caracterización molecular de 50 genotipos de papa solanum

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE 50 GENOTIPOS DE PAPA SOLANUM
TUBEROSUM MEDIANTE LA TÉCNICA DE MICROSATÉLITES, DE LOS
CUALES 2 SON VARIEDADES COMERCIALES QUE PRESENTAN ALTO
GRADO DE SENSIBILIDAD A TECIA SOLANIVORA Y 48 ACCESIONES QUE
PRESENTAN ALGÚN GRADO DE RESISTENCIA A ESTE INSECTO PLAGA,
PARA ASÍ IDENTIFICAR CUÁLES SON LOS MÁS CONTRASTANTES A
NIVEL MOLECULAR PARA QUE PUEDAN SER UTILIZADOS COMO
PARENTALES EN PROGRAMAS DE MEJORAMIENTO GENÉTICO.
LADY MARCELA CASTAÑEDA URREGO
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Profesional en Biología.
Director
VICTOR MANUEL NUÑEZ ZARANTES
Investigador Líder
Laboratorio de Genética Molecular Vegetal
Centro de Biotecnología y Bioindustria Corpoica
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
IBAGUÉ-TOLIMA
2013
ADVERTENCIA
La Facultad de ciencias de la Universidad del Tolima, el director del trabajo y el jurado
calificador, no son responsables de los conceptos ni de las ideas expuestas por el autor
del presente trabajo.
Artículo 16, Acuerdo 032 de 1976 y Artículo 29, acuerdo 064 de 1991, Consejo
Académico de la Universidad del Tolima.
4
La autora LADY MARCELA CASTAÑEDA URREGO, autoriza a la Universidad del
Tolima la reproducción total o parcial de este documento, con la debida cita de
reconocimiento de la autoría y cede a la misma universidad de los derechos
patrimoniales con fines de investigación, docencia e institucionales, consagrados en el
artículo 72 de la Ley 23 de 1982 y las normas que lo constituyan o modifiquen.
ACUERDO 0066 DE 2003 DEL CONSEJO DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA
LADY MARCELA CASTAÑEDA URREGO
Autora
5
DEDICATORIA.
A Dios.
A mis padres.
Mis hermanos y amigos.
A Beto.
A todas las personas que de una u otra forma me apoyaron.
6
AGRADECIMIENTOS.
A la naturaleza…Por permitirme ver en ella la obra de Dios.
A mis padres por la paciencia y la constancia.
A mis hermanos por el entusiasmo.
A mis amigos por su colaboración y buenos deseos
A mis compañeros de laboratorio por enseñarme…y por los buenos momentos,
especialmente a Linda
A Víctor Núñez por darme la oportunidad de trabajar en este proyecto y por su inmensa
paciencia.
A CORPOICA por su apoyo logístico.
7
CONTENIDO
RESUMEN.
Pág.
ABSTRACT.
INTRODUCCIÓN.
18
1.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
20
2.
OBJETIVOS.
22
2.1.
OBJETIVO GENERAL.
22
2.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
22
3.
JUSTIFICACIÓN.
23
4.
MARCO TEÓRICO.
25
4.1.
ORIGEN DE LA PAPA.
25
4.1.1.
Clasificación taxonómica.
25
4.1.2.
La planta de papa.
26
4.1.3.
Flores.
27
4.1.4.
Fruto.
28
4.1.5.
Tubérculos.
29
4.2.
EL CULTIVO DE LA PAPA EN EL MUNDO.
31
4.3.
EL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA.
32
4.4.
COLECCIÓN CENTRAL COLOMBIANA DE PAPA (CCC).
32
4.5.
POLILLA GUATEMALTECA TECIA SOLANIVORA
(LEPIDOPTERA: GELECHIIDAE).
33
4.5.1.
Clasificación taxonómica.
33
4.5.2.
Ciclo de vida.
34
8
4.5.2.1. Huevo.
35
4.5.2.2. Larva.
35
4.5.2.3. Pupa.
37
4.5.2.4. Adulto.
37
4.6.
LA POLILLA GUATEMALTECA Y EL CULTIVO DE LA
PAPA.
39
4.7.
RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A LOS INSECTOS.
40
4.8.
MARCADOR GENÉTICO.
41
4.9.
MARCADORES MOLECULARES.
42
4.10.
MICROSATÉLITES O SSR (SHORT SEQUENCE
REPEATS).
43
4.11.
ESTADO DEL ARTE.
44
4.12.
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTOS EN LAS ACCESIONES
OBJETO DE ESTUDIO.
46
4.12.1.
Diversidad genética.
46
4.12.2.
Heterocigosidad.
47
4.12.3.
El índice de diversidad de Shannon y Wiener.
48
4.12.4.
Uniformidad.
49
4.13.
OBTENCIÓN HÍBRIDOS DE SOLANUM TUBEROSUM.
49
4.13.1
Ventajas de los cruces entre tetraploides.
5.
METODOLOGÍA: MATERIALES Y MÉTODOS.
51
5.1.
LUGAR DE ESTUDIO.
51
5.2.
MATERIAL VEGETAL.
51
5.3.
EXTRACCIÓN DEL ADN.
51
5.4.
CUANTIFICACIÓN DEL ADN.
53
5.5.
DILUCIONES DE TRABAJO.
53
5.6.
SELECCIÓN DE MICROSATÉLITES
53
5.7.
CONDICIONES DE PCR.
54
5.8.
ELECTROFORESIS EN ACRILAMIDA.
56
5.9.
PREPARACIÓN DE LA ACRILAMIDA.
56
9
5.10.
LIMPIEZA Y ARMADO DE LA CÁMARA.
56
5.11.
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA.
57
5.12.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
57
5.13.
TINCIÓN DEL GEL.
58
5.14.
DETERMINACIÓN DEL PESO DE LAS BANDAS CON
GENETOOLS.
59
5.15.
OBTENCIÓN DE LA MATRIZ DE DATOS BINARIA.
59
5.16.
ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS.
59
5.17.
ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTOS EN LAS ACCESIONES
61
OBJETO DE ESTUDIO.
5.18.
MATERIALES PARA LOS CRUCES.
61
5.19.
OBTENCIÓN DEL POLEN Y CONSERVACIÓN.
61
5.20.
SELECCIÓN DE LA FLOR RECEPTORA.
62
5.21.
POLINIZACIÓN.
62
5.22.
OBTENCIÓN DE LA SEMILLA.
63
5.23.
GERMINACIÓN IN VITRO.
63
5.24.
PROPAGACIÓN IN VITRO.
64
6.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
65
6.1.
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACION DEL ADN.
65
6.2.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR.
69
6.3.
ELECTROFORESIS EN ACRILAMIDA.
70
6.4.
DETERMINACIÓN Y PESO DE LAS BANDAS.
71
6.5.
ANÁLISIS CON NTSYS PC 2.1.
72
6.6.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS ACCESIONES
EVALUADAS.
75
6.7.
OBTENCIÓN DE LOS CRUZAMIENTOS.
78
6.8.
GERMINACIÓN IN VITRO Y PROPAGACIÓN.
79
7.
CONCLUSIONES.
80
10
RECOMENDACIONES.
82
REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS.
83
11
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1.
Duración del ciclo de vida de la polilla guatemalteca
(en días).
Tabla 2.
35
Parte de la planta de donde se sacó la muestra
para la extracción de ADN.
52
Tabla 3.
Condiciones de PCR
54
Tabla 4.
Temperaturas a las que se trabajaron los
microsatélites.
Tabla 5.
55
Soluciones utilizadas en el proceso de tinción y
tiempos de exposición del gel a las mismas.
Tabla 6.
Concentración y pureza de las muestras de ADN
extraído.
Tabla 7.
58
66
Resultados de Heterocigosidad en Solanum
76
tuberosum
12
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1
Clasificación de la papa.
26
Figura 2
Planta de la papa.
27
Figura 3
Flor de la papa
28
Figura 4
Fruto de la papa
29
Figura 5
Tubérculo de la papa
30
Figura 6
Ciclo de vida de Tecia solanivora
34
Figura 7
Daño a tubérculo de la papa por la larva de Tecia
37
solanivora
Figura 8
Dispersión geográfica de la polilla guatemalteca en
el período comprendido entre 1973 y 1996
39
Figura 9
Flor sin corola
62
Figura 10
Flor emasculada
62
Figura 11
Cruce cubierto con bolsa de tul y debidamente
etiquetado
Figura 12
63
Visualización de la concentración de ADN extraído
en Gel de Agarosa al 2%.
Figura 13
Promedio de ADN obtenido según la parte de la
planta de donde se realizó la extracción
Figura 14
71
Dendograma de la relación entre accesiones
utilizando el método de agrupamiento UPGMA.
Figura 18
69
Imagen de PCR corrida en gel de poliacrilamida.
Microsatélite STMS 2022.
Figura 17
68
Confirmación visual en Agarosa de la amplificación
por PCR del Microsatélite STMS 1024
Figura 16
68
Promedio del Ratio OD 260/280 según la parte de
la hoja de donde se realizó la extracción.
Figura 15
65
Heterocigosidad Esperada y la Heterocigosidad
13
74
Esperada Corregida por Tamaño de Muestra.
76
Figura 19
Índice de diversidad de Shannon – Wiener.
77
Figura 20
Uniformidad de los alelos por Locus.
78
Figura 21
Planta F1 germinada y propagada in vitro.
79
14
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Concentracion ADN
92
Anexo B. Diluciones de trabajo
95
Anexo C. Protocolo PCRS
97
Anexo D. Tabla de similaridad de JACCARD.
99
Anexo E. Peso de las bandas amplificadas.
114
Anexo F. Códigos y especies de las accesiones
115
Anexo G. Microsatélites evaluados inicialmente para determinar si
116
presentan polimorfismos en Solanum Tuberosum.
15
RESUMEN.
Utilizando la técnica de marcadores moleculares microsatélites se caracterizaron 50
accesiones de Solanum tuberosum, de los cuales 48 genotipos en estudios previos
presentaron algún nivel de resistencia a la polilla guatemalteca Tecia solanivora en
bioensayos de Desarrollo Biológico de no Elección y Severidad y 2 genotipos
comerciales altamente susceptibles en campo y en los bioensayos. El análisis se
realizó con 7 microstatélites que resultaron polimórficos en Solanum phureja en el
estudio de Ospina (2008) y se obtuvieron 27 alelos con los cuales se alimentó una
matriz de datos binaria de presencia/ausencia. El análisis estadístico se realizó
utilizando el método de agrupamiento UPGMA (Weighted Pair Group Method Using
Arithmetic Average). Así mismo se realizaron cruces entre materiales susceptibles y los
genotipos resistentes buscando que fueran lo más divergente posible a nivel molecular
para incluirlos como parentales en programas de mejoramiento genético que buscan
ofrecer resistencia al insecto plaga Tecia solanivora.
Palabras clave: microsatélites, susceptibles, resistentes, Solanum tuberosum, Tecia
solanivora.
16
ABSTRACT.
Using the technique of molecular markers microsatellites were characterized 50
accessions of Solanum tuberosum, of which 48 genotypes in previous studies showed
some level of resistance to the Guatemalan moth bioassays Tecia solanivora in
Biological Development and Severity Election not and 2 commercial genotypes highly
susceptible field and bioassays. The analysis was performed with 7 microstatélites that
were polymorphic in Solanum phureja in Ospina's study (2008) and 27 alleles were
obtained which were fed a binary data matrix of presence / absence. Statistical analysis
was performed using the UPGMA (Weighted Pair Group Method Using Arithmetic
Average) clustering method. Also crosses were made between materials susceptible
and resistant genotypes looking to be as divergent as possible at the molecular level to
include them as parents in breeding programs seeking to provide resistance to insect
pest Tecia solanivora.
Key words: microsatellites, resistance, susceptible, Solanum tuberosum, Tecia
solanivora.
17
INTRODUCCIÓN
La papa es el cuarto cultivo de importancia a nivel mundial después del trigo, arroz y
maíz
(FAO, 2008). La papa ocupa el quinto lugar en la producción agropecuaria
nacional con 2.272.770 toneladas producidas por año, una extensión de 123.659 ha y
un rendimiento de 18.37 t/ha, el consumo per cápita anual es alrededor de 70 Kg
(FAO, 2009). En Colombia se presenta una amplia gama de sistemas agroecológicos y
de sistemas de producción; la producción comercial de papa está localizada entre los
2000 y 3500 m.s.n.m., con una zona óptima de producción entre 2500 y 3000 m.s.n.m.
El rango de temperatura va desde 10°C hasta 15°C y el de precipitación entre 500 y
2500 mm / año. (Cevipapa, 1999).
Es el cultivo que más demanda fungicidas e insecticidas (Minagricultura, 1999) y es
atacado por gran variedad de enfermedades ocasionadas por nematodos, virus,
hongos, oomicetos y bacterias (Mosquera, 2006) y por plagas como el gusano blanco Premnotrypes vorax (Hustache)- y la polilla guatemalteca Tecia solanivora, la cual es
considerada actualmente uno de los insectos plaga de mayor importancia económica
en el cultivo de la papa en Colombia (Espinal el al , 2005); está presente en más del
80% de las zonas productoras de papa, con pérdidas significativas en la disminución en
los rendimientos anuales superiores al 30% (Bosa et al., 2005) y es incluso la más
delicada por el desconocimiento existente sobre su biología y estrategias de manejo
(Minagricultura, 1999).
Generalmente el control de Tecia solanivora se realiza por medio de aplicación de
insecticidas, sin embargo, las aplicaciones frecuentes de estos productos pueden
producir riesgos de neurotoxicidad -a las personas que la aplican ya que en muchos
casos no utilizan los elementos de protección personal
y eventualmente a
los
consumidores si no se respeta el intervalo previo a la cosecha estipulado en las
instrucciones de uso de los plaguicidas - por exposición aguda y crónica, impacto sobre
la entomofauna benéfica e invertebrados acuáticos, causar problemas de resistencia
del insecto y de contaminación irreversible en suelos por la formación de residuos no
18
extraíbles (Bosa & Osorio, 2008.) Además al existir problemas de sobredosificación se
comprometen
las
posibilidades
de
ampliar
e
incluso
mantener
mercados
(Minagricultura, 1999).
Debido a que la protección del cultivo por medio de agroquímicos es costosa y cada
vez hay mayores restricciones para su uso, el desarrollo de variedades resistentes es
la forma más razonable para reducir el problema ocasionado por plagas y
enfermedades
(Mosquera T. , 2006). El primer paso en los programas de
mejoramiento genético es identificar materiales contrastantes en al menos una de sus
características, CORPOICA ya realizó una preselección de materiales al realizar
experimentos de Desarrollo Biológico de No Elección y Severidad del Daño donde se
seleccionaron materiales que presentaron algún grado de resistencia a Tecia
solanivora y dos materiales susceptibles comerciales. El paso a seguir es caracterizar
genéticamente a todas las accesiones, utilizando la técnica de los microsatélites se
puede encontrar cuales son más contrastantes y por lo tanto seleccionar de manera
confiable los progenitores que se incluirán en el programa de búsqueda de resistencia
genética a Tecia solanivora.
Una vez hallados los materiales más contrastantes se hace necesario hibridarlos para
evaluar en la progenie aquellos que contengan las características deseables, en este
caso el rendimiento del tubérculo comercial y la resistencia del tubérculo a Tecia
solanivora.
