TRABAJO FIN DE ESTUDIOS MÁSTER EN QUÍMICA AVANZADA Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno TN Claudio Daniel Navo Nájera Tutores: Alberto Avenoza Aznar y María del Mar Zurbano Asensio Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática Curso 2011-2012 Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno TN, trabajo fin de estudios de Claudio Daniel Navo Nájera, dirigido por Alberto Avenoza Aznar y María del Mar Zurbano Asensio (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los titulares del copyright. © © El autor Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2012 publicaciones.unirioja.es E-mail: [email protected] UNIVERSIDAD DE LA RIOJA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA Grupo de Síntesis Química de La Rioja U.A. – C.S.I.C. Trabajo de investigación. Proyecto fin de Máster. Claudio D. Navo Nájera Junio 2012 ALBERTO AVENOZA AZNAR, Catedrático de Química Orgánica del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja y MARÍA DEL MAR ZURBANO ASENSIO, Profesora Titular de Universidad del Departamento de Química de la Universidad de La Rioja. HACEN CONSTAR: Que la memoria "Síntesis de C-glicopéptidos análogos del antígeno Tn" ha sido realizada por el Licenciado CLAUDIO DANIEL NAVO NÁJERA en el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 30 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo fin de Máster. Logroño, Junio 2012 Fdo.: Alberto Avenoza Aznar Fdo.: María del Mar Zurbano Asensio A mis padres, mi hermana, demás familiares, mi novia y mis amigos: sin todos ellos, hoy no sería lo que soy. Hace ya un año y medio que comencé con mis peripecias químicas en este grupo, y parece que fuera ayer. Este relativamente corto periodo de tiempo me ha servido para aprender muchas cosas, tanto en el ámbito profesional como en el personal. Y esto no hubiera sido posible sin vosotros: A Alberto, Pere, Héctor y Marimar, por todo lo que me han ido enseñando y ayudando a lo largo de todos estos años, desde el día en que empecé la carrera, y por haberme dado la oportunidad de formar parte de este grupo. Y también a Paco, por toda la ayuda prestada tanto dentro del laboratorio como fuera de éste, y por su paciencia, haciendo ver que la química no es tan difícil, después de todo. Por supuesto, a todos mis compañeros de laboratorio. De cada uno de ellos me llevo un trocito de sabiduría. Gracias a Charlie, mi mentor, por haberme ido enseñando los entresijos del laboratorio con tanta paciencia y dedicación. A Eva, por echarme una mano siempre que lo he necesitado, y siempre con una sonrisa en la cara. A Lara, por todo el apoyo y consejos que me ha ido proporcionando desde el momento en el que entré. A Victor S., por su gran sentido del humor tan característico y contagioso, sea la hora del día que sea. A Victor R., por ser un gran compañero de laboratorio y persona, siempre dispuesto a responder cualquier pregunta, por muy absurda o tonta que fuera. A Nuria, por llenar el laboratorio de buen rollo y optimismo. A Fer, que, desde los sótanos, me ha ayudado mucho, sobre todo con los RMN. A Iván y David, con quienes empecé la carrera, por todos esos buenos momentos, tanto entonces como ahora. Como no, a Ismael y Laura, mis compañeros de fatigas durante el Máster, y ahora también compañeros de grupo, por ese compañerismo y personalidad que poseéis. A los nuevos, Nuria, Iris y Victor P., espero que estéis por aquí al año que viene con la misma ilusión y entusiasmo (o más). Y a todos los vecinos y compañeros fotoquímicos: Alegría, Héctor, Marina, Pedro, Miguel Ángel, Diego y Anselmo. También a todos los demás compañeros de Máster: Laura, Jesús, Rocío, Justo y Sábel, con quienes las clases se hicieron más amenas y entretenidas. Por último, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda económica aportada para la realización de este proyecto: x Gobierno de La Rioja, por la concesión del proyecto COLABORA 20010/05. x Ministerio de Ciencia e Innovación, por la aportación económica al proyecto CTQ2009-13814/BQU. x Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y científico idóneo para el desarrollo de este trabajo. ÍNDICE Abreviaturas I 1. Introducción 1 1.1. Aplicaciones de las glicoproteínas y glicopéptidos 3 1.2. Importancia de la C-glicosilación 11 Antecedentes y objetivos 15 2.1. Formación del enlace O-glicosídico 17 2.2. Formación del enlace C-glicosídico 22 2.3. Trabajos previos 28 2.4. Objetivos 32 Discusión de resultados 33 3.1. Introducción 35 3.2. Síntesis del producto de partida 38 3.3. Síntesis del C-glicopéptido objetivo 42 3.4. Segunda ruta sintética 44 4. Conclusiones 53 5. Experimental 59 6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 73 2. 3. I Abreviaturas [D]xD G ºC 1 H RMN 13 C RMN Ac AcOEt Bn Boc Boc2O Bz cat Cbz col. COSY d dd ddd ESI Et EtOH Et2O eq. Fmoc g GalNAc h HRMS HSQC Hz J LHMDS m rotación óptica específica desplazamiento químico grado Celsius resonancia magnética nuclear de protón resonancia magnética nuclear de carbono-13 acetilo acetato de etilo bencilo terc-butoxicarbonilo dicarbonato de di-terc-butilo benzoilo catalizador benciloxicarbonilo colaboradores COrrelated SpectroscopY doblete doblete de dobletes doblete de dobletes de dobletes ionización por electrospray etilo etanol éter dietílico equivalente/s 9-fluorenilmetoxicarbonilo gramo N-Acetilgalactosamina hora High Resolution Mass Spectroscopy Heteronuclear Single Quantum Correlation hertz constante de acoplamiento hexametildisililamiduro de litio multiplete II mg mL mm mmol m/z M Me MeCN MeOH N Napht NEt3 NOESY PDC ppm q R ref. RMN s Ser t td TFA TfO THF Thr TMB TMS p-TsOH v. miligramo mililitro milimetro milimol relación masa/carga molaridad, metal metilo acetonitrilo metanol normalidad naftalenuro trietilamina Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY dicromato de piridinio partes por millón cuatriplete alquilo referencia resonancia magnética nuclear singlete serina pseudotriplete, triplete, tiempo triplete de dobletes ácido trifluoroacético triflato tetrahidrofurano treonina tetrametoxibutano tetrametilsilano ácido p-toluensulfónico versión 3 1.1Aplicacionesdelasglicoproteínasyglicopéptidos Los aminoácidos hidroxilados, como serina y treonina, además de formar parte de las proteínas, son fundamentales en otro tipo de biomoléculas, como las glicoproteínas (Figura 1.1).1 Estos compuestos son proteínas unidas a oligosacáridos mediante el grupo hidroxilo de la cadena lateral, presente tanto en la serina como en la treonina, o mediante el N de la amida de la cadena lateral, presente en la asparagina, formando un enlace denominado glicosídico de tipo D o E (Figura 1.2). Figura 1.1. Parte de la glicoproteína MUC1. 1 (a) Varki, A.; Cummings, R. D.; Esko, J.; Freeze, H.; Hart, G. W.; Marth, J. Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor: New York, 1999. (b) Pratt, M. R.; Bertozzi, R. C. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68. (c) Van den Steen, P.; Rudd, P. M.; Dwek, R. A.; Opdenakker, G. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1998, 33, 151-208. (d) Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57-92. (e) Dwek, R. A. Chem. Rev. 1996, 96, 683-720. (f) Varki, A. Glycobiology 1993, 3, 97-130. (g) Wittmann, V. Glycopeptides and Glycoproteins: Synthesis, Structure, and Application en Topics in Current Chemistry, Springer-Verlag, Berlín, vol. 267, 2007. 