UNIVERSIDAD TECNICA DE AMBATO FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS EL ESTUDIO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN CON EL MICROORGANISMO Trichoderma viride EN LA GENERACIÓN DE LACTONA (6 PENTIL α PIRONA) Proyecto de investigación previo a la obtención del título de Ingeniería en Alimentos. AUTOR: Andrea Verónica Delgado Ramos. TUTOR: César German. Ambato, 2006 INDICE Carátula i Índice ii Introducción v CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1. Contextualización 1 1.1.1. Análisis macro 1 1.1.2. Análisis meso 2 1.1.3. Análisis micro 2 1.2. Análisis crítico 3 1.3. Árbol de problemas 4 1.4. Prognosis 4 1.5. Formulación 5 1.6. Preguntas directrices 5 1.7. Delimitación del problema 5 1.8. Justificación 6 1.9. Objetivos 7 ii CAPITULO II MARCO TEORICO 2.1. Antecedentes investigativos 8 2.2. Fundamentación filosófica 8 2.3. Diagrama de Flujo 10 2.3.1. Categorías fundamentales 10 2.4. Hipótesis 12 2.5. Señalamiento de variables de la hipótesis 12 2.6. Glosario de Términos 12 CAPITULO III METODOLOGÍA 3.1. Enfoque 14 3.2. Modalidad básica de la investigación 14 3.3. Tipos de investigación 15 3.4. Población y muestra 15 3.5. Operacionalización de variables 16 3.5.1. Variables Independientes 16 3.5.2. Variable Dependiente 16 3.6. Recolección de Información 17 3.7. Procesamiento de Datos 17 iii CAPITULO IV MARCO ADMINISTRATIVO 4.1. Recursos 18 4.1.1. Institucionales 18 4.1.2. Humanos 18 4.1.3. Materiales 18 4.1.4. Económicos 19 4.2. Cronograma 20 4.3. Bibliografía 20 iv INTRODUCCIÓN El impacto económico de la biotecnología aplicada a la producción de aromas para el uso en alimentos, se ha incrementado en forma muy importante en años recientes. Es sin duda una de las áreas de mayor desarrollo en el presente y futuro cercano. A partir de los años 70 el uso de aditivos en la industria se ha intensificado significativamente en nuestro país. Se ha seguido los lineamientos establecidos por los países industrializados quienes con el uso de estos productos, han buscado una homogeneidad en la calidad de las diferentes materias primas. (www.ub.es/depnutricioibromatologia.htm) La evolución de los diferentes métodos de producción, en la actualidad tiende mucho hacia el campo de la biotecnología de aromas, es decir, hacia la producción de compuestos específicos en lugar de utilizar mezclas complejas. En el capitulo uno, se analiza el problema de la investigación, donde se ha definido básicamente el motivo del estudio para extraer la 6 pentil α pirona del microorganismo Trichoderma viride. En el capítulo dos, se presenta la fundamentación filosófica que sustenta el estudio de esta investigación, en esta parte del perfil se presenta el procedimiento a aplicar tanto para la inoculación del microorganismo y las hipótesis ha ser analizadas si son factibles de comprobación, y los respectivos niveles de cada variable a ser tomadas en cuenta. En el capítulo tres de metodología, se analiza de que manera y que medios se va a utilizar para este tipo de investigación, además se plantean el v procedimiento que se va ha realizar con los datos obtenidos en la fase investigativa. En el capítulo cuatro, se describe el marco administrativo de este proyecto, es decir, se detalla todo los medios necesarios para cumplir con la factibilidad de esta investigación, además en esta parte encontramos la bibliografía recopilada y la información complementaria que nos llevaran a cumplir con los objetivos planteados. vi CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 1.1. CONTEXTUALIZACIÓN Los aromas y fragancias usados en las industrias de alimentos, cosméticos y de detergentes son productos de gran significado comercial. La 6 - pentil - α - pirona (6PP), es una lactona que posee un aroma característico a coco. Es considerada un agente saborizante no tóxico, la principal aplicación es como aditivo en bebidas, yogures, panadería y confitería. El uso comercial se ha limitado