diversidad y optimizacin del diagnstico del fitoplasma asociado al

DIVERSIDAD Y OPTIMIZACIÓN DEL DIAGNÓSTICO DEL FITOPLASMA ASOCIADO AL
AMARILLAMIENTO LETAL DEL COCOTERO EN CUBA
R. Llauger 1 ∗, E.L. Peralta
González 4.
2
, M. Dollet 3, J. Cueto
1
, M. Rodríguez
1
, D. Fajardo
1
y V.
1
: Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical (IIFT), Ave. 7ma, # 3005 e/ 30 y 32, Playa, C. de la
2
Habana, Cuba; : Centro Nacional de Sanidad Vegetal (CENSA), Autopista Nacional y Carretera de
Tapaste, Apdo 10, San José de la Lajas, Cuba; 3 CIRAD, TA 30/G, Campus International de Baillarguet,
4
344398, Montpellier Cedes 5, Francia; : Empresa del Coco, Carretera del Toa Km 3.5, Mabujabo,
Baracoa, Cuba.
∗ Autor para correspondencia: Tel: 2025526, Fax: 204 6794, email: [email protected]
Resumen
Entre los aspectos de mayor interés en el ámbito internacional con respecto al Amarillamiento
Letal del Cocotero (LY) se encuentran el estudio de la variabilidad genética del fitoplasma
asociado a la enfermedad y el perfeccionamiento de los métodos para su diagnóstico, los que
constituyen objetivos de este trabajo. Para la optimización del diagnóstico, se ensayaron
diferentes parejas de cebadores empleadas para la detección de la enfermedad en otras
regiones del Caribe (LY1F/LY1R y MMR/MMF); distintas concentraciones de MgCl2 y
diluciones de las muestras. Se seleccionaron 23 de los aislados positivos procedentes de cinco
provincias cubanas y se analizaron por PCR-RFLP empleando los cebadores universales P1 y
P6 (Deng and Hiruki, 1991) y las enzimas de restricción EcoRI, RsaI y BamHI. La
concentración de 2.5mM de MgCl2 y la dilución de 1/100 resultaron las óptimas para el
diagnóstico con los cebadores LY1F/LY1R. Los cebadores MMR/MMF no reconocieron los
aislados cubanos. La comparación de los perfiles de restricción, evidenció la diversidad de los
aislamientos cubanos, la presencia de entre 5 y 7 patrones con cada enzima, así como los
perfiles mayoritarios en cada caso.
Palabras Claves: Amarillamiento letal del cocotero, Diversidad genética, diagnóstico PCR, Mollicutes.
DIVERSITY AND DIAGNOSIS OPTIMIZATION OF THE PHYTOPLASMA ASSOCIATED TO
THE COCONUT LETHAL YELLOWING IN CUBA
Abstract
Among the aspects of greater interest in the international scope with respect to the Coconut
Lethal Yellowing (LY) are the study of the genetic variability of phytoplasmas associated to the
disease and the improvement of the methods for their diagnosis, which constitute objectives of
this paper. For the optimization of the diagnosis, different primers pairs used for the detection of
the disease in other Caribbean regions were tried (LY1F/LY1R and MMR/MMF), as well as
different concentrations from MgCl2 and dilutions of the samples. Twenty-three positives
isolated coming from five Cuban provinces were selected and they were analyzed by PCRRFLP, using universal primers P1 and P6 (Deng and Hiruki, 1991) and restriction enzymes
EcoRI, RsaI and BamHI. The concentration of 2.5mM of MgCl2 and the sample dilution of 1/100
were optimal for the diagnosis with primers LY1F/LY1R. No amplification was obtained when
MMR/MMF primers were used. Comparison between restriction patterns evidenced the diversity
of Cuban isolates, the presence of 5-7 profiles and the main ones with each enzyme.