4 R1 = H (Ser) R1 = Me (Thr) BnO OBn BnO OBn BnO O H N R AcHN NH O AcHN R1 O N H O H N O O BnO O O H N R R N H O H N O R Figura 1.2. O-Glicopéptido (izquierda) y N-glicopéptido (derecha). La presencia de grupos carbohidrato unidos a una proteína altera la estructura de ésta y, por tanto, su función. En la mayor parte de los casos, se observa que el péptido adopta una conformación extendida, debido, lógicamente, a las interacciones producidas entre los restos carbohidrato y el backbone (o esqueleto) del péptido. Por tanto, estos cambios conformacionales implican un cambio en la función biológica de las moléculas. Así, un alto grado de glicosilación modifica las propiedades de estas glicoproteínas, provocando un aumento en la estabilidad proteica al reducir su vulnerabilidad a la degradación proteolítica, tanto química como enzimática.1c 5 Las glicoproteínas juegan un papel importante dentro de numerosos procesos biológicos.1e,1f,2 Un tipo de glicoproteínas importantes son las denominadas glicoproteínas anticongelantes3 (Figura 1.3), gracias a las cuales muchos animales son capaces de soportar las bajas temperaturas de las aguas polares, ya que evitan la congelación de los fluidos de estos organismos inhibiendo el crecimiento de cristales de hielo en su interior. Figura 1.3. Ejemplo de una proteína anticongelante 2 (a) Williams, D. H. Nat. Prod. Rep. 1996, 13, 469-477. (b) Wyss, D. F.; Wagner, G. Curr. Opin. Biotechnol. 1996, 7, 409-416. (c) Bertozzi, C. R.; Kiessling, L. L. Science 2001, 291, 2357-2364. (d) Partt, M.R.; Bertozzi C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68. 3 (a) Chen, L.; Devries, A. L.; Cheng, C.-H. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 38173822. (b) Tsvetkova, N. M.; Phillips, B. L.; Krishnan, V. V.; Feeney, R. E.; Fink, W. H.; Crowe, J. H.; Risbud, S. H.; Tablin, F.; Yeh, Y. Biophys. J. 2002, 82, 464-473. (c) Tablin, F.; Oliver A. E.; Walker N. J.; Crowe L. M.; Crowe J. H. J. Cell Physiol. 1996, 168, 305– 313. (d) Wang J. H. Cryobiology 2000, 41, 1–9. (e) Feeney R. E.; Yeh Y. Trends Food Sci. Technol. 1998, 9, 102–106. (f) Tachibana Y.; Fletcher G. L.; Fujitani N.; Tsuda S.; Monde K.; Nishimura S. I. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 856–862. 6 Estas proteínas están siendo estudiadas debido a sus importantes aplicaciones, desde la conservación de células, tejidos3c o alimentos,3d hasta la destrucción de tumores.3e Se sabe que para que estas glicoproteínas mantengan su actividad es necesaria la presencia de la secuencia Ala-(DGalNAc)Thr-Ala, siendo GalNAc la N-acetilgalactosamina. Además, se conocen tres hechos estructurales que parece que juegan un papel fundamental en dicha actividad:3f el Me en posición E de la Thr, el grupo acetilo del GalNAc y que el enlace O-glicosídico sea D y no E. (Figura 1.4). HO HO OH O AcHN O Ala HN Ala O Figura 1.4. Secuencia que forma las glicoproteínas anticongelantes, con los hechos estructurales fundamentales marcados en verde. Estos datos estructurales afectan a la unión entre el carbohidrato (GalNAc) y el aminoácido (Ser o Thr). Este glicoaminoácido es conocido como antígeno Tn, presentando siempre un enlace D-O-glicosídico, y es un patrón común en numerosas glicoproteínas (Figura 1.5). HO OH O HO AcHN OSer/Thr Figura 1.5. Antígeno Tn El antígeno Tn se descubrió que era responsable de la aglutinación de los eritrocitos obtenidos de un paciente con una anemia hemolítica poco 7 frecuente (síndrome Tn), al observar Moreau, Dausset y sus colaboradores que algunos glóbulos rojos se podían aglutinar por suero humano normal independientemente del grupo sanguíneo.4 Sin embargo, su estructura no fue descrita hasta 1975, año en el que Dahr y sus colaboradores identificaron la estructura GalNAc-O-Ser/Thr.5 Desde que se descubrió que en el 90% de los carcinomas humanos estaba presente esta estructura,6 ha atraído mucha atención en el mundo de la oncología. Numerosos estudios clínico-patológicos han sido descritos confirmando su importancia en biología de tumores y su valor para el diagnóstico diferencial de varios tipos de cánceres.7 Además, se sabe que es un elemento importante en el reconocimiento celular, participando como mediador en varias interacciones intercelulares, como puede ser la metástasis organotrópica en células tumorales. Esto lo convierte en un potencial objetivo para la inmunoterapia contra el cáncer. Por otro lado, se ha descubierto que el antígeno Tn se expresa por la proteína gp120 del síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) y se ha detectado recientemente su presencia en un amplio rango de parásitos de tipo helmíntico, abriendo así nuevas vías de investigación en el estudio de las interacciones parásito – huésped. 4 (a) Moreau, R.; Dausset, J.; Bernard, J.; Moullec, J. Bull. Soc. Méd. Hôp. 1957, 73, 569587. (b) Dausset, J.; Moullec, J.; Bernard J. Blood 1959, 14, 1079-93. 5 Dahr, W.; Uhlenbruck, G.; Gunson, H.; van der Hart, M. Vox Sang 1975, 29, 36-50. 6 Springer, G. Science, 1984, 224, 1198-206. 7 Hanisch, F. G.; Baldus, S. E. Histol. Histopathol. 1997, 12, 263-281. 8 Otro tipo de O-glicoproteínas importantes son, sin duda, las mucinas,8 que se localizan en la membrana de muchas células epiteliales. Estas glicoproteínas actúan en procesos como la inflamación, la respuesta inmunológica, la comunicación célula-célula, el crecimiento celular, la adherencia celular y la actividad anticongelante, entre otros.1c,3f,9 Además, las mucinas son moléculas de gran interés desde el punto de vista terapéutico,10 especialmente en el desarrollo de vacunas para el tratamiento del cáncer.11 En las mucinas, el primer residuo de carbohidrato unido a la cadena peptídica es el GalNac, y se une a través de un enlace D-O-glicosídico a serina o treonina. De nuevo, aparece la estructura del antígeno Tn (Figura 1.5) en otro tipo de O-glicoproteína. Actualmente se sabe que las mucinas están sobreexpresadas en las células tumorales, ocurriendo con frecuencia cambios en la glicosilación. 8 Strous, G. J.; Dekker, J. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1992, 27, 57–92. Lowe, J. B. Cell 2001, 104, 809-812. 10 (a) Davis, B. G. Chem. Rev. 2002, 102, 579-601. (b) Watt, G. M.; Lund, J.; Levens, M.; Kolli, V. S. K.; Jefferis, R.; Boons, G.-J. Chem. Biol. 2003, 10, 807-814. (c) Lui, H.; Wang, L.; Brock, A.; Wong, C.-H.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 1702-1703. (d) Gamblin, D. P.; Garnier, P.; van Kasteren, S.; Oldham, N. J.; Fairbanks, A. J.; Davis, B. G. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 116, 827-833. (e) Davis, B. G. Science 2004, 303, 480-482. 11 (a) Blattman, J. N.; Greenberg, P. D. Science 2004, 305, 200-205. (b) Moingeon, P. Vaccine 2001, 19, 1305-1326. (c) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 836-863. (d) Jarcz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054. (e) Dziadek, S.; Hobel, A.; Schmitt, E.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7630-7635. (f) Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Glycobiology 2006, 16, 113R-136R. (g) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nature Rev. 2005, 4, 477-488. (h) Hollingsworth, M. A.; Swanson, B. J. Nature Rev. Cancer, 2004, 4, 45-60. (i) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (j) Kim, Y. J.; Varki, A. Glycoconjugate J. 1997, 14, 569-576. (k) Trap, M. A.; Clausen H. Biochim. Biophys. Acta 2008, 1780, 546-563. 9 9 Como consecuencia del mal funcionamiento de algunas glicosiltransferasas, las células cancerosas presentan glicoproteínas parcialmente glicosiladas y con glicanos más cortos y menos complejos de lo normal (Figura 1.6). Figura 1.6. Mucina sana y mucina con errores de glicosilación. Esto determina que algunos antígenos, que en las células normales se encuentran enmascarados por la presencia de carbohidratos más externos, queden expuestos en la superficie,12 resultando la formación de nuevos antígenos asociados al cáncer. Este hecho convierte a los glicopéptidos derivados de mucinas parcialmente glicosilados en prometedores candidatos para la terapia contra el cáncer (vacunas basadas en carbohidratos).13 En este 12 (a) Sell, S. Human Path. 1990, 21, 1003–1019. (b) Hakomori, S.; Zhang, Y. Chem. Biol. 1997, 4, 97-104. (c) Taylor-Papadimitriou, J.; Epenetos, A. A. Trends Biotech. 1994, 12, 227–233. (d) Gabius, H. J. Angew. Chem. 1988, 27, 1267–1276. 