universidad veracruzana facultad de ciencias químicas
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO TESIS "IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO POR LOS MÉTODOS DE CAPTURA DE HÍBRIDOS E INMUNOHISTOQUÍMICA EN MUESTRAS DE MUJERES CON HALLAZGOS COLPOSCÓPICOS ANORMALES” PRESENTA NANCY JANETTE CASAS SÁNCHEZ DIRECTOR DEL TRABAJO RECEPCIONAL DR. MARIO ROBERTO BERNABE GUAPILLO VARGAS ORIZABA, VER. DICIEMBRE, 2010 Este trabajo fue realizado bajo la dirección externa del Médico Anatomopatólogo Gabriel Juan Mandujano Alvarez y dirección interna del Dr. Mario Roberto Bernabe Guapillo Vargas. La asesoría del Dr. Enrique Méndez Bolaina, de la Dra. Aracely López Monteon, del Dr. Ángel Ramos Ligonio y del Médico Anatomopatólogo Gabriel Manuel Mandujano Vera. La fase experimental se desarrolló en el Centro de Anatomía Patológica Avanzada del Hospital Médica Tabasco de Villahermosa, Tabasco. Dedicatoria A MIS PADRES POR TODO SU AMOR, APOYO, CONFIANZA, COMPRENSIÓN, CONSEJOS, SACRIFICIOS, POR DARME LA OPORTUNIDAD DE VIVIR. SIN USTEDES NO SERÍA LA PERSONA QUE SOY. TODOS MIS LOGROS SON POR Y PARA USTEDES. A MIS ABUELITOS POR SER COMO UNOS PADRES PARA MÍ EN ÉSTA ETAPA. SON LOS MEJORES ABUELITOS DEL MUNDO. Agradecimientos A la UNIVERSIDAD VERACRUZANA por brindarme tal y como lo dice nuestro escudo ARTE, CIENCIA Y LUZ. A la FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS por brindarme una educación integral y hacerme amar a la Química. A mis PROFESORES por hacer de mí una Química Farmacéutica Bióloga en toda la extensión de la palabra, por todas sus enseñanzas, consejos y apoyo. Dr. Mario Roberto Bernabe Guapillo Vargas: Gracias por su apoyo, consejos, enseñanzas, paciencia, por el tiempo invertido en mí y sobre todo por su fundamental colaboración. Dr. Enrique Méndez Bolaina: Gracias por su apoyo a lo largo de mi formación universitaria, porque siempre que necesité una asesoría conté con usted, por aclarar mis dudas y su apoyo. Dr. Ángel Ramos Ligonio y Dra. Aracely López Monteon: Gracias por su asesoría en este trabajo. Pero sobre todo por sus invaluables clases. Médico Anatomopatólogo Gabriel Juan Mandujano Alvarez: Gracias por darme la oportunidad de trabajar con usted, por depositar en mí la confianza de realizar este trabajo. Es un gran maestro y sobre todo un gran amigo. Médico Anatomopatólogo Gabriel Manuel Mandujano Vera: Gracias por el apoyo recibido, por la confianza depositada y por las facilidades otorgadas en la realización de éste trabajo. Histotecnólogo Sandro Saúl Que Chan: Gracias por tu paciencia, apoyo y enseñanzas en el laboratorio. Sin ti éste trabajo no hubiera podido realizarse, es tanto mío como tuyo. Lic. Héctor Iván Sánchez Morales: Gracias por tu apoyo, amistad, porque estuviste conmigo desde el inicio de éste camino y en especial por tu ayuda y compañía en ésta noche. Siempre contarás conmigo, eres un tío-primo genial. Índice ÍNDICE Página ÍNDICE DE FIGURAS iii ÍNDICE DE TABLAS iv LISTA DE ABREVIATURAS v RESUMEN vii 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES GENERALES 2 2.1 Cáncer cervicouterino 2 2.2 Incidencia y mortalidad de cáncer cervicouterino 4 2.3 VPH como agente causal de cáncer cervicouterino 6 2.4 Factores de riesgo 9 2.5 Tipos, genoma y estructura de VPH 11 2.6 Infección por VPH 14 2.7 Biología molecular de la infección por VPH 16 2.7.1 Oncogenes E6 y E7 16 2.8 Prevención de la infección por VPH 19 2.9 Diagnóstico de VPH 20 2.9.1 Diagnóstico morfológico 21 2.9.2 Diagnóstico inmunohistoquímico 21 2.9.3 Detección de secuencias genómicas de VPH 21 3. ANTECEDENTES DIRECTOS 23 3.1 Colposcopía 23 3.2 Sistema Bethesda 25 3.3 Captura de híbridos 26 3.4 Inmunohistoquímica 27 i Índice 3.4.1 Proteína p16INK4a 28 3.4.2 Proteína Ki-67 29 4. JUSTIFICACIÓN 31 5. OBJETIVOS 32 5.1 Objetivo general 32 5.2 Objetivos particulares 32 6. MATERIALES Y MÉTODOS 33 6.1 Población en estudio 33 6.2 Material biológico 33 6.3 Criterios de inclusión 33 6.4 Criterios de exclusión y eliminación 33 6.5 Captura de híbridos 34 6.6 Inmunohistoquímica 35 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 8. CONCLUSIONES 40 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 41 ii Índice de figuras ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Progreso del epitelio normal a cáncer invasor 2 Figura 2. Estimación de casos de cáncer cervicouterino por edad en el mundo 4 Figura 3. Tipos de cáncer más frecuentes en México, mujeres 5 Figura 4. Prevalencia de ADN de VPH en mujeres con citología normal 8 Figura 5. Estructura icosaédrica de VPH 12 Figura 6. Organización genómica de VPH 13 Figura 7. Efecto de E6 y E7 en el ciclo celular 18 Figura 8. Tinciones IHQ con Hematoxilina y Eosina, p16INK4a, Ki-67 37 Figura 9. Gráfica que indica la relación entre los resultados de CH2 e IHQ 38 iii Índice de tablas ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla I. Concentrado de resultados de las muestras analizadas por CH2 e IHQ 39 iv Lista de abreviaturas LISTA DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico AR: Alto riesgo ARN: Ácido ribonucleico ATP: Adenosín trifosfato BR: Bajo riesgo CaCu: Cáncer cervicouterino CC: Cervicitis crónica CEA: Células escamosas atípicas CEA-AG: Células escamosas atípicas de alto grado CEA-SI: Células escamosas atípicas de significado indeterminado CGA-SI: Células glandulares atípicas de significado indeterminado CH2: Captura de híbridos 2 CMV: Citomegalovirus CN: Control negativo CP: Control positivo FDA: Food and Drug Administration (Administración de Medicinas y Alimentos) IHQ: Inmunohistoquímica ITS: Infección de transmisión sexual kb: Kilobases kDa: Kilodaltones L: Litros LAG: Lesión de alto grado LBG: Lesión de bajo grado LIEAG: Lesión intraepitelial de alto grado LIEBG: Lesión intraepitelial de bajo grado min: Minutos mL: Mililitros µm: Micrómetros v Lista de abreviaturas NIC: Neoplasia intraepitelial cervical pb: pares de bases PCR: Reacción en cadena de la polimerasa pg: Picogramos pRb: Proteína retinoblastoma RLC: Región larga de control r.p.m: Revoluciones por minuto URL: Unidades relativas de luz VHS: Virus de herpes simple VP: Virus de papiloma VPH: Virus de papiloma humano VPH-AR: Virus de papiloma humano de alto riesgo VPH-BR: Virus de papiloma humano de bajo riesgo vi Resumen RESUMEN El cáncer cervicouterino representa un importante problema de salud pública, ya que es la primera causa de mortalidad en mujeres por neoplasia en países en desarrollo. Casi todos (99.8%) los casos de cáncer de cervicouterino se deben a tipos específicos de un virus ADN tumoral transmitidos por vía sexual, el virus del papiloma humano (VPH). En la práctica clínica las herramientas de biología molecular para evaluación de VPH, son cada vez más utilizadas con fines diagnósticos y de seguimiento. Los productos de los genes E6 y E7 de VPH, interaccionan con genes supresores celulares p53 y retinoblastoma (pRb). Un resultado es la regulación alterada del p16INK4a en G1/S. Por método de inmunohistoquímica (IHQ), se considera a p16INK4a, un buen marcador de la infección por VPH, sumado al índice de proliferación celular. La captura de híbridos 2 de DIGENE® (CH2), detecta 13 tipos de VPH de alto riesgo y 5 de bajo riesgo. El objetivo de este trabajo fue identificar la presencia de VPH en muestras de mujeres con datos clínico/colposcópicos de lesión intraepitelial escamosa por los métodos CH2 e IHQ para VPH con marcadores p16INK4a y Ki-67. . El estudio se realizó en casos que se contaba con vial de CH2 y biopsia (veinte pacientes). Las biopsias cervicales, fijadas en formaldehído, cortadas previa inclusión en parafina. Se realizó recuperación antigénica y se incubaron anticuerpos p16INK4a y Ki-67. La CH2 fue realizada bajo los estándares de Hybrid Capture®2 de DIGENE. La CH2 fue positiva a virus de alto riesgo en quince casos (75%) y positiva a virus de bajo riesgo en ninguno. La expresión de IHQ fue favorecedora a lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIEAG) en dos casos (10%), lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (LIEBG) en once casos (55%) y siete (35%) presentaron cervicitis crónica. En once con positividad a virus de alto riesgo por CH2, diez presentaron LIEBG y dos con LIEAG, por IHQ. Tres positivos a virus de alto riesgo, presentaron cervicitis crónica. vii Resumen En el presente estudio se detectó la presencia de VPH en 15 muestras por captura de híbridos 2 de DIGENE® y presencia de lesión intraepitelial escamosa en 13 casos, por medio de inmunohistoquímica. Los resultados sugieren que los cambios celulares identificados por colposcopía son ocasionados por la infección del VPH. Ambos estudios son de gran utilidad como herramientas diagnósticas y se complementan para determinar el nivel de progresión de la infección por VPH. viii Introducción 1. INTRODUCCIÓN La infección persistente por VPH es condición necesaria para el desarrollo de cáncer cervicouterino. Si la