADN se
encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido
digeridos (Erlich et al. 1991).
Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR, que es su elevada
sensibilidad puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se
podría coamplificar un ADN extraño o ajeno al que nos interesa (Arnheim y Erlich
1992). Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en
función de su tamaño por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se
utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Genética Forense
(Entrala 2000):
2.9 INHIBIDORES DE PCR
Casi todo puede inhibir la PCR si se presenta en exceso. Los agentes mas
comunes son: proteinasa K (degrada la ADN polimerasa), fenol, y EDTA. Otras
sustancias que pueden causar problemas son los detergentes iónicos (Weyant et
al. 1990), heparina (Beutler et al. 1990), polianiones, hemoglobina, azul de bromo
fenol (Hoppe et al. 1997). Muchos de los problemas se pueden solucionar
limpiando la muestrra de ADN con diálisis, precipitación por etanol, extracción con
cloroformo o cromatografía.
36
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 LOCALIZACIÓN
Laboratorio de Biología Molecular Aplicada y Serología (LABMAS) del
Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva y Salud Animal (VPS), de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ), de la Universidad de São
Paulo (USP). São Paulo, Brasil.
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
3.2.1 Muestras de tejido porcino. Se utilizaron en total 17 muestras de pools de
bazo, hígado y riñones de porcinos provenientes de piaras localizadas en los
estados de São Paulo, Minas Gerais y Santa Catarina, Brasil (muestras AL 04/04,
AL 05/04, AL 07/04, AL 08/04, AL 09/04, AL 10/04, AL 13/04, AL 15/04, AL 17//04,
AL 20/04, AL 1/02, AL 2/02, AL 4/02, AL 6/02, AL 13/02 , AL 14/02 y AL 3/02).
Dichas muestras eran positivas para la presencia de PCV-2 (Castro, 2005). Las 17
muestras fueron utilizadas como controles positivos para las PCRs.
También se analizaron las muestras 10P y 10L, suspensión de riñones y lesiones
de piel, de dos animales sospechosos del Síndrome Dermatitis Nefritis Porcina
(PDNS).
3.2.2 Muestras de suero porcino. Para la fase de aplicación de las PCRs, para
PCV-2, se utilizaron 16 muestras de suero porcino, disponibles en el VPS-FMVZUSP (muestras m 311/05 4, m 311/05 7, m 311/05 9, m 311/05 10, m 311/05 11, m
311/05 12, m 311/05 13, m 311/05 14, m 311/05 15, m 311/05 16, m 311/05 17, m
311/05 20, m 311/05 21, m 311/05 22, m 311/05 23, m 311/05 24). Dichas
muestras no habían sido examinadas para PCV-2.
3.3 VARIABLES
Se evaluó la positividad o negatividad de las muestras por una PCR.
37
3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se aplicó análisis estadístico no paramétrico utilizando en especial porcentajes de
número de animales positivos para PCV-2 por una PCR.
3.5 MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS
3.5.1 Extracción de ADN. El ADN fue extraído de las muestras, tanto de los pools
como del suero y de los controles negativos, en conformidad con la metodología
descrita por Chomkcynski et al. (1993).
Se homogenizaron 200µl de la muestra con 600µl de GT (Guanidine
Isothiocyanate + fenol (pH= 8) y se mezclaron por 10 segundos (seg) en un vortex
mixer (después de cualquier procedimiento que incluya la mezcla de dos
substancias se agita la muestra por 10 seg). Posteriormente se incubaron las
muestras por 10 minutos (min), a temperatura ambiente.
Después se adicionaron 100µl de Cloroformo, agitándose e incubándose por 10
minutos.
Concluido este tiempo se llevaron las muestras a la centrífuga (Figura 11),
siempre a rcf (Fuerza Centrífuga Relativa) de 12.000 x g (gravedades) a 4ºC, por
10 min, transfiriéndose el sobrenadante (± 400µl) para otro tubo eppendorf con
600µl de Propanol; se agita y se deja a -20ºC por 2 horas.
Figura 11 –Centrífuga Eppendorf 5804 R.
