Estudios del quitosano como portador de osteoblastos en

Estudios del quitosano como portador
de osteoblastos en cultivo
Chitosan studies as a carrier of cultured osteoblasts
1
2
3
4
Departamento de Ingeniería Química
lngenieros Industriales. UPM
Madrid
Laboratorio de Fisiología Ósea
Fundación Jiménez Díaz
Madrid
Servicio de Traumatología
Centro de Rehabilitación y Prevención FREMAP
Majadahonda (Madrid)
Departamento de Óptica
Facultad de Ciencias Físicas. UCM
Madrid
Larena A. 1
Cáceres D. A. 1
De la Piedra C. 2
Montero M. 2
Vicario C. 3
Fuentes A. 3
I barzábal A. 3
Bernabeu E. 4
Ribelles P. 4
RESUMEN
ABSTRACT
Introducción: El quitosano es un material potencialmente
útil en el trans~ortede células humanas.
Objetivos: Comprobar la penetración por los osteoblastos
humanos en cultivos en diversas pre~aracionesde auitosano.
y esterilización
Materiales y métodos:Tras lampreparación
de diferentes formas de quitosano se procede a su adición a un
cultivo primario de osteoblastos humanos. Mediante distintas
técnicas microscópicas se analiza la penetración en el biomaterial de las células cultivadas.
Resultados: Se ha encontrado penetrabilidad osteoblástica
así como crecimiento superficial en membranas de quitosano
de distintas concentraciones.
Introduction: Chitosan is a potentially human cells carrier
useful material.
0bjedves:To probe penetration in several chitosan preparations by human cultured osteoblasts.
Material and methods: Different chitosan forms were prepared and sterilized. Then they were added to a primary human osteoblasts culture. Osteoblasts penetration into the biomaterial was analyzed using several microscopic techniques.
Results: Osteoblastic penetrability was found. Surface growing on different concentrations chitosan membranes could
be demonstrated.
Palabras clave: Quitosano, osteoblasto, penetración, biomaterial.
Larena A, Cáceres D A, de la Piedra C, Montero M, Vicario C,
Fuentes A, Ibarzábal A, Bernabeu E, Ribelles P
Estudios del quitosano como portador de osteoblastos
en cultivo
Patología del Aparato Locomotor, 2004; 2 (3):7 99-204
Key words: Chitosan, osteoblast. penetration, biomaterial.
Larena A, Cáceres D A, de la Piedra C, Montero M, Vicario C,
Fuentes A, Ibarzábal A, Bernabeu E, Ribelles P
Chitosan studies as a carrier of cultured osteoblasts
Patología del Aparato Locomotor, 2004; 2 (3):799-204
Correspondencia:
A. Larena
ETS Ingenieros Industriales
Universidad Politécnica de Madrid
C/José GutiérrezAbascal, 2
28006 Madrid
47
PATOLOG~
DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
199
A. Larena, D. A. Cáceres, C. de la Piedra, et al.
El quitosano, cadenas de N-acetilglucosamina, es un derivado desacetilado de la quitina, polímero natural que se encuentra en estructuras de
insectos, artrópodos y caparazones de crustáceos.
Su capacidad como material biocompatible ha
sido ampliamente demostrada en numerosos estudios (1,2).
Claire Chatelet, Odile Damour and Alain Domard investigaron la proliferación de keratinocitos y fibroblastos y las propiedades biológicas de
membranas de quitosano de diferente grado de
desacetilación (3) como paso previo para el estudio de la biocompatibilidad.
Para la correcta regeneración ósea una de las
cualidades requeridas a los biomateriales es la
capacidad para inducir la osteoinducción a través de una adecuada proliferación celular de osteoblastos así como posibilitar la accesibilidad de
otros tipos celulares a través de la penetrabilidad
y porosidad del material. Sin embargo, se ha mostrado que la adhesión de osteoblastos, mediada
por integrinas (subunidades B1 y B5), caderinas
(caderina E, 4 en bajos niveles, 11 y N-caderina)
y conexinas (conexina43 y conexina 45 in vitro)
está condicionada por la superficie del biomaterial y es necesario un entendimiento completo de
la adhesión osteoblasto/material para optimizar
la interface hueso/biomaterial (4).