infección de VPH de alto riesgo persiste causa una lesión precancerosa, y esta no es detectada y tratada en un tiempo oportuno puede llegar a convertirse en cáncer. La captura de híbridos es una técnica de amplificación de la señal, que da buenos resultados. La actual captura de híbridos de segunda generación “Captura de Híbridos 2 de DIGENE®”, tiene una adecuada relación entre sensibilidad y especificidad si se establecen límites de señal lumínica adecuados (1 pg de ADN; equivalentes a 100,000 copias del genoma viral). La utilización de un cocktail de sondas de alto riesgo, que en la última versión incluye 13 tipos de VPH (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68) y otro para el grupo de bajo riesgo que incluye 5 tipos (6, 11, 42, 43 y 44), permite la detección de cualquiera de estos tipos en dos únicas reacciones, si bien en la práctica clínica sólo se usa habitualmente la sonda de alto riesgo (VPH-AR). La proteína p16INK4a cumple una importante función en la regulación del ciclo celular normal. Es parte de la cascada de señales que desencadena la detención de la división celular (replicación) durante la diferenciación celular. En células epiteliales terminalmente diferenciadas la p16INK4a está regulada a un nivel bajo que apenas se detecta. Sin embargo, en las células cervicales donde los oncogenes VPH-AR han iniciado la transformación celular, se ha visto que la p16INK4a se encuentra intensamente regulada a un nivel alto. Al ser la p16INK4a una proteína celular, puede servir como un biomarcador independiente del tipo de VPH-AR, y un indicador del proceso de un cáncer cervical en curso. Existen varios tipos de VPH-AR, pero en todos los casos el efecto de las oncoproteínas E7 es el mismo: bloquear el pRB y provocar una sobreexpresión de la p16INK4a. La sobreexpresión de la p16INK4a es un marcador directo de la actividad oncogénica en todos los tipos de VPH de alto riesgo. 1 Antecedentes generales 2. ANTECEDENTES GENERALES 2.1 Cáncer cervicouterino La mayoría de las mujeres que fallecen a causa de cáncer cervicouterino, especialmente en los países en desarrollo, ocurre en edad reproductiva, su desaparición no solamente resulta una tragedia personal, sino también una pérdida luctuosa para sus familias que impacta en la estructura social y económica de las comunidades. El cáncer cervicouterino es de las formas más prevenibles y tratables de cáncer, siempre y cuando se detecte a tiempo y sea tratado con eficacia (1). El cáncer cervicouterino representa un importante problema de salud pública, ya que es la primera causa de mortalidad en mujeres por neoplasia en países en desarrollo. (2). Es una alteración celular que se origina en el epitelio del cuello del útero y que se manifiesta inicialmente a través de lesiones precursoras de lenta y progresiva evolución, que se suceden en etapas de displasia leve, moderada y severa, que evolucionan a cáncer in situ, un grado variable cuando ésta se circunscribe a la superficie epitelial y luego a cáncer invasor cuando el compromiso traspasa la membrana basal (Figura 1). Figura 1. Progreso del epitelio normal a cáncer invasor. La infección por VPH puede inducir cambios en las células recién transformadas, con la incorporación de componentes víricos en el ADN celular. Si el virus persiste, puede causar alteraciones precancerosas y más tarde cancerosas al interferir con la regulación normal de la multiplicación celular (1) 2 Antecedentes generales Eventualmente pueden cambiar a células cancerígenas, sin embargo, en más del 50% de las mujeres con lesiones pre-cancerosas, las células permanecen benignas. Con frecuencia, en sus etapas iniciales el cáncer cervicouterino no muestra síntomas por lo que a menudo no se detecta hasta que se hace severo (3). El cáncer cervicouterino ocurre en dos formas predominantes: carcinoma escamoso y adenocarcinoma. El tipo histológico más comúnmente encontrado en las mujeres es el carcinoma escamoso (80% de los casos). El adenocarcinoma es el segundo tipo histológico más común (4). Las lesiones de células escamosas aparecen de manera cada vez más frecuente en mujeres más jóvenes; en la actualidad su incidencia máxima es a los 45 años de edad, unos 10 o 15 años más tarde que las lesiones precursoras. El intervalo puede ser mucho más corto en algunas personas con cambios intraepiteliales particularmente agresivos, en tanto que en otras mujeres los cambios neoplásicos precursores pueden persistir durante toda la vida. El cáncer cervicouterino invasor se define como una invasión de células anormales en el tejido conectivo fibroso y denso situado por debajo de la membrana basal. Se inicia con un estadio microinvasor, que no es visible al ojo desnudo durante el examen con especulo y debe diagnosticarse histológicamente, mediante una muestra de tejido obtenido en una conización o una histerectomía. Luego da lugar a lesiones mayores, que pueden extenderse a la vagina, las paredes pélvicas, la vejiga, el recto y órganos distantes. Si no se trata el cáncer cervicouterino progresa de manera predecible y casi siempre conduce a la muerte. El carcinoma in situ suele ser asintomático, excepto quizá por la presencia de cierta leucorrea, que con mayor frecuencia se relaciona con la cervicitis o vaginitis concurrente. Cuando aparece carcinoma invasivo, en general en el quinto o sexto decenio de la vida, a menudo se acompaña de sangrado vaginal irregular, leucorrea, coito doloroso y disuria (5). 3 Antecedentes generales 2.2 Incidencia y mortalidad de cáncer cervicouterino El cáncer cervicouterino es el tercer cáncer más común en las mujeres y el séptimo en incidencia en ambos sexos, con un estimado de 52,900 nuevos casos en 2008. Más del 85% de los casos de cáncer cervicouterino se produce en los países en desarrollo, donde representa el 13% de todos los canceres femeninos. Las regiones de alto riesgo son el Este y Occidente de África (ASR mayor de 30 por 100,000), África del Sur (26.8 por 100,000), Sur y Centro de Asia (24.6 por 100,000), América del Sur y el Oriente Medio y África (ASR 23.9 y 23 por 100,000 respectivamente). Los casos registrados son menores en el oeste de Asia, América del Norte y Australia/Nueva Zelanda (ASR menos del 6 por 100,000). El cáncer cervicouterino sigue siendo el cáncer más común en las mujeres solo en el este de África, Sur y Centro de Asia y Melanesia (Figura 2). Figura 2. Estimación de casos por edad en el mundo, por 100 (6) 4 Antecedentes generales En general, la mortalidad por proporción de incidencia es de 52%, y el cáncer cervicouterino es responsable de 275,000 muertes en 2008, alrededor del 88% de las cuales ocurren en países en desarrollo: 53,000 en África, 31,700 en América Latina y el Caribe, y 159,800 en Asia. En nuestro país en 2008 tuvo una incidencia de 10,186 casos y una mortalidad de 5,061. Ocupando el segundo lugar en incidencia y mortalidad, después del cáncer de seno en mujeres (Figura 3). Figura 3. Tipos de Cáncer más frecuentes en México, mujeres (6) 5 Antecedentes generales Tan solo en el año 2002 se presentaron en el mundo 493,243 casos y de estos, 273,505 fueron decesos. En México, se presentaron 12,512 nuevos casos de cáncer cervicouterino, de los cuales 5,777, el 46% de los casos, fueron decesos (6). 2.3 VPH como agente causal de cáncer cervicouterino Casi todos (99.8%) los casos de cáncer cervicouterino se deben a tipos específicos de un virus ADN tumoral transmitidos por vía sexual, el VPH. El enlace entre el cáncer cervicouterino y el VPH fue demostrado a principios de los años 80’s por el doctor Harald zur Hausen y la infección por este agente es un requisito necesario para el desarrollo de esta enfermedad (7). En contra de la opinión predominante en los años setenta, Harald Zur Hausen postuló el papel del VPH en el cáncer cervicouterino, el segundo tumor maligno más común entre las mujeres. Su teoría asumió que las células tumorales, si están infectadas por un virus oncogénico, podrían portar el ADN viral integrado en su genoma. Así los genes de VPH que facilitaban la proliferación celular, debían ser detectados mediante el hallazgo de células tumorales que aportaban este ADN viral. Harold Zur Hausen defendió esta idea durante 10 años, dedicándose a la investigación y determinación de estos virus. La epidemiología del cáncer de cuello uterino sugería un vínculo con una patología de transmisión sexual y este hecho resultaba prometedor. Desde 1967, el virus del herpes simple (VHS) había sido el principal sospechoso, pero Zur Hausen en su laboratorio “Krebsforchungzentrum” en Heidelberg, Alemania, empezó a examinar otros virus ante el hecho de no detectar ADN del VHS en el cáncer de cuello uterino. La aparición de resultados sobre la conversión maligna de los condilomas acuminados lo llevo a especular que el responsable del cáncer cervicouterino podría ser el VPH. Con el VPH-11 obtuvo los primeros resultados positivos. Posteriormente detectó el ADN de los VPH-16 y 18. 