Key words: coconut Lethal Yellowing, genetic diversity PCR diagnosis, Mollicutes
Introducción
EL cultivo del cocotero (Cocos nucifera L) es afectado por varias enfermedades de diferente
etiología. Entre estas, la enfermedad de Amarillamiento Letal (LY) representa una de las más
importantes para la región del Caribe por las pérdidas económicas ocasionadas (Roca de
Doyle, 2001) y se asocia a la presencia de fitoplasmas. En Cuba, se han registrado epifitias de
esta enfermedad en diferentes décadas de los siglos XIX y XX (Cueto J. Comunicación
personal; Waters et al., 1978).
A pesar de los resultados alcanzados por autores como Rohde et al., (1993), Martínez Soriano
et al., (1994), Harrison et al., (1994) y Tymon et al., (1998), el conocimiento de la variabilidad
genética de los fitoplasmas asociados al LY es aún limitado y no se ha trabajado
profundamente en la optimización de los ensayos de PCR para su diagnóstico. Los objetivos
de este trabajo han sido abordar ambos como parte del estudio del LY en Cuba.
Optimización del diagnóstico mediante PCR
Para la optimización del diagnóstico se ensayaron los protocolos y las parejas de cebadores
descritos por Harrison, (1992) (LY1F/LY1R) y Martínez-Soriano, (1994) (MMR/MMF). Se
utilizaron dos controles positivos y uno negativo previamente comprobados (Llauger et
al.,2002). Se evaluó la influencia en los resultados de la PCR de las concentraciones finales de
MgCl2 (1.5mM, 2.5mM y 3.5mM) y de la dilución del ADN (1/10 y 1/100), seleccionándose las
condiciones óptimas de realización. Estas fueron empleadas posteriormente para el análisis
de 68 muestras con y sin síntomas de la enfermedad, seleccionadas en diferentes localidades
de las provincia Pinar del Río, Ciudad de la Habana, Holguín, Granma y Guantánamo. El ADN
total de todas la muestras trabajadas fue obtenido y cuantificado según lo descrito por Doyle
and Doyle (1990) modificado por Rohde et al. (1995).
Al emplear los cebadores LY1F/LY1R se obtuvieron amplificaciones de la talla esperada (1,1
kb) en los controles positivos, no así en el negativo. Al emplear 2.5mM y 3.5mM de MgCl2 se
obtuvieron resultados positivos con las dos diluciones de ADN evaluadas. Sin embargo, con la
concentración de 1.5mM, la intensidad del producto amplificado fue muy débil y los resultados
no fueron repetibles. Se seleccionó la concentración de 2.5 mM de MgCl2 y la dilución de la
muestra 1/100 como óptimas, teniendo en cuenta la homogeneidad de los resultados con
respecto al tamaño de la banda, su nitidez e intensidad, así como la reproducibilidad en los
diferentes ensayos. La importancia de la concentración de MgCl2 en la PCR ha sido
previamente discutida por varios autores (Saiki, 1989; Mahony, et al., 1994) y se confirman con
los resultados obtenidos en este trabajo.
La evaluación de muestras de campo con y sin síntomas, demostró la factibilidad del ensayo
bajo las condiciones seleccionadas. En la Fig. 1 pueden apreciarse las diferencias obtenidas al
evaluar las tres concentraciones de MgCl2, así como los resultados del análisis de algunas de
las muestras de campo colectadas.
Los resultados de la amplificación con los cebadores descritos por Martínez Soriano et al.,
(1994),fueron negativos, lo que evidencia que no pueden ser empleados para el diagnóstico en
nuestro caso, ya que no reconocen los aislados de las regiones de Cuba analizadas.