El objetivo de este trabajo se basa en estudiar
la biocompatibilidad de membranas de quitosano neutralizadas y sin neutralizar para el crecimiento de cultivos primarios de osteoblastos, su
degradación en el medio de cultivo y la penetración de los osteoblastos en dichos medios.
El quitosano minimum 85% deacetilado de
caparazones de cangrejo fue proporcionado por
SIGMA. Se midió en el Centro de Ciencias Medioambientales del CSIC, el contenido de Pb, As
y Hg en un equipo lnductive Coupled Plasma Perkin Elmer Optima 4300 DV de una disolución de
1,5% de quitosano en 0,5% de ácido acético y
se comprobó que en los tres casos el contenido
era despreciable.
El KOH 90% escamas puro y la glicerina 87%
purísima, peso molecular 92,10 gmlmol fueron
proporcionados por PANREAC.
2 O0
El medio de cultivo de osteoblastos utilizado
fue el Dulbecco's Modified Eagle Medium 10938,
proporcionado por GlBCO lnvitrogen Corporation que fue suplementado además por 100 Ulml
de penicilina, 100 pglml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM y 20% de suero bovino fetal.
Preparación de los filmes de quitosano
Se realizaron distintos tipos de películas de
quitosano en función de su concentración utilizando como soporte placas Petri de polietileno
de alta densidad de 9 cm de diámetro según el
método reportado por Qiao-ling Hu, Zheng-ping
Fang, Ying Zhao and Cheng-wei Xu (2001) (5) con
ligeras modificaciones (6, 7).
Estas disoluciones se mantuvieron a temperatura y condiciones de humedad relativa del aire
ambiente (aproximadamente 23 "C + 2 "C, 50%
respectivamente) hasta total desecación del disolvente (acético 1,5% en medio acuoso).
Después de formadas las membranas se pesaron. Algunas membranas se lavaron con una disolución acuosa de 12 ml de KOH 1% (cuatro lavados) seguido de lavado con abundante agua
desionizada (cuatro lavados) utilizando una pipeta de 10 ml para la eliminación de los restos de
iones potasio y acetato, y se sometieron a estufa
de desecación a 45" C durante una hora. Otras
no fueron neutralizadas y por tanto no fueron
sometidas a este proceso.
De cada película se cortaron muestras para
sumergirlas en placas multipocillo con medio de
cultivo de aproximadamente 1 cm de diámetro.
Se pesaron las membranas antes y después del
lavado con KOH para ver la pérdida de componentes y, por tanto, la solubilidad de la membrana, tras este tratamiento.
La espesores de los filmes neutralizados se
observaron usando el microprocessor Coating
Thickness Gauge MINITEST 21 00 (ELEKTRO HYSIK'KOLN).
Esterilización de las membranas
Las esterilizaciones de las membranas se realizaron en la Unidad de Esterilización del Centro
de Rehabilitación de FREMAP en Majadahonda.
Se siguieron varios métodos para la esterilización
PATOLOG~
DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
48
Estudios del quitosano como portador de osteoblastos en cultivo
de las membranas para comparar su posible repercusión en la biocompatibilidad de las mismas.
Membranas sin neutralizar con la disolución
de KOH 1% se sometieron a esterilización con
formaldehído a 60 "C y se dejó desgasificar las
muestras para la posible eliminación de todo el
formaldehído remanente en las muestras introducido en las membranas a través de sus poros.
El proceso de esterilización tipo fue el siguiente (Fig. 1 y Tabla 1):
Membranas sin neutralizar con la disolución
de KOH 1OO/ y las membranas neutralizadas se
sometieron a una esterilización rápida en autoclave a 134-138 "C durante aproximadamente 1520 minutos aproximadamente.