6 Antecedentes generales La infección persistente de tipos de alto riesgo de VPH tiene una crítica función etiológica en el desarrollo de neoplasia intraepitelial cervical y cáncer cervicouterino. La progresión de displasia de bajo grado a alto grado y cáncer invasivo es raro en ausencia de VPH. Los tipos de VPH 16 y 18 son incriminados como los grandes causantes en 65-77% de los casos de cáncer cervicouterino (8). El VPH es responsable de aproximadamente medio millón de nuevos casos de cáncer cervicouterino cada año y al menos 250,000 muertes por año. Más del 95% de los CaCu presentan ADN del VPH detectable mediante métodos de detección sensibles, tales como la CH2 y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (9). El cáncer cervicouterino es el primer cáncer identificado por tener una singular causa obligatoria, infección cervical por VPH. Sin embargo, la infección por VPH es común, el cáncer cervical no lo es. Al menos, todas las personas que son sexualmente activas han tenido una o más infecciones de VPH en su vida. Los tipos de VPH asociados a pre-cáncer y cáncer cervicouterino son llamados “Tipos de VPH de Alto Riesgo”. Otros tipos que no causan cáncer son llamados “Tipos de VPH de Bajo Riesgo”. Las infecciones causadas por VPH, incluidos los tipos de alto riesgo, son benignas, transitorias y resueltas espontáneamente en un año o dos. Menos comunes son las infecciones persistentes. Si la infección persiste, lo más probable es que cause una lesión pre-cancerosa, que si no es tratada en tiempo oportuno puede llegar a convertirse en cáncer (10). Algunas variantes del VPH se relacionan más a menudo con neoplasias invasoras. Casi 25% de los cánceres CaCu en México se atribuyen a variantes asiaticoamericanas del VPH- 16. En Guanacaste, Costa Rica, en las mujeres infectadas con variantes no europeas de VPH-16 existe 11 veces más probabilidades de que se diagnosticara cáncer cervicouterino en comparación con las mujeres infectadas con el prototipo de VPH-16. 7 Antecedentes generales Basado en el análisis de secuencia de DNA, se han reconocido más de 100 genotipos de VPH que causan un diverso rango de lesiones epiteliales. Cerca de 35 tipos de VPH se identifican en lesiones benignas y malignas del tracto anogenital tanto en hombres como en mujeres; además, quince de estos tipos virales se asocian en diferente grado al cáncer de cérvix. El papilomavirus tipo 16 es el más prevalente de los VPH oncogénicos, responsable de más de la mitad de los tumores, mientras que el papilomavirus tipo 18 está involucrado en el 20% de los mismos (Figura 4) (11). Figura 4. Prevalencia de ADN de VPH en mujeres con citología normal, se observa mayor incidencia en África y América Latina y prevalencia de los cinco tipos de VPH más frecuentes en cada una de las cinco regiones mundiales, el ADN del VPH tipo 16 fue el más encontrado (11) La infección por VPH esencialmente es una enfermedad de transmisión sexual. De esta manera, tanto hombres como mujeres están involucrados en la cadena epidemiológica de la infección, pudiendo ser acarreadores asintomáticos, transmisores y también víctimas de la infección por VPH (12). 8 Antecedentes generales En un estudio poblacional de cohortes realizado a lo largo de 7 años en Guanacaste, Costa Rica, los autores observaron que, independientemente de la edad de la mujer, las infecciones nuevas de VPH se asociaron a un riesgo absoluto muy bajo de persistencia o de neoplasia intraepitelial cervical de grado dos o mayor. La tasa de progresión de las infecciones nuevas a lesión intraepitelial cervical de grado dos después de tres años de seguimiento no fue mayor para las mujeres de 34 años o más en comparación con las mujeres más jóvenes. Además, las tasas de infecciones disminuyeron considerablemente con la edad hasta situarse en 13.5% en las mujeres de 42 años o más. Sin embargo, entre las infecciones prevalentes, la persistencia entre las mujeres de más de 42 años fue superior a la de los grupos de edad más jóvenes. En las mujeres con infecciones prevalentes, el riesgo posterior de lesión intraepitelial cervical de grado 3 también aumento con la edad (13). 2.4 Factores de riesgo El riesgo de contraer un VPH genital está influenciado por la actividad sexual, por lo que el cáncer cervicouterino sigue un patrón típico de enfermedades transmitidas sexualmente. Hay una fuerte asociación entre el número de parejas que han tenido tanto la mujer como su compañero a lo largo de su vida y la adquisición del VPH. El uso de condón ayuda a reducir las posibilidades de contraer el virus, pero no siempre ayuda porque el VPH puede estar presente en áreas no cubiertas por el condón. Actividad sexual a temprana edad. El inicio de las relaciones sexuales antes de los 16 años se vincula con una duplicación del riesgo de cáncer cervical respecto de las mujeres cuya primera experiencia sexual ocurre después de los 20 años. Tener historial de otras enfermedades transmitidas sexualmente, verrugas genitales, test de papanicolaou con resultados anormales, pareja sexual con cáncer de cérvix o de pene. La infección es más común en mujeres jóvenes sexualmente activas, de 18 a 30 años 9 Antecedentes generales de edad, después de los 30 años decrece la prevalencia. El cáncer cervicouterino es más común después de los 35 años, lo que sugiere infección a temprana edad y progresión lenta a cáncer (14). Persistencia viral. Común entre los tipos virales de alto riesgo y factor determinante en el desarrollo a cáncer. La persistencia puede inducir cambios genéticos secundarios dado que las proteínas virales interfieren con los puntos de control del ciclo celular e inducen inmortalización de los queratinocitos. Uso prolongado de anticonceptivos orales. Las usuarias de anticonceptivos orales durante periodos prolongados (cinco años o más) tienen un riesgo dos veces mayor de cáncer cervicouterino que las que no los usan. La región larga de control (RLC) en el genoma viral, contiene elementos de respuesta a glucocorticoides, inducibles por hormonas esteroidales como la progesterona (componente activo de los anticonceptivos orales) y la dexametasona. Estudios han reportado el uso de anticonceptivos orales y la alta positividad al ADN viral. Coinfección con otros virus, como el del herpes simple tipo 2, citomegalovirus (CMV), herpes virus humano tipos 6 y 7, detectados todos en el cérvix. La carga viral correlaciona directamente con la severidad de la enfermedad. El VPH tipo 16 puede alcanzar una carga viral más alta que otros tipos virales. Predisposición genética. Representa el 27% del efecto de los factores subyacentes para el desarrollo del tumor. La herencia afecta la susceptibilidad a la infección por VPH, la capacidad para resolverla y el tiempo de desarrollo de la enfermedad. El aumento de la paridad también parece ser un factor de riesgo independiente. Datos compartidos de ocho estudios de casos y testigos, efectuados en cuatro continentes, sugieren que las mujeres con tres o cuatro embarazos de termino tenían un riesgo de 2.6 veces más alto de aparición de cáncer cervicouterino que aquellas que nunca habían dado a 10 Antecedentes generales luz; las mujeres con siete partos o más, presentaron un riesgo 3.8 veces mayor. Variantes virales intratipo. El consumo de tabaco debilita el sistema inmunitario y aumenta el riesgo, cuando el individuo se expone al virus. El sistema inmune determina si se puede desarrollar una infección por VPH cuando se está expuesto. Las personas con mal funcionamiento de los sistemas inmunes son más propensas a contraer una infección de VPH. Se considera que una baja condición socioeconómica es un factor de riesgo de numerosos problemas de salud, incluido el cáncer cervicouterino; en particular en entornos de bajos recursos. Las mujeres con una baja condición socioeconómica a menudo tienen bajos ingresos, limitaciones para acceder a los servicios de atención de salud, nutrición deficiente y escasa concientización acerca de los temas de salud y de una conducta preventiva. Todos estos factores pueden predisponerlas a enfermarse o a padecer enfermedades que pueden prevenirse (15). 