Luego se centrifugó por 20 min y se descartó el sobrenadante; en esta etapa del
proceso ya es posible observar la condensación de ADN (pellet) en el fondo del
tubo. Se adicionaron 500µl de Etanol al 70%, mezclándose y centrifugándose de
nuevo por 10 min. Se descartó el sobrenadante con cuidado para no perder el
pellet y se llevaron las muestras a baño seco (56ºC), por un máximo de 10 min.
38
Al final, se resuspendió el pellet en 20µl de água ultrapura esterilizada, se agitó e
incubó a 56ºC por 15 min (Figura 12), seguidos de nueva agitación y suave
centrifugación.
Figura 12 –Baño seco, Thermolyne.
Type 16500 Dri-Bath.
El ADN extraido de esta forma fue congelado a -80ºC hasta la realización de los
pasos a seguir.
3.5.2 Reacción en cadena de la polimerasa para el gen de la proteína del cápside
(PCR-CAP). Se evaluó la aplicabilidad de una PCR especifica para el PCV-2
dirigida al gen codificador de la proteína de cápside del virus, según descrito por
Yu et al. (2005) para la amplificación de un segmento de 986 pares de bases.
La secuencia de los primers CapF y Cap R es la siguiente:
•
•
CapF (senso): 5' GGAGTCAAGAACAGGTTTGGGTG 3'
CapR (anti-senso) 5' AGACTCCCGCTCTCCAACAAG 3'
Se seleccionó una de las 17 muestras al azar (AL 08/04) y se realizaron diluciones
(1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:100.000), en Suero Fetal Bovino (SFB)
(CULTILAB® Brasil) y en agua ultra-pura autoclavada, para observar la sensibilidad
analítica de la prueba.
•
Condiciones 1. Se sometieron a estas condiciones tanto las 17 muestras
de suspensión de tejido como las diluciones de la muestra AL 08/04 en SFB
y agua ultra-pura y los 16 sueros porcinos disponibles en el VPS-FMVZUSP, estos últimos con el objetivo de entrar en la fase de validación. Como
controles negativos, se utilizaron SFB y agua ultra-pura.
39
Los componentes, concentraciones y volúmenes para la PCR se muestran
en la tabla 4 y las condiciones del termociclador en la tabla 5, con 40 ciclos.
Tabla 4- Condiciones 1: Componentes, concentraciones y volúmenes para
PCR-CAP.
COMPONENTES
CONCENTRACIÓN
VOLUMEN (µL)
ADN extraído (según item 3.5.1)
2,5
10x PCR Buffer
2,5
dNTPs
1,25mM
4
MgCl2
50mM
0,75
Primer Cap F
10µM
2,5
Primer Cap R
10µM
2,5
TAQ ADN polimerasa
2,5 Und.
0,5
Agua ultrapura
9,75
VOLUMEN TOTAL: 25 µL
Tabla 5- Condiciones 1 del termociclador para PCR-CAP.
•
ACCIÓN
TEMPERATURA (ºC)
TIEMPO DE DURACIÓN
Desnaturalización inicial
94
4 min
Desnaturalización de ADN
94
30 seg
Hibridación
63
45 seg
Polimerización del ADN
72
1 min
Extensión final
72
10 min
Condiciones 2. Después de los resultados obtenidos con las Condiciones
1, se realizaron las modificaciones contempladas en la tabla 6 (en azul),
junto con el aumento de la temperatura de hibridación (66ºC), esto con el
objetivo de disminuir las amplificaciones inespecíficas y mejorar los
resultados en la fase de aplicación, aplicándose dichas condiciones a 8
muestras de suero porcino (m 311/05 4, m 311/05 9, m 311/05 10, m
311/05 11, m 311/05 13, m 311/05 14, m 311/05 17, m 311/05 22)
disponibles en VPS-FMVZ-USP, las muestras 3/02 y 15/04 (controles
positivos) y agua ultra-pura y SFB (controles negativos).
40
Tabla 6- Condiciones 2: Modificaciones en los volúmenes para PCR-CAP.
COMPONENTES
CONCENTRACIÓN
VOLUMEN (µL)
ADN Extraido
2,5
10x PCR Buffer
2,5
dNTPs
1,25mM
4
MgCl2
50mM
0,75
CAP F
10µM
1,25
CAP R
10µM
1,25
TAQ ADN polimerasa
2,5 Und.
