INFORME TECNICO Dr. Severin

“PF2”
Una sustancia natural obtenida de la planta Caléndula Officinalis y desarrollada en
laboratorio ha demostrado ser un potenciador del sistema inmunológico y ha
conseguido reducir la formación de células cancerosas.
La “PF2”, es la responsable, según las observaciones, de la reducción del tamaño de
tumores que parecían incurables. Ha tenido éxito en enfermos terminales (casos
anecdóticos) y es capaz, además, de reducir los efectos secundarios de la
quimioterapia.
El Dr. José Manuel Frías, a mediados de los 90, descubrió que una molécula, la
“PF2”, era muy activa contra el cáncer. Frías puso su descubrimiento en manos del
catedrático y profesor de Farmacología y Medicina de la Universidad de Illinois
(Chicago) John Pezzuto. El doctor Pezzuto y su equipo se han encargado de desarrollar
el estudio en torno a sus propiedades anticancerígenas para crear con ella un
mecanismo específico para el tratamiento del cáncer.
La molécula “PF2” se ha revelado como un potente inmunomodulador, capaz de
potenciar el sistema inmunológico humano, concretamente los linfocitos.
La potenciación del sistema inmunológico supone por sí misma un arma contra el
cáncer, capaz, según se ha comprobado, de reducir el crecimiento de tumores
aparentemente incurables y de frenar el desarrollo de metástasis, es decir, la aparición
de nuevos tumores diseminados en el cuerpo del paciente oncológico avanzado.
La potenciación del sistema inmunológico –que con la
“PF2” se expresa en la
potenciación de los linfocitos-- permite optimizar además los tratamientos tradicionales
ya que facilita seguir con los ciclos de quimioterapia o radioterapia, eliminando sus
efectos secundarios, que pueden ser altamente nocivos, y posibilita la continuidad y la
repetición de las terapias en pacientes que de otro modo no podrían resistirlas más.
"La “PF2” tiene una intensa actividad antitumoral indirecta –explica John Pezzuto-estimulando el sistema inmunológico, reduciendo incluso el tamaño del tumor cuando
éste está ya formado. Al ser de origen natural no presenta toxicidad y es además
capaz de amortiguar los efectos secundarios de la químio y la radioterapia."
Según los investigadores, la “PF2” estimula la producción de linfocitos, monocitos y
neutrófilos, las tres principales familias celulares del sistema inmunológico que deben
ocuparse de impedir el crecimiento de un tumor canceroso. Al mismo tiempo, añade,
detiene y reduce la formación del tumor.
“Eso lo convierte en un oncolítico indirecto (liquidador del cáncer), ya que provoca una
reducción de las células cancerosas que invaden un órgano, al tiempo que potencia las
del sistema inmunológico", explicó Eugenii Severin, director del Centro de
Investigación de Diagnosis y Terapia Molecular, de Moscú. "La
“PF2” es un
inmunomodulador muy eficaz".
"Supimos –explicó el profesor Pezzuto– que la “PF2” había dado resultados positivos en
enfermos terminales e investigamos cómo actúa esa sustancia, descubriendo que lo
que hacía era estimular el sistema inmunológico. Ahora trabajamos para llegar a su
aprobación como medicamento por la Food and Drug Administration, la FDA".
Pezzuto se ha referido también al tema en los siguientes términos: "En EEUU solo el
2% de las personas que sufren cánceres metastásicos, como el de pulmón, logran
superar los cinco años de vida". Antes había dicho que "no se conocen vacunas contra
el cáncer y la quimioterapia generalmente fracasa, al menos en condiciones de
malignidad y metástasis".
La “PF2”, por su poder inmunomodulador, se perfila además como un elemento capaz
no solo de reducir tumores y metástasis, sino que por su capacidad de potenciar la
inmunidad natural del cuerpo, podría ser lo más parecido que existe hasta la fecha a
una vacuna contra el cáncer. Pezzuto hizo hincapié en la importancia de disponer entre
el arsenal terapéutico de un producto que tuviera ese efecto protector.
"Tras un procedimiento especial de extracción, la “PF2” ha demostrado ser
esperanzadora en el tratamiento de pacientes con cáncer e incluso tener una acción
profiláctica que podría desembocar en una futura vacuna contra el cáncer, lo que haría
desaparecer el miedo al factor hereditario".
El científico relató como las investigaciones que se hicieron poniendo en contacto el
producto liofilizado con una gran variedad de cultivos de células cancerosas humanas
no ofrecieron como resultado una actividad inhibitoria del crecimiento, como cabría
esperar de cualquier agente estándar de quimioterapia contra el cáncer, sin embargo
"se observó una importante estimulación linfocítica que sugirió una actividad
inmunomoduladora".
Los trabajos prosiguieron aplicando a la sustancia un fraccionamiento por bioactividad
y utilizando la estimulación linfocítica como referente se identificaron moléculas de
polisacáridos como principios activos y "se aisló un componente clave, llamado “PF2”,
cuya estructura primaria quedó clarificada y se examinó detalladamente su potencial
para estimular la proliferación de células de inmunorespuesta".
Los investigadores vieron como esa estimulación era –en las células aisladas del bazo
de un ratón– veinte veces mayor que el estimulador que se había utilizado como
control, la Concanavalina A, una proteína que es un inmunomodulador que solo se
puede utilizar en los laboratorios por presentar una alta toxicidad para los seres
humanos. La estimulación crecía si se coadyuvaba al “PF2” con un coestimulador.
"Estos resultados –ha dicho el doctor John Pezzuto a la comunidad médica– sugieren
que el potencial de la “PF2” aumenta la respuesta inmunológica en combinación con la
propia respuesta del sistema inmunológico humano. En resumen, la “PF2” parece útil
como tratamiento contra el cáncer." Y no solo contra el cáncer, ya que su acción de
potenciación del sistema inmunológico es una esperanza contra las infecciones más
graves.
"La “PF2” –concluyó el profesor americano– como antitumoral indirecto es compatible
con los tratamientos de quimioterapia y radioterapia. Además es de utilidad para la
reducción de los efectos secundarios de estas terapias. Por lo tanto, podría ser de
utilidad para aquellos pacientes oncológicos que presentan intolerancia a los
tratamientos tradicionales."
Para que la “PF2” sea considerada un medicamento han de pasar varios años. Pezzuto
espera que en cinco años el proceso haya acabado y la FDA dé su autorización.
La investigación con enfermos de cáncer ha comenzado a ser aplicada a enfermos, en
varias clínicas de Moscú, y posteriormente se ha utilizado en EEUU y España a más de
3.000 personas.
La ausencia de toxicidad en el tratamiento prolongado con la “PF2”, comprobada hasta
ahora en modelos animales, podría permitir administrar la sustancia en altas
concentraciones si la expansión y agresividad del tumor lo requieren, añadieron los
investigadores.
Caracterización Estructural del Polisacárido “PF2” (Inmunoestimulador)
Extracto
El cáncer metastático es una enfermedad recalcitrante con limitadas opciones
terapéuticas. De los tratamientos actuales los productos naturales juegan un papel
dominante y las terapias alternativas o complementarias están siendo investigadas con
mayor intensidad. Uno de estos productos es la nueva molécula “PF2”, extraída
mediante un novedoso proceso patentado a nivel mundial de la Caléndula Officinalis L.
(Asteraceae). Este material ha sido usado para el tratamiento de cánceres humanos con
algunos éxitos. La investigación del producto liofilizado no ha revelado una actividad
inhibitoria de crecimiento directo con una variedad de células de cáncer humano, pero se
ha observado estimulación linfocítica, que nos sugiere actividad inmunomoduladora. El
fraccionamiento guiado por bioactividad condujo a la identificación de polisacáridos como
componentes activos, uno de los cuales estaba compuesto por a-L-arabinofuranosa, bD-galactopyranosa, y a-L-rhamnopyranosa, con un peso molecular de aproximadamente
480,000 Da. Las correlaciones de amplio rango entre el C-1 y C-6 de Gal y Gal’ en el
espectro HMBC sugirieron una base b-D-galactopyranosa con 1® 6. Ara fue ligada en
1® 3 a Gal, como se sugiere por la correlación de amplio rango entre el C-1 de Ara y el
C-3 de Gal. Del espectro 1H NMR, el ratio de tipos de azúcar fue 3:1:2:2:1
(Ara:Ara’:Gal:Gal’:Rha) de acuerdo a los valores de integración de los picos de protones.
Claramente, se requiere trabajo adicional para caracterizar completamente el valor
terapéutico de la “PF2”. De todos modos, los resultados actuales otorgan una explicación
creíble de cómo esta sustancia puede funcionar como agente antitumoral en un marco
auxiliar.
Introducción
A pesar de los años de búsqueda intensiva, el cáncer se mantiene como la mayor causa
de muerte en el mundo. Una vez que la enfermedad ha alcanzado un estado de
metástasis maligno, las opciones de tratamiento son limitadas y el grado de
supervivencia es bajo. Como resultado, además de los programas de desarrollo de
fármacos estándares, se ha puesto mayor énfasis en pasos terapéuticos tradicionales o
alternativos. Varios informes de naturaleza anecdótica han indicado una prometedora
actividad antitumoral en pacientes diagnosticados con varios tipos de cáncer. Basado en
estos informes, hemos investigado el potencial biológico de este material. Los esfuerzos
iniciales se han centrado en una creciente actividad inhibitoria en células cancerígenas
humanas en cultivo. De todos modos, no se ha observado una actividad significante. Por
lo tanto, hemos investigado el potencial inmunomodulador, empleando un modelo in
Vitro. Los resultados los exponemos en el presente estudio.
Materiales y Métodos
Esta sustancia en estudio, es un producto acuoso que se prepara del material de la
planta usando un determinado proceso descubierto por el Dr. José M. Frías. Para el
presente análisis, el extracto acuoso (120 L) fue liofilizado para conseguir un polvo de
color tostado (800 g).
Resultados y Discusión
Basado en los informes sobre el potencial de la “PF2”, como mediador de efectos
terapéuticos en pacientes de cáncer, hemos elegido evaluar el potencial biológico de
este material en varios sistemas modelos. Primero, ya que es bien conocido que los
agentes anti cáncer efectivos tales como paclitaxel, vinblastine, y camptothecin son
potentes inhibidores de proliferación de células, la “PF2” se evaluó por actividad
antiproliferativa con un panel de células cancerosas humanas. Cuando se probó con una
variedad de tipos de células (pecho, colon, próstata, melanoma, carcinoma de pulmón
de células escamosas, etc.), el material era inactivo para concentraciones relativamente
altas (p. ejemplo, 100 mg/mL) (datos no mostrados). Por lo tanto, para explorar la
posibilidad de los efectos indirectos, el material de test se evaluó como potencial
inmunoestimulador empleando células aisladas de bazo de ratón. Se observó una
significante actividad, y este sistema de prueba se empleó como guía para dirigir el
aislamiento de los constituyentes activos.
Según lo dicho, se procedió con el fraccionamiento por bioensayo de un extracto acuoso
de la sustancia en estudio, a través de una serie de precipitaciones de MeOH, se
repitieron los pasos de solubilización y centrifugación, y cromatografía de las fracciones
activas sobre columnas de filtración de gel Sephadex, llevó al aislamiento de un
polisacárido activo, denominado polisacárido A (1). La hidrólisis de este polisacárido,
seguido por un análisis de placa fina de celulosa (TLC), llevó a la identificación de a-Larabinofuranosa, b-D-galactopyranosa, y a-L-rhamnopyranosa
como
azúcares
compuestos. Más adelante, usando dextrans con un rango de diferentes pesos
moleculares como estándares de referencia, el polisacárido aislado se determinó que
tenía un peso molecular de 480,000 Da por comparación con columnas de filtración con
gel.
Un completo estudio de respuesta a dosis se realizó para establecer el potencial del
polisacárido A (1) para estimular la proliferación de células con inmunorespuesta
aisladas del bazo del ratón. En ausencia de un coestimulador (p. ejemplo, Con A), de
concentraciones en el rango 0.1-100 mg/mL, se observó estimulación dependiente de la
dosis hasta un máximo de más de 20 veces mayor que el control. En relación a otros
productos naturales no tóxicos evaluados en nuestro laboratorio, esta respuesta fue
altamente significativa y potente. La respuesta obtenida en presencia de una
concentración fija del co-estimulador (Con-A) fue también notable. Bajo estas
condiciones experimentales, se observó que la estimulación incrementaba de una
manera dependiendo de la dosis de más de 100% del control. Estos datos sugirieron que
el potencial del polisacárido A permitían aumentar la respuesta inmune en combinación
con el propio sistema del huésped.
En resumen, la “PF2” se pronostica como un útil tratamiento para el cáncer, pero se
necesitan posteriores ensayos preclínicos y clínicos para establecerse desde un punto de
vista aceptable científicamente. De todos modos, el presente informe pone en evidencia
que la “PF2” es capaz de mediar una respuesta que pueda ser muy útil para una
variedad de enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. La inmunoterapia es un área
de gran interés actual, de una forma directa para la reducción de la carga de los
tumores, o para restaurar la inmunodeficiencia que resultan de las agentes estándar de
quimioterapia. Aunque queda por probar, basándonos en los datos de este informe de
ensayo “In Vitro” y el modo de acción anticipado, parece probable que se pueda crear un
régimen de tratamiento saludable de la “PF2” en seres humanos. Diseñando ensayos
clínicos de este tipo, será importante incluir preparaciones estandarizadas para control
de calidad y resultados reproducibles, y comúnmente se estandarizan estas
preparaciones en base a un componente activo único. El Polisacárido A sería un buen
candidato para usarse con esta capacidad.