13 (a) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (b) Dziadek, S.; Kunz, H. The Chem. Rec. 2004, 3, 308-321. (c) Jaracz, S.; Chen, J.; Kuznetsova, L. V.; Ojima, I. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5043-5054. (d) Danishefsky, S. J.; Allen, J. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2000, 39, 836-863. (e) Slovin, S. F.; Ragupathi, G.; Musselli, C.; Olkiewicz, K.; Verbel, D.; Kuduk, S. D.; Schwarz, J. B.; Sames, D.; Danishefsky, S. J.; Livingston, P. O.; Scher, H. I. J. Clin. Oncol. 2003, 21, 4292-4298. (f) Chen, X.; Lee, G. S.; Zettl, A.; Bertozzi, C. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2004, 43, 6111-6116. (g) Galonic, D. P.; 10 contexto, el grupo de Danishefsky14 ha desarrollado algunas vacunas que contienen diferentes estructuras de glicanos. A modo de ejemplo se muestra una vacuna sintética desarrollada por el grupo de Boons15 constituida por los mínimos requerimientos estructurales para provocar una respuesta inmune. Consta de tres partes: el antígeno Tn, el péptido epítopo T, constituido por una secuencia de 20 aminoácidos, denominado YAF, y un lipopéptido abreviado como Pam3Cys (Figura 1.7). HO HO OH O AcHN O Me O H N AcHN O H N 3 GLFLEFANRGVNAHRAYKFAY N H O S NH O O O O 14 Antígeno Tn Espaciador Péptido YAF (epítopo T) O 14 14 Lipopéptido Pam3Cys Figura 1.7. Estructura de la vacuna de Boons. Gin, D. Y. Nature 2007, 446, 1000-1007. (h) Hang, H. C.; Bertozzi, C. R. Bioorg. Med. Chem. 2005, 13, 5021-5034. (i) Dube, D. H.; Bertozzi, C. R. Nat. Rev. Drug Discovery 2005, 4, 477-488. 14 Ragupathi, G.; Coltart, D.M.; Williams, L. J.; Koide, F.; Kagan, E.; Allen, J.; Harris, C.; Glunz, P. W.; Livingston, P.O.; Danishefsky, S. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 13699-13704 15 Buskas, T.; Ingale, S.; Boons, G.-J. Angew. Chem., Int. Ed. 2005, 44, 5985-5988. 11 1.2ImportanciadelaCǦglicosilación La C-glicosilación, la formación de un enlace carbono-carbono en el centro anomérico de un carbohidrato, ha atraído una gran atención debido a la importancia de los compuestos que presentan este tipo de enlace en su estructura, como pueden ser los C-glicósidos miméticos de glicolípidos, oligosacáridos o glicoproteínas. En 1993 se logró aislar y determinar la estructura de las agelasfinas, unos novedosos esfingolípidos anticancerosos extraidos de una esponja marina, Agelas mauritianus (Figura 1.8, izquierda). Ya que son los primeros ejemplos de D-galactosil ceramidas encontrados en la naturaleza, y que se espera un nuevo modelo de acción dada su actividad anticancerígena, el desarrollo de fármacos antitumorales basados en agelasfinas conduce hasta el KRN7000 (Figura 1.8, centro), un esfingolípido sintético que ha demostrado ser un efectivo antitumoral. Diez años más tarde, Franck y sus colaboradores16 publicaron la síntesis de un C-glicósido análogo del KRN7000 (Figura 1.8, derecha), el cual, sorprendentemente, mostró una actividad cien veces superior al KRN7000 en un modelo de melanoma de ratón. 16 Franck, R. W.; Tsuji, M. Acc. Chem. Res. 2006, 39, 692-701. 12 HO OH O HN HO HO O HO OH OH (CH2)21CH 3 OH HN HO HO OH (CH 2 )23CH3 OH (CH 2 )13CHMe 2 (CH2)11CHMe2 OH OH agelasfina O HO OH O HN HO HO O OH (CH2 )23CH3 OH C-glicósido del KRN7000 (CH2 )13CHMe2 OH KRN7000 Figura 1.8 Este ejemplo demuestra la importancia de los C-glicósidos análogos de glicoconjugados biológicamente activos en ámbitos como la biología o la farmacia. Estas uniones C-glicosidicas están presentes en multitud de productos naturales biológicamente importantes como pueden ser toxinas marinas naturales o antibióticos (Figura 1.9) Debido a que la síntesis de estas estructuras complejas ha sido objetivo en los últimos años de la química orgánica sintética, las reacciones de C-glicosilación estereoselectivas han sido estudiadas de forma extensiva. Para ello se utilizan carbohidratos como compuestos quirales de partida, ya que son fácilmente accesibles de la naturaleza.17 17 (a) Isobe, M.; Ichikawa, Y.; Bai, D. L.; Masaki, H.; Goto, T. Tetrahedron 1986, 27, 4767-4776. (b) Ley, S. V.; Humphries, A. C.; Eick, H.; Downham, R.; Ross, A. R.; Boyce, R. J.; Pavey, J. B. J.; Pietruszka, J. J. Chem. Soc. Perkin Trans, 1998, 1, 3907-3912. (c) Forsyth, C. J.; Sabes, S. F.; Urbanek, R. A. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 8381-8382. (d) Nicolaou, K. C.; Yang, Z.; Shi, G. Q.; Gunzner, J. L.; Agrios, K. A.; Gärtner, P. Nature 1998, 392, 264-269. 13 O H O O HO O OH H OH H H OH O O H O H H OH O ácido okadaico OH O HO HO OH HO H HO O H O H O OH O CO2H OH O OH O vineomycinone B2 OH Cl H O HO H O O O O H H O H O H AcO OAc H O OMe OH espongistatina O H HO H brevetoxina A H OH H O H HO H H O H O H H OH H O O Figura 1.9. Compuestos naturales que presentan enlaces C-glicosidicos (marcados en rojo). 17 En el presente capítulo se describen los procedimientos sintéticos más habituales para la formación de enlaces O y C-glicosídicos. Además se recoge un breve resumen de los trabajos previos realizados y las conclusiones más importantes obtenidas por nuestro grupo de investigación en este campo. 2.1FormacióndelenlaceOǦglicosídico En la mayoría de las glicoproteínas, la unión entre los restos carbohidrato con la cadena peptídica es mediante un enlace O-glicosídico. La incorporación de la parte carbohidrato a un péptido es el paso clave en la obtención de glicopéptidos, la cual se lleva a cabo a través de la síntesis de un building block: un glicoaminoácido que, posteriormente se incorpora en un péptido mediante síntesis en fase sólida (SPSS). Otra opción es la formación del enlace glicosídico directamente sobre un aminoácido que forme ya parte de una cadena peptídica, aunque ésta suele darse con bajos rendimientos. El enlace O-glicosídico entre el grupo hidroxilo de Ser o Thr y el GalNAc muestra generalmente configuración D. A pesar de que en la bibliografía se pueden encontrar diversas revisiones acerca de la formación de enlaces O-glicosídicos,1 se describirán a continuación algunas de las metodologías más habituales para la formación del enlace D-O-glicosídico, utilizando GalNAc como resto carbohidrato. 1 (a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317-11362. (b) Boons, G. J., Tetrahedron 1996, 52, 1095-1121. (c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2000, 2137-2160. (d) Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron-Asymmetry. 1997, 8, 2839-2876. (e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085-3112. (f) Herzner, H.; Reipen, T.; Schultz, M.; Kunz, H. Chem. Rev. 2000, 100, 4495-4537. 18 MÉTODO DEL TRICLOROACETIMIDATO Este método, desarrollado por Wong y colaboradores,2 proporciona de forma mayoritaria el anómero D frente al E. Se utiliza el grupo tricloroacetimidato como activador para la glicosilación en un derivado de Thr y, en dos pasos, se genera el enlace D-O-glicosídico, obteniendo los anómeros D y E en proporción 2:1, respectivamente (Esquema 2.1). AcO OAc AcO OAc CCl3CN, K2CO3, CH2Cl2 O AcO AcO OH N3 CCl3 O N3 O NH AcO OAc AcO OAc CCl3 O AcO N3 O NH + Me CO2Allyl TMSOTf, CH2Cl2, éter HO NHFmoc 55% (Dos etapas) O AcO N3 O Me CO2Allyl NHFmoc Esquema 2.1 El grupo de Toyokuni describió un ejemplo utilizando Ser debidamente protegida a través de esta misma metodología, obteniendo de forma mayoritaria el anómero D, donde la mezcla de anómeros se separa utilizando cromatografía flash (Esquema 2.2).3 2 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y-Y.; Case D.A.; Wong C-H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527-13536. 3 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673-2676. 