UFSC CC V LABFITOP ESTUDIO DE LAS INTERACCIONES PLANTAHONGOS PATOGÉNICOS Marciel J. Stadnik Preguntas? > Respuestas Cual órgano y tejido es infectado por el hongo? Como ocurre la infecció infección? directa o indirecta? Cuales cé células del hué huésped son colonizadas? (epidermis, mesó mesófilo, filo, etc.) Cuá Cuáles son los mecanismos involucrados con la defensa de la planta contra el hongo? Clase I - conceptos [email protected] Clasificación de hongos: Cuanto a la relació relación parasitaria: Pará Parásitos obligados: obligados: Ciclo de vida ocurre exclusivamente en el tejido vivo del hué huésped Pará Parásitos no obligados Sapró Saprófitos facultativos Pató Patógenos facultativos Clasificación de hongos Cuanto a las relaciones nutricionales (Luttrell ,1974): (Luttrell,1974): Necrotró Necrotrófico (Pertotrofico): Pertotrofico): pató patógeno mata las cé células do hué huésped antes de colonizarlas Alternaria spp. Hemibiotró Hemibiotrófico: fico: pató patógeno forma inicialmente una asociació asociación con cé células vivas del hué huésped, y mas tarde se vuelve necrotró necrotrófico Ex: Colletotrichum spp. Biotró Biotrófico: fico: pató patógeno se nutre de tejido vivo Oídios, dios, Rojas Características organismos biotróficos estructuras de infecció infección altamente desarrolladas baja actividad de enzimas lí líticas camadas interfaciales que separan las membranas plasmá plasmáticas del hongo y planta mecanismos de supresió supresión de defensa del hué huésped haustó haustórios (Mendgen & Hahn, Hahn, 2002). 1 Modo de infección y colonización Rojas (biotróficos del mesófilo) Rojas (basidiomycota) basidiomycota) Oídios (ascomycota) ascomycota) Colletotrichum lindemuthianum y Colletotrichum gloeosporioides = presentan diferentes tipos y grados de desarrollo biotró biotrófico. fico. Uromyces appendiculatus Formació Formación de apresó apresório en respuesta a caracterí características topográ topográficas Allen et al. (1991) Roja de la soja (Phakopsora pachyrhizi) Penetración directa ! Microscopía de luz Tests in vitro sobre papel celofá celofán Koch et al. (1983) 2 Aná Análisis inmunocitoló inmunocitológicas y geles Padró Padrón de expresió expresión de ARD1 - Arabitol Desidrogenase (A) Representació Representación de las estructruras de infecció infección de la roja: 1, uredó uredósporo (SP); 2, tubo germinativo (GT) 4 h despué después de la germinació germinación; 3– 3–6, estructuras de infecció infección in vitro en estadí estadíos siguientes: 3, apresó apresório (AP) (6 h); 4, vesí vesícula subestomatal (SV) (12 h); 5, hifa de infecció infección (IH) (18 h); 6, cé célulalula-madre haustorial (HM) estadí estadío (21 h); 7, haustó haustório (HA); 8, hojas infectadas; 9, no infectadas (estructuras 2– 2–6 obtidas in vitro).; vitro).; NB, gola do pescoç pescoço; EM, matriz extrahaustorial. extrahaustorial. (B) Gele de agarosa (C) Northern blot de geles descritos en (B (B). Link et al. (2005) Oídios (biotró biotróficos de la epidermis) epidermis) Blumeria graminis Proceso de infección de Blumeria graminis MICROSCOPÍA DE FLUORENCIA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE VARREDURA COMPUESTOS FENÓLICOS SUPERFICIE Microscopia de fluorescencia (MF) Luz incidente 100 a 400nm Filtro antes de la lente objetiva permite apenas el pasaje de luz excitada Componentes autofluorescentes (ex. compuestos fenó fenólicos) Fluorocromos como sondas En materiales fijados y no fijados Proteí Proteínas fluorescentes (expresadas (expresadas o microinyectadas) microinyectadas) en células vivas. 