0,25
Agua ultrapura
12,5
VOLUMEN TOTAL:
25 µL
•
Condiciones 3. Con el mismo propósito de disminuir las reacciones
inespecíficas, se realizaron otras modificaciones el la PCR-CAP, retornando
la temperatura de hibridación a 63ºC, pero con las mismas cantidades de la
tabla 6 y las mismas muestras de las Condiciones 2.
•
Condiciones 4. Con el objetivo de aumentar la concentración de la banda
amplificada por la PCR-CAP, se aumentó en un 25% la Taq ADN
polimerasa (0,375µl) y se realizó otra PCR-CAP (tabla 7), con las
condiciones de termociclador ilustradas en la tabla 5, utilizandose las
muestras m 311/05 4, m 311/05 9, m 311/05 10, m 311/05 11, m 311/05 17,
m 311/05 22, 10P y 10L.
Se aplicaron estas condiciones también a las diluciones 1:10 H2O, 1:100
H2O, 1:100 SFB, 1:1.000 SFB, 1:10.000 SFB, 1:20.000 SFB de la muestra
AL 08/04.
Tabla 7- Condiciones 4: Modificación en el volumen de la TAQ ADN
polimerasa para PCR-CAP.
COMPONENTES
CONCENTRACIÓN
VOLUMEN (µl)
ADN Extraido
2,5
10x PCR Buffer
2,5
dNTPs
1,25mM
4
MgCl2
50mM
0,75
CAP F
10µM
1,25
CAP R
10µM
1,25
TAQ ADN polimerasa
2,5 Und.
Agua ultrapura
0,375
12,375
VOLUMEN TOTAL: 25 µl
41
3.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa para la región entre los orfs 1 y 2
(PCR-U). Se evaluó la aplicabilidad de una PCR específica para el PCV-2, con el
objetivo de compararla con la PCR-CAP, dirigida a la amplificación de un
segmento de 476 pares de bases para una región localizada entre las ORFS 1 y 2
del PCV-2, entre los nucleótidos 1584 y 828 del genoma del virus según describió
Castro (2005).
La secuencia de los primers Fa2 y Ra2 es la siguiente:
•
•
Fa2 (senso , ORF-1): 5' ATTACCAGCAATCAGACCCCGT3'
Ra2 (antisenso, ORF-2): 5'CAACCCTTCTCCTACCACTCC3'
Las condiciones de la reacción y del termociclador se encuentran explicadas en
las tablas 8 y 9 respectivamente.
Tabla 8- Componentes, concentraciones y volúmenes para PCR-U.
COMPONENTES
ADN Extraido
10x PCR Buffer
dNTPs
MgCl2
Primer Fa2F
Primer Ra2
TAQ ADN polimerasa
Agua ultrapura
CONCENTRACIÓN
VOLUMEN (µl)
2,5
2,5
1,25mM
4
50mM
0,75
10µM
2,5
10µM
2,5
2,5 Und.
0,15
10,1
VOLUMEN TOTAL: 25 µl
Tabla 9- Condiciones del termociclador para PCR-U.
ACCIÓN
Desnaturalización
inicial
Desnaturalización de
ADN
Hibridación
Polimerización del
ADN
Extensión final
TEMPERATURA (ºC)
TIEMPO DE
DURACIÓN
95
5 min
95
30 seg
51
30 seg
72
30 seg
72
5 min
42
Se sometieron a estas condiciones tanto las diluciones en SFB (1:10, 1:100,
1:1.000, 1:10.000, 1:100.000), como las de agua, de la muestra AL 08/04 y 2
muestras pool (10P y 10L, suspensión de riñones y lesiones de piel, de dos
animales sospechosos del Síndrome Dermatitis y Nefritis Porcina)
Como fase de aplicación los 9 sueros porcinos (m 311/05 4, m 311/05 7, m 311/05
9, m 311/05 10, m 311/05 11, m 311/05 17, m 311/05 22, m 311/05 23, m 311/05
24) también se analizaron bajo las mismas condiciones PCR-U. Como controles
negativos, también se incluyeron SFB y agua ultra-pura.