debido a los bajos rendimientos de producción alcanzados hasta el momento. (www.pncta.com.mx) 1.1.1. ANÁLISIS MACRO Las especias han sido definidas como cualquier producto de origen vegetal, esencialmente aromático, usado en el arte culinario, en la producción industrial de alimentos. De manera general, cuando el producto vegetal aromático, fragante, saporífero, usado en comidas y bebidas, es de origen tropical, es considerado una especia. (CALVO, M. (1991)). El mercado mundial para la importación de especias es considerable, y se evalúa en algo más de USD 2.300 millones (www.rincondelvago.com). 1 Actualmente, la mayoría de países producen suficiente especias para el surtido de sus propios mercados y las que importan lo hacen principalmente de Singapur, Hong Kong, Madagascar, Tanzania o Indonesia. (www.fao.org) En los últimos años la producción se ha extendido a países como Italia, Polonia, Checoslovaquia y algunas zonas en Norte América. Otras significativas áreas de producción son Yugoslavia, Alemania, Bulgaria y Hungría. China y Corea son los dos mayores productores de especias en Asia. (www.wikipedia.com) 1.1.2. ANALISIS MESO En Latinoamérica el país con mayor producción de especias es Argentina, la cual aporta el 0,25% del total elaborado. (www.wikipedia.com) 1.1.3. ANALISIS MICRO El Ecuador siendo un país sub desarrollado se encuentra afectado por los problemas nutriciones al igual que otros países del tercer mundo. En nuestro país la investigación sobre bacterias productoras de aditivos es muy baja y de igual manera la extracción de aromas por este tipo de tecnología, ya que no existen empresas dedicadas a la obtención de dicho aditivo. Ecuador ofrece perspectivas favorables, sin embargo de momento no hay interés por parte de organizaciones comerciales, por lo que es dudoso que organizaciones internaciones dedicadas a este tipo de investigación pueda realizar inversiones en nuestro país. La extracción de aromas a partir de cultivos de bacterias, en el país es una de las 2 actividades que no se toma en cuenta dentro del sector alimenticio como aditivo en la mayoría de productos consumidos. En Ecuador la producción de aditivos naturales a nivel industrial, no es explotada, ya que la mayoría de las empresas que proveen de estos aditivos a las industrias ecuatorianas la importan, y muy pocas son las excepciones que buscan un producto natural, como mejorador de las calidades organolépticas de los productos alimenticios. 1.2. ANÁLISIS CRÍTICO Como se observa existe una gran producción de especies las cuales son utilizadas para dar sabor, olor y color a los productos alimenticios elaborados. Existen muchas razones por las que se optó por investigar y desarrollar el tema propuesto para convertirlo en un instrumento de consulta, en vista de que los sistemas de dos fases acuosas han sido utilizados para la recuperación de productos proteicos a partir de suspensiones biológicas. En el área de fermentación extractiva (o recuperación in situ) existen también ciertos intentos reportados para la recuperación del mismo tipo de productos. Sin embargo, no existen reportes que discutan el uso de esta tecnología en cultivos con hongos y más aun, para la recuperación de aromas producidos por este tipo de cultivos filamentosos. El uso comercial se ha limitado debido a los bajos rendimientos de producción alcanzados hasta el momento. 3 1.3. ARBOL DE PROBLEMAS GRAFICO 1: El Árbol de Problemas ELABORACIÓN: Andrea Delgado 1.4. PROGNOSIS En caso de no ejecutar el presente trabajo se estará delimitando el campo de estudio de generación de aromas a partir de microorganismos. Este producto es muy requerido para la elaboración de alimentos como bebidas, panadería y confitería. Se puede considerar que al tratarse de producto de origen vegetal y no químico, se ofertaría una demanda considerable, como lo es actualmente, en productos naturales. 4 1.5. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA EL ESTUDIO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN CON EL MICROORGANISMO Trichoderma viride EN LA GENERACIÓN DE LACTONA (6 PENTIL α PIRONA) 1.6. PREGUNTAS DIRECTRICES ¿Cuál microorganismo utilizar para la obtención de aroma? ¿Determinar el proceso para obtener el aroma a coco? ¿Establecer el rendimiento de la extracción? ¿Cuáles serían las aplicaciones de este tipo de aromas? 1.7. DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA CAMPO: Alimentario AREA: Biotecnología ASPECTO: Tecnología de Aditivos TEMA: El estudio de los métodos de extracción con el microorganismo Trichoderma viride en la generación de lactona (6 pentil α pirona) 5 PROBLEMA: El sistema de fermentación en sistemas de dos fases acuosas, para la obtención de aroma a coco. 1.8. JUSTIFICACIÓN El uso de la técnica no convencional de extracción que explota los sistemas de dos fases acuosas presenta una alternativa tecnológica para la recuperación de aromas de fermentación miceliares (hongos) que evita los problemas de toxicidad presentes en ciertos sistemas de fermentación. En particular, se quiere demostrar el potencial técnico de recuperar 6-pentilα-pirona producido por Trichoderma viride como una alternativa a los sistemas de extracción evaluados y reportados hasta el momento. El uso de esta técnica de extracción potencialmente puede reducir los problemas de toxicidad presentes en ciertos sistemas de fermentación. La aplicación de sistemas de dos fases acuosas para la recuperación de aromas (6-pentilα-pirona) fue por primera vez reportada a la comunidad científica. (www.rincondelvago.com) La 6-pentil-α-pirona es una molécula cuyo uso como aromatizante en la industria alimentaria se ha limitado por los bajos rendimientos de producción. (www.pncta.com.mx) En el presente trabajo se utilizará extracto de papa y glucosa como fuente de carbono que, se ha demostrado estimula la biosíntesis de la molécula. Adicionalmente se consideró que el aceite en el medio de cultivo permitiría eliminar los efectos de toxicidad de la molécula hacia el microorganismo, fungiendo como solvente extrayente del aroma. (www.pncta.com.mx) 6 La incorporación de aditivos ha aportado enormes ventajas, particularmente en el terreno económico. El avance en el conocimiento de los aromas y los sabores de los alimentos ha permitido la creación de nuevos productos. Las proporciones de sustitutos a incorporar en los alimentos son una función directa de la calidad y variedad de los aditivos disponibles, en esto radica la importancia de los aromas, saborizantes y potenciadores de sabor. 1.9. OBJETIVOS 1.9.1. OBJETIVO GENERAL Estudiar los métodos de extracción con el microorganismo Trichoderma viride en la generación de lactona (6 – pentil - α - pirona). 1.9.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS Usar el microorganismo Trichoderma viride en la obtención de aroma a coco. Conocer el proceso de extracción por fases acuosas. Determinar el rendimiento de la extracción del aroma a coco (6 – pentil - α - pirona). Determinar las aplicaciones de aroma de coco en la industria alimenticia. 7 CAPITULO II MARCO TEÓRICO 2.1. ANTECEDENTES INVESTIGATIVOS De lo revisado en los estudios realizados en la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la Universidad Técnica de Ambato, no se encontró ninguna investigación similar a la planteada en este perfil, ni tampoco se encontró libros que detallen expresamente la técnica a utilizar para la extracción. 