19
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
El cultivo de la papa es la principal actividad agrícola de las zonas andinas en
Colombia, la cual es desarrollada por cerca de 90.000 familias. Se caracteriza por ser
el cultivo que mayor demanda tiene en el país en fungicidas e insecticidas, el segundo
en fertilizantes de síntesis química, después del café; es un cultivo disperso, aislado, de
pequeños productores con limitado acceso a la tecnología. (Minagricultura, 1999). El
cultivo de la papa es atacado por gran variedad de enfermedades ocasionadas por
nematodos, virus, hongos, oomicetos y bacterias (Mosquera, 2006) y por plagas como
el gusano blanco Premnotrypes vorax (Hustache) y la polilla guatemalteca, Tecia
solanivora, la cual es considerada actualmente uno de los insectos plaga de mayor
importancia económica del cultivo en Colombia (Espinal el al, (2005) citados por
Rincon & García, (2007)) y el desconocimiento sobre su biología y estrategias de
manejo la hacen de gran importancia agronómica (Minagricultura, 1999). En Colombia
fue registrada por primera vez en 1985 en cultivos de papa de Chitagá (Norte de
Santander) donde las pérdidas ocasionadas en campo y almacén superaron el 50% de
la producción a finales de la década de los 80. Posteriormente, se propagó a Boyacá,
Cundinamarca y Antioquia, en donde se reportaron pérdidas hasta del 100% bajo
condiciones favorables a la plaga (Arias J. , 1997).
Para el manejo de esta plaga bajo condiciones de campo, sólo unos pocos insecticidas
químicos han sido aprobados por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA). Sin
embargo, las aplicaciones frecuentes de estos productos pueden producir riesgos de
neurotoxicidad por exposición aguda y crónica, impacto sobre la entomofauna benéfica
e invertebrados acuáticos, causar problemas de resistencia del insecto y de
contaminación irreversible en suelos por la formación de residuos no extraíbles (Bosa &
Osorio, 2008.) Además al existir problemas de sobredosificación se comprometen las
posibilidades de ampliar e incluso mantener mercados como el de exportación
(Minagricultura, 1999).
20
Como se expuso anteriormente, en el cultivo de papa, para el control tradicional de
Tecia solanivora se utilizan insecticidas que elevan los costos de producción, ponen en
riesgo la salud humana, contaminan el ambiente e inminentemente limitan el mercado
de exportación, debido al exceso de aplicación. Por lo tanto, se hace necesario buscar
alternativas que reduzcan los costos de producción, el impacto ambiental negativo y
los riesgos para la salud humana, una alternativa viable es desarrollar variedades
resistentes buscando genes que confieran resistencia entre el acervo genético que se
encuentra en los bancos de germoplasma; para hacerlo es necesario caracterizar,
identificar y por último introducirlos en variedades comerciales utilizando herramientas
biotecnológicas.
La evaluación fenotípica y caracterización molecular de genotipos que presentan algún
grado de resistencia al ataque
de Tecia solanivora y de materiales altamente
susceptibles, puede arrojar información valiosa como base para la identificación
marcadores o genes asociados o relacionados a la resistencia para el establecimiento
posterior de esquemas de producción de variedades de interés comercial. En este
caso,
los
marcadores
moleculares
microsatélites
resultan
muy
útiles
para
caracterizaciones genotípicas de individuos y poblaciones, debido a sus características
de codominancia, reproducibilidad y alto polimorfismo. Con el desarrollo de este trabajo
se busca contribuir con la generación de información molecular de materiales
resistentes y susceptibles previamente evaluados por resistencia en condiciones de
laboratorio y casa de malla. Además se dio inicio a la conformación un grupo de
individuos F1 entre genotipos resistentes y susceptibles con el fin de sentar las bases
para futuras investigaciones en selección asistida por marcadores de ADN para
resistencia a Tecia solanivora.
Una vez obtenida la semilla F1 se debe evaluar si tienen el vigor híbrido que se está
buscando, si estos caracteres se encuentran suficientemente desarrollados en la F1 se
pueden reproducir por métodos asexuales para obtener un mayor número de plantas
con los caracteres deseados idénticos; de no ser así se puede recurrir a los retrocruces
para fortalecer alguna de las características presentes en los parentales.
21
2. OBJETIVOS.
2.1.
OBJETIVO GENERAL.
Caracterizar
molecularmente 50 genotipos de papa Solanum tuberosum
mediante la técnica de microsatélites, de los cuales 2 son variedades
comerciales que presentan alto grado de sensibilidad a Tecia solanivora y 48
accesiones que presentan algún grado de resistencia a este insecto plaga, para
así identificar cuáles son los más contrastantes a nivel molecular para que
puedan ser utilizados como parentales en programas de mejoramiento genético.
2.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

Evaluar 48 genotipos de papa previamente seleccionados por resistencia a la
polilla guatemalteca Tecia solanivora y dos genotipos susceptibles comerciales
utilizando la técnica de microsatélites.

Determinar cuáles son los genotipos más contratantes a nivel molecular entre los
48 genotipos resistentes frente a los dos
genotipos susceptibles comerciales
evaluados.

Generar cruzamientos entre los genotipos seleccionados en el segundo objetivo
específico para obtener plantas F1 como base para futuros estudios de mejoramiento
genético.
22
3. JUSTIFICACIÓN.
En la actualidad, en el Centro de investigación de CORPOICA Tibaitatá se encuentra la
Colección Central Colombiana de Papa que cuenta con 2.985 clones cultivados y
silvestres de papa y con ella se facilita el mejoramiento del cultivo de la papa en el
presente y el futuro, promoviendo el uso de genes valiosos que se encuentran en el
germoplasma silvestre y domesticado de la papa (Moreno & Valbuena, CORPOICA,
2006). Según Busso (1990) las bases genéticas son reducidas sobre todo en los países
tropicales y subtropicales donde se han utilizado cultivares europeos obsoletos como
progenitores de las variedades mejoradas.
Cuando se
busca implementar programas de mejoramiento genético en especies
vegetales de alto interés agrícola, es de vital importancia conocer la variabilidad entre
especies y entre variedades de la misma especie. Para esto se hace necesario conocer
y entender la diversidad y estructura genética de las especies de interés. (FonsecaTrujillo, 2009). La caracterización varietal se realiza comúnmente a partir de la
utilización de un grupo de descriptores morfológicos (Cooke, 1995). Sin embargo la
expresión de estos descriptores es afectada en muchos casos por factores ambientales
y otros el número de descriptores de utilidad, es limitado (Rodriguez, Hernadez,
Delgado, & Cornide, 2005). Con la caracterización de los materiales de interés,
mediante la técnica de microsatélites se puede conocer el grado de polimorfismo y
determinar los más contrastantes para seleccionar de manera confiable los
progenitores que se incluirán en el programa de búsqueda de resistencia genética a
plagas, en este caso específico Tecia solanivora. Una de las formas más confiables de
obtener una variedad mejorada es la hibridación, cruzando dos variedades o especies
diferentes para conseguir reproducir en la descendencia, algunos de los caracteres
parentales; no obstante, con la hibridación
se derivan también otros rasgos
indeseados, es por ello que tras la hibridación suele ser necesario realizar un proceso
de selección artificial durante varias generaciones, eliminando así aquellas plantas que
sostengan rasgos desfavorables para que predominen sólo los deseados, aunque el
23
alcance del presente trabajo llega únicamente hasta la obtención de plantas F1
obtenidas por cruzamiento entre las accesiones más contrastantes.
Este trabajo de grado es parte de la Meta 7 del Proyecto “Evaluación y Caracterización
de Materiales Genéticos Promisorios de la Colección Central Colombiana de Papa por
Resistencia a la Polilla Guatemalteca Tecia solanivora” que hace parte del Programa
Innovación Tecnológica en el Cultivo de la Papa a Través del Mejoramiento Genético
para Tolerancia a Insectos y Buenas Características de Procesamiento.
24
4. MARCO TEÓRICO.
4.1.
ORIGEN DE LA PAPA.
Hasta el presente se reconocen 228 variedades silvestres y siete cultivadas. La
diversidad genética que tiene la papa en Colombia se expresa en un sinnúmero de
variedades que corresponden a las especies cultivadas Solanum tuberosum ssp
andigena y Solanum phureja. Sin embargo, solo unas 30 variedades entre las nativas
antiguas y las mejoradas genéticamente se explotan comercialmente según Cevipapa
(1999). Ñustez C. en 2010 elaboró un catálogo con variedades nativas y mejoradas
donde se incluyeron 24 variedades, cinco de las cuales son nativas.
4.1.1. Clasificación taxonómica.
Según Rodriguez (2009):
Existe controversia sobre la conveniencia de clasificar la papa como
varias especies, bajo la clasificación propuesta por Linneaus (1753) y
adoptada por el Código Internacional de Nomenclatura Botánica (ICBNInternational Code of Botanical Nomenclature), o como única especie con
diferentes grupos cultivados ubicados dentro de S. tuberosum, utilizando
la nomenclatura propuesta por el Código Internacional de Nomenclatura
de Plantas cultivadas(Icncp-International Code of Nomenclature of
Cultivated Plants) (Spooner y Hetterscheid, 2005). (p.25).
25
Para no confundir al lector en el presente documento se trabajará con la clasificación
de Hawkes (1990):
Figura 1. Clasificación de la papa.
Fuente: Rodriguez, 2009.
4.1.2. La planta de papa. La papa es una dicotiledónea herbácea con hábitos de
crecimiento rastrero o erecto, generalmente de tallos gruesos y leñosos, con
entrenudos cortos. Los tallos son huecos o medulosos, excepto en los nudos que son
sólidos, de forma angular y por lo general verdes o rojo púrpura. El follaje normalmente
alcanza una altura entre 0.60 a 1.50 m. Las hojas son compuestas y pinnadas. Las
hojas primarias de plántulas pueden ser simples, pero una planta madura contiene
hojas compuestas en par y alternadas. Las hojas se ordenan en forma alterna a lo largo
del tallo, dando un aspecto frondoso al follaje, especialmente en las variedades
mejoradas. (Pumisacho, 2002)
26
Figura 2. Planta de la papa.
Fuente: Pumisacho, 2002.
Las papas silvestres se mantienen por largos periodos debido al continuo rebrote de los
tubérculos. En contraste, las variedades cultivadas viven de cuatro a siete meses. Las
plantas provenientes de semilla sexual poseen un sistema radicular muy fibroso, con
raíz primaria, hipocotilo, cotiledones y epicotilo, a partir de los cuales se desarrolla el
tallo y el follaje. En cambio, las plantas de cultivo comercial se originan de un tallo
lateral que emerge de un brote proveniente de tubérculos usados como “semilla”. Las
raíces son adventicias. (Pumisacho, 2002)
4.1.3. Flores. Diversos factores climáticos, especialmente el fotoperiodo y la
temperatura, estimulan la floración. Las flores nacen en racimos y por lo regular son
terminales.
Cada flor contiene órganos masculino (androcéo) y femenino (ginecéo). Son
pentámeras (poseen cinco pétalos) y sépalos que pueden ser de variados colores, pero
comunmente blanco, amarillo, rojo y púrpura. Muchas variedades dejan caer las flores
después de la fecundación. La autopolinización se realiza en forma natural. En los
tetraploides la polinización cruzada es relativamente rara. (Pumisacho, 2002).
27
Figura 3. Flor de la papa.
Fuente: Pumisacho, 2002.
4.1.4. Fruto. El fruto de la papa es una baya pequeña y carnosa que contiene las
semillas sexuales. La baya es de forma redonda u ovalada, de color verde amarillento o
castaño rojizo. Posee dos lóculos con un promedio de 200 a 300 semillas. Cultivos
comerciales de papa pueden ser obtenidos a partir de híbridos provenientes de semilla
sexual, pero la semilla sexual se usa generalmente con propósitos de mejoramiento. En
la actualidad, los mejoradores esperan uniformizar la progenie con el fin de obtener una
papa con características determinadas (Pumisacho, 2002) y continúa diciendo:
La papa posee una serie de ploidias (múltiples pares de cromosomas, con
especies cultivadas desde el nivel diploide (2n=24 cromosomas), triploide
(2n=36), tetraploide (2n=48), pentaploide (2n=60) y hasta hexaploide
(2n=72) en las especies silvestres. Comúnmente las variedades nativas
del Ecuador (ej. Solanum phureja o Chaucha) son diploides, mientras que
las variedades cada vez más dominantes en el mercado son las
tetraploides, genéticamente mejoradas (p. 35).
28
Figura 4. Fruto de la papa.
Fuente: Pumisacho, 2002.
4.1.5. Tubérculos. Los tubérculos son tallos carnosos que se originan en el extremo del
estolón y tienen yemas y ojos. La formación de tubérculos es consecuencia de la
proliferación del tejido de reserva que estimula el aumento de células hasta un factor de
64 veces. El tejido vascular de los tallos, estolones y tubérculos toma inicialmente la
forma de haces bicolaterales, con grupos de células floemáticas de pared delgada en la
parte externa del xilema (floema externo) y hacia el centro en la parte interna del xilema
(floema interno). A medida que el estolón se alarga, el parénquima se desarrolla,
separando los haces vasculares de tal forma que el anillo vascular se extiende.
Mientras el tubérculo está en crecimiento, nuevos grupos de floema, incluyendo tubos
cribosos, células acompañantes y elementos del parénquima conductor, se forman.
Hidratos de carbono se almacenan dentro de las células del parénquima de reserva, de
la medula y la corteza en forma de gránulos de almidón con detalles característicos
(Pumisacho, 2002).
29
Figura 5. Tubérculo de la papa.
Fuente: Pumisacho, 2002.
La producción comercial de papa a través del mundo está prácticamente basada en la
propagación vegetativa. Se plantan los tubérculos y éstos producen nuevas plantas y
tubérculos que tienen un genotipo idéntico al de la planta madre. Sin embargo, el
sistema de multiplicación vegetativa no es ajeno a problemas, entre los cuales se
incluyen: la transmisión de enfermedades, el abultamiento, un radio de multiplicación
lento y la pudrición de los tubérculos de semilla (Redepapa, 2002).
Durante la etapa de tuberización se puede formar un gran número de tubérculos,
siendo generalmente dos a cuatro por cada tallo, los que logran un tamaño comercial.
Los tubérculos pueden cosecharse inmaduros, obteniéndose papas llamadas
comúnmente “nuevas” o “pelonas”, las cuales se caracterizan por presentar un
periderma (piel) suelto y muy delgado. En la medida que avanza la madurez, los
tubérculos continúan creciendo y van afirmando progresivamente su periderma; éste se
va engrosando y adquiriendo un color cada vez más oscuro. Este crecimiento continúa
aún después que el follaje comienza a amarillear, alcanzándose el máximo rendimiento
en cada planta cuando un 50% de su follaje se encuentra seco (Redepapa, 2002).
Los tubérculos habitualmente se desprenden de los rizomas durante la cosecha,
quedando en evidencia un fragmento corto remanente o una pequeña cicatriz en su
30
extremo proximal. En cada nudo existen normalmente tres yemas, las cuales se ubican
en las axilas de hojas escamosas existentes en áreas deprimidas del tubérculo; cada
yema representa un potencial tallo no desarrollados. Sus desventajas radican en el alto
desperdicio y tiempo de pelado, debido al grosor de la piel y a la profundidad de los
ojos, aspectos que afectan el rendimiento y la presentación del producto terminado.
