Tesis - Universidad de Colima

Resumen del trabajo
La Tripanosomiasis Americana es una antropozoonosis provocada por el microorganismo
unicelular Trypanosoma cruzi endémico para las Américas y transmitido por el vector de la
familia Triatominae.
En humanos la infección por T.cruzi se llama la Enfermedad de Chagas y es una de las
problemas mas serias de la Salud Pública en las Américas. Tumores malignos también son
una de las causas más importantes de mortalidad en todo el mundo.
En este trabajo se estudió posible interacción entre el tumor maligno y Tripanosomiasis
Americana en los ratones.
Se estudiaron tropismos tisulares de T.cruzi en presencia de la forma sólida del tumor
L5718Y en diferentes periodos de la infección parasitaria y varios parámetros del
crecimiento tumoral en estas circunstancias.
No se observo el cambio del tropismo tisular de T.cruzi en presencia de tumor, había una
supresión significativa del crecimiento tumoral y mas marcado efecto de la ulceración
tumoral.
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Abstract.
The American Tripanosomiasis is antropozoonosis provoked by protozoan agent
Trypanosoma cruzi endemic for New World and transmitted by insect vector from
Triatominae family.
In human this infection is denominated as Chagas’ disease and represents one of the most
serious problems for Public Health in American continents. Malignant tumors are known
to be one of the most important causes of mortality around the world.
In the present work the possible interaction between malignant tumor and American
tripanosomiasis in the mouse animal model was studied.
Tissular tropism of T. cruzi in presence of solid form of the T cell tumor L5718Y in the
different stages of parasite infection and different parameters of tumor growth in this
circumstances was analyzed.
It was no changes in tissular tropism of T. cruzi in presence of tumor. Remarkable tumor
growth suppression and tumor ulceration increase was observed.
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I. INTRODUCCION
En 1909 Carlos Chagas descubrió el Trypanosoma cruzi Chagas 1909 en el
intestino de un hemíptero (Triatoma infestans ó chinche hocicona) cuando aun era
estudiante de medicina (Chester et al, 1990). Posteriormente Carlos Chagas encontró el
mismo Trypanosoma en la sangre de una niña que tenia fiebre, anemia y lifadenopatia, y
demostró que este parásito era la causa de una enfermedad endémica en ciertas zonas del
Brasil. Este es el único caso en la historia de la medicina en que el agente etiológico de una
enfermedad y el insecto transmisor se descubrieron antes de ser diferenciada aquella como
entidad nosológica. Comúnmente llamada “Enfermedad de Chagas” en su honor. (Chester
et al, 1990).
La enfermedad de Chagas está confinada al hemisferio occidental. T. cruzi y sus
vectores artrópodos se distribuyen ampliamente desde el sur de EUA a través de México y
Centroamérica y Sudamérica hasta el centro de Argentina y Chile (CECIL, 1994; Chester et
al, 1990).
El T. cruzi, es un protozoario hemoflagelado causante de la enfermedad de Chagas o
Tripanosomiasis americana, el transmisor es la Triatoma infestans, es un parásito endémico
para la América Latina en México principalmente en los estados del Sur y Sudoeste de
México donde la prevalencia va desde 1.5% hasta un 29% de la población (Goldsmith,
1992; Ruegsegger, 1993; Trujillo, 1993).
Para el estado de Colima según estudios seroepidemiológicos realizados muestran
una seropositividad de 0.85 % (Ramirez, 1991) y de 1.9% (Coll, 1999).
La Tripanosomiasis americana tiene un cuadro clínico típico con las manifestaciones
cardiacas, neurológicas e intestinales, además de estos trastornos se ha observado
inmunodepresión debido a que en la fase aguda de esta enfermedad se observa una
disminución en el numero de linfocitos en nódulos linfáticos, timo y otros órganos
linfocitarios centrales y periféricos (Hatcher y Kuhn 1981). Es justo que por el disminuido
control de parte del sistema inmune los tumores tienen más alta incidencia en los pacientes
inmunodeprimidos, por eso seria lógico esperar más alta incidencia de neoplasias en
Tripanosomiasis americana. El desarrollo del tumor puede ser acelerado por la
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inmunodepresión, que tiene lugar en el transcurso de la Tripanosomiasis americana
(Hatcher y Kuhn 1981).
Una de las causas principales de mortalidad en el estado de Colima desde el año de
1992 a la fecha son los tumores malignos, variando entre el primero y segundo lugar de
mortalidad. Por lo tanto los tumores se consideran un problema grave y muy importante en
Colima (Anuario estadístico SSA, 1999).
Por otra parte, la autoinmunidad que surge en el hospedero en la fase crónica de
Tripanosomiasis americana puede ser no solamente contra los tejidos normales del
hospedero (Brener, 1994; Hernandez-Munain et al, 1992), sino también contra el tumor
(Kalinnicova et al, 1997).
En las referencias bibliográficas (Plata, 1985; Kalinnicova et al, 1997) existen
contradicciones en cuanto a la influencia del parásito en el estado de tumores malignos. La
comparación de estos trabajos resulta difícil, así como aclarar la relación entre el parásito y
el tumor, debido a que en estos experimentos la metodología utilizada fue diferente, así
como tampoco se utilizó el mismo tumor y la misma cepa de T. cruzi, estos factores tienen
un papel muy importante en la relación entre la infección por T. cruzi con los incrementos
de inmunidad y el crecimiento del tumor, en este trabajo de investigación se estudia la
interrelación entre el
tumor “L5178Y” (tipo linfoma) y los tropismos tisulares de
Trypanosoma cruzi en la fase aguda en ratones igual que posible interrelación entre estos
dos factores.
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II. Marco Teórico.
II.A. Trypanosoma cruzi Chagas 1909
II.A.1. Historia del estudio del problema.
Entre los antecedentes para conocer el origen y dispersión de la enfermedad de Chagas
existen conjeturas basadas en los relatos de los cronistas españoles, revisiones de
publicaciones arqueológicas, así como la actual distribución de los triatominos en América,
que fundamentan en conjunto, que la adaptación de Triatoma infestans klug, importante
transmisor de T. cruzi en Sudamérica, ocurrió hace 2000 o 2500 años. Según los trabajos
de (Rothhamer et al 1985), la autopsia de 35 momias exhumadas en el desierto chileno
fechadas con la técnica del Carbono 14 entre los años 470 A.C. y 600 D.C., revelo la
presencia de manifestaciones que sugieren la preferencia de la enfermedad de Chagas en
esas épocas.
La historia de la enfermedad de Chagas como tal, está revestida de datos interesantes, pues
en primer lugar ha sido la única en la que primero se encontró su agente etiológico y
transmisor y posteriormente se describió la entidad nosológica. En abril del 2000 se
cumplieron 91 años de que Carlos Chagas descubrió una nueva especie de
Trypanosomatido en las deyecciones de un triatomino que infestaba las casas de Lassance,
pequeña comunidad de Minas Gerais en Brasil conocidos como barbeiros.
En el primer trabajo de Chagas no solo se presentaron las investigaciones relacionadas por
el descubrimiento de un nuevo flagelado, sino que se presento los registros de todas las
observaciones suficientes para describir la enfermedad que actualmente lleva su nombre,
pues un año antes, el 21 de abril de 1908, diagnostico la tripanosomiasis en una niña de 2
años, Berenice Soares de Moura, la cual se encontraba en ese momento, en aparente buen
estado de salud. A los 15 días la encontró febril, con el bazo e hígado aumentada de
tamaño, grupos de ganglios linfáticos periféricos infartados y una infiltración generalizada.
Un año después, 23 de abril de 1909, la vio por última vez, su temperatura era normal y los
parásitos sanguíneos habían desaparecido.
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En 1961, 53 años después del primer encuentro de Chagas con Berenice un grupo de
médicos del Hospital de la Facultad de Medicina de Belo Horizonte, Universidad de Minas
Gerais, se reunieron con el objeto de estudiar la evolución del primer caso registrado de
tripanosomiasis americana. El sumario de la investigación es como sigue:
“El primer caso de tripanosomiasis americana estudiado y descrito por Carlos Chagas,
fue una niña de 2 años que había tenido una forma aguda y severa de la enfermedad.
En abril de 1961 esta paciente fue sometida a una revisión pertinente y su
xenodiagnostico encontrado positivo (la cepa de T. cruzi aislada está ahora en
estudio). Todos los resultados de una serie de exámenes fueron sorprendentemente
pobres, con relación a las formas conocidas de la enfermedad de Chagas. En este caso
históricamente documentado, parece que señala la posibilidad de infección en el
humano por T. cruzi por medio siglo sin producir manifestaciones clínicas
reconocidas”
Berenice aún vivió muchos años mas y a partir de 1961, fue examinada con ciertos
intervalos de tiempo; toda su vida permaneció asintomática, salvo que se quejó vagamente
de algunas alteraciones referidas a varios sistemas como disfagia ocasional, palpitaciones y
dolor precordial espontaneo o producido por alguna emoción; sin embargo, su historia
clínica a lo largo de su vida, no mostró datos de mayor relevancia (Lewinson, 1981).
Los estudios de Carlos Chagas abrieron inmensas posibilidades de investigación y a la vez,
descubrieron una tragedia continental que permanece en la actualidad. Después de los
primeros casos descritos por el mismo, estudios progresivos sobre la tripanosomiasis
americana han revelado un gradual polimorfismo en sus manifestaciones, con la presencia
de lesiones en diferentes sistemas, con la consiguiente variedad de cuadros clínicos que
actualmente han ido reflejando la complejidad de la patogenicidad y virulencia de T. cruzi.
II.A.2. Epidemiología de la enfermedad de Chagas
En el Mundo
Es una enzootia que constituye un problema de salud publica en el continente americano,
principalmente Sudamérica, Centroamérica, México y el sur de E.U.A.. Se considera que
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está entre las 6 principales enfermedades producidas por parásitos. De acuerdo con la
Organización Mundial de la Salud (OMS) (Guzmán-Marín et al, 1999), existen 24 millones
de personas afectadas, causando anualmente la muerte a 45,000 personas, y se estima que
de 80 a 100 millones de personas se encuentran en riesgo de ser infectadas. Afecta
principalmente a los estratos sociales bajos, puede parasitar a personas de cualquier edad,
pero el contacto con el parásito, en zonas endémicas suele ser antes de cumplir diez años.
(90, Vera-Cruz et al, 1999).
En México.
La prevalencia de Chagas en México es muy variable, existen localidades, sobre todo en
Oaxaca, Guerrero y Chiapas, en donde se encuentra positividad a T cruzi hasta en el 29%
de la población (Goldsmith RS, et al. 1983; Anderson N, et al. 1990; Gloss G, et al. 1990;
Ruegsegger de Gutierrez GL, et al. 1993), mientras que en otros sitios como Jalisco,
Zacatecas la prevalencia es cercana al 1.5% (Trujillo Contreras F, et al, 1993). En términos
generales se estima que la prevalencia a nivel nacional es de 1.5 a 1.6%, en lo que
coinciden datos de la enc uesta serológica nacional (Castrejón Oscar V, et al. 1992) y la de
serología en bancos de sangre por Guzmán Bracho et al, 1998.
En el estado de Colima
Para el estado de Colima solo contamos con los datos aportados en la encuesta nacional de
Velasco C., en donde aparece con un 0.1% en una muestra de 400 individuos, mientras que
los estudios seroepidemiológicos local realizados por Ramírez Parra en 1991 y Coll
Cardenas en 1999 mostraron una seropositividad cercana al 1% y 1.9% respectivamente.
II.A.3. Caracterización morfológica de Trypanosoma cruzi.
El parásito se presenta en cuatro formas morfológicas dependiendo de la fase de su ciclo
biológico y medio donde habita.
1) Trypomastigote metacíclico
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En este forma el parásito se presenta en la ampolla rectal de vector y penetra en los tejidos
de huésped, en
caso de ser depositado con las heces sobre la piel o mucosa.
Trypomastigote metacíclico es flagelado, alargado con un gran núcleo central, cinetoplasto
de gran tamaño y el blefaroplasto posterior de donde surge un flagelo que contornea una
membrana ondulante, que le confiere movimiento. En este estadio parásito casi no se
reproduce y esta capaz de infectar a los mamíferos.
2) Trypomastigote sanguíneo
En este forma el parásito se presenta en la sangre de huésped mamífero y se ingiere por
vector con la sangre o invade otras células de huésped.
Es flagelado, alargado, con el cinetoplasto grande alejado de la parte anterior del núcleo;
similar al estadio descrito arriba. Este forma puede ser presente en dos subformas que son
subforma fina y gruesa. Además de las diferencias morfológicas estas formas se distinguen
por su movimiento (rápido propulsivo- en fina y giratorio- en gruesa) y por virulencia (los
formas finas son mucho más agresivas que gruesas).
En este estadio parásito no se reproduce y esta capaz de infectar a los mamíferos en caso de
ser transferido con la sangre.
3) Epimastigote
En este estadio parásito se encuentra en la luz del intestino de vector y se reproduce con
división bilateral simple longitudinal.
Es fusiforme, con un flagelo que forma una membrana ondulante que nace del
blefaroplasto. El cinetoplasto se encuentra cercano a la parte anterior del núcleo que se
encuentra en posición central.
4) Amastigote
En este estadio el parásito reside en interior de las células de tejidos de huésped mamífero y
se reproduce por medio de la división bilateral.
Es de forma redondeada, carece de flagelo y por lo tanto de movimiento; tiene un gran
núcleo que se encuentra en posición central (Salazar Schetino P.M. et al.1999).
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II.A.4. Ciclo biológico del parásito.
Trypanosoma cruzi es un hemoflagelado que circula entre mamíferos e insectos vectores de
la subfamilia Triatominae conformando una enzootia nidal silvestre en la que originalmente
se involucran pequeños mamíferos marsupiales, roedores y edentados (“ Enfermedad de
Chagas” 1960; Lent H, et al 1979). El T cruzi desarrolla dos ciclos de vida distintos, uno
dentro del insecto y otro dentro del hospedero mamífero. Ingresa al tubo digestivo del
triatomino cuando éste toma sangre infectada, emigra hacia el intestino posterior del insecto
donde se transforma en un epimastigote móvil y extracelular que se mantiene vivo en la luz
del intestino posterior, allí se reproduce sin afectar al insecto, el cual continúa llevando una
vida normal. Además hay reportes que parásitos pueden ser transmitido por el Cimex
lectularius (Cecil A.Hoar 1972). Una vez cumplido el ciclo vital en el insecto, los
epimastigotes se transforman en trypomastigotes metacíclicos infectantes que se acumulan
en la ampolla rectal del triatomino a partir del día 28 y en esta forma son depositados, con
las heces del insecto, sobre la piel del nuevo hospedero (Asin S et al 1995; Schofield C.J.,
1994). Los trypomastigotes metacíclicos, rápidamente atraviesan la capa epidérmica
aprovechando cualquier lesión de la misma, como cuando la persona se rasca por el prurito
del piquete (Brener Z 1973). Sin embargo, también se han documentado otras formas de
inoculación, tales como la entrada a través de mucosa oral, conjuntivas, o por absorción
intestinal del hemoflagelado (Calvo- Méndez M et al.1994; Ribeiro DR, et al.1987), así
como la entrada directa a torrente sanguíneo a través de transfusiones sanguíneas (Wendel
S, et al. 1992) o transplantes de órganos infectados (Lopes de Faira J.B.1993).
El parásito se reproduce en las células de huésped en el lugar de entrada y en las células de
nódulos linfáticos drenantes. Después el parásito se transforma en trypomastigotes
sanguíneas que son las formas infectantes y se libera de los macrófagos en la circulación e
invade diferentes tejidos. La presencia del parásito en la sangre en la fase aguda fue
nombrada como la parasitemia primaria. Por su resultado la parasitemia primaria puede ser
propagativa (cuando el parásito penetra a los tejidos de animal infectado), fulminanteterminal (causa la muerte de animal infectado por abundancia de parásito y la respuesta
inmune de dueño exagerada), eliminada (en caso de baja virulencia de parásito, cuando las
células parasitarias no penetran a los tejidos de organismo y se eliminan del flujo sanguíneo
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por la respuesta inmune) (Monteón V.M., et al.1996). La parasitemia primaria puede ser:
con el inicio temprano (con el inicio antes de séptimo día después de ser infectado el
animal), con inicio clásico (7-10 días después de ser infectado el animal), con inicio tardío
(después de día 10 al ser infectado el animal), continua, con la disminución crítica y
moderada, con el paso a la fase de parasitemia mixta (los parásitos del foco primario y de
los tejidos después de propagación). Por su nivel parasitemia puede ser de 1 célula por ml
hasta 40 millones y más por ml (Andrade S.G. 1985).
Luego de esta fase aguda, cuando el parásito se ha incorporado a las células de diferentes
tejidos, se presenta una etapa de latencia, durante la cual los amastigotes se reproducen
liberando ocasionalmente formas trypomastigóticas a la circulación. Una vez dentro de la
célula el parásito sufre una transformación hacia la forma amastigótica, con una
composición antigénica distinta al trypomastigote, la cual no se expresa a través de los
antígenos de superficie de las células infectadas y evita así su reconocimiento por parte de
macrófagos y de eventuales anticuerpos. En esta forma de amastigote el flagelado se
reproduce en el interior celular en forma muy lenta. Mientras que en el insecto la parasitosis
del tubo digestivo posterior no altera las funciones vitales, en los mamíferos sí produce
lesiones histológicas y disfunciones graves.
En el transcurso de la fase indeterminada el hospedero suele estar asintomático y no
presenta signos clínicos de enfermedad, pero eventualmente la invasión tisular se hace muy
extensa, o bien aparece reacción inmunológica contra las células infectadas, lo cual lleva a
destrucción progresiva y a cambios inflamatorios crónicos que dan lugar a la aparición del
cuadro característico de Chagas crónico, cuyo espectro clínico dependerá del tejido mas
afectado (Mendoza González JD, et al. 1995).
II.A.5. Diferentes clasificaciones del espécimen T.cruzi.
Clasificación sistemática de Trypanosoma cruzi C.Chagas 1909
REINO: Protozoa
PHYLUM: Sarcomastigosphora
SUBPHYLUM: Mastigophora
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CLASE: Zoomastigosphora
ORDEN: Kinetoplastida
SUBORDEN: Trypanosomatina
FAMILIA: Trypanosomatidae
SUBFAMILIA: Trypanosomatinae
GENERO: Trypanosoma
ESPECIE: Cruzi
(Cecil A. Hoar 1972)
Clasificación genética
La población general de T.cruzi tiene la estructura policlonal por sus propiedades genéticas
y marcadores principales (Breniere SF, et al 1998). Se considera que los criterios genéticos
pueden ser indicadores de la posición filogenética de la cepa por adentro del espécimen.
Con el termino del clon se denomina la línea de organismos proveniente de uno solo
progenitor, los clones parasitarios probablemente evolutivamente en realidad tienen su
origen de un progenitor cada uno. Bajo el termino de clonet se comprende el conjunto de
aislados de T.cruzi que son parecidos por las pruebas genéticas especiales pero no fue
comprobado el origen común de todos estos aislados. Los clonets que son más abundantes
se denominan como los clones mayores (Breniere SF, et al 1998). Esta clasificación
desarrollada por Tibayrenc et al. tiene en su base la caracterización de la región variable del
minicírculo de kDNA estudiado con la reacción de PCR (Breniere SF, et al 1998).
Además existen otras clasificaciones desarrolladas a base de diferentes métodos de análisis
genética de distintas fracciones de DNA de varias estructuras celulares del parásito.