2.2. FUNDAMENTACION FILOSÓFICA Como antecedente tenemos una investigación realizada en el Centro de Biotecnología Campus Monterrey – México en el que durante 18 meses se desarrolló un proyecto sobre la recuperación de aromas producidos por hongos, en colaboración con el Instituto de Biotecnología de la Universidad financiamiento Nacional del Autónoma Consejo de Nacional México de (UNAM) Ciencia y y con Tecnología (CONACYT). (www.rincondelvago.com) Además existe una investigación en la Universidad Politécnica del Chimborazo para estudiar el efecto del medio de cultivo en la producción de aromas frutales por Trichoderma harzianum a partir de aceite de ricino como sustrato. (www.espoch.edu.ec) Las lactonas son ésteres cíclicos internos, hidroxiácidos principalmente gamma y delta. Una lactona interesante es la pentil α alfa pirona que tiene 8 un fuerte olor a coco es posible obtenerlo mediante un cultivo de Trichoderma viride en medios de cultivo constituidos por extracto de papa y glucosa. (www.pncta.com.mx). El rendimiento de este proceso es de aproximadamente 55 g de lactona por litro de medio de cultivo (www.tansferencia.mty.itesm.mx). El uso de la técnica no convencional de extracción que explota los sistemas de dos fases acuosas presenta una alternativa tecnológica para la recuperación de aromas de fermentación miceliares (hongos) que evita los problemas de toxicidad presentes en ciertos sistemas de fermentación. (www.pncta.com.mx) El procedimiento necesario para la obtención de las condiciones de operación del proceso de recuperación de 6-pentil-α-pirona involucra, como primera etapa, evaluar el comportamiento del sistema de fermentación en los sistemas de dos fases acuosas. La partición del aroma (6-pentil-α-pirona) y del microorganismo (Trichoderma viride) en los sistemas de dos fases acuosas se evalúa utilizando sistemas experimentales a nivel laboratorio. Con el uso de esta metodología es posible evaluar diversas condiciones de operación para la recuperación de 6-pentil-α-pirona del caldo de fermentación de Trichoderma viride. 9 2.3. DIAGRAMA DE FLUJO Trichoderma viride RECEPCION INOCULACIÓN FERMENTACIÓN Polietilenglicol ADICION AGITACIÓN CENTRIFUGACIÓN ANALISIS PURIFICACIÓN ALMACENAMIENTO GRAFICO 2: Diagrama de Flujo ELABORACIÓN: Andrea Delgado 2.3.1. CATEGORIAS FUNDAMENTALES Recepción: Se recibe el microorganismo, inocuo y en cepa cien por ciento pura, se mantiene a temperatura de refrigeración para el posterior uso, adquirido desde Argentina del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. (www.iib.unsam.edu.ar) Inoculación: En una cámara de asepsia previa esterilización, con las condiciones adecuadas, en un cultivo de extracto de papa y 10 glucosa (constituido en un 85% papa y 15% glucosa) como sustrato, se inocula a una temperatura de 28 ªC, en concentración de 275 mg por litro de cultivo, no debe existir presencia de luz. Fermentación: Se armaron fermentadores de 2 Lt, en los que se trabaja por un tiempo de 15 días controlando pH (5) y temperatura de 25 ºC. Adición: Se adiciona el poli-etilen-glicol (PEG) de 1.450 daltons a diferentes concentraciones (5 %, 10 %), además el fosfato en una concentración de 2%, Agitación: Con agitación mecánica a 25 ºC por 30 minutos para lograr la disolución de los componentes. Centrifugación: La separación de las fases fue alcanzada por centrifugación a 150 y 300 rpm por 20 minutos a 25ºC. Análisis: Se toma muestras de las fases para estimar el contenido de aroma y biomasa en cada una de ellas, utilizando cromatografía de gases y la técnica de peso seco, respectivamente. Purificación: Para purificar el aroma se van a utilizar dos tipos de destilación: hidrodestilación y destilación por arrastre de vapor. Almacenamiento: Ya extraída la aroma de cada una de las fases, se procede a un almacenamiento a refrigeración y en envases sellados. 11 2.4. HIPOTESIS Hipótesis Nula: Concentración del polietilenglicol, la velocidad de la centrifugación y el método de purificación, durante el proceso de extracción no afectan en el rendimiento de obtención del producto. Hipótesis Alternativa: Concentración del polietilenglicol, la velocidad de la centrifugación y el método de purificación, durante el proceso de extracción afectan en el rendimiento de obtención del producto. 