Igualmente la variación del contenido de azúcares reductores y de materia seca limita
su rendimiento en línea. Los tubérculos pueden presentar una forma alargada,
redondeada u oblonga; su color, en tanto, puede ser blanco, amarillo, violeta o rojizo.
Están constituidos externamente por el periderma, las lenticelas, los nudos, las yemas
y, eventualmente, por un fragmento o una cicatriz proveniente de la unión con el rizoma
del cual se originaron. Internamente se distingue la corteza, el parénquima vascular de
reserva, el anillo vascular y el tejido medular (Redepapa, 2002)
4.2.
EL CULTIVO DE LA PAPA EN EL MUNDO.
El sector mundial de la papa atraviesa grandes cambios. Hasta inicios del decenio de
1990, casi la totalidad de las papas se producían y consumían en Europa, América del
Norte y en los países de la antigua Unión Soviética. Desde entonces se ha producido
un espectacular aumento de la producción y la demanda de papa en Asia, África y
América Latina, donde la producción aumento de menos de 30 millones de toneladas a
principios del decenio de 1960 a más de 165 millones en 2007. En 2005, por primera
vez, la producción de la papa del mundo en desarrollo excedida el del mundo
desarrollado. China se ha convertido en el primer productor mundial de papa, y poco
menos de una tercera parte de todas las papas hoy se cosechan en China y la India
(FAO, 2008).
31
4.3.
EL CULTIVO DE LA PAPA EN COLOMBIA.
El cultivo de la papa es la principal actividad agrícola de las zonas andinas en Colombia
desarrollada por cerca de 90.000 familias. Se caracteriza por el uso intensivo de
fertilizantes y plaguicidas, alta demanda de mano de obra rural no calificada (entre 110
y 120 jornales por hectárea), y por ser un cultivo disperso, aislado, de pequeños
productores con limitado acceso a la tecnología. En la actualidad se cultivan en
Colombia alrededor de 110000 hectáreas se reporta en el Año Internacional de la Papa
(2008) el cultivo de la papa participa con el 7,1% de la superficie sembrada en cultivos
transitorios y aporta cerca de 7,8% de la producción agrícola, generando alrededor de
69.000 empleos directos, principalmente en los departamentos de Cundinamarca,
Boyacá, Nariño y Antioquia. En 2009, el área sembrada de papa fue de 128.701
hectáreas con una producción de 2.272.772 toneladas y un rendimiento de 18,4 t/ha.
La participación departamental en la producción nacional se encuentra distribuida de la
siguiente manera: Cundinamarca 37,8%, Boyacá 26,3%, Nariño 16,4%, Antioquia
6,5%, Santander 5,6% y otros departamentos participan con el 6,4% (Osorio et al
2012)
4.4.
COLECCIÓN CENTRAL COLOMBIANA DE PAPA (CCC).
La papa es el cuarto cultivo en el mundo en términos de rendimiento y, por lo tanto, hay
una demanda significativa de recursos genéticos para mejoramiento del cultivo. La
base genética mundial de la papa es mantenida por aproximadamente 25 bancos o
colecciones en el mundo. Estos bancos están ubicados en la zona andina y en otros
centros de origen de materiales nativos y silvestres situados en Europa y Norte
América. El número de accesiones en Latinoamérica es de aproximadamente 18.293,
en Europa de 28.942, en Norte América de 5.778 y en Asía de 2.693. Las colecciones
están compuestas especialmente de especies silvestres, formas primitivas o
variedades nativas, cultivares sustituidos, nuevos y otros tipos de materiales (Moreno &
Valbuena, 2006).
32
La colección de campo se regenera cada año en el Centro de Investigación de
Tibaitatá y está conformada por los siguientes grupos: subespecie andigena, 664
accesiones; subespecie tuberosum, 84 accesiones; especie phureja, 52 accesiones;
chaucha, 48 accesiones; variedades comerciales, 32; 4 accesiones provenientes de
colectas del departamento de Boyacá en 1999 y 31 accesiones de especies cultivadas
y silvestres: jungadifolium, flahaultii, stoloniferum, estradae, colombianum, etc. para un
total de 915 accesiones en tubérculo-semilla. Con respecto a la colección, en
condiciones de conservación, propagación, introducción y recuperación existen 962
accesiones conformadas de la siguiente manera: subespecie andigena, 704 colectas;
Solanum phureja, 100; subespecie tuberosum, 23; Solanum chaucha, 47; Solanum sp.
(resistentes a virus y gota), 31; clones del Centro Internacional de la Papa –CIP-, 26;
variedades comerciales, 10 (andigena x tuberosum); especies silvestres y cultivadas,
21 colectas (colombianum y estradae). Bajo la forma de semilla botánica se mantienen
1.604 accesiones en cuarto frío (5ºC) de especies cultivadas y 185 colectas de 11
especies silvestres, para un total de 1.789 accesiones con 273 materiales duplicados
en conservación a largo plazo (-20º C). (CORPOICA, 2006)
En la búsqueda de resistencia genética a la polilla guatemalteca (Tecia solanivora) en
la Colección Central Colombiana de Papa, se evaluaron 842 accesiones de la
colección, discriminadas de la siguiente manera: 639 de la subespecie andigena, 78 de
la subespecie tuberosum, 45 de la especie Solanum chaucha, 49 de Solanum phureja y
31 variedades comerciales. Como resultado se seleccionaron 60 genotipos de las
subespecies andigena y tuberosum en los que se constató resistencia moderada.
(CORPOICA, 2006)
4.5.
POLILLA
GUATEMALTECA
TECIA
GELECHIIDAE)
4.5.1. Clasificación taxonómica.
Orden: Lepidóptera
33
SOLANIVORA
(LEPIDOPTERA:
Suborden: Dystrisia
Superfamilia: Tineoideae
Familia: Gelechiidae
Tribu: Gnorimoschemini
Género: Tecia
Especie: Solanivora
4.5.2. Ciclo de vida.
Figura 6. Ciclo de vida de Tecia solanivora.
Fuente: Mendiburu, (2002). Tecia solanivora: patata-ekoizleen amesgaiztoa.
Recuperado de http://zientzia.net/artikuluak/itecia-solanivorai-patata-ekoizleenamesgaiztoa/
34
El ciclo de vida depende de la temperatura ambiental, tal como lo muestra la siguiente
tabla.
Tabla 1. Duración del ciclo de vida de la polilla guatemalteca (en días).
o
La Selva-
Pamplona – Norte de
Tunja –
Antioquia
Santander
Boyacá
2200 msnm
2287 msnm
2787 msnm
Temperatura ( C)
16
12-20
12-14
Humedad relativa
78-83
78-83
44-58
Huevo
10
8-10
13-15
Larva
20
22
30
Pupa
20
15-18
23
Huevo adulto
50
45-50
66-68
Longevidad Adulto
20-25
20
20-25
Total
70-75
60-70
86-93
(%)
Fuente: La Polilla Guatemalteca de la papa (1998).
4.5.2.1.
Huevo. Al principio su color es blanco crema, luego se tornan amarillentos
y cuando están próximos a eclosionar su coloración es grisácea; esto es debido a la
esclerotización de la cápsula cefálica de la larva, visible a través del corión. La forma
de los huevos varía ligeramente; tiende a ser ovoide cuando son puestos en forma
individual y un poco más redondeada cuando son colocados en grupo. La longitud
promedio de los huevos es de 0,53 ± 0,04 mm para el primer caso y 0,41 ± 0,04 de
ancho para el segundo (Torres, 1989) En campo se encuentran en grupos de 2 a 4 o
aislados, sobre las hojas bajeras de la planta, en el cuello de la raíz, base del tallo y
sobre el área de tuberización. En este estado duran de 8 a 10 días en condiciones
ambientales de laboratorio (CORPOICA, 1999).
35
4.5.2.2.
Larva. Pasa por cuatro instares larvales; las larvas de primer instar son
muy pequeñas de color blanco transparente y cabeza de color marrón oscuro, penetran
en el tubérculo haciendo orificios casi imperceptibles; este estado es muy sensible a la
luz solar, al agua y a polvos finos que se le puedan pegar y envolver su cuerpo
ocasionando su deshidratación. Las larvas de segundo instar son de color blanco
crema y hacen minas superficiales en el tubérculo. Las de tercer instar se caracterizan
por tener una coloración crema. El estado larval de Tecia solanivora se caracteriza por
presentar puntos o máculas de color negro en cada segmento torácico y abdominal lo
que la diferencia de las larvas de Phthorimaea operculella, principalmente en los tres
primeros instares. La larva es el estado que causa el daño (a la papa) y solo se
alimenta del tubérculo, dejando los excrementos esparcidos por la galería y cuando
termina el cuarto instar abandona el tubérculo dejando el orificio de salida libre de
estos, a diferencia de Phthorimaea operculella. Bajo las condiciones climáticas de
Pamplona y en laboratorio este estado dura 22 días en promedio (CORPOICA, 1999).
Los estudios de las poblaciones de larva en el campo, de acuerdo al desarrollo del
cultivo, indican que es posible el ataque del tubérculo semilla, pero en menor
proporción que los producidos por la planta. También se encontró que la infestación de
larvas se inicia con la tuberización de la planta de papa y se va incrementando
conforme aumenta el peso fresco del tubérculo. Se observó que la especie coloniza el
cultivo especialmente por los bordes, distribuyéndose en una forma agregada.
Posteriormente, a medida que se desarrolla el cultivo y las poblaciones de polilla se
incrementan sin ningún control, el ataque avanza hacia el centro de la parcela; no
obstante, los bordes mantienen los mayores daños al final de la cosecha. Estos
tubérculos infestados representan focos de infestación, cuando son utilizados como
semilla (Torres, 1989). Una vez abandonado el tubérculo la larva busca el sitio de
empupamiento que puede ser el suelo, almacén, empaques, encima de los tubérculos,
dentro de las galerías, etc., disminuye de tamaño y conserva el color del cuarto instar.
Este estado dura de 2 a 3 días (CORPOICA, 1999).
36
Figura 7. Daño a tubérculo de la papa por la larva de Tecia solanivora.
Fuente: Mendiburu, (2002). Tecia solanivora: patata-ekoizleen amesgaiztoa.
Recuperado de http://zientzia.net/artikuluak/itecia-solanivorai-patata-ekoizleenamesgaiztoa/
4.5.2.3.
Pupa. La larva se envuelve en un capullo de seda dentro del cual se
forma la pupa. A la parte externa del capullo se le adhieren partículas de suelo y otros
materiales que están a su alrededor formando el cocon pupal. En este estado pueden
durar de 15 a 18 días bajo las condiciones ambientales en Pamplona (CORPOICA,
1999).
4.5.2.4.
Adulto. Cabeza, tórax y tégula marrón claro en las hembras. La coloración
de las palpas labiales es más oscura en los machos que en las hembras y las puntas
de las escamas varían de marrón a marrón grisáceo en la mayoría de los casos. Las
alas anteriores son amplias de color marrón oscuro en los machos a marrón claro
brillante en las hembras y con tres manchas o estigmas muy visibles. Las hembras en
37
especial, presentan un patrón de líneas longitudinales nítidas en el ápice del ala y
terminan en forma de manchas marginales más o menos desarrolladas. El margen
costal es notablemente marrón más oscuro especialmente en los machos, similar a la
banda axial que se alarga y amplía desde el tercer estigma hasta el ápice del ala,
dónde finaliza en la forma de un ocelo oscuro. En los machos las alas posteriores son
de un gris oscuro difundido con escamas negruzcas a lo largo del margen costal y
venas; en las hembras las posteriores son gris claro, con similar difusión negruzca. En
ambos sexos los pelos marginales varían entre negro y gris. El abdomen dorsalmente
gris grafito y blanquecino, con las líneas longitudinalmente paralelas de color marrón.
La longitud promedio de las alas anteriores es de 7,2 mm en los machos y 10,6 mm en
las hembras. Presenta un dimorfismo sexual notorio, tanto en tamaño como en
coloración. Las hembras son visiblemente más grandes, en la mayoría de los casos de
color marrón claro brillante con un patrón de tres estigmas y una línea longitudinal muy
marcada. La longitud promedio observada fue de 12, 73 ± 1,20 mm en las hembras y
11,80 ± 0,75 mm en los machos. La hembra se reconoce a su vez por el abdomen
ligeramente abultado, debido al contenido de huevos y por la forma cónica del final por
la salida del huevo. El macho presenta un abdomen más corto y espatulado (Torres,
1989).
Los adultos permanecen durante el día escondidos entre las hojas de las plantas en el
campo y entre los tubérculos, sacos o huacales en el almacén. Cuando perciben cierta
luz y son perturbados, buscan esconderse rápidamente, observándose su vuelo
errático y corto. La mayor actividad de la polilla, específicamente la sexual, se observa
entre 5 y 6 a.m. La hembra, presenta un período de preoviposición promedio de 2,81 ±
1,28 días. El período de oviposición de 11,25 ± 3,60 días con un rango de 7 a 23 días,
observándose que 90% de los huevos son puestos en los siete primeros días, con un
pico máximo de oviposición entre el quinto y sexto día: El promedio de huevos puesto
por hembra /día de 23,80 ± 5,44 con rango de 1-107, siendo la fecundidad promedio de
la hembra de 209,4 ± 63,50 con rango de 86-279 huevos y con un porcentaje de
fertilidad de 94,7 %. La longevidad promedio de los adultos apareados es de 15,68 ±
3,71 días en los machos y 20 ± 4,11 días en las hembras. El ciclo total de T. solanivora
38
bajo condiciones de laboratorio a 15,53 °C y 65,58% de humedad relativa, fue en
promedio de 94,17 días. Sin embargo, a temperaturas más altas el ciclo es menor: se
observó que a 20°C el ciclo es de 55,3 días y de 41,7 días en promedio a 25°C de
temperatura constante. Por el contrario, a temperaturas más bajas el ciclo se alarga
(Torres, 1989).
4.6.
LA POLILLA GUATEMALTECA Y EL CULTIVO DE PAPA.
La polilla guatemalteca es originaria de Centro América y llegó a América del Sur en
1983 en una importación de semilla de papa hecha por Venezuela, la cual fue
sembrada en la zona papera del estado de Táchira en límites con Colombia,
Posteriormente se reportó en 1985 en el municipio de Chitagá. Dicho municipio es el
principal productor de papa de la región Nororiental colombiana, además de ser el
principal productor de semilla para los Santanderes, motivo por el cual su diseminación
fue muy rápida en esta área. En 1990 fue reportada en el altiplano Cundiboyasence a
donde posiblemente fue llevada en sacos de fique usados por los comerciantes para el
empacado de semilla, luego apareció en Antioquia, Nariño y el vecino país de Ecuador
mediante la comercialización de semilla (CORPOICA, 1999).
Figura 8. Dispersión geográfica de la polilla guatemalteca en el período comprendido
entre 1973 y 1996.
Fuente: ICA, FEDEPAPA 1998.
39
Tecia solanivora es considerada una de las principales plagas del cultivo de la papa en
Colombia. En cerca de once años logró dispersarse por las zonas productoras de papa
causando pérdidas económicas anuales superiores al 20% en los departamentos de
Norte de Santander, Boyacá, Cundinamarca, Antioquia y Nariño (CORPOICA, 2006).