2.5 Tipos, genoma y estructura de VPH El virus del papiloma (VP), pertenece a la familia Papillomaviridae. Estos virus están ampliamente distribuidos en la naturaleza. Infectan específicamente el epitelio escamoso de más de 20 especies diferentes de mamíferos, así como aves y reptiles. Existen más de 75 tipos de papilomavirus humanos, aquellos que son capaces de infectar mucosas genitales se dividen en grupos. De acuerdo a su asociación con lesiones preinvasivas y cáncer, se agrupan en: alto (tipos 16, 18, 45, 56), moderado (tipos 31, 33, 35, 51, 52) y bajo riesgo (tipos 6, 11, 40, 42, 43, 44), siendo el VPH 16 el responsable hasta en el 50% de todos los CaCu (16). La partícula viral del papiloma humano tiene una cápside icosaédrica que lo protege, constituida por 72 capsómeros (60 hexámeros y 12 pentámeros), con un diámetro 11 Antecedentes generales aproximado de 55 nm y que contiene al genoma viral. Los capsómeros están hechos de dos proteínas estructurales: L1 en mayor proporción y L2 (Figura 5). El VPH es relativamente estable y debido a que no tiene una envoltura, permanece infeccioso en un ambiente húmedo por meses (17). Figura 5. Estructura icosaédrica de VPH, constituida por capsómeros. Los capsómeros están hechos a base de las proteínas estructurales L1 y L2 (18). A pesar de la gran diversidad de los VPH, su organización genómica es muy conservada. Todos presentan seis genes de expresión temprana (E) y dos de expresión tardía (L), así como una región reguladora no codificadora. Todos sus genes están codificados en una sola cadena y usan un procesamiento diferencial de corte y empalme para la expresión individual de cada uno de sus genes. El genoma del VPH consiste de una molécula de DNA circular de doble cadena, aproximadamente de 8 Kb, asociado a proteínas tipo histona. Se divide en tres regiones: la región larga de control, que no contiene marco de lectura alguno; la región que corresponde 12 Antecedentes generales a las proteínas tempranas E1 a E8 y la región que corresponde a las proteínas tardías L1 y L2 (Figura 6). Figura 6. Genoma de VPH. Se indica la LCR, los genes de expresión temprana (E) y los genes de expresión tardía (L) (19) La regulación genética de los VPH reside en RLC, una porción no codificadora del genoma viral (20). La segunda región, E, codifica para proteínas que participan en funciones reguladoras a nivel del ciclo celular, replicación del ADN y la activación del ciclo lítico. La E2 codifica para tres proteínas que funcionan como factores de transcripción; éstos son reguladores intragenómicos a través de la formación de dímeros en sitios específicos de unión. E1 promueve la replicación viral. E5 participa en las fases tempranas de la infección. La capacidad oncogénica de los VPH reside en dos productos virales: las 13 Antecedentes generales proteínas tempranas E6 y E7, cuya expresión depende de un gran número de factores celulares, y la presencia de la proteína viral reguladora E2. E6 y E7 participan en el proceso de transformación viral mediante la unión a las proteínas celulares p53 y Rb, respectivamente, desregulando el crecimiento celular e inhibiendo la apoptosis. La tercera región codifica las proteínas estructurales. Los genes tardíos L1 y L2 codifican para las proteínas de la cápside viral. La L1 tiene un peso molecular de 55 kDa, es la proteína principal de la cápside y presenta similitudes en los diferentes tipos de VPH, a diferencia de la L2, que presenta muchas más variaciones. De acuerdo con el tipo de VPH se presentan variaciones en el tamaño y composición de nucleótidos. Dentro de esta región se regula la transcripción de los genes E6 y E7. El gen L1 es el más conservado del genoma viral y por tanto ha sido usado para identificar nuevos tipos virales. Un nuevo tipo viral es reconocido como tal solo si la secuencia nucleotídica del gen L1 difiere por poco más del 10% de aquella del tipo viral conocido más cercano. Diferencias de 2 a 10% definen a un subtipo viral, mientras que la diferencia menor a 2% define a una variante viral (20). Hasta la fecha se han descrito y secuenciado completamente 118 tipos virales y se ha identificado un número mayor de posibles nuevos tipos mediante la amplificación de regiones subgenómicas. Los VP se clasifican en 3 niveles taxonómicos: Género, Especie y Tipo. Los diferentes géneros comparten menos del 60% de identidad en la secuencia de L1; las especies de un género comparten una identidad de secuencia de 60 a 70% y los tipos virales dentro de una especie comparten de 71 a 89% de identidad de secuencia (21). 2.6 Infección por VPH El resultado usual de la infección por VPH es una verruga o papiloma. Las verrugas de la piel pueden ser verrugas planas (superficiales) o verrugas plantares (más profundas). 14 Antecedentes generales Las verrugas genitales, o condilomas, se transmiten por contacto sexual, el 90% de estas son causadas por los tipos virales 6 y 11. Una vez expuesto el paciente, las opciones son la eliminación del virus o la infección. Cuando ocurre la infección, la replicación de la partícula viral requiere queratinocitos maduros de la sección escamosa o plana del epitelio para el ensamblaje de la cápsula. La infección prolongada por VPH permite al virus producir sus proteínas y, en el caso de los tipos de alto riesgo, están incluidas las proteínas E6 y E7. En ese proceso se vincula de manera estrecha con los cambios morfológicos clasificables como NIC y afección invasora. Para los tipos de bajo riesgo, la expresión de las proteínas virales lleva a una respuesta epitelial proliferativa y la formación de condilomas o, en algunos casos, el NIC de bajo grado. El ciclo de vida de VPH, así como la expresión de las proteínas virales, están estrechamente relacionadas con la diferenciación de la célula huésped infectada. Los virus genitales, tanto oncogénicos como no oncogénicos, pueden causar Lesión Intraepitelial Escamosa de Bajo Grado (LIEBG) en la zona de transformación del cuello uterino, ya que el VPH infecta la lámina basal del epitelio escamoso estratificado. Las LIEBG, son manifestaciones transitorias de la infección viral productiva. Se caracterizan por presentar mayor actividad mitótica y contenido de células inmaduras en el tercio inferior del epitelio. Este se diferencía y madura, mostrando anormalidades menores de la célula. La zona de transformación del cuello uterino es la unión entre el epitelio columnar del endocervix y el epitelio escamoso del ectocervix. Es un sitio de continuos cambios metaplásicos, más activos en la pubertad y durante el primer embarazo y declinan después de la menopausia. Una metaplasia escamosa atípica, inducida por algún virus y que se desarrolle en esta región, puede progresar a una Lesión Intraepitelial Escamosa de Alto Grado (LIEAG), las verdaderas precursoras del cáncer cervicouterino y que se caracterizan por presentar mayor actividad mitótica y contenido de células inmaduras en los tercios central y superior de la lesión. Conforme se vuelven más graves las lesiones los coilocitos 15 Antecedentes generales desaparecen, disminuyen los números de copias de VPH y desaparece el antígeno de la cápside, lo que indica que el virus no es capaz de reproducirse en las células menos diferenciadas. Una LIEAG es comúnmente positiva a los tipos virales oncogénicos que evitan la maduración y diferenciación, produciendo una replicación continua de células inmaduras y eventualmente la acumulación de anormalidades genéticas que favorecen la malignidad (22). 2.7 Biología molecular de la infección por VPH El mecanismo de acción de los VPH de alto riesgo en el desarrollo de la neoplasia cervical, se explica principalmente por la acción de dos de sus oncoproteínas virales E6 y E7. Estas tienen la capacidad de inmortalizar y transformar queratinocitos, confiriéndoles un alto grado de inestabilidad cromosómica. La expresión continua de estos genes, es requisito indispensable para mantener el crecimiento neoplásico de las células del cérvix. Estudios del mecanismo molecular del proceso de transformación, han revelado un complejo patrón de interacciones de estas proteínas virales con reguladores celulares, envueltos en procesos biológicos como: la apoptosis, la proliferación y diferenciación celular. Se considera que el proceso de integración del genoma del VPH al genoma de la célula hospedera es el evento fundamental en la progresión a cáncer, debido a la sobreexpresión de las oncoproteínas E6 y E7 por la pérdida de E2, proteína implicada en su regulación. 