43
4 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN Y APLICACIÓN
4.1 RESULTADOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
PARA EL GEN DE LA PROTEÍNA DE LA CÁPSIDE (PCR-CAP)
Para facilitar el entendimiento de los resultados, estos fueron divididos según las
condiciones enunciadas en el numeral 3.5.
4.1.1 Condiciones 1. Todas las muestras de pool dieron la banda esperada de
984 pb. La electroforesis de las diluciones (1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000,
1:100.000) de la muestra AL 08/04, en SFB mostró positividad hasta 1:10.000
(Figura 13). Las diluciones de la muestra, AL 08/04, en agua ultra-pura
autoclavada, dio como resultado una sensibilidad de 1:10 (Figura 14).
Al comparar los dos resultados se encontró que la sensibilidad de la PCR-CAP, es
mayor en el suero (1:10.000) que en el agua (1:10). Con estos resultados de la
fase de validación, se sometieron a las condiciones 1 los sueros porcinos.
Figura 13- Electroforesis de diluciones en SFB de la muestra AL 08/04 con PCRCAP. Marcador Tamaño Molecular 100pb = MTn. (Control negativo (N)= SFB;
Control positivo (+)=AL 08/04
MTn
+
10 100
1,000
984 pb
MTn
10,000
100,000
N
44
Figura 14- Electroforesis de diluciones en ultrapura de la muestra AL 08/04 con
PCR-CAP. (Control negativo (N3)= ultrapura autoclavada; Control positivo (+)=AL
08/04).
MTn
+
10 100 1,000
984 pb
10,000 20,000 100,000 N3
MTn
La realización de la PCR-CAP en 16 sueros porcinos (m 311/05 4, m 311/05 7, m
311/05 9, m 311/05 10, m 311/05 11, m 311/05 12, m 311/05 13, m 311/05 14, m
311/05 15, m 311/05 16, m 311/05 17, m 311/05 20, m 311/05 21, m 311/05 22, m
311/05 23, m 311/05 24), disponibles VPS-FMVZ–USP (Figura 15 y 16) y de las
muestras 10L y 10P, mostró gran cantidad de amplificaciones inespecíficas y
ninguna resultó positiva para la presencia de PCV-2. Por este motivo, se decidió
realizar cambios en las condiciones de la PCR y con esto mejorar la fase de
aplicación. Cuanto a los controles negativos (SFB y agua ultra-pura) no se observó
ninguna banda.
Figura 15- Sueros porcinos 1 (Fase de aplicación PCR-CAP). (Control negativo
(N1)= ultrapura autoclavada; Control positivo (+)= AL 3/02).
MTn
4
7
9
10
11 12
13
14 N1
+
984 pb
45
Figura 16- Sueros porcinos 2 (Fase de aplicación PCR-CAP). (Control negativo
(N2)= ultrapura autoclavada; Control positivo (+)= AL 3/02; Control positivo
(15/04)= AL 15/04).
MTn
15 16
17
20
21 22
23 24
N2
15/04
NEG +
984
4.1.2 Condiciones 2. Las modificaciones contempladas en la tabla 7, junto con el
aumento de la temperatura de hibridación (66 ºC), dieron como resultado la
desaparición de las reacciones inespecíficas en las 8 muestras de suero, pero
también disminuyó la detección de PCV-2 en las muestras de tejido, ya que
solamente se detectó la banda esperada (984pb) en la muestra 3/02 y no en la
15/04 (Figura 17).
Figura 17- Electroforesis realizada con las condiciones 2. (Control negativo
(NEG)= ultrapura autoclavada; Control positivo (3/02)= AL 3/02; Control positivo
(15/04)= AL 15/04).
MTn
4
MTn
9
10 11
13 14
17 22 15/04 3/02 NEG
984 pb
46
4.1.3 Condiciones 3. Al retornar la temperatura de hibridación a 63 ºC, con las
mismas cantidades de la tabla 7, dieron como resultado los mismos que para las
Condiciones 2.