Citaremos las mas conocidas (Zingales B., et al.1996):
a) Clasificación a base de mapeo del DNA de kinetoplasto por restricción – análisis por
esquisodemos de Morel et al., 1992.
b) Kariotipaje molecular- Henriksson et al., 1993
c) Improntas de DNA- Macedo et al., 1992
d) Análisis de DNA randomizado y amplificado (RAPD)- Steindel et al., 1993
e) Análisis de los genes de RNA ribosomal (rDNA)- Souto y Zingales, 1993
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De todos estos estudios deriva que hay dos linajes grandes a los cuales pertenece toda la
diversidad de cepas de T.cruzi conocidas hasta la fecha (Breniere SF,et al 1998; Zingales
B., et al.1996). Estos linajes ocupan diferentes areales y para México es propio el linaje 2.
Clasificación por propiedades bioquímicas y enzimáticas
El grupo de los parásitos que tienen propiedades enzimáticas y bioquímicas parecidas se
denomina como zimodemo. La técnica de los perfiles isoenzimaticos permite dividir toda la
población de T.cruzi en varios
zimodemos grandes. En Brasil fueron descritos 3
zimodemos, los cueles se difieren por varios parámetros: el zimodemo I (Z 1) es de origen
selvático y circula entre animales triatominos selváticos y es intelectivo para el hombre; el
zimodemo II (Z 2) es de origen domestico y comprende cepas aisladas de pacientes con
enfermedad de Chagas aguda o crónica y de animales domésticos; el zimodemo III (Z 3)
comprende cepas de casos humanos autóctonos de Brasil y comparte el ciclo selvático.
La electroforesis isoenzimática permite dividir cada cepa en subcepas por sus patrones
enzimáticas que también se usa en los estudios epidemiológicos y básicos. Ahora en total
conocemos 12 biodemos, de los cuales nada mas unos cuantos fueron aislados de humanos
y pueden infectar al hombre (Montamat E.E., et al.1996).
Además los patrones isoenzimaticos pueden cambiarse dependiendo de la etapa del ciclo
del parásito que también implica varias correcciones en la clasificación isoenzimática.
El perfil isoenzimaticos esta relacionado con la susceptibilidad del parásito a los
medicamentos antichagásicos (en Brasil por ejemplo se demostró que el más susceptible es
el Z 2), que permite considerar esta característica como importante en la practica clínica
(Guzman-Marin E., et al. 1999).
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Clasificación por comportamiento biológico
Por su comportamiento biológico, todas las cepas del parásito pueden ser divididas en tres
biodemos.
Tipo I
Cepas con un rápido índice de multiplicación con un máximo de parasitemia y mortalidad
de 7 a 12 días de infección, predominando las formas delgadas. Macrofagotropismo en la
fase temprana de la infección.
Prototipos: Cepa Y (Brasil) y cepa Peruana.
Tipo II
Cepas con multiplicación relativamente lenta, con picos
parasitémicos irregulares de 12
a 20 días de infección, donde se alcanza un máximo de mortalidad; con predominio de
formas gruesas y un bajo porcentaje de formas delgadas en la fase inicial de la infección.
Miotropismo con predominante afección del miocardio.
Prototipo: Cepa 12 SF (Sao Felipe-Bahia State, Brasil).
Tipo III
Cepas con multiplicación lenta, con picos parasitémicos altos y tardíos (20 a 30 días
después de la infección), bajos índices de mortalidad al día 50 de la infección, predominio
de formas gruesas hasta el final del curso de la infección.
Miotropismo con complicación predominantemente en músculo esquelético.
Prototipo: Cepa Colombiana (Storino R, et al.1994)
Interrelación entre diferentes clasificaciones
Hay observaciones que diferentes grupos genéticos del parásito tienen diferente
comportamiento biológico y sensibilidad hacia los medicamentos contrachagásicos y estas
propiedades son estrictamente relacionadas con la estructura genética (Revollo S et al.
1998).
Hay también estudios sobre la correlación entre características enzimáticas del parásito y su
comportamiento biológico. Por ejemplo el biodemo I corresponde al zimodemo Z2b, Typo
II a Z2, Typo III and Z1. Además en las regiones donde predomina un zimodemo
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determinado se observa la prevalencia del biodemo correspondiente a este zimodemo
(Andrade SG et al.1996). En este mismo estudio se reportó que las lesiones
histopatologicos también son parecidos para la mayoria de los casos en una region
determinada (Andrade SG et al.1996).
En los estudios de cepas pertenecientes a diferentes zimodemos y linages no se encontró
alguna relación de estas caracteristicas en conjunto con la virulencia del parasito (GuzmanMarin E.et al. 1999).
II.A.6. Evolución de la infección en mamíferos,
cuadro clínico y
patogénesis en diferentes etapas.
En términos generales en mamíferos la evolución de la Tripanosomiasis americana se
presenta en las siguientes fases: fase de inoculación de parásito y efectos locales, fase
aguda con el cuadro de parasitemia, fase indeterminada, fase crónica con manifestaciones
clínicas de diferente índole.
II.A.6.1 Fase de inoculación del parásito con manifestaciones locales.
Esta fase de inflamación por infección se presenta usualmente entre las 2 y 3 semanas
posteriores a la inoculación en humanos.
Cuadro clínico en el humano
Todos los signos son locales y pueden ubicarse en el sitio de picadura, o bien de la entrada
por mucosas por que fueron nombrados como los síntomas relacionados con la puerta de
entrada de los parásitos.
En el sitio de inoculación se puede formar una lesión indurada, edematizada, dolorosa,
caliente rodeada de pequeñas nodulaciones linfáticas (chagoma), que puede persistir de
varios días hasta tres meses (Stuart Walker T. 1999).
En caso de su ubicación en la cara chagoma tiene el nombre del signo de Romaña- edema
no liso a un lado de la cara, poco doloroso, aspecto violáceo que se acompaña de
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conjuntivitis e inflamación del párpado superior y el inferior, adenopatías preauriculares y
cervicales ípsilaterales (Salazar Schetino P.M.et al.1999).
El edema facial inicial puede diseminarse a mejillas y cuello que en su turno se denomina
como el síndrome oculoglandular (Stuart Walker T. 1999).
Se considera que el signo de Romaña y el síndrome oculofacial además de la inoculación
por conjuntiva puede revelar una reacción sistémica a distancia de una infección
hematógena (Schofield C.J., 1994).
Patogénesis
Al ser depositado con las heces del triatomino sobre la piel o mucosas de huésped los
trypomastigotes por cualquiera lesión penetran en el espacio intracelular donde son
accesibles para los macrófagos residentes por los cuales es capturado, gracias a un
complejo proceso enzimático mediante el cual el parásito produce glicosilación de
proteínas en su pared que favorecen la opsonización y con ello su fagocitosis. Además de
esto trypomastigotes penetran en histiocitos, células adiposas, células musculares y
macrófagos polimorfonucleares (Stuart Walker T. 1999).
Posteriormente en macrófagos el flagelado se incorpora a los lizosomas para luego
romperlos mediante un mecanismo similar al que utiliza el sistema de complemente (C9 o
perforina) con ello pasa al citoplasma de la célula en donde se transforma en amastigotes
los cuales se multiplican por división simple bipolar (David JR, et al.1994). En otras células
afectadas en el lugar del inóculo parásito directamente entra en citoplasma donde se
transforma en amastigote para la reproducción posterior (Stuart Walker T. 1999).
Al cumplirse el ciclo de multiplicación y al agotar todos los recursos de la célula infectada
el parásito se transforma en trypomastigote sanguínea y escapa de la célula dirigiéndose a
los ganglios linfáticos drenantes, donde se multiplica de nuevo como amastigote. De los
ganglios drenantes que son muy bien irrigados por la sangre el parásito después de su
segundo ciclo de multiplicación sale a la sangre y se disemina por todo el organismo.
En caso de la infección de macrófagos el parásito directamente por éstos se transporta hacia
la sangre y a través de es ta vía llega a diversos tejidos.
Las alteraciones iniciales generalmente se deben a la acción alergénica de la saliva del
triatomino en donde introdujo la proboscis, en ciertos sujetos muy sensibles o que han
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sufrido picaduras múltiples, se puede presentar un cuadro de alergia asociado al piquete del
insecto, sin embrago, en la gran mayoría de casos el efecto inflamatorio local desaparece
sin consecuencias luego de 3 a 5 días. Cuando el piquete se acompañó de inoculación
efectiva del Trypanosoma, la reacció n inflamatoria se prolonga debido a la fagocitosis de
macrófagos, los cuales liberan gran cantidad de citocinas que despiertan respuesta
inflamatoria local y sistémica (Kirchhoff L., 1994).
Los epimastigotes fagocitados estimulan la liberación de citocinas por parte de macrófagos,
los cuales se agrupan alrededor del sitio inoculado y generan una respuesta inflamatoria
local caracterizada por vasodilatación, edema, rubicundez, calor, agregación de células
mononucleares y PMN, así como crecimiento de ganglios linfáticos y fiebre, la cual se
explica por la liberación de citocinas como IL2, IL6, y factores del complemento activados.
La microadenitis regional se explica por multiplicación del parásito en los ganglios
drenantes y posible reacción inflamatoria de mismo mecanismo ya descrito anteriormente.
II.A.6.2 Fase aguda con el cuadro de parasitemia.
El día de inicio de este fase esta relacionado en el forma directo con el inicio de
parasitemia primaria. La misma parasitemia y su nivel en diferentes días, duración de
parasitemia primaria- todos estos factores dependen de la cepa de T.cruzi y de
susceptibilidad de huésped (Dvorak JA, et al. 1987; Guevara Gómez Y, et al.1998), que
puede ser influenciada por diferentes factores (edad y sexo del huésped, estado nutricional,
presencia de enfermedades que pueden bajar la inmunidad de macroorganismo). Por
ejemplo se observó que las hormonas sexuales femeninas pueden disminuir niveles de
parasitemia y las hormonas masculinas a la inversa favorecen su desarrollo (do Prado
junior JC, et al. 1998; do Prado JC Jr, et al. 1999). Estos datos se comprueban muy bien por
la estructura de mortalidad de chagas en humanos donde 62.6% ocupan hombres y 37.4 %
mujeres (Schmunis GA, 1994). En caso de ser inoculado del medio de cultivo artificial el
parásito tiene un zimograma especial para cada uno de los medios y este también influye en
el comportamiento biológico (Ramírez ME, et al.1998).
Lo más común es que este fase remita en 4 a 6 semanas sin dejar secuelas clínicas
aparentes.
16
Cuadro clínico en humano.
La fase aguda puede ser acompañada de los signos de la entrada que aún no desaparecen y
por los signos generales.
En este fase se presente hipertermía elevada sin características especiales de niveles hasta
40°C y por su curva continua, intermitente o remitente (CECIL 1994), macro y
micropoliadenidis generalizada, hepatomegalia y/o esplenomegalia, exantemas cutáneos
pasajeros (no duelen ni producen ardor y desaparecen de 7 a 10 días después) (CECIL
1994), ataque al estado general con dolores musculares, cefaleas y vértigos, dolores
cardiacos y pesadez en abdomen.
Por las características cardiotrópicas y miotrópicas de Trypanosoma cruzi al complicarse
la fase aguda de la enfermedad se presentan miositis y/o una miocardiopatía y con
frecuencia pancarditis, esta y la meningoencefalitis, en indivíduos VIH y recién nacidos son
las dos entidades que en esta fase ocasionan con frecuencia la muerte del paciente.
Fue revelada cierta correlación entre la gravidez de los síntomas cardíacos en la fase aguda
y desarrollo del cuadro clínico en la fase crónica (Brener Z 1994).
Patogénesis.
Al salir a la sangre parásito entra en contacto con el sistema inmune del huésped. Muchos
trypomastigotes se fagocitan por macrófagos residentes del bazo e hígado. Pero parásito
puede resistir a la lisis y en esta fase en dichos órganos se observan macrófagos residentes
llenos por trypomastigotes. Los macrófagos que contactaron con los antígenos de
trypanosoma emiten señales a otras células inmunocompetentes con las cuales están en
contacto. Esto provoca hipertrofia e hiperplasia de macrófagos residentes del bazo y células
Kupfer en hígado. Además de esto se observa abundante proliferación de células
inmunocompetentes en nódulos linfáticos periféricos y pulpa blanca del bazo. En mayoría
de los casos hepatosplenomegalia y poliadenitis son debidos a la proliferación masiva de
células inmunocompetentes en estos órganos.
Pero en casos de parasitemia extremadamente alta el crecimiento de bazo e hígado tiene
otro substrato. En este caso la inmunidad es completamente oprimida por parásito u otros
factores y no se observa la proliferación masiva de pulpa blanca y macrófagos residentes.
17
En este caso la abundante cantidad del parásito en la sangre cambia las propiedades
reológicas de ésta, que dificulta el paso de la sangre por capilares y vénulas. En las
condiciones del flujo disminuido con mucha facilidad se forman caúgulos intravasales y
crece la presión intravasal, la fase líquida de la sangre sale el espacio extracelular de los
tejidos que lleva al cuadro del edema. En este caso edema se nota en todos los tejidos
blandos. Pero este cuadro clínico fue descrito solo en ratones que no sobrevivieron la fase
aguda.
La disminución de velocidad de eritrocitos y vasoconstricción se observan en cierto grado
en fase aguda en todos los casos cuando se presenta la parasitemia. Fueron observados
trastornos microcirculatorios en arteríolas y vénulas de los niveles 1 a 3 y revelada posible
relación de estos trastornos con formación de microaneurismas en los vaos de estos niveles
en la fase aguda. Además se observo mayor que en control agregación de plaquetas en
dichos vasos. Todos estos cambios se reversan al usar bloqueadores de calcio, que puede
dar la idea de posible influencia de T.cruzi en los canales de calcio de la capa muscular de
los vasos sanguíneos (Tanowitz H.B.,et al.1996).
Antes de la aparisión masiva en la sangre parásito se observó en el endotelio de los vasos
coronarios, que puede ser una de explicaciónes de rápido desarrollo de la cardiomiopatía
chagasica dilatada en la fase aguda por ser afectado el corazón antes de los demás órganos
(Tanowitz H.B.,et al.1996).
Durante la fase aguda de la enfermedad de Chagas se presenta infiltración de diversos
órganos, como hígado, bazo, ganglios linfáticos, piel, y sistema nervioso central, glándulas
salivales, utero, órganos de sistema urinaria, tejido conjuntivo de diferentes órganos,
endotelio de vasos sanguíneos (Klueva NG, et al.1946; Kallinicova VD, et al.1994;
Kalinnicova VD, et al.1997; Rosenberg ME, et al.1993; Andrade SG, et al.1966; Gardiner
et al.1988), músculo estriado, neuroglía de plexos viscerales y, sobre todo fibras
miocárdicas (Higuchi ML, et al.1993), en donde los parásitos se fijan a sus membranas y
mediante un proceso aún desconocido, se internalizan sin causar lisis celular (Schofield CJ,
1994; Kirchhoff L, 1994).
Se puede suponer que la curva de parasitemia de cada una de las cepas depende de los
niveles de inmunoglobulinas en diferentes periodos de la fase aguda, en su turno estos
niveles serán dependientes de presentación de antígeno parasitario.
18
II.A.6.3 Fase indeterminada
Inicia al terminarse la fase aguda y en mayoría de los sujetos puede durar décimos de años
o hasta la muerte del individuo por las caus as ajenas al parásito.
Clínicamente en esta fase no hay ningunos signos y molestias atribuidos a la presencia de
los parásitos. Las pruebas serológicas específicas en esta fase son positivas, mientras
estudios electrocardiográficos y con rayos X de corazón, colon y esófago no revelan
ningunos cambios. Los estudios longitudinales epidemiológicos revelan que 50-60% de
personas de la población seropositiva no presentan algún cuadro clínico. Los estudios
morfológicos de los tejidos revela en esta fase una fibrosis muy leve en miocardio, además
se observan pequeños nidos de amastigotes (Brener Z 1994).
II.A.6.4 Fase crónica.
Empieza con los síntomas propios para las lesiones orgánicas que provoca el parásito. El
pronóstico del paciente al iniciarse este fase es malo a mediano plazo y depende
directamente de la extensión de destrucción del tejido por parásito y capacidades del
organismo para mantener las funciones vitales en estas condiciones. Entre los pacientes que
presenten síntomas clínicos la mayoría (60-70 %) tiene problemas cardíacos y el resto esta
sufriendo de las alteraciones de tracto digestivo, además pueden ser presentes formas
combinadas de la enfermedad (Brener Z 1994).
Cuadro clínico en humanos.
Las manifestaciones de la enfermedad crónica se pueden iniciar con mareos, molestia
precordial e incluso síncope, al principio el corazón presenta un tamaño normal o
ligeramente superior.
Mas tarde se puede producir una cardiomegalia masiva por cardiomiopatía dilatada (Reis D
D´A, et al.1993) con insuficiencia cardíaca o arritmias como bloqueos o arritmias
ventriculares fatales.
Otros pacientes presentan mas bien afectación de esófago con dilatación y manifestaciones
tipo acalasia (los síntomas son disfagia, sensación de plenitud después de comer o ingerir
19
pequeñas cantidades, dolor torácico, regurgitación), o de colon con la aparición de
megacolon, todas las cuales pueden ser de curso fatal (Reyes López PA, 1993).
Es frecuente que haya embolias periféricas a cerebro u otros órganos.
Pueden surgir paroxismos febriles agudos coincidentes con la aparición de trypomastigotes
en la sangre (Chester et al, 1990).
Raras veces puede presentarse hipersalivación e hipertrofia de glándulas salivales
secundaria a hipersalivación, que aun no molesta mucho a los pacientes (Cecil, 1994;
Chester et al, 1990; Jawetz et al, 1992) .
La muerte sobreviene por insuficiencia cardíaca, arritmias fatales, infartos esquémicos.
Patogénesis.
La afinidad del parásito por determinado tejido depende de la cepa del mismo, seguramente
debido a una diferente preferencia por receptores específicos en el tejido por cada cepa
(Espinoza B, 1998). Este fenómeno se puede explicar por la presencia de proteinas en la
superficie del parásito inmunológicamente parecidos a las proteínas del huesped (Calvo
Mendez Ma, et al.1996; Guzman-Marin E, et al. 1998; Becerril-Flores MA, et al. 1998;
Olivas Rubio M, et al. 1998). No se deja de discutir la posibilidad del mecanismo
autoinmuno en la patogénesis de lesiones chagásicas, que también tiene su base en la
análisis de mimicria antigénica de parásito y observación de los anticuerpos ambivalentes
en el suero de los pacientes infectados con el cuadro clínico bien definido. Junto con el
estudio de los mecanismos autoinmunes no se debe olvidar del efecto de destrucción celular
directa por parásito.
El sustrato anatómico en la forma cardíaca de la Tripanosomiasis americana es una
miocarditis fibrosa intersticial, destrucción por parásito de los neuronas en ganglios
parasimpáticos cardíacos (Brener Z 1994).
Los dolores musculares se provocan por una miositis crónica con infiltrados linfocitarios.
La invasión o destrucción tóxica de plexos nerviosos en las paredes de vías digestivas
conducen a la segunda manifestación crónica más frecuente que es la enfermedad mega de
esófago o colon.
Otros órganos afectados son hígado, bazo y medula ósea ( Jawetz et al. 1992).
20
II.A.7. Lesiones morfológicas en diferentes tejidos en diferentes fases de la
enfermedad.
Los trypanosomas penetran en diferentes tejidos e invaden células de muchos tipos. La
invasión de tejidos se observa desde el primer día de infección y dependiendo de la fase de
enfermedad tiene un cuadro diferente. En la tabla que sigue esta presentada la lista de todos
los tejidos que pueden ser infiltrados en el curso de la enfermedad por diferentes cepas:
Organo
Células
Cepa de
Presencia por
T.cruzi
fases
Aguda
Bazo
Macrófagos
Y
+
Crónica
+
residentes
Cerebro
Referencia
Storino R, et
al. 1994
Astrocitos
?
+
Gonzalez
Cappa SM et
al. 1994
Células
de ?