2.7.1 Oncogenes E6 y E7 Las proteínas virales E6 y E7, como otras oncoproteínas, tienen la facultad de interacturar con los productos de los genes supresores de tumor p53 y p105 RB, respectivamente. El gen E6 es uno de los primero que se expresan durante el ciclo viral. Al interactuar E6 con p53, bloquea su función y la marca para su degradación. De esta forma, 16 Antecedentes generales la célula es inducida a permanecer en un estado de división celular constante, con lo cual hay disponibilidad de toda la maquinaria de replicación del ADN a fin de que el virus pueda utilizarla. También p53 puede bloquear al promotor temprano de estos virus, ya que interactua con la TBP (Proteína de unión a TATA), asi que la eliminación de p53 garantiza el funcionamiento del promotor temprano. La proteína p53, es un factor transcripcional que estimula la expresión de genes involucrados en la regulación del ciclo celular y apoptosis, por ejemplo, es inhibidor de las cinasas dependientes de ciclinas (p21). E6 se une a p53 y la conduce a su degradación a través de la vía de la ubiquitina. En este proceso, también participa la proteína celular asociada a E6 (E6-AP), que actúa como una ubiquitín ligasa. Las mutantes de E6-AP incapaces de unirse a E6 no pueden interactuar con p53 y las proteínas mutantes de p53 que no se unen a E6, no son susceptibles a la degradación inducida por E6-AP, señalando que E6 es requerida para mediar la interacción p53/E6-AP. E6 al unirse a p53 también puede producir su retención en el citoplasma, bloqueando su translocación hacia el núcleo y por tanto inhibiendo su función, independiente del proceso de degradación. La interacción de E6-p53 es importante para la progresión del ciclo celular (Figura 7). El gen p14, un producto alterno de p16, es un supresor de tumores que induce el paro celular a través de p53, causando una elevación en los niveles de p21 y finalmente el paro en las fases G1 o G2. A diferencia de las células normales, en fibroblastos que expresan E6, pueden omitir el paro en el ciclo celular y continuar la proliferación a pesar de los altos niveles de p14. El análisis del mecanismo de E6 para abolir esta señal de paro celular, ha revelado que se trata de una ruta dependiente de p53 en la que existe un mecanismo de represión de los promotores de la ciclina B y cdc2. E7, está conformada por tres dominios llamados CD1, CD2 y CD3, basados en la homología con la proteína E1A del adenovirus. 17 Antecedentes generales Figura 7. Efecto de E6 y E7 en el ciclo celular (19) Estos dominios conservados, son críticos para las actividades transformantes para cada una de estas oncoproteínas, a través de estos dominios, estas proteínas interactúan con una gran variedad de proteínas celulares, incluyendo al producto del gen supresor de tumores del retinoblastoma pRb. La oncoproteína E7 interactua con p105RB e impide que este supresor de tumor se asocie con el factor transcripcional celular E2F, el cual es responsable de la activación transcripcional de los promotores de algunos oncogenes celulares. Aunque estas secuencias homólogas al sitio de interacción de E2F se encuentra en las RLC de VPH genitales, no se ha demostrado la participación de este factor en la transcripción temprana. La proteína pRb es el principal regulador negativo del ciclo celular en la transición de la fase G1 a S. El estado de fosforilación de pRB, se regula a través del ciclo celular. La proteína pRb, se fosforila en múltiples residuos de serina por ciclinas dependientes de cinasas en los límites G1/S y durante las fases S, G2, y M. Al final de la fase M, es desfosforilada por una fosfatasa específica. En este estado de hipofosforilación, la proteína se encuentra activa y se evita la progresión a la fase S del ciclo celular. 18 Antecedentes generales La proteína E7, establece un complejo con la forma hipofosforilada de pRB, e induce su degradación. La inactivación de pRb induce la activación constitutiva del factor de transcripción E2F, el cual induce la activación de genes involucrados en la síntesis de ADN, durante la fase S del ciclo celular. El mecanismo por el cual, la proteína E7 induce la degradación de pRb aún no ha sido completamente dilucidado, sin embargo, recientes estudios han demostrado que esta actividad de E7, esta mediada por la proteasa de cisteínas activada por calcio, llamada calpaína, la cual es reclutada por E7, antes de unirse a pRb (23). 2.8 Prevención de la infección por VPH El VPH es un virus común que se transmite por contacto íntimo, por ejemplo, por contacto sexual con y sin penetración. Una gran proporción de varones y mujeres se infectan por el VPH en algún momento de sus vidas. La única manera infalible de prevenir el VPH genital es la abstención total del contacto genital directo y del coito. No obstante, algunos cambios de comportamiento sexual (por ejemplo, el uso de preservativos, la demora del primer coito) ofrecen cierta protección contra el VPH. Los preservativos protegen solo parcialmente del contagio de VPH, dado que puede haber virus en las superficies corporales no cubiertas por el preservativo, como son la zona perianal y el ano en los varones y mujeres, la vulva y el perineo en las mujeres y el escroto en los varones. A pesar de ello, se ha visto que el uso sistemático y correcto de preservativos brinda importantes beneficios: Permite una eliminación más rápida del VPH tanto en los varones como en las mujeres. Aumenta la regresión de las lesiones cervicouterinas. Reduce el riesgo de verrugas genitales. 19 Antecedentes generales Reduce el riesgo de precáncer cervicouterino y de cáncer cervicouterino. Protege contra otras infecciones de transmisión sexual (ITS), incluidas las infecciones por clamidias y el VHS-2, que son posibles cofactores del cáncer cervicouterino. Protege contra la infección por el VIH, un conocido facilitador tanto de la infección por VPH oncógenos como de la progresión a lesiones de alto grado. Protege contra el embarazo no deseado. Los preservativos pueden reducir el riesgo de contraer enfermedades relacionadas con el VPH porque disminuyen la cantidad de VPH transmitidos o reducen la posibilidad de reexposición. Hasta la fecha se desconoce si los preservativos femeninos (que cubren parte de la vulva) ofrecen la misma protección contra el VPH que los preservativos masculinos o si ofrecen una protección mayor (24). 2.9 Diagnóstico VPH La detección de la infección por VPH puede realizarse mediante distintos métodos. Podemos clasificar básicamente estos métodos en tres grupos: Diagnóstico morfológico. Inmunohistoquímico (detección de proteínas relacionadas con la infección por VPH). Molecular (detección de secuencias genómicas de VPH). 2.9.1 Diagnóstico morfológico Consiste en la identificación de las alteraciones morfológicas producidas por el VPH en las células escamosas, las que pueden observarse en el examen citológico y en el estudio histológico. Se considera a la coilocitosis o atipia coilocítica como el signo 20 Antecedentes generales morfológico característico de la infección por VPH. Esta al alteración se caracteriza por la presencia de aumento del tamaño de los núcleos, hipercromasia e irregularidad del contorno de la membrana nuclear, junto con una peculiar vacuolización perinuclear. Actualmente sabemos que estas alteraciones son la traducción de una infección productiva con presencia de gran cantidad de viriones en el interior de éstas células. 2.9.2 Diagnóstico inmunohistoquímico Se basa en el uso de anticuerpos dirigidos específicamente contra antígenos celulares (superficiales o intracelulares) y un sistema que permita evidenciar la interacción antígeno-anticuerpo. El procedimiento inmunohistoquímico más utilizado es el sistema avidina-biotina-peroxidasa, que permite amplificar dicha interacción y ponerla de manifiesto mediante un cromógeno. 2.9.3 Detección de secuencias genómicas del VPH Se basan en la detección específica de secuenciuas de DNA del VPH en tejido o bien en raspados de material procedente del área a estudiar (cérvix), y permiten, por tanto, identificar el tipo de virus presente en la lesión. Básicamente, todas ellas consisten en enfrentar el ADN de una determinada muestra con sondas o iniciadores específicos cuya secuencia es complementaria a la secuencia de ADN del tipo viral que se va a identificar. El uso de estas técnicas si bien es muy sensible, no permite la identificación de la célua que en la muestra porta el ADN viral. Por lo tanto, su contaminación por espermatozoides, leucocitos o moco de origen masculino puede propiciar resultados falsopositivos de pruebas de ADN para VPH. Existen numerosas técnicas de análisis cualitativo del ADN y una gran diversidad de variaciones o modificaciones. Estas técnicas presentan entre ellas diferencias en cuanto a 21 Antecedentes generales su sensibilidad, complejidad, y reproductibilidad. Algunas de ellas se encuentran disponibles comercialmente. Los métodos más frecuentes de detección de ADN para VPH se basan en la PCR y la identificación de híbridos ARN-ADN, que es el método utilizado en el sistema Captura de Híbridos (CH2) (HC; Digene, Gaithersburg, MD). La PCR no parece presentar contaminación cruzada de sus resultados en relación con otros VPH que no son importantes desde el punto de vista clínico para esa paciente o muestra particular. De igual modo, algunos investigadores consideran que la sensibilidad de la PCR es mejor que la de CH2 y recomiendan que las citologías negativas para VPH sean objeto de otra prueba con PCR. Otra posible ventaja de la PCR en su capacidad para determinar de modo específico de qué VPH se trata, en tanto que la CH2 sólo puede discernir si el ADN se encuentra en la categoría de los virus de alto o bajo riesgo (25). 