19 AcO OAc O AcO OAc CCl3 O AcO O N3 CO2Bn + NH HO NHCbz TMSOTf (68%) AcO N3 O CO2Bn NHCbz Esquema 2.2 METODOLOGÍA DE SCHMIDT Esta metodología, una de las más extendidas, fue desarrollada por Schmidt y colaboradores4 para la obtención de un enlace D-O-glicosídico con el GalNAc.4c,5 La metodología se basa en una adición de tipo O-Michael, en medio básico, de un alcohol al 2-nitro-D-glucal o 2-nitro-D-galactal convenientemente protegidos, con formación de los correspondientes productos de O-glicosilación (Esquema 2.3). BnO OTBDPS O BnO + R CO2 tBu HO NHBoc t BuOK tolueno NO2 BnO OTBDPS O BnO O2 N O CO2 tBu NHBoc R: H R: Me R R: H (97%) R: Me (97%) Esquema 2.3 4 (a) Winterfeld, G. A.; Ito, Y.; Ogawa, T.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1999, 11671171. (b) Winterfeld. G. A.; Schmidt, R. R. Angew. Chem., Int. Ed. 2001, 40, 2654-2657. (c) Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609-1613. (d) Schmidt, R. R.; Vankar, Y.D. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1059-1073. 5 Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706-707. 20 Este método permite, en general, obtener de forma mayoritaria el anómero D, aunque la selectividad se puede controlar mediante la base utilizada. De esta forma, con bases fuertes como tBuOK, se obtiene una elevada selectividad D, mientras que utilizando bases de tipo amina, como puede ser NEt3, la selectividad favorecida es la E. METODOLOGÍA DE KOENIGS-KNORR Este método es uno de los más antiguos y sencillos de glicosilación.6 Se basa en el empleo de haluros derivados de carbohidratos, como grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo aceptor. Esta metodología fue la utilizada por Liebe y Kunz en la síntesis del antígeno Tn (Esquema 2.4).7 6 7 Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957-981. Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618-621. 21 AcO OAc AcO OAc Me O + AcO N3 Br HO AgClO4/Ag2CO3 (1:11) CH2Cl2/tolueno (10:9) 47% NHFmoc CO2tBu O AcO N3 O CO2tBu NHFmoc Me HO OH O HO AcHN O Me CO2H NH2 Antígeno Tn Esquema 2.4 22 2.2FormacióndelenlaceCǦglicosídico Ya se ha comentado en el capítulo de Introducción la importancia que tiene sobre la estructura de una glicoproteína, y por tanto sobre su función, el tipo de enlace, O o C-glicosídico, que se forma entre el resto carbohidrato y la cadena peptídica. Aunque también se pueden encontrar diversas revisiones acerca de la formación de enlaces C-glicosídicos,1a,8 se describirán a continuación algunas de las metodologías más habituales para la formación del enlace D-C-glicosídico. ADICIÓN NUCLEÓFILA SOBRE DERIVADOS CARBOHIDRATO ELECTRÓFILOS Esta estrategia es una de las más utilizadas para la C-glicosilación. Uno de los métodos más clásicos es por adición de un reactivo de Grignard a un haluro de glicosilo. Así, la reacción entre yoduro de galactosilo y bromuro de vinilmagnesio en presencia de TBAI (n-Bu4NI) en tolueno a 110 ºC da, de forma estereoselectiva, el D-vinil-C-galactósido (Esquema 2.5).9 8 Fraser-Reid, B. O.; Tatsuta, K.; Thiem, J. Glycoscience, Springer-Verlag, Berlín, vol. 1, 2008. 9 Kulkarni, S. S.; Gervay-Hague, J. Org. Lett. 2006, 8, 5765 23 BnO OBn O BnO BnO OBn BnO OBn BnO MgBr O BnO I BnO I TBAI tolueno 110 ºC O BnO BnO 79% (D/E = 12/1) Esquema 2.5 En estas condiciones, ambos anómeros del yoduro de galactosilo, D y E, se encuentran bajo un equilibrio de anomerización y el bromuro de vinilmagnesio reacciona preferentemente con el anómero E, que es más reactivo, dando el producto via SN2. Éste producto es un intermedio de la síntesis del glicolípido antitumoral KRN7000. REACCIONES RADICALARIAS Las reacciones radicalarias han sido empleadas en la síntesis de DC-glicósidos de 2-aminoazúcares.10 El bromuro de GalNAc, D o E, se hace reaccionar con alilfenilsulfona en presencia de (Bu3Sn)2 disuelto en benceno y activación por luz, para formar el D-alil-C-GalNAc (Esquema 2.6).9a AcO OAc O AcO AcHN SO2Ph (Bu3Sn)2, hQ, benceno Br AcO OAc O AcO AcHN 42 % Esquema 2.6 10 (a) Bouvet V. R.; Ben, R. N. J. Org. Chem. 2006, 71, 3619-3622. (b) Roe, B. A.; Boojamra, C. G.; Griggs, J. L.; Bertozzi, C. R. J. Org. Chem. 1996, 61, 6442-6445. (c) Grant, L.; Liu, Y.; Walsh, K. E.; Walter, D. S., Galagher, T. Org. Lett. 2002, 4, 4623-4625. (d) San Martin, R.; Tavassoli, B.; Walsh, K. E.; Walter, D. S.; Galagher, T. Org. Lett. 2000, 2, 4051-4054. (e) Abel, S.; Linker, T.; Giese, B. Synlett 1991, 1, 171-172. 24 GENERACIÓN DE UN ANIÓN ANOMÉRICO Al contrario que en la C-glicosilación por adición nucleófila a un carbohidrato electrófilo, el uso de un anión anomérico ha estado muy limitado, debido a su inestabilidad. Aun así, se puede utilizar esta metodología en C-glicosilación estereoselectiva, ya que a bajas temperaturas, los aniones son configuracionalmente estables, y pueden reaccionar con una gran variedad de electrófilos. Un ejemplo típico es el de la N-acetilglucosamina. Partiendo del cloruro de N-acetilglucosamina, se trata con n-BuLi y se reduce a continuación con naftalenuro de litio a -78 ºC. De esta forma se genera un dianión, con retención de la configuración en el carbono anomérico. Este anión anómerico reacciona con aldehídos, CO2 y yoduros de alquilo, formando los correspondientes D-glicósidos (Esquema 2.7)11. OBn BnO BnO 1) n-BuLi, THF, -90 ºC, 1 min O AcHN Cl 2) Li-Napht, -78 ºC, 10 min OBn OBn BnO BnO O AcN Li Li i-Pr-CHO BnO BnO 64% (D/E = 17/1) O AcHN HO i-Pr Esquema 2.7 11 (a) Hoffmann, M.; Kessler, H. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 6067-6070. (b) Burkhart, F.; Kessler, H. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 255-256. 25 TRANSPOSICIÓN SIGMATRÓPICA La reacción más importante dentro de las transposiciones sigmatrópicas para la C-glicosilación es la transposición de Claisen. Ireland y Fraser-Reid publicaron una transposición de este tipo del éster del glical y sus derivados,12 en la que se propone un estado de transición tipo bote. (Esquema 2.8). Dado que se trata de un proceso concertado, la quiralidad se conserva a lo largo de la reacción. O O O O O X O H X O OH X Esquema 2.8 En el ámbito de los glicoaminoácidos, la transposición de un oxazol, derivado del éster de la alanina, conduce, tras otros pasos de reacción, a C-manosil-alanina (Esquema 2.9).13 12 (a) Fraser-Reid, B.; Dawe, R. D.; Tulshian, D. B. Can. J. Chem. 1979, 57, 1746-1748. (b) Ireland, R. E.; Wilcox, C. S.; Thaisrivongs, S.; Vanier, N. R. Can. J. Chem. 1979, 57, 17431745. 13 Colombo, L.; Di Giacomo, M.; Ciceri, P. Tetrahedron 2002, 58, 9381-9386. 26 O O O O PPh3, CCl4 Et3N, t.a. O N O O O Ph (2.6/1) N NHBz O O O O O 86% O O Ph NH2 HO O HO CO2H OH OH Esquema 2.9 REACCIONES CATALIZADAS POR METALES DE TRANSICIÓN Desde que se ha empezado a estudiar de forma extensiva la formación de enlaces C-C catalizada por metales de transición, un gran número de reacciones con catalizadores como Ni o Pd han sido publicadas para la generación de enlaces C-glicosídicos, debido a la alta compatibilidad con diversos grupos funcionales. La reacción de un complejo S-alil-paladio con un anión estabilizado (reacción de Tsuji-Trost) se ha ampliado para la C-glicosilación de azúcares insaturados. En concreto, azúcares 2,3-insaturados se tratan con un nucleófilo carbonado en presencia del catalizador de Pd(0) con migración del doble enlace. La estereoquímica depende generalmente de la naturaleza del nucleófilo: cuando se emplea un anión estable (nucleófilo blando), el nucleófilo ataca al carbono anomérico por la cara contraria a donde se sitúa el complejo de paladio (ataque anti), reteniendo por completo la 27 configuración. Si se trata de un anión no estabilizado (nucleófilo duro), el anión atacará al Pd y se transferirá al carbono anomérico por la misma cara (ataque sin), transcurriendo la reacción con inversión de la configuración (Esquema 2.10).14 OMe O CO2Me CO2Me NHAc OMe O CO2Me CO2Me NHAc DMF, 70 ºC OMe O OAc Pd OAc nucleófilo Pd(PPh3)4 90% OMe OMe O PhZnCl O OMe O Ph THF, t.a. Pd OAc Pd Ph 94% Esquema 2.10 14 (a) Dunkerton, L. V.; Serino, A. J. J. Org. Chem. 1982, 47, 2814. (b) Moineau, C.; Bolitt, V.; Sinou, D. J. Org. Chem. 1998, 63, 582. 