El proceso de autoclavado rápido comprendió
las fases de: marcha (Pc 1,O1 7b Tc 103,4 "C), pur-
ga de aire (Pc 2,266b Tc 122,3 "C), inyección de
vapor (Pc 2,273b Tc 122,2 "C), prevacío (Pc
0,398bTc 82,9 "C), inyección de vapor (Pc 2/019b
Tc 108,2 OC), prevacío (Pc 0,39913 Tc 82,6 "C),
calentamiento (Pc 3,04913 Tc 134,O OC), esterilización (Pc 3,140b Tc 135,O "C), desvaporización
(Pc 0,196b Tc 79 "C), secado (Pc 0,057b Tc 79
"C) e igualación (Pc 0,93b Tc 109,8 "C). Temperatura mínima de esterilización: 134,O 'C. Temperatura máxima de esterilización: 135,l "C. Duración total del proceso: 26 minutos (Tablas II y
111).
Cultivo de osteoblastos humanos
El cultivo de osteoblastos provenían de explantes de hueso esponjoso de mujeres postmenopáusicas sometidas a artroplastia total de cadera,
crecidos según procedimientos descritos por el
Laboratorio de Fisiopatología Ósea de Fundación
Jiménez Díaz.
Cultivo primario de osteoblastos humanos: Se
utilizó la técnica de Nácher y cols. (8). El hueso
trabecular, procedente de explantes de operaciones quirúrgicas del Servicio de Traumatología de
la Fundación Jiménez Díaz, se cortó en pequeños fragmentos y se depositó sobre una malla de
nylon en una placa Petri. La muestra se incubó
TABLA II. Composición de las membranas de
quitosano sin neutralizar sometidas a esterilización
en autoclave
Gm de quitosano
02
0,5
AcH 5% (m])
Glicerina 5% (ml)
2o
20
1,6
1,6
Fig. 1. Tratamiento de esterilización en formaldehído.
TABLA III. Composición de las membranas de
quitosano neutralizadas sometidas a esterilización
en autoclave
TABLA l. Concentraciones de las membranas de
quitosano sin neutralizar sometidas a esterilización
en formaldehído
Cm de quitosano
AcH 5% (ml)
Glicerina 5% (ml)
02
0,5
2o
20
1,6
1,6
Cm de quitosano
AcH 5% (ml)
Glicerina 5% (ml)
PATOLOG~DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
201
A. Larena, D. A. Cáceres, C. de la Piedra, et al.
con D-MEM, suplementado. Los osteoblastos migran del hueso y crecen sobre la malla de nylon.
Cuando las células han cubierto la superficie de
la malla (aproximadamente 45 días), se tripsinizan y se subcultivan en frascos F75. Las experiencias se realizaron con células de posteriores
subcultivos entre el 2." y 6." pase. Los osteoblastos se caracterizaron por su actividad fosfatasa
alcalina, analizada química e histoquímicamente, y por la estimulación de la síntesis de osteocalcina en respuesta al l,25 dihidroxicalciferol.
Método experimental: Se colocaron, en el fondo de pocillos de placas P24, fragmentos de la
correspondiente muestra de quitosano de forma
circular de unos 4 mm de diámetro. A continuación se sembraron sobre la muestra de biomaterial 50.000 osteoblastos procedentes del cultivo
primario, se realizaron controles sin la adición de
células. Posteriormente se añadió 1 ml de medio
de cultivo D-MEM en las mismas condiciones que
las descritas anteriormente. El medio de cultivo
se cambió cada dos días. Al cabo de cinco días,
los fragmentos de quitosano se sacaron del medio
de cultivo y se introdujeron en formaldehído.
Transcurridos los diferentes tiempos, se realizan estudios de biocompatibilidad y bioestabilidad de las muestras de quitosano con el cultivo
celular de osteoblastos. Los filmes de quitosano
fueron fijados en formaldehído o etanol y posteriormente en parafina para su observación al
microscopio óptico mediante un procedimiento
convencional de análisis clínico llevado a cabo
por el Servicio de Anatomía Patológica de la Fundación Jiménez Díaz. Los tratamientos de fijación de las muestras no fueron superiores a 24
horas.
Técnicas de observación microscópicas
Microscopio óptico LElCA tipo 302603
Se han observado distintos comportamientos
de la membrana de quitosano de acuerdo a su
concentración en el proceso de inclusión en parafina. El procedimiento técnico de tinción fue la
utilización de hematoxilina-eosina que consiste
básicamente en desparafinar e hidratar, incubar
durante diez minutos en hematoxilina de Carazzi, lavar durante diez minutos, contrastar con solución alcohólica de eosina, deshidratar, aclarar y
montar.