+
Gonzalez
microglia
Cappa SM et
al. 1994
Células
de ?
+
Gonzalez
macroglia
Cappa SM et
al. 1994
Meningeocitos
?
+
Gonzalez
Cappa SM et
al. 1994
Células
de Y
Purkinje
de
+
Jardim
E.
1967
cerebello
Líquido cefalo- ?
+
21
Salgado PR,
raquídeo
Corazón
et al. 1996
Miocardiocitos
12
SF
(Sao +
+
Felipe -Bahia
Storino R, et
al. 1994
State, Brasil).
Células
de ?
+
Lazzari J.O.
plexos
1994
cardíacos
Ganglio
Macrófagos
linfático
residentes
?
+
Stuart
Walker
periférico
T.
1999
Glándula
Miocitos
lisos ?
adrenalia
de
vena
la
+
Brener
Z
1994
central
Células
de ?
+
Brener
parénquima
Gdula
Z
1994
Leche
?
+
mammalia
+
Moya
PR
1994
Glándula
Células
salivaria
acinosas
RC
+
al. 1991
Epiteliocitos de RC
los
Lopes RA, et
+
ductos
Lopes RA, et
al. 1991
excretores
Miocitos de la RC
+
capa muscular
Lopes RA, et
al. 1991
de los ductos
Lumen de los RC
+
acinus
Células
Lopes RA, et
al. 1991
de RC
+
tejido
Lopes RA, et
al. 1991
conjuntivo
(véase aparte)
22
Hígado
Macrófagos
Y
+
Storino R, et
residentes
Médula
al. 1994
ósea Macrófagos
roja
residentes
Músculos
Miocitos
?
+
Jawetz, E.; et
al. 1992
Colombiana
+
esqueléticos
Piel
+
+
Storino R, et
al. 1994
Macrófagos
?
+
residentes
Stuart
Walker
T.
1999
Adipocitos
?
+
Stuart
Walker
T.
1999
Fibroblastos
?
+
Stuart
Walker
T.
1999
Células
musculares
?
+
de
Walker
M.erector pili
Ptacenta
T.
1999
Celulas
Y,
Perú, +
epiteliales
Colombiana
Plexos nérvicos Neuronas de las ?
periféricos
Stuart
Andrade SG
1982
+
fibras
Lazzari J.O.
1994
parasimpáticas
Riñón
Neuronas de las ?
+
fibras
Lazzari J.O.
1994
simpáticas
Tejido
Macrófagos
perivascular
residentes
?
+
Stuart
Walker
conjuntivo
T.
1999
Adipocitos
?
+
Stuart
Walker
23
T.
1999
Fibroblastos
?
+
Stuart
Walker
T.
1999
Tracto
Células
del ?
digestivo
plexo nervioso
+
+
Lazzari J.O.
1994
submucoso
Células
del ?
+
plexo nervioso
+
Lazzari J.O.
1994
myentérico
Miocitos
del Zila María de +
músculo liso
Jesus,
Jose
Alencar A.,
et al.1968
Gomez
Vasos
Células
sanguíneos
endotelio
de Brasil,
+
Tulahuen
Tanowitz
H.B., et al.
periféricos
1996; Huang
H, et al. 1999
Células
de Brasil
+
túnica muscular
Tanowitz
H.B., et al.
1996
Vesícula
Epiteliocitos
Y
+
urinaria
Scremin LH,
et al. 1999
Lámina propia
Y
+
Scremin LH,
et al. 1999
Miocitos de la Y
+
capa muscular
Mesoteliocitos
de
la
Scremin LH,
et al. 1999
Y
+
túnica
Scremin LH,
et al. 1999
adventicia
Células
de Y
+
tejido
Scremin LH,
et al. 1999
24
conjuntivo
(véase aparte)
Adipocitos
Y
+
Scremin LH,
et al. 1999
En resultado de tanta infiltración las células infectadas no pueden funcionar bien y se
destruyen cuando los trypomastigotes salen de ellas. La detritis celular por medio de
fagocitosis se elimina del tejido por macrófagos. Al salir al espacio intercelular el parásito
presenta su antígeno a las células inmunocompetentes que provoca inflamación en tejido
afectado, con destrucción de células invadidas y normales que tienen antígenos cruzados
con T.cruzi. En tejido se observa un infiltrado linfocitario que puede ser abundante o muy
escaso. En lugares de destrucción celular masiva se registran polimorfonucleares y
macrófagos, pero el infiltrado predominante es linfocitario.
En bibliografía revisada no fue encontrada ninguna relación entre el tipo de lesión en tejido
y características propias de cepa. Se puede suponer que si un tejido esta invadido por
T.cruzi independientemente de cepa los cambios van a ser parecidos. Lo único que sí podrá
variar es gravedad de lesiones y el grado de la reacción inmune. Como ejemplo
presentamos la tabla del artículo de Vera-Cruz et al, 1999 para la cepa JALGO (con varios
cambios estructurales).
Órgano
fase aguda
fase crónica
Bazo
- Hiperplasia de la pulpa
-
blanca.
Hiperplasia del tejido
linfoide
- Escasas células gigantes
-
multinucleares.
Presencia de células
gigantes multinucleares
-
Numerosos macrófagos
con parásitos
-
Hemólisis por abundante
presencia de pigmento
de hemosiderina
Colon
- Escaso infiltrado linfoide
25
-
Abundante infiltrado
en la mucosa y en pared
muscular.
linfoide
-
Presencia de macrófagos
con parásitos
Corazón
- Infiltrado moderado.
-
Escaso infiltrado linfoide
- Necrosis del músculo.
-
Edema intersticial
- Abundantes nidos de
-
Destrucción del tejido
amastigotes.
Duodeno
muscular (miocarditis)
- Escaso infiltrado linfoide,
-
Escaso infiltrado linfoide
-
Abundante infiltrado
principalmente en tejido
muscular.
Hígado
- Escaso infiltrado linfoide.
- Hiperplasia e hipertrofia
acentuada de células de
linfoide
-
Esteatosis
-
Infiltrado moderado en
Kupfer.
Íleon
- Escaso infiltrado linfoide.
la mucosa y submucosa
-
Necrosis de células
ganglionares de plexos
mesentéricos
-
Aumento moderado de
células plasmáticas en la
mucosa
-
Presencia de 2
pseudotumores linfoides
Músculo Esquelético
- Edema.
-
- Necrosis.
Abundante infiltrado
linfoide
- Escaso infiltrado linfoide.
-
- Un gran número de nidos
de amastigotes.
Necrosis de fibras
musculares
-
Nidos de amastigotes
alrededor de un nervio
Riñón
- Escaso infiltrado linfoide.
26
-
Escaso infiltrado linfoide
- Edema intersticial
-
Glomerulonefritis focal y
segmentaria
Por supuesto la gravedad de lesiones e invasión de tejidos serán dependientes también del
estado general y de la inmunidad del organismo huésped.
La presencia en el organismo- huésped de otros procesos patológicos es también un factor
fuerte la influencia del cual aun no está bien estudiada. No cabe duda que diferentes
procesos patológicos de diferente manera van a influir en el estado del sistema inmune que
va a cambiar la patogénesis de las lesiones chagásicas y el mismo tipo de éstas (Rodriguez
M. et al. 1999; Araujo Z. et al. 1999; Torrechilhas A.C. et al. 1999).
II.A.8. Respuesta del sistema inmune a la invasión por Trypanosoma cruzi.
El Trypanosoma cruzi es fuertemente inmunogénico. La respuesta inmune del mamífero a
la infección por T. cruzi depende de la cepa del parásito y el estado inmunológico del
hospedero (pude haber una inmunización previa a una cepa de T. cruzi). En general la
infección aguda por T. cruzi provoca una rápida transformación blástica y activación
policlonal marcada de linfocitos T y B. En las primeras dos semanas de infección mas de la
mitad de las células del bazo y de los ganglios linfáticos aumentan su tamaño y mues tran
proliferación (Minoprio et al, 1986). Los niveles de hierro intracelular del hospedero
parecen tener un papel importante en la protección frente a T. cruzi, debido a que los
amastigotes necesitan hierro para alcanzar su crecimiento y patogenicidad óptimos.
II.A.8.1 Producción específica y no especifica de anticuerpos.
Fase aguda
Durante la fase aguda de la infección se elevan los niveles de inmunoglobulinas (IgM,
IgG) pero descienden al aplicar el tratamiento y disminuyendo la parasitemia (Braude et al,
1984). En el plasma se pueden encontrar anticuerpos protectores específicos y fijadores del
complemento, los que presumiblemente causan la desaparición de las formas sanguíneas
por medio de macrófagos activados, neutrófilos y eosinófilos a través de los mecanismos
27
dependientes de anticuerpos (Jawetz et al, 1992). La inmunidad mediada por anticuerpos se
ha visto que esta asociada principalmente a las inmunoglobulinas G (IgG). Hay niveles
elevados de IgM y IgG que aparecen en los días 14 – 20 de la infestación (fase aguda)
(Pereira & Krettli, 1990) y en el curso de la enfermedad el número de células productoras
de Ig en el bazo, ganglios linfáticos y médula ósea siempre va en aumento. Aunque hay
muy poca diferencia entre el reconocimiento inmunológico de los antígenos superficiales
y títulos de anticuerpo entre los ratones susceptibles y los resistentes. Pero la IgG de
ratones resistentes a T. americana en comparación con los susceptibles tiene una
presentación más amplia y completa de anticuerpos específicos contra los antígenos del
trypomastigote y epimastigote (De Gaspari et al, 1990). Datos obtenidos con ELISA
revelan que la proporción de las IgG contra los antígenos superficiales de trypomastigotes
es más alta en la fase aguda de la infección que en la fase crónica y lo opuesto se ha
mencionado para los antígenos internos (Umezawa et al, 1996).
Niveles de inmunoglobulinas en la fase aguda.
Por Antas Pr et al. en 1999 de acuerdo con los niveles de inmunoglobulinas en la sangre la
fase aguda fue dividida en tres periodos:
1. Fase aguda temprana se caracteriza por la presencia en la sangre de los niveles elevados
de IgM específica.
2. En la fase aguda intermedia se presentan niveles altos de IgM y IgG (Gal)- antiGalα, IgG
T.cruzi especifica en siguientes combinaciones: a) IgM, IgG (Gal); b) IgM, IgG; c) IgM,
IgG, IgG (Gal).
3. En la fase aguda tardía se observan IgG, IgG (Gal).
Se puede suponer que la curva de parasitemia de cada una de las cepas depende de los
niveles de inmunoglobulinas en diferentes periodos de la fase aguda, la respuesta
inmunológica de estos niveles serán dependientes de la presencia del antígeno especifico
parasitario, en su turno estos antígenos específicos dependerán de la migración del parásito
en el organismo del hospedero y del comportamiento biológico de T. cruzi y esto a su vez
depende del tipo de biodemo.
De esto deriva que las cepas de T. cruzi pertenecientes a los biodemos II y III presentan
una cantidad menor de antígenos que las cepas del biodemo I, esto provoca la respuesta
28
inmune especifica mas tarde. La fase aguda en estos biodemos es larga, debido a que en el
biodemo I presenta macrofagotropismo y un índice de multiplicación de parásitos mas
elevado en corto tiempo, en relación con los biodemos II y III.
Fase crónica
En la fase crónica aparecen anticuerpos bivalentes, los cuales se presentan cuando aparecen
los anticuerpos del hospedero, provocando la aparición de anticuerpos cruzados, solamente
en esta fase (Avila, 1992), reportados en la tabla 3 según Brener en 1994.
Se han propuesto dos explicaciones para la autoinmunidad: a) La infección con parásitos
altera la inmunoregulación e induce la disminución de la tolerancia a los antígenos propios;
b) La otra posibilidad es la existencia de una reacción cruzada con los antígenos del
parásito y los del hospedero (Avila, 1992).
En una síntesis toda la variedad de la mimicria antigénica de T.cruzi y antígenos humanos
puede ser presentada de modo siguiente (Brener Z 1994 con varios cambios de autor):
Antígeno
Referencia
Miocardiocitos
Células
de
Santos-Buch and Texeira, 1974
endotelio
cardíaco,
vasos Cossio et al., 1974
sanguíneos e intersticio
Neuronas (El Sistema Nervioso Central)
Ribeiro dos Santos et al., 1974
Nervios periféricos
Khoury et al., 1979
Neuronas cerebellares
Wood et al., 1982
Neuronas cerebrales
Snary et al., 1983
Antígeno
del
retículo
sarcoplasmático Sadigursky et al., 1982
cardíaco
Laminina
Szarfman et al., 1982
Nidógeno
Avila et al., 1986
Glicolípidos neuronales
Petry et al., 1988
Acetylholinesteraza humana
Ouaissi et al., 1988
29
Tejido nervioso de mamíferos
Van Voorhis and Eisen, 1989
Nervios periféricos, plexos myentéricos y Van Voorhis et al., 1991
estructuras de filamentos cerebrales
Antígenos de pulmón, intestino y cerebro
Olivas Rubio et al., 1998 (27)
II.A.8.2 Activación de las células Agresoras Naturales y de la producción
de IFN - γ.
La producción de IFN-γ se inicia poco tiempo después de la infección. Las células
Agresoras Naturales (NK) son responsables de la síntesis del IFN-γ en la fase aguda de la
infección. El tratamiento de animales resistentes a Tripanosomiasis con anticuerpos
monoclonales contra las células NK lleva a la disminución o la ausencia de IFN-γ en el
suero con el desarrollo de sensibilidad a la infección por T. cruzi . Esta respuesta de las
células NK al Trypanosoma no es específica y puede presentarse contra otros parásitos
como Leishmania major, Listeria monocytogenes, Toxoplasma gondii (Cardillo et al,
1996).
Las cepas de ratones que por no tener el receptor para el Interferon Gamma (IFN-γ) son
altamente susceptibles a la infección por T. cruzi, aunque los niveles y actividad de Ig son
normales (Hölscher et al, 1998). Por lo tanto la respuesta inmune al T. cruzi incluye
diferentes fases y la producción de anticuerpos es solamente una de ellas.
II.A.8.3 Activación de los macrófagos, producción de Oxido Nítrico (NO)
y factor alfa de necrosis tumoral (TFN-α)
α) .
Los macrófagos producen proteínas en el organismo infectado, de las proteínas importantes
que tienen una función clave en la regulación de la inmunidad son: la interleucina 1,
interleucina 2, interleucina 12 y TNF-α (Factor Alfa de Necrosis Tumoral), que activa a
otros macrófagos y células linfáticas (Hunter et al, 1996, Tizard, 1998). Este efecto, está
30
mediado por receptores situados en la superficie de los macrófagos y otras células
competentes. La producción de IFN-γ y TNF-α en el organismo infectado por T. cruzi
lleva a la activación de la sintetasa de Oxido Nítrico (NOS) y al aumento de la producción
de Oxido Nítrico (NO) por los macrófagos fue encontrado en ratones (Hölsher et al, 1998).
El NO es el producto del metabolismo de la arginina y es un efector antimicrobiano muy
importante, que actúa contra microbios intracelulares e incluso T. cruzi. La producción de
NO se aumenta dramáticamente en el curso de la infección por T. cruzi en ratón (Tizard,
1998).
Los animales expuestos a dosis subclínicas crónicas de TNF – α pierden peso y se vuelven
anémicos. La perdida de peso se debe a que el TNF – α hace que las células adiposa
pierdan su reserva de lípidos. Esta sustancia también es la causa del intenso desgaste que se
observa en individuos con cáncer o enfermedades parasitarias o bacterianas crónicas. El
TNF – α ocasiona que las células hepáticas secreten las proteínas de fase aguda: Proteína C
– reactiva (principal en humanos y algunos mamíferos), amiloide sérico P (principal en
ratones) y el amiloide sérico A (efecto inmunodepresor en humanos); también estimula la
quimiotaxis de los macrófagos y neutrófilos y aumenta sus actividades fagocitarias y
citotóxicas. Elimina a las células tumorales y produce necrosis en el centro de algunos
tumores in vivo. Esto se debe a que estas células interpretan la unión del TNF – α con su
receptor como una señal para morir (Tizard, 1998).
En algunas especies, en partículas roedores y bovinos (pero no en seres humanos ni
conejos), los macrófagos activados por la exposición a partículas extrañas o agentes
quimiotacticos sintetizan una enzima la Sintetasa de Oxido Nítrico (NOS). Esa enzima
utiliza NADPH y Oxígeno para actuar en la L – arginina y producir NO y citrulina. Aunque
el NO no es muy tóxico en sí mismo, puede reaccionar con un ánion superóxido para
producir derivados muy tóxic os, como NO 2, NO 2 -, N2 O3, ONOO- y NO3 . Estos derivados
pueden matar a las bacterias ingeridas y parásitos intracelulares que ocasionan un daño
hístico grave (Tizard, 1998).
II.A.8.4 Muerte de las células inmunocompetentes en el organismo del
hospedero en fase aguda.
31
Durante la fase aguda de la infección por T. cruzi, la población celular del timo y de las
placas de Peyer se reduce drásticamente. Esta involución del timo es debida a la reducción
del número de linfocitos. Estudios de las placas de Peyer revelaron la desaparición y/o
reducción importante de las zonas dependientes del timo. El mecanismo de la atrofia del
timo en los animales infectados se asocia en la apoptosis de los timocitos corticales
(Verinaud et al, 1998). Los niveles de las subclases de células T recuperan su cantidad
normal solamente en la fase tardía de la infección (14 semanas) (Antunez et al, 1997). Los
mecanismos de la muerte de células linfoides en el organismo infectado no fueron ni han
sido investigados. La producción excesiva de las formas activas de Oxígeno y NO por
macrófagos podría ser una de las explicaciones posibles de este fenómeno, por lo menos el
NO tiene efecto citotóxico en varios tipos de células (Dobrovinskaia et al, 1989). Hay
reportes de que el NO estuvo involucrado en el proceso de la supresión de la inmunidad del
hospedero. Las células del bazo tienen tendencia a la apoptosis y fragmentación del DNA
nuclear, que se presenta en el noveno día de la parasitemia, cuando el nivel NO en el suero
esta elevado. La inhibición de la producción de NO por adición de L-arginina, los
anticuerpos monoclonales contra TNF-α o IFN-γ o sus análogos esto, aumenta la viabilidad
de las células y reduce la muerte de los esplenocitos en los animales infectados (Martins et
al, 1998). Este mecanismo fue investigado solamente en el modelo animal y no fue
confirmado en los estudios en humanos. Esto debe ser tomado en consideración ya que los
macrófagos humanos no producen NO. El TNF-α producido por macrófagos puede estar
involucrado en la mortalidad de diferentes tipos de células, incluyendo linfocitos. El efecto
depende de la cantidad producida y circulante que esté presente en alguna región
determinada. Otro posible agente citolítico podría ser el glycoinositolfosfolipido (GIPL) de
la membrana celular del T. cruzi. Se sabe que el GIPL puede inducir la muerte de
macrófagos en presencia de IFN-γ y este proceso no depende de la secreción de NO (Freirede-Lima et al., 1998).
II.A.8. 5 Septicemia endogénica en la fase aguda de la infección por T.
cruzi.
32
La infección de los ratones Balb/C con T. cruzi se asocia a septicemia (endogénica) en la
fase aguda de la infección, causando inmunosupresión probablemente por invasión
bacteriana a partir del tubo digestivo, tracto respiratorio alto o uretra, y esta, puede ser la
causa de la mortalidad alta en la fase aguda de Tripanosomiasis en ratones (Calabrese et al,
1992).
II.B. Tumores malignos.
II.B.1. Epidemiología de tumores malignos.
Las neoplasias malignas son la segunda causa más frecuente de muerte en el mundo
industrializado.