28 2.3Trabajosprevios Es conocido que la D-O-glicosilación de proteínas tiene un enorme efecto de organización sobre la cadena peptídica, forzándola a una conformación extendida.15,16 Diversas investigaciones han intentado encontrar una explicación para este hecho, ya que para discernir cómo las glicoproteínas interaccionan con sus blancos biológicos, es esencial mejorar nuestra comprensión acerca de los mecanismos que permiten que el carbohidrato modifique el equilibrio conformacional del esqueleto peptídico. Actualmente, esta conformación extendida se explica mediante la formación de un enlace de hidrógeno, el cual tiene lugar entre el NH del GalNAc y el oxígeno carboxílico del aminoácido al que está unido, tal y como se propone en el estudio llevado a cabo por Danishefsky y col.14 (Figura 2.1). Este enlace de hidrógeno “bloquea” la orientación del carbohidrato con respecto al esqueleto peptídico.17 15 Coltart, D. M.; Royyuru, A. K.; Williams, L. J.; Glunz, P. W.; Sames, D.; Kuduk, S.; Schwarz, J. B.; Chen, X.-T.; Danishefsky, S. J.; Live, D. H. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 9833-9844. 16 Pratt, M. R.; Bertozzi, C. R. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 58-68. 17 (a) Mimura, Y.; Inoue, Y.; Maeji, N. J.; Chûjô, R. Int. J. Pept. Protein Res. 1989, 34, 363-368; (b) Shuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P. Glycoconjugate J. 2000, 17, 835-848. (c) Tachibana, Y.; Monde, K.; Nishimura, S.-I. Macromolecules 2004, 37, 6771-6779. 29 a b Figura 2.1. a) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de treonina de la cadena peptídica a través de enlaces de hidrógeno. b) Interacciones entre el GalNAc y el residuo de serina de la cadena peptídica a través de moléculas de agua. Sin embargo, y atendiendo a la geometría, el enlace de hidrógeno propuesto entre el GalNAc y el aminoácido al que está unido presenta valores fuera del intervalo de un enlace de hidrógeno convencional.18 En el mismo estudio los autores han observado que los derivados con un enlace E-O-glicosídico no inducen ningún cambio conformacional en el péptido, debido a que no presentan los enlaces de hidrógeno comentados anteriormente. Otros autores achacan estos cambios en la estructura del péptido a impedimentos estéricos, ya que la glicosilación se da, generalmente, en varios puntos contiguos del péptido.19 18 Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 14640-14648. 19 Schuman, J.; Qiu, D.; Koganty, R. R.; Longenecker, B. M.; Campbell, A. P. Glycoconjugate J. 2000, 17, 835-848. 30 Debido a esta controversia, nuestro grupo de investigación se planteó demostrar si esta interacción es la responsable o no de la conformación extendida del esqueleto peptídico. Para ello se estudiaron diversos glicoaminoácidos, con Ser, Thr o D-MeSer unida por enlace glicosídico a GalNAc, en sus formas D y E. Los resultados experimentales y teóricos obtenidos en este estudio señalan la existencia de una molécula de agua puente entre las partes carbohidrato y peptídica e indican que las moléculas de agua circundantes son también esenciales para mantener la conformación bien definida (Figura 2.1b). A pesar de que estos resultados son para el glicopéptido modelo más pequeño, la existencia de tales interacciones carbohidrato-péptido a través de moléculas de agua puente podría explicar las características particulares de las glicoproteínas tipo mucina. Por otro lado, la limitación en la flexibilidad conformacional en glicopéptidos es campo de interés para los investigadores, con el fin de encontrar conformaciones bioactivas. Una de las estrategias más importantes consiste en sustituir alguno de los aminoácidos naturales glicosilados (Ser o Thr) por uno no natural análogo estructuralmente, pero que presente cierta rigidez conformacional. En este campo, nuestro grupo de investigación tiene una amplia experiencia en la síntesis de hidroxiaminoácidos no naturales con rigidez conformacional análogos de Ser y Thr. De entre las metodologías desarrolladas por nuestro grupo para añadir una restricción al aminoácido, nos centraremos en la estrategia que implica la síntesis de un N,O-acetal bicíclico,20 que puede ser alquilado estereo20 (a) Jiménez-Oses, G.; Aydillo, C.; Busto, J. H.; Zurbano, M. M.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Org. Chem. 2007, 72, 5399-5402. (b) Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.; Avenoza, A.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. J. Org. Chem. 2011, 76, 6990– 31 selectivamente, obteniéndose diversas D-alquilserinas enantioméricamente puras de forma rápida, sencilla y en escala multigramo (Esquema 2.11). Esta alquilación tiene lugar con una diastereoselectividad superior al 95% y con retención de la configuración original. Con electrófilos como ésteres D,Einsaturados en adiciones de Michael, también se lograron buenos rendimientos y elevadas diastereoselectividades. MeO HO O O RX H 2N N R O R CO 2Me MeO CO2H a-alquilserinas O O N CO2Me O O CO2Me 1 O HO N O H2 N CO2 Me MeO2 C CO2H MeO 2C ácido (R)-(hidroximetil)glutámico Esquema 2.11 Como continuación lógica a nuestra investigación, se decidió emprender una rama paralela de investigación a la O-glicosilación: la Cglicosilación, utilizando nuestra metodología de síntesis de hidroxiaminoácidos. 6996. (c) Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M.; Avenoza, A. Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840-4848. 32 2.4Objetivos De entre todas las rutas sintéticas comentadas anteriormente para la formación de enlaces C-glicosídicos, la más sencilla y directa es la adición nucleófila sobre derivados carbohidrato electrófilos, y más aún, teniendo en cuenta los excelentes resultados obtenidos en nuestro grupo de investigación en la alquilación del N,O-acetal bicíclico 1. De esta forma se pretende en el presente trabajo sintetizar el C-glicopéptido, análogo del antígeno Tn, que se muestra en la figura 2.2. HO OH OH HO AcHN AcHN CONHMe Figura 2.2 Una vez sintetizado el glicopéptido, y ya fuera de este trabajo, se realizará un estudio estructural tanto experimental (RMN) como teóricamente (dinámica molecular y cálculos DFT) en disolución acuosa y se compararán con los obtenidos anteriormente para la diamida de D-O-DGalNAc-L-Ser. 35 3.1.Introducción En nuestro grupo de investigación, contamos con una gran experiencia tanto en síntesis como en análisis conformacional de Oglicopéptidos.1 Como ya se ha comentado en el capítulo de Antecedentes y objetivos, el método de Schmidt permite la glicosilación de los aminoácidos hidroxilados. A través del tri-O-bencil-2-nitro-D-galactal (Esquema 3.1), mediante una reacción de tipo O-Michael del aminoácido protegido, se logra la unión con el carbohidrato (Esquema 3.2). BnO O BnO BnO OBn O 1) HNO3, Ac2O, -50 ºC 2) NEt3, CH2Cl2, t.a. OBn BnO NO2 Esquema 3.1 1 (a) Corzana, F.; Busto, J. H.; Engelsen, S. B.; Jiménez-Barbero, J.; Asensio, J. L.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. Chem. Eur, J. 2006, 12, 7864-7871. (b) Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; Asensio, J.L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem, Soc. 2006, 128, 14640-14648. (c) Corzana, F.; Busto, J. H.; Jiménez-Osés, G.; De Luis, M. G.; Asensio, J. L.; Jiménez-Barbero, J.; Peregrina, J. M.; Avenoza, A. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9458-9467. 36 BnO BnO OBn OH O R BnO NO2 NHAc t BuOK, THF, t.a. BnO OBn O NHAc O2N O CONHMe CONHMe R HO HO OH O NHAc AcHN O CONHMe R Esquema 3.2 Tras algunas etapas de transformación de grupo funcional, se obtiene la D-N-acetilgalactosamina unida a un aminoácido mediante enlace O-glicosídico. Por los extremos amino y ácido se pueden unir otros aminoácidos y formar así glicopéptidos más complejos.2 Partiendo de esta base, para la formación de un enlace de tipo Cglicosídico (Figura 3.1) y a la vista de los excelentes resultados que demostraron los N,O-acetales bicíclicos actuando como nucleófilos sobre acrilatos en reacciones de tipo Michael (ver Antecedentes y objetivos, esquema 2.11), nos planteamos relizar una modificación en el método de Schmidt: emplear nuestro N,O-acetal bicíclico como nucleófilo, en lugar del derivado de serina, dando de esta forma una reacción tipo C-Michael (Esquema 3.3). 