2.5. SEÑALAMIENTO DE VARIABLES DE HIPOTESIS Variables Independientes: Concentración del polietilenglicol, la velocidad de la centrifugación y el método de purificación en el proceso de extracción de 6-pentil-α-pirona. Variables dependiente: El rendimiento de 6-pentil-α-pirona. 2.6. GLOSARIO DE TÉRMINOS Aditivos Aromatizantes: Son las sustancias o mezclas de sustancias con propiedades aromáticas capaces de conferir o reforzar el aroma sabor de los alimentos. (www.wikipedia.com) Aromatizantes Naturales: Aquellos obtenidos exclusivamente mediante métodos físicos, microbiológicos o enzimáticos, a partir de 12 materias primas aromatizante natural. Se entiende por materia prima aromatizante natural a los productos de origen animal o vegetal normalmente utilizados en la alimentación humana que contenga sustancias odoríferas, ya sea en su estado natural o después de un tratamiento adecuado. Se engloban aquí: aceites esenciales, extractos, bálsamos y oleorresinas. (www.wikipedia.com). Trichoderma viride: Se trata de un hongo con reproducción asexual. Englobados en Deuteromycota. Es un productor de antibióticos que forma colonias y produce pigmentos amarillos. (www.pncta.com.mx). Lactonas: Son responsables de aromas agradables como: fruta, coco, caramelo, nueces. Los microorganismos pueden sintetizar lactonas ópticamente activas en el cual se requiere numerosos procesos sintéticos. Las lactonas son potentes compuestos usados en la industria aromática, aunque en la actualidad su producción se lleva a cabo por síntesis químicas, principalmente, pero también existen distintos procesos de producción de lactonas usando como materia prima diversas cepas de microorganismos. (www.espoch.edu.ec) 6-pentil-α-pirona: A partir de cultivo de Trichoderma viride en medio de dextrosa de patata. La síntesis química requiere siete reacciones consecutivas. (www.espoch.edu.ec). Extracción de productos naturales: Los fluidos supercríticos son una alternativa a la aplicación de disolventes orgánicos en procesos de extracción y separación de los principios activos de los materiales biológicos, pues permiten temperaturas suaves de extracción y la fácil y total eliminación del disolvente. (www.pncta.com.mx) 13 CAPÍTULO III MARCO METODOÓGICO O METODOLOGÍA 3.1. ENFOQUE Esta investigación es de carácter predominante cuantitativo ya que obtendremos datos en la realización de este proyecto el cual nos permitirá mejorar si se desea profundizar o ampliar el tema de estudio. Los factores a considerarse en este estudio son la concentración del polietilenglicol, la velocidad de la centrifugación y el método de purificación durante el proceso de extracción para determinar el rendimiento de la extracción de 6-pentil-α-pirona por el método de fases acuosas. 3.2. MODALIDAD BÁSICA DE LA INVESTIGACIÓN Esta investigación es bibliográfica – experimental. La investigación documental según Cazares L. y otros (1982): “Depende fundamentalmente de la información que recoge, consultas en documentos, entendiéndose este termino en sentido amplio, como todo aquel material de índole permanente, es decir, al que se pueda acudir como fuente o referencia en cualquier momento o lugar, sin que se altere su naturaleza o sentido, para que aporte información o rinda cuenta de una realidad o acontecimiento”. (www.monografias.com) 14 La investigación experimental obtiene la información de la actividad intencional realizada por el investigador y que se encuentra dirigida a modificar la realidad con el propósito de crear el fenómeno mismo que se indaga, y así poder observarlo. 3.3. TIPOS DE INVESTIGACIÓN Este trabajo investigativo es de campo, por cuanto se está tratando de indagar y determinar el mejor tratamiento para la obtención de 6-pentil-αpirona a partir del microorganismo Trichoderma viride. Además también se lo puede tomar dentro en base a una asociación de variables, pues al tener diferentes niveles en los tratamientos a aplicar, necesitamos saber cuales son las variables que intervienen significativamente. 