El daño económico lo causa la larva, la cual, una vez que eclosiona se orienta hacia el
tubérculo, raspa su superficie y penetra debajo de la epidermis y luego barrena más
profundamente hasta formar galerías dentro del tubérculo. El ataque puede ocurrir
tanto en campo como en almacén, constituyendo en este último caso un verdadero
problema para los agricultores. Las pérdidas oscilan entre un 20-50% en los países
centroamericanos y puede llegar al 100% si no se ejerce ninguna acción de control
(Alvarado et al 1992-1993).
4.7.
RESISTENCIA DE LAS PLANTAS A LOS INSECTOS.
En el sentido más amplio, resistencia de la planta es definida por Teetes (1996) como
“la consecuencia de las cualidades heredables de la planta que resultan en que una
planta sea relativamente menos dañada que una planta sin esas cualidades” (Plant
Resistance to Insects: A Fundamental Component of IPM. Recuperado de
http://ipmworld.umn.edu/chapters/teetes.htm). En términos agrícolas prácticos, un
cultivar de un cultivo resistente a un insecto es uno que rinde más que un cultivar
susceptible cuando se enfrenta a la invasión de un insecto plaga. La resistencia de las
plantas es relativa y se basa en la comparación con plantas que carecen de los
caracteres de resistencia, es decir, las plantas susceptibles (Teetes, 1996). Plantas e
insectos llevan alrededor de 350 millones de años coexistiendo, durante este gran
lapso de tiempo han desarrollado diferentes tipos de interacciones (Gatehouse, 2002).
Las interacciones incluyen casos benéficos para las plantas como la polinización y
dispersión de semillas, pero otras veces son perjudiciales cuando las plantas son
atacadas por insectos herbívoros (Dicke y Van Poecke, 2002). Una manera sencilla
que la plantas utilizan para evitar ser comidas es ser tóxicas o menos palatables
40
(Pasteels, 2007). De esta forma las plantas han logrado desarrollar un extenso conjunto
de defensas químicas que son
efectivas
reduciendo drásticamente el ataque de
insectos, enfermedades y plagas en general. La activación de respuestas de defensa
específicas requieren reconocimiento eficiente del agresor, conversión de la señal
percibida y transmisión de estas señales, para dar lugar al comienzo de reacciones
apropiadas contra el enemigo (Walling, 2009).
Las estrategias que las plantas han desarrollado para defenderse ellas mismas contra
insectos fitófagos y nemátodos incluyen: las defensas que están constitutivamente
presentes como barreras físicas, y por medio de mecanismos de defensa que son
inducidos en el ataque como fitoquímicos ( Van Poecke, 2002).La defensa inducida
contra insectos herbívoros se activa al empezar el ataque y consta de dos
componentes: la defensa directa, con la producción de químicos que actúan como
toxinas o disuasorias para la alimentación (Kessler & Baldwin, 2002), y la defensa
indirecta, con la producción de una mezcla de volátiles que atraen a los enemigos
carnívoros de los herbívoros (Takabayashi y Dicke, 1996).
4.8.
MARCADOR GENÉTICO.
Inicialmente los mapas genéticos consistían en una representación gráfica de la
ordenación y ubicación de los genes en cada cromosoma. Sin embargo actualmente se
incluyen en estos mapas no solo genes, sino otras regiones del DNA, de modo que
para englobar a ambos se emplea el término marcador genético; el papel de marcador
genético puede desempeñarlo cualquier característica física o molecular del ADN que
difiera entre individuos y sea detectable en el laboratorio para poder seguir su patrón de
herencia como marcadores genéticos , por tanto, se incluyen tanto regiones que forman
parte de un gen (marcadores génicos) como segmentos no codificantes (marcadores
no génicos). La gran mayoría de marcadores genéticos en los mapas actuales son
marcadores no génicos (Luque & Herraez, 2001).
41
Blanco et al (2007) definen un marcador genético como una secuencia de ADN con un
componente variable que permite identificar diferencias entre individuos y que puede
ser localizado en una posición concreta del genoma. Al componente variable de los
marcadores genéticos se le denomina polimorfismo. A cada una de las variantes de un
marcador genético se le llama alelo. Cuando un individuo tiene dos alelos iguales se
dice que es homocigoto para ese marcador genético y cuando tiene dos alelos
diferentes se dice que es heterocigoto.
Existen tres tipos de marcadores genéticos: Los primeros son los marcadores
morfológicos, el primer tipo de marcadores que fueron utilizados. Se consideran
marcadores morfológicos a los caracteres de un individuo que se expresan en un
ambiente específico y que se identifican, generalmente para estimar la variación
morfológica existente en una población. Sin embargo, hay varias limitaciones para su
uso, entre ellas la influencia del ambiente en que se desarrollan y que solo se pueden
identificar y medir en individuos completos o adultos Universidad Veracruzana (2005).
El segundo, según Collard et al (2005) citado por Ospina, (2008) se refiere a los
marcadores bioquímicos, los cuales incluyen variantes alélicas o enzimas llamadas
isoenzimas, que son detectadas por la diferencia en carga eléctricas mediante
electroforesis y el tercer tipo son los marcadores ADN, los cuales revelan sitios en la
variación del ADN. Un marcador molecular, entonces, es cualquier fenotipo molecular
originado de la expresión de un gen o de segmentos específicos de ADN que puede
ser detectado y heredado.
La desventaja de los marcadores morfológicos y
bioquímicos es que se encuentran limitados por la influencia de factores ambientales o
por el estado de desarrollo de la planta.
4.9.
MARCADORES MOLECULARES.
Los marcadores moleculares están constituidos por fragmentos de ADN de diferentes
tamaños, pueden ir desde pequeñas secuencias hasta grandes segmentos que pueden
contener algún gen, aunque no es relevante que contengan o no secuencias
42
codificantes (Cubero, 2003). Las principales ventajas de este tipo de marcadores con
respecto a los otros son:

Se pueden detectar variaciones con mínimas cantidades de material.

Pueden detectarse en cualquier estado de desarrollo, incluyendo el mismo
embrión.

Se distribuye a lo largo de todo el genoma. Esta característica es muy importante
para facilitar la construcción de mapas.

Entre estos marcadores los hay de carácter dominante y codominante.

No presentan epistasis ni pleitropía.

El número de variaciones entre individuos o polimorfismo es enorme.
La principal desventaja radica en el elevado costo dado que se requieren equipos de
laboratorio complejos y reactivos costosos. Los principales marcadores moleculares
son los siguientes: RFLP (Restriction Fragments length polymorphism), RAPD
(Random
Amplified
Polimorphic
DNA),
AFLP
(Amplified
Fragment
length
polymorphism), SCAR (Sequence Characterised Amplified Region), SST (Sequence
Tagged Sites), microsatélites: STMS (Sequence Tagged Microsatellite Sites) y SSR
(Short sequence Repeats) (Cubero, 2003).
Los marcadores de ADN revelan diferencias entre individuos de la misma especie o de
diferentes especies; estos marcadores son llamados polimórficos, mientras que
aquellos que no discriminan entre genotipos se denominan monomórficos. Los
marcadores polimórficos pueden ser codominantes o dominantes. Los marcadores
codominantes son aquellos que discriminan los homocigotos y heterocigotos mientras
que los dominantes no discriminan (Collard et al, (2005) citado por Ospina, (2008)).
4.10. MICROSATÉLITES O SSR (SHORT SEQUENCE REPEATS).
Se basan en ADN, generalmente de un máximo de 100 pares de bases, formado por
secuencias repetidas de di a penta nucleótidos, por ejemplo (CA)8, (TCC)5 o (GACA)4.
43
Una vez localizados tales secuencias cortas de ADN, que son frecuentes en el
genoma, se secuencian las zonas que las flanquean y se construyen, a partir de estas,
cebadores que debido a los extremos serán de secuencia única, y debido al fragmento
repetido entre ellos, podrán aparearse a numerosos puntos del genoma, generando
innumerables loci. Los alelos de un mismo locus son secuencias con distinto número
de copias del motivo (GA, CAC, ATC, etc.) repetido; la combinación de numerosos loci
con innumerables alelos hace que el total de microsatélites sea ilimitado. El número de
polimorfismos a que dan lugar es muy elevado con ventajas sobre RAPD y AFLP: son
codominantes, de alta reproducibilidad y dan lugar a puntos fijos de mapa. Son ideales
para la identificación varietal (Cubero, 2003).
Los microsatélites además de ser extremadamente polimórficos (variables entre los
individuos) poseen una herencia mendeliana simple. Esto significa que para cada locus
todo individuo posee dos alelos, uno heredado de la madre y otro del padre. Los
descubridores de esta metodología consideraron que estos patrones serían
prácticamente específicos para cada individuo y los denominaron DNA fingerprint huella digital de ADN- (Gisbert, 2005). Debido a que los SSRs pueden diferir en unos
pocos pares de bases, el producto amplificado debe ser corrido usualmente en
poliacrilamida de alta resolución (Ospina, 2008).
4.11. ESTADO DEL ARTE.
Como ya se mencionó, el cultivo de la papa es de gran importancia y los cultivares son
atacados por diversos patógenos que elevan el costo de producción y causan
importantes pérdidas. Debido a que la mayoría de los rasgos deseables en un cultivar como producción, calidad y resistencia a enfermedades-, son controlados por genes
que pueden asociarse a marcadores moleculares, los Centros de investigación y
mejoradores de cultivos están utilizando estos marcadores en sus procesos de
selección de cultivares mejorados y élite (Collard et al, 2005).
44
En papa, al igual que en el resto de la plantas, la resistencia genética a patógenos
puede ser de dos tipos: la de hipersensibilidad (también llamada cualitativa,
monogénica ó vertical) es controlada por uno o unos pocos genes, por lo cual su acción
es muy específica y determina una clara incompatibilidad entre el hospedero y el
patógeno. Esto hace que la duración de la reacción incompatible sea limitada, por
cuanto se genera una presión de selección hacia genes de virulencia en el patógeno
que necesita sobrevivir y la resistencia es vencida cuando aparece o se selecciona
entre las existentes, una raza del patógeno que no encuentra barreras para
establecerse y alcanzar poblaciones altas. Este tipo de resistencia no es afectada por
condiciones ambientales por lo que su manifestación es plena y además es muy fácil
de incorporar a programas comunes de mejoramiento, por lo que es ampliamente
utilizada en estos procesos (Ospina, 2005).
En la resistencia horizontal, también llamada resistencia de campo, es un grupo de
genes los que rigen esta característica y por eso se le llama también resistencia
poligénica; el conjunto de genes participantes rigen diversos procesos fisiológicos en la
planta. Esto previene la pérdida de resistencia ya que el patógeno puede mutar uno o
varios genes al tiempo pero no todos a la vez, razón por la cual la RH es muy duradera.
Entre más rústica sea una variedad mayor es la RH, posiblemente desarrollada en un
proceso evolutivo de la planta, expuesta a muchos genotipos del patógeno. Cuando
una planta se somete a prolongados procesos de mejoramiento la RH se erosiona en
los cruces y retrocruces, conforme se estrecha la base genética. La RH confiere
resistencia contra todas las razas de un patógeno determinado permitiendo niveles de
daños muy leves que no amenazan la “convivencia” del hospedero y el patógeno,
lográndose así una menor presión de selección hacia nuevas razas. Las plantas con
resistencia RH pueden presentar lesiones pequeñas, poco inóculo, ciclos más largos,
etc., características que influyen directamente sobre la posibilidad de que la
enfermedad llegue a la categoría de epifitia. La RH es más influenciada por las
condiciones ambientales que pueden retardar o activar los genes según el estímulo
externo que reciba la planta. Desde el punto de vista genético este tipo de resistencia
es muy difícil de incorporar en variedades comerciales debido al gran número de genes
45
involucrados (Rivera, 1999). En papa se ha encontrado que 18 QTL contribuyen a
resistencia cuantitativa, aunque en cada caso solo actúan entre uno y cuatro QTL
(Mosquera et al, 2008).
En papa se han mapeado 20 genes de resistencia a virus, nematodos y oomicetos,
utilizando marcadores moleculares. La mayoría de estos genes R fueron introducidos
de especies silvestres. Otros genes de resistencia al nematodo de la agalla de la raíz,
Globodera pallida, patotipos Pa2 y Pa3, de S. spegazinii han sido y el gen R MC1, que
confiere resistencia a Meloidogyne chitwoodi, se localizó en el cromosoma XI. De los
20 genes R mapeados, catorce se encuentran en hot-spots para resistencia. Gebhardt
y Valkonen (2001) observaron que muchos genes R están organizados en clústeres de
genes de resistencia y que confieren resistencia a varios patógenos. A la fecha se han
identificado cinco clusters de resistencia:
• Los genes R1 (P. infestans), Rx2 y Nb (PVX), en la región proximal en el cromosoma
V.
• Los genes H1 y GroV1 (G. rostochiensis), en el brazo largo del cromosoma V.
• Los genes R3, R6, y R7 (P. infestans), en el brazo corto posición distal del
cromosoma XI.
• Los genes Ryadg (PVY), Naadg (PVA), RMcl (M. chitwoodi) y Sen1 (Synchytrium
endobioticum), en el brazo corto posición distal de cromosoma XI.
• Los genes Rx1 (PVX) y Gpa2 (G. pallida) (Gebhardt y Valkonen, 2001), en el brazo
largo posición distal del cromosoma XII. (Mosquera et al, 2008).
4.12. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTOS EN LAS ACCESIONES OBJETO DE
ESTUDIO.
4.12.1.
Diversidad genética. Es la variación de los genes dentro de cada especie
y representa la variación heredable dentro y entre poblaciones de organismos.
46
Depende de las variaciones en la sucesión de los cuatro pares de bases nitrogenadas
que se constituyen el código genético induciendo así variaciones proteicas que pueden
derivar en cambios bioquímicos, morfológicos o de comportamiento que causan
diferencias en la tasa reproductiva, sobrevivencia o comportamiento individual
(Bioética, 2005)
La diversidad genética comprende la variación de los genes dentro de las especies
vivas. Cada ser vivo pertenece a una especie en particular, y una especie tiene muchos
individuos, que se diferencian genéticamente entre sí. La diversidad genética es
fundamental para que las especies se puedan adaptar a los cambios que ocurren en el
ambiente a través del tiempo (por ejemplo, en respuesta al enfriamiento de la Tierra
durante las épocas glaciares del pasado). Incluye a la variedad que existe dentro de
determinadas poblaciones de cada especie, como se observa en las muchas
variedades tradicionales de maíz que hay en los campos rurales de Mesoamérica, o en
los múltiples individuos de pino (Pinus occidentalis) en los bosques de coníferas de las
montañas de la República Dominicana. También cubre la variación genética de una
sola población como en el caso de una especie endémica conocida de un solo lugar.
La diversidad genética puede ser muy alta para una especie con amplia distribución en
un país continental como México o Brasil, mientras que tiende a ser muy baja en una
especie endémica, aislada en una isla de las Antillas Menores. Jardines botánicos y
otras colecciones ex situ como bancos de semillas también utilizan cada vez más las
medidas de diversidad genética para conocer la variedad biológica en sus colecciones
de especies raras, útiles, claves y amenazadas. (Kappelle, M. 2009).
La diversidad genética es típicamente descrita usando polimorfismos, promedios de
heterocigosidad y diversidad alélica (Frankham et al., 2004 en (Cusba, 2010)).
4.12.2.