Reconocimientos
Los autores están agradecidos al Dr. Fang Ji-Nian, Instituto Shangai de Materia
Medica, Academia China de la Ciencia, Shangai, PRC, por la determinación del peso
molecular y al Dr. José M. Frías, por suministrar el extracto acuoso del que se deriva la
“PF2”.
Referencias:
•1 Richardson,
MA, Sanders T, Palmer JL, Greisinger A, Singletary SE
Complementary/alternative medicine use in a comprehensive cancer center and the
implications for oncology. J Clin Oncol 2000 Jul 18:2505-14.
•1 Pezzuto, J.M: Plant-derived Anticancer Agents, Biochen, Pharmacol., 53: 121-
133,1997.
•1 Likhitwitayawuid,
k., Angerhofer, C.k., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M., and
Ruangrungsi, N. Cytotoxic and Antimalarial Bisbenzylisoquinole Alkaloids from
Stephania erecta. J. Nat.Prod.56: 30-38, 1993.
•1 Mar, W., Tan, G.T., Cordell, G.A., Pezzuto, J.M., Jurcic, K,. Redl, K,.Steinke, B., and
Wagner, H. Biological Activity of Novel Macrocyclic Alkaloids (Budmunchiamines)
from Alibizia amara detected on the Basis of Interaction with DNA. J.Nat. Prod.,54:
1531-1542, 1991.
•1 Calis I., Yürüker, A., Tasdermir, Wright, A.D., Sticher, O., Luo, Y.-D and Pezzuto,
J.M. Ct¡yckiartane Triterpene Glycosides from
melanophruruis.Planta Med., 63: 183-186, 1997.
the
Roots
of
Astragalus
TABLA 1. 13 CNMR datos del polisacarido A (1) (D2O, referidos a DSS, 125
MHz)
Sugar linkages
C-1
C-2
C-3
C-4
C-5
C-6
Araf-(1-»
110.1
85.0d
74.5d
86.7d
63.2t
--
84.7d
->3)-Araf-(1 -»
119.d
84.0d
79.4d
86.5d
63.9t
--
83.9d
63.7t
83.7d
64.8t
->6)-Galp-(1->
106.1d
72.9d
75.3d
72.2d
76.4d
69.2t
->3)-Galp-(1->)
105.9d
73.5d
82.8d
73.5d
76.1d
69.2t
->6)
105.8d
Rhap-81->
100.2d
72.2d
73.5d
72.5d
71.1d
19.2q
TABLA 2 ESTIMULACIÓN DE PROLIFERACIÓN LINFOCITO MEDIADA POR EL
POLISACARIDO A(1)
dpm +/- S.D. (% incrementado)
Conc.
No Con A
Con Con.A (8mg/ml)
0.1
330 +/- 34 (4)
44820 +/- 2501(4)
1
795 +/- 57(152)
71509 +/- 8533(66)
5
1453 +/- 437(360)
74248 +/- 5630(73)
10
1932 +/- 190(511)
89819 +/- 2687(109)
25
2569 +/- 236(713)
88171 +/- 7266(105)
50
4868 +/- 1465 (1440)
100757 +/- 7499(134)
100
7771 +/- 709(2359)
85002 +/- 4287 (98)
INFORME DE PROGRESO.
BIOACTIVIDAD DIRIGIDA, PROTOCOLO DE AISLAMIENTO
FITOQUÍMICO.
INTRODUCCIÓN:
El intento del aislamiento de un polisacárido activo
homogéneo de la mezcla activa de “PF2” RS8A preparado
de HPLC fue fallida debido a la intrasferibilidad de las
condiciones analíticas del HPLC. De ahí, una investigación
posterior sobre la separación potencial de moléculas
cribadas cromatograficamente usando Sephadex G 50 fuera
iniciada como el medio de separación. Consecuentemente,
un polisacárido homogéneo fue aislado, bioensayado, y su
estructura parcial aclarada por NMR espectroscópicos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
I. Aislamiento de polisacárido activo “PF2” RS8B-2.
Una parte(2.0g) del poco activo “PF2” RS9 (LT = 73,5%), el
cual fue preparado por el 67% MEOH, precipitación de
“PF2” R (ver diagrama de Flujo) fue elegido como material
de prueba. La razón, es que aunque el “PF2” RS9 es menos
activo que “PF2” RS8, su proximidad a la fracción más
activa, Sin embargo presagia a su contenido potencial del
mismo
polisacárido,
aunque
en
más
pequeña
concentración, y además su bajo nivel de actividad es
más
utilizable
como
material
de
prueba.
Consecuentemente la muestra de “PF2” RS9 fue disuelta
en H2O y centrifugada. La supernatant fue sometida a
Sephadex (G-25, 150µm, 80 g) columna de la separación
cromatográfica con H2O como el eluent. Las bandas de
color marrón fueron reunidas y designada como “PF2”
RS9A (0,3g). Un análisis de la 1H NMR espectra de “PF2”
RS9A y la anteriormente definida como la combinación del
polisacárido activo “PF2” RS8A se mostraron idénticas. De
esta manera, “PF2” RS9A (0,2g) fue combinado con la
reservas existentes de “PF2” RS8 (1.4g), designado como "
“PF2” RS8B" y sometida a una nueva separación con
Sephadex G-50(20-80µm, 68g). Elution con H20 produjo
seis fracciones (“PF2”RS8B-1,-2,-3,-4,-5 y -6). El análisis
cromatográfico HPLC de estas fracciones (Figuras 1-12)
mostraron que únicamente la fracción “PF2” RS8B-2 es
homogénea usando tanto una suave dispersión evaporativa
como la identificación UV (Figuras 3 y 4). La estructura
parcial de este aislamiento fue determinada por el análisis
de NMR. Es nota de interés que “PF2” RS8B-2, el cual
representa el 33.7% del total de la fracción separada, dio
1H NMR y 13C NMR spectra (Figura 15 y 16) que son muy
similar a esos de “PF2” RS8A (Figura 13 y 14) indicando
que el polisacárido principal en el “PF2” RS8A es “PF2”
RS8B-2.
“PF2” RS8B-2 fue sometido por bioensayo y encontrado
para exponer una transformación linfocita (LT) actividad de
÷6203 como comparación de la actividad de ÷3532
obtenida por “PF2” RS8A (Tabla 2) en el mismo
experimento. Este polisacárido homogéneo (“PF2”RS8B-2)
así aparece para ser dos veces casi tan activo como su
mezcla original (“PF2” RS8A).
Para propósitos comparativos, la transformación linfocita
determinó los datos de la actividad para “PF2” RS8A el
14/04/00 y el 25/04/00, además están presentados en la
Tabla 2.
TABLA 2
EFECTOS DE LA MUESTRAS PF2RS8A Y “PF2”RS8B-2 DE LA
TRANSFORMACIÓN LINFOCITA (RATON SMC)*
MUESTRA
No Con A
“PF2”RS8A (08/18)
“PF2”RS8B-2
Media + S.D
%
Media + S.D.
%
0
165 +31
0
197+51
0
0.01
311+41
+91
205+49
+24
0.1
371+51
+127
361+76
+83
1
556+26
+237
649+48
+229
10
3829+380
+2220
2348+305
+1092
100
5993+1760
+3532
12417+3153
Con A 8m g/ml 1762+349
+6203
1507+250
MUESTRA
No Con A
“PF2”RS8A (04/14)
“PF2”RS8B-2(04/25)
Media + S.D
%
Media + S.D.
%
0
900 +195
0
290+112
0
0.01
940+105
+4
665+159
+129
0.1
2549+410
+183
475+239
+64
1
4857+927
+440
542+130
+87
10
8830+816
+881
1979+344
+582
100
10565+449
+1074
14233+2079
+4808
EL RATﾓN ERA FEMENINO
Efecto de las Muestras PF-1, “PF2”, PF-1-MEOH, “PF2”-MEOH, PF-1-5 and PF-1-6
sobre la transformación Limfocita
(Rat
SMC)*
Muestra
Con A 8ug/ml
PF-1
Con A 8ug/ml
“PF2”
PF-1- MeOH
“PF2”-MeOH
Media ± S.D
%
Media ± S.D
%
Media ± S.D
%
Media ± S.D
%
0
61298±4812
0
65886±4698
0
64388±4051
0
55309±1664
0
0.01
62429±6195
+2
62508±7283
-5
68105±4455
+6
64090±3335
+16
0.1
59490±6476
-3
57382±3942
56939±2385
13
-12 49688±4063
-10
1
58256±8719
-5
52524±3143
59939±5596
20
-7
-8
51103±3714
10
51895±3986
-15
100
75082±4516
+22 63282±1932
47605±2814
50748±3207
28
-21 49375±3681
-11
-4
-3
-10
62266±3738
49668±5683
Muestra
Con A 8ug/ml
PF-1
“PF2”
Media ± S.D
%
Media ± S.D
%
0
73225±5445
0
68429±3889
0
0.01
70886±4579
-3
61771±2917
-4
0.1
65244±2027
-11
58575±2420
14
1
58994±5671
-20
51320±1685
25
10
56560±2139
-23
49984±672
27
100
84661±9308
+16 54647±3197
%
%
24
*El ratón era femenino
Efecto de las Muestras PF-1, “PF2”, PF-1-MEOH, “PF2”-MEOH, PF-1-5 y PF-1-6
sobre la transformación linfocítica
(Mouse SMC)*
Sample
No Con A
No Con A
PF-1
Media ±
“PF2”
%
PF-1- MeOH
“PF2”-MeOH
Media ±
Media ±
%
Media ±
2518±211
0
2074±174 0
1721±237 0
%
%
0
1469±302 0
0.01
1660±
+13
1592±268
-38
1943±752 -6
2399±39
0.1
2723±
+85
2751±285
+8
2457±396 +17
2292±467 ±33
1
6309±
+329 6260±403
+145 2326±3
10
3734±
+154 5660±416
+121 5061±773 +143 4204±344 ±144
100
1183±
-19
+86
4766±532
873±250
+12
-58
±39
2644±495 ±65
807±97
-52
Sample
No Con A
PF-1
Media ±
“PF2”
%
Media ±
%
0
2515±265 0
2253±281
0
0.01
2584±235 +1
3851±569
+71
0.1
2643±322 +3
5356±492
+138
1
6464±646 +153 10110±1272 +344
10
6870±485 +169 9915±387
+340
100
1917±408 -25
+385
*El ratón era femenino
10930±993
%
%
INTRODUCCIÓN
La meta de este estudio fue investigar y caracterizar la actividad inmunomoduladora de la
sustancia original, llamada “PF2” y su posible aplicación en oncología clínica.
Los inmunomoduladores se usan en la práctica clínica para estimular y normalizar la
función del sistema inmunológico. Casi todas las enfermedades, incluso las tóxicas y los
desórdenes nerviosos conducen a diferentes cambios y trastornos en el sistema
inmunológico, principalmente:
-Disminución del suero inmunoglobulino,
-Cambios de actividad en los linfocitos T y B,
-Cambios en el equilibrio de sub-poblaciones de linfocitos T
-Disminución de la actividad de fagotitos.
Todos estos síntomas son la característica de las diferentes formas de desordenes de
deficiencia inmunológica.
Los inmunomoduladores son usados en los métodos modernos de corrección de
inmunodeficiencias para facilitar el tratamiento de la enfermedad y para evitar infecciones
y complicaciones auto inmunes. Las propiedades inmunocorrectivas de
inmunomoduladores pueden ser utilizadas con éxito en tratamiento y prevención de
enfermedades oncológicas, porque las células inmunocompetentes juegan un papel
principal en el proceso de eliminación de las células tumorales por otra parte tales procesos
patológicos como la progresión tumoral y la formación de metástasis son particularmente
controladas por el sistema inmunológico. Estos procesos tan complicados dependen de la
actividad de las células tumorales así como de las células inmunocompetentes. El uso de los
inmunomoduladores en la medicina oncológica es esencial y puede ser objetivo para la
mejora de la identificación de objetivos por las células inmunoconpetentes y puede ser
dirigida específicamente hacia la selección de un tipo de tumor celular o usarla para
mejorar la resistencia del conjunto del organismo.
PARTE I. ANÁLISIS DE LA DOCUMETACIÓN
CAPITULO 1. RESPUESTA INMUNE ANTI-TUMORAL
En los últimos años la inmunología del tumor ha tenido un progreso considerable y esta
recibiendo cada vez más atención. Este incremento del interés esta justificado por varias
razones.
En primer lugar, la noción de antígenos tumorales específicos, que inicialmente afectaba a
toda la superficie celular de las proteínas reconocidas por anticuerpos, se extendió a células
T epítopos expuestas por moléculas MHC y reconocidas por células T especificas (1). El
campo de la inmunología tumoral ha cambiado ampliamente, desde entonces respecto al
análisis y la manipulación de reacciones de las células T. Los resultados hasta ahora
obtenidos con modelos animales han llegado a ser tan espectaculares que las expectativas
se han elevado con respecto a la inmunoterapia de tumores humanos. El principal
problema en el desarrollo de una respuesta celular antitumoral es la identificación de los
antígenos tumorales por las Células T. La identificación de tales epítopos está relacionado
con la inmunogenicidad de los tumores. Diferentes métodos son usados para mejorar la
inmunogenicidad de los tumores, entre ellos la transfección de genes los cuales podrían
posiblemente incrementar la inmunogenética de las células tumorales, tales como genes
citoquina. Los primeros resultados obtenidos en tumores de ratones modelos (2.3) fueron,
de hecho notablemente exitosos y decenas de ensayos clínicos están actualmente en
marcha.