4.1.4 Condiciones 4. Al aumentar en un 25% la Taq ADN polimerasa (0,375µl) y
mantener las condiciones de termociclador ilustradas en la tabla 6, los resultados
en la electroforesis mejoraron al mostrar de nuevo positividad para la muestra AL
15/04 (Figura 18) y por primera vez una banda debil en la muestra 10L, aunque las
reacciones inespecíficas reaparecieron en 3 (m 311/05 4, m 311/05 10, m 311/05
22) de las 6 muestras de suero y en la muestra 10P.
Se realizó una PCR-CAP con las condiciones 4, a las diluciones 1:10 H2O, 1:100
H2O, 1:100 SFB, 1:1.000 SFB, 1:10.000 SFB, 1:20.000 SFB y se utilizó como
control positivo la muestra AL 08/04 (Figura 19).
Figura 18- Electroforesis realizada con las condiciones 4. (Control negativo (N)=
ultrapura autoclavada; Control positivo (3/02)= AL 3/02; Control positivo (15/04)=
AL 15/04).
MTn
4
9
10
11
17 15/04
984 pb
MTn 3/02
22
10P 10L N 15/04
984 pb
47
Figura 19- Electroforesis realizada con las condiciones 4, para diluciones 1:10 y
1:100 en H2O y 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:20.000 en SFB. (Control negativo (N)=
ultrapura autoclavada; Control positivo (+)= AL 08/04.
MTn
10
100 100 1.000
H2O H2O SFB SFB
+
984 pb
MTn
10.000 20.000
SFB SFB
N
+
984 pb
La positividad de la prueba disminuyó significativamente en las diluciones en SFB,
ya que no se detectó el virus en ninguna de las diluciones. La positividad en agua
fue la misma (1:10).
4.2 RESULTADOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
PARA LA REGIÓN ENTRE LOS ORFS 1 Y 2 (PCR-U)
La prueba mostró una positividad en las diluciones en SFB de 1:100.000 y en
agua de 1:1.000 (Figura 20). Las muestras 10L y 10P mostraron positividad
(Figura 20). Las reacciones referentes a los controles negativos no presentaron
bandas.
En la fase de aplicación todas las muestras de suero mostraron reacciones
inespecíficas sin reacciones especificas, o sea, fueron negativas para PCV-2
(Figura 21).
48
Figura 20- Electroforesis PCR-U 1 para diluciones 1:10 y 1:100 1:100 en H2O y
1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:20.000 en SFB. (Control negativo (N)= ultrapura
autoclavada; Control positivo (+)= AL 08/04 y 3/02; 10P y 10L muestras pool de
Castro.
MTn
10P
10L
100 1,000 10,000
SFB
SFB SFB
N
3/02
476 pb
MTn
20,000 10
SFB
H2O
100
H2O
1,000
H2O
N
N
N
08//04
476 pb
Figura 21- Electroforesis PCR-U 1 para diluciones 1:10.000, 1:20.000 y 1:100.000
en H2O y 1:100.000 en SFB. (Control negativo (N)= ultrapura autoclavada; Control
positivo (+)= AL 08/04 y 3/02; MD= Muestras Diferentes).
MTn
100.000
SFB
10,000
20,000 100.000
H2O
H2O
H2O
08/04
4
7
9
10
N
476
MD
MTn
3/02
11
17
22
23
24
476 pb
49
5 DISCUSIÓN
En el presente trabajo se investigó la aplicabilidad de una PCR para PCV-2 en
sueros porcinos, para este propósito se utilizaron dos (2) diferentes pares de
primers específicos para PCV-2.
En la PCR-CAP los resultados de 984 pb, en los pools, mostraron la eficacia de
los primers, al amplificar la secuencia del tamaño esperado.
Al comprar los resultados de las diluciones en agua y en SFB es evidente que la
sensibilidad de la prueba es mayor en el segundo. Esto puede estar determinado
por el efecto cargador de ADN (Meinkoth y Wahl, 1984; Maniatis, 1989) que existe
en el SFB. En el suero encontramos grandes cantidades de ADN, el cual se
precipitará en la etapa de extracción, favoreciendo la precipitación de una mayor
cantidad de ADN viral; por el contrario el agua autoclavada ultra-pura, no posee tal
efecto al encontrarse libre de patógenos y células en general por los procesos a
los que es sometida.