Epidemiología nacional
La tasa nacional de mortalidad se oscila entre 50 y 60 casos por 100 000 habitantes con la
prevalencia de carcinomas y en especial cancer cervicouterino. La incidencia de los
tumores de tipo linfoma es 1-5 casos por 1 000 000 de habitantes (Anuario estadístico SSA,
1999).
Situación epidemiológica en el estado de Colima.
Una de las causas principales de mortalidad en el estado de Colima en los últimos años son
los tumores malignos, actualmente ocupan el segundo lugar de mortalidad en el estado. Por
lo tanto los tumores se consideran un problema grave y muy importante en Colima. En la
tabla 1 se muestran las tasas de mortalidad debidas a tumores malignos a partir del año
1992 al año 1998 (Anuario estadístico SSA, 1999).
33
Tasa de mortalidad por tumores malignos
en el Estado de Colima y en la Republica Mexicana
Año
Tasa de Mortalidad
Nacional
Estatal
1992
50.4
62.3
1993
50.8
63.2
1994
51.6
61.5
1995
52.6
61.6
1996
53.6
60.2
1997
54.1
70.7
1998
64.8
Tasa por 100,000 habitantes
II.B.2 Información general .
Todos los tumores malignos comparten la característica de un trastorno en el transcurso;
normal de la división, el crecimiento y la diferenciación celular. Los síntomas producidos
por el crecimiento de las células malignizadas se pueden incluir generalmente en alguna de
las tres siguientes categorías:
1. Locales: dolor o tumefacción que puede ser dolorosa o indolora en una zona de
expansión de las células tumorales.
2. Regionales: disfunción del órgano de origen o de órganos adyacentes o distantes debido
al crecimiento local o metastásico del tumor.
3. Sistemicos: efectos remotos del tumor debidos a la producción de hormonas o citocinas
por el propio tumor o por la reacción del hospedero frente al mismo.
Biología celular del cancer.
Los aspectos característicos que definen al tumor maligno son dos: el crecimiento celular
no regulado por las señales externas (autónomo) y la capacidad de invadir tejidos y
34
metastatizar, y colonizar lugares a distancia. El crecimiento incontrolado de células
anormales, es una propiedad de todas las neoplasias o nuevos tumores. Cáncer es sinónimo
de neoplasia maligna.
La resistencia a la transformación neoplásica se debe a los niveles de control que existen en
todas las fases de la función celular. Las anomalías de la función de una proteína pueden
ser compensadas por otras proteínas y vías.
Los tejidos más diferenciados experimentan un recambio caracterizado por muerte celular y
reemplazo. Cuando las velocidades de recambio natural son lentas, puede inducirse la
proliferación de células totalmente diferenciadas para producir células hijas completamente
diferenciadas.
En los tejidos con recambio rápido, como la piel, la médula ósea y el intestino, la función
diferenciada y la de reemplazo son desempeñadas por diferentes tipos de células. En
circunstancias normales, una célula individual se encuentra en una de dos vías que son
mutuamente excluyentes: división o diferenciación. Las células capaces de dividirse son
indiferenciadas (células madre), mientras que las células totalmente diferenciadas sin
incapaces de dividirse. Las células madre (reponiendo así el comportamiento de células
madre) o experimentar una diferenciación completa, según las circunstancias y las señales
del medio. Las células madre se distinguen de las células en proceso de diferenciación por
los distintos patrones de expresión génica.
Metastasis e invasión
La proliferación celular no regulada puede producir un crecimiento neoplásico, pero las
características definidoras de malignidad son la invasión y las metástasis. Una neoplasia
maligna es un crecimiento reciente con la capacidad de invadir localmente o metastatizar a
lugares distantes del organismo.
La metástasis, al igual que la génesis del tumor, se produce sólo después de que entra en la
circulación un número suficiente de células tumorales con los cambios genotípicos y
fenotípicos necesarios.
La invasión es la translocación activa de células neoplásicas a través de las barreras
tisulares y de las barreras celulares y de matriz extracelular del huésped. No es simplemente
35
debida a la presión del crecimiento sino que requiere un descontrol genético y de señales
adición es el resultado de un desequilibrio y un descontrol de acontecimientos
estimuladores e inhibidores que en otras condiciones son normales.
La invasión y la neovascularización pueden ser acontecimientos muy tempranos en el
cáncer, que a menudo se producen incluso años antes de la detección clínica. La invasión es
necesaria para el avance desde la enfermedad in situ, y la formación de nuevos vasos
sanguíneos, para un aporte nutritivo adecuado para los tumores en crecimiento. Los
carcinomas pueden diseminarse por vía linfática y hematógena, y lo más frecuente es que
las metást asis se encuentren en órganos alimentados corriente abajo por los flujos linfático
y sanguíneo. La adherencia celular, la proteólisis local y la locomoción forman la tríada de
la invasión. Aunque todas son necesarias para que se produzcan metástasis con éxito,
ninguna es suficiente de forma individual. Para la invasión es necesaria la degradación de la
membrana basal local y la estroma intersticial circundante, pero por si sola, al igual que la
adherencia y la movilidad, no es suficiente para la diseminación a distancia de las células
malignas. La capacidad de cambiar de posición a través de hendiduras locales en las
barreras estructurales del organismo requiere que las células individuales tengan una
capacidad de locomoción. En la infección, los monocitos circulantes deben migrar hacia la
estroma para iniciar la formación de la yema vascular. De igual modo, las células tumorales
deben ser capaces de migrar desde la masa primaria para alcanzar un conducto vascular,
intravasarse, ser transportadas por la corriente sanguínea hasta lechos capilares distantes,
extravasarse y migrar una cierta distancia para iniciar la formación de una colonia. El
proceso de invasión tumoral y metástasis es una compleja sucesión de acontecimientos
bioquímicos y genéticos que está mediada por vías de transducción de señales y sistemas
moleculares múltiples (Harrison, 1999).
Antígenos Asociados a Tumores
Son antígenos asociados a células tumorales que no se encuentran en las células normales.
La mayoría de los tumores, inducidos o trasplantados, experimentales en animales
inmunizan a los receptores singenicos contra posteriores exposiciones al mismo tumor, pero
no contra el trasplante de tejidos normales o de otros tumores. Los AAT se demuestran
36
especialmente en tumores inducidos por carcinogenos químicos que presentan Ag
específicos que varían de un tumor a otro, y en tumores inducidos por virus, que tienden a
mostrar reactividad cruzada entre tumores inducidos por un virus determinado.
Se ha comprobado la existencia de AAT en diversos tumores malignos humanos,
incluyendo el linfoma de Burkitt, el neurublastoma, el melanoma maligno, el osteosarcoma
y algunos carcinomas GI. Por desgracia, aunque puedan poseer AAT, aparentemente no
todos los tumores humanos son inmunogenicos en el hospedero.
II.B.3. Neoplasias en el sistema inmunitario
II.B.3.1 Clasificación general
Las neoplasias del sistema inmunitario provienen de linfocitos, histocitos u otras células
que forman el sistema inmunitario. Se ha demostrado que los tumores linfocíticos son una
expansión monoclonal de células malignas y se cree que todas las neoplasias lo son. Esas
neoplasias suelen retener muchas características morfológicas funcionales y migratorias
semejantes a todas sus contrapartes celulares normales.
Clasificación de los trastornos inmunitarios según su célula de origen
Célula de origen
I.
Neoplasia
Célula B
Célula B medular
Leucemia linfocítica crónica,
linfoma
linfocitico pequeño
difuso.
Célula B folicular
Linfomas foliculares, linfoma
mixto difuso, linfoma de células
grandes difuso, linfoma de
Burkitt.
37
Célula B
Linfoma inmunobástico difuso.
Inmunoblástica
II.
Célula T
Célula T tímica
Linfoma linfoblástico.
Célula T madura
Linfoma de células T periféricas,
leucemia linfocítica cronica
(rara), linfoma relacionado con
HTLV-1, micosis fungoide,
síndrome de Sézary.
Célula T
Linfoma inmunoblástico difuso.
Inmunoblástica
III.
Histiocítico
Histiocitos
Histiocitosis maligna, linfoma
histiocitico verdadero (raro).
IV.
Desconocido
Enfermedad de Hodgkin.
Todas las neoplasias del sistema inmunitario son entidades clínicopatologicamente
distintas. Estos trastornos tienden a compartir algunos datos clínicos; por ejemplo es
posible que haya síntomas sistemáticos de fiebre, sudores nocturnos y perdida de peso, los
cuales tienden a correlacionarse con etapas avanzadas del padecimiento. La neoplasia suele
surgir en uno o más órganos del sistema hematopoyetico (ganglios linfáticos, hígado, bazo
y medula ósea) o si no se da tratamiento o este es ineficaz, tiende a diseminarse a todos
esos órganos, así como a otros sitios. La afección de la medula ósea con manifestaciones en
sangre periférica o sin estas es frecuente en ciertos trastornos y puede ser el dato que
predomina. En ocasiones hay infiltración meníngea cuando las neoplasias agresivas afectan
la medula ósea.
38
II.B.3.2 Neoplasias de las células linfoides
Los linfomas malignos aparecen por la transformación de las células linfoides normales en
distintas etapas de su diferenciación (Harrison, 1999). El linfoma afecta a un sistema
corporal que se comunica con los demás sistemas orgánicos, no obstante en vez de
proceder del tejido hemático este cáncer deriva del sistema linfático, red de ganglios, vasos
y órganos que proporcionan la principal defensa contra la infección. Por lo general, el
linfoma se origina en estos ganglios pero en ocasiones aparece en otros tejidos linfoides
como el bazo o el revestimiento intestinal. Los signos y síntomas específicos varían con el
grado y ubicación de la infiltración linfomatosa (Harrison, 1999).
Las neoplasias de la línea linfocítica B o T se denominan linfomas no Hodgkin. Este tipo de
linfomas son clasificados por el National Cancer Institute (NCI) y por Rappaport (cuadro
2).
En la clasificación de Rappaport el termino folic ular (utilizado en la clasificación del NCI)
se sustituye por modular, y el termino célula grande por histocito. Los grupos de pronostico
favorable y desfavorable se denominan grado bajo, intermedio y alto.
La clasificación de Rappaport, esta basada solo en conceptos morfológicos y no toma en
cuenta información reciente en cuanto al sistema inmunitario; por ejemplo el termino
linfoma “histiocítico” en general es incorrecto porque todos los linfomas no Hodgkin no
son de origen linfocitico.
Clasificación de los linfomas no Hodgkin
NCI (1982)
Rappaport (1966)
Grado bajo
Linfocitico pequeño (SLL)
Linfocitico
difuso,
diferenciado (DLWD).
39
bien
Folicular, célula hendida (FSCL)
Linfocitico
modular,
poco
diferenciado (NLPD).
Folicular, células hendidas pequeñas,
Linfocitico–histiocitico
modular mixto (NML)
grandes, y mixtas (FML)
Grado intermedio
Folicular, de células grandes (FLCL)
Histiocitico modular (NHL)
Difuso, de células hendidas pequeñas
Linfocitico
(DSCL)
difuso,
diferenciado
poco
(DLPD),
Linfocitico - histocitico difuso
mixto (DML)
Difuso, células hendidas pequeñas, y
Histiocitico
difuso
(DHL) grandes, mixtas (DML)
Difuso, de células grandes (hendidas
y no hendidas) (DLCL)
Grado alto
Inmunoblástico de células grandes
Histiocitico difuso(DHL)
(IBL)
Linfoblástico (contornado y no
contornado, (LL)
De células no hendidas pequeñas
Indiferenciado difuso
(DUL)
(de Burkitt y no Burkitt) (SNL)
Muchos de los linfomas no Hodgkin muestran dos tipos histológicos distintos. La estructura
y el tipo de célula los cuales pueden cambiar, por lo general evolucionan de un linfoma de
grado bajo hasta uno de grado intermedio o alto.
40
Los linfomas no Hodgkin son el tipo más grande de neoplasias del sistema inmunitario.
Estos se comprenden mejor como un grupo heterogéneo de enfermedades malignas cuyo
vinculo común es una expansión monoclonal característica de linfocitos malignos B o T.
La interpretación anatomopatologica de los linfomas no Hodgkin puede complementarse
con diversos estudios en la inm unofenotipificación es posible identificar la célula de origen
al demostrar Ig de superficie monoclonal de células B, rosetas de eritrocitos de carnero con
células T (rosetas E), y Ag de diferenciación de células B o T.
Los linfomas de grado bajo (SLL, FSCL y FML) presentan varias características clínicas
semejantes:
1. Cada uno tiene antecedentes de adenopatia que aumenta o disminuye o es lentamente
progresiva.
2. Esos son ganglios linfáticos móviles y de consistencia de caucho que rara vez son fijos
y no muestran infiltración cutánea suprayacente; los ganglios linfáticos pueden ser muy
voluminosos, pero rara vez causan dolor.
3.
A menudo hay alteración anatomopatologica en hígado y bazo, que pueden agrandarse.
4. Suele afectarse la medula ósea; es posible identificar células de linfoma circulante en el
frotis o mediante técnicas de clasificación de células.
5. Las biometrias hemáticas por lo general son normales en el momento del diagnostico.
6. Otros sitios de enfermedad extraganglionar pueden incluir pleura, pulmones, piel,
mamas y tubo digestivo.
7. Es posible que el agrandamiento de ganglios linfáticos ocasionen linfoedema,
obstrucción ureteral o compresión de medula espinal epidural.
8. No se observa infiltración del SNC (meníngea ni parenquimatosa), renal ni testicular.
Los linfomas intermedios (FLCL, DSCL, DML y DLCL) y los de grado alto (IBL, LBL y
SNCL) comparten varios datos clínicos generales:
3) Hay antecedentes de inicio repentino con masas de ganglios linfáticos y crecimiento
rápido.
4) Los ganglios linfáticos pueden tener consistencia de caucho y ser móviles, pero
también ser duros, fijos y con infiltración cutánea suprayacente.
41
5) Puede haber masas de ganglios linfáticos y voluminosos en el mediastino, en el
retroperitoneo, o en le mesenterio todos o una combinación de los anteriores.
6) Es posible que haya afección del anillo de Waldeyer y a menudo se relaciona con la
enfermedad extraganglionar del estomago o del intestino delgado, o ambos.
7) Puede haber hepatoesplenomegalia así como anormalidad en las pruebas de función
hepátic a.
8) Suele haber afección extraganglionar: estomago, intestino delgado, pulmones, piel,
huesos y SNC.
9) En el momento del diagnostico se observan con menor frecuencia trastorno de la
medula ósea y células circulantes, que en los linfomas de grado bajo; con todo puede
surgir un cuadro leucemico, cuando aparece enfermedad progresiva.
10) Las masas de ganglios linfáticos pueden causar linfoedema, obstrucción uretral o
vascular (síndrome de la cava superior, tromboflebitis) y compresión epidural de la
medula espinal.
II.B.4. Características del linfoma L5718Y.
El tumor tipo linfoma “L5718Y” es un modelo de tumor desarrollado experimentalmente
para su utilización en organismos de ratones (modelo murino), el cual es parecido al tumor
presentado en los humanos. proviene de células t del timo de ratón, es un tumor de células
grandes poco diferenciadas. se desarrolla en ratones con un complejo alto de
histocompatibilidad H-2 d de los cuales fue obtenido.
Se presenta en tres formas: dos locales y una generalizada. las formas locales son ascitis y
subcutánea sólida; la forma generalizada es la invasión de espacios porta en hígado,
sinusoides de bazo y otros órganos.
Hay reportes de la inmunosupresión asociada con la presencia de este tumor en forma
ascítica en ratones de la línea BALB/c (Daneri- Navarro A et al. 1995).
La causa de muerte del ratón es la generalización del proceso tumoral con la destrucción de
medula ósea roja, trastornos cerebrales e insuficiencia policitemica ó en caso de ascitis es la
insuficiencia cardiaca por presión de vasos principales de parte del liquido ascitico.
42
La forma sólida del tumor es muy bien vascularizada. el tumor es agresivo y rápidamente
penetra en el tejido normal infiltrándolo. el ratón en caso de tener tumor sólido muere de 9
– 30 días después de la inoculación de 1x107 células tumorales.
Las hembras son más susceptibles que los machos. en medio de cultivo el tumor crece en
suspensión en los medios de clase Fisher (ATCC, 1996).
II.B.5. Inmunología tumoral
Se han demostrado respuestas inmunitarias en experimentos in vivo, frente a tumores lo
cual ha incrementado el interés por la búsqueda de unas respuestas inmunitarias en el ser
humano. La disponibilidad de cepas singénicas de animales permite diferenciar entre las
reacciones inmunes dirigidas contra antígenos asociados a tumores (AAT) y las dirigidas
contra los antígenos (Ag) de histocompatibilidad normal presentes también en las células
tumorales.
Probablemente la presencia de estructuras de superficie inmunogenicas en las células
neoplasicas
humanas
nos
permita
su
identificación
por
células
huéspedes
inmunocompetentes, así como su interacción con los anticuerpos (Ac) humorales. El
significado de tales identificaciones y reacciones en la patogenia de los tumores y la
posibilidad de aumentarlas a favor del hospedero son objeto de una intensa investigación.
II.B.5.1 Respuestas del hospedero frente a los tumores.
Inmunidad celular
Los mecanismos celulares asociados a hipersensibilidad tardía (es decir, mediada por
células T) destruyen las células tumorales recién formadas después de identificar a los
AAT. En el hombre, mediante la mezcla de suspensiones de linfocitos de sangre periférica
del paciente y de células tumorales se ha inhibido el crecimiento de nódulos tumorales in
vivo lo cual sugiere la existencia de una reacción de mediación celular contra el tumor. Se
ha demostrado que células linfoides (generalmente linfocitos T) de pacientes con ciertas
neoplasias muestran citotoxicidad contra células cultivadas de tumores correspondientes.
No se conoce por completo el significado de tales reacciones en el control de crecimiento
43
tumoral. Parece probable que uno o más tipos de linfocitos T, puedan lesionar in vivo a las
células tumorales. También se han hallado células con esta capacidad en individuos no
portadores de tumores, a las que se han denominado células agresoras naturales (NK).
Los macrófagos pueden destruir significativa y específicamente las células tumorales
cuando se activan en presencia de AAT, linfocinas (factores solubles) producidas por las
células T o por IFN -. Además los linfocitos T supresores, inhiben la producción de una
respuesta inmunitaria contra los tumores.
Inmunidad humoral
En ciertos linfomas y leucemias en animales se ha demostrado un efecto protector mediado
por Ac contra el crecimiento tumoral in vivo. Por el contrario, la protección mediada por
células linfoides in vivo se produce en una gran diversidad de sistemas tumorales en
animales.
Los Ac. Antitumorales pueden incluir los siguientes tipos:
1. Ac. Citotóxicos; que en general se fijan al complemento y se dirigen contra los Ag de
superficie. Los Ac IgM suelen ser más citotóxicos que los IgG.
2. Ac bloqueadores o estimulantes; por lo general IgG, que posiblemente forman
complejos con Ag solubles. Pueden favorecer el crecimiento de un tumor, en vez de
inhibirlo.
No se conocen bien los mecanismos y la importancia relativa de tal potenciación
inmunológica, pero es posible que intervengan inmunocomplejos solubles y la producción
de células T supresoras.
Se ha comprobado in vitro la presencia de Ac humorales, dirigidos contra las células
tumorales humanas o sus constituyentes, en el suero de pacientes con linfoma de Burkitt,
melanoma maligno, osteosarcoma, neuroblastoma y carcinomas GI.
II.B.5.2 Alteraciones de la respuesta inmune del hospedero.
44
Los tumores que poseen AAT. Son capaces de crecer in vivo, lo que sugiere la existencia de
una respuesta deficiente del hospedero contra los AAT. Los posibles mecanismos que
pueden seguir son los siguientes:
1. Puede desarrollarse una tolerancia inmunológica especifica a los AAT. Es probable que
las células T supresoras intervengan de una forma desconocida.