2 (a) Corzana, F.; Busto, J. H.; De Luis, M. G.; Fernández-Tejada, A.; Rodríguez, F.; Jiménez-Barbero, J.; Avenoza, A.; Peregrina, J. M. Eur. J. Org. Chem. 2010, 3525-3542. (b) Corzana, F.; Busto, J. H.; De Luis, M. G.; Jiménez-Barbero, J.; Avenoza, A.; Peregrina, J. M. Chem Eur. J. 2009, 15, 3863-3874. 37 HO OH OH HO O HO NH 2 AcHN O O HO OH AcHN CO 2H H2 N D-O-GalNAc-Ser CO2 H D-C-GalNAc-Ser Figura 3.1. N-Acetilgalactosamina unida mediante un enlace O-glicosídico (antígeno Tn) y mediante un enlace C-glicosídico a la serina (análogo del antígeno Tn). Bajo nuestro punto de vista, éste sería el primer ejemplo de reacción de tipo C-Michael en la metodología de Schmidt para la formación de D-C-glicopéptidos. HO HO BnO OH O OH AcHN AcHN CONHMe BnO OBn O O2N MeO2 C BnO OBn O O N MeO2 C O N O O OMe 2 O O BnO OMe NO2 1 Esquema 3.3 Con estas premisas, el primer producto necesario para la obtención de nuestro objetivo será la síntesis del compuesto 2 (Figura 3.2). 38 OBn BnO O BnO O O2N MeO2 C N O O OMe 2 Figura 3.2 3.2Síntesisdelproductodepartida La síntesis del producto de partida 2 se llevó a cabo siguiendo la metodología que ya se había empleado anteriormente en nuestro grupo de investigación. A partir de serina comercial, tras la protección de los grupos amino con terc-butoxicarbonil (Boc) y ácido, en forma de éster metílico, se obtiene el N,O-acetal bicíclico 1 por reacción con tetrametoxibutano (TMB). Posteriormente, se lleva a cabo una adición de Michael con tri-O-bencil-2nitro-D-galactal (Esquema 3.4), que hubo que sintetizar previamente mediante la metodología de Schmidt descrita en el esquema 3.1. MeO2 C O H (S) NHBoc TMB, TsOH·H2 O cat, Tolueno Reflujo, 3 h, 75% OH O MeO2 C (S) N (S) O O (R) (S) N O (R) (S) O 1 OMe BnO BnO OBn (R) (R) O BnO OMe MeO2 C (R) 1) THF, -78 ºC 2) LHMDS, 45 min, 44% (S) NO2 OBn (R) O (S) O (S) (R) O2 N (R) N O (R) MeO 2C (S) BnO O 2 1 Esquema 3.4 OMe 39 Se observa la aparición del aducto de Michael 2,3 el cual se obtiene con una elevada diastereoselectividad, ya que únicamente se obtiene ese diastereómero de los ocho posibles, al generarse tres nuevos estereocentros. La estereoquímica se pudo confirmar mediante su análisis de difracción de rayos X (Figura 3.3). Figura 3.3. Diagrama ORTEP3 obtenido mediante difracción de rayos X del compuesto 2. 3 Tesis Doctoral de Carlos Aydillo Miguel, 2011, Universidad de La Rioja. 40 La estereoquímica obtenida es la predicha por la aproximación en el estado de transición análoga a otros acrilatos4, tal y como se puede apreciar en el esquema 3.5. O MeO OMe O (R) N (S) O O H MeO O (R) O (R) O 2N O OMe ( R) N (R) (S) O O ( R) (S) OBn H O 2N (S) BnO OBn TS2 O (S) ( R) OBn (S) BnO OBn 2 Esquema 3.5 Hay que señalar que el CD del N,O-acetal retiene su configuración, pero es R debido al cambio de prioridad en el grupo introducido en el estereocentro. Con este método se obtiene el anómero D, aunque en este caso no se puede hablar en esta nomenclatura ya que el resto carbohidrato no presenta una estructura de tipo silla (al menos en estado sólido) ni posiciones axiales ni ecuatoriales. Lo que se observa es que, curiosamente, el esqueleto de galactosa adopta una conformación de tipo bote (Figura 3.4), energéticamente desfavorable frente a las típicas sillas que se observan en O-glicósidos. 4 Aydillo, C.; Jiménez-Osés, G.; Avenoza, A.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M. J. Org. Chem. 2011, 76, 6990–6996. 41 Figura 3.4. Conformación de tipo bote de la galactosa en el compuesto 2. Se han eliminado los bencilos para una mayor claridad. 42 3.3.SíntesisdelCǦglicopéptidoobjetivo Como primer objetivo se planteó la obtención del C-glicósido análogo del antígeno Tn a partir del compuesto 2 (Esquema 3.6). OBn BnO O BnO OH HO O O2N MeO2 C O HO AcHN MeHNOC O N NHAc OMe O OH 2 Esquema 3.6 El primer paso en la ruta sintética fue la hidrólisis ácida del compuesto 2, en HCl 4 N a 40 ºC. El clorhidrato obtenido se acetila utilizando Ac2O y piridina en proporción 1:2 para dar el compuesto 3 (Esquema 3.7). BnO (R) BnO (R) OBn (R) O ( S) O2N BnO (S) (R) O N MeO2C (S) O (R) 1) HCl 4N, 40 ºC, 12 h O (R) 2) Ac2O, Py, 3h, 52% OBn (R) O (S) (R) (S) O2N (R)NHAc BnO MeO2C OMe OAc 2 3 Esquema 3.7 Aunque se esperaba que la reacción de acetilación transcurriera con un rendimiento elevado, se observó que, prácticamente en la misma proporción que el compuesto 3, aparece un producto secundario 4. La 43 formación de este producto secundario se puede explicar por el mecanismo mostrado en el esquema 3.8. Inicialmente, la piridina arranca el protón ácido marcado en rojo. El carbanión generado ataca al carbonilo de la acetamida y, posteriormente, pierde una molécula de agua, formando así el compuesto 4. BnO OBn H O BnO O2N OBn NO2 O BnO BnO NHAc MeO2C OAc + -H OAc BnO N H O BnO CO2Me OBn NO2 O O N H OAc CO2Me 3 BnO BnO OBn NO2 O O N H BnO + H+ BnO OAc CO2Me OBn NO2 O HO N H BnO (R) OAc CO2Me - H2O BnO (R) OBn NO ( R) 2 O ( R) (R) N (R) OAc CO2Me 4 Esquema 3.8 Se observa un cambio de configuración en el carbono donde se forma el carbanión, ya que es la única que permite el ataque al grupo carbonilo y la formación de un ciclo estable. A pesar de que este nuevo compuesto obtenido atrae cierto interés debido a las posibilidades sintéticas que abre, hemos preferido cambiar la ruta sintética, con el fin de obtener un mayor rendimiento. Por esto, en un futuro se trabajará en la optimización de la reacción de acetilación. 44 3.4Segundarutasintética En vistas de que la ruta sintética propuesta anteriormente no resultó ser lo efectiva que se esperaba, se planteó una segunda ruta sintética. En lugar de comenzar hidrolizando el N,O-acetal bicíclico, se propuso reducir inicialmente el grupo nitro del compuesto 2 a amina, utilizando para ello H2 soportado sobre un catalizador de niquel platinado para formar el compuesto 5 (Esquema 3.9). BnO OBn (R) (R) BnO (S) (R) O O2N MeO2 C OBn BnO (S) (R) N (S) O O H2, Ni Raney / H 2PtCl6 O O H 2N MeO 2C 3.5 h, r.t. ( R) O BnO O N OMe OMe O 2 5 Esquema 3.9 Sorprendentemente, el compuesto 5 no se pudo aislar, ya que inmediatamente, en el propio medio de la reacción, el grupo carbonilo del éster sufre un ataque intramolecular por parte de la amina recién formada, perdiendo MeOH y generando así la lactama 6 (Esquema 3.10). BnO OBn O 2 BnO O 48% O BnO H HN MeO N OMe BnO OBn (R) (R) O O (S) HN (R) (R) -MeOH O N 5 O 6 Esquema 3.10 (R) (S) O O O (S) OMe 45 Este nuevo compuesto 6 posee un gran interés, dada su estructura tan restringida generada por la aparición de la lactama. Por esta razón, a pesar de que no nos va a permitir alcanzar nuestro objetivo inicial, decidimos aprovechar el producto obtenido y modificar nuestro objetivo inicial hacia el derivado C-glicosídico mostrado en el esquema 3.11. BnO (R) (R) BnO (R) HO OBn HN O OH O (S) (R) N ( R) (S) NHAc HN OMe O O O HO O (S) O 6 NHMe O GalNAc-Aa Esquema 3.11 Se puede observar que este compuesto posee un resto análogo al GalNAc (verde) y una parte aminoácido (azul), que está protegido en forma amida para simular una cadena peptídica. 46 Así, el siguiente paso dado para la obtención de nuestro nuevo Cglicoaminoácido análogo del antígeno Tn, fue la hidrólisis del compuesto 6 en HCl 4N a 40 ºC y posterior acetilación de los grupos amino y alcohol utilizando la misma metodología descrita anteriormente para la formación del compuesto 3 (Esquema 3.12). BnO (R) (R) BnO OBn O BnO O (S) HN (R) (R) N ( R) (S) OMe 2) Ac2O, Py, 3h, 87% O O (R) (R) 1) HCl 4N, 40 ºC, 12 h O (S) BnO OBn O (S) HN (R) (R) O 6 (S) NHAc OAc 7 Esquema 3.12 En esta ocasión, al contrario que ocurrió con la formación del compuesto 3, únicamente se obtiene el compuesto 7, ya que el protón involucrado es considerablemente menos ácido, ya que está situado en posición D de una amida y no de un grupo NO2. Una vez obtenido el compuesto 7, se trató con una disolución de MeO- / MeOH, para recuperar el grupo OH libre y formar el compuesto 8 (Esquema 3.13). 