1.1 ANTIGENOS TUMORALES ESPECÍFICOS
Los primeros estudios sugerían la existencias de antígenos tumorales específicos, los
cuales son exclusivos únicamente para las células tumoráles. La especificación de estos
ATE también depende del origen del tejido de las células tumorales y del nivel de
diferenciación de las células en ese tejido. El sistema inmunológico reconoce ATE y
desarrolla anticuerpos específicos contra ATE. Alguno de los ATE son específicas para
ciertos niveles de diferenciación celular. Entre ellos antígenos onco-fetales alfa
fetoproteínico y antígenos carcinoembriónicos, receptores de los factores de crecimiento,
tales como transferencias de receptores, receptores IL-2 y receptores de insulina, los cuales
son específicos únicamente por la proliferación de las células de origen linfoide y están
presentes únicamente en pequeñas cantidades sobre la superficie de la célula madura.
Otro objetivo inmunogénico, presente en el tumor celular son los gangliosidos. La
inmunoterapia pasiva en melanoma y neuroblastoma con anticuerpos anti-gangliosidos
resultaron insignificante en la remisión de estos tumores (4.5).
Anticuerpos supresores tumorales p53 se encontraron en ratones con sarcoma, causado por
methychilandren (6).
Todos estos datos muestran que ATE, identificadas por anticuerpos específicos pueden ser
ambas proteínas mutantes o normales pero presentadas en gran cantidad, o teniendo
algunos cambios en el nivel de glicolisación. Así es mejor referirse a estos tumores de
moléculas específicas como tumores de epítopos específicos y no como tumores de
antígenos específicos.
Como fue mostrado al comienzo de los 40 días, los ratones inmunizados con cyngenic a los
que químicamente se les provocó el tumor celular pueden rechazar un injerto del mismo
tumor. Los antígenos fueron exclusivos para cada sujeto a los que químicamente se le
produjo el tumor, puesto que la protección especifica fue obtenida contra la inmunización,
pero no contra otros tumores, incluso si lo causó el mismo carcinogen. Los antígenos
responsables del rechazo tumoral fueron calificados como Transplantes de antígenos
tumorales específicos, (T.A.T.E.). La diversidad de la naturaleza molecular de estos
antígenos disminuyó la esperanza de identificación de estructuras comunes que pueden ser
usadas para diagnósticos o propósitos terapéuticos. Actualmente se acepta que los
carcinógenos puedan causar la aparición de nuevos antígenos. Pero siempre no está claro si
el resultado posterior es a partir de la mutación celular de los genes o a partir de genes
silentes preexistiendo activados.
Las Células T son capaces de reconocer únicamente antígenos MHC presentados sobre las
células superficiales.
Las células auxiliares CD4+T y las células CD8-T (linfocitos citotóxicos, CTLs)
identifican pequeños péptidos, los cuales se originaron tras la elaboración de una molécula
más grande dentro de la célula, y se presentan mediante las moléculas MHC I o MHC II
respectivamente.
La presentación de antígenos celulares (macrófagos, células B, dendríticas células),
expresan MHC II y presentan anfígenos externos a las células T. Este camino incluye la
endocitosis de la proteína natural, su metabolización, la formación compleja de pequeños
productos péptidos con MHC II hasta terminar en endosomas, emigración a las células
superficiales y la identificación por las células CD4+T. La molécula CD4 está ligada
permanentemente al área (región) de la MHCII. Las proteínas Endógenas (Proteínas vírales,
proteínas integrantes de células normales, etc.) son tratados de formas diversas. Después de
la metabolización interna de la célula los péptidos se cargan dentro de los surcos que
presentan los péptidos de MHC I en la retícula endoplasmática. Las moléculas MHC I son
inestables si no son cargadas con un péptido. Las células T la cual identifica el peptido
presentado por moléculas de clase I expresada como CD8. lo que la ata al área constante de
las moléculas de clase I MHC (8). Como consecuencia, las proteínas endógenas están
perfectamente identificadas por CD8+CTLs en el contexto de MHC I ya que los antígenos
exógenos están principalmente identificado por auxiliares CD4 - T en el contexto de MHC
II. Sin embargo, hay además ayudantes específicos para las células T y CTLs específicos
para MHC II. Los Pépticos, eluted de MHC I son normalmente sobre 9 grandes amino
ácidos, mientras que los péptidos eluted de MHCII son normalmente más grandes y
variados en tamaños.
La primera estructura antigénica es detectada con regularidad sobre las células tumorales ya
que el objetivo por las células T fueron la inmunidad de antígenos vírales. Los otros
objetivos pueden ser antígenos originados a partir de péptidos con la estructura alterada a
partir de una expresión anormal de proteínas normales. Varios Antígenos tumorales
específicos, los cuales parecían ser proteínas mutantes CTL fueron identificados.
Además las proteínas producto de oncogenes alterados o genes supresores tumorales
alterados pueden ser un posible objetivo para las células T. Tienen varias características en
común. Lo primero de todo, estas proteínas están presentes en todo el tumor celular y la
mutación de sus genes es necesaria por tumorigenesis.
El término simultáneo de oncogenes y de Genes Supresores Tumorales (TSG) dirige a la
proliferación preferencial de células malignas. El bloqueo de la expresión de genes
alterados puede ser la forma de tratamiento efectiva contra el Cáncer. Solamente este hecho
motivó la identificación del tiempo actual de 10 TSG entre más de 100 oncogenes, el papel
que el péptido produce en el desarrollo de la inmunidad contra el cáncer tienen respuestas
poco claras. Varias muestras de tales proteínas mutantes serán discutidas más adelante.
Proteína Mutante p53. Mutaciones esporádicas en p53 TSG son los cambios genéticos más
comunes en tumores humanos. La mutación p53 fue encontrado en el 73% de los casos de
humanos en el cáncer de colon., 30-50% en el cáncer de mama, 50% cáncer de pulmón y el
100% de los casos de pequeñas células de carcinomas en el pulmón. (10). La posibilidad de
la generación de los clones de CTI.s específicos para p53 y posiblemente de terapia
antitumor por inmunización con péptido especifico p53 fueron mostrados(11).Encogen
bcr/abl. Mas del 95% de los pacientes con leucemia mielogénica crónica (CML) conlleva el
desplazamiento t(9,22) (q34,q11). Es el desplazamiento de la c-abl protooncogene (abl)
sobre el cromosoma 9 el punto de ruptura que agrupa el área (bcr) sobre el cromosoma 9 al
punto de ruptura que agrupa el área (22) sobre el cromosoma 22 produce los cromosomas
philadelphia y dirige a la formación de la fusión de genes llamada bcr/abl, la cual codifica a
210kDa proteínas quimérico con actividad anormal de la tirosina quinasa (12,13) la abl y
genes bcr son expresados por células normales y de esta manera las proteínas codificadas
son probablemente no inmuogenicas, sin embargo la unión de segmentos de áreas de la
bcr/abl proteína quimérica está compuesta por una secuencia de abl aminoácidos que unen
a aminoácidos ver que son manifestados únicamente por células malignas. La inmunización
de ratones con péptidos sintéticos corresponde a bcr/abl uniendo áreas sacadas del péptido
específico CD4+, de clase II restringido a células T, las proteínas bcr/abl representan un
potencial agente antitumoral relacionado con el suceso de la transformación y manifestados
en la gran mayoría de los pacientes con CML.
El ras oncogenes. Mutación de protooncogenes está entre las alteraciones más frecuentes
encontradas en los males humanos. De esta manera las mutaciones de la Ki-ras, N-ras, o
Ha-ras son encontrados aproximadamente en 905 de carcinomas de páncreas , 50%
carcinoma de colon y el 25% de leucemia mielogenica aguda, pero en menos que el 5% de
carcinomas de mama (15,16,17,18,19). Los ras oncogenes son activados por puntos de
mutaciones. La vacunación con péptidos sintéticos correspondientes al área multada de
proteínas ras obtuvo alguna respuesta de la célula T.
Otro mecanismo puede explicar la manifestación de un antigeno tumoral sobre la célula
transformada. Si un gen es silencioso o manifiesta bajo nivel en el tejido normal, y si es
activado en el tumor celular la sobre manifestación de la inmutación la propia proteina
puede dirigir a las producciones de un grupo de representación de la propia proteína las
cuales son objetivos potenciales para el antitumor CTLs.(21,22)
1.2. PORQUE SON TUMORES POBREMENTE INMUNOGENICOS ?
1.2.1 Antígenos bajos o expresión MHC clase I.
La baja regulación de MHC I ha sido demostrado que ocurre en muchas leucemias de
animales y humanos, linfomas y tumores sólidos.
La idea generalmente aceptada es que la perdida de la expresión MHC I y la consecuente
incapacidad de las células para presentar péptidos específicos tumorales, a clones CTL
pueden inducir a un escape de los respectivos tumores celulares de control Inmunológico.
La baja regulación de la expresión MHC I puede ser la consecuencia del proceso
oncogénico en si mismo, ya que fue mostrado que algunos oncogenes, por ejemplo C-myc
y N- myc son capaces de bloqueo de genes de expresión MHC I en células melanómicas y
neuroblastómicas (24). Interferón, TNF y algunos otros linfoquines pueden activar la
expresión de MHC I sobre las células tumorales.
1.2.2. Carencia de moléculas co-estimuladoras ( B7-CD28/CTLA-4)
La estimulación máxima de las células T, responden a un peptido/MHC complejo
necesitado de una segunda señal co-estimulatoria normalmente repartida por células que
presentan antígenos, por ejemplo células B activadas, macrófagos o células dendríticas. La
ocupación de la célula T receptora en ausencia de una señal co - estimuladora induce a un
estado de insensibilidades en la célula T, caracterizada por una baja producción y
proliferación de IL-2 en respuesta a consecuentes exposiciones a antigenos, incluso en la
presencia de una señal co - estimulado. Este antígeno específico en estado duradero de
insensibilidad ha sido llamado energía. Aunque los mecanismos moleculares de la energía
de la célula T no está completamente indirigida, la evidencia sugiere que un camino coestimulatorio supone la interacción de células T- superficiales, antígenos CD-28 y CTLA-4
con su ligando B7, expresados sobre APS.(25).
El antígeno CD 28 está constitutivamente expresado en el 95% de las células CD4+. el
50% de las células CD8+ y timocitos coexpresando CD4 y CD8 y ello regula la producción
de células T mediante mecanismos transcripcionales y post transcripcioneales (26). CTL4+
es el ligando segundo, y es prácticamente indetectable sobre el resto de las células T, pero
se expreso en los subconjuntos activados de la células CD4+ y CD8+ en ~ 1/30 –50 los
niveles de CD28 (27).
B7, como CD28 y CTLA-4 es un miembro de la súper familia del gen de la
inmunoglobulina y se expresa en las células B activadas y macrófagos y constitutivamente
sobre células dendríticas (28). La función de CTLA en la célula T activada puede ser para
promover de forma eficaz la interacción entre CD 28 y B7. Bloqueando la co-estimulación
del receptor CD28 en la presencia continuada de un antígeno extraño puede conducir a la
insensibilidad de la Célula T.
La inducción de la activación y proliferación de la célula T es un proceso de dos etapas:
Primero: El reconocimiento similar de un complejo específico de péptidos /MHC por los
receptores de la Célula T conduce a la activación de la tiroxina kinases en las células T y a
la transmisión citoplasmática por la cola citoplásmica de la molécula MHC, la cual causa la
expresión incrementada de B7 sobre APC (29,30).
En Segundo Lugar: B7 obra recíprocamente con sus contra receptores naturales, CD28.
CTLA-4, en la célula-T induce un estimulo independiente, probablemente mediante la
fosforilación de tiroxina de péptidos específicos, incluyendo la fosfolipasa C-1 y poner en
funcionamiento señales calcio dependientes y calcio independientes.
Esto conduce posteriormente a la producción de IL-2 y de las citoquinas y a la proliferación
de copias específicas de células T.(25,26). En contraste, cuando el antígeno del péptido es
presentado por MHC en ausencia de B7, los clones de la célula T son incapaces de detectar
niveles de IL-2 y proliferar. La mayoría de los tumores se derivan de las células
parénquimal o mesenquimal, que no expresan B7, así que la capacidad del tumor celular
para actuar eficazmente, ATE puede ser deteriorada seriamente y esa carencia de coestimulación puede ser un importante mecanismo confiriendo una baja inmunogenicidad
incluso a las células tumorales que expresan MHC y ATE.
1.2.3. Factores Inmunosupresivos (TGF-b and IL-10)
Ha sido largamente postulado que las células malignas pueden secretar factores
inmunosupresores que podrían contribuir a la evasión inmunológica.
Probablemente la mejor caracterización del cáncer relacionadas a factores
inmunosupresores es el factor de transformación del crecimiento (TGFb). Inhibe la
actividad del numero de otros citoquines, inhibida la proliferación de células T y B, así
como la generación de LAK y CTL, bloquea la actividad citolítica y abajo reguló la
expresión de MHC y del receptor IL-2.(31).
Otro Inmunorepresores – IL 10 – es además secretado por las células tumorales y por
supresivos T (pero no CTLs) y algunas otras células(33).
1.3 LOS EFECTOS CELULARES EN EL SISTEMA DE DEFENSA ANTI-TUMORAL
DEL ORGANISMO.
Una gran cantidad de diferentes mecanismos de reconocimiento y eliminación de células
transformadas y virus- infectados fueron desarrollados por los organismos. Diversas
células desempeñan un importante papel en el sistema de defensa antitumoral, incluyendo
macrófagos, los monocitos, neutrófilos activados, células Nk, TCLs.
Hay dos etapas en el proceso de la respuesta celular al tumor. En la primera etapa, efectos
no específicos celulares, monocitos y macrófagos, eosinofilos activados y células NK se
reclutan en el proceso de Inflamación y juegan un papel conductor en las primeras 18 horas
del contacto con las células tumorales. Durante la 2ª Etapa, Tumores específicos CTLs
llegaron a ser activados y comenzaron a proliferar y provocaron la respuesta específica
contra las células malignas.