Heterocigosidad. La medida que, probablemente, sea más útil para
estimar la diversidad genética dentro de una población es la heterocigosidad (H), que
47
se define como el porcentaje promedio de loci heterocigóticos por individuo (o de
manera equivalente, el porcentaje medio de individuos heterocigóticos por locus).
4.12.3.
Índice de Shannon y Wiener. Este índice, se usa en ecología u otras
ciencias similares para medir la biodiversidad. Este índice se representa normalmente
como H’ y se expresa con un número positivo, que en la mayoría de los ecosistemas
naturales varía entre 1 y 5. Excepcionalmente puede haber ecosistemas con valores
mayores (bosques tropicales, arrecifes de coral) o menores (algunas zonas desérticas)
(Ministerio del Interior y de Justicia, 2009).
La fórmula del índice de Shannon es la siguiente:
Donde:

S – número de especies (la riqueza de especies)

pi – proporción de individuos de la especie i respecto al total de individuos (es decir
la abundancia relativa de la especie. pi, se expresa de la siguiente manera:
48
Donde
ni – número de individuos de la especie i
N – número de todos los individuos de todas las especies
4.12.4.
Uniformidad. Es un indicador de lo uniformemente que están distribuidos
los genotipos dentro de una población. Un valor de 1 en la uniformidad indica que todos
los genotipos tienen la misma frecuencia. (Brussel, 2009) La uniformidad se calcula
como:
4.13. OBTENCIÓN HÍBRIDOS DE SOLANUM TUBEROSUM.
En documento de la UNAD (2004):
“Cuando el cruzamiento es factible, los híbridos suelen mostrar mayor
vigor que los parentales, es decir que la hibridación se utiliza para
aprovechar la heterosis mejor que cualquiera de los métodos de mejora
utilizados hasta ahora, lo que da lugar a un mayor rendimiento” (p. 40)
Teniendo en cuenta lo anterior y en concordancia con el tercer objetivo específico de
este trabajo, se seleccionaron los materiales que presentaron un mayor contraste a
nivel genético y se hicieron cruces recíprocos entre ellos para obtener semilla F1.
49
4.13.1.
Ventajas de los cruces entre tetraploides. No es recomendable hacer
cruces entre especies tetraploides debido a que la mayoría de ellas no puede ser
usada en cruzamientos directos, ya que por lo general las semillas presentan un
desarrollo anormal del endospermo (International Potato Center, 1990) dificultando el
desarrollo del embrión en medios naturales; sin embargo actualmente se puede recurrir
a técnicas como el cultivo in vitro tanto para germinar las semillas de la F1 como para
propagar las plántulas de interés y dado que la papa se propaga comercialmente como
tubérculo el cuello de botella se puede superar fácilmente y, al usar tetraploides no se
perdería la mitad de la información genética –como ocurre cuando se hacen cruces con
haploides obtenidos por cultivo de anteras- sino que se conservaría en su totalidad, lo
cual daría como resultado mayor diversidad en la F1, ya que el nivel tetrasómico se
considera de mayor potencialidad productiva que el disómico, precisamente porque
puede albergar mayor diversidad genética por locus, lo cual genera la posibilidad de
promover respuestas heteróticas no alcanzables en un nivel de ploidía menor
(International Potato Center, 1990).
50
5.
5.1.
METODOLOGÍA: MATERIALES Y MÉTODOS.
LUGAR DE ESTUDIO.
Los análisis moleculares se realizaron en el Laboratorio de Genética Molecular Vegetal
del Centro de Biotecnología y Bioindustria- CBB de la Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria (Corpoica), Km 14 vía Mosquera.
5.2.
MATERIAL VEGETAL.
Las 48 muestras presuntamente resistentes se obtuvieron de la Colección Central
Colombiana, que según bioensayos previos presentaron algún grado de resistencia a la
polilla guatemalteca Tecia Solanivora, y dos materiales comerciales altamente
susceptibles correspondientes a Parda Pastusa y Diacol Capiro.
5.3.
EXTRACCIÓN DEL ADN.
Se tomaron hojas jóvenes disponibles de cada accesión, sin embargo de aquellas
accesiones de las que no se pudo obtener hojas jóvenes ni brotes se tomó cáscara de
tubérculo. La extracción del ADN se llevó a cabo mediante la técnica de fenolcloroformo modificada por CORPOICA en su “Protocolo de Extracción de ADN de
Especies Vegetales del Laboratorio de Genética Vegetal Molecular” CORPOICA
Tibaitatá. Código: IN-R-12. Versión: 1. Fecha de aprobación: 8/09/2009.
51
Tabla 2. Parte de la planta de donde se sacó la muestra para la extracción de ADN.
Registro
15060027
Parte de
Registro
Parte de
Registro
Parte de
donde se
donde se
donde se
sacó la
sacó la
sacó la
muestra
muestra
muestra
Hoja
15062152
Hoja
15062581
Hoja
Hoja
15062384
Hoja
Parda
Cáscara
15060121
Pastusa
15060191
Cáscara
15062387
Hoja
15061815
Hoja
15060303
Hoja
15062388
Hoja
15062060
Brote
15060907
Cáscara
15062391
Hoja
Diacol
Cáscara
capiro
15061202
Hoja
15062394
Hoja
15062500
Hoja
15061213
Cascara
15062395
Hoja
15062506
Hoja
15061235
Hoja
15062406
Hoja
15061648
Hoja
15061286
Hoja
15062407
Hoja
15061676
Hoja
15061287
Brote
15062419
Hoja
15062467
Hoja
15061290
Hoja
15062420
Hoja
15062497
Hoja
15061331
Hoja
15062427
Hoja
15062498
Hoja
15061333
Hoja
15062430
Hoja
15061604
Hoja
15061338
Hoja
15062443
Hoja
15061612
Hoja
15061340
Hoja
15062446
Hoja
15061630
Hoja
15061522
Hoja
15062453
Hoja
15062464
Hoja
15061539
Hoja
52
5.4.
CUANTIFICACIÓN DEL ADN.
La cuantificación se realizó en el espectrofotómetro del Laboratorio de Genética
Molecular Vegetal. Se seleccionaron los siguientes parámetros: ADN de doble cadena,
dilución 1:50 y rango λ 260-280. El blanco utilizado fue H2O desionizada y destilada.
Cada 10 muestras leídas se realizó un lavado con ddH 2O a la columna de cuarzo. Se
tomaron los datos de concentración en ng/µl y el Ratio de λ 280/260 los resultados se
muestran en el Anexo 1.
5.5.
DILUCIONES DE TRABAJO.
Una vez conocidas las concentraciones del ADN obtenido se procedió a realizar las
diluciones de trabajo, que según el protocolo del laboratorio para la amplificación de
microsatélites deben ser de 10ng/µl. Para hacer el cálculo se utilizó la información del
Anexo 1 y la fórmula V1C1=V2C2 y se preparó un volumen final de 100 µl completado
con dH2O, Tal como lo muestra el Anexo 2. Posteriormente se realizó la confirmación
visual de las diluciones en gel de agarosa al 2%.
5.6.
SELECCIÓN DE MICROSATÉLITES.
Se hizo una preselección de los microsátelites basándose en los 17 reportados por
Ospina (2008) que presentaron polimorfismos en Solanum phureja (Anexo 7) de éstos
sólo 7 presentaron polimorfismos en Solanum tuberosum y por lo tanto fueron los
seleccionados para buscar polimorfismos en las accesiones evaluadas en el presente
trabajo.
53
5.7.
CONDICIONES DE PCR.
Las condiciones de PCR para los 7 microsatélites se muestran en la Tabla 3 y fueron
iguales para los microsatélites evaluados, exceptuando la temperatura.
Tabla 3. Condiciones de PCR.
Reactivo
Concentración
Volumen
Concentración
Volumen
Volumen
1
1
2
2
para 52
tubos
Buffer
10X
2µ
1X
20 µl
104 µl
MgCl2
50X
1µ
2.5 mM
20 µl
52µl
dNTPs
10 mM
0.4µ
0.2 mM
20 µl
20.8µl
Cebador
5mM
2µ
0.5 mM
20 µl
104 µl
5mM
2µ
0.5mM
20 µl
104 µl
5U/µl
0.3µ
0.075 U/µl
20 µl
15.6 µl
-
7.3µ
-
20 µl
379.6
forward
Cebador
reverse
Taq
polimerasa
ddH2O
El volumen final de la reacción fue de20µl, para lo cual se agregaron 15µl del mix y 5µl
de ADN de interés a una concentración de 10ng/µl. El cálculo para el mix se realizó con
la fórmula V1C1=V2C2.
Las temperaturas a las cuales se trabajaron los microsatélites son las reportadas por
Ospina 2008 como se indica en la Tabla 4.
54
Tabla 4. Temperaturas a las que se trabajaron los microsatélites.
Marker
Secuencia primer
Tm (ºC)
STMS
F GCGTCAGCGATTTCAGTACTA
2022
R TTCAGTCAACTCCTGTTGCG
STMS
F ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA
1024
R TCAAAACCCAATTCAATCAAATC
STMS
F TACATACATACACACACGCG
0051
R CTGCAACTTATAGCCTCCA
STMS
F TCAGCTGAACGACCACTGTTC
3009
R GATTTCACCAAGCATGGAAGTC
STMS
F CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG
1049
R AGGGACTTTAATTTGTTGGACG
STMS
F AACTCTAGCAGTATTTGCTTCA
0038
R TTATTTAGCGTCAAATGCATA
STMS
F TCAGAACACCGAATGGAAAAC
3016
R GCTCCAACTTACTGGTCAAATCC
60
60
54
64
60
54
64
Estos marcadores, reportados por Milbourne et al (1998) y Ghislain et al (2006), fueron
previamente probados en Solanum phureja por Ospina (2008) en el laboratorio de
Genética Vegetal Molecular de CORPOICA. Para este estudio, se realizó un ensayo de
reproducibilidad de los resultados de amplificación haciendo tres repeticiones por cada
microsatélite evaluado.
Antes de correr las muestras en el gel de acrilamida se confirmaron los productos
amplificados por PCR en agarosa al 2% con Bromuro de Etidio.
55
5.8.
ELECTROFORESIS EN ACRILAMIDA.
Para la verificación del producto amplificado de SSR se realizó una electroforesis en
gel denaturante de poliacrilamida al 6% y 5M de urea, el cual tiene la ventaja de
poseer propiedades tales como trasparencia, elasticidad, porosidad controlable y
compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos que lo hace un
excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas. Los geles de
poliacrilamida son el resultado de la polimerización del monómero de acrilamida y la
bis-acrilamida (N-N´ Metil- bisacrilamida) en presencia de persulfato de amonio y la
tetrametiletiléndiamina (TEMED). El persulfato de amonio activa el TEMED, el cual a su
vez activa al monómero de acrilamida para que polimerice. Las cadenas de
poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bis-acrilamida, formándose así una red
de porosidad uniforme (Switzer, 1999).
5.9.
PREPARACIÓN DE LA ACRILAMIDA.
Se preparó inicialmente una solución de acrilamida al 30%, la cual contenía acrilamida
y N-N-Metil bis acrilamida en una relación de 19:1 respectivamente. La solución de
acrilamida al 6% 7M de urea se preparó adicionando 20ml de acrilamida al 30%; 42 gr
de urea y 20 ml de buffer TBE5X hasta completar un volumen de 100ml con agua
destilada desionizada.
5.10. LIMPIEZA Y ARMADO DE LA CÁMARA.
El lavado de los vidrios y la cámara de secuenciación Sequi-Gen 38x30 se realizó con
abundante agua y jabón líquido y luego se pusieron a escurrir. La cámara se limpió con
etanol al 70% tres veces dejando evaporar el exceso cada vez, luego se aplicó silicona
en espray y se esparció con una servilleta y se dejó secar. El vidrio se limpió con etanol
56
al 70% tres veces dejando evaporar el exceso cada vez, luego se le aplicó la solución
de pegado que contiene 1 ml de solución de ácido acético glacial 5% y etanol 95% y 1µ
de Bind Silane, se esparció sobre una cara del vidrio y se dejó secar, luego se retiró el
exceso con etanol al 70% y una servilleta limpia tres veces. Finalmente se armó la
cámara según las especificaciones de la misma.
5.11. PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA.
En un vaso de precipitado que contenía 60ml de poliacrilamida se adicionó 100 µl de
TEMED y 500 µl de persulfato de amonio 10% (p/v). La solución se sirvió en la
cámara cuidadosamente con una jeringa de 100 ml dejando un poco de la preparación
en el vaso de precipitado para confirmar la polimerización. Posteriormente se sirvieron
30 ml de Buffer de corrido TBE 0.5X precalentado en la cubeta inferior de la cámara y
aproximadamente 1500 ml del mismo en la cubeta del gel. Se retiró el peine y se
limpió el frente de corrido disparándole un chorro del mismo buffer con una jeringa
suavemente para no dañarlo, se limpió el peine y se procedió a colocarlo con los
dientes hacia el gel y que penetraran aproximadamente 1mm en el. Luego se realizó
otra limpieza similar a cada pozo y se procedió a sembrar el buffer de carga 2X (95%
de formamida, 0.05% de azul de bromofenol y 0.05% de xilene cyanol) en pozos
intercalados para verificar el estado de los mismos y se puso a correr la fuente de
poder a 80W por 15 minutos a una temperatura no superior a los 45°C. Una vez
verificado que la cámara estaba corriendo correctamente se procedió a sembrar las
muestras.
5.12. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.
A 20 µl de la muestra se le adicionaron 5µl del buffer de carga 2X. Las muestras se
denaturaron a 94°C en el termociclador durante 3 minutos y fueron transferidas al hielo
inmediatamente. Se sirvieron 2 µl de la muestra preparada de esta manera en cada
57
pozo y flanqueando cada extremo del gel se sembraron 2 µl de marcador de peso de
10pb. La duración de la electroforesis fue de 45 minutos aproximadamente bajo las
mismas condiciones de precorrido.
5.13. TINCIÓN DEL GEL.
Una vez terminada la electroforesis se procedió a retirar el vidrio con el gel de la
cámara de acrilamida y se realizó la tinción como de describe en la Tabla 5.
Tabla 5. Soluciones utilizadas en el proceso de tinción y tiempos de exposición del gel
a las mismas.
Solución
Fijadora
Tiempo
Composición
10 minutos
150 ml etanol absoluto
15 ml ácido acético
1335 ml ddH2O
Lavado de 1 minuto con ddH2O
Oxidación
3 minutos
22,5 ml ácido cítrico
1477,5 ml ddH2O
Lavado de 1 minuto con ddH2O
Nitrato de plata 20 minutos
3 gramos de Nitrato de plata
1.8 ml formaldehido
1500 ml ddH2O
Lavado de 10 segundos con ddH2O
Revelado
Hasta que aparezcan las bandas del 30 gramos carbonato de sodio.
Marcador de Peso Molecular.
540 ml formaldehido.
1000 ml ddH2O
Lavado de 1 minuto con ddH2O
58
Parada
4 minutos
75 ml ácido acético
1425 ml ddH2O
Lavado de 1 minuto con ddH2O
Se dejó secar el gel de un día para otro y se procedió a registrar las imágenes en un
escáner HP ScanJet XPA en formato .JPEG para ser analizadas posteriormente.