47 BnO (R) (R) BnO OBn O ( S) HN (R) (R) O BnO (R) (R) MeO- /MeOH, pH = 9 (S) NHAc 1.5 h, r.t., 95% OAc BnO OBn O ( S) HN (R) (R) O 7 (S) NHAc OH 8 Esquema 3.13 Una vez liberado el grupo OH, se intentó su oxidación directa a ácido con diversos oxidantes: reactivo de Jones (CrO3),5 O2 sobre Pd/C,6 RuO47 o PDC8. Sin embargo, ninguno de estos procedimientos dio los resultados esperados: o reaccionaba de forma incompleta hasta el aldehído, o no se podía aislar ningún compuesto, o en algún caso, directamente no reaccionaba. Por tanto, se decidió oxidar el alcohol en dos etapas, pasando por el aldehído y posterior oxidación al ácido. Aunque alguno de los métodos anteriormente mencionados oxidaba el alcohol hasta aldehído, lo hacía con bajos rendimientos. Por tanto, el procedimiento con el que se obtuvo mejor rendimiento fue utilizando el reactivo de Dess-Martin.9 Posteriormente, el aldehído fue oxidado utilizando el reactivo de Tollens [Ag(NH3)2+] (Esquema 3.14), que ha de ser sintetizado in situ: a partir de AgNO3, se hace reaccionar con NaOH, y el precipitado se redisuelve con NH4OH. 5 (a)Heilbron, I.; Jones, E.R.H.; Sondheimer, F. J. Chem. Soc. 1947, 1586-1590. (b) Heilbron, I.; Jones, E.R.H. J. Chem. Soc. 1949, 604-607. 6 An, G.; Ahn, H.; De Castro, K. A., Rhee, H. Synthesis, 2010, 3, 477-485. 7 Ashby, E.C.; Goel, A. B. J. Org. Chem. 1981, 46, 3936-3938. 8 Corey, E.J.; Schmidt, G. Tetrahedron Lett. 1979, 20, 399-402. 9 (a) Dess, D. B.; Martin, J. C. J. Org. Chem. 1983, 48, 4155-4156. (b) Dess, D. B.; Martin, J. C. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7277-7287. 48 OBn BnO (R) (R) BnO O (S) (R) HN NHAc BnO (R) HN 42% (R) (R) (R) 2) Tollens (S) OBn BnO 1) Dess-Martin (S) (R) (R) (S) H BnO (R) HN O O 8 (S) (S) ( S) OH O O OBn BnO NHAc (R) NHAc O H 9b 9a Esquema 3.14 Sorprendentemente, no se pudo aislar el compuesto con el grupo ácido carboxílico libre, sino que éste descarboxilaba a temperatura ambiente para formar una mezcla de los diastereómeros 9a y 9b, ya que, a pesar de que la reacción de Tollens tenga lugar en medio básico, el work up requiere un tratamiento ácido para la eliminación de la plata por precipitación de AgCl. Este tratamiento genera el grupo ácido, formando así un compuesto 1,3-dicarbonílico, que descarboxila a temperatura ambiente (Esquema 3.15). BnO OBn BnO O BnO O H -CO2 BnO HN HN NHAc NHAc HO O OBn O O BnO NHAc O HN BnO OBn O 9 Esquema 3.15 La estructura de ambos compuestos pudo ser elucidada utilizando técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y espectrometría de masas. La asignación completa de las señales de 1H RMN se realizó con experimentos bidimensionales y mediante un experimento 2D NOESY se pudo identificar cada compuesto (Figuras 3.5 y 3.6). 49 Figura 3.5. 2D-NOESY del producto 9a. Los OBn y el H del NH han sido omitidos para una mayor claridad. Para el compuesto 9a, se observan picos de cruce NOE entre los hidrógenos H3-H3a y H3a-H7a. Esto nos indica que se trata del diatereómero con configuración S en el C3. 50 6 7 H5 7a O4 H 3a N1 H H 2 3 NHAc H O 9b Figura 3.6. 2D-NOESY del compuesto 9b. Los OBn y el H del NH han sido omitidos para una mayor claridad. Para el compuesto 9b, no se observa pico de cruce NOE entre los hidrógenos H3-H3a, sino que se observan entre los hidrógenos H3-H5 y H3H7. Esto nos indica que se trata del diatereómero con configuración R en el C3. De esta forma, aunque no se haya logrado llegar al Cglicoaminoácido objetivo, se han logrado sintetizar dos C-glicoaminoácidos en su forma protegida, 9a y 9b, los cuales presentan una estructura muy restringida debido a la presencia del esqueleto lactama. Estos nuevos compuestos presentan en su estructura un resto análogo al GalNAc (verde) y, aunque no tan evidente, una parte aminoácido 51 (azul), que está protegido en forma amida para simular un enlace peptídico (Figura 3.7). BnO BnO OBn O BnO OBn O BnO HN HN NHAc NHAc O O "aminoácido enmascarado" "GalNAc" Figura 3.7 Posteriormente a este trabajo, la desprotección de los grupos OBn bajo atmósfera de H2, con Pd soportado sobre C como catalizador, permitirá llegar a dos nuevos C-glicoaminoácidos (Figura 3.8). HO OH HO O HO OH O HO HN HN NHAc O H Figura 3.8 H NHAc O 55 Se ha logrado la D-C-glicosilación del tri-O-bencil-2-nitro-Dgalactal utilizando como nucleófilo el N,O-acetal bicíclico derivado de serina 1, formándose el compuesto 2 con una elevada diastereoselectividad. Se generan tres nuevos centros estereogénicos, con un control total de la selectividad, ya que de los ocho compuestos posibles, únicamente se forma el compuesto 2 (Figura 4.1). BnO (R) BnO OBn (R) O (R) (S) O2N MeO2 C O (S) N O (R) (R) (S) O OMe 2 Figura 4.1 Por otro lado, se ha llevado a cabo la síntesis de dos Cglicopéptidos diastereómeros 9a y 9b, análogos del antígeno Tn, con una estructura bicíclica y, por tanto, con una libertad conformacional muy restringida. La síntesis se ha llevado a cabo en disolución, utilizando el compuesto 2 como producto de partida. 56 MeO2C N (S) (R) (S) BnO O (R) (R) BnO O O (S) (R) (S) O2N N O MeO2C (R)(S) ( R) (S) NO2 OMe OBn BnO BnO OBn (R) (R) O O 1 BnO 2 OBn (R) (R) BnO ( R) OMe O HN O BnO (S) (S) (R) O 9a NHAc H OBn (R) (R) BnO (R) HN O BnO (S) ( S) (S) O H NHAc 9b OBn (R) (R) BnO (R) HN O O O (S) (S) (R) N (R) (S) OMe O O 6 Esquema 4.1 El grupo NO2 fue reducido a NH2, produciéndose posteriormente un ataque intramolecular sobre el carbonilo del éster metílico y formación de la lactama espirocíclica. Tras la hidrólisis del N,O-acetal bicíclico y consiguiente diacetilación, se desacetila el grupo OH y es oxidado en dos etapas hasta el ácido, que inmediatamente descarboxila (Esquema 4.1). De esta forma se obtienen los dos C-glicopéptidos diastereómeros 9a y 9b, análogos del antígeno Tn, a escala miligramo. Obteniéndose 7 mg del compuesto 9a, y 11 mg del 9b. Posteriormente a este trabajo, se desprotegerán los grupos OBn, utilizando para ello una atmósfera de H2, empleando Pd soportado sobre C como catalizador, y se realizará el análisis estructural de ambos, combinando técnicas de Resonancia Magnética Nuclear y Cálculos de Dinámica Molecular. Los cálculos obtenidos en estos estudios se 57 compararán con los obtenidos en anteriores investigaciones para la diamida de D-O-D-GalNAc-L-Ser. Además, en un futuro se optimizará la reacción de acetilación para la obtención del compuesto 3 y, a partir de éste, sintetizar el primer Cglicopéptido objetivo (Esquema 4.2). Una vez sintetizado se llevará a cabo un estudio conformacional similar al anteriormente descrito. BnO BnO OBn HO O O2N CO2Me HO NHAc OH O AcHN MeHNOC OAc NHAc OH 3 Esquema 4.2 61 Los espectros de RMN 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro Bruker ARX-300 y un Bruker Avance-400. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm en la escala G y las constantes de acoplamiento (J) en hercios (Hz). Se utilizó como disolvente deuterado cloroformo, con TMS como referencia interna. Los análisis de electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con fuente Multi Mode, ionización ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo. Los ángulos de rotación óptica se midieron en un polarímetro Perkin.Elmer 341, utilizando celdas de 1.0 dm de longitud y de 1.0 ml de capacidad. La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel (Polichrom SI F254) sobre soporte de poliéster o aluminio y para su visualización se utilizó luz ultravioleta y revelador de ácido fosfomolíbdico en etanol. La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.040.06 mm (230-400 mesh). Todos los disolventes utilizados se purificaron utilizando técnicas estándar. 