La aplicación de la prueba en los sueros y las muestras 10P y 10L, mostró una
gran cantidad de bandas inespecíficas, lo cual podría estar explicado al tomar en
cuenta la gran cantidad de ADN que se encontraban en las muestras, una posible
pérdida de sensibilidad o el hecho de las muestras ser negativas. La última de las
opciones, parece ser la que es más razonable, ya que al ser negativa las
muestras, los componentes de la PCR amplifican fragmentos errados y llevan a la
visualización de fragmentos inespecíficos.
Cuando se variaron las condiciones de la PCR-CAP por primera y segunda vez,
aunque las amplificaciones inespecíficas de los sueros desaparecieron, la prueba
perdió sensibilidad al desaparecer una de las bandas en una muestra control. Esto
esta explicado al notar que las variaciones en la temperatura de hibridación
(aumento de 63ºC a 66ºC), cantidad de primer (disminución de 2,5µL a 1,25µL) y
de Taq ADN polimerasa (disminución de 0,5µL a 0,25µL) aumentaban la
especificidad de la prueba aumentando el riesgo de falsos negativos. Como
ocurrió al no aparecer la banda de la muestra 15/04.
La disminución de la Taq ADN polimerasa en un 25% respecto a la cantidad inicial
(0,5µL), con la cantidad de primer citada anteriormente (1,25µL) y temperatura de
hibridación de 63ºC, llevo a la reaparición de la banda de 984pb de la muestra AL
15/04, lo cual nos mostró un aumento en la sensibilidad, esto gracias al aumento
50
en la Taq respecto a las condiciones 2 y 3. La amplificaciones inespecíficas en 3
de las muestras de suero, pueden ser indicativas de la disminución de la
especificidad, respecto a las condiciones 2 y 3, al permitir una mayor cantidad de
enzima y primer en muestras negativas.
Al evaluar las diluciones en suero y agua, con estas condiciones, es evidente la
disminución de la sensibilidad, respecto a las condiciones 1 de la PCR-CAP, esto
debido al cambio en la cantidades de primer y Taq, las cuales aumentaron la
especificidad analítica pero disminuyeron la sensibilidad, creando la posibilidad de
una alta cantidad de falsos negativos.
En la PCR-U los resultados de 476 pb, en los pools, mostraron la eficacia de los
primers, al amplificar la secuencia del tamaño esperado.
Se evaluaron las diluciones en SFB y en agua, de la misma extracción de la PCRCAP. La sensibilidad alcanzada en las diluciones en agua fue de nuevo menor que
las de SFB, posiblemente por el efecto cargador.
Las muestras de tejido 10P y 10L mostraron positividad, al ser visible en la
electroforesis la banda esperada de 476 y encontrarse en la misma posición que la
banda de control positivo.
La aplicación de la PCR-U en los sueros mostró una banda inespecífica de la
misma altura en todas las muestras de suero, para esclarecer la presencia de
estas bandas es apropiado realizar el secuenciamiento de estas y observar a que
corresponden, para descartar la posibilidad de una variación en el segmento de
PCV-2 que se buscaba o si este evento se trata simplemente de un gen que se
encuentra en el genoma de los porcinos.
Al comparar la PCR-CAP y la PCR-U, es evidente que esta última posee mayor
sensibilidad tanto en agua como en SFB, esto puede ser debido a la diferencia en
la cantidad de pares de bases para amplificar. Para la PCR-CAP son 984 pb, en
comparación con 476 pb en la PCR-U; ya que un segmento menor de pares de
bases se encuentra bioquímicamente favorecido. Además, un segmento extenso
es apropiado para el secuenciamiento de un gen y uno pequeño para el
diagnóstico, sin contar con que la reacción más eficiente es la segunda.
Las muestras 10P y 10L, originarias de riñones de porcinos sospechosos de
síndrome dermatitis nefritis porcina, mostraron positividad (476 pb) en la PCR-U,
sin amplificaciones inespecíficas, mientras que en la PCR-CAP solo la 10L mostró
51
la banda esperada, aunque bastante suave, lo cual proponía la posibilidad de
presencia de ADN viral y la muestra 10P solo mostró reacción inespecífica. Esta
diferencia entre las dos pruebas puede estar dada por la diferencia en la
sensibilidad de la prueba; sin embargo, queda demostrada la presencia del PCV-2
en dichas muestras.