2. Agentes químicos, físicos o viricos pueden suprimir la respuesta inmune.
3. El tratamiento, especialmente los fármacos citotóxicos y la radioterapia, puede suprimir
la respuesta inmune.
4. El tumor puede per se suprimir la respuesta inmune. Una inmunidad celular deficiente
puede asociarse a recidivas y diseminación de los tumores, aunque es difícil determinar
cuál es la causa y cuál es el efecto.
II.C. Relación entre la presencia de tumor maligno y infección por T. cruzi
in vivo.
II.C.1. Aceleración del crecimiento de tumores inducidos por virus.
Los ratones infectados con T.cruzi son más susceptibles al crecimiento progresivo de las
células singénicas B.GV de tumor inducido por virus que los ratones no infestados. Los
resultados similares fueron obtenidos con y sin la aplicación de células tumorales. Se ha
propuesto la infección crónica por T.cruzi como inhibidor de la generación de linfocitos
citotóxicos T tumoroespecíficos (CTL). Esta supreción es inducida por una subpoblación de
células supresoras provenientes del bazo (Plata F 1985).
45
II.C.2. Actividad lítica espontánea de células linfoides del huesped contra
los tumores alogénicos.
Los macrófagos peritoneales y las células linfoides del bazo de los ratones infectados con
T.cruzi generan una respuesta citotóxica mediada por células específicas y no específicas
contra tumores alogénicos (Hatcher FM, et al. 1981). Este efecto citotóxico se observa en
células del bazo extraído de animales previamente sensibilizados con células tumorales y
luego inoculados con T cruzi y se disminuye cuando animal no esta infectado con T.cruzi.
Además, los esplenocitos y las células de la cavidad peritoneal desarrollaron actividad
citotóxica no específica contra las células tumorales sin previa sensibilisación. Esta
actividad lítica no específica producida por T.cruzi (TILA) tiene dos fases: 1. fase temprana
(2 días después del inóculo) y 2. fase tardía (20-22 días después). El mecanismo de este
efecto no fue determinado, pero podría ser el resultado de la actividad mayor de las células
NK del bazo, demostrado en animales con T.cruzi (Cardillo F, et al. 1996).
Por otra parte se ha reportado la participación del timo en el crecimiento de tumores
malignos, como los inducidos químicamente, o el sarcoma murino provocado por virus. En
ambos modelos, la timectomía antes de la inducción del tumor produjo una mayor
resistencia contra su crecimiento, efecto que podría ser explicado por eliminación de las Tcelulas supresoras del timo extirpado, este efecto podría observarse también en la infección
por T cruzi, ya que se produce atrofia tímica, como se señaló anteriormente.
II.C.3. Teoría de las propiedades antitumorales de la especie
Trypanosoma cruzi.
A principio de los años 30 de este siglo en Rusia se planteó el antogonismo natural entre la
infección por T.cruzi y la presencia de tumor maligno en el organismo de mamíferos
(Roskin Gr, et al. 1932; Roskin G.I., et al. 1931). Posteriormente se ha observado, que la
infección disminuye el crecimiento de, por lo menos 30 tipos diferentes de tumores en
varias especies de mamíferos, y en caso de ser inoculado antes de inicio de proceso maligno
46
a veces impide su desarrollo in vivo ( Kallinicova VD, et al.1994a; Kallinicova VD, et al.
1994b; Kallinicova VD, et al. 1995; Kallinicova VD, et al. 1996; Kalinnicova VD, et
al.1997). Se propuso que T.cruzi tenía tropismo a las células malignas, y podía provocar
lisis de estas últimas (Klueva NG, et al. 1946). Se describieron los cambios morfológicos
del tumor en diferentes fases de la infección, aunque no fue revelado el mecanismo de estos
cambios (Klueva NG, et al. 1946). En los años 40-50 los trabajos en este campo fueron
iniciados en Francia en el Instituto Merieux, y los resultados obtenidos en esta institución
no diferían mucho de los obtenidos por los rusos. (Galliard H, et al. 1950). En los años 50
a base de los resultados obtenidos en Rusia y en Francia se planteó La teoría de las
propiedades anticanceríginas de la especie Trypanosoma cruzi. Sin embargo, algunos
autores han encontrado que la infección crónica con T cruzi favorece el desarrollo de
tumores murinos (Kallinicova VD, et al. 1996).
II.C.4. Los factores antitumorales en trypomastigotes de Tripanosoma
cruzi.
El homogenizado de trypomastigotes de T.cruzi demostraba una baja actividad citolítica
contra las células de neuroblastoma. Esta actividad se disminuía después de una
criopreservación de homogenado a –20C° durante 1 semana. Tripsina y pronasa E
potenciaban el efecto citolítico de esta sustancia la actividad de la cual parece ser
dependiente de la actividad de varias enzymas. El factor citotóxico fue insoluble en la
solución salina y obtenida en los extractos clorofórmicos del parásito. La análisis
cromotográfico revelo que dicha actividad podría ser atribuida a 3 ácidos grasos y unas
fracciones lippopolisacáridas presentes en T.cruzi. La actividad más alta fue observada en
experimentos con los ácidos eicosatetranoico (20:4) y octadecadienoico (18:2). Vale la
pena mencionar que alrededor de 27.7% de los lípidos en total de T.cruzi de tres ácidos
grasos que revelaron actividad tumorolítica y 1 mg de homogenado contenia 96
microgramos de estos ácidos (Asahi H et al 1986).
47
III. Conclusiones generales y planteamiento del problema.
Conclusiones generales.
Hasta ahora en la literatura no conseguimos encontrar mas que unas cuantas referencias de
este tema. El estudio de estas ref erencias nos permite concluir:
1. Los trabajos dedicados al estudio del desarrollo simultaneo de T.cruzi y
tumores malignos son muy escasos y se han hecho con diferente
metodología (diferentes cepas de T.cruzi, con dosis diferentes del inóculo y
niveles de parasitemia así como tumores diferentes y diferentes métodos de
los estudios morfológicos).
48
2. Se han analizado las propiedades de la infección en diferentes períodos de
esta.
3. Los datos y mecanismos propuestos para la explicación de los efectos sobre
los tumores son contradictorios.
4. En ninguno de estos trabajos se observó el cambio posible del tropismo
tisular de T.cruzi en los animales con tumores malignos.
Planteamiento del problema
El tumor maligno por su presencia en animal provoca una depresión de la inmunidad
general, que puede hacer a los animales más susceptibles a la infección por T.cruzi. En
estas condiciones se puede esperar que T.cruzi será capaz de invadir mas tejidos que en
los ratones con la inmunidad no afectada. La infección por T.cruzi también afecta la
inmunidad de huesped que puede favorecer el desarrollo del tumor. Los posibles efectos
de la inmunidad especifica ambivalente tambien pueden influir en el desarrollo de
ambos procesos.
IV.Objetivos del estudio.
Objetivos generales
Describir el tropismo tisular de la cepa CH 4 de T.cruzi.
Describir los cambios posibles de este tropismo en caso de presencia de tumor maligno
en animal en dos etapas de la fase aguda.
Describir los cambios posibles en desarrollo del tumor en los animales infectados por
T.cruzi.
49
Objetivos específicos
Determinar la influencia del linfoma L5178Y (forma solido subcutaneo) sobre la
distribución de T.cruzi cepa CÍ 4 en tejidos de raton en la fase inicial de la fase aguda.
Evaluar el efecto del linfoma L5178Y (forma solido subcutaneo) sobre la eliminación
de T.cruzi cepa CH4 de los tejidos de raton en la fase de estabilización de parasitemia.
Estudiar posible influencia de presencia de la infección de T.cruzi cepa Ch4 en ratones
en el desarrollo y estado de la linfoma L5178Y (forma solido subcutaneo) en la fase de
inicio de parasitemia y la fase de estabilización de parasitemia.
Campo de conocimiento que se pretende cubrir.
Biología de enfermedades protozoarias y neoplasias malignas
V. Las Hipótesis del trabajo
Hipótesis nula.
Los tropismos tisulares de la cepa CH 4 de T.cruzi no se cambiarán en presencia de
tumor maligno en animal y en su turno T.cruzi no va a influir en el desarrollo del tumor.
Hipótesis alterna.
50
Los tropismos tisulares de la cepa CH 4 de T.cruzi
se cambiarán en presencia de
tumor maligno en animal y a su vez T.cruzi va a influir en el desarrollo del tumor.
.
VI. Metodología
Tipo de estudio.
Se trata de un estudio experimental en el modelo animal.
Unidad de observación.
Ratones de la cepa BALB/C machos de la edad de 8 semanas (lab. CIBO-IMSS, Guad.
Jal.).
51
Asignación por grupos.
Los ratones serán asignados en forma secuencial a cada tratamiento, mediante un
muestreo simple y con reposición. La aleatorización se hará mediante sorteo del tipo de
experimento. Los grupos de ratones (20 en cada uno) se dividirán de la siguiente
manera:
A) Ratones infectados con T.cruzi y sacrificados a los 16 días de parasitemia;
B) Ratones inoculados con tumor subcut áneamente en el primer día de
parasitemia de T cruzi y sacrificados a los 16 de parasitemia;
C) Ratones infectados con T.cruzi y sacrificados a los días 59-65 de parasitemia;
D) Ratones infectados con T.cruzi e inoculados con tumor subcutaneamente a
los días 43-49 de parasitemia y sacrificados a los días 59-65 de iniciada la
parasitemia;
E) Ratones inyectados con solución salina (grupo control).
F) Ratones inyectados con tumor subcutaneamente
Medidas de Intervención:
A) Mantenimiento: Todos los ratones se mantendrán bajo condiciones
controladas de alimento (Nutricubes, Ralston Rations), temperatura (28°C)
y humedad relativa 75%.
B)
Camadas:
Para cada experimento se utilizarán camadas homogéneas
para mantener el mayor control posible.
C)
La inoculación del tumor: se hará siguiendo la técnica de la inoculación
subcutánea en la región de nuca en la dosis de 1000000 células
D)
La infección por T cruzi: se practica a través de la inoculación peritoneal
en la dosis de 100000 trypomastigotes siguiendo el protocolo de
Wisnivesky.
Mediciones:
52
1) Recuento de Trypanosomas en la sangre:
a) En el día 6,7 y 8 después de inoculación para definición del día de inicio de
parasitemia, que se tomara como valor de referencia para el día de inicio de
parasitemia.
2) Medición de crecimiento tumoral al día 16 después de inoculación de tumor:
a) Revisión de la presencia de tumor (si o no) cada dos días después de
inoculación con finalidad de anotar el día de aparición del tumor o conocer
el porcentaje de no desarrollo con la finalidad de conocer la proporción de
desarrollo tumoral en el animal inoculado.
b) Revisión de la presencia de tumor al día 16 después de inoculación en los
ratones se incluirán los casos de degeneración espontánea del tumor
c) Medición de dos parámetros tumorales (longitud y anchura)
d) Anotacción de posibles ulceraciones superficiales de tumores
3) Estudios morfológicos para detectar y comprobar la presencia del parásito en
tejidos.
Manejo de Variables:
1.- Tamaño de tumor (en escala continua)
2.- Ulceración del tumor (nominal)
3.- No desarrollo del tumor (nominal)
4.- Degeneración espontánea del tumor (nominal)
5.- Tropismo cerebral (nominal).
6.- Tropismo a la médula espinal (nominal).
7.- Tropismo cardíaco (nominal).
8.- Tropismo hepático (nominal).
9.- Tropismo al bazo (nominal).
10.- Tropismo renal (nominal).
11.- Tropismo tumoral (nominal)
12.- Tropismos a los músculos estriados (nominal)
53
1) Para la análisis de las variables nominales como Degeneración espontánea de tumor,
No desarrollo de tumor, Ulceración de tumor se usaron las tablas de contingencia.
2) Para la análisis de la variable Tamaño de tumor se usó ANOVA de una vía con un
intervalo de confianza de 95% y una p de 0.05.
3) Para la análisis de las variables de tropismos se usó la tabla general de valores
nominales .
Para las análisis estadisticas se usaron programas Statgraphics 2000 y Epi 6.
Variables a comparar en los grupos del experimento.
1) Tamaño del tumor en el día 16 de desarrollo del tumor
a) En los grupos B,F
b) En los grupos D,F
2) Presencia de ulceración en tumores en el día 16 de desarrollo.
c)
En los grupos B,F
d) En los grupos D,F
3) Tasas de no desarrollo de tumores
e) En los grupos B,F
f) En los grupos D,F
4) Tasas de degeneración espontanea de tumores
g) En los grupos B,F
h) En los grupos D,F
5) Tropismos tisulares del parásito
i) En los grupos A,B,E
j) En los grupos C,D,E
54
Representación de resultados
Los resultados de tropismos se representan en una tabla general con las frecuencias
relativas de la presencia de parásito en diferentes tejidos.
Los resultados de crecimiento de estudio de desarrollo o no desarrollo de tumores,
ulceración de tumores, regreso de tumores, se representan en tablas 2X2.
Los resultados de crecimiento de tumores se representan en unas tablas comparativas
con valores promedios de superficie en santimetros cuadrados.
Los procedimientos preliminares al estudio.
Estos procedimientos se hicieron con la finalidad de justificar la dosis de inoculación por
parásito y por tumor, el día de inoculación de tumor en el experimento y los días de
sacrificio de animales.
Estandarización de la cepa de T.cruzi.
a) Procedimiento para estandarización de la presencia de parasitemia.
Los ratones se inocularon con T.cruzi en la dosis definida. A partir de 3 día después de
inyección cada 2 días se tomó la sangre por medio de corta de cola. La sangre se examinó
de diferentes modos con microscopio luminar: hasta la aparición de parasitemia- en gota
gruesa fresca, en la frotis colorada con método de Romanovski -Giemsa. En caso de
presencia de parasitemia en animales el resultado de ensayo fue considerado por positivo.
El resultado de procedimiento nos dio la tasa de presencia de parasitemia de la cepa
determinada de T.cruzi.
b) Procedimiento para definición de la índice de mortalidad en la fase de parasitemia
primaria en machos para las dosis determinadas del inóculo.
En todos los casos de parasitemia primaria fueron incluidos todos los casos de
fallecimiento de animales.
El resultado de procedimiento general se presentó como tasa de la mortalidad en la
fase de parasitemia primaria para la cepa determinada de T.cruzi inoculada en la dosis
determinada.
c) Procedimiento para definición de nivel de parasitemia primaria.
55
En este procedimiento cada día de parasitemia se tomó la sangre por medio de corte de
cola y el número de parásitos se contó en cámara hematocitométrica.
Este procedimiento nos da información en cuanto a tipo de la curva de parasitemia
para la dosis determinada del inóculo de T.cruzi.
Estandarización de la línea celular tumoral in vivo.
Por razón de presentar el tumor con el desarrollo de ascitis en caso de ser inoculado
intraperitonealmente el linfoma C5718Y puede ser mantenida en vivo por medio de
resiembra con la inoculación intraperitoneal del líquido ascítico del animal donador al
animal receptor. Los animales se revisaron cada dos días con el fin de encontrar la ascitis.
Se consideraron todos los casos de no desarrollo del tumor o desaparición espontanea de
este. Además se documentaron todos los casos de la muerte de animales.
Los procedimientos iguales se hicieron en el caso de la inoculación subcutánea de
tumor, con finalidad de ver todos estos parámetros para la forma sólida.
Así se determinaron:
a) tasa de desaparición espontanea de tumor
b) tasa de no desarrollo de tumor en el animal inoculado.
c) tasa de mortalidad causada por tumor.
Métodos
1)Preparación de los medios de cultivo NNN.
En el mantenimiento de las cepas de T.cruzi se usarán dos tipos de los medios NNN:
a) para mantenimiento de cultivo (D2, L1) (Castejón Oscar V. 1989)
b) para envejecimiento rápido del cultivo con el fin de obtener formas trypomastigotes
en cantidades suficientes para la inoculación al animal (D1, L2).
La fase densa de cultivo va a ser preparada de los modos siguientes:
D1) Agar purificado bacteriológico
14 g
Na Cl
6g
Agua destilada, desionisada
900 ml
Sangre de conejo desfibrinisada
180 ml
56
Solución de Penicilina
1000000 U
D2) Agar de Infusión de cerebro y corazón 46.8 g
Agua destilada, desionisada
900 ml
Sangre de conejo desfibrinisada
300 ml
Solución de Penicilina
1000000 U
Agar y Cloruro de Sodio se desuelen en el agua y se esterilizan en esterilizador. A la
sangre se adiciona la solución de penicilina. Antes de que se solidifique el Agar a t° de
48°C se adiciona la sangre desfibrinada de conejo.
La fase densa se reparta por tubos estériles con tapón plástico en cantidad 4 ml por tubo.
La fase líquida de medio de cultivo va a ser preparada de los modos siguientes:
L1) Infusión de cerebro y corazón
37 g
Agua destilada, desionisada
1000 ml
Solución de Penicilina
1000000 U
L2) Solución Ringer
NaCl
8g
Na2HCO3
0.2 g
KCL
0.2 g
Agua destilada, desionisada
1000 ml
Solución de Penicilina
1000000 U
En todos los casos la solución de Penicilina se agrega después de esterilización cuando
el medio de cultivo no tiene t° más que 48°C.
Al preparar ambas fases y después de solidificación de fase densa la fase líquida y fase
densa por separado se exponen a t° 37°C durante 48 horas. Después de control
microscópico de contaminación, la fase líquida se agrega en cantidad de 5-6 ml a los tubos
con la fase densa no mas que dos día antes de sembrar la cepa de T.cruzi.
2) Mantenimiento de cultivo de T.cruzi.
En condiciones de la campana con flujo laminar a los tubos estériles con el medio de
cultivo NNN se agregan por lo menos 10 gotas de la fase líquida de cultivo de T.cruzi. Los
tubos se tapan con tapón de plástico y se almacenan en incubadora a t° de 28°C. Cada dos
semanas los tubos se observan en microscopio para controlar el estado de cultivo y
57
contaminación por bacterias y hongos. En caso de aparecer los signos de degeneración de
cultivo (la disminución de cantidad de células mas que en dos veces en comparación con la
cantidad máxima, agrupamiento de células a "rosetas") este inmediatamente se resiembra.
3) Marcación de ratones.
a)Ratones fueron marcados con el Nitrato de Plata. El pelo de ratones se moja con
nitrato de plata y después de 2-12 cambia color de blanco a marrón y permanece así unos 24 meces. La clave de marcación es siguiente:
1- la pata izquierda anterior
6- la pata derecha posterior
2- el lado izquierdo
7- la cabeza
3- la pata izquierda posterior
8- el lomo
4- la pata derecha anterior
9- la cola
5- el lado derecho
10- la línea de cabeza hasta la cola
11- la línea de cabeza hasta la cola y la pata izquierda anterior
b)Las jaulas con ratones traen el rótulo con la fecha de inoculación, la cepa de T.cruzi
con que fueron inoculados ratones, sexo de ratones inoculados, cantidad de ratones en esta
jaula, y en caso de fallecimiento de ratones la fecha de fallecimiento y las claves de
animales fallecidos.
4) Mantenimiento de ratones
Ratones van a ser mantenidos en las jaulas de plástico transparente separados por sexo
no más que 10 animales en 1 jaula.
Alimento va a ser "Nutricubes" de Ralston Rations para ratas, ratones y jamsters.
El agua purificada in biberones.
5) Preparación de la gota gruesa fresca de la sangre.
La cola de ratón se esteriliza con la gasa alcoholizada y se corta con tijeras. La gota de
la sangre se pone a portaobjetos después con la micropipeta automática se toma 5µl de la
sangre y se pone al otro portaobjetos y se cubre con cubreobjetos. La cola debe ser
quemada en la llama de mechero de gas o de alcohol gota de sangre se observa
inmediatamente en el microscopio luminar (Ivey MH 1970).