Los antígenos, reconocidos por los monocitos-macrófagos y neutrófilos que están sobre la
superficie de la célula tumorales todavía son detectados. Las células NK reconocen
antígenos y algunos otros antígenos de origen desconocidos.
Las células asesinas reconocen los antígenos que cubren las células, Pero solamente los
CTLs reconocen antígenos (Tumorales, virales, etc) asociado cada uno con moléculas
MHC de clase I o de clase II.
Hay dos tipos posibles de tumores celulares malignos con resultado de la interacción con
células effector. El Tipo de célula maligna necrótica ocurre después de la interacción de
células tumorales con células NK, neutrófilos, y parcialmente macrófagos. El tipo de célula
maligna Apoptosica ocurre después de la interacción con CTLs, monocitos y macrófagos.
El proceso que conduce a la apoptosis está durando entre 18-48 horas y este proceso es
controlado mediante varios genes (37).
Un factor muy significativo que se debe evaluar en el pronóstico de la enfermedad es la
actividad de CTLs contra las células autologous.(38). Como fue mostrado por Uchida et al.
que no solamente la actividad citotóxica de los linfocitos periféricos sanguíneos del
paciente contra las células tumorales se correlaciona con el tiempo que continua con vida el
paciente después de la operación, pero el nivel de la actividad citotóxica, incrementada por
inmunomoduladores además se correlaciona con el pronostico de la enfermedad
(38).Varios inductores de la actividad citotóxica fueron estudiados , entre ellos IL-2,
medicamento autorizado streptococcal 432 o complejo proteinico-azucarado Sizoforan. Los
resultados de estos estudios pueden animar al uso de los inmunomoduladores en la práctica
clínica.
CAPITULO 2.
INMUNOTERAPIA DEL CANCER
Varios acercamientos al tratamiento anti-cáncer, basado en la activación de los diversos
encadenamientos del sistema inmune de defensa fueron desarrollados durante la
investigación intensiva en el campo de la inmunología tumoral. La complejidad del tema no
permitirá discutir cada acercamiento en detalles, así que en esta revisión mencionaremos
solamente a alguno de ellos:
La mielotrasplantación: La trasplantación de los tallos celulares después de la
quimioterapia y de la radioterapia; inmunoterapia celular adoptiva del cáncer y metástasis
basada en la inoculación del anti-tumoral CTLs activado, inmunización activa específica.
La administración post-quirúrgica de la vacuna anti-tumoral, pasiva inmunización con los
anti- ATE anticuerpos (39,40,40).
El otro acercamiento se ocupa del desarrollo de los anticuerpos bioespecíficos, el cual
puede unir a los ATE y las células T receptoras y obtener CTLs(42). Este acercamiento
también se llama retargeting del TCLs no específico hacia las células del cáncer. Varios
anticuerpos bioespecíficos bifuncionales son generalmente usados en casos anti-CD3/ antiATE con CD28/ anti-ATE (42).
Un montón de esfuerzos se hacen hacia el desarrollo de vacunas anti-idiotypic para las
vacunaciones. Esta aproximación sugiere el uso de los anticuerpos anti-idiotypic para las
vacunaciones. Fue mostrado en los estudios con animales, que la inmunización con
anticuerpos anti-idiotypic inhibe el crecimiento tumoral. Los ensayos clínicos mostraron el
desarrollo de inmunorespuestas celulares anti-tumorales y humorales en los pacientes con
carcinoma colonrectal, linfomas de las células B y de las células T de la piel (43). Debe ser
acentuado que cada caso clínico separado requiere un acercamiento individual, basado en la
inmunogeneticidad del tumor y en la capacidad del organismo para desarrollar
inmunorespuestas.
CAPITULO 3
EFECTOS ANTI-TUMORALES E INMUNOMODULADORES DE LAS SUSTANCIAS
DERIVADAS DE LAS PLANTAS USADAS EN ONCOLOGÍA CLÍNICA.
El efecto de los inmunomoduladores o de los inmunomodificadores de la inmunorespuesta
no está especificado y está dirigido hacia la estimulación del sistema de defensa del
organismo en general.
La opción y la optimización de la estrategia del tratamiento con inmunomoduladores deben
ser ajustadas en cada caso clínico específico. El grupo de inmunomoduladores incluye
algunos productos bacterianos, sustancias derivadas de las plantas y limfoquinas. Las
acciones anti-tumorales de estos medicamentos se basan en la potenciación de los efectos
mecánicos o de la inhibición de los componentes supresores, en los efectos y el mediar de
las características del medicamento en sí mismo y en el incremento de la resistencia del
organismo en general (44). Entre los medicamentos estan BCG y Corinebacterium parvum
(44), productos derivados del Streptococci y Enterotoxon B de Stafilococci (45).
Linfoquinas recombinantes (Interferones, IL-2, TNFa) son también extensamente utilizados
como inmunomoduladores (46,47,48). Su acción se basa en el bloqueo de la proliferación
de las células tumorales, su lysis, en la activación de los efectos celulares como efectos
hormonales.
Los extractos de la planta y la sustancias derivadas de las plantas se convierten en
Inmunomoduladores cada vez más populares en Rusia (49). Estos medicamentos son muy
conocidos y se utilizan desde épocas antiguas en China, Japón, y Corea. Pero aquí debemos
mencionar el hecho de que la carencia de los resultados bien documentados del uso clínico
de estos medicamentos hace difícil evaluar sus efectos sobre la progresión de la
enfermedad.
El grupo de medicamentos derivados de las plantas que se utilizan en oncología clínica y
que tienen efectos directos anti-tumorales incluye:
*Vinblastin, derivado de la planta Vinca Rosea y Catharantus Rosea, La vincrestin
derivada de Vinca Rosea tiene efectos antiproliferantes y se usa extensamente en la practica
clínica para la regresión del crecimiento tumoral.
*Podophyllin, derivado de podopfhyllum pellatum, colhamin and colhicin (de
Cholchicium Speciosum Stev.)Taxol y sus derivados (de Taxux brevifolia Nutt).
Ellinticin (de ochrosia elliptica Labill.), Kamptotecin (from Camphotheca acuminata
Decne) y algunos otros también se convierten en medicamentos muy populares y se usan
en ontología clínica.
El centro de investigación ruso del cáncer de la academia rusa de ciencias creó la base de
datos de los productos naturales, los cuales tienen actividad anti-tumoral. Algunas de las
sustancias derivadas de las plantas que no tienen efecto anti-tumoral directo, pero parecen
ser inmunomoduladores. Este grupo de medicamentos incluye adaptogenes biológicamente
activos, tales cono Eleutherococcus, Ganoderma Lucidim, PSK, OK-432, etc. y el grupo de
vitaminas. Estas sustancias se utilizan extensamente en combinación con los citostáticos
(38,39).
Los inmunomoduladores adaptogenes derivados de las plantas no tienen generalmente
ninguna actividad citotóxica, sino que estimulan el inmunosistema ( El incremento de la
inmunidad de la célula T ,disminuye o bloquea la actividad del supresor, estimula la
producción natural de células asesinas, el interferón, la producción de IL-2.)
Los estudios del mecanismo de la acción de Eleutherococcus mostraron su capacidad de
inducir la producción del interferon-g por los linfocitos humanos. Cuando se utiliza en la
practica clínica Eleutherococcus reduce las reacciones tóxicas después de la quimioterapia,
incrementa la duración de la vida, normaliza las subpoblaciones de los linfocitos y reduce
la probabilidad de la progresión recíproca de la enfermedad (53,54).
Datos similares fueron obtenidos en ensayos clínicos con el uso de los otros
inmunomoduladores derivados de las plantas. La sustancia activa de estos medicamentos es
el polisacárido específico. Los polisacáridos de Eleuterococcus estimulan la producción del
interferón en la cultura del linfocito, una actividad citotóxica de CTLs e incrementan las
células del bazo (56). Muchas de las sustancias derivadas de la plantas usadas en la
medicina china tradicional, son capaces de aumentar la producción del interferón y la
actividad de células NK (49).
Proteoglycan, derivado del hongo Coriolus versikalov llamado Krestin-PSK, es utilizado
como inmunomodulador en Japón para el tratamiento del cáncer de estómago, carcinoma
colorectal, del cáncer de pulmón, del cáncer de pecho y de algunos otros, ( 38,57,58,59).
Efectos similares tienen el Letinan (polisacarido derivado del hongo Lentinum edodes)
(60).Applanatum (de Ganordena lucidum), Por ultimo también reduce el dolor, así pueden
minimizar el uso de las sustancias narcóticas. Se demostró que esos polisacáridos estimulan
la actividad de fagocitos (61) y de macrófagos.(62)
Algunas especulaciones sugieren que la contaminación de productos bacterianos, presentes
en tales sustancias derivadas de las plantas pueden también permitirse potenciar los efectos
inmunoestimulantes.
En conclusión podemos decir que la fitoinmunoterapia es el campo mas rápidamente
desarrollado de las investigaciones científicas y probablemente no ayudaran únicamente al
desarrollo de nuevos medicamentos anti-tumorales efectivos si no que también
comprenderán los mecanismos moleculares de sus acciones.
MATERIALES Y MÉTODOS
CULTIVO CELULAR
Las líneas celulares humana QQS, SKVLB, SKOV3, Lm9, astrocytoma línea celular , la
línea celular de ratones Sp2/0, B16 ( Moscú, Centro médico ecológico de investigación )
fueron cultivadas en RPMI media (Gibco), suplimentada con 10%FCS (sigma, E.E.U.U.)
100u/ml de penicilina (Gibco), 100mkg/ml de streptomycine (Gibco) (R10). Linfocitos
periféricos sanguíneos (PBLs) fueron aislados por centrifugación Ficoll-Pague se cultivan
en R10. La proliferación linfocíta se estimula mediante la Con A (Gibco, 10 mkg/ml).
PRUEBA DE VIABILIDAD
El índice de supervivencia de las células bajo acción de diversas sustancias fue evaluado
por el análisis de MTT (basado en la evaluación de la formación de los cristales del
formazane del tetradolium por célula vivas). Las células fueron bien incubadas en la placa
96 con diversas concentraciones del compuesto estudiado (Tres medidas paralelas para
cada concentración ) durante 3 días; entonces 200 mkl de cultivo medido fue añadido a 50
mkl de la solución de MTT (1mg/ml) de 2-4 horas. Después de que la reacción de color
fuera completa, los cristales del formazane fueron disueltos en el 150 mkl del
dimethylsulfoxide y la densidad óptica en 540 ejecutados fue medida. El índice de la
supervivencia de la célula fue evaluado en el porcentaje del correspondiente control
(64,65).
EVALUACIÓN DE LOS EFECTOS DE LA “PF2” EN LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA
DEL PBLs
La actividad CTLs de la “PF2” estimula los linfocitos periféricos sanguíneos humanos
contra los objetivos (Células tumorales humanas) y se evalúa de forma estándar la
realización de análisis Cr o el análisis MTT.
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA “PF2” SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA
DE SPLENOCITES.
La actividad citotóxica de Splenocites en ratones C57Black contra las células B16 de
melanoma de ratones y de ratones Balb/C contra las células Sp2/0 fue medida por
metodo(73). Los objetivos celulares fueron incubados en el depósito de plata 96 en 2 x 104
con efectos celulares (en diluciones 1:10, 1:2, 1:40). “PF2” fue agregada a los medios de
cultivo o administrada intraperitonealmente en ratones durante 3 días. Después de las 24
horas de incubación 3h thymidin fue añadido a los depósitos (1,25 mkCi/en cada depósito).
Después de las 24 horas de incubación con células thymidines se cosechó en filtros y la
radioactividad se detectó en el centelleo del contador. El nivel de citotoxidad fue calculada
de acuerdo a la siguiente formula:
Indice citotóxico=cpm/min(control)-cpm/min(efecto) / cpm/min(control)
El control de suspensión de Splenocytes y animales experimentales (después de la
administración de “PF2”) se preparó en R10. Las células viables fueron contadas en un
contenedor celular. Los glóbulos rojos fueron lysed por 0.87%NH4CI.
EVALUACIÓN DE LOS DAÑOS DE DNA
La estructura DNA fue estudiada por técnicas fluorometrica (74) y su modificaciones (72),
usando fluorimeter (Jasco FP 550), con una longitud de onda de520nm. emisión de 590nm.
El bromuro de ethidium fue usado como un fluorofor. El ratio de desnaturalización básica
de DNA (en porcentajes de DNA de doble trenzado) fue evaluada después de 30min. La
incubación de la célula lysate en PH12,8 en 0ºC, después de 60 min de incubación a 15ºC.
Cantidad de doble trenzado de DNA fue contada usando la formula:
D= (P_B)/(T-B)100%
B- fluorescencia básica (fluorescencia de otros componentes excepto doble trenzada DNA).
T-control de fluorescencia de doble trenzado DNA más otros componentes.
P-resultando fluorescencia de la permanencia después de la desnaturalización del doble
trenzado DNA.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTI-TUMORAL DE LA “PF2” EN MODELOS
ANIMALES.
Las células de melanomas de línea celular Sp2/0 fueron inoculados diariamente
intraperitonalmente en ratones Balb/c.
Para la inducción de tumores sólidos las células Sp2/0 fueron inoculadas subcutáneamente
en ratones Balb/c en 0.1 ml de PBS. Empezando por el segundo día después de la
inoculación del tumor celular. “PF2” en volumen 0.04 ml, fue administrada a 8 ratones 4
veces al día directamente por vía oral. PBs solo fue administrado para los animales del
grupo control. El tamaño del tumor fue medido de 1-3 días. La relativa actividad
antitumoral de la “PF2” fue evaluada por el cambio en el ratio de supervivencia,
incrementando la duración de la vida (ILF), y reduciendo el tamaño tumoral. La siguiente
formula fue utilizada para la calculación del aumento de duración de la vida.(ILF).