62 (2R,2’S,3’S,4’R,5’R,6’R)-2-Acetamido-3-acetoxi-2-(4’,5’-bis(benciloxi)6’-(benziloximetil)-3’-nitrotetrahidro-2H-piran-2’-il)-propanoato de metilo [3] y (2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-7-(Acetoximetil)-3,4-bis(benciloxi)-2(benciloximetil)-5-metil-4a-nitro-2,3,4,4a,7,7a-hexahidropirano[3,2c]pirrol-7-carboxilato de metilo [4] BnO (R) BnO OBn (R) BnO O (S) (R) (S) O2N NHAc MeO2 C (R) OAc ( 2R,2'S,3' S,4'R,5' R,6'R)-3 (R) BnO (R) OBn NO (R) 2 O (R) N (R) (R) OAc CO2 Me (2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-4 El compuesto 2 (150 mg, 0.21 mmol) se disuelve en THF (16 ml) en un matraz esférico y se le añade HCl 4 N (4.5 ml). La mezcla se agita durante una noche a 40 °C. El disolvente se elimina a vacio y el residuo se disuelve en piridina/Ac2O (2:1, 6 ml). La disolución se agita durante 3 h, se concentra y purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (Hexano/AcOEt, 1:1) para dar una mezcla de los compuestos 3 (72 mg, 0.11 mmol, 52 %), como un aceite viscoso; y 4 (75 mg, 0.12 mmol, 43 %) como un aceite viscoso amarillento. 63 (2R,2'S,3'S,4'R,5'R,6'R)-3 ሾߙሿଶ = - 27.0 (c 1.00 en CH2Cl2). HRMS (ESI) m/z = 665.2914 (M+H)+; calculado para C35H41N2O11+ = 665.271. 1 H NMR (300 MHz, CDCl3) d (ppm) 1.88 (s, 3H, CH3CO2), 1.91 (s, 3H, NCOCH3), 3.59 (s, 3H, CO2CH3), 3.61 (d, 1H, J = 11.4 Hz; BnOCHCHNO2) 3.95 - 4.09 (m, 2H, BnOCH2), 4.18 (m, 1H, CHCH2OBn), 4.34 (d, 1H, J = 11.8 Hz; PhCHaHbO), 4.38 (d, 1H, J = 11.0 Hz; PhCHcHdO), 4.41 – 4.52 (m, 5H, CH2OAc, PhCHeHfO, O2NCH, CHCHCH2OBn), 4.59 – 4.71 (m, 2H, Canomérico, PhCHcHdO), 4.77 (d, 1H, J = 10.0 Hz; PhCHeHfO), 4.89 (d, 1H, J = 11.8 Hz; PhCHaHbO), 6.54 (s, 1H, NH), 7.08 – 7.36 (m, 15H, Ph) (2R,3R,4R,4aR,7R,7aR)-4 HRMS (ESI) m/z = 647.2614 (M+H)+; calculado para C35H39N2O10+= 647.2605. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.98 (s, 3H, CH3C=N), 2.60 (s, 3H, CH3CO2), 3.64 (m, 1H; CHCHaHbOBn), 3.72 (s, 3H, CH3OCO), 3.85 (m, 1H; CHCHaHbOBn), 3.90 (t, 1H, J = 4.2 Hz; CHCHCHaHbOBn), 4.01-4.08 (m, 1H,CHCHCHaHbOBn), 4.44 (d, 1H, J = 11.9; PhCHcHdO), 4.51 (d, 1H, J =3.1 Hz; PhCHeHfO), 4.54 (d, 1H, J = 3.1 Hz; PhCHeHfO), 4.64 (d, 1H, J = 11.7 Hz; PhCHgHhO), 4.69 (s, 2H, AcOCH2), 4.75 (d, 1H, J = 11.9 Hz; 64 PhCHcHdO), 4.81 (d, 1H, J = 4.2 Hz; BnOCHCNO2), 4.82 (d, 1H, J = 11.7 Hz; PhCHgHhO), 5.07 (s, 1H, Canomérico); 7.39 – 7.24 (m, 15H, Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) į 20.6 (CH3C=N), 24.4 (CH3CO2), 52.8 (CH3OCO), 63.1 (PhCHgHhO), 65.8 (CHCHaHbOBn), 69.1 (BnOCHCNO2), 69.5 (Canomérico), 72.6 (AcOCH2), 72.8 (PhCHeHfO), 72.9 (PhCHcHdO), 74.3 (CHCHCHaHbOBn), 75.2 (CHCHCHaHbOBn), 118.9 (CD), 127.6, 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.3, 128.4, 128.4, 137.4, 137.47, 138.0 (Ph), 164.9 (C=N), 168.6 (CH3OCO), 169.7 (CH3CO2). (3R,3aS,5R,6R,7R,7'R,7aS,7'aS)-6,7-Bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)7'-metoxi-7',7'a-dimetil-espiro[1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2b]pirrol-3,3'-2H-oxazolo[4,3-b]oxazol]-2,5'-diona [6] BnO (R) BnO OBn (R) O (S) HN (R) (R) O O O (S) N (R) (S) OMe O (3R,3aS,5R,6R,7R,7'R,7aS,7'aS)-6 A una suspensión de Ni/Raney (2.00 g) en H2O (12 ml) se le añade ácido hexacloroplatínico (50 mg) y NaOH al 20% (400 Pl). La disolución se agita durante 2 h y 30 min a 50 °C. Se añade NaOH al 40% (6 ml) y se mantiene la agitación a la misma temperatura durante 1 h y 30 min más. Se forma una nube blanca en la parte superior del matraz. Ésta se elimina por decantación lavando con H2O caliente (3 x 15 ml) y EtOH (3 x 15 ml). El catalizador obtenido se suspende en EtOH (10 ml) y se prehidrogena 65 durante 10 min. Se añade una disolución del compuesto 2 (160 mg, 0.23 mmol) en EtOH (7 ml), y la mezcla de reacción se agita bajo H2 durante 3 h a temperatura ambiente y presión atmosférica. Se filtra sobre tierra de diatomeas y se evapora el filtrado, que se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 99:1) para obtener el compuesto 6 (70 mg, 0.11 mmol, 48 %) como un aceite. ሾߙሿଶ = +4.2 (c 1.00 en CHCl3). HRMS (ESI) m/z = 645.3041 (M+H)+; calculado para C36H41N2O9+ = 645.2807. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.59 (s, 3H; CH3), 1.62 (s, 3H; CH3), 3.49 (s, 3H; OCH3), 3.57 (d, 1H, J = 5.7 Hz; BnOCHCHN), 3.74 (m, 2H, CH2OBn), 4.12-4.19 (m, 2H, CHCH2OBn, CHCHCH2OBn), 4.37 (d, 1H, J = 9.5 Hz; OCHcHdPh), 4.55 (s, 2H; OCH2), 4.61-4.73 (m, 5H, NCH, OCH2Ph, OCHcHdPh, OCHeHfPh), 4.92-4.97 (m, 2H, OCHeHfPh, Hanomérico), 7.29-7.40 (m, 15H, Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 16.9 (CH3CN), 18.0 (CH3COMe), 51.6 (CH3O), 57.8 (NCH), 67.5 (CH2OBn), 68.69 (CD), 69.1 (OCHcHdPh), 71.0 (Canomérico), 71.9 (OCHcHdPh), 72.3 (CHCH2OBn), 73.5 (OCH2), 73.92 (OCHeHfPh), 76.8 (CHCHCH2OBn), 80.6 (BnOCHCHN) 103.0 (CH3CN), 108.1 (CH3COMe), 127.7, 127.7, 127.7, 127.8, 127.8, 128.1, 128.4, 128.5, 128.5, 128.7, 137.7, 138.1, 138.2 (Ph), 154.8 (NCO2), 173.6 (NCO). 66 Acetato de [(3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-3-acetamido-6,7-dibenciloxi-5- (benciloximetil)-2-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3il]metilo [7] BnO BnO OBn (R) (R) O (S) HN (R) (R) O (S) NHAc OAc (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-7 El compuesto 6 (150 mg, 0.23 mmol) se disuelve con THF (7 ml) en un matraz esférico y se le añade HCl 4 N (2.5 ml). La mezcla se agita durante 12 horas a 40 °C. El disolvente se elimina a vacio y el residuo se disuelve en piridina/Ac2O (2:1, 6 ml). La disolución se agita durante 3 horas, se concentra y purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 15:1) para dar el compuesto 7 (122 mg, 0.20 mmol, 87%) como un aceite viscoso incoloro. ሾߙሿଶ = +56.2 (c 1.00 en CHCl3). HRMS (ESI) m/z = 603.2701 (M+H)+; calculado para C34H39N2O8+ = 603.2701. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 1.96 (s, 3H; OCOCH3), 1.98 (s, 3H; NCOCH3), 3.55 (d, 1H, J = 7.6 Hz; BnOCHCHN), 3.63 (m, 2H, CHCH2OBn), 4.07 (m, 1H, CHCHCH2OBn), 4.13 (d, 1H, J = 4.4 Hz; CHCHCH2OBn), 4.27 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHaHbO), 4.31 (t, 1H, J = 7.6 67 Hz; NCH), 4.46 (d, 2H, J = 11.7 Hz; PhCHcHdO), 4.51 (s, 2H, AcOCH2), 4.52 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHaHbO), 4.58 (d, 1H, J = 11.7 Hz; PhCHcHdO), 4.70 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHeHfO), 4.70 (d, 1H, J = 7.6; Hanomérico), 4.88 (d, 1H, J = 11.6 Hz; PhCHeHfO), 6.18 (s, 1H; CONH), 6.42 (s, 1H; CONH), 7.25 – 7.40 (m, 15H, Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) G (ppm) 20.8 (OCOCH3), 23.1 (NCOCH3), 55.9 (NCH), 63.1 (CHCHCH2OBn), 63.2 (CD) 67.7 (CHCH2OBn), 71.4 (AcOCH2), 71.6 (CHCHCH2OBn), 73.4 (PhCHaHbO), 74.3 (PhCHeHfO), 75.6 (Canomérico), 76.5 (CHCHCH2OBn), 81.1 (BnOCHCHN), 127.7, 127.7, 727.8, 127.9, 128.2, 128.4, 128.5, 128.5, 128.7, 137.5, 138.0, 138.2 (Ph), 170.0 (OCOCH3), 170.6 (NCOCH3), 172.3 (NCO). (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3(hidroximetil)-2-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3il]acetamida [8] BnO (R) OBn (R) BnO O (S) (R) HN (R) O (S) NHAc OH (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-8 El compuesto 7 (122 mg, 0.20 mmol) se disuelve en 4 ml de MeOH y se le añaden 2 ml de una disolución de NaOMe en MeOH 0.5 M. Se deja bajo agitación durante 1.5 h. Posteriormente, se añaden un par de puntas de espátula de Dowex ácido y se filtra. El filtrado se concentra y 68 purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH, 15:1) para dar el compuesto 8 (107 mg, 0.19 mmol, 95%) como un aceite viscoso incoloro. ሾߙሿଶ = +89.8 (c 1.00 en CHCl3). HRMS (ESI) m/z = 561.2603 (M+H)+; calculado para C32H36N2O7+ = 561.2595. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.03 (s, 3