Comparación de los patrones de restricción de aislamientos cubanos de LY
Se emplearon 23 de los aislados con resultados positivos (epígrafe anterior), representativos
de las cinco provincias muestreadas. La amplificación del ADN para su posterior análisis por
RFLP se realizó a partir de los cebadores P1 y P6 (Deng and Hiruki, 1991) con el protocolo
utilizado por Tymon et al., (1998). El volumen final de la mezcla de reacción fue de 50µl
conteniendo:1 µl de la muestra de ADN (50ng), 1µl de cada cebador (10pmol/µl), 2µl de la
mezcla de los dNTPs (8mM), 2µl de MgCl2 (2.5mM), 5µl del tampón de PCR 10X, y 0.25 µl de
Taq Polimerasa (5 unidades/reacción). Los productos de PCR (10µl) fueron digeridos con las
enzimas de restricción EcoRI, RsaI, BamHI según lo establecido por el productor (Boehringer &
Mannheim, UK).
Las amplificaciones realizadas dieron como producto una banda de 1,5kb en todos los
aislamientos estudiados, no así en los controles negativos. Resultados similares fueron
obtenidos por Tymon et al., (1998) con diferentes aislados africanos. La Tabla 1 resume los
resultados obtenidos al digerir los productos de PCR con las tres enzimas de restricción.
Estos resultados sugieren la existencia de variabilidad entre los aislados estudiados. Se
identificó un patrón mayoritario en el 70% de las muestras al ser digeridas con la enzima
BamHI, evidenciándose diferencias en las restantes, entre las que se destaca la 18 de Ciudad
de la Habana, que también pudo distinguirse del resto mediante la digestión con EcoRI. El
perfil mayoritario con RsaI agrupó sólo el 39% de los aislamientos y el 49% en el caso de
EcoRI. Este último patrón coincide con el obtenido por Harrison et al., (1994) para aislamientos
procedentes de la Florida, Jamaica y Tanzania y en general, son comparables a los obtenidos
en este trabajo. Por otra parte llama la atención que con EcoRI, todos los aislamientos
estudiados procedentes de Holguín se agrupan en un mismo perfil, al igual que la mayoría de
los colectados en Ciudad Habana. Por otra parte, más del 50% de los aislamientos de
Guantánamo presentaron un mismo patrón al ser digeridos con esta enzima, a diferencia de lo
observado con las restantes.
Trabajos similares han sido realizados por otros autores (Tymon et al., 1997 y 1998; Cronjé,
1998) empleando productos amplificados a partir de diferentes parejas de cebadores diseñadas
para las regiones 16S rADN y 16-23S de los fitoplasmas. Aunque no es posible comparar los
perfiles obtenidos por haberse empleado condiciones diferentes, se confirma la utilidad de esta
metodología para la diferenciación de aislados de fitoplasmas.
Los resultados presentados son los primeros que sugieren la diversidad de aislamientos
cubanos de fitoplasmas asociados al LY. Sin embargo, nuevas investigaciones se encaminan a
la utilización de una mayor cantidad de enzimas y la secuenciación de diferentes aislados,
como criterio conclusivo para la determinación de la variabilidad y relaciones filogenéticas entre
los aislamientos, teniendo en cuenta que los análisis RFLP de las regiones del ARN ribosomal
16S o la intergénica, por sí solos, no reflejan completamente la variabilidad de los fitoplasmas
(Seemüller et al, 1998).
Agradecimientos: Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el CIRAD, Montpellier
donde se realizó una parte de las investigaciones aquí incluidas. Al Prof. Dr. Wolfgang Rohde
del MPIZ por el aporte de reactivos y materiales de Laboratorio.
Referencias
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6. Llauger R., Becker D., Cueto J.,Rohde W., Peralta E., González & Rodríguez M. 2002.
Detection and characterization of phytoplasma associated with Letal Yellowing disease of
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Molecular methods for virus detection, Eds: D.L. Wiedbrauk & D.H. Farkas. Academic
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8. Martínez-Soriano,J.P, Almeyda-León I.H, Rocha Peña, M.R & Byerly Murphy, K.F.1994.