ILF = 100 x (T/C-1)
T- cuanto se alarga la vida en días en los animales tratados.
C- cuanto se alarga la vida en el grupo de animales control (no tratados).
El volumen del tumor fue calculado, usando la siguiente formula:
L – diámetro exterior del tumor.
W diámetro interior del tumor.
ACTIVIDAD MITOGENICA DE “PF2”
La actividad mitogénica de “PF2” fue determinada por la capacidad de las sustancias
probadas para estimular la proliferación de linfocitos. PBLs se incubó en el depósito de
plata 96 en R10 el cultivo medio con diferentes diluciones de “PF2” durante 3 días. 3H
thymidine (0.2mkci/por depósito) fue añadido a los depósitos 24 horas antes del final de la
incubación. Las células fueron recogidas en filtros y la radioactividad fue medida en
contadores centelleantes (LKB). el índice de estimulación fue calculado como ratio de
radioactividad de las células incubadas con el control mitiguen (Fitohemagglutinin, PHA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CAPITULO 1
Características Biológicas del Inmunomodulador “PF2”
La meta de este estudio fue la caracterización de la actividad anti-cancerigena de la
sustancia, llamada “PF2”.
Los resultados preliminares del estudio han presentado muestras de actividad citotóxica de
esta sustancia contra los diferentes canceres humanos.
La sustancia tiene un color marrón.
Para caracterizar la actividad anti-tumoral de la “PF2” tenemos varios criterios, entre ellos
la actividad citotóxica contra las células malignas y normales “In Vitro”, efectos mito
génicos sobre PBLs humanos , La capacidad para potenciar la secreción de los factores
citotóxicos por linfocitos, también fue estudiada la capacidad para estimular la actividad
citotóxica de PBL humano.
El mismo criterio fue utilizado para caracterizar la actividad biológica de la “PF2” después
de la depuración parcial.
La necesidad de tal depuración fue causada por la inesterilidad de la sustancia presente o
del precipitado. Además las sustancias fue contaminada con bacterias y levaduras. Los
resultados de la pruebas bacteriológica de “PF2” se muestran en la Tabla 1.1. La
concentración de la endotoxina fue 25u/ml. La depuración parcial de “PF2” fue alcanzada
por la centrifugación, seguida por filtración a través del filtro de 0.22 mM (fig.1.1-1.3,
Tabla 1.2)
TABLA 1.1
RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS BACTERIOLÓGICOS DE “PF2” Y DE SU
SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIÓTICOS.
Bacteria
antibióti
ca
Penicillin
E.coli
Enterococcus
insensible
lactosa-negativo
esherihia
Levomecitin
sensible
Tetracyclin
sensible
Lincomicin
sensible
sensible
sensible
sensible
Piopen
sensible
sensible
sensible
Gentamicin
sensible
sensible
sensible
Oleandomycin
sensible
Polymixin B
sensible
Cefalotin
sensible
Ampicilin
sensible
sensible
insensible
sensible
TABLA 1.2
La secreción de los factores citotóxicos por PBLs humano “In Vitro” después de la
incubación durante 18 horas con las diferentes concentraciones de “PF2” y
Staphylococcus enterotoxin B (SEB). Células tumorales humanas de línea celular
SKVLB fueron utilizados cono efectos de la célula en estos experimentos.
“PF2”
Actividad citotóxica
Actividad Citotóxica
dilución
“PF2” no-estéril
“PF2” estéril
-
100
100
1/105
100
101
1/104
96
103
1/103
99
100
1/102
99
100
1/101
90,3
85,8
SEB 0,1nM
27,1
27,1
PHA 20 mg/ml
13,8
13,8
La posible asociación de la actividad citotóxica de linfocitos con el nivel de expresión
de los receptores superficiales de linfocitos fue estudiado mediante análisis FACS,
después de la incubación de PBLs con
receptores específicos anticuerpos
monoclonales (Becton Dickinson). Los resultados de estos experimentos se muestran
en la Tabla 1.3. Es obvio, que la “PF2” no tiene efecto en la expresión de los antigenos
superficiales de PBLs y no estimula su proliferación ( no incrementa las células con
IL-2 receptor CD25- y HLA DR antígeno se encontró). Esta observación conduce a la
conclusión que el incremento de la actividad citotóxica no es consecuencia de los
cambios en la diferenciación celular, pero es probablemente debido a los cambios en
las funciones celulares.
FIG 1.1
RATIO DE SUPERVIVENCIA
FIG. 1.1
La actividad citotóxica de “PF2” contra los diferentes tumores celulares y PHA- estimulado
PBLs humano in Vitro.
-·- Linfocitos estimulados
+
Astrocitoma
-*- Astraciclin- carcinoma ovárico resistente en humanos (SKVLB)
-o- Carcinoma ovárico humano
-ñ- Linfoma humano de células T,QOS.
-◊ - Linfoma humano de Células B, lm9.
FIG. 1.2:
Actividad mitogénica de “PF2” estériles y no estériles. La estimulación del índice después
de la estimulación del PBLs con PHA (20 mkg/ml) fue utilizada como un control positivo.
FIG.1.3
Los efectos estimulantes de la “PF2” esterilizado y no esterilizado sobre la actividad
citotóxica de PBls humano contra célula en comparación con el testigo (3).
FIG.1.4
Los efectos de la “PF2” sobre la actividad citotóxica de PBLs humano (A), monocitos (B),
neutrofilos (c), 1 –testigo, 2-en la presencia de “PF2” (1:200) contra las células SKVLB.
Los efectos fueron evaluados por los objetivos celulares de los ratios de supervivencia.
TABLA 1.3
EFECTOS DE LA “PF2” (DILUCIÓN 1:200) EN LA EXPRESIÓN DE LA SUPERFICIE
RECEPTORA DE PBLs (24 HORAS DE INCUBACIÓN).
Subpoblación de Linfocitos, %
Marcador
CD3+
CD20+
CD4+
CD8+
CD16CD25+
HLA-DR
Células T
Células B
Auxiliar T
Supresor T
Células NK
(Activación de marcadores)
68
6
32
33
20
4
6
“PF2” 1:200
68
4
33
35
21
5
5
Los efectos citotóxicos de monocitos/macrófagos y neutrofilos especialmente pueden ser
debidos a la "explosión oxigénica" - Proceso que conduce a la generación de estas células
del metabolismo activo de oxígeno, que determinan los efectos citotóxicos de estas células.
HCT- pruebas que utilizamos para determinar los efectos de la “PF2” sobre el nivel de la
actividad neutrofílica. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 1.4
Los efectos del activador zymozan fue evaluado como un testigo y parecía ser parecido con
los efectos de la “PF2”.
TABLA 1.4
ACTIVACIÓN PERIFÉRICA SANGUÍNEA DE NEUTRÓFILOS MEDIANTE
“PF2”
Sustancia
Actividad de Neutrófilos, %
Control (Actividad espontánea)
0
Zimozan
59.2
“PF2” 1:200
46.9
Los efectos citotóxicos de "Explosión oxigénica" está acompañado por el daño del DNA de
estos efectos celuláres. Integridad y estructura de neutrófilos DNA, fueron estudiados
después de su incubación con “PF2” para evaluar su actividad citotóxica y los resultados se
muestran en la tabla 1.5
TABLA 1.5
ACUMULACIÓN DE DAÑOS EN DNA DE NEUTRÓFILOS Y LINFOCITOS DE LA
PERIFERIA SANGUÍNEA DESPUÉS DE SU INCUBACIÓN DURANTE 30 MINUTOS
CON “PF2”.
Daños en el DNA, %
“PF2” dilución
Linfocitos
Neutrofilos
0
0
1:1000
1.2
6.7
1:100
3.4
18.1
1.10
3.5
22.9
Como puede verse, la “PF2” induce a la secreción de Neutrófilos de metabolismos con
oxigeno activo, que daña DNA de esas células. El mismo mecanismo no especificado
puede determinar efectos citotóxicos de monocitos / macrófagos y neutrófilos contra los
tumores celulares en presencia de la “PF2”
FIG.1.5
Los efectos de la “PF2”(1:200) sobre la actividad citotóxica de PBLs humano contra las
células K562 calculadas en el análisis estándar de liberalización de Cromo. A – después de
la Incubación de efectos y objetivos con “PF2”, B – después de la preincubación de
objetivos con “PF2” durante 24 horas. 1 – testigo 2 –1 la presencia de “PF2”.
La actividad citotóxica del PBLs fue estudiada en el análisis de liberación de Cromo
después de 4 horas de incubación de PBLs (efectos) con células K562 (Objetivos). Como
se muestra en la Fig. 1.5 que la actividad citotóxica de PBLs posteriormente incrementa su
estimulación con “PF2”. Es más, se muestra que la actividad citotóxica se incrementa
significativamente después de la preincubación de los objetivos celulares con “PF2”
durante 24 horas. Este dato sugiere que la presencia de “PF2” en los objetivos medios
sensibilizados (células malignas) los hace más susceptibles a los efectos.
Los incrementos de la actividad citotóxica de PBLs de pacientes de cáncer mediante “PF2”
se muestran en la Tabla 1.6. El PBLs de pacientes de cáncer por “PF2” se muestran en la
Tabla 1.6. El PBLs de 2 pacientes en el grupo muestra algunas diferencias en el nivel de
actividad citotóxicas. Pacientes D tenían excepcionalmente un índice alto de actividad
citotóxica, y pacientes B con células B Leukosis no tienen actividad citotóxica de PBLs
debido al predominio de células B.
TABLA 1.6
EFECTOS DE LA “PF2” (DILUCIÓN 1:200) EN LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE
PACIENTES CON CÁNCER
El índice objetivo / efecto es 1:100
CTI,%
Pacientes Diagnósticos Objetivo testigo
SKVLB Objetivo testigo
SKOV3
A Cáncer de la vesícula biliar 13.6 23.9 12.9 18.8
F Cáncer de esófago 0 21.1 0 19.3
L Cáncer de Laringe 11.3 15.9 5.9 9.6
C Cáncer de Colon 0 13.9 11.8 16.0
D Cáncer ovárico 54.8 49.9 40.9 38.8
B Leucosis de la célula B 0 0 0 0
El efecto de la “PF2” (dilución 1:200) en la actividad citotóxica del PBLs de los El efecto
de la “PF2” sobre la capacidad de las células malignas para vencer la
Las células SKVLB expresan la resistencia de múltiples medicamentos, gene mdrl y se
resisten a antibióticos como antracycline. Los efectos de la “PF2” se comparó con los
efectos positivos del Verapamil. El tratamiento con Verapamil hace a las células SKVLB
susceptibles a los antracyclines. Los resusltados de estos experimentos se muestran en la
fig. 1.6. En éste experimento “PF2” no tiene efecto sobre la susceptibilidad de las células
resistentes SKVLB, y además no cambia la susceptibilidad de las células sensibles al
doxorubicina de línea celular SCOV.
Dos conclusiones principales se pueden trazar de éste experimento:
- “PF2” no tiene efecto sobre la susceptibilidad de células sensibles a la
doxorubicina, además no cambia la actividad antitumoral del doxorubicina. Eso hace
posible el uso de la “PF2” en combinación con los medicamentos comunes anti-cáncer.
- “PF2” no tiene efecto en la susceptibilidad de las células resistentes a los múltiples
medicamentos antibióticos.
FIG 1.6
Figura 1.6.
Los efectos de la “PF2” sobre la actividad citotóxica del doxorubicina contra las células
SKOV3 (1.2.3.) y SKLVB (4,5,6) células resistentes a múltiples medicamentos:
1 y 4 en presencia de doxorubicina.
2 y 5 en presencia de “PF2” (1:200) y doxorubicina.
3 y 6 en presencia de doxorubicina y verapamil (20 mcM).
LAS SIGUIENTES CONCLUSIONES PUEDEN SER TRAZADAS DESDE LOS
RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS DESCRITOS EN ÉSTE CAPÍTULO:
1.
La “PF2” no tiene efectos mitogénicos en los PBLs humanos “In Vitro”.
2.
La “PF2” no induce la secreción de los factores citotóxicos por PBLs humanos
“In Vitro”.
3.
La “PF2” no cambia la actividad de los medicamentos anti-tumorales (por
ejemplo doxorubicina).
4.
La “PF2” no tiene efectos reversibles sobre los múltiples medicamentos
resistentes al cáncer celular.
5.
La “PF2” incrementa la actividad citotóxica de los linfocitos, monocitos y
neutrofilos en la sangre periférica de los pacientes sanos y con cáncer contra el objetivo de
las células malignas en los experimentos “In Vitro”.
6. La alta concentración de “PF2” es citotóxica contra la rápida proliferación de las
células normales y malignas.
CAPITULO 2
EFECTO DE LA “PF2” SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE RATONES
SPLENOCYTES FRENTE A LAS CÉLULAS TUMORALES.
Para caracterizar los posibles efectos de la “PF2” sobre las células inmunocompetentes “In
Vivo”, los ratones splenocytes fueron tratados con una concentración mínima no toxica de
“PF2” “In Vitro”.
La toxicidad de “PF2” fue estudiada sobre las células de melanoma de ratón línea B 16
(Fig. 2.1). Los datos muestran que las diferentes preparaciones de “PF2” tienen diferentes
efectos citotóxicos sobre las células tumorales. De acuerdo a los datos de toxicidad la
siguiente dilución de preparados “PF2” fue usada para evaluar sus efectos sobre la
actividad citotóxica de splenocytes de C57 ratones negros “In Vitro”: N12. N14 fueron
probados en dilución 1:200, N7 –1:5000. Los resultados se muestran en la Tabla 2.1. Todos
los preparados tenían efectos sobre la actividad estimulante de ratones splenocytes cuando
el ratio efectos / objetivos fue 1:20. N12 había estimulado actividad citotóxica en todos los
ratios efectos/ objetivos estudiados.
TABLA 2.1
EFECTOS DE LOS DIFERENTES PREPARADOS DE “PF2” (N7, N12, N14) SOBRE
LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS RATONES NEGROS SPLENOCYTES c57
NEGRO, EN CONTRA DE LAS CÉLULAS DE MELANOMAS DE RATÓN B16 “IN
VITRO”.
LOS EFECTOS FUERON EVALUADOS DE ACUERDO AL RATIO DE
SUPERVIVENCIA DE LOS OBJETIVOS CELULARES.
RATIO
CTI, %
DILUCIÓN DE “PF2”
EFECTOS
OBJETIVOS
N7
1:5000
N12
1:200
N
1:200
1:5
3.5
0
14.1
1.6
1:10
18.0
14.0
34.5
14.1
1:20
35.4
66.2
68.0
60.4
FIG 2.1
FIG. 2.1 La actividad citotóxica de los diferentes preparados de la “PF2” (N7,
N14,N12) contra las células melanomas de ratón B16 “In Vitro”.
TABLA 2.2
EFECTOS DE “PF2” (FRACCIÓN N14) SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA
DE RATÓN SPLENOCYTES CONTRA LAS CÉLULAS MALIGNAS
AUTOLOGOUS (MIELOMA DE RATÓN LÍNEA CELULAR Sp2/0) “IN VITRO”.
RATIO
CTI,%
EFECTOS / OBJETIVOS
“PF2”
1:20
8.3
19.3
1:40
30.8
33.5
Estos datos muestran que la “PF2” estimula la actividad citotóxica de
ratones splenocytes y que diferentes preparados de “PF2” tienen
efectos diferentes.
Para estudiar los efectos de la “PF2” “In Vivo”, “PF2” fue administrada a ratones
C57negro y Balb/c , diariamente durante 3 días, por vía oral. Las dosis diarias eran
de 0.5ml y fue administrado en 4 dosis. Los bazos fueron quitados y la suspensión
splenocytes fue preparada de acuerdo a materiales y métodos. Las Células de
mieloma de ratón, línea celular B16 fue usada como objetivo para los ratones
Splenocytes de C57negros, Sp2/o fue usado como objetivo para los ratones Balb/c. Los
resultados muestran que 3 días de administración de “PF2” incrementa la actividad
citotóxica de células inmunocompetentes contra células tumorales allogenic. (Tabla
2.3).
TABLA 2.3
Actividad citotóxica de ratones splenocytes después de 3 días de tratamientos con
“PF2” (dosis diarias 0.5 ml).
Ratio
efectos / objetivos
Splenocytes-C57Negro
Objetivos-B16
1:10
1:20
1:40
Splenocytes-Balb/c
Objetivos-Sp2/0
1:20
1:40
R CTI, %
at Fracciones
io
o
b
je
ti
v
o
s
c
el
ul
a
r
es
o
b
je
ti
v
o/
ef
e
ct
o
s
C
o
n 1
tr
ol
2
3
4
1:
2,
S 5
K
1:
O
5
V
3 1:
1
0
0
7. 0
3
0
1
0
7.
2
4.
8
1.
5
1
8.
2
4.
8
1
6.
4
2
3.
7
2.
4
1 7.2
3.
17.3
0
30.4
2
6.
8
S
K
V
L
B
1:
2,
0
5
0
1:
5 0
1:
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
5
“PF2”
3.
1
16.9
8.
18.0
9
36.3
1
5.
CTI,%
Control
CTI,% “PF2”
25.4
40.8
65.3
37.5
52.4
68.5
5.7
22.7
12.4
37.0
1
0
1
Como se puede ver, la “PF2” induce el incremento de actividad citotóxicas de células
inmunocompetentes contra las células malignas de ambos tanto “In Vitro” como “In
Vivo”.
CAPITULO 3
FRACCIONAMIENTO Físico-QUÍMICO DE LA “PF2”” Y EL
Análisis DE LA ACTIVIDAD Biológica DE LAS
FRACCIONES.
Tres propuestas fueron elegidas para el fraccionamiento de la “PF2”:
1. Fase - inversa cromatográfica sobre el Nucleosil C4.
2. Fraccionamiento por etanol y extracción de cloroformo, seguido de una
precipitación con 80% de sulfato de amonio.
3. Extracción por hexane, cloroformo y etanol.
Las fracciones fueron analizadas por su capacidad para modificar la actividad
citotóxica de PBLs contra los carcinomas ováricos humanos línea celular SKVLB y
SCOV3. Los resultados se muestran en la tabla 3.1.
TABLA 3.1
Actividad biológica de la fracción, obtenida mediante fase inversa
cromatográfica.
De la “PF2” sobre el Nucleosil C4 en agua-acetonitril gradient con la
presencia de 0.1%TFA.
Las fracciones 3, 4 y 5 estimulan la actividad citotóxica de PBLs. Fracción I
reprime su actividad.
Desde entonces los carbohidratos son elementos esenciales de extractos de plantas de
agua, la presencia de carbohidratos fue analizada en diferentes porciones del “PF2”
mediante la reacción con fenol y ácido sulfúrico. Los Carbohidratos fueron
encontrándose el extracto completo y en fracciones 1 y 2 no activas “In Vitro” y
estuvieron ausentes en las fracciones 3,4 y 5, activo “In Vitro”.
TABLA 3.2
Efectos biológicos de porciones diferentes de la “PF2”, obtenidas por la extracción
con solventes diferentes o por un preparado de sulfato de amonio sobre la actividad
citotóxica de PBLs.
Ratio
CTI, %
Objetivos
objetivo/
efecto
Control
I
II
III
IV
V
“PF2”
SKOV3
1:2,5
1:5
1:10
0
7,3
17,2
4.5
12.8
17.1
0
0
5,2
6.3
17.4
17.8
0.4
1.5
12.3
0
14.1
20.4
5.2
20.0
27.2
SKVLB
1:2,5
1:5
1:10
0
0
0
0
0
25.2
0
3.5
19.8
0
17.2
31.3
0
10.1
19.4
0
0
8.0
Los resultado, resumidos en la Tabla 3.2 mostraron la distribución de la
actividad biológica de “PF2” en fracciones, obtenidas por el fraccionamiento de la
“PF2” con etanol y cloroformo y por la preparación con 80% de sulfato de amonio.
Los datos muestran de cloroformo y parcialmente polimerizado, probablemente en la
forma presente de componentes de proteína, que se muestran por la presencia de
actividad biológica en la fracción 5, obtenidas después de la precipitación de sulfato
amónico. Aquí deberíamos mencionar que estos resultados demuestran únicamente
una evaluación cualitativa de la actividad biológica.
CARACTERIZACIÓN DE LAS FRACCIONES
El extracto I fue obtenido después de la evaporación de ~ 1 mg. de
“PF2”. Tenía un agradable olor, parecido a anethol o eugenol. Una
fina capa cromatográfica (TLC) (n-C6P14; AcoEt, 1:1) manifestó una
serie de manchas rectangulares (Rf. 0.9, 0.7, 0,57),
visible bajo rayos UV en invisible después del calentamiento.
Gas liquido cromatografico (GLC) (Cromatografia Hewlett-Packard
5890A, integrador Hewlett-Packard 3393 A, columna capilar ultra-2
(0,33 µm, fase liquida, capa de 25m X 0.2mm), gas- nitrógeno,
Temperatura perfilada: 800C (min. isotérmico, línea creciente con la
proporción de 108/m hasta 2900C) manifestó un montón de
sustancias diferentes en la muestra de PF-2 (95 picos), la intensidad
más alta de pico (t 10.6min.) fue 17,2%, 17 picos tenían mas
intensidad del 1%. 2 extractos fueron obtenidos después de la
evaporación de ~ 2-3 mg de “PF2”. TLC reveló una serie de manchas
Rf>0,7 (UV, débil) .0,59(), 0,44( UV,), 0,40 () y vigilar de cerca el
comienzo (UV).
2 extractos fueron fraccionados sobre las columna con silicagel
silpearl.
2A GLC ( En las mismas condiciones experimentales ) 16 picos, max. t
5.64mim (25,3%) y 7.57min. (26,2%).
2B TLC 9n-C6H14, AcOEt, 1:1) ; Rf 0,57. () 2C TLC Rf.0.46 y – 0.33 (uv)
Precipitado 3 (0,34g), color negro, obtenido por la evaporación de
suspensión de agua.
Supernatant 4 (i.20g) obtenido por la evaporación del rotor, porción
(128 mg) fue analizado en la columna con Sephadex G-15 V0_ 20ml,
dilución de agua, Fig 3.2) En una porción de 2.0ml la presencia de
carbohidratos fue analizada mediante la reacción
con Fenol y ácido sulfúrico. Elution adicional por 20ml de una seria
dilución de la fracción 4D.
Los pesos de las fracciones fueron:
16.8
18.0
36.3
4A..... 3mg, 4B......42mg, 4C.........29mg, 4D……3mg (algunas perdidas
menores pueden ser debidos a la irreversible absorción del material
durante la filtración del gel). 4C contiene cristales con colores claros.
m.b. no orgánicos.
FIG. 3.1
Fraccionamiento de la “PF2” usando TLC, para la nueva separación del preparado 2
mediante extracción de cloroformo y filtración de gel sobre Sephadex G-15 de la
fracción que puede no ser extraídas mediante cloroformo y hexane y no es soluble en
etanol.- significa la capacidad de la fracción de estimular la actividad citotóxica de
PBLs, - sin tales efectos.
FIG. 3.2 FIG. 3.2.
Separación de la fracción 4 sobre Sephadex G-15 (Curva elution)
Casi toda la actividad tóxica de la porción 4 estaba determinada por
la sustancias en la fracción 4D. La Fracción 4A la cual no tenía
actividad citotóxica propia, tenía el más alto efecto estimulante sobre
la actividad Citotóxica de PBLs. Este dato muestra que las diferentes
substancias en “PF2” determina su propia actividad citotóxica y su
capacidad para estimular la actividad Citotóxica de PBLs.
El Fraccionamiento de la “PF2” y el análisis de la fracción mostró que los efectos
estimulantes de la “PF2” sobre la actividad citotóxica, del PBLs está determinada
mediante la mezcla de múltiple componentes de sustancias lipofílicas, extraídas por
hexane y cloroformo. Pero la conclusión final sobre la posibilidad del uso de la “PF2”
en la práctica clínica puede ser realizada únicamente después de las pruebas
adicionales en modelos animales.
FIG. 3.3
FIG 3.3
La actividad citotóxica de las fracciones 4, 4A, 4B, 4C, 4D contra los
carcinoma humano, línea celular SCOV3.
CAPITULO 4:
ARREGLO DE LAS CONDICIONES DE PREPARACIÓN Y
ALMACENAJE DE LA “PF2”.
LA “PF2” es la extracción de los componentes activos de la materia
prima mediante un nuevo procedimiento patentado a nivel mundial:
1. Extracción de agua a 25ºC.
2. Extracción de agua a 37ºC.
3. Extracción de Ethanol (10%) a 25ºC.
4. Extracción de Ethanol (10%) a 37ºC.
La extracción se hizo con el agua o el ethanol desde 300g/l de la
materia prima. Este valor se eligió de acuerdo a los requisitos
presentados.
Durante los procesos de extracción las muestras fueron recogidas
cada 3 días. La extracción fue seguida mediante la centrifugación y
la esterilización a través de filtros de 0.22 . Se formaron precipitados
durante el almacenaje de estos extractos. La actividad biológica de
los extractos fue evaluada mediante los siguientes criterios:
1. Actividad citotóxica de los extractos.
2. Efecto de los extractos sobre la actividad citotóxica humana
PBLs "In Vitro".
Estas características se compararon con la características
preparación estándar de la “PF2”, actividad biológica de la “PF2”,
preparado mediante la disolución de los productos liofilizados.
Después de la extracción mediante los procedimientos 1-3, los
extractos no son tóxicos en dilución 1:400, mediante el
procedimiento 4 – 1:1600. Estas diluciones de los extractos se
probaron por su capacidad para estimular la actividad citotóxica del
PBLs.
La preparación estándar se probó en dilución 1:500, a causa de su
importante poder tóxico.
TABLA 4.1
Los efectos de las diferentes preparaciones (preparados de acuerdo
con los diferente procedimientos de extracción.) sobre la actividad
citotóxica del PBLs. Objetivo celulares – Carcinoma ovárico
humano células línea SCVLB.
Actividad Citotóxica,
régimen de extracción
Tiempo de extracción
(días)
1
3
Ratio objetivos/
I
efectos
II
III
IV
1:5
1:10
1:5
1:10
22
40
19
51
33
57
22
40
27
56
30
48
38
68
33
64
1:5
1:10
1:5
1:10
1:5
1:10
1:5
1:10
6
9
12
15
26
39
32
50
41
48
53
53
Control
“PF2”
“PF2”
1:5
1:10
no
40
59
33
50
34
56
34
54
46
55
29
58
35
49
28
49
30
40
49
56
41
49
19
34
40
46
Dilución 1:4000
Dilución
1:500
40
53
46
63
Con ello se mostró que la actividad biológica se conserva únicamente
después de la extracción por procedimiento I (extracción de agua a
25ºC, 1-3 días) Una extracción más grande conduce a la desaparición
de la actividad biológica.
TABLA 4.2
Efectos de la liofilización sobre la actividad biológica de “PF2”
examinada por sus efectos estimulantes sobre la actividad citotóxica
de PBLs.
Actividad Citotóxica, %
Ratio
objetivos/
efectos
Control
sin “PF2”
“PF2” antes
liofilización
“PF2” después
de liofilización
1:5
1:10
40
59
71
71
58
66
La actividad antitumoral de la preparación estéril fue comparada con
la misma actividad de la preparación antes de la esterilización
(actividad inicial) en los modelos animales, usando la línea celular
Sp2/O.
Los resultados (Tabla 4.3.) mostraron que la actividad biológica de la
“PF2” se reduce después de su esterilización, eso puede ser la
evidencia de la contribución parcial de los efectos antitumorales de
producción bacteriana a los efectos antitumorales de la “PF2” sin
esterilizar. Como se mostró en clínicas, algunas bacterias, por
ejemplo Lactobacillus caseu tiene efectos antitumorales.
TABLA 4.3
Frecuencia de la formación de tumores en ratones Balb/c después del
tratamiento con “PF2” estéril y no - estéril (administración
intraestomacal (vía oral) 8 veces al día, dosis diaria 0.04 ml).
“PF2” preparación
Frecuencia de formación tumoral
-­‐
90
“PF2” no estéril
25
“PF2” estéril
50
El Siguiente esquema fue elegido para la preparación del
inmunomodulador desde la sustancia inicial de la “PF2”:
1. Centrifugación (Beckman centrifugadora j2-21, rotor N14,
13000r/min. 30 min.)
2. Esterilización de la filtración a través de filtro de 0.22 micras
3. Almacenaje en frascos estériles de 250ml (+4º C)*
*- Las condiciones de almacenaje permiten la formación del preparado
marrón sobre el fondo del frasco.
CAPITULO 5
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE “PF2” EN
LOS MODELOS ANIMALES.
5.1 ESTUDIOS TOXICOLÓGICOS.
La toxicidad de la “PF2” fue estudiada en los modelos de ratón. La
“PF2” fue administrada intraperitonealmente en ratones Balb/C en
diferentes dosis. El porcentaje de supervivencia fue determinado a
las 24 horas de haber administrado la “PF2”. (Tabla 5.1.1.)
TABLA 5.1.1
Toxicidad de una administración única intraperitoneal
(dosis diferentes).
Dosis
mg/kg
0.56
5.6
28.0
volumen/raton
ml
0.12
1.2
6.0
de “PF2”
Supervivencia,
%
100
100
0
LD50/24 estuvo entre 5.6mg/kg y 28.0mg/kg. De acuerdo con este
dato “PF2” no es un componente tóxico. (Clasificación de WHO).
5.2 ESTUDIO DE LOS EFECTOS ANTITUMORALES DE LA “PF2”.
Los efectos antitumorales de “PF2” fue estudiado en los ratones
modelos. Los tumores fueron generados por inoculación subcutánea
de los animales en experimento (ratones Balb/c) con las células
mielomas de ratón Sp2/0 (0.5 ml de células en 0,1 ml
de placebo). La primera vez la “PF2” fue administrado 24 horas
después de la inoculación de las células malignas y después de ello se
administró diariamente, 4 veces al día, 8 ml /kg. Los resultados se
muestran en la tabla 5.2.1.
TABLA 5.2.1
Los efectos de la administración diaria intraestomacal de “PF2”
(0,04ml 4 veces al día) sobre el tumor desarrollado.
Grupo
Frecuencia de tumores desarrollados después
de un mes de tratamiento, %
Control
91
“PF2”
20
Los datos muestras que la “PF2” tiene una actividad antitumoral en
modelos de ratón “In Vivo”. Para evaluar los efectos terapéuticos, la
“PF2” fue usado para el tratamiento fueron tratados con “PF2”
intraestomacalmente (vía oral) con una dosis de 40ml/kg ,8 veces al
día (dosis más alta que en el experimento anterior), los animales del
grupo de control obtuvieron únicamente placebo. Los resultados se
muestran en la Fig. 5.2.1. Del tratamiento de animales con “PF2”
resultó una significativa inhibición del
crecimiento de los tumores. Para elegir el protocolo optimo de la
administración de la “PF2” fueron probados varias combinaciones en
el mismo modelo de ratón.
1.
2.
0.04 ml de “PF2” 4 veces por día.
0.1
ml de “PF2” 8 veces por día.
3.
0.2 ml de “PF2” 8 veces por día durante 14 días, y 0.05ml
veces un día.
4.
8
Grupo de control, PBS.
Los resultados se muestran en la Figura 5.2.2. El protocolo 3 fue
elegido como optimo por la cohibición del crecimiento tumoral en los
animales experimentados.
Los datos experimentales están resumidos en la Tabla 5.2.2.
FIG 5.2.1
Tamaño del tumor en cm3
Días
FIG. 5.2.1.
La dinámica del crecimiento del tumor inducido Sp2/o tumor
inducido en los animales controlados (1) y después del tratamiento
con administración de “PF2”.
FIG. 5.2.2
Tamaño del tumor en cm3
FIG. 5.2.2
Dinámica de crecimiento del tumor inducido Sp2o en los grupos
experimentales y de control de animales. Protocolo de la
administración de “PF2”:
1. 4 veces por día, 0.04ml por ratón
2. 8 veces por día, 0,1ml por ratón
3. 8 veces por día, 0,2ml por ratón durante 14dias, entonces
8 veces al día 0,05ml por ratón.
4. Grupo de control.
TABLA 5.2.2
Actividad anti-tumoral de “PF2” (dosis diferentes) utilizadas en el
protocolo con administración diferente.
Frecuencia
de
la
Frecuencia
formación
Ratio
de
la
de
la
Protocolo
de
Incremento
del tumor un
media
de
administración
completa
de la media
mes después
supervivencia,
disminución
de “PF2”
de vida, %
de
en días.
del tumor
tratamiento;
%
1. 0.04 ml, 4
30
veces al día
20
67.1
61.3
2. 0.1 ml,
veces al día
30
20
56.7
36.6
3. 0.2 ml, 8
veces al día 14
días, y luego 8 10
veces
al
día
0.05 ml.
40
72.7
74.6
4.
0
41.6
-
-
8
90
5.3 COMBINACIÓN DE “PF2”
TUMORALES Y SU USO “IN VIVO”
CON
MEDICAMENTOS
ANTI-
La acción combinada de “PF2” y conjugada de alfaFP con Vinblastina
fue estudiada en los ratones modelos conjugada fue administrada
intraperitonealmente, diariamente durante 7 días, (15 mkg-kg de
Vinblastina, diariamente).
La “PF2” fue administrada diariamente, 8 veces / día, 0.05ml cada
dosis. El efecto de esta dieta está resumido en la Tabla 5.3.1.
TABLA 5.3.1.
La frecuencia de formación de tumores en ratones Balb/c después de
la inoculación con células tumorales, seguidos por la administración
de la conjugación alfaFP-VP y “PF2”.
Medicamento
Dosis
Frecuencia
de
la
formación del
tumor en %.
1.Control
-
90
2. alfaFP-VB
15µ/kg de VB, 7 días, i/p
60
3. “PF2”
0.05ml, 8 veces/día, diariamente 25
4. alfaFP - VB + “PF2” Similar a 2,3
25
Los resultados prueban la posibilidad del uso combinado de “PF2” con
medicamentos quimioterapéuticos.
5.4 POSIBLE USO DE LA “PF2” PARA LA PREVENCIÓN DEL CÁNCER.
La capacidad de la “PF2” para prevenir la formación de tumores fue
estudiada en los mimos modelos de ratones. Los animales fueron
inyectados con “PF2” diariamente intraestomacalmente (vía oral), 8
veces al día 0.05 ml por dosis. Entonces la administración de la “PF2”
se paró. El grupo experimental y el de control de animales fueron
inoculados con células Sp2/o (0.5ml). 90 días después de la
inoculación todos grupo de control desarrollaron tumores y
murieron. Estos experimentos prueban la evidencia que la “PF2” es
altamente efectivo en la prevención de la formación del Cáncer.
Tabla 5.3.2
Frecuencia de la formación del tumor en ratones después de la
administración preventiva de la “PF2”
Sustancias Frecuencia de la formación de Tumores en %
PBS
100
“PF2"
0
CONCLUSIONES:
1.
“PF2” reduce significadamente la frecuencia de la
formación del tumor.
2. “PF2”, cuando se utilizó en altas dosis, consiguió el
incremento de la vida de los animales tratados.
3. “PF2” impidió el crecimiento tumoral.
4. La “PF2” es muy efectiva en la prevención de la formación
del tumor, por lo tanto puede ser utilizada para la prevención del
cáncer
CONCLUSIONES GENERALES:
Los resultados definitivos del informe demuestran que el estudio de
la sustancia llamada “PF2” es claramente antitumoral, no solo
debido a la directa acción citotoxica y citostatic, sino también debida
a la activación de las defensas des sistema del organismo en general.
Se demuestra la capacidad para prevenir el CÁNCER en los modelos
animales donde la “PF2” ha probado ser un efectivo agente previsor.
Estas propiedades de la
inmunomodulador.
“PF2” nos permiten calificarlo como un
Nuevos estudios están planificados para investigar la actividad antitumoral en la radiación inducida y en los modelos tumorales
cancerigenos inducidos. Su baja toxicidad y su alta actividad
antitumoral en los experimentos con animales hace ver a la “PF2”
como candidata para su uso en la fase I de las pruebas clínicas para la
investigación de su posible uso en la terapia contra el cáncer.
Resumiendo todos los datos experimentales, revisando el manuscrito,
llegamos a las siguientes conclusiones:
1.
La “PF2” no tiene efectos mitogénicos en PBLs “In Vitro”
sobre humanos.
2.
PBLs.
La “PF2” no induce a la secreción de factores citotóxicos en
3. La “PF2” no cambia la actividad antitumoral de las medicinas
(por ejemplo doxorubicina).
4.
La “PF2” no tiene efectos reversibles sobre los múltiples
medicamentos resistentes de las células cancerosas.
5.
La “PF2” incrementa la actividad citotóxica de los
linfocitos, monocitos y neutrófilos de los donantes
saludables y de pacientes de cáncer contra el objetivo de las células
malignas "In Vitro".
6.
La alta concentración de “PF2” es citotóxica contra la rápida
proliferación de las células malignas.
7. La “PF2” induce al incremento de la actividad citotóxica de
las células inmuno incompetentes las células malignas tanto "In
Vitro" como "In Vivo".
8.
El fraccionamiento de la “PF2” y el análisis de sus fracciones
mostraron que la estimulación de los efectos de la “PF2” sobre la
actividad citotóxica del PBLs están determinadas por los múltiples
componentes mixtos de sustancias
lipofílicas, extraídas por
hexane y cloroformo y por la molécula altamente soluble en el agua,
conteniendo la fracción hidratos de carbono.
9. Los estudios llevados en los modelos animales como ratones
con tumores, inducidos por inoculación del tumor celular autologous,
mostró que la “PF2” de los animales tratados. La “PF2” impide el
crecimiento del tumor y pareció ser muy efectiva en la prevención
de la formación del cáncer, así que puede ser usada para la
prevención del cáncer.
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EL ANÁLISIS DE LA “PF2” POR MEDIO DE LA GRAN CALIDAD DEL
LIQUIDO CROMATOGRÁFICO Y SDS-ELECTROPHORESIS
HPLC: La pruebas de la “PF2” fueron resueltas sobre la columna
"Nucleosil 30-7C4" (Macherey-Nagel, 3.50 mm.) La elution de la
sustancias absorbentes en 214 nm fue realizado por una pendiente
lineal (0-80% de acetonitril, conteniendo 0,1% de ácido
trifluoracetico.
Los resultados de las resoluciones están presentados en la figura 1.
Los picos fueron combinados separadamente, liofilizado y analizado
en los experimentos con células humanas. SDS-Electrophoresis;
durante el transcurso de la resolución de la “PF2” sobre
elecrophoregramma nos hemos encontrado con 4 bandas de proteínas
principales con aproximadamente una masa molecular de: 100,70,50
y 42 kDa (Figura 2).
LOS EFECTOS DE LA “PF2” SOBRE EL NIVEL CELULAR
Nosotros hemos investigado:
1.
Los efectos de esterilización de la “PF2” por filtración
sobre su capacidad para estimular la actividad citotóxicas de
leucocitos mononucleares (ML) hacia las células tumorales humanas
"In Vitro".
2.
Los efectos de los picos separados de “PF2” tras el alto
rendimiento liquido cromatográfico HPLC, sobre CTA de ML hacia
carcinomas ováricos SKVLB células. Los efectos de la “PF2” respecto
a la resistencia (SKVLB) y sensibilidad (SKOV3) para células
carcinomas ováricas en comparación con Verapamil- la sustancia
capaz de transformar la resistencia de las células SKVLB.
Los resultados:
1.
CTA fue estimada como un superviviente de los objetivos
celulares en co-cultivación con ML en la presencia de “PF2” en
dilución 1:100. El superviviente de objetivos celulares como SKVLB y
SKOV3 (Carcinomas humanos ováricos resistentes y sensibles a
antracilinic y antibioticos respectivamente) fue medido después del
lavado de ML en MTT- test. Se mostró (Tabla 1) que la esterilización
del
ACTIVIDAD CITOTOXICA
%
SKOV3 como objetivo celular
SKVLB
como
objetivo celular
Inmuno
Inmuno
Inmuno
Inmuno
Control noControl noEsteril
Esteril
esteril
esteril
1:1.2
21.9
2.8
13.1
0
6.2
25.6
1:2.5
31.6
4.0
16.2
8.5
14.3
18.5
1:5
34.7
6.6
12.0
10.3
26.6
-
1:10
48.5
21.6
46.3
39.2
26.6
44.0
TABLA 1
2.
TABLA 2.
INFLUENCIA DE LOS PICOS SEPARADOS DE “PF2” SUPERVIVIENTES
DE LAS CELULAS SKVLB.
MUESTRAS
SUPERVIVENCIA DE CELULAS %
Control
100
“PF2” (1:100)
100
“PF2" pico nº 1 84.4
pico nº 2
85.9
nº3
97.2
nº 4
89.5
nº 5
85.7
TABLA 3.
LOS EFECTOS DE LOS PICOS SEPARADOS DE LA “PF2” SOBRE CTA
DE ML HACIA LAS CÉLULAS SKVLB.
ACTIVIDAD CITOTOXICA %
CONTROL “PF2” PICOS
1:1.2
1:2.5
6.2
14.3
1
2 3
4
5
0
0 20.5 11.3 0
6.4 0 18.7 10.0 9.0
Como se puede ver desde las Tablas los picos separados de “PF2” no
tienen actividad citotóxicas. Pero algunos de ellos estimulan CTA de
ML con un alcance bastante alto. Ciertamente los experimentos
necesitan más cautela para probarlos.
3.
Los resultados obtenidos están representados en la Tabla 4 y
permite concluir que “PF2” no tiene influencia sobre las actividades
antitumorales de doxorubicina en comparación con el Verapamil. Así,
que podemos concluir que los efectos de “PF2” sobre CTA de ML no
combinaba con la funciones de la proteína p170(MDR, resistentes a
múltiples medicamentos).
TABLA 4
LOS EFECTOS DE LA “PF2” (1:100) Y VERAPAMIL (20nM) SOBRE LA
ACTIVIDAD
ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE DOXORUBICIN HACIA
SKVLB y SKOV3 CELULAS “IN VITRO”.
Células supervivientes, %
Células SKVLB
Células SKOV3
DR+
DR+
DR+
DR+
DR
DR
“PF2” VER
“PF2” VER
100
100
0
0.03 89
91
91
0.06 72
91
74
0.12 58
68
52
0.24 53
0.48 45
1.2 20
58
57
18
36
20
20
93
89
92
96
91
95
89
72
4
2.5
87
80
40
5.0
67
73
-
10.0
43
49
40
GRAFICO SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LINFOCITOS
SKOV3/UNSTIM.
GRAFICO SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS
LINFOCITOS SKVLB/STIM
GRAFICO SOBRE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LOS LINFOCITOS SKVLB/
UNSTIM.
LOS RESULTADOS DE ANÁLISIS DE TOXICIDAD DE LA
“PF2”
27 de marzo de 1995
La toxicidad de la “PF2” registrada entre 0.55g/kg. La administración
de desarrollo de toxicidad aguda). Lo estimado LD50 para fue entre
10 y 28 kg. Conclusión: De acuerdo a los Principios y métodos de la
determinación de toxicidad de sustancias químicas de la UN programa
ambiental y
WHO
(Criterio
higiénico
de
las condiciones
ambientales,1981) la “PF2” no es tóxica y no tiene ningún efecto
dañino o perjudicial.
Este documento lo firma el Director general del Centro
investigación de Diagnósticos moleculares y terapias de Moscú.
El profesor E.S. Severin
DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD DE LA “PF2”
de
La toxicidad de la “PF2” fue probada sobre ratones (Balb/c) (Peso 1820g) por inyección intraperitoneal con diferentes concentraciones de
“PF2” en las siguientes dosis:
1. 0.12ml (correspondientes a 0.55g/kg de peso)
(lo mismo fue utilizado para el tratamiento con pacientes
humanos).
2. 1.20ml (5.5g/kg)
3. 6.00ml (28g/kg)
A los ratones controlados le fueron dados el mismo volumen de
solución fisiológica. (Se utilizaron, 3 animales por cada grupo).
En 24 horas ratones los cuales habían recibido 28g/kg murieron, los
otros dos grupos y el grupo control estuvieron vivos durante 14 días, (
el tiempo necesario para el desarrollo de toxicidad aguda).
Así que, “PF2” tiene una toxicidad de (LD50) entre 5.5 y 28g/kg,
medidas conducidas en concordancia con los "Principios y métodos
de la determinación de las sustancias químicas" de la UN programa
medioambiental y WHO (Criterio higiénico de las condiciones
medioambientales.1981).
Consecuentemente los componentes de la sustancias de “PF2” no
causa ningún efecto perjudicial al las concentraciones en el rango de
3-5 g/kg y además no es tóxico (Academia nacional de Ciencias,
1975).
Para la investigación con el fin de saber cuando la “PF2” puede llegar
a ser venenosa se necesitaría repetir diariamente las inyecciones de
“PF2” durante 5-12 días. En nuestro experimento, los ratones
recibían diariamente 4 dosis orales correspondientes a 0.55g/kg,
estuvieron vivos durante 12 días y no mostraron ninguna diferencia
de los ratones controlados.
“PF2” EXPERIMENTO Nº 20
El siguiente experimento utilizando mieloma fue un éxito ( usando 16
ratones):
El día que empezó el experimento sería llamado día "A".
A. 16 ratones Balb/c fueron inyectados a "A", con 10 células de
mieloma sp2/0.
B. 5 de esos 16 ratones, dos días después de "A", empezaron a
ser tratados oralmente con una dosis de “PF2” proporcional al
volumen que se da en pacientes humanos.
NINGUNO DE ESOS 5 RATONES DESARROLLARON
NINGÚN TUMOR VISIBLE
- 1 ratón sin embargo murió 30 días después de "A", sin ningún
tumor visible.
- Otro ratón murió 39 días después de "A", pero ellos tenia
pequeños tumores sólidos con un diámetro de unos 3 mm).
- 3 de ellos están vivos 50 días después del día "A" y con buena
salud.
C. Los 7 ratones controlados - que no llevaban la “PF2”
murieron entre 37 y 40 días después de recibir una fuerte dosis de
cáncer (mieloma), descrito en A.
D. 4 ratones, sobre el día 26 después de "A", empezaron a
ponerse “PF2” (después de la formación de visibles tumores- la tallas
de los tumores fueron de 27x30, 10x24, 14x17 y 12x18mm).
EL TRATAMIENTO DE LA “PF2” DETUVO EL CRECIMIENTO DE LOS
TUMORES
2 de ellos murieron el día 41
2 de ellos todavía estaban vivos el día 50 y los tumores han
parado su crecimiento y son de la misma talla que el día que
empezaron a tomar “PF2”.
CONCLUSIONES DESPUÉS DEL EXPERIMENTO Nº 20
1. La “PF2” tiene una influencia en el tiempo de aparición del
tumor, por ejemplo:
-Los tumores en ratones no tratados aparecieron sobre el
día 19.
-Los tumores en ratones tratados empezaron a aparecer
sobre el día 26.
2. La “PF2” administrada oralmente en ratones con tumores
formados (día 26) retardaron y pararon el desarrollo de tumores que
habían aparecido el día 26 después de la inyección con mieloma se
menciona en el apartado A.
“PF2” EXPERIMENTO Nº 21
Los criterios siguientes del 1 al 4 fueron usados para este
experimento con los parámetros adicionales (usando 50 ratones):
1. Tiempo de aparición del tumor.
2. Tamaño del tumor y dinámica de su desarrollo.
3. Duración de la vida de los ratones tratados y de los no
tratados.
4. Autopsia de los principales órganos (bazo, hígado, etc.) de
ratones que murieron.
50 ratones modelos Balb/c (Peso 18 - 20g) con 0.1ml (107 células)
fueron inoculadas subcutáneamente con células mieloides. En el
experimento
nº
20
usamos
una
doble inyección
tanto
subcutáneamente como intraperitonealmente.
Las células fueron obtenidas del tumor extraído de los ratones usados
en el experimento nº 20, homogenizados, lavados con PBS y
centrifugados.
Para el control de viabilidad y cálculo de la cantidad de tinte especial
- Trypan azul fue utilizado.
A - 20 ratones fueron utilizados como control sin
tratamiento.
B - 30 ratones fueron alimentados con “PF2” por un
nuevo
procedimiento,
con
las
siguientes
concentraciones orales:
b.1 10 ratones- 4 veces x 0.4ml por día (lo mismo que
en el exp. 20
b.2 10 ratones - 8 veces x 0.1 ml por día
b.3. 10 ratones- 8x 0.2 ml por día.
En el ultimo grupo - dosis máxima recibida (10 veces más alta que en
el experimento 20) Dos ratones después de 10 días de experimento
inesperadamente desarrollaron edemas y murieron. Después que
redujéramos la dosis al 50%.
La situación del día 19 del experimento:
A. Grupo sin tratamiento - 17 de 20 desarrollaron tumores visibles
b.1 grupo con 4 x 0.04 (0.16ml diariamente)
1 de 10 desarrollaron un pequeño tumor
b.2 grupo con 8 x 0.05 (0.04 ml diariamente)
1 de cada 8 desarrollaron 1 pequeño tumor
b.3
grupo con 8 x 0.1 (0.8 ml diariamente)
2 de 10 desarrollaron tumores pequeños.
LOS RESULTADOS DEL EXPERIMENTO CON RATONES EN EL DIA
50DESDE EL20/03/1995AL6/05/1995.
A. GRUPO CONTROLADO (20 RATONES) MIELOMA DE RATÓN Sp 2/o
Situación en el día 40
- 26-04-1995:
18 ratones tenían un tumor, desde 26/04/1997, 3 ratones con
tumores empezaron a ser tratados con Vinblastine una vez a la
semana y 3 ratones con tumores empezaron a ser tratados con
Vinblastine junto con “PF2”.
Situación en el día 50 - 6/05/1995:
14 ratones de este grupo controlado han muerto, y además 3 nuevos
ratones tratados únicamente con Vinblastine murieron. Por lo tanto
de los ratones controlados 17 ratones del total han muerto.
Únicamente 1 ratón de los tres tratados con Vinblastine
junto “PF2” está todavía vivo: En el día 40 y en el 50 tenían la misma
talla de tumor 25 X 35 mm ( El mismo resultado que tuvimos en el
primer experimento con ratones), pero 2 ratones de este grupo
murieron (cuando se inyecto con Vinblastine habíamos elegido los
ratones con los tumores más grandes-probablemente era demasiado
tarde). Al mismo tiempo dos ratones los cuales no tenían tumores en
el día 40 no tenían tumores visibles. Las razones son desconocidas.
Finalmente, de ese grupo 3 ratones están todavía vivos: de los cuales
2 sin tumores y 1 (El cual fue tratado con Vinblastine y “PF2” con
tumor.
B. 10 RATONES INYECTADOS CON MIELOMA DE RATON Sp2o FUERON
ALIMENTADO CON “PF2” 4 VECES CON 40µL (DETERMINACIÓN DE LA
DOSIS).
Situación en el día 40:
6 ratones tenían pequeños tumores, 4 ratones no tenían tumores.
Situación en el día 50:
8 ratones estaban todavía vivos - 5 de ellos tenían tumores de tamaño
pequeños.
Los resultados:
1. Retraso en el crecimiento de tumores.
2. Muerte de 2 ratones
3. Aparición del tumor en un ratón más.
Los 2 ratones (los que han muerto) habían recibido “PF2”
contaminado - de acuerdo con nuestros experimentos con células,
esta remesa fue altamente contaminada mediante almacenamiento.
Ahora en este grupo tenemos 8 ratones 5 de los cuales tienen
tumores. Comenzando el 5 de mayo 2 de ellos con tumores aún
recibiendo “PF2” con alfa-fetoproteina vinblastina conjugada.
C 10 RATONES INYECTADOS CON MIELOMA DE RATÓN Sp2/o FUERON
ALIMENTADOS CON “PF2” ,8 VECES 100µl (DETERMINACIÓN DE LA
DOSIS).
Situación el en día 40:
tenían.
Situación en el día 50:
tienen tumores.
6 ratones tenían pequeños tumores, 4 no
8 ratones todavía vivían - 6 de ellos
Los resultados:
1. Los tumores han crecido pero mas lentamente
2. 2 ratones han muerto
3. aparición de tumores en 2 ratones más.
Los dos ratones que han muerto habían recibido “PF2” contaminado
de acuerdo con nuestro experimento celular, esta remesa estaba
altamente contaminada mediante bacteria y levadura - probablemente
la mala calidad de este lote es la única razón de su muerte estuvo
(demasiado tiempo fuera de la nevera). Confirmando instrucciones de
almacenaje.
Ahora en este grupo nosotros tenemos 8 ratones, 6 de los cuales
tienen tumor. Dos de ellos (con tumor) empezaron el 5 de mayo
cuando aun recibían “PF2” a ser inyectados con alfa-fetoproteina:
Vinblastina conjugada.
D 8 RATONES INYECTADOS CON MIELOMA DE RATÓN Sp2o FUERON
ALIMENTADOS CON “PF2”, 8VECES 50ml (determinación de la dosis)
Situación en el día 40: Dos ratones tenían pequeños tumores 6 no
tenían.
Situación en el día 50: Todos los ratones estaban vivos y solo 2 de
ellos tenían tumores( como en el día 40).
Nuestras conclusiones:
1. “PF2” retrasa el crecimiento de tumores
2. Paraliza las muertes.
3. Paraliza la aparición de nuevos tumores.
Ahora en día 6 de mayo tenemos en este grupo 8 ratones, 2 de los
cuales teniendo tumores, y todavía recibiendo “PF2” fue inyectado
con alfa-fetoproteina : Vinblastina conjugada. La dosis administrada
en este grupo es la más apropiada.
Algunos comentarios al experimento con el grupo D: Al empezar
experimento nosotros teníamos 10 ratones en este grupo. Fueron
tratados con altas dosis de “PF2”. Los 2 ratones han muerto en
comienzo del experimento, después que cambiáramos la medida de
dosis (entre B y C).
Los mejores resultados probablemente se pueden explicar por
rotura de la estimulación de la inmunidad al comienzo de
formación del tumor y siguiendo de la dosis tardía.
el
el
la
la
la