3.4. POBLACIÓN Y MUESTRA El diseño experimental que hemos encontrado conveniente es 23 teniendo en cuenta los siguientes factores y niveles especificados a continuación: Tabla 1: Descripción de los Factores de Estudio. Factor A = Concentración de polietilenglicol [%] Factor B = Velocidad en Factor C =Método de centrifuga. purificación. [rpm] ao = 5 bo = 150 a1 = 10 b1 =300 ELABORACIÓN: Andrea Delgado 15 co = Hidrodestilación c1 = Destilación con arrastre de vapor 3.5. OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES 3.5.1. Variable Independiente TABLA 2: Variables Independientes Conceptualización Categorización Generación Extracción Purificación Indicadores Ítems Técnicas Instrumentales Relación de Concentración de polietilenglicol Porcentaje Velocidad de Revoluciones Centrifugación por minuto % nutrientes en cultivo Mililitros Destilación obtenidos Utilización de rpm cronómetros de precisión Utilización de mL equipos para destilación. ELABORACIÓN: Andrea Delgado 3.5.2. Variable Dependiente TABLA 3: Variable Dependiente Conceptualización Categorización Indicadores Ítems Rendimiento del Producto Eficiencia. Líquido purificado Capacidad de equipos. ELABORACIÓN: Andrea Delgado 16 Técnicas Instrumentales Cromatografía mL de gases. Peso en seco. 3.6. RECOLECCION DE INFORMACIÓN Se recopilara los datos por réplica en cada tratamiento, y se los almacenará en Microsoft Word y Microsoft Excel para su respectivo análisis. TABLA 4: Recolección de Datos Tratamiento Tratamiento Rendimiento 1 a0b0c0 ? a a1b0c0 ? b a0b1c0 ? ab a1b1c0 ? c a0b0c1 ? ac a1b0c1 ? bc a0b1c1 ? abc a1b1c1 ? ELABORACIÓN: Andrea Delgado 3.7. PROCESAMIENTO DE DATOS Para el procesamiento y análisis de la información obtenida durante la extracción se usará los programas estadísticos SPSS y Statgraphics. 17 CAPÍTULO IV MARCO ADMINISTRATIVO 4.1. RECURSOS Para alcanzar los objetivos planteados se requiere de los siguientes recursos: 4.1.1. Institucionales Para realizar esta investigación requeriremos el apoyo de los laboratorios de la Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos de la Universidad Técnica de Ambato. 4.1.2. Humanos Director de Perfil Ayudante de Laboratorio Trabajo Personal 4.1.3. Materiales Cepas de Microorganismo: Trichoderma viride.. Obtenida desde Argentina del Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. (www.iib.unsam.edu.ar) Medio de Cultivo: Extracto de papa y glucosa Nutrientes: fosfato de amonio y poli-etilen-glicol (1.450 daltons) Balanza 18 Bioreactor pHmetro Centrifuga Termómetros Tubos de ensayo Vasos de precipitación Agitador mecánico Cromatógrafo de gases. Equipo de destilación. 4.1.4. Económicos TABLA 5: Recursos Económicos Aportado por # Rubros UTA Investigador $ $ 560 1700 1 Personal 2 Bibliografía 50 3 Materia Prima 150 4 Materiales 150 5 Uso de Laboratorios 6 Imprevistos 7 Publicación 100 20 300 Suman 580 Total 2450 3030 ELABORACIÓN: Andrea Delgado 19 4.2. CRONOGRAMA TABLA 6: Cronograma ACTIVIDAD PRELIMINARES Revisión Bibliográfica Pruebas preliminares Formulación del plan Aprobación del plan OPERATIVAS Evaluación de los Resultados Revisión del primer borrador Redacción del proyecto. Revisión y Corrección del proyecto. Publicación del Proyecto ELABORACIÓN: Andrea Delgado 20 1 2 3 4 5 6 4.3. 1. BIBLIOGRAFÍA CALVO, M. (1991). “Aditivos Alimentarios. Propiedades, aplicaciones y efectos sobre la salud”. Mira Editores S.A. 2. www.ub.es/depnutricioibromatologia 3. www.pncta.com.mx/pages/pncta_investigaciones_95c.asp 4. www.rincondelvago.com 5. www.transferencia.mty.itesm.mx/Transferencia44/eli-01.htm 6. www.espoch.edu.ec/servicios/tricodema/aromasfruatales.html 7. www.cquick.conacyt.mx/QuickPlace/direccion_de_comunicacion_ social/Main.nsf/h 8. www.um.es/bbmbi/GruposInvest/Biotecnologia/biot_con.htm 9. www.fao.org/documents/show_cdr.asp 10. www.wikipedia.com 11. www.monografias.com/trabajos7/inci/inci.shtml 12. www.iib.unsam.edu.ar/IIBINTECH/html/laboratorios/micologia /cepas.html 13. www.fao.org/spanish/newsroom/news 21