3 Técnicas microscó microscópicas para la evaluació evaluación de anastomosis conidial Electron microscopy Live‐cell imaging Labelling Scanning Staining Transmission GFP Carboxy‐DFDA DiCO6 Calcofluor White DAPI Electron microscopy Spores collected by touching a 1515-day old culture with nylon hybridisation membrane, membrane, or fixed and mounted directly from de bean pod. pod. Live-cell imaging 1- Staining - Conidia collected from 7-16 old cultures and suspended in water (1x106 conidia/mL) → conidia/mL)→ inoculate PDB in slide culture chamber. chamber. - Incubated for 24h,48 and 72h. - Calcofluor White(0,12 M)→ M)→ for cell wall DAPI→ DAPI→ for nuclei DiCO6 → for mitochondria CarboxyCarboxy-DFDA → for vacuoles - Inverted microscope equipped with blue diode and argon ion lasers Microscópio óptico & GUS e GFP Expresió Expresión génica a nivel celular mediante el uso de genes repó repórteres visualmente detectables GUS (β (β-D-glucoronidasa) glucoronidasa) Marcadores histoquí histoquímicos y genes repó repórteres Son introducidos em el hongo de interé interés. Amuestras son colectadas y colocadas para reaccionar con el substrato de GUS(5cloro-3-indolylindolyl-β-DGUS(5-bromobromo-4-cloroglucoró glucorónido (X-GlcA) GlcA) → precipitado azul http://www.springerlink.com/content/w751815875t11p4 0/fulltext.pdf 2- Labelling with GFP - Protoplast obtained from young mycelia in NaCl as osmotic stabilizer - Incubation of protoplasts for 3h with Lyzing Enzymes. Enzymes. - Tranformation of protoplasts with the plasmid pMF357 which carried hH1hH1-sgfp gene and hph gene for hygromycin resistance - Mixture transfered to regeneration agar and hygromycin B - Conidia obtained from transformants were spread onto PDA containing hygromycin. hygromycin. - Single conidia expressing hH1hH1-sFGP were selected using a fluorescence stereo microscope with GFP filter set 4 Metodología básica Propidium iodide (nuclei) DAPI (nuclei) Carboxy‐DFDA (vacuoles) Calcofluor White (cell walls) DISCOS FOLIARES hH1 ‐GPF SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN Metodologia SOLUCIÓN PARA CLAREAMENTO Stadnik e Buchenauer (2000): 1) Colecta de discos de tejido foliar después de la inoculación 1) Solución I: (etanol/ácido acético glacial; 3:1, v/v) para fijación y clareamento de los tejidos. - 24 -48 h/ cambios de soluciones 2) Solución II: lactoglicerol (ác. lático, glicerol y agua) para continuar el clareamento y conservación. 4) Visualización al microscopio óptico (hasta 3 meses) Puntos importantes: - Conducción con máximo cuidado para evitar el desprendimiento de esporas adheridos suavemente en las hojas. - Las estructuras del hongo son teñidas con azul de anilina en lactofenol (0,1%) o Coomansie blue o tripan blue. - El porcentaje de germinación, la formación de apresórios y la penetración son evaluados sobre cada disco foliar, observando-se 100 esporas/disco. Crecimiento del hongo in planta Weigel e Glazebrook (2002) Incubación con solución de coloración (azul de tripan 2,5 mg/mL em lactofenol + 2 volúmenes de etanol) a 100°C por 1 min. Resfriar el material por 1 h a temperatura ambiente. Fitopatologia Brasileira, 31 (supl.) 79-80, 2006 Detecció Detección de la reacció reacción de hipersensibilidad en Arabidopsis Incubar en solución de diaminobenzidina (1 mg/mL) por 8 h Weigel e Glazebrook (2002) Decoloración en etanol 100% por 3h. Solución de conservación (glicerol 70%) Incubar por 12 h y substituir la solución de clareamento por glicerol 70%. Incubar por 6 h y substituir la solución de clareamento por una nueva. Remover la solución de coloración y adicionar cloral hidratado (2,5 g/mL). 5 Detecció Detección de la reacció reacción de hipersensibilidad en poroto Hϋckelhoven (1999) Fotos: Crecimiento del hongo in planta Plantas inoculadas con una gota de 10uL de una suspensió suspensión de esporas de A. brassicicola (106 coní conídios/mL) Evaluació Evaluación realizada a los 4 dias despué después de la inoculació inoculación Conservación en ácido láctico: glicerol: agua (1:1:1, v/v/v) Decoloración en ácido tricloroacético 0,15% p/v; en etanol: clorofórmio (4:1) Solución de diaminobenzidina (1mg/mL) Foto: Reacción de hipersensibilidad Metodología básica DISCOS FOLIARES SOLUCIÓN DE CONSERVACIÓN Desarrollo biotrófico de los oídios SOLUCIÓN PARA CLAREAMIENTO Técnicas histoquímicas Johansen (Capí (Capítulo IX) Clareamiento y tinció tinción de los tejidos A 6 Tipos de haustórios Oídio del Pepino Podosphaera xanthii Hemibiotró Hemibiotróficos Hemibiotróficos (dos “faces” faces” de un pató patógeno) geno) Colletotrichum lindemuthianum (Colletotrichum lindemuthianum) Antracnose del frijol 7 Colletotrichum lindemuthianum (24 hai) Colletotrichum gloeosporioides (48 hai) Colletotrichum gloeosporioides Manzano ? 8