58
6) Preparación de frotis de la sangre periférica de ratón colorada con el método de
Romanovski- Giemsa.
La cola de ratón se esteriliza con la gasa alcoholizada y se corta con tijeras. La gota de
la sangre se pone a portaobjetos después con la micropipeta automática se toma 5µl de la
sangre y se pone al otro portaobjetos y se hace frotis por medio de un portaobjetos
desgrasado. La cola debe ser quemada en la llama de mechero de gas o de alcohol. El
frotamiento se seca 15 minutos, se fija en la solución de Alcohol Metílico 96% a +4°C, se
seca 15 minutos, y se colora con Azul de Giemsa (diluido- 3 gotas de Azul en 5 ml de Agua
destilada y desionisada) durante 20 minutos, se lava con el Agua destilada y deshionisada y
se seca.
7) Sacrificio del animal y extracción de los órganos para el estudio morfológico.
Antes de ser sacrificados animales fueron eterizados con Eter Etílico como anestético.
Después se extrajeron los órganos siguientes: cerebro, médula espinal, corazón, hígado,
bazo, riñón, músculo esquelético.
8) Fijación y coloración de los cortes de diferentes órganos de ratón con HematoxilinaEosina.
La preparación de los cortes se realizó en el departamento de patología de la Facultad
de Medicina de acuerdo con los métodos convencionales.
9) Preparación de medio de cultivo para las células cancerígenas.
En las condiciones estériles se mezclaron los componentes siguientes en la proporción
determinada (Culture of Animal Cells...1993):
Medio RPMI
90%
Suero bovino fetal, inactivado por calentura
10%
Antibiótico- Antimicótico:
Penicilina G de Sodio-
100 000 U/l;
Sulfato de Estreptomicina
100 000 mg/l;
250 µg/l
Amphotericina B
59
10) Mantenimiento de las líneas de células cancerígenas en vitro.
Para el control corriente las células se contaron en cámara hemocitométrica. Las
células para ser observadas fueron tratadas con Azul de Trypana (0.4% p/v al medio de
cultivo sin suero para evitar la precipitación del colorante).
Células se cultivarán en incubadora en condiciones de humedad con acceso controlado
de CO2 al t° de 37°C.
Todas las manipulaciones con cultivos fueron efectuadas en condiciones de esterilidad
extrema en la campana de flujo laminar vertical o horizontal.
Todos los cultivos en diferentes fases de cultivación se examinaron microscópicamente
con el fin de control de contaminación bacteriana y honguígena. Todos los frascos
contaminados se reemplazaron inmediatamente.
11) Mantenimiento de la línea tumoral in vivo.
Las líneas celulares se mantuvieron in vivo por medio de inoculación de 0.1- 0.2 ml del
líquido ascítico de los animales enfermos sacrificados de acuerdo con el tiempo de
resiembra estandarizado especialmente.
12) Criopreservación de la línea tumoral.
a) Preparación del medio para Criopreservación.
Al preparado medio de cultivo correspondiente para cada de las cepas (90% de vol.)
sin antibiótico se adicionó Dimethyl sulfoxide, DMSO 10%.
b) Preparación del cultivo para criopreservación
En la fase log de cultivación el medio de cultivo acondicionado se reemplazó por el
medio fresco. Después de 24 horas de conservación el medio se completará con 10% de
DMSO.
c) Almacenamiento.
En los frascos plásticos las células se almacenarán primeramente en cámara especial en
REVCO (-70°C). Y después de ser congeladas a este t° fueron colocadas a las condiciones
de criopreservación en el Nitrógeno líquido.
60
Después las líneas celulares cancerígenas son almacenadas en los tubos o frascos
estériles de plástico en el Nitrógeno puro líquido en el frasco de Dewar.
13) Inoculación de tumor de cultivo a animales.
A los animales de experimento van a ser inoculados las células cancerígenas
subcutaneamente en la región de nuca en la dosis de 1000000 de células, con las jeringas de
insulina graduadas.
14) Inoculación de T.cruzi a animales.
A los animales de experimentos se inocularon trypomastigotes de la sangre de los
ratones infectados intraperitonealmente en la dosis de 100000 de células por ratón.
Nota importante:
1) Trypanosomas son objetos de bioriesgo, y en transcurso de trabajo se cumplieron
todas las medidas requeridas para la preservación de personal. Para evitar la infección
posible se creó pequeño almacenamiento de preparados antichagásicos (Por ejemplo
"Radanil").
2)La línea tumoral es el objeto de bioriesgo de grado 1. En trabajo con ella también se
cumplieron todas las medidas requeridas para la preservación de personal.
61
VII. Material experimental y recursos humanos.
La cepa de T.cruzi es CH4 (Ahislada y donada por M.D. Mario Barrera Perez del Instituto
Hideo Noguchi Merida Yucatan).
La línea tumoral es el tumor de las células T C5718Y (Instituto de Inv. Biomédicas UNAM
Cuernavaca)
Equipo para los laboratorios microbiológicos y cultivo de tejidos en
general.
Equipo
Cantidad Disponibilidad Origen
pH-metro
1
Disponible
CUIB
Electroestufa con la mezcladora
1
Disponible
CUIB
Mezcladora magnética
1
Disponible
CUIB
Electroesterilisadora
1
Disponible
CUIB
Electroestufa
1
Disponible
CUIB
Campana de flujo laminar
1
Disponible
CUIB
Mechero de Gas
3
Disponible
CUIB
Mechero de Alcohol
3
Disponible
CUIB
con el rotor para los 1
Disponible
CUIB
Disponible
CUIB
Microscopio óptico de la luz "Zeiss" 2
Disponible
CUIB y fM
Microscopio óptico ivertido "Nicon" 2
Disponible
CUIB
Incubadora
2
Disponible
CUIB
Cámara de hematocytométrica de 5
Disponible
CUIB
Disponible
CUIB
magnética
Centrífuga
tubos de 1.5 ml
Centrífuga
con el rotor para los 1
tubos de 15 ml
New Bouer
Pipetaid
2
62
Precio*
Barras magnéticas para mezclar las 3
Disponible
soluciones
1
Disponible
Espatel de acero inoxidable
2
Disponible
liquido 1
Disponible
para
10.80$
Z26,630-2
Balanzas de laboratorio
Dewar
Sigma
nitrogeno
CUIB
CUIB
“Locator 4”
Equipo para preparación de los cortes
Tipo de equipo
Cantidad Disponibilidad Origen
Microtomo normal
1
1
fM
Estuche de vivisección
2
1
LEfM
20
fM
Envases para los órganos con formol 50
Precio*
Gasto corriente
Incluye la cristallería, guantes y cubrebocas desechables, los plásticos para el
cultivo de las células y criopreservación, filtros y puntillas para las pipetas automáticas
agua tridistilada, cinta adhesiva, papelería, marcadores de vidrio y para papel, gaza,
algodón, detergentes etc., con un total de gasto 15000 en MN y 730 en $ de USA para dos
años de trabajo.
Reactivos y medios para el cultivo de Trypanosomas.
Tipo de material
Cantidad Disponibilidad Origen
Bóferes de referencia a pH = 4.0, 1
disponible
frasco de 500 ml
Sigma
Precio*
13.40 $
B5020
Bóferes para calibración de pH- 1
disponible
metro a pH = 7.0, frasco de 500 ml
Sigma
13.40 $
B4770
Bóferes para calibración de pH- 1
dis ponible
63
Sigma
13.40 $
metro a pH = 10.0, frasco de 500 ml
Infusión
B4895
de corazón y cerebro 2x450g
1
LEfM
"Bexton"
Agar purificado "J.T. Baker"
2x500g
1
LEfM
Agar nutritivo "Bexton"
2x450g
1
LEfM
cerebro 2x450g
1
LEfM
Agar
de
corazón
y
"Bexton"
Sangre del conejo
q.s.
Disponible
CUIB
Cloruro de Sodio en polvo
1x500g
Disponible
LEfM
NaHCO 3
1x450g
Disponible
LEfM
KCL
1x450g
Disponible
LEfM
Disponible
LEfM
Disponible
LEfM
Soluciones de HCl para ajustar el 200ml
pH de medio
Soluciones de NaOH para ajustar el 200ml
pH de medio
TOTAL
40.20
Todos los reactivos y materiales necesitados para la coloración de los cortes con
Hematoxilina -Eosina están disponibles en el departamento de Patología de la facultad de
Medicina. En el caso de no ser disponibles los materiales fueron solicitados a parte.
Además del equipo enumerado antes se necesitó lo siguiente:
Medios para el cultivo de las células cancerígenas
Material
Cantidad Disponibilidad Origen
Precio*
RPMI media 500ml
12
Suero fetal bovino, 100 ml
2
Antibiótico-antimicótico, 20 ml
3
Versene, 1X, 100 ml
Trypsin, 100 ml
disponible
Gibco
186$
disponible
Gibco
172$
disponible
Gibco
33 $
6
disponible
Gibco
38$
6
disponible
Gibco
42$
64
Trypan blue stain
2
disponible
Gibco
28$
HEPES Buffer solution, 100ml
1
disponible
Gibco
51$
550$
TOTAL
Reactivos para la preparación de las frotis de sangre fijadas
Isopropanol
500 ml
disponible
Sigma
12.80$
0398
Azul de Giemsa
8x200 ml
disponible
Sigma
114.40$
G3032
Mantenimiento, reproducción y marcación de ratones:
Fueron necesarias jaulas de diferentes tamaños, biberones.
Se necesitaron los alimentos "Nutricubes" en cantidad de 20 kg mensuales con el gasto de
338 pesos y viruta.
El reactivo que se usa para la marcación de ratones
Solución de Nitrato de plata
50 ml
Disponible
CUIB
Medicamentos
Tipo de medicamento
Cantidad Disponibilidad Origen
Precio*
Benzilpenecilina la sal de Sodio
50 frascos disponible
800MN
Solución de NaCl fisiológica estéril
8x500 ml 2
120MN
Radanil (Benzonidazol)
250 comp Disponible
Roche.Arg.
100$
Notas para las tablas:
a) * Para el equipo y material disponible en el CUIB o en la Facultad de Medicina de la
Universidad de Colima no se indica el precio.
b) CUIB- Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas
65
c) LEfM- Laboratorio de Ecología de la facultad de Medicina
d) fM- la facultad de Medicina
e) #- Los artículos hechos en México, que van a ser cotizados durante el transcurso de
trabajo.
Recursos humanos
Asesores
En Mexico:
Dr. Rafael Coll (U. de Colima)
Dra. Oxana Dobrovinskaya (U. de Colima)
En Rusia:
Dr. Mikhail V. Dalin (UdAPR Moscú)
Tutores
Dr. Francisco Fiero
Dr. Francisco Espinoza
Colaboración con otras unidades de la Universidad de Colima
Departamento de Morfología de la Facultad de Medicina
Bioterio del CUIB
Colaboración con otras Universidades
Universidad de Amistad de los Pueblos Rusa- Departamento de Microbiología e
Inmunología general.
66
VIII. Resultados de los procedimientos preliminares al estudio.
Estandarización de la cepa de T.cruzi .
a) Procedimiento para estandartización de la presencia de parasitemia.
Los 20 machos ratones se inocularon con T.cruzi en la dosis de 100 000 de células por
ratón. A partir de 3 día después de inyección cada 2 días se tomaba la sangre por medio de
corta de cola. La sangre se examinaba en fresco con microscopio luminar: hasta la
aparición de parasitemia. En caso de presencia de parasitemia en animales el resultado de
ensayo se consideró por positivo.
-Tasa de virulencia de la cepa Ch 4 en la dosis de 100 000 de trypomastigotes
sanguíneos por raton en machos de 8 semanas de edad de la línea BALB/ Ñ- 100%
- Día de inicio de parasitemia de la cepa Ch 4 en la dosis de 100 000 de
trypomastigotes sanguíneos por ratón en machos de 8 semanas de edad de la línea BALB/C
es el día 8 post inoculación intraperitoneal.
b) Procedimiento para definición de la índice de mortalidad en la fase de parasitemia
primaria en machos para las dosis determinadas del inóculo.
En todos los casos de parasitemia primaria fueron incluidos todos los casos de
fallecimiento de animales.
-Tasa de mortalidad en la fase aguda de parasitemia en machos de la línea
BALB/C infectados por la cepa Ch 4 en la dosis de 100 000 de trypomastigotes sanguíneos
por ratón – 9/20
67
Curva de parasitemia en los machos de la línea BALB/c infectados por la
cepa CH 4 en la dosis de 100 000 de trypomastigotes sanguíneos por ratón
7)
1)
(6
60
(6
5)
54
(5
(4
9)
48
3)
42
(4
7)
36
(3
(3
1)
30
5)
24
(2
9)
18
)
(1
13
12
6(
1(
8)
9000000
8000000
7000000
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
Características principales de la curva de parasitemia:
Día de inicio de parasitemia-
día 8
La Fase de Ascenso –
días 9-18
Día de máximo de parasitemia-
día 18
Fase de descenso-
días 19-43
Día de inicio de la fase de estabilización de parasitemia oculta-
día 43
68
Curva de la mortalidad acumulada de los machos de la línea BALB/c
infectados por la cepa CH 4 en la dosis de 100 000 de trypomastigotes
sanguíneos por ratón
10
8
6
4
2
0
1a6
7a
12
13 a
18
19 a
24
25 a
30
31 a
36
37 a
42
Diagrama de mortalidad por períodos para
los
machos de la línea
BALB/c infectados por la cepa CH 4 en la dosis de 100 000 de
trypomastigotes sanguíneos por ratón
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
13 a
18
19 a
24
25 a
30
31 a 37 a
36
42
43 a
48
49 a
54
Estandarización de la línea celular tumoral in vivo.
Por razón de presentar el tumor con el desarrollo de ascitis en caso de ser inoculado
intraperitonealmente el linfoma C57185 puede ser mantenida en vivo por medio de
resiembra con la inoculación intraper itoneal del líquido ascítico del animal donador al
69
animal receptor. Los animales se revisaron cada dos días con el fin de encontrar la ascitis.
Se considerarán todos los casos de no desarrollo del tumor o desaparición espontánea de
este. Además se documentaran todos los casos de la muerte de animal por tumores.
Los procedimientos iguales se hicieron en el caso de la inoculación subcutánea de
tumor, con finalidad de ver todos estos parámetros para la forma sólida.
Así se determinaron:
a) tasa de desaparición espontánea de tumor o
b) tasa de no desarrollo de tumor en el animal inoculado.
c) tasa de mortalidad causada por tumor.
Para la forma ascítica la tasa de no desarrollo de tumor en los machos de la línea BALB/C
inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por ratón fue 6/20
Para la forma ascítica la tasa de desaparición espontánea de tumor en los machos de la
línea BALB/C inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por
ratón fue 0/20
Para la f orma ascítica la tasa de mortalidad en los machos de la línea BALB/C cuales al
ser inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
desarrollaron el tumor fue 14/14
70
Mortalidad acumulada en los machos de la línea BALB/C cuales al ser
inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por
ratón desarrollaron el tumor .
15
10
5
0
0
1a6
2
13 a
18
11
25 a
30
14
37 a
42
Mortalidad por períodos en los machos de la línea BALB/c cuales al ser
inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por
ratón desarrollaron el tumor
10
8
6
4
2
0
7 a 12
13 a
18
19 a
24
25 a
30
31 a
36
37 a
42
Para la forma sólida la tasa de no desarrollo de tumor en los machos de la línea BALB/C
inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón fue 1/20
Para la forma sólida la tasa de desaparición espontánea de tumor en los machos de la
línea BALB/C inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
fue 4/19
71
Para la forma solida la tasa de mortalidad en los machos de la línea BALB/C cuales al
ser inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
desarrollaron el tumor fue 15/20
Mortalidad acumulada en los machos de la línea BALB/C cuales al ser
inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
desarrollaron el tumor
20
15
10
5
0
1a6
7 a 12
13 a 18 19 a 24 25 a 30
Mortalidad por períodos en los machos de la línea BALB/C cuales al ser
inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
desarrollaron el tumor
10
8
6
4
2
0
7 a 12
13 a
18
19 a
24
25 a
30
31 a
36
37 a
42
72
IX. Discusión de los resultados de estudios preliminares y justificaci ón a
base de estos resultados de las condiciones del experimento.
La virulencia 100% del parásito en la dosis 100 000 por raton en los machos nos sugiere
esta dosis como una dosis segura para inoculación del parásito.
El día de inicio de parasitemiaEs justo esperar en los ratones genéticamente absolutamente iguales los mismos
parámetros iniciales de parasitemia, porque la respuesta inmunitaria básica en todos los
ratones se sobreentiende como igual.
El mismo día de aparición de parásito en la sangre además puede evidenciar que la
manipulación de inoculación del parásito fue hecha correcto, porque en caso de inoculación
directa en los vasos sanguíneos aparición del parásito en la sangre periférica es más rápida.
El idea principal del experimento es ver como cambiará el tropismo tisular del parásito
en condición de presencia en el organismo animal de tumor sólido. Pero además de esto
nuestro objetivo es ver como en su turno va a influenciar el parásito en el desarrollo del
tumor. Para nosotros sería muy importante crear las condiciones cuando uno de los
procesos por alguna de las razones no oprima el desarrollo de otro y de otro lado conseguir
el contacto seguro entre tumor y parásito. El primer día de parasitemia, entonces es el día
cuando el parásito empieza a diseminarse por tejidos y todavía no hay ningunas reacciones
inmunitarias específicas contra parásito. En esta condición el tumor en su estado
subcutáneo es accesible para el parásito por medio del flujo sanguíneo. En su lugar el tumor
tampoco provoca todavía reacciones inmunitarias específicas que podrían influenciar en
contacto. En curso de su desarrollo el tumor va a influenciar en la respuesta inmune contra
el parásito y el estado general de la inmunidad que podría tener cierta importancia en la
distribución del parásito en tejidos. En su turno el parásito también va a influenciar en el
estado general de inmunidad que también puede tener significativo para el desarrollo del
tumor.
Este día entonces puede ser sugerido como el día de inoculación de tumor subcutánea
para el experimento de la inoculación tumoral simultanea con aparición de parasitemia.
73
Tasa de mortalidad en la fase aguda en machos de la línea BALB/Ñ infectados por la
cepa CÍ 4 en la dosis de 100 000 de trypomastigotes sanguíneos por raton – 9/20 con la
mortalidad principal entre los días 13 y 36
Por cuestiones técnicas de la cría de animales al mismo tiempo nosotros no podemos
disponer más que de 20 animales al mismo tiempo.
Pero la mortalidad de 9/20 nos sugiere la reposición del grupo experimental casi en 50%
para el experimento de inoculación del tumor en el día 45-49 de parasitemia y de 2
animales para el experimento con inoculación de animales con tumor en el día de inicio de
parasitemia.
Por eso en ambos casos para obtener el número suficiente de las muestras morfológicas
necesitaremos repetición del experimento en varios grupos.
Curva de parasitemia en los machos de la línea BALB/Ñ infectados por la cepa CÍ 4 en la
dosis de 100 000 de trypomastigotes sanguíneos por raton con el máximo del parásito en la
sangre periférica en el día 18 de parasitemia.
El numero del parásito en la sangre períferica es la reflexión del proceso de la reproducción
del parásito en tejidos. Una trópomastigote circula en la sangre periférica no más que 72
horas durante este tiempo la mayoría de estas se eliminan por reacción del complimento o
atacadas por anticuerpos o invaden algunas células del huesped.
Por esas razones es lógico de esperar que 72 horas antes del día cuando la cantidad del
parásito en la sangre periférica será la máxima nosotros podremos encontrar en los tejidos
la máxima cantidad de amastigotes.
De esto deriva que el día mejor para ver el tropismo máximo del parásito en los téjidos
será el día 16 de parasitemia. Este día fue entonces el día de toma de la muestra
morfológica.
La cantidad de parásitos se estabiliza a partir del día 43 de parasitemia, esto significa que
las condiciónes se estabilizan y la respuesta inmune especifica ya no cambia mucho en su
intensidad. En este período teóricamente nosotros podemos observar la eliminación
continua del parásito de los tejidos.
Para el experimento donde queremos ver la posible influencia de tumor en el proceso de
eliminación del parásito de tejidos entonses nos conviene inocular el tumor en cualquier
74
día a partir de 43. Además en este período podemos ver la posible influencia en el
desarrollo del tumor de la respuesta inmunitaria elaborada contra el parásito .
Para la forma ascítica la tasa de no desarrollo de tumor en los machos de la línea
BALB/C inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por ratón fue
6/20
Para la forma ascítica la taza de mortalidad en los machos de la línea BALB/C cuales al
ser inoculados intraperitonealmente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
desarrollaron el tumor fue 14/14 con el máximo de mortalidad entre los días 19 y 24.
Es importante de mencionar que la dosis de 1600 000 de células tumorales por ratón es la
dosis máxima que nosotros podemos conseguir a inocular en nuestras condiciones por
razones de la celularidad del líquido ascítico.
Esos datos nos sugieren que para el mantenimiento del tumor in vivo necesitaremos tomar
el grupo de por lo menos de 3 ratones para reinocular y hacer la reinoculación del tumor
hasta el día 19 después de inoculación.
Para la forma sólida la tasa de no desarrollo de tumor en los machos de la línea BALB/C
inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón fue 1/20
Para la forma sólida la tasa de desaparición espontánea de tumor en los machos de la
línea BALB/C inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón
fue 4/19.
Para la forma sólida la tasa de mortalidad en los machos de la línea BALB/C cuales al ser
inoculados subcutáneamente con 1 600 000 de células tumorales por ratón desarrollaron
el tumor fue 15/20 con el máximo entre los días 19 y 24.
Estos datos nos sugieren que los ratones del experiment o en todos los casos tienen que
ser sacrificados antes del día 19 de desarrollo del tumor, con reposición de los ratones que
no desarrollaron el tumor y consideración de estos casos.
75
Justificación de la elección de la forma sólida de tumor como el modelo de
estudio.
La elección a favor de la forma sólida de tumor se hizo por las siguientes razones:
a)Los parámetros dimencionales fáciles de medir por medio de calibrador
b) La estructura de tejido es conveniente para la preparación de los cortes histológicos
con el posible estudio de la presencia de formas extracelulares del parásito que pueden estar
presentes en focos de destrucción de tumor.
c) Es muy fácil de valorar el porcentaje de las células muertas en un cote fijado.
76
X. Resultados de los experimentos.
X.A. Comparación de diferentes grupos de ratones por el parámetro del
regreso en el crecimiento de tumor sólido subcutáneo.
La variable fue manejada como nominal dependiente.
Como la variable independiente intervino la presencia de parásito.
Para la análisis de los datos se usó el metodo de tablas de contingencia o 2x2 y se calculó el
Ch 2 ajustado por Fisher.
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia y evolución de tumor de 16 días.
Hay regreso
No hay regreso
Total
T.cruzi 16 Tumor 16
1
21
22
Tumor 16
2
20
22
Total
3
41
44
Conclusión: no hay significancia estadística (Ch2=0.35, P fisher = 0.500).
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia de 59-65 días y evolución de tumor de 16
días.
Hay regreso
T.cruzi 59-65
No hay regreso
Total
1
19
20
Tumor 16
2
18
20
Total
3
20
40
Tumor 16
77
Conclusión: no hay significancia estadística (Ch2=0.35, P fisher = 0.5000).
X.B. Comparación de diferentes grupos de ratones por el parámetro de la
ulceración superfacial de tumor sólido subcutáneo.
La variable fue manejada como nominal dependiente.
Como la variable independiente intervino la presencia de parásito.
Para la análisis de los datos se usó el metodo de tablas de contingencia o 2x2
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia y evolución de tumor de 16 días.
Hay ulcerac ión
No hay ulceración
Total
T.cruzi 16 Tumor 16
5
17
22
Tumor 16
0
22
22
Total
5
39
44
Conclusión: hay significancia estadística a favor de T. cruzi y tumor 16 días (Ch2= 5.51, P
fisher = 0.02424).
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia de 59-65 días y evolución de tumor de 16
días.
Hay ulceración
T.cruzi 59-65
No hay ulceración
Total
1
19
20
Tumor 16
5
15
20
Total
6
34
40
Tumor 16
78
Conclusión: no hay significancia estadística (Ch2=3.06, P fisher = 0.09088).
X.C. Comparación de diferentes grupos de ratones por el parámetro de
no desarrollo inicial de tumor sólido subcutáneo hasta el periodo
observado.
La variable fue manejada como nominal dependiente.
Como la variable independiente intervino la presencia de parásito.
Para la análisis de los datos se usó el metodo de tablas de contingencia o 2x2
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia y evolución de tumor de 16 días.
Hay efecto
No hay efecto
Total
T.cruzi 16 Tumor 16
0
22
22
Tumor 16
2
20
22
Total
2
42
44
Conclusión: no hay significancia estadística (Ch2=2.05, P fisher=0.24418).
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia de 59-65 días y evolución de tumor de 16
días.
Hay efecto
T.cruzi 59-65
No hay efecto
Total
0
20
20
Tumor 16
1
19
20
Total
1
39
40
Tumor 16
79
Conclusión: no hay significancia estadística Conclusión: no hay significancia estadística
(Ch2=1.05, P fisher = 0.48780).
X.D. Comparación de diferentes grupos de ratones por el parámetro la
superficie de tumor sólido subcutáneo para el día 16 de su desarrollo.
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia y evolución de tumor de 16 días.
T.cruzi 16 Tumor 16
Promedio de
Tumor 16
2.758 cm2
4.560 cm2
superficie
La variable fue manejada como continua y dependiente.
Como variable independiente intervino la presencia de parasitemia.
Para la análisis de los datos se usó el método de ANOVA de una vía por grupos con el
intervalo de confianza de 95%.
En comparación de las superficies de tumores se encontró diferencia estadísticamente
significativa con una p de 0.008
Conclusión: En presencia de parasitemia en la fase aguda tumor crece con menos
intensidad que en grupo- control, sin parasitemia.
80
Comparación de los grupos: grupo con evolución de tumor 16 días vs grupo
con la presencia de parasitemia de 59-65 días y evolución de tumor de 16
días.
T.cruzi 59-65
Tumor 16
Tumor 16
Promedio de
1.768 cm2
4.247 cm2
superficie
La variable fue manejada como continua y dependiente.
Como variable independiente intervino la presencia de parasitemia.
Para la análisis de los datos se usó el método de ANOVA de una vía por grupos con el
intervalo de confianza de 95%.
En comparación de las superficies de tumores se encontró diferencia estadísticamente
significativa con una p de 0.005
Conclusión: En presencia de parasitemia en la fase crónica tumor crece con menos
intensidad que en grupo- control, sin parasitemia.
Comparación de los grupos: grupo con la presencia de parasitemia de 16
días y evolución de tumor 16 días vs grupo con la presencia de parasitemia
de 59-65 días y evolución de tumor de 16 días.
Promedio de
T.cruzi 59-65
T.cruzi 16
Tumor 16
Tumor 16
1.768 cm2
2.758 cm2
superficie
La variable fue manejada como continua y dependiente.
81
Como variable independiente intervino la presencia de parasitemia en la fase avanzada (59
–65 días).
Para la análisis de los datos se usó el método de ANOVA de una vía por grupos con el
intervalo de confianza de 95%.
En comparación de las superficies de tumores se encontró diferencia estadísticamente
significativa con una p de 0.0065
Conclusión: En presencia de parasitemia en la fase crónica tumor crece con menos
intensidad que en grupo de la fase aguda.
Comparación de los grupos: 2 grupos con la evolución de tumor de 16 días
uno contra otro.
Tumor 16 grupo1
Promedio de
Tumor 16 grupo 2
4.560 cm2
4.247 cm2
superficie
La variable fue manejada como continua y dependiente.
Como variable independiente intervino la pertenencia de los ratones a uno de los grupos del
control.
Para la análisis de los datos se usó el método de ANOVA de una vía por grupos con el
intervalo de confianza de 95%.
En comparación de las superficies de tumores no se encontró diferencia estadísticamente
significativa con una p de 0.65
Conclusión: los grupos de control muestran una homogenidad que nos permite excluir
influencia de otros factores además de las medidas de intervención enumerados en el
capítulo VII.
82
X.E. Resultados del estudio de los tropismos tisulares de la cepa CÍ4 de
T.cruzi por grupos de ratones de experimento.
La tabla comparativa de los tropismos tisulares por grupos de experimento.
Grupo
T.cruzi
Bazo Cerebro
Corazón Hígado
Riñón
Músculos
Tumor Total de
estriados
órganos
-
-
+
-
-
+
0
+
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
+
-
-
+
0
+
-
-
+
-
-
+
-
+
-
-
+
-
-
+
+
+
16
T.cruzi
y
L5178
16
T.cruzi
59-65
T.cruzi
59-65
L5178
16
Total
En este experimento no se estudió la expresividad de los tropismos en diferentes tejidos. Ya
que para estudio de esta propiedad de tropismos por su grande especificidad y
relativamente baja sensibilidad dependiente del superficie y cantidad de niveles de cortes
estudiados se usa el método de los cortes seriados con el control de cantidad de parásito por
el superficie del corte que no se hizo en este estudio.
Por esas mismas causas no se investigaron las diferencias de tropismos por adentro del
grupo muscular por el hecho de que la presencia del parásito en cualquier músculo ya se
considera como tropismo muscular y las diferencias en tropismos en este grupo van a
depender solamente del masa del órgano e intensidad del riego sanguíneo.
83
El propósito del estudio fue investigar posible cambio del comportamiento biológico que
podría expresarse en ampliación o en disminución de preferencia de parásito de
cardiomuscular hacia otros tejidos.
Para que el resultado se considera positivo en condiciones de tan baja sensibilidad del
método sería suficiente la única observación de los formas amastigotes en tejido en grupo
de 20 ratones.
Conclusiones:
1) No se observó el cambio del tropismo cardiomuscular en ninguno de los grupos
del experimento hacia los tejidos normales.
2) Se observó el tropismo tumoral extracelular en el grupo de la parasitemia de 16
días y 16 días de evolución del tumor .
84
XI.Discusión de los resultados.
XI.A. Desarrollo de tumores en la fase aguda de infección aguda por T.cruzi
cepa CÍ 4 en ratones BALB/C machos con evolución de infección de 16 y
59-65 días.
1) En la fase aguda de infección por T.cruzi cepa CÍ 4 no se observa el regreso y no
desarrollo del tumor L5178 forma subcutáneo sólido.
2) En la evolución de tumor L5178 forma subcutáneo sólido de 16 días en la fase inicial de
parasitemia se observa la ulceración de tumor mas marcada que en grupo de control.
3) Se observa disminución del crecimiento de L5178 forma subcutáneo sólido en inicio y
en la fase de estabilización de parasitemia (en la cepa CÍ 4 según los resultados
preliminares de trabajo a partir del día 43 después del inicio de parasitemia) en
comparación con el grupo control.
Estos efectos pueden ser explicados por diferentes razones entre las cuales pueden ser
enumerados las siguientes:
1) la presencia de altos niveles TNF, que provoca necrosis central de tumor (II.A.8.3* );
2) activación de células acecinas naturales, que son los agentes muy fuertes
Comentario:
anticancerígenos (II.A.8.2);
3) producción de NO por macrófagos activados en el curso de la infección por T.cruzi
(II.A.8.3);
4) las propiedades citolíticas directas debidas al parasitismo intracelular de T.cruzi en
las células cancerígenas (II.C.3) y al cambio de las propiedades reológicas de la
sangre por abundancia del parásito en el torrente sanguíneo.
5) las propiedades citolíticas directas de las sustancias celulares de T.cruzi (II.C.4)
*
Comentario: De aquí en
adelante se harán las referencias a
los capitulos correspondientes del
presentet rabajo
de aquí en adelante se harán referencias a los capítulos correspondientes del presente trabajo.
85
No obstante el estudio de los mecanismos concretos de estos efectos requiere una
ivestigación especial con el estudio de los cambios morfológicos en tejidos normales y
tumoral.
4) Se observa disminución del crecimiento de L5178 forma subcutáneo sólido en la fase de
estabilización de parasitemia en comparación con el grupo de la fase de inicio de
parasitemia .
Este efecto puede ser explicado por posible presencia de los anticuerpos ambivalentes que
aparecen en esta fase de infección y pueden tener actividad contra las células tumorales
además de actividad antiparasitaria (II.A.8.1).
XI.B. Tropismos tisulares de la cepa CÍ 4 de T.cruzi en presencia del tumor
maligno sólido subcutáneo L5178 en ratones BALB/C.
1) En presente estudio para la cepa C Í 4 de T.cruzi se observó tropismo
cardiomuscular en todos los grupos del experimento que en conjunto con las
características de parasitemia (el máximo después de 20 días postinfección) y
mortalidad (máximo después del día 24
postinfección) puede permitir atribuir esta cepa al biodemo 3 (II.A.5.4)
2) En el estudio no se observó cambio de tropismos de la cepa Ch 4 de T.cruzi hacia los
tejidos normales en comparación con el grupo de control .
Este resultado puede ser explicado por la inmunosupresión insuficiente en presencia de
forma sólida del tumor para la ampliación de los tropismos tisulares, para aclarar la
posibilidad del cambió de tropismos de T.cruzi en presencia de L5718 en el modelo animal
hay que hacer el estudio con el forma ascítico de este tumor para el cual ya hay reportes de
inmunosupresión marcada en animales (II.B.3)
86
Comentario:
3) Se registró la presencia de parásito en tejido tumoral en la fase aguda de la infección en
el día 16 de parasitemia.
Estos datos apoyan las observaciones de Roskin I. 1932 (II.C.3).
87
XII. Conclusiones del trabajo.
La cepa CH 4 de Trypanosoma cruzi por su comportamiento puede ser atribuida al
biodemo 3, con el tropismo cardiomuscular.
En presencia del tumor L5178Y de tipo linfoma de células T grandes en su forma sólida
no provoca cambio de tropismos tisulares de la cepa CH 4 de Trypanosoma cruzi.
La cepa CH 4 de Trypanosoma cruzi en la fase aguda tiene tropismo hacia el tejido de
forma sólida del tumor L5178Y de tipo linfoma de células T grandes, donde el parásito se
observa en el estadio de amastigote en el espasio extracelular en los focos de destrucción
de tumor.
En la fase aguda (hacia el día 16) de la infección por la cepa CH 4 de Tripanosoma cruzi
se observa la ulceración de tumor L5178Y de tipo linfoma de células T grandes más
frecuente que en grupo de control con una diferencia estadísticamente significativa.
En la presencia de Trypanosoma cruzi cepa CH4 en ratón BALB/C disminuye el
crecimiento de forma sólida del tumor L5178Y de tipo linfoma de células T grandes.
En la fase de estabilización de parasitemia de la cepa CH 4 de Trypanosoma cruzi en
ratón BALB/C la disminución del crecimiento del tumor L5178Y de tipo linfoma de
células T grandes es más pronunciado que en la fase de ascenso de parasitemia.
88
Bibliografía.
Alencar A., De Kastner M.R.Q., Cerqueira M.C. (1968): " Estudo do sistema nervoso
autónomo do aparelho digestivo em camundongos albinos crónicamente infectados con
Schizotrypanum cruzi".
"O Hospital" Jan. 1968 vol 73, No 1. pp 185-196
Anderson N., Morales A., Nava., Martínez E., Rodríguez I., Young P., Howard MK., Miles
MA., (1990): Trypanosoma cruzi infection in the mexican state of Guerrero. Am J Trop
Med & Hyg., 93 (5): 341-346.
Andrade S.G. (1985):" Morfológical and behavioral characterization of Trypanosoma cruzi
strains."
Rev. da Sci. Bras. de Med.Trop. 18, 39-46
Andrade SG & Andrade ZA (1966):” Doenca de Chagas e alteracoes neuronais no plexo de
Auerbach”
Revista do Instituto Medicina Tropical. Sao Paulo 1966 May; 8 (5): 219-224
Andrade SG; Magalhaes JB (1996) : “Biodemes and zymodemes of Trypanosoma cruzi
strains: correlations with clinical data and experimental pathology”.
Rev Soc Bras Med Trop,1996 30(1):27-35 1996 Jan-Feb
Antas PR, Medrano-Mercado N, Torrico F, Ugarte-Fernandez R, Gomez F, Correa
Oliveira R, Chaves AC, Romanha AJ, Araujo-Jorge TC (1999): " Early, intermediate, and
late acute stages in Chagas' disease: a study combining anti-galactose IgG, specific
serodiagnosis, and polymerase chain reaction analysis."
Am J Trop Med Hyg 1999 Aug;61(2):308-14
Anuario estadístico de la SSA, 1999.
89
Araujo Z., Ei Bouhdidi A., Heremans H., Van Marck E., Castes M., Carlier Y. (1999):
“Vaccination of mice with a combination of BCG and killed Leishmania promastigotes
reduces acute Trypanosoma cruzi infection by promoting an IFN-γ response”.
Vaccine 1999 Feb 26;17(7-8):957-64
Asahi H, Kawabata M, Moribayashi A, Okumura H, 1986: “ Cytotoxic factors toward
neuroblastoma cells in trypomastigotes of Trypanosoma cruzi”.
Can J Microbiol 1986 Sep;32(9):711- 8
Asin S; Catala S,1995 :"Development of Trypanosoma cruzi in Triatoma infestans:
influence of temperature and blood consumption."
J Parasitol, 81(1):1 -7 1995 Feb
Avila, J. L. 1992. Molecular mimicry between trypanosoma cruzi and host nervous tissues.
Acta Cient venez. 43(6):330-40.
Becerril-Flores MA, Ramirez- Zamudio L, Salazar- Shettino PM. 1998: “Variabilidad
patógena interclonal de la cepa T5 de Trypanosoma cruzi “
Memoria XIII Congreso Nacional de Parasitología. Conapar 1998: 8-9.
Braude, A. I.; Davis C. E. & Fierer J. 1984. Microbiología clínica.
Editorial medica panamericana, Argentina. p. 792 – 793.
Brener Z. (1973): “Biology of Trypanosoma cruzi.”
Annu Rev Microbiol. 27: 347-362.
Brener Z (1994): ” The patogenesis of Chagas´ disease: an overview of current theories”.
“Chagas´ disease and the nervous system.”
Pan Americ an Health Organization 1994. Pp 30-46.
90
Breniere SF, Bosseno MF,Telleria J, Bastrenta B, Yaksic N, Noireau F, Alcazar JL,
Barnabé Ch, Wincker P, Tibayrenc M (1998): " Different behavior of two Trypanosoma
cruzi major clones: Transmission and circulation in young Bolivian patients".
Exp Par 89, 285-295 (1998)
Calabrese, K. S.; Bauer, P. G.; Largrange, P. H. & Goncalves da Costa, S. C. 1992.
Inmunol. Lett. 31 (1): 91-96.
Calvo- Méndez Ma L, Nogueda- Torres B, Alejandre-Aguilar R, Córtes- Jiménes M 1994:”
Infección experimental con Trypanosoma cruzi a través de agua y alimentos
contaminados”
Revista Latinoamericana de Microbiología 1994 (36):67-69.
Calvo- Méndez Ma L, Higuchi M (1996):”Chronic, chagasic myocarditis is T.cruzi-antigen
and CD8+ T cell dependent”
Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 1996 Nov; Vol. 91,Suppl.
Cardillo F, Voltarelli JC, Reed SG, Silva JS. (1996): “Regulation of Trypanosoma cruzi
infection in mice by Gamma Interferon and Interleukin 10: role of NK cells.”