22 Antecedentes directos 3. ANTECEDENTES DIRECTOS 3.1 Colposcopía La colposcopía es un examen visual especializado del cérvix, la vagina y algunas veces de los labios vaginales externos o la vulva. Este examen se practica en aquellos casos donde la prueba de papanicolaou ha mostrado células anormales. El colposcopio puede aumentar la vista normal de 2 a 60 veces. Este método apareció hace 70 años en Alemania y recientemente ha evolucionado hasta demostrar alta eficacia en la detección y diagnóstico de lesiones cancerígenas en el cuello uterino desde etapas tempranas. Es indispensable el examen colposcópico en las pacientes en las que se sospecha cáncer invasivo temprano con base en los resultados de la prueba de papanicolaou y el cuello uterino de aspecto normal a simple vista. Los datos colposcópicos que sugieren invasión son: a) vasos sanguíneos anormales, b) contorno superficial irregular con pérdida del epitelio superficial y c) cambios en el tono de color. La colposcopía consiste de un examen visual a través de un instrumento que se asemeja a unos binoculares montados sobre una base. Durante el examen se coloca un espéculo vaginal para separar las paredes de la vagina, al igual que se hace al tomar la prueba de papanicolaou, el cual se mantiene en esa posición durante el examen. El colposcopio se coloca a una distancia de varias pulgadas frente a la vagina, pero no hará contacto con ella. La persona que lleve a cabo el examen aplicará una solución de ácido acético o yodo sobre el cérvix y la vagina para identificar cualquier área anormal. Se puede limpiar el flujo vaginal que haya con un algodón o una gasa. Posteriormente se limpia con ácido acético diluido, el cual además de limpiar mejor el flujo y los detritus celulares, resalta aquellas células del cuello del útero que puedan tener alguna anormalidad. El epitelio que 23 Antecedentes directos se vuelve blanco después de la aplicación de ácido acético (concentración de 3 a 5%) se denomina epitelio blanqueado. La aplicación de ácido acético coagula las proteínas del núcleo y del citoplasma, y vuelve a estas proteínas opacas y blancas. El ácido acético no afecta el epitelio productor de glucógeno maduro porque no penetra más allá del tercio más exterior del epitelio. Las células de esta región tienen núcleos muy pequeños y una gran cantidad de glucógeno (sin proteína). Estas áreas se ven de color rosado durante la colposcopía. Las más afectadas son las células displásicas. Contienen grandes núcleos con cantidades anormalmente grandes de cromatina (proteínas). Las vellosidades cilíndricas se volverán “más pesadas” después de la aplicación del ácido acético; estas células serán, por tanto, más fáciles de ver. Tienen un aspecto blanquecino, en particular si se encuentran los signos iniciales de la metaplasia. Las células metaplásicas inmaduras tienen núcleos de mayor tamaño y también manifiestan ciertos efectos del ácido acético. Una vez identificadas estas zonas, se puede teñir el cuello con una solución de lugol, llamada solución de Schiller que es rica en yodo. Las células normales del cuello del útero bajo los efectos de las hormonas femeninas contienen glucógeno que se tiñe con el yodo. Así en una mujer que todavía regla el cuello del útero se ve de una coloración marrón intensa, salvo en aquellas zonas en que el epitelio este lesionado, por ejemplo inflamaciones, erosiones o en las que este sustituido por epitelio escamoso (se vería blanquecino) o haya otras alteraciones epiteliales. En algunas ocasiones se tomarán fotografías del cérvix, la vagina, o la vulva. Si se identifican áreas anormales en el cérvix, con frecuencia se requiere una biopsia para obtener el diagnóstico correcto. Durante la biopsia se toma un fragmento muy pequeño de tejido de esta área anormal. Si existe más de una de estas áreas anormales, se toman varias biopsias. Las muestras que se obtienen se envían al laboratorio para ser examinadas por un médico patólogo (26). 24 Antecedentes directos 3.2 Sistema Bethesda El sistema Bethesda se originó en Bethesda, Maryland, en 1988, en un seminariotaller organizado por el National Cancer Institute de los Estados Unidos. Los participantes concluyeron que la clasificación de papanicolaou no se considera aceptable en la práctica moderna de la citología, por cuanto no corresponde a los conocimientos actuales sobre lesiones cérvico-vaginales. En el sistema Bethesda se utilizan las categorías siguientes: 1. Sin datos de células malignas. 2. Con células escamosas atípicas (CEA) que representan alguna variedad de cambios hallados en las células precancerosas, pero que no son diagnósticos. 3. LIBG para células con hallazgos consistentes con los efectos del virus del papiloma humano (HPV) o cambios de tipo NIC 1. Se asumió que había poca capacidad para discernir por citología entre el efecto coilocítico y los cambios de NIC 1. 4. LIAG para células con hallazgos consistentes con NIC 2, 3 o carcinoma in situ. La capacidad para discernir entre esas categorías era limitada, pero los cambios citológicos eran diferentes a los del efecto de VPH en el NIC 1. En el año 2001, la tercera conferencia de Bethesda tuvo como resultado cambios más sutiles e importantes. Se subdividió la categoría CEA en dos: células escamosas atípicas de significado indeterminado (CEA-SI) y aquellas en las que deben excluirse lesiones de grado alto (CEA-AG). La actualización del sistema Bethesda en el 2001 no modificó las categorías de LIBG y LIAG y se creó una categoría citológica especial para el adenocarcinoma in situ. De las categorías preinvasoras glandulares, las células glandulares atípicas (CGA) también tienen significado indeterminado (CGA-SI) y sugieren neoplasia (27). 25 Antecedentes directos 3.3 Captura de híbridos La CH2 constituye un método relativamente simple y barato para reconocer y amplificar una señal específica de ADN y tiene importancia clínica como la única prueba aprobada para la FDA para detectar VPH. Además de ser ampliamente aceptada por la comunidad europea y asiática. Es recomendable realizarla como método de tamizaje. La prueba se puede realizar con la misma muestra recolectada para el examen de Papanicolaou. Se fragmenta con una solución básica a las bacterias o virus y libera el ADN blanco de la muestra. No requiere preparación especial del espécimen Las sondas de ARN específicas para los tipos de VPH se agregan después a la solución y se permite que se adhieran al ADN blanco para formar híbridos de ADN-ARN. Ese material se expone entonces a los anticuerpos contra híbridos de ADN-ARN, que ya están adheridos a las paredes de un recipiente y de esa forma son capturados los híbridos de ADN-ARN en una fase sólida. Múltiples anticuerpos que tienen fosfatasa alcalina adherida y que amplifican la señal reconocen entonces a los híbridos. La amplificación de la señal puede ser hasta de 3,000 veces. Se agrega luego un sustrato de dioxetano quimioluminiscente a la muestra y se fragmenta por medio de la fosfatasa alcalina. El sustrato produce a continuación un tipo de luz que puede medirse con un luminómetro y se cuantifica en unidades relativas de luz (URL). Las URL de una sustancia desconocida se comparan con las producidas por una muestra testigo que contiene 10 pg/ml de ADN de VPH relevante. Los datos finales se señalan como razón URL:PC y una muestra positiva debe tener un valor de 1.0 o mayor. Lo atractivo para la CH2 es que se requiere poco equipo adicional para el análisis. También se puede colocar de una sola vez múltiples sondas de ADN de VPH en la muestra, lo que hace posible la detección de muchas secuencias de ADN de VPH diferentes. En consecuencia, el análisis distingue entre grupos de alto y bajo riesgo. En el primer grupo se tienen sondas de ARN para 13 tipos, entre los que se encuentran el 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68. En el grupo de bajo riesgo, detecta a 5 tipos de virus, 6, 11, 42, 43 y 44 (28). 26 Antecedentes directos La Sociedad Americana de Colposcopía y Patología Cervical recomienda utilizar este examen a los tres años de tener la primera relación sexual o a la edad de 21 años (29). 3.4 Inmunohistoquímica Las técnicas de inmunohistoquímica permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas, de determinantes antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular. La aplicación directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros morfológicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y proporcionando información adicional esencial en muchos casos. Estas técnicas se basan en el establecimiento de uniones altamente específicas y afines entre dos moléculas bien definidas desde el punto de vista bioquímico, con el único propósito de identificar y localizar en el seno de los tejidos y de las células la presencia y distribución de determinados componentes bioquímicos. De entre ellas las más importantes serían aquellas que se basan en la alta especificidad y afinidad demostrada por el anticuerpo frene al antígeno correspondiente. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos ha facilitado, en gran medida, la identificación de productos celulares o marcadores de superficie. Existen diversos anticuerpos dirigidos contra las proteínas o enzimas nucleares. La mayor parte de los antígenos nucleares incluye proteínas asociadas al ciclo celular, proteínas reparadoras de genes, enzimas nucleares, factores de transcripción, productores de genes supresores tumorales, receptores de hormonas esteroides, proteínas ligadoras de calcio, y algunas proteínas virales nucleares. 27 Antecedentes directos Esta técnica permite demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos, esta reacción es visible solo si el anticuerpo esta marcado con una sustancia que absorbe, emite luz o produce coloración. Las técnicas inmunohistoquímicas enzimáticas permiten una localización precisa de las reacciones, ya que la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta técnica (30). 3.4.1 Proteína p16 INK4a La proteína p16INK4a pertenece a la familia INK4 de inhibidores de cinasas dependientes de ciclinas (INK4 CKI). Esta familia de inhibidores está integrada por las proteínas p16INK4a, p15INK4b, p18INK4c, y p19INK4d y son codificadas por el gen CDKN2A. p16INK4a está estructurada por cuatro dominios repetidos de 33 aminoácidos descubiertos en la anquirina, la cual es una proteína de la membrana eritrocitaria que interacciona con la espectrina y con la proteína de la banda 3 con el fin de mantener la morfología bicóncava del glóbulo rojo. Estos dominios de anquirina median el reconocimiento molecular a través de las interacciones proteína-proteína. Todas las proteínas INK4a tienen una estructura similar y se unen específicamente a las cinasas CDK4 y CDK6 inhibiendo su actividad. CDK4 y CDK6 son cinasas dependientes de ciclinas D, cuya función es fosforilar a la proteína Rb (retinoblastoma), que en estado hiperfosforilado se libera del factor de trascripción E2F permitiendo el progreso del ciclo celular de la fase G1 a S. p16 INK4a impide la progresión del ciclo celular induciendo un cambio conformacional en las cinasas CDK4 y CDK6 inhibiendo la interacción de estas proteínas con las ciclinas D, por lo tanto, pRb no es fosforilado y se detiene el ciclo celular en la fase G1. 28 Antecedentes directos En los últimos años se ha demostrado una relación recíproca entre la integridad de pRb y la expresión de p16INK4a. Es decir, p16INK4a se encuentra incrementada cuando pRb está mutada, con alguna deleción o inactivada; y reducida cuando pRb está normal. La inmunodetección p16INK4a es considerada como un marcador sensible y específico de lesiones cervicales clínicamente significativas asociadas a VPH de alto riesgo. La detección de la sobreexpresión de p16INK4a en lesiones cervicales, puede permitir identificar de forma inequívoca las células con cambio neoplásico inducido por VPH, mejorar la reproductibilidad de los diagnósticos histológicos de las lesiones cervicales intraepiteliales y predecir el riesgo de progresión de displasia cervical de bajo grado (31). 3.4.2 Proteína Ki-67 Fue descrita por primera vez en 1983 por Gerdes y colaboradores, como una proteína nuclear no histona, poco después este mismo grupo logró desarrollar un anticuerpo para su detección. El anticuerpo original fue obtenido en ratones inmunizados con núcleos de la línea celular L428. La proteína se presenta en dos isoformas con peso molecular aproximado de 345 a 395 kDa, codificadas por el mismo gen mediante empalme alternativo. La clonación del cDNA de la ki-67 revela un gen de alrededor de 12,500 pb con 15 exones; el exón 13 de 6,845 pb codifica la mayor parte de la proteína. Contiene 16 secuencias repetidas de 366 pb cada una, dentro de las cuales se encuentran las que codifican para el epítope FKEL reconocido por el anticuerpo MIB-1. Se ha determinado la asociación de Ki-67 con diversas proteínas como las Ran (proteínas de transporte al núcleo), proteínas reguladoras del ciclo celular, helicasas dependientes de ATP y proteínas propias del núcleo. Ki-67 se ha visto expresada únicamente en células en proliferación (células en fases G1, S, G2 y M), excepto en aquellas en fase G0, por lo que su expresión inmunohistoquímica proporciona un índice directo de la fracción de crecimiento del tejido. La expresión de la proteína Ki-67 está restringida al estado basal o parabasal del epitelio ectocervical, el epitelio metaplásico 29 Antecedentes directos escamoso y al estrato basal del epitelio endocervical, en el desarrollo de lesiones intraepiteliales cervicales la expresión de Ki-67 puede encontrarse en los estratos intermedio y superficial del epitelio. Inicialmente el anticuerpo contra Ki-67 se utilizó para la determinación de proliferación celular en cortes de tejido no fijados, posteriormente Cattoreti y colaboradores desarrollaron nuevos anticuerpos denominados MIB-1 y MIB-3, los cuales son anticuerpos monoclonales que reconocen a las isoformas de Ki-67 una de 345 kDa y la otra de 395 kDa respectivamente. Estos anticuerpos mostraron resultados equivalentes al anticuerpo Ki-67 original, aunque en los estudios recientes el anticuerpo más utilizado es MIB-1 ya que ha probado ser más estable en la determinación en cortes fijados en formalina y embebidos en parafina. En el 2005, Cambruzzi y colaboradores investigaron la expresión de Ki-67 en el adenocarcinoma endocervical y su relación con VPH. El estudio se realizó en 229 casos de adenocarcinoma obteniendo expresión alta a Ki-67 en 207 (90.4%), de ellos, al mismo tiempo que encontraron asociación significativa con la presencia de VPH (32). 30 Justificación 4. JUSTIFICACIÓN El cáncer cervicouterino es un problema de salud pública en nuestro país, cuyo factor de riesgo principal es la infección de ciertos tipos de virus de papiloma humano. La detección oportuna puede dar paso a un tratamiento adecuado para evitar el desarrollo de cáncer cervicouterino. Métodos de diagnóstico convencionales presentan el inconveniente de errores en el muestreo e interpretación de resultados. Además de la dificultad de obtener células glandulares atípicas, obteniendo falsos positivos hasta en el 50% de los casos y falsos negativos hasta en el 30% de casos. Actualmente se cuenta con nuevas herramientas de diagnóstico para la infección por VPH, como captura de híbridos e inmunohistoquímica. Algunas ventajas de estos métodos son, en el caso de la inmunohistoquímica es que indica el estado de las células tras la infección por VPH, predice la progresión o regresión de la infección, mejor concordancia interobservador y tiene buenos marcadores de progresión a carcinoma invasor. Las ventajas de la CH2 son que es el único método de diagnostico de biología molecular aprobado por la FDA, ofrece un análisis cuantitativo y se cuenta con kits comerciales. 31 Objetivos 5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo general Identificar la presencia de VPH en muestras de mujeres con datos clínico/colposcópicos de lesión intraepitelial escamosa por los métodos CH2 e IHQ para VPH con marcadores p16INK4a y Ki-67. 5.2 Objetivos particulares Obtener muestras en citología líquida e histológicas en pacientes con datos clínicocolposcópicos anormales. Realizar captura de híbridos a la citología líquida e inmunohistoquímica a las muestras histológicas. Diagnosticar las muestras histológicas por el sistema Bethesda. 32 Materiales y métodos 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Población en estudio La población en estudio fueron mujeres que por criterio de su médico tratante se les realizó toma de muestra para CH2 e inmunohistoquímica. Estudiados en el periodo de mayo de 2008 a febrero de 2010 (21 meses). Las edades de las pacientes oscilaron entre los 18 y 50 años de edad, con un promedio de 27. 6.2 Material biológico El material en estudio consistió en 20 viales con toma de muestra para CH2 y 20 biopsias de cuello uterino. El material se seleccionó de los archivos del Centro de Anatomía Patológica Avanzada, Hospital Médica Tabasco. Las biopsias fueron fijadas en formaldehído al 10%, cortadas a 3µm, previa inclusión en parafina. Se tiñeron con hematoxilina-eosina para evaluar la conservación del epitelio cervical y confirmación del diagnóstico histológico, así como para los inmunohistoquímicos. 6.3 Criterios de inclusión Se seleccionaron casos de pacientes que presentaron un estudio colposcópico anormal (epitelio aceto-blanco, punteado, mosaico, zonas yodo-negativas y vasos atípicos). Pacientes que contaran con biopsia de cuello cervical y vial con toma de muestra para CH2. 6.4 Criterios de exclusión y eliminación No se incluyeron pacientes que no reunieran los criterios de inclusión. Se eliminaron las muestras mal conservadas, insuficientes para el diagnóstico, que se perdieron durante el tratamiento histológico, o que las tomas de muestra fueran en diferente fecha. 