202
Microscopio confoca1 SENSOFAR L Pp
Las membranas fueron puestas por triplicado
en una placa de 96 pocillos e inmersas en medio
de cultivo DMEM con 20% de suero fetal. Tras
cinco días de incubación el medio sobrenadante fue eliminado y las muestras se dejaron secar
al aire bajo condiciones ambientales y sin ninguna técnica de esterilidad. Posteriormente se
embebieron las muestras de quitosano en parafina y se cortaron transversalmente.
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
modelo Jeol, JSM 6400 (Centro de microscopia
electrónica. UCM)
Se realizaron al menos tres mediciones al azar
de las membranas de quitosano en el microscopio electrónico de barrido. El tratamiento de las
muestras para su observación fue el siguiente: se
sumergió la muestra en glutaraldehído disuelto
en agua al 2,5% durante 40 minutos. Se lavó con
agua destilada, se deshidrató en una serie de soluciones de etanol de concentraciones 25%, 5O0/0,
75% y 90% durante cinco minutos. Finalmente
se sumergió en etanol puro (100%) durante diez
minutos y se secó la muestra mediante la técnica del punto crítico.
RESULTADOSY DISCUSIÓN
Preparación de las membranas
En la Tabla IV se muestran las diferencias de
peso de las membranas debido al lavado de las
mismas. Se puede observar que las pérdidas en
todos los casos se sitúan en torno a los 4-6 dg no
extrapolándose una relación lineal entre gramos
de quitosano en la membrana y pérdida de peso.
Debido al arrugamiento sufrido tras el proceso de lavado, estas medidas se consideran poco
representativas.
Observación al microscopio óptico
Existe un efecto crucial de los métodos de esterilización sobre la adhesión celular que pueden
estar relacionados con las modificaciones químicas superficiales inducidas por la esterilización
PATOLOG~DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
50
Estudios del quitosano como portador de osteoblastos en cultivo
TABLA IV. Pérdidas de peso sufridas por
las membranas tras el lavado con KOH
Composición
de quitosano
(g)
Antes de
KOH 1%
02
0,2885
02
0,2895
0,5150
0,5198
0,4
ot4
ot5
0, 5
0, 7
1
(g)
0,6425
0,6238
0,8860
1,2881
Después
de KOH 1%
(g)
Diferencias
de peso
0,2386
0,2390
0,4693
0,4835
0,581 9
0,5680
0,8285
1,2486
0,0499
0,0505
0,0457
0,0363
0,0606
0,0558
0,0575
(S>
0,0395
[5] y observadas en investigaciones anteriores del
grupo 16, 71. Así se pudo observar que el tratamiento con formaldehído producía fragilidad en
las membranas y un manejo difícil de las mismas
por la fragmentación para tiempos superiores a
24 horas de fijación acorde con las membranas
obtenidos por el tratamiento de esterilización con
formaldehído. E l formaldehído podría quedar
incluido dentro de las cadenas de quitosano manteniendo una estructura más rígida y menos flexible que podría ser el origen de la fragilidad.
Se ha visto que se produce una degradación
rápida de las membranas tras el cultivo en medio
con osteoblastos. Sin embargo, la membranas de
tipo 111 (0,7 g de quitosano, tratamiento de esterilización en autoclave y membrana neutralizada)
pueden ser observadas al microscopio. La tipo IV
(1 g de quitosano, tratamiento de esterilización
en autoclave neutralizada) no fue observada tras
su corte de pie después de siete días de cultivo.
Las membranas 1 (0,5 g de quitosano tratamiento
de esterilización en autoclave sin neutralizar) y II
(0,5 g de quitosano y tratamiento de esterilización en autoclave, membrana neutralizada) se
deshacen tras permanecer siete o más días en contacto con el medio de cultivo.
Sin embargo al hacer un cultivo de células
impronta durante cinco días se puede apreciar un
crecimiento generalizado de los osteoblastos en
las membranas 1, 11, Ill y IV.