5.14. DETERMINACION DEL PESO DE LAS BANDAS CON GENETOOLS.
Para determinar el peso molecular de las bandas se comparó la movilidad de éstas en
el gel de acrilamida con el marcador de peso molecular de 10 pares de bases de DNA
Ladder de INVITROGEN, al cual se le asignó el peso molecular en su carril
correspondiente y por comparación el programa de Genetools determinó el peso de
todas las bandas presentes.
5.15. OBTENCIÓN DE LA MATRIZ DE DATOS BINARIA.
Una vez conocidos los pesos de las bandas se seleccionaron aquellas que presentaron
una mejor definición en el gel y que fueron reproducibles en las 3 repeticiones. Una vez
determinadas las bandas de interés se procedió a organizar los datos en una matriz
binaria donde 1 es presencia y 0 es ausencia. Los datos faltantes se consignaron como
333 según las especificaciones del programa. En las columnas se ubicaron a los alelos
y las accesiones en las filas.
5.16. ANÁLISIS DE CONGLOMERADOS.
Se procedió a utilizar los datos ingresados en el NTedit como datos de entrada y se
abrieron por medio del programa NTSYSpc 2.1 y se analizaron bajo los siguientes
parámetros:
59
SimQual: NTSYSpc 2.11L, (C) 2000-2002, Applied Biostatistics Inc.
Input parameters
Read
input
from
file:
C:\Users\Desktop\TESIS
MARCELA\NTSYS\Datos
completos\Matriz de datos completa .NTS
Compute by: cols
Save results in output file: coeficiente de jaccard.NTS
Coefficient: J
Positive: 1.0000
Negative: 0.0000
Matrix type = 1, size = 27 by 50, missing value code = 333 (rectangular)
Dis/Similarity matrix (50 by 50) saved in file: coeficiente de jaccard.NTS
Para obtener el dendrograma se utilizaron los datos obtenidos y se corrieron con el
programa NTSYSpc 2.1 en el sub-menú CLUSTERING. Los parámetros para analizar
los datos fueron los siguientes:
SAHN: NTSYSpc 2.11L, (C) 2000-2002, Applied Biostatistics Inc.
---------------------------------------Input parameters
Read input from file: C:\Users\Rodrigo Ivan\Desktop\TESIS MARCELA\NTSYS\Datos
completos\coeficiente de jaccard.NTS
Save result tree in output file: Dendograma.NTS
Clustering method: UPGMA
In case of ties: WARN
Comments:
SIMQUAL: input=C:\Users\Rodrigo Ivan\Desktop\TESIS MARCELA\NTSYS\Datos
completos\Matriz de datos completa .NTS, coeff=J
60
by Cols, += 1.00000, -= 0.00000
Matrix type = 3, size = 50 by 50, missing value code = "none" (similarity)
Results will be stored in file: Dendograma.NTS
** Warning - at least one tie found that can influence clustering **
5.17. ANÁLISIS DE AGRUPAMIENTOS EN LAS ACCESIONES OBJETO DE
ESTUDIO.
Se utilizó el software ATetra-Version 1.2a, diseñado específicamente para analizar los
datos de microsatélites que se obtengan a partir de especies o de especies
autotetraploides o alotetraploides con patrones de herencia inciertos o desconocidos.
Se calculó la heterocigosidad esperada, la heterocigosidad esperada corregida por
tamaño de la muestra, la diversidad de Shannon-Wiener y la uniformidad.
5.18. CRUZAMIENTO.
Para cumplir con el tercer objetivo de este trabajo se realiza el cruzamiento entre las
variedades Diacol capiro y la accesión 15060303, con el fin de confirmar si es posible el
cruce sexual entre dos papas tetraploides sin hacerla pasar por estado diploide y
evaluar la viabilidad de las semillas producidas. El material para los cruces fue cedido
por el Laboratorio de Manejo Integrado de Plagas que mantenían el material vegetal en
la casa de malla de CORPOICA. De acuerdo con el objetivo se realizaron cruces
recíprocos entre la Parda Pastusa susceptible y la accesión N° 15060303 resistente.
5.19. OBTENCIÓN DEL POLEN Y CONSERVACION.
Para obtener el polen se cortaron 15 flores por cada accesión. Se tuvo especial
cuidado en escoger aquellas que tenían anteras maduras y bien formadas. Se pusieron
61
en bolsas plásticas, se etiquetaron y posteriormente se llevaron al laboratorio donde se
les extrajo el polen por agitación con la ayuda de una aguja de disección. El polen se
recogió en papel aluminio,
luego se guardó en un tubo eppendorf de 150 ml. Se
etiquetó y se llevó a congelación a -20°C hasta su utilización.
5.20. SELECCIÓN DE LA FLOR RECEPTORA.
Se escogieron flores que aún no estaban abiertas. Se les retiró parte de la corola y se
emascularon. Luego se sumergió el pistilo en un beaker con agua oxigenada para
determinar si estaba o no receptiva: si se producían burbujas se consideraba receptiva
y se seguía con el siguiente paso, si no se producían burbujas se eliminaba (Keans &
D.W, 1993).
Figura 9. Flor sin corola.
Se pueden observar los
estambres inmaduros aún.
Fuente: El Autor.
Figura 10. Flor emasculada para
facilitar la polinización artificial y
evitar autofecundación.
Fuente: El Autor.
5.21. POLINIZACIÓN
Cuando se seleccionaba una flor receptiva se polinizaba introduciendo el pistilo dentro
del tubo eppendorf con el polen hasta que quedaba completamente cubierto y luego se
realizó un suave masaje con la aguja de disección. Los primeros cruces se cubrieron
62
con bolsas de parafina, posteriormente se protegieron con bolsas de tul para evitar la
humedad excesiva.
Figura 11. Cruce cubierto con bolsa de tul y debidamente etiquetado.
Fuente: El Autor.
5.22. OBTENCIÓN DE LA SEMILLA.
Durante todo el proceso se mantuvieron cubiertos los cruces, al comienzo para
protegerlos y garantizar que no recibieran aportes de polen de otras flores y una vez
formados los frutos para evitar que cayeran al piso y se confundieran.
5.23. GERMINACIÓN IN VITRO DE LA SEMILLA OBTENIDA.
Debido al éxito en la obtención de la semilla se prosiguió con la germinación in vitro, la
cual se llevó a cabo en las instalaciones del laboratorio de Cultivo de tejidos Vegetales
de CORPOICA Tibaitatá. Las semillas obtenidas se desinfectaron en una solución de
hipoclorito de cloro al 0,5% durante 10 minutos y se lavaron con ddH2O tres veces y
luego se realizó un lavado con alcohol al 70 % durante 30 segundos seguidos por tres
lavados con ddH2O. Posteriormente se sembraron en medio M&S modificado. Los
63
procesos de desinfección y siembra se llevaron a cabo íntegramente dentro de la
cámara de flujo laminar para evitar la contaminación dentro de los medios.
Posteriormente se rotularon y se mantuvieron en la oscuridad durante 30 días.
5.24. PROPAGACIÓN IN VITRO.
Con el fin de aumentar el número de individuos por cruzamiento se realizó la
propagación de cada planta derivada de cada semilla, cuando las plantas alcanzaron
un tamaño aproximado de 4 cm. El proceso consistió en retirar las raíces y dejar
explantes de aproximadamente 1cm y sembrarlos teniendo en cuenta la dominancia
apical. Nuevamente se sembraron en medio M&S pero esta vez no se dejaron en la
oscuridad sino con el fotoperiodo que maneja el laboratorio de Cultivo de tejidos
Vegetales de CORPOICA Tibaitatá.
64
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
6.1.
EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ADN.
Según la confirmación visual en agarosa, todas las muestras mostraron buena cantidad
y calidad de ADN, lo cual concuerda perfectamente con el resultado obtenido en la
cuantificación por espectrofotometría tal como se muestra en la Tabla 6. Aunque el
protocolo de extracción utilizado es para muestras de hojas jóvenes, también funcionó
para muestras de brotes y cáscaras de tubérculo, confirmando lo dicho por Cubero
(2003) quien afirma que se puede trabajar con microsatélites incluso con poca cantidad
de material genético, aunque los mejores resultados respecto a la cantidad y calidad
del ADN se obtuvieron con muestras de hojas jóvenes, como era esperado.
Figura 12. Visualización de la concentración de ADN extraído en Gel de Agarosa al
2%.
Fuente: El Autor.
65
Tabla 6. Concentración y pureza de las muestras de ADN extraído.
Muestra
Concentraci
Rati
Explant
ón
o
e
Muestra
ng/µl
1506002
1486.2
7
1506012
1
1506019
1.80
Hoja
1.78
Hoja
2101.4
370.61
1181.9
544.65
726.58
1078.7
725.27
1429.0
1.73
Hoja
Hoja
8
1295.7
1.59
1.68
1.76
1.75
1.77
1349.8
1.77
1.78
1506239
Cáscara 1506240
1364.3
Hoja
1506240
1185.9
1506241
1335.7
1506242
1381.6
1506242
1727.7
1506243
1146.3
1506244
66
1.75
Hoja
1.78
Hoja
1.75
Hoja
1.71
Hoja
2
1497.4
1.75
Hoja
6
1638.6
1.78
Hoja
0
1521.0
1.73
Hoja
0
1573.6
0
Hoja
Hoja
0
7
Hoja
1.77
5
0
Hoja
Hoja
5
9
Brote
1.77
6
7
Hoja
Hoja
2
6
1
1065.3
1506239
1.71
3
5
6
1
5061333
1.79
708.86
4
7
0
1506133
1506238
Cascara 1506239
2
7
1506129
1.58
4
6
1506128
e
1
5
5
1506128
Hoja
0
3
1506123
1.71
7
2
1506121
1506238
1631 Cáscara 1506238
4
7
1506120
o
8
3
1506090
ón
7
1
1506030
Explant
4
8
343.61
Rati
ng/µl
4
2107.2
Concentraci
1.81
Hoja
5
1175.5
1.76
Hoja
3
2
1506133
908.24
8
1506134
1161.1
2017.5
Hoja
1.77
1509.8
1.78
1506245
Hoja
1506246
Hoja
1506246
Concentraci
Rati
Explant
ón
o
e
1299.3
4
1506161
Muestra
2
1506163
0
1506164
1023.3
1447.0
5
1506206
2
Hoja
670.13
1.75
Hoja
Hoja
1.73
Hoja
3
1206.8
1.56
Hoja
6
Concentraci
Rati
Explant
ón
o
e
1.75
1.74
1.76
1.72
1.77
1506249
1.63
Hoja
1386.7
1506249
8
805.04
1506250
Hoja
1506250
1347.6
1506258
1410.6
Parda
2096.7
Diacol
capiro
Hoja
8
67
Hoja
1.79
Hoja
1.79
Hoja
2
664.22
Pastusa
Brote
1.73
6
1
Hoja
Hoja
2
6
Hoja
1.04
0
0
3
1354.4
1724.4
8
4
0
1506215
1.70
6
1618.8
1.68
9
7
0
6
1506181
Hoja
3
8
1506167
1.64
8
1446.2
Hoja
ng/µl
2
672.87
1387.1
7
4
1.78
2
4
ng/µl
1506160
2445.4
3
1
9
Muestra
1.77
1506244
6
1
2
1506153
Hoja
2
0
1506152
1.76
0
1.39
Cascara
5
684.3
1,38
2
Cascara
)LJXUD3URPHGLRGH$'1REWHQLGRVHJ~QODSDUWHGHODSODQWDGHGRQGHVHUHDOL]y
ODH[WUDFFLyQ
)XHQWH(O$XWRU
)LJXUD3URPHGLRGHO5DWLR2'VHJ~QODSDUWHGHODKRMDGHGRQGHVH
UHDOL]yODH[WUDFFLyQ
)XHQWH(O$XWRU
Como se puede observar en la Figura 14 la calidad del ADN está relacionada con la
edad del tejido de la que ha sido extraído, se puede ver que tejidos jóvenes - hojas- y
en desarrollo –brotes- el Ratio OD 260/290 tiene un valor por encima de 1,7 rango que
es aceptado como indicador de una alta pureza y fiabilidad para su posterior análisis.
Valores por debajo de 1,5 o encima de 2.0 indican que el ADN está contaminado y su
análisis podría inducir a errores (Vitagenes, 2012). En contraste se observa que el
valor del Ratio para las muestras extraídas de cáscara de los tubérculos se aproxima a
1,5, probablemente debido a la presencia de otras sustancias como el almidón. Como
regla general un buen método de extracción debe mantener la integridad física y
bioquímica del ADN e incrementar sus rangos de pureza y concentración (Rocha,
2002).
6.2.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR.
Los siete marcadores utilizados amplificaron en los 50 individuos evaluados,
independientemente del tejido de de donde se extrajo el ADN. Y se encontró que la
reacción de amplificación funcionó mejor en los tubos eppendorf que en placas de 96
pozos al evitar la evaporación de las muestras, lo que implica ahorro de tiempo y
reactivos.
Figura 15. Confirmación visual en Agarosa de la amplificación por
Microsatélite STMS 1024.
Fuente: El Autor.
69
PCR del
M= Marcador de peso 1KB. L11= Control positivo. C- = Control negativo. 22, 42, 52 y
56 corresponden a las muestras experimentales15061340, 15062419, 15062498 y
parda pastusa. El marcador de peso en esta ocasión se usa como control positivo para
comprobar que la agarosa y la cámara de corrido estén funcionando de manera
adecuada.
6.3.
ELECTROFORESIS EN ACRILAMIDA.
Las condiciones en las que se utilizó la acrilamida sirvieron para separar las bandas
amplificadas según su peso, incluso cuando las diferencias entre ellas fueran de menos
de 10 pares de bases, confirmando que los geles de poliacrilamida en vertical son el
método de elección más efectivo en la separación de pequeños fragmentos de ADN
desde 5 a 500 pb, los resultados de pesos de bandas se pueden observar en el Anexo
6.
En las indicaciones de uso de la cámara de electroforesis se recomienda retirar el
exceso de silicona de la cámara con tres limpiezas con alcohol al 70%, pero se
presentaban problemas de contaminación con Bind xilane por lo que se decidió no
retirar la silicona de la cámara de electroforesis y funcionó bien en varios aspectos: no
interfirió con el proceso de corrido;
el gel no se pegó a la cámara quedando
íntegramente adherido al vidrio y como consecuencia la cámara se podía utilizar con
mayor frecuencia porque no se necesitaba el proceso de descontaminación que dura
24 horas y se ahorra en reactivos de limpieza.
70
Figura 16. Imagen de PCR corrida en gel de poliacrilamida. Microsatélite STMS 2022.
M= Marcador de peso de 10 pb.; C+= Control positivo y C-= Control negativo.
Fuente: El Autor.
6.4.
DETERMINACIÓN Y PESO DE LAS BANDAS.
Para seleccionar los alelos se tomaron en cuenta factores como la reproducibilidad y
nitidez de las bandas. De los 7 SSRs se obtuvieron en total 27 alelos, lo cual arroja un
promedio de 3.85 alelos por locus a diferencia de los 9,86 encontrados por (Pérez,
2004), algunos marcadores arrojaron 6 ó más bandas pero sólo se tomaron en cuenta
las bandas con las mejores cualidades de reproducibilidad y lectura, además “el
número de alelos va a ser dependiente de la cantidad de individuos analizados, puesto
que aumenta la probabilidad de encontrar nuevos alelos que pudieran estar en una
frecuencia más bajas detro de una población” Pérez (2004), el promedio bajo de lelos
por locus también puede deberse a la intervención antropogénica, ya que como es un
cultivo de interés comercial la propagación es clonal por medio de tubérculos semilla. El
peso de las bandas osciló entre 62 y 190 pares de bases –ver el Anexo 6-, fragmentos
considerados pequeños en comparación con trabajos similares, como el de (Orona,
2006) donde los fragmentos oscilaban entre 150 a 850 pares de bases.