33 Materiales y métodos 6.5 Captura de híbridos Para el método de CH2 se realizó la identificación de VPH a partir de muestras obtenidas por cepillado cervical, siguiendo el protocolo estándar de Hybrid Capture 2 de DIGENE®. Los criterios de positividad son Unidad Relativa de Luz (URL) de la muestra estudiada entre el promedio de URL de tres controles positivos. Siendo el resultado menor a la unidad negativo y mayor o igual a ésta positivo. Se procedió a la toma de muestra con Surepath. La cantidad recolectada fue de un volumen aproximado de 5 mL. Se resuspendieron las células obtenidas con el citrobrush mediante agitación del vial original. El resuspendido fue colocado en un tubo de fondo cónico. Se sometió a centrifugación durante un minuto. Se desecho el sobrenadante conservando el botón de células concentradas. Una vez obtenido el botón celular, se resuspendió en 1 mL de medio de transporte de DIGENE. Se disolvió el botón celular, mediante una resuspensión celular (vórtex). Al desnaturalizar se agregaron 500 μL de desnaturalizante a cada muestra, al Calibrador Positivo (CP) y 1 mL al Calibrador Negativo (CN). Se mezclaron los tubos individualmente a alta velocidad por 15 segundos (vórtex). Se mezcló por inversión el tubo para lavar la parte interna, la tapa y el anillo. Se incubaron a 65 ºC en baño maría por 45 min. Se centrifugó brevemente el vial de la sonda de alto riesgo para que todo el líquido se fuera al fondo del mismo. Se utilizaron 25 μL de sonda por prueba y se preparó una dilución 1:25. Durante 15 segundos se agitó a máxima velocidad en vórtex. Dentro de los pozos de la microplaca de hibridación se colocó 75 μl de las muestras desnaturalizadas, así como los calibradores negativos, los calibradores positivos y los controles de calidad. Se incubó durante 10 minutos a 25 ºC, se pipeteó 25 μl de la sonda diluida de alto riesgo en cada uno de los pozos que contenían las muestras desnaturalizadas de la microplaca de hibridación. 34 Materiales y métodos Se tapó nuevamente la microplaca de hibridación y se colocó en el agitador rotatorio a 1,100 r.p.m. para mezclar durante 3± 2 minutos. Después se incubaron a 65 ± 2 ºC durante 60 ± 5 minutos en la microplaca de calentamiento. Se transfirió el contenido completo de cada pozo de la microplaca de hibridación a los pozos correspondientes en la microplaca de captura utilizando una pipeta multicanal de 8 puntas con puntillas extra largas libres de ADN y ARN. Se agitó a 1,100 r.p.m. durante 60 ± 5 minutos, en el agitador rotatorio a una temperatura de 20 a 25 ºC. Se retiró el líquido de los pozos invirtiendo por completo la microplaca de captura. La conjugación se realizó pipeteando 75 μL del reactivo de detección no. 1 en cada uno de los pozos de la microplaca de captura, incubándose de 20 a 25 ºC de 30 a 45 minutos y decantándose. Para preparar el buffer de lavado se diluyó 100 ml del buffer concentrado con 2.9L de agua desionizada y se mezcló, siendo el volumen final de 3L. Una vez preparado se enjuagó con éste los pozos 6 veces y se decantó el líquido, dejando drenar durante 5 minutos. Al amplificar la señal de hibridación se pipetearon 75 µl del reactivo de detección no.2 en cada pozo del micro placa de captura. Se incubo de 20 a 25ºC durante 15 minutos en cuarto obscuro. Para la lectura de resultados se colocó la microplaca de captura en el luminómetro (33). 6.6 Inmunohistoquímica Las lesiones histológicas, fueron clasificadas según el sistema “Bethesda”. Se agregó bloqueador de reacción de fondo (Bio Sb) durante 10 minutos. Se realizó recuperación antigénica a 95 ºC, por 40 minutos con Trilogy (Cell Marque). El bloqueador de peroxidasa se agregó durante 10 minutos. Se incubaron anticuerpos anti p16INK4a (1:25, Cell Marque) y Ki-67 (1:50, Bio Sb). Sistema de detección: diamino-bencidina. 35 Resultados y discusión 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Antes de realizar las determinaciones inmunohistoquímicas y CH2 se comprobó el estado de conservación del tejido y epitelio cervical y se realizó un diagnóstico histológico definitivo de cada pieza incluida en el estudio, según el sistema Bethesda. Así el número final de casos estudiados fue de 20. El resultado de la CH2 para alto riesgo fue positiva en 15 casos (75%), se les realizó CH2 para bajo riesgo a 15 muestras de las cuales ninguna fue positiva. La IHQ fue positiva a lesión de alto grado (LAG) en dos casos (10%), lesión de bajo grado (LBG) en 11 casos (55%), y 7 (35%) presentaron cervicitis crónica (figura 8). De acuerdo a investigaciones anteriores la prevalencia de VPH en mujeres es muy alta siendo las mujeres más jóvenes quienes presentan mayor carga viral que el resto, lo que sugiere una mayor relación con los factores de riesgo asociados a la infección por VPH (34). Figura 8. Tinciones IHQ con Hematoxilina y Eosina, p16INK4a, Ki-67 en lesiones de bajo grado, alto grado y negativo a lesión 36 Resultados y discusión En 15 muestras con positividad a VPH de alto riesgo por CH2, 11 presentaron LBG y dos con LAG, por IHQ. Dos positivos a virus de alto riesgo, presentaron cervicitis crónica. Estudios similares señalan una alta relación entre ciertos marcadores moleculares y el estado de la infección por VPH (35). La relación de cada paciente, su captura y su expresión en IHQ, se muestran en la figura 9 y tabla I. Figura 9. Gráfica que indica el número de casos por cada relación entre los resultados de CH2 e IHQ De las muestras analizadas, ninguna presentó cáncer cervicouterino, sin embargo, la presencia de lesiones de bajo o alto grado, y los resultados positivos a VPH por CH2 e IHQ indican etapas tempranas de la infección por VPH y sugieren un potencial de riesgo a cáncer cervicouterino. Aunado a esto, se determinó que el promedio de edad de las mujeres que participaron en el estudio fue de 27 años, lo que muestra que las infecciones se están 37 Resultados y discusión presentando en edad reproductiva temprana. En otras investigaciones se ha observado la alta prevalencia de infección por VPH en mujeres de 25 a 29 años, sobre otros grupos de edad, lo que concuerda con nuestro análisis (36). Tabla I. Concentrado de resultados de las muestras analizadas por CH2 e IHQ No. de muestra Edad Diagnóstico histopatológico P16INK4a Ki-67 1 20 LBG +a 2 18 LBG 3 21 4 Captura de híbridos AR BR + II 7.77 0.18 +b +I 917.74 0.82 LBG +a +I 174.79 0.27 19 LBG +b +I 1768.08 0.60 5 24 LBG - +I 3.51 0.19 6 35 LBG +a +I 7.87 0.12 7 20 LBG +a + I Basales 2050.09 0.94 8 24 CC +a +I 0.10 0.14 9 33 LBG +a +I 422.85 0.42 10 50 LBG - +I 0.09 0.10 11 30 LAG +b + II 749.06 0.91 12 25 LBG +a + II 4632.95 13 20 Condiloma / LBG +a +I 1615.24 14 27 CC - +I 1.06 15 35 CC - + I Basales 0.17 16 25 CC - + I Basales 0.13 17 22 CC - + I Basales 3.70 18 33 CC - + I Basales 422.85 0.42 19 29 CC - + I Basales 0.19 0.42 20 24 LAG +c + II 1076.95 0.49 CC, Cervicitis Crónica LBG, Lesión de Bajo Grado LAG, Lesión de Alto Grado -, p16 INK4a negativo +a, bajo +b, moderado +c, alto 0.12 + I Basales, en células basales + I, bajo + II, alto 38 Resultados y discusión En la muestra 2, llama la atención p16INK4a bajo y titulación alta para CH2 AR. En la muestra 4, la lesión es de bajo grado y tiene p16INK4a moderado con titulación alta para CH2. En el 7, se considera una expresión baja para Ki-67, por fragmento mínimo residual. En la muestra 8, hay mínima expresión con cervicitis crónica. En la 12 probablemente aunque con carga viral alta, el daño citopatológico, está iniciando o probablemente el sistema inmune está regulando una sobreexpresión (paciente de 25 años). En los casos de IHQ negativa y CH2 positiva a VPH se sugiere una infección temprana (figura 9). 39 Conclusiones 8. CONCLUSIONES En el presente estudio se detectó la presencia de VPH en 15 muestras por captura de híbridos 2 de DIGENE® y presencia de lesión intraepitelial escamosa en 11 casos, por medio de inmunohistoquímica. Se pudo realizar la identificación lo que sugiere que la colposcopía anormal es producto de VPH. Ambos estudios son de gran utilidad como herramientas diagnósticas y se complementan para determinar el nivel de progresión de la infección por VPH. Los resultados sugieren que los cambios celulares identificados por la colposcopía son ocasionados por la infección del VPH. Además se concluye que tanto la CH2 como la IHQ son herramientas necesarias para un diagnóstico integral que complemente los hallazgos clínico e histo/citológicos. 40 9. Referencias Bibliográficas 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Organización Mundial de la Salud. (2007). Control integral del cáncer cervicouterino: guía de prácticas esenciales. OMS. Suiza. 4, 40. 2. Shah V, and Howley M. (1996). Papillomaviruses. In Fields virology. Third Edition, Lippin Cott-Raven Publishers, Philadelphia, 2077-2106. 3. Reimers LL, Anderson WF, Rosenberg PS, Henson DE, Castle PE. (2009). Etiologic Heterogeneity for Cervical Carcinoma by Histopathologic Type, using comparative age period-cohort models. Cancer Epidemial Biomarkers. 18, 792-799. 4. Comisión Nacional de Cáncer Cervicouterino. (2004). Diagnóstico y tratamiento de cáncer cervicouterino. Ministerio de Salud. 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