Sumándose los resultados hasta ahora presentados con las discusiones
expuestas anteriormente, queda claro que la PCR más efectiva para la detección
de PCV-2 en sueros porcinos es la PCR acá nombrada PCR-U, pues la misma
posee mayor sensibilidad analítica y menor producción de bandas inespecíficas.
En cuanto a la aplicación de las PCR a una población de sueros porcinos, la
frecuencia de ocurrencia de PCV-2 fue de 0%, una vez que no se detectó ninguna
de las muestras como positiva. Una de las posibilidades, además de la de ser
estos porcinos realmente libres de PCV-2, es que los animales muestreados no
estuvieran en viremia cuando fueron tomados los sueros, aún que tuvieran el virus
en otras partes de su organismo. En apoyo a esta hipótesis, se ha reportado que
la viremia en porcinos dura desde la séptima hasta la dieciseisava semana de
vida (França et. al., 2005).
Además, la frecuencia de detección de PCV-2 en sueros porcinos es muy variable
(Calsamiglia et. al, 2002; LIU et. al., 2002).
Por último, hay que considerar que las PCRs empleadas en la presente
investigación, aunque teóricamente hayan sido demostradas como sensibles,
pueden haber fallado en detectar bajos títulos de PCV-2 en los sueros estudiados.
Al no tener los antecedentes de los porcinos muestreados, la toma de muestras se
dio al azar, pudo haber repercutido en la probabilidad de detección de animales
virémicos. Así, es interesante que se asocie la PCR-U con las observaciones
clínicas como adelgazamiento progresivo, ictericia, vomito, tos, lesiones en piel y
diarrea, comúnmente asociados a infecciones por PCV-2 (Calsamiglia et. al, 2002)
para la toma de muestras en estudios seroepidemiológicos.
El presente trabajo abre las puertas a investigaciones futuras acerca del estado
epidemiológico de una región o una población de porcinos en cuanto al PCV-2 se
refiere, ya que el empleo de una PCR en suero puede brindar informaciones
válidas para el control de enfermedades a las cuales este virus ha estado
asociado.
52
CONCLUSIONES
•
Se validó una técnica de reacción en cadena por la polimerasa (PCR) para
detección de circovirus porcino tipo 2 (PCV-2) en sueros de porcinos.
•
Pools de órganos positivos o sospechosos para PCV-2 son una fuente
efectiva de virus para validación de técnicas de PCR.
•
Diluciones de muestras de tejido 1:10 y 1: 10.000 en água y suero fetal
bovino, respectivamente, resultaron positivas para PCV-2 utilizando la PCR
para el gen de la proteína de la cápside, mientras que para la PCR dirigida
a la región entre las ORFs 1 y 2 estos valores fueron 1:1000 y 1: 100.000,
respectivamente.
•
La aplicación de PCR en muestras de suero porcino para detección del
PCV-2 demostró ser otra alternativa para el seguimiento epidemiológico de
la enfermedad, aunque en el presente trabajo el 100% de animales fueron
negativos.
53
RECOMENDACIONES
Es importante que la reacción de PCR que se validó en la presente investigación
sea aplicada a una más amplia y diversificada población de porcinos, con el intuito
de tomar informaciones epidemiológicas que puedan ayudar en el control de las
enfermedades asociadas al Circovirus porcino 2.
Es aconsejable que, a continuación de este o de similares estudios, se realice la
secuenciación de amplificaciones inespecíficas, para elucidar su origen, y de
amplificaciones específicas, par la comparación entre diversas cepas de PCV-2.
El sector de la porcicultura precisa de más investigaciones en el área de salud y
prevención para que se pueda incrementar la producción y generar mayor
consumo de carne porcina.
Se invita a una mayor comunicación entre el sector productivo y los investigadores
para entender mejor las necesidades de los porcicultores y realizar investigaciones
que conlleven a una rentabilidad mejor.
Se recomienda que el Gobierno, las Universidades, las Instituciones de
Investigación y las asociaciones de porcicultores desarrollen proyectos conjuntos y
amplíen los convenios nacionales e internacionales, para incrementar el desarrollo
del sector.
54
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