Observación al microscopio confocal
Los tacos de parafina preparados conservaban
restos de membrana y eran adecuadas para su
SI
observación al microscopio confocal. Así se pudo
observar porosidades de pequeño tamaño, microporosidades, de aproximadamente 1pm y de 3 a
5 pm (Fig 2).
Observación al microscopio electrónico
de barrido (SEM)
Los osteoblastos se apreciaron tanto en la
superficie como en cortes transversales y demostraron que había penetrabilidad celular. Sin embargo, las colonias fueron mayores en impronta que
en el corte transversal manifestando que si bien
había penetrabilidad no todas las células eran
capaces de migrar a través del material. En la Figura 3 se puede apreciar tales resultados para una
membrana neutralizada de 1 g de contenido de
quitosano en un corte transversal de la misma.
En impronta se pueden apreciar más colonias
celulares tal y como lo demuestra la Fig 4.
-
Fig. 2A. Observación de microporosidadesde 1 pm en
cortes de membranas de quitosano, por microscopia óptica confocal (objetivo 50x). B. Observación de mesoporosidades 3 a 5 pm en cortes de membranas de quitosano, por microscopia óptica confocal (objetivo 50x).
-
PATOLOG~DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
203
A. Larena, D. A. Cáceres, C. de la Piedra, et al.
cuado para el transporte de osteoblastos en técnicas de ingeniería tisular. Para ello, sin embargo, es preciso continuar con el estudio y el desarrollo de un modelo experimental animal
adecuado.
Agradecimientos
Fig. 3. Microfotografía de SEM de un osteoblasto en un
c&e transversal de una membrana neutralizada de 1 gm
de quitosano. El objetivo utilizado fue de 1.000X.
600pm
I
Fig. 4. Microfotografía de SEM de poblaciones de osteoblastos en impronta de una membrana neutralizada de
1 g de quitosano. El objetivo utilizado fue de 1OOX.
CONCLUSIONES
En el presente estudio se ha demostrado que
los osteoblastos humanos penetran y crecen en
la superficie de diversas membranas de quitosano. Por ello se considera este material como ade-
204
Agradecemos la colaboración de doña María
José Luque del Centro de Rehabilitación y Prevención de FREMAP en la esterilización de las
muestras y de don Octavio Cedenilla del Centro
de Ciencias Medioambientales del CSlC en la
determinación de los metales pesados por ICP.
1. ZHANG M, LI X H, GONG Y D, ZHAO N M, ZHANG
X F. Properties and biocompatibility of chitosan films
modified by blending with PEG. Biomaterials. 2002;
23: 2641-2648.
2. NURSEVIN OZTOP H, SARAYDIN D, CETINUS S. pHsensitive chitosan films for baker's yeast immobilization. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2002;
1O1: 239-249.
3. CHATELET C, DAMOUR O, DOMARD A. lnfluence
of the degree of acetylation on come biological properties of chitosan films. Biomaterials. 2001; 22 (3):
261-268.
4. Anselme K. 2000. Review. Osteoblast adhesion on
biomaterials. Biomaterials 21, 667-681.
5. Q, FANG Z, ZHAO Y, X U C. A new method to prepare chitosan membrane as a biomedical material.
Chineselournal of Polymer Science. 2001; 19. 467470.
6. LARENA A, CACERESD A, VICARIO C, FUENTES A.
Release of a chitosan/hydroxyapatite composite loaded with ibuprofen and acetyl-salicylic acid submitted to different sterilization treatments A. Applied Surface Science (jn press).
7. LARENA A, CACERES D A. Variability between chitosan membrane surface characteristics as function of
its comppositio and environmental conditions. Applied
Surface Science (in press).
8. NACHER M, AUBIA J, BOSCH J, MARIÑOSO M L
HERNÁNDEZJ, SERRANO S. Caracterización de cultivos de osteoblastos humanos. Rev Esp EnfMetab
Óseas. 1993; 2: 3-8.
PATOLOG~DEL APARATO LOCOMOTOR, 2004; 2 (3): 199-204
52