71
6.5.
ANÁLISIS CON NTSYS PC 2.1.
Los datos se introdujeron en el NTedit y luego se abrieron con el programa NTSYSpc
2.1 y se analizaron bajo los parámetros ya mencionados en la metodología: La tabla de
resultados se encuentran en el Anexo 4 y el dendrograma obtenido se puede apreciar
en la Figura 17.
Como se puede apreciar en el dendograma, los marcadores utilizados en este trabajo
diferenciaron a 48 de los 50 individuos tratados cumpliendo así con el primer objetivo
específico de este trabajo, solo las accesiones 15062152 y 15062384 aparecen con
una similaridad del 100%, lo cual puede indicar una de tres posibilidades: que por error
humano sean una misma muestra marcada con códigos diferentes, que sean diferentes
accesiones pero que falten descriptores para diferenciarlas o que sean clones pero que
muestren diferencias en su fenotipo.
Las cincuenta accesiones tenidas en cuenta para este estudio se agruparon en siete
diferentes grupos, de los cuales sólo uno es homogéneo de la sub-especie Solanum
tuberosum ssp. andigena, el resto son heterogéneos; esto puede deberse a que existe
correlación entre sus ancestros y refleja afinidad en su pedigrí (Demeke et al,1996). La
variabilidad entre las accesiones es baja, si bien es lógico concluir que este resultado
se debe a que la papa es un cultivo de propagación mayormente clonal y por lo tanto la
variabilidad es menor que las especies que se propagan por reproducción sexual
(Barbosa & Bered, 1998) y sumado a esto que eran materiales pre-seleccionados que
cumplían la característica de presentar algún grado de resistencia a tecia solanivora, se
esperaba mayor variabilidad dado que es un planta originaria de los Andes y su cultivo
en esta zona se remonta a más de 7.000 años (CIP, 2006).El hecho de que la variedad
Diacol Capiro se desligara de los demás materiales es un indicador de la distancia
genética de este cultivar con el resto y que pudiera ser explotada en programas de
mejoramiento donde se incluya esta variedad como progenitor susceptible pero con
características comerciales deseables, de ésta manera se da cumplimiento al segundo
objetivo específico de este trabajo.Se debe considerar que la papa es una especie
72
tetraploide (4 juegos de cromosomas), por lo tanto se asume que en cada locus pueden
existir hasta cuatro alelos distintos, lo que da lugar a múltiples estados de
heterocigocis, como AAAB; AABB; AABC o heterocigotos completos ABCD (Thrall &
Young, 2000) por lo tanto no se puede afirmar que al visualizar una banda se esté
amplificando un solo locus: dos individuos pueden ser heterocigotos pero diferir en su
composición (por ejemplo A1A1A2A3 vs A1A2A3A4) y probablemente por esa misma
razón algunas bandas presenten resoluciones tan nítidas al revelarlas en el gel de
poliacrilamida si se toma en cuenta métodos de cuantificación cualitativa de ácidos
nucleicos.
73
Figura 17. Dendrograma de la relación entre accesiones utilizando el método
de agrupamiento UPGMA.
7
Fuente: El Autor.
Andígena
Tuberosum
ICA Huila
Nueva
San Pedro
Corpoguata 1
ICA Morita
ICA Nariño
Boyacá
Comerciales
susceptibles
6
5
4
3
2
1
74
Los resultados indican que la Parda pastusa comparte más características genéticas
con el resto de las accesiones que la Diacol Capiro que tiene una rama única en el
dendrograma
con más del 50% de dis-similaridad con el resto de las accesiones
incluida la Parda Pastusa. Según estos datos sería más apropiado utilizar la Diacol
capiro como progenitor susceptible en los programas de mejoramiento genético que
buscan resistencia a Tecia solanivora, pues presenta diferencias en cuanto a
susceptibilidad al patógeno y polimorfismo molecular. Este resultado concuerda con la
búsqueda y confirmación de individuos contrastantes, tanto en fenotipo como en
genotipo para la generación de poblaciones F1 segregantes en relación la resistencia al
insecto.
Sin embargo los resultados obtenidos en este trabajo son sólo una hipótesis de cómo
son las relaciones filogenéticas entre las accesiones estudiadas (Knapp et al., 2004)
debido a que cada estudio utiliza diferentes descriptores puede darse el caso de
trabajos que apoyen los resultados obtenidos o que los refuten.
El ADN obtenido a partir de brotes y tubérculos sirvió para el objetivo de amplificar
marcadores microsatélites tipo SSR´s, lo cual puede ser empleado en estudios
posteriores cuando no se disponga de material de hojas jóvenes.
6.6.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LAS ACCESIONES EVALUADAS.
El cálculo de la Heterocigosidad Esperada y la Heterocigosidad Esperada Corregida
por Tamaño de Muestra arrojó valores similares para todos los Locus, por lo tanto los
datos presentan alta confiabilidad. El resultado se puede apreciar en la Figura 18.
75
Figura 18. Heterocigosidad Esperada y la Heterocigosidad Esperada Corregida por
Tamaño de Muestra.
Fuente: El Autor.
La heterocigosidad se encuentra en todos los Locus por encima del 0,55, lo cual indica
una alta heterocigosidad; en la Tabla 7 se puede observar datos de estudios similares.
Tabla 7. Resultados de Heterocigosidad en Solanum tuberosum.
Autor
Huamán et al.
Año
Técnica
Tamaño de la muestra
2000 ISOENZIMAS
306 accesiones
Valor
0,46 -0,52
Raker y Spooner 2002 MICROSATELITES 36 accesiones
0,51 – 0,57
Pérez 2004
0,88
2004 MICROSATÉLITES 273 accesiones
La diferencia entre el estudio actual y Huamán et al (2000) se debe a la diferencia entre
las técnicas utilizadas, pues se ha demostrado que los microstaélites tienen una mayor
capacidad de discriminar heterocigosidades (Coombs et al., 2004). En el estudio de
Raker y Spooner sólo se incluyeron 36 accesiones, a diferencia de las 50 del presente
76
estudio y las 273 de Pérez, lo cual puede indicar una relación directamente
proporcianal entre el tamaño de la muestra y el porcetaje de heterocigocis encontrado.
La alta hererocigosidad encontrada en papa puede atribuirse a su autoincompatibilidad,
la cual hace contrapeso a la reproducción asexual por medio de tubérculos y ha sido
clave en su supervivencia (NSF Potato Genome Project, 2004)
Figura 19. Índice de diversidad de Shannon – Wiener.
Fuente: El Autor.
Para cada Locus analizado el índice de Shannon-Wiener oscila entre 0,9 y 1,3 valores
considerados bajos y que dado que la heterocigosidad es alta puede deberse al
tamaño de la muestra. En cuanto a la Uniformidad se nota que las heterocigocis estan
uniformente distribuidas entre los locus.
77
Figura 20. Uniformidad de los alelos por Locus.
Fuente: El Autor.
6.7.
OBTENCIÓN DE LOS CRUZAMIENTOS.
Se realizaron cruces recíprocos entre la Parda Pastusa y las accesiones 15060303 y
15061235 que fueron las más contrastantes, el único que llegó a producir semilla viable
fue el cruce entre Parda Pastusa (Masculino) y la accesión 15060303 (Femenino) que
se realizó protegiendo el cruce con bolsas de tul de factores ambientales como el
viento y permitió mantener un microclima más favorable para los frutos en formación;
los demás se vieron afectados por la alta humedad que hubo dentro de las bolsas de
papel parafinado lo que produjo el marchitamiento por el ataque de hongos y por la
muerte de las plantas receptoras debido al virus del entorchamiento de las hojas. Por
tal razón sólo se obtuvo un fruto que produjo 42 semillas, considerado un valor bajo
porque los frutos de las papas por lo general producen entre 200 y 400 semillas por
fruto (Redepapa, 2002), similar a lo descrito por Gonzalez el al (2001). Generando este
cruce se da por cumplido el tercer objetivo específico de este trabajo. Aunque en la
semilla obtenida por cruzamiento de parentales tetraploides el porcentaje de
78
producción de semilla fue de 25%, Bradshaw & Mackay (1984)
afirman que
tretraploides como Solanum tuberosum se pueden cruzar pero resulta dificultoso,
apoyándose en la técnica de cultivo de tejidos in vitro se pudo aumentar el porcentaje
de germinación y multiplicar los individuos tal como lo demuestra el presente estudio.
6.8.
GERMINACIÓN IN VITRO Y PROPAGACIÓN.
Las 42 semillas obtenidas se pusieron a germinar y de éstas al cabo de 30 días habían
germinado y alcanzado una altura aproximada de 4 cm 34 de ellas, lo cual equivale a
un 80,95% de germinación, lo que reduce la cantidad de tiempo empleado para obtener
los cruces y permite que se conserven las características deseables y el vigor híbrido
sin necesidad de pasar los posibles parentales por etapas 2n.
Figura 21. Planta F1 germinada y propagada in vitro.
Fuente: El Autor.
79
7. CONCLUSIONES.
Los siete marcadores microsatélites utilizados en este trabajo fueron lo bastante
informativos para la detección de polimorfismos entre las accesiones permitiendo
diferenciar completamente 48 de las 50 accesiones, sin embargo no diferenciaron
claramente entre contrastantes y susceptibles.
Se logró diferenciar entre los grupos susceptibles y resistentes los genotipos más
contrastantes, siendo la Diacol Capiro la variedad susceptible que presenta mayor
contraste a nivel molecular con el resto de las accesiones teniendo una rama única en
el dendrograma y una dis-similaridad de aproximadamente 48% con el resto de las
accesiones; en el grupo de las resistentes fueron las accesiones 15060303 y 15061235
las escogidas como más contrastantes para realizar los cruces en búsqueda que
semillas F1.
Se generó un cruzamiento exitoso entre la variedad Parda Pastusa y la accesión
15060303 obteniendo un fruto con 42 semillas, de las cuales el 80,95% fueron viables.
Se confirmó que los marcadores STMS 2022, STMS 1049, STMS 0038 son de gran
ayuda en la caracterización de las diferentes especies de papas de la colección central
de papa existente en los bancos de germoplasma administrados por Corpoica.
En general la similaridad entre las accesiones es alta, esto puede deberse a que la
propagación es clonal.
El ADN extraído de cáscaras y de brotes funciona perfectamente para el objetivo de
análisis con microstatélites.
80
Se puede obtener semillas viables por cruce directo entre especies de papa
tetraploides apoyándose en técnicas de cultivo in vitro para mejorar el porcentaje de
germinación.
81
RECOMENDACIONES.
•
Utilizar más y diferentes descriptores microsatélites con el fin de diferenciar
completamente las accesiones susceptibles y las contrastantes.
•
Amplificar con marcadores diferentes las accesiones 15062152 y 15062384 para
determinar si existe variabilidad o si son la misma accesión.
•
Utilizar la variedad Diacol capiro como progenitora susceptible en los cruces.
•
Evaluar las características de resistencia y rendimiento del tubérculo en la F1
para confirmar vigor híbrido.
82
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90
ANEXOS
91
ANEXO A. Concentración ADN
Muestra
Concentraci
Rati
Explant
ón
o
e
Muestra
ng/µl
1506002
1486.2
7
1506012
1
1506019
1.80
Hoja
1.78
Hoja
2101.4
370.61
1181.9
544.65
726.58
7
1.58
1506238
1.73
1.59
1.68
1078.7
1.76
1.79
Hoja
708.86
8
1295.7
Hoja
1.75
7
1506239
1364.3
1185.9
1506240
1335.7
1506241
1381.6
1506242
0
92
1.77
Hoja
1.75
Hoja
1.78
Hoja
5
1727.7
1.75
Hoja
0
1146.3
1.71
Hoja
2
1497.4
9
Brote
Hoja
5
7
Hoja
1.77
6
6
Hoja
Hoja
2
5
Cáscara 1506240
1.71
3
4
2
725.27
1506239
Cascara 1506239
4
6
1506128
e
1
5
5
1506128
Hoja
0
3
1506123
1.71
7
2
1506121
1506238
1631 Cáscara 1506238
4
7
1506120
o
8
3
1506090
ón
7
1
1506030
Explant
4
8
343.61
Rati
ng/µl
4
2107.2
Concentraci
1.75
Hoja
6
1638.6
1.78
0
Hoja
1506129
1429.0
0
1506133
1349.8
1065.3
908.24
1161.1
2017.5
1509.8
1299.3
672.87
1446.2
6
1.77
1.78
1.64
1.70
1.75
1023.3
1.75
Hoja
1.74
6
1175.5
1506244
1506245
1506246
Hoja
1506246
2445.4
1506249
1387.1
1506249
1724.4
1506250
1206.8
1506250
1386.7
1506258
1
93
Hoja
1.68
Hoja
1.73
Hoja
1.56
Hoja
1.63
Hoja
8
805.04
1.04
Hoja
0
1347.6
1.73
Hoja
2
1410.6
6
Hoja
1.78
6
0
Hoja
Hoja
3
8
Hoja
1.76
9
7
Hoja
Hoja
2
7
Hoja
1.81
0
4
0
1447.0
1506244
Hoja
5
3
3
8
1506167
Hoja
8
0
1506164
1.77
1573.6
6
2
2
1506163
Hoja
4
4
1506161
1.76
1506243
1.73
0
3
1
9
1506160
Hoja
1
2
1506153
1.78
1521.0
0
2
0
1506152
Hoja
2
8
1506134
1.77
1506242
7
1
3
1506133
Hoja
6
1
1506133
1.77
1.79
Hoja
6
2096.7
1.79
2
Hoja
1506181
1618.8
5
1506206
2
Hoja
670.13
1.72
Brote
1.77
Diacol
capiro
3
1354.4
Parda
664.22
Pastusa
4
0
1506215
1.76
Hoja
8
94
1.39
Cascara
5
684.3
1,38
2
Cascara
ANEXO B. Diluciones de trabajo.
