metodos_estudio_interaccion_planta_patogeno

UFSC
CC
V
LABFITOP
ESTUDIO DE LAS
INTERACCIONES PLANTAHONGOS PATOGÉNICOS
Marciel J. Stadnik
Preguntas? > Respuestas
ƒ Cual órgano y tejido es infectado por el hongo?
ƒ Como ocurre la infección? directa o indirecta?
ƒ Cuales células del huésped son colonizadas?
(epidermis, mesófilo, etc.)
ƒ Cuáles son los mecanismos involucrados con
la defensa de la planta contra el hongo?
Clase I - conceptos
[email protected]
Clasificación de hongos:
ƒ Cuanto a la relación parasitaria:
ƒ Parásitos obligados: Ciclo de vida ocurre
exclusivamente en el tejido vivo del huésped
ƒ Parásitos no obligados
ƒ Saprófitos facultativos
ƒ Patógenos facultativos
Clasificación de hongos
Cuanto a las relaciones nutricionales (Luttrell,1974):
ƒ Necrotrófico (Pertotrofico): patógeno mata
las células do huésped antes de colonizarlas
ƒ Alternaria spp.
ƒ Hemibiotrófico: patógeno forma inicialmente una asociación
con células vivas del huésped, y mas tarde se vuelve
necrotrófico
ƒ Ex: Colletotrichum spp.
ƒ Biotrófico: patógeno se nutre de tejido vivo
ƒ Oídios, Rojas
Características
organismos biotróficos
ƒ estructuras de infección altamente
desarrolladas
ƒ baja actividad de enzimas líticas
ƒ camadas interfaciales que separan las
membranas plasmáticas del hongo y planta
ƒ mecanismos de supresión de defensa del
huésped
ƒ haustórios
(Mendgen & Hahn, 2002).
1
Modo de infección y
colonización
Rojas
(biotróficos del mesófilo)
ƒ Rojas (basidiomycota)
ƒ Oídios (ascomycota)
ƒ Colletotrichum lindemuthianum y
Colletotrichum gloeosporioides
ƒ = presentan diferentes tipos y grados de
desarrollo biotrófico.
Uromyces appendiculatus
Formación de apresório en
respuesta a características
topográficas
Allen et al. (1991)
Roja de la soja
(Phakopsora pachyrhizi)
Penetración directa !
Microscopía de luz
ƒ Tests in vitro sobre papel celofán
Koch et al. (1983)
2
Análisis inmunocitológicas y geles
Padrón de expresión de ARD1
- Arabitol Desidrogenase
(A) Representación de las
estructruras de infección de la
roja: 1, uredósporo (SP); 2, tubo
germinativo (GT) 4 h después de
la germinación; 3–6, estructuras de
infección in vitro en estadíos
siguientes: 3, apresório (AP) (6 h);
4, vesícula subestomatal (SV) (12
h); 5, hifa de infección (IH) (18 h);
6, célula-madre haustorial (HM)
estadío (21 h); 7, haustório (HA);
8, hojas infectadas; 9, no
infectadas (estructuras 2–6 obtidas
in vitro).; NB, gola do pescoço;
EM, matriz extrahaustorial.
(B) Gele de agarosa
(C) Northern blot de geles
descritos en (B).
Link et al. (2005)
Oídios
(biotróficos de la epidermis)
Blumeria graminis
Proceso de infección de
Blumeria graminis
MICROSCOPÍA DE
FLUORENCIA
MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA DE
VARREDURA
COMPUESTOS FENÓLICOS
SUPERFICIE
Microscopia de
fluorescencia (MF)
ƒ Luz incidente 100 a 400nm
ƒ Filtro antes de la lente objetiva permite apenas
el pasaje de luz excitada
ƒ Componentes autofluorescentes (ex.
compuestos fenólicos)
ƒ Fluorocromos como sondas
ƒ En materiales fijados y no fijados
ƒ Proteínas fluorescentes (expresadas o
microinyectadas) en células vivas.
3
Técnicas microscópicas para la
evaluación de anastomosis conidial
Electron microscopy
Live‐cell imaging
Labelling
Scanning
Staining
Transmission
GFP
Carboxy‐DFDA
DiCO6
Calcofluor White
DAPI
Electron microscopy
Spores collected by
touching a 15-day old
culture
with
nylon
hybridisation membrane,
or fixed and mounted
directly from de bean
pod.
Live-cell imaging
1- Staining
-
Conidia collected from 7-16 old cultures and
suspended in water (1x106 conidia/mL)→
inoculate PDB in slide culture chamber.