Infection and Immunity 1996 Jan; 64 (1):128-134
Castejón Oscar V. (1989): “Manual de técnicas de laboratorio”
Instituto Nacional de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicas. México. DF 1989.
Castrejón Oscar V., Valdespino JL., Tapia-Conyer R., Salvatierra B., Guzmán Bracho C.,
Magos C., Llausas A., Gutiérrez G., Sepulveda J., 1992: “Seroepidemiología de la
enfermedad de Chagas en México”.
Salud Pública Mex., 34 (2): 186-196.
Cecil A.Hoar (1972): "The trypanosomes of mammals."
91
BlackWell Scientific Publications Oxford
1972.
CECIL (1994): “Tratado de medicina interna”.
Ch. 22. Enfermedades por protozoarios y metazoarios. (ed). Wyngaarden, J. B.; Smith, Ll.
H. & Bennett, J. C.
Editorial Mc Graw – Hill, México 1994. p. 2299 – 2304.
Chester, P. B.; Clifton, R. J. & Wayne, E. C. (1990): “Parasitología clínica”.
México, D.F. Editorial Salvat. p. 100 – 108.
"Culture of Animal Cells. A manual of basic technique." Second edition, 1993.
Published by A john Wiley & Sons, Inc. Ed. Ian Freshney
Daneri-Navarro A, Del Toro- Arreola A, Garcia- Velazco JD, Del Toro- Arreola S, OrbachArbous S, Bravo- Cuellar A. (1995): “L-5178-Y lymphoma associated immunosuppression
in Balb/c mice.”
Biomed Pharmacother 1995; 49 (1): 39-44
David JR, Liu LX., 1994: Protozoal and helminthic infections: General considerations. in:
Harrison´s Principles of Internal Medicine, edit by Isselbacher & Braunwald. pp 865- 871,
Mc Graw Hill, NY.
De Gaspari, E.; Umezava, E.; Zangalez, B.; Stolf, A.; Colli, W. & Abrahamsohn, I. 1990.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 85:261-70.
do Prado junior JC, Leal M de P, Anselmo-Franci JA, de Andrade juniur HF, Kloetzel JK
(1998): " Influence of female gonadal hormones on the parasitemia of female Calomys
callosus infected with the "Y" strain of Trypanosoma cruzi."
Parasitol Res 1998;84( 2):100-5
92
do Prado JC Jr, Levy AM, Leal MP, Bernard E, Kloetzel JK (1999): " Influence of male
gonadal hormones on the parasitemia and humoral response of male Calomys callosus
infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi."
Parasitol Res 1999 Oct;85(10):826-9
Dobrovinskaya O.R., Korystov Yu.N.,Shaposhnikova V.V., Eidus L.Kh., 1989: “Study of
thymocite death during incubation in vitro: the role of active oxigen forms.”
Inmunology 1989 2 feb:20-22 (in fuso con el abstract en ingles).
Dvorak JA, Postan M. 1987: “ Estudios sobre la infección de ratones endogámicos con
clone de Trypanosoma cruzi “.
Boletín of Sanitaria Panamericano 1987 Fev; 103 (2): 93-105.
“ Enfermedad de Chagas” Informe de un Grupo de Estudio. 1960
Organización Mundial de la Salud. Palais des Nations. Ginebra. 1960.
Espinoza B, 1998: Genotype and virulence correlation within Mexican stocks of
Trypanosoma cruzi isolated from patients. Acta Trop. 70(1):63-72.
Galliard H., Brumpt L.C., Martinez R. 1950: ”Infections experimentales a Trypanosoma
cruzi: Chagas chez l´homme a propos de la bioterapie du cancer”
Bull. Soc. Pathol. Exot. 43 # 3-4: 204- 216.
Gardiner et al. 1988 “An Atlas of Protozoan Parasites in Animal Tissues”
USDA Agriculture Handbook 1988 No.651
Gloss G., Barrera MR., Monteón V., Reyes P, 1990: Tripanosomiasis americana y
cardiopatía chagásica en el Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chávez. Arch Inst
Cardiol Mex., 60: 261-266.
93
Goldsmith RS, Ortega M, Zarate RJ, Zarate IG, Beltran F. 1983: ”Encuestas
seroepidemiológicas de la enfermedad de Chagas en Chiapas, Mexico”.
Archivo de Investigación Médica (Méx)1983 14: 43-50
Guevara Gómez Y, Salazar SPM, Jiménez RJA, Rojas WGE. 1998:” Comparación de
parasitemias y curvas de crecimiento de 10 aislados de Trypanosoma cruzi del estado de
Veracruz”.
Memoria XIII Congreso Nacional de Parasitología. Conapar 1998: 15.
Guzmán Bracho C., García García L., Floriani Verdugo J., Guerrero Martínez S., Torres
Cosme M., Ramírez Melgar C., Velasco Castrejón O., (1998): “Riesgo de transmisión de
Trypanosoma cruzi por medio de transfusión sanguínea en México”.
Rev Panam Salud Pública. 4 (2): 94-99.
Guzman-Marin E, Zavala- Castro JE .1998:” Caracterización por kinetodemos de 6 cepas
de Trypanosoma cruzi y su correlación con el comportamiento biológico del parásito.”
Memoria XIII Congreso Nacional de Parasitología. Conapar 1998: 8.
Guzman-Marin E., Zavala-Castro J., Acosta- Viana K.Y., Rosado-Barrera M.E. (1999): “
Importancia de la caracterizacion de cepas de Trypanosoma cruzi “
Rev. Biomed 1999; 10: 177- 184.
“ HARRISON Principios de medicina interna”. 1999. Vol. I.
(ed). Fauci, A. S.; Braunwald, B.; Isselbacher, K. J.; Wilson, J. D.; Martin, J. B.; Kasper, D.
L.; Hauser, S. L. & Longo, D. L.
Editorial Mc Graw – Hill, México. p. 409, 575 – 577, 561 – 562, 592 – 595, 793 – 797, 813
– 814.
Hatcher FM,Kuhn RE 1981 “Spontaneous lytic activity against allogeneic tumor cells and
depression of cpecific cytotoxic reponses in mice infected with Trypanosoma cruzi.”
Journal of Immunology 1981 jun; 126(6):2436-42
94
Higuchi ML, Gutierrez PS, Aiello VD, Palonmino S, Bocchi E, Kalil J, Belloti G, Pilleggi
F. 1993:” Immunohistochemical characterization of infiltratintg cells in human chronic
chagasic myocarditis: comparision with myocardial rejection process”
Virchows Archiv A Pathologic Anatomy 1993 (423): 157- 160
Hölscher, C.; Köler, G.; Müler, U.; Mossman, H.; Schaub, G. & Brombacher, F. 1998.
Infect. Inmunol. 66(3):1208-15
Huang H, Calderon TM, Berman JW, Braunstein VL, Weiss LM, Wittner M, Tanowitz HB
(1999): " Infection of endothelial cells with Trypanosoma cruzi activates NF-kappaB and
induces vascular adhesion molecule expression."
Infect Immun 1999 Oct;67(10):5434-40
Hunter, C.; Slifer, T. & Araujo. 1996. Infect Inmunol 64:2381-6.
Ivey MH 1970:" Laboratory procedures in parasitology"
in Frankel S, Reitman S, Sonnenwirth AC "Gradwohl´s Clínica laboratory methods and
diagnosis" Volume two. The C.V. Mosby Company. Saint Louis 1970.
Jardim E. (1967): "Alteracoes quantitativas das células de Purkinje na moléstia de Chagas
experimental no camundongo"
Arq. Neuro- Psiquiat. (Sao-Paulo) 1967, vol 25, No 3, sept, 1967 pp 199-207
Jawetz, E.; Melnick, J. L. & Adelberg, E. A. (1992): “Microbiología médica”.
México, D.F. Editorial El Manual Moderno. p. 365 – 368.
Kallinicova VD,Leikina MI, Sokolova NM, Pogodina LS, Ogloblina TA, Matjokin PV,
Kononenko AF (1996): “Antitumoral properties of parasitic flagellete protozoa
95
Trypanosoma cruzi Chagas 1909. 4.Tropism Trypanosoma cruzi in tissue cultures.” (en
ruso con el abstract in ingles)
Vestnik Moskovskogo Universiteta #16 Biologia 1996 #2.
Kalinnicova VD, Matjokin PV, Ogloblina TA, Leikina MI, Pogodina LS, Kononenko AF,
Sokolova NM (1997):”Las Propiedades antitumorales de protozoa flagelado paras itario
Trypanosoma cruzi Chagas 1909. 5. Las potencias anticanceríginas de las formas culturales
de Trypanosoma cruzi.” (en ruso)
Vestnik Moskovskogo Universiteta #16 Biologia 1997 #3.
Kallinicova VD, Ogloblina TA, Kononenko AF, Leikina MI, Sokolova NM, Pogodina LS,
Matjokin PV, 1994a: “Antitumoral properties of parasitic flagellete protozoa Trypanosoma
cruzi Chagas 1909. 1. Inhibitory influence of Trypanosoma cruzi infection on the
development of tumors in animals”
Vestnik Moskovskogo Universiteta #16 Biologia 1994 #1. (en ruso con el abstract in
ingles)
Kallinicova VD, Ogloblina TA, Kononenko AF, Leikina MI, Sokolova NM, Pogodina LS,
Matjokin PV, 1994b:”Las Propiedades antitumorales de protozoa flagelado parasitario
Trypanosoma cruzi Chagas 1909. 2. Los efectos lejanos posteriores de la inoculación a los
ratones de Trypanosoma cruzi para el crecimiento de Sarcoma-180.” (en ruso)
Vestnik Moskovskogo Universiteta #16 Biologia 1994 #3.
Kallinicova VD, Sokolova NM, Ogloblina TA, Kononenko AF, Leikina MI, Matjokin PV,
Pogodina LS (1995): “Antitumoral properties of parasitic flagellete protozoa Trypanosoma
cruzi Chagas 1909. 3. Tropism and tumorotropism of Trypanosoma cruzi diferent strains
in the vertebrate host.” (en ruso con el abstract in ingles)
Vestnik Moskovskogo Universiteta #16 Biologia 1995 #1.
Kirchhoff L., 1994: Chagas´ disease, in: Harrison´s Principles of Internal Medicine, edit by
Isselbacher & Braunwald. pp 899- 901, Mc Graw Hill, NY.
96
Klueva NG, Roskin GI 1946 “Bioterapia de los tumores malignos” Editorial de la
Academia de Ciencias Medicas de la URS Moscú 1946. (en ruso).
Lazzari J.O. 1994: “Autonomic nervous system alterations in Chagas´disease: review of
the literature.”
Chagas´ disease and the nervous system. Pan American Health Organization 1994. Pp 7296.
Lent H., Wygodzinsky P., 1979: Revision of the Triatominae (Hemiptera, Reduviidae):
Bull Am Museum Nat Hist. 163 (3): 127-137.
Lewinson, R. (1981): “Carlos Chagas and the discover of Chagas’ disease (American
trypanosomiasis)”.
R Soc Med. 74(6): 451-455
Lopes de Faira J.B.(1993): "Transmission of Chagas´ disease through cadaveric renal
transplantation".
Transplant. Dec 1993, Vol 56, No6 pp. 583-584
Lopes RA, Ribeiro RD, Carvalho TL, de Albuquerque S, Watanabe IS (1991): " Presence
of amastigotes in the Weber's lingual salivary gland of Trypanosoma cruzi-infected mice."
Braz Dent J 1991;2(1):75-9
Mendoza González JD, Miranda LE, Velasco Castrejón O, Tinoco RO, Maciel PM, 1995:
Cardiopatía chagásica crónica, presentación de 60 casos. Arch Inst Nal Cardiol Mex. 65:
546- 550.
Minoprio, P.; Eisen, H.; Forni, L.; D’Imperio – Lima, M.; Joskowicz, M. & Coutinho, A.
1986 Scand. J Inmunol. , 24:661-8.
97
Montamat E.E., De Luca D´Oro G.M., Gallerano R.H., Sosa R., Blanco A. (1996):
“Charac terization of Trypanosoma cruzi population by zymodemes: correlation with
clinical picture”.
Am J Trop Med Hyg 1996 Dec; 55 (6):625-8
Monteón V.M., Furuzava-Carballeda J, Alejandre-Aguilar R, Aranda-Fraustro A., RosalesEncina J.L., Reyes P.A. 1996: " American Trypanosomiasis: In Situ and Generalized
Features of Parasitism and Inflammation Kinetiks in a Murine Model" Exp.Parasit. 83, 267274 (1996)
Moya PR 1994: “Chagas´ disease in children: neurological and psyhological aspects”
Chagas´ disease and the nervous system. Pan American Health Organization 1994. Pp 189202.
Olivas Rubio M, Ventura-Juárez J, Rosales-Encina JL. 1998: “ Reacción cruzada entre una
proteína específica de amastigota de Trypanosoma cruzi y células de diferentes tejidos.”
Memoria XIII Congreso Nacional de Parasitología. Conapar 1998: 9.
Pereira, M. & Kretti. 1990 Braz J Med Biol Res. 23:283-92
Plata F 1985 “Enhancement of tumor growth correlates with suppression of the tumorspecific cytolytic T lymphocyte response in mice chronically infected by Trypanosoma
cruzi.”
Journal of Immunology 1985 Feb; 134(2):1312-9
Ramírez Parra T, 1991: “Estudio seroepidemiológico de la enfermedad de Chagas en 1
municipio de Colima”
Tesis recepcional, Universidad de Colima, México.
98
Ramírez ME, Nogueda TB, Santos PS. 1998:” Modificación en los zimogramas de
Trypanosoma cruzi al ser mantenidas en diferentes medios de cultivo”
Memoria XIII Congreso Nacional de Parasitología. Conapar 1998: 16.
Reis D D´A, Jones EM, Tostes JR S, Lopes ER, Gazzinelli G, Cooley DG & McCurlley
T.1993: “Characterizaton of inflamatory infiltrates in chronic chagasic myocordial lesions:
presence of tumor necrosi factor-a+ cells and dominance of granzime A+, CD8+
lymphocytes.”
American Journal of Tropical Medical Hygiene 1993 May; 48(5):637-644.
Revollo S; Oury B; Laurent JP; Barnabe C; Quesney V; Carri`ere V; No¨el S; Tibayrenc M
1998: “Trypanosoma cruzi: impact of clonal evolution of the parasite on its biological and
medical properties.”
Exp Parasitol, 1998 89(1):30-9
Reyes López PA., (1993): “Chagas' disease in north America.”
Am Heart J;126(6):1496
Ribeiro DR, García TA, Bonomo W., 1987: Contribucao para o etudo dos mecanismos de
transmissao do agente etiologico da doenca de Chagas: Rev Saúde Pública. 21: 51-54.
Rodriguez M.,Terrazas L.I., Marquez R., Bojalil R. (1999): “ Susceptibility to
Trypanosoma cruzi is modified by a previos non-related infection”
Parasite Immunol 1999 Apr;21(4): 177-85
Rosenberg ME, Bakhiet M, Olsson T, Kristensson K, Mak T, Wigzell H, Orn A 1993:
“Differential susceptibilities of mice genomically deleted of CD4 and CD8 to infections
with Tripanosoma cruzi or Tripanosoma brucei”
Infection & Immunity 1993 Dec;61(12): 5129-33
99
Roskin G.I. Exempliarskaja E. (1931) “Protozoinfektion und experimenteller Krebs” Zschr.
Krebsforsch. 34, #6 628-645.
Roskin Gr. Exempliarskaya E. (1932) “La infección protozoaria y cancer experimental.”
Rev. de microbiología y inmunología 9. #3, 339-349. ( en ruso)
Rothhamer, F.; Allison, MJ.; Núñez, L.; Standen, V.; Arriaza, B. (1985): “Enfermedad de
Chagas en Sudamérica pre-colombina.”
Rev Amer Antrop Fis 68:495-498.
Ruegsegger de Gutierrez GL., Monteón VM., Marcuschamer J., Reyes PA., 1993:
Tripanosomiasis americana. un estudio seroepidemiológico en una comunidad rural de
Oaxaca. Arch Inst Cardiol Mex., 63 (2): 145-148.
Salazar Schetino P.M., Bucio Torres M., Guevara Gómez Y., Ruiz Hernández A. 1999:
"Diagnóstico de Laboratorio para la enfermedad de Chagas"
Materiales del I Encuentro Internacional sobre Enfermedad de Chagas en México Reunión
conmemorativa del nonagésimo aniversario de la primera publicación de Dr. Carlos Chagas
Nov. 1999.
Salgado PR, Gorski AG, Aleixo AR, de Barros EO, 1996: “Tumor –like lesion due to
Chagas´ disease in a patient with lymphocytic leukemia.”
Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1996 Jul- Aug; 38 (4):285-8
Schmunis GA, 1991: Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease: Status in
the blood supply in endemic and nonendemic countries.
Transfusion 31: 547-551.
Schmunis GA, 1994: “American trypanosomiasis as public health problem”
Chagas´ disease and the nervous system. Pan American Health Organization 1994. Pp 3-29.
100
Schofield C.J., 1994: Triatominae, biología y control.
Eurocomunica pubs. pp 74, West Sussex, UK.
Scremin LH, Corbett CE, Laurenti MD, Nunes EV, Gama-Rodrigues JJ, Okumura M
(1999): "Megabladder in experimental Chagas disease: pathological features of the bladder
wall."
Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo 1999 Mar-Apr;54(2):43-6
Storino Rubén, Milei José Jörg Eduardo M. (1994): "Enfermedad de Chagas."
Argentina:Mosby Doyma,1994.1-7
Stuart Walker T. 1999: "Hemoflagelados" en el libro de "Microbiología."
Microbiología McGraw -Hill Interamericana 1999 pp. 479-480
Tanowitz H.B., Kaul D.K., Bing Chen, Morris A.S., Factor S.M., Weiss L.M., Wittner M.
1996: "Compromised microcirculation in acute murine Trypanosoma cruzi infection"
J.Parsitol 82(1). 1996, p. 124-130.
Tizard J. 1998: “Inmunología veterinaria”.
Ed. Manual Moderno 1998.
Torrechilhas A.C., Faquim-MauroE., Da Silva A.V., Abrahamson I.A. 1999: “Interference
of natural mouse hepatitis virus infection with cytokine production end susceptibiliti to
Trypanosoma cruzi”.
Immunology 1999 Mar; 96(3):381-8
Trujillo Contreras F, et al, 1993: “The prevalence of Trypanosoma cruzi infection in blood
donors in the state of Jalisco, Mexico”.
101
Rev Soc Bras Med Trop. 26(2):89-92
Umezawa, ES. ; Shikanai – Yasuda, MA. ; Stolf, AM. 1996. J Clin Lab Anal, 10(6): 40713.
Vera-Cruz, JM.; Covarrubias-Pinedo, A.; Grijalva-Larrañaga, GJ; Armendáriz -Borunda, J.
(1999): “Detección sensible, rápida y oportuna de Trypanosoma cruzi usando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR)”.
Invest en Salud 1999: 3 (3)181- 187.
Verineaud, L.; Da Cruz – Hofling, M.; Sakurada, J.; Rangel, H.; Vassallo, J.; Wakelin, D.;
Sewell, H. & Camargo, J. 1998. Clin Diagn Lab Inmunol. 5:186-91
Wendel S,Brener Z, Camargo ME, Rassi A.1992”Chagas Disease-
American
Trypanosomiasis: its impact on transfusion and clínica medicine”
ISBT Brazil´92, Sao Paulo, Brazil 1992.
Zingales B., Fernandes O., Macedo A.M., Campbell D.A., Souto R.P. (1996): “C11- Two
major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi defined by DNA markers: a challenge
to the scientific community”
Mem. Do Inst. Owaldo Cruz 1996, Vol. 91, Suppl., Nov, 1996.
102