Muestra
Volumen
1 (µl)
concentración Volumen concentración
1 (ng/µl)
2 (µl)
2 (ng/µl)
15060027 0,67285695
1486,2
100
10
15060121
0,4745634
2107,2
100
10
15060191 2,91027619
343,61
100
10
15060303 0,47587323
2101,4
100
10
15060907 2,69825423
370,61
100
10
15061202 0,84609527
1181,9
100
10
15061213 1,83604149
544,65
100
10
15061235 1,37631094
726,58
100
10
15061286 0,92704181
1078,7
100
10
15061287 1,37879686
725,27
100
10
15061290 0,69979006
1429
100
10
0,7408505
1349,8
100
10
15061333 0,93870271
1065,3
100
10
15061338 1,10103056
908,24
100
10
15061340 0,86125226
1161,1
100
10
15061522 0,49566295
2017,5
100
10
15061539 0,66233938
1509,8
100
10
15061604 0,76964519
1299,3
100
10
15061612 1,48617118
672,87
100
10
15061630 0,69146729
1446,2
100
10
15061648 0,97723053
1023,3
100
10
1447
100
10
15061815 0,61774154
1618,8
100
10
15062060 1,49224777
670,13
100
10
15062152 0,73833432
1354,4
100
10
15062384
708,86
100
10
15061331
15061676
0,691085
1,4107158
95
15062387 0,77178359
1295,7
100
10
15062388 0,73297662
1364,3
100
10
15062391 0,84324142
1185,9
100
10
15062394 0,74867111
1335,7
100
10
15062395 0,72379849
1381,6
100
10
15062406 0,57880419
1727,7
100
10
15062407 0,87237198
1146,3
100
10
15062419 0,66782423
1497,4
100
10
15062420 0,61027707
1638,6
100
10
1521
100
10
15062430 0,63548551
1573,6
100
10
15062443 0,85070183
1175,5
100
10
15062446 0,40893105
2445,4
100
10
15062453 0,72092856
1387,1
100
10
15062464 0,57991185
1724,4
100
10
15062467 0,82863772
1206,8
100
10
15062497 0,72113651
1386,7
100
10
15062498
1,2421743
805,04
100
10
15062500 0,74205996
1347,6
100
10
15062506 0,70891819
1410,6
100
10
15062581 0,47693995
2096,7
100
10
664,22
100
10
15062427
Parda
0,6574622
1,50552528
Pastusa
96
ANEXO C. Protocolo PCRS
AMPLIFICACIÓN DE MARCADORES SSR (REPETICIONES DE SECUENCIA
SIMPLE)
OBJETIVO: Amplificar fragmentos de ADN mediante marcadores SSRs en plantas.
ALCANCE: El siguiente procedimiento establece el protocolo para la amplificación de
segmentos de ADN mediante marcadores tipo SSR en plantas.
CÓDIGO: IN-R-05
VERSIÓN: 1
MATERIALES Y EQUIPOS
 Buffer de PCR
 Cebador
 Centrífuga
 ddH2O
 dNTPs
 Gradillas frías y normales
 MgCl2
 Micropipetas de volúmenes variables de 0,5 a 10 microlitros, 20 a 200 microlitros
y 200 a 1000 microlitros y sus respectivas puntas.
 Taq polimerasa
 Termociclador
 Tubos de pared delgada 0,2 mililitros.
 Neveras
METODOLOGÍA
 Descongelar los reactivos: buffer de PCR, MgCl 2, dNTPs, ddH2O, cebador y ADN
a trabajar.
 En gradilla fría colocar todos los componentes anteriores descongelados y la
Taq polimerasa.
97
 En un tubo eppendorf estéril en gradilla fría adicionar los reactivos para el master
mix dando vórtex a cada uno antes de adicionarlo pero excluyendo la Taq
polimerasa. (Anexo 1).
 En
gradilla
fría
ubicar
los
tubos
de
PCR
correspondientes al número de muestras que
debidamente
marcados,
desea amplificar y colocar 5
microlitros de ADN molde en una concentración final de 50 nanogramos.
 Agregar 15 microlitros de máster mix sobre cada muestra de ADN.
 Dar un spin a cada tubo.
 Colocar los tubos en el termociclador previamente programado y dar inicio al
proceso.Condiciones de amplificación: Una denaturación inicial a 94°C por 3
minutos, luego se repite 30 veces una denaturación de 94°C por 1 minuto,
anillamiento de acuerdo al cebador usado y extensión a 72°C por 1 minuto y 30
segundos. Una extensión final a 72°C por 5 minutos. Por último hay un paso a
4°C, a esta temperatura las muestras pueden permanecer por varias horas.
 Al finalizar el programa de PCR guardar las muestras a 4°C±2°C ó -20°C ±5°C.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
ADN molde: A partir de la fórmula C1*V1=C2*V2 se halla la cantidad total de ADN total a
tomar para diluirlo en ddH2O para obtener una concentración final de 50 nanogramos
en el volumen final deseado. Siendo C 1 la concentración inicial de la solución de ADN
obtenida por espectrofotometría o cuantificación con marcador de masa; C 2 es la
concentración final deseada; V1 el volumen de ADN a tomar de la solución inicial y V2 el
volumen final deseado.
98
ANEXO D. Tabla de similaridad de JACCARD.
" SIMQUAL: input=C:\Users\Desktop\TESIS MARCELA\NTSYS\Datos completos\Matriz
de datos completa .NTS, coeff=J
" by Cols, += 1.00000, -= 0.00000
3 50L 50 0
C1 C2 C3 C4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12 V13 V14 V15 V16 V17 V18 V19 V20 V21
V22 V23 V24 V25 V26 V27 V28 V29 V30 V31 V32 V33 V34 V35 V36 V37 V38 V39 V40
V41 V42 V43 V44 V45 V46 V47 V48 V49 V50
1.00000000000000E+000
7.05882352941177E-001 1.00000000000000E+000
6.00000000000000E-001 6.87500000000000E-001 1.00000000000000E+000
5.33333333333333E-001 5.29411764705882E-001 6.15384615384615E-001
1.00000000000000E+000
4.66666666666667E-001 4.70588235294118E-001 5.38461538461538E-001
5.83333333333333E-001 1.00000000000000E+000
5.00000000000000E-001 5.00000000000000E-001 5.55555555555556E-001
4.21052631578947E-001 3.68421052631579E-001 1.00000000000000E+000
6.25000000000000E-001 7.05882352941177E-001 8.46153846153846E-001
5.33333333333333E-001 5.71428571428571E-001 5.78947368421053E-001
1.00000000000000E+000
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5.71428571428571E-001 7.14285714285714E-001 5.50000000000000E-001
5.00000000000000E-001 4.50000000000000E-001 6.81818181818182E-001
6.50000000000000E-001 5.00000000000000E-001 5.45454545454545E-001
7.72727272727273E-001 7.00000000000000E-001 7.14285714285714E-001
6.19047619047619E-001 6.36363636363636E-001 6.19047619047619E-001
6.81818181818182E-001 6.08695652173913E-001 6.00000000000000E-001
4.50000000000000E-001 6.08695652173913E-001 6.08695652173913E-001
6.95652173913043E-001 6.95652173913043E-001 6.95652173913043E-001
7.27272727272727E-001 7.27272727272727E-001 6.36363636363636E-001
6.36363636363636E-001 4.76190476190476E-001 5.00000000000000E-001
5.21739130434783E-001 5.41666666666667E-001 5.00000000000000E-001
7.61904761904762E-001 6.81818181818182E-001 6.81818181818182E-001
111
5.41666666666667E-001 5.45454545454545E-001 6.19047619047619E-001
6.36363636363636E-001 5.45454545454545E-001 6.19047619047619E-001
8.57142857142857E-001 8.18181818181818E-001 8.18181818181818E-001
5.83333333333333E-001 1.00000000000000E+000
7.22222222222222E-001 7.89473684210526E-001 6.11111111111111E-001
4.00000000000000E-001 5.00000000000000E-001 6.66666666666667E-001
7.22222222222222E-001 4.73684210526316E-001 6.00000000000000E-001
7.61904761904762E-001 6.84210526315789E-001 6.19047619047619E-001
6.84210526315789E-001 7.00000000000000E-001 7.77777777777778E-001
5.90909090909091E-001 7.50000000000000E-001 5.78947368421053E-001
5.00000000000000E-001 5.90909090909091E-001 5.90909090909091E-001
6.81818181818182E-001 7.61904761904762E-001 6.81818181818182E-001
7.14285714285714E-001 7.14285714285714E-001 7.00000000000000E-001
6.19047619047619E-001 5.26315789473684E-001 5.45454545454545E-001
5.00000000000000E-001 5.90909090909091E-001 5.50000000000000E-001
5.90909090909091E-001 7.50000000000000E-001 8.42105263157895E-001
6.66666666666667E-001 6.00000000000000E-001 6.00000000000000E-001
6.19047619047619E-001 6.00000000000000E-001 6.00000000000000E-001
7.61904761904762E-001 7.27272727272727E-001 7.27272727272727E-001
5.00000000000000E-001 8.09523809523810E-001 1.00000000000000E+000
5.23809523809524E-001 5.90909090909091E-001 4.28571428571429E-001
3.18181818181818E-001 3.33333333333333E-001 7.14285714285714E-001
5.23809523809524E-001 3.18181818181818E-001 5.71428571428571E-001
7.27272727272727E-001 6.81818181818182E-001 5.90909090909091E-001
5.71428571428571E-001 5.90909090909091E-001 5.71428571428571E-001
5.90909090909091E-001 7.14285714285714E-001 4.76190476190476E-001
4.54545454545455E-001 5.65217391304348E-001 5.90909090909091E-001
6.81818181818182E-001 8.09523809523810E-001 7.27272727272727E-001
6.36363636363636E-001 6.36363636363636E-001 5.45454545454545E-001
5.90909090909091E-001 5.00000000000000E-001 5.45454545454545E-001
112
5.45454545454545E-001 6.36363636363636E-001 4.54545454545455E-001
6.19047619047619E-001 6.36363636363636E-001 6.66666666666667E-001
6.36363636363636E-001 5.71428571428571E-001 5.71428571428571E-001
5.90909090909091E-001 5.71428571428571E-001 5.71428571428571E-001
7.27272727272727E-001 7.72727272727273E-001 7.72727272727273E-001
6.36363636363636E-001 7.72727272727273E-001 7.61904761904762E-001
1.00000000000000E+000
5.62500000000000E-001 4.73684210526316E-001 4.37500000000000E-001
3.75000000000000E-001 4.00000000000000E-001 5.26315789473684E-001
5.62500000000000E-001 3.75000000000000E-001 4.44444444444444E-001
5.50000000000000E-001 5.78947368421053E-001 5.55555555555556E-001
6.87500000000000E-001 5.55555555555556E-001 6.25000000000000E-001
4.73684210526316E-001 5.26315789473684E-001 4.70588235294118E-001
5.62500000000000E-001 5.26315789473684E-001 4.73684210526316E-001
5.78947368421053E-001 6.31578947368421E-001 5.50000000000000E-001
5.26315789473684E-001 5.26315789473684E-001 5.00000000000000E-001
4.00000000000000E-001 6.00000000000000E-001 5.00000000000000E-001
5.00000000000000E-001 5.26315789473684E-001 5.62500000000000E-001
5.00000000000000E-001 5.26315789473684E-001 6.47058823529412E-001
6.11111111111111E-001 5.29411764705882E-001 4.44444444444444E-001
4.73684210526316E-001 4.44444444444444E-001 4.44444444444444E-001
5.50000000000000E-001 5.23809523809524E-001 5.23809523809524E-001
5.26315789473684E-001 5.23809523809524E-001 6.66666666666667E-001
5.90909090909091E-001 1.00000000000000E+000
113
ANEXO E. Peso de las bandas amplificadas.
Peso bandas
Alelo
Marcador
83
alelo 1
STMS 0038
90
alelo 2
STMS 0038
95
alelo 3
STMS 0038
104
alelo 4
STMS 0038
108
alelo 5
STMS 1024
112
alelo 6
STMS 1024
105
alelo 7
STMS 1024
123
alelo 8
STMS 1024
164
alelo 9
STMS 1049
180
alelo 10
STMS 1049
190
alelo 11
STMS 1049
200
alelo 12
STMS 1049
105
alelo 13
STMS 0051
112
alelo 14
STMS 0051
120
alelo 15
STMS 0051
134
alelo 16
STMS 0051
113
alelo 17
STMS 2022
120
alelo 18
STMS 2022
138
alelo 19
STMS 2022
140
alelo 20
STMS 2022
60
alelo 21
STMS 3009
68
alelo 22
STMS 3009
100
alelo 23
STMS 3009
124
alelo 24
STMS 3009
105
alelo 25
STMS 3016
110
alelo 26
STMS 3016
126
alelo 27
STMS 3016
en pb
114
ANEXO F. Códigos y especies de las accesiones.
Registro
Especie/subespecie
Registro
Especie/subespecie
15060027
Andígena
15062152
Andígena
15060121
Andígena
15062384
Andígena
15060191
Tuberosum
15062387
ICA Huila
15060303
Andígena
15062388
Nueva
15060907
Tuberosum
15062391
Tuberosum
15061202
Andígena
15062394
San Pedro
15061213
Andígena
15062395
Corpoguata 1
15061235
Andígena
15062406
Tuberosum
15061286
Andígena
15062407
Tuberosum
15061287
Andígena
15062419
Tuberosum
15061290
Andígena
15062420
ICA Morita
15061331
Andígena
15062427
ICA Nariño
15061333
Andígena
15062430
Tuberosum
15061338
Andígena
15062443
Tuberosum
15061340
Andígena
15062446
Tuberosum
15061522
Andígena
15062453
Tuberosum
15061539
Andígena
15062464
Tuberosum
15061604
Andígena
15062467
Tuberosum
15061612
Andígena
15062497
Tuberosum
15061630
Andígena
15062498
Tuberosum
15061648
Andígena
15062500
Tuberosum
15061676
Andígena
15062506
Tuberosum
15061815
Andígena
15062581
Boyaca
15062060
Andígena
Parda
Andígena-Tuberosum
Pastusa
115
ANEXO G. Microsatélites evaluados inicialmente para determinar si presentan
polimorfismos en Solanum Tuberosum.
Características de los SSR
Marcador
Sentido
Secuencia
amplificación
STM 0001
(°C)
F
AGTATTCAACCCATTGACTTGGA
R
TAGACAAGCCAAGTCGGAGAA
STMS
F
CAGTCTTCAGCCCATAGG
0014
R
TAAACAATGGTAGACAAGACAAA
STMS
F
CATTACCTTGTGAGATTAGATTG
0024
R
CATATAAGTAGGAATAGGAGGTTT
STM 0038
F
AACTCTAGCAGTATTTGCTTCA
R
TTATTTAGCGTCAAATGCATA
STMS
F
AATTATATGCTATCCAACACA
0047
R
ACTTCATTGACCACTACG
STM 0051
F
TACATACATACACACACGCG
R
CGCAACTTATAGCCTCCA
STMS
F
TATTCCCCCTTCCTACTCAA
1002
R
TCTTCCACATTCCTAACCTG
STMS
F
CACTTAATATGGAATAGAGGAAGTA
1003
R
GAACTTATGCTTTATCATTCA
STM 1008
F
GTTCATGATTGTGAATGCTC
R
TAGACACTCTCACATCCACT
F
ATACAGGACCTTAATTTCCCCAA
R
TCAAAACCCAATTCAATCAAATC
F
GTTGAGTAGAAGGAGGATT
R
CCTTTGTCTTCTGCTTTTG
F
CTACCAGTTTGTTGATTGTGGTG
R
AGGGACTTTAATTTGTTGGACG
STM 1024
STM 1041
STM 1049
Temp.
116
60
54,3
53,4
54
48,6
54
56,2
54
56
60
52
60
STM 1106
F
TCCAGCTGATTGGTTAGGTTG
R
ATGCGAATCTACTCGTCATGG
F
GCGTCAGCGATTTCAGTACTA
R
TTCAGTCAACTCCTGTTGCG
F
TCAGCTGAACGACCACTGTTC
R
GATTTCACCAAGCATGGAAGTC
F
TCAGAACACCGAATGGAAAAC
R
GCTCCAACTTACTGGTCAAATCC
STMS
F
CCAAAAGTCCGGCAAACTT
3018
R
CCATATGAGGCCGCTTTTTAC
STM 2022
STM 3009
STM 3016
117
60
60
64
64
60