- Incubated for 24h,48 and 72h.
-
Calcofluor White(0,12 M)→ for cell wall
DAPI→ for nuclei
DiCO6 → for mitochondria
Carboxy-DFDA → for vacuoles
- Inverted microscope equipped with blue
diode and argon ion lasers
Microscópio óptico &
GUS e GFP
ƒ Expresión génica a nivel celular mediante el uso de
genes repórteres visualmente detectables
ƒ GUS (β-D-glucoronidasa)
ƒ Marcadores histoquímicos y genes repórteres
ƒ Son introducidos em el hongo de interés. Amuestras
son colectadas y colocadas para reaccionar con el
substrato de GUS(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-Dglucorónido (X-GlcA) → precipitado azul
ƒ http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4
0/fulltext.pdf
2- Labelling with GFP
- Protoplast obtained from young mycelia in NaCl as osmotic
stabilizer
- Incubation of protoplasts for 3h with Lyzing Enzymes.
- Tranformation of protoplasts with the plasmid pMF357 which
carried hH1-sgfp gene and hph gene for hygromycin
resistance
- Mixture transfered to regeneration agar and hygromycin B
- Conidia obtained from transformants were spread onto PDA
containing hygromycin.
- Single conidia expressing hH1-sFGP were selected using a
fluorescence stereo microscope with GFP filter set
4
Metodología básica
Propidium iodide
(nuclei)
DAPI (nuclei)
Carboxy‐DFDA (vacuoles)
Calcofluor White (cell walls)
DISCOS FOLIARES
hH1 ‐GPF
SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN
Metodologia
SOLUCIÓN PARA
CLAREAMENTO
Stadnik e Buchenauer (2000):
1) Colecta de discos de tejido foliar después de la inoculación
1) Solución I: (etanol/ácido acético glacial; 3:1, v/v) para fijación y clareamento de
los tejidos.
- 24 -48 h/ cambios de soluciones
2) Solución II: lactoglicerol (ác. lático, glicerol y agua)
para continuar el clareamento y conservación.
4) Visualización al microscopio óptico (hasta 3 meses)
Puntos importantes:
- Conducción con máximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos
suavemente en las hojas.
- Las estructuras del hongo son teñidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie
blue o tripan blue.
- El porcentaje de germinación, la formación de apresórios y la penetración son evaluados
sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco.
Crecimiento del hongo in
planta
Weigel e Glazebrook (2002)
Incubación con solución de coloración (azul de tripan
2,5 mg/mL em lactofenol + 2 volúmenes de etanol) a 100°C por 1 min.
Resfriar el
material por 1 h a temperatura ambiente.
Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006
Detección de la reacción de
hipersensibilidad en
Arabidopsis
Incubar en solución
de diaminobenzidina
(1 mg/mL) por 8 h
Weigel e Glazebrook (2002)
Decoloración
en
etanol 100% por 3h.
Solución
de conservación
(glicerol 70%)
Incubar por 12 h y substituir la solución
de clareamento por glicerol 70%.
Incubar por 6 h y substituir la solución
de clareamento por una nueva.
Remover la solución
de coloración
y adicionar cloral hidratado (2,5 g/mL).
5
Detección de la reacción de
hipersensibilidad en poroto
Hϋckelhoven (1999)
Fotos: Crecimiento del hongo
in planta
ƒ Plantas inoculadas con una gota de 10uL de una
suspensión de esporas de A. brassicicola (106
conídios/mL)
ƒ Evaluación realizada a los 4 dias después de la
inoculación
Conservación en
ácido láctico: glicerol: agua (1:1:1, v/v/v)
Decoloración en ácido tricloroacético 0,15% p/v; en etanol: clorofórmio (4:1)
Solución de diaminobenzidina
(1mg/mL)
Foto: Reacción de
hipersensibilidad
Metodología básica
DISCOS FOLIARES
SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN
Desarrollo biotrófico de
los oídios
SOLUCIÓN PARA
CLAREAMIENTO
Técnicas histoquímicas
ƒ Johansen (Capítulo IX)
ƒ Clareamiento y tinción de los tejidos
A
6
Tipos de haustórios
Oídio del Pepino
Podosphaera xanthii
Hemibiotróficos
Hemibiotróficos
(dos “faces” de un patógeno)
Colletotrichum lindemuthianum
(Colletotrichum lindemuthianum)
Antracnose del frijol
7
Colletotrichum lindemuthianum (24 hai)
Colletotrichum gloeosporioides (48 hai)
Colletotrichum gloeosporioides
Manzano
?
8