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10. Rohde, W., Kullaya, A., Mpunami, A. & Becker, D. 1993. Rapid and sensitive diagnosis of
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12. Saiki, R.K. 1989. The design and optimization of the PCR, en PCR Technology. Principles
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13. Seemüller, E.; Marcone, C.; Ragozzino, A. & Göschl, M. (1998): Current status of molecular
classification of the phytoplasmas. J. Plant. Pathol. 80 (1): 3-26.
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16. Waters, H.,Romney,D.H & Harries., H.C.1978. Nuevos Focos de enfermedades y Plagas.
Cuba. Boletín de la FAO :139-141.
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 1314 1516
1.1 kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13 14 1516171819 20
1.1 kb
D
C
Figura 1 : Resultados del PCR con los cebadores LY1F/LY1R en la detección del fitoplasma
causante del amarillamiento letal del cocotero : A (1.5mM de MgCl2), B : (2.5mM de MgCl2), C :
(3.5mM de MgCl2 ). Pocillos 2 y10 : Holg 2 dilución 1/10, Pocillos 3 y 11 : Holg 2 dilución 1/100,
Pocillos 4 y 12 : RCH-I dilución 1/10, Pocillos 5 y 13 : RCH-I dilución 1/100, Pocillos 6 y 14: MYD
(Sano) dilución 1/10, Pocillos 7 y 15 : MYD (Sano) dilución 1/100, Pocillos 8 y 16: H2O. Pocillo
1 :marcador 100bp DNA Ladder y Pocillo 9 : Φ X174 RF DNA/Hae III Fragments. D : Detección del
fitoplasma en muestras foliares de cocotero con síntomas de Amarillamiento Letal con los cebadores
LY1F/LY1R. Pocillo 2: Nibujón1, Pocillo 3: Navas 1, Pocillo 4: Duaba 3, Pocillo 5: Duaba 2, Pocillo 6:
BOD-BAR 2, Pocillo 7 : P-BAR 1, Pocillo 8: EV-Piedra 2, Pocillos del 9-15 plantas asintomáticas,
Pocillo 16: Control Positivo, Pocillo 17: Control negativo MYD, Pocillo 18: Control negativo 110,
Pocillo 19: H2O. Pocillo 1 :marcador 100bp DNA Ladder y Pocillo 20 : Φ X174 RF DNA/Hae III
Fragments.
Diferentes perfiles de restricción determinados en los aislados cubanos de LY
con las enzimas EcoRI, RsaI, BamHI.
Tabla 1.
•
PERFILES
(talla de las bandas, bp)
900 y 600
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
900, 600 y 100
1650, 1600, 900, 600 y 100
1600, 900 y 600
1600
500 y 400
500, 400, 150 y 100
500, 400 y 100
600, 500, 400, 150 y 100
600, 500, 400 y 100
600, 500 y 400
600, 500 y 100
900 y 700
900, 700 y 100
1650, 900, 700, 100
1650,900 y 700
1650
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
ENZIMAS
BamHI
RsaI
EcoRI
*Procedencia de las muestras:
Guantánamo
PR:
MUESTRAS*
1, 3 y 4 (H);2(CH); 5-7,9-11, 20 (Gu); 12, 16 y
23 (Gr);17 y 22 (CH)
8 (Gu)
13 (Gu); 19(CH)
15 (Gu); 21(PR)
18 (CH)
1(H); 2, 17 y 22 (CH); 9,10,11 y 20 (Gu); 16 (Gr)
3 (H)
4 (H); 5 y8 (Gu)
6,7 y 15 (Gu)
13,14 (Gu)
21(PR); 23 (Gr)
18 y 19 (CH)
1,3 y 4 (H); ,5 y 15 (Gu): ,12 y 23 (Gr); 21 (PR)
2, 17, 19 y 22 (CH); 6,7,8,9,10 y 11 (Gu)
13 y 14 (Gu); 16 (Gr)
20 (Gu)
18 (CH)
Pinar del Río; CH: Ciudad de la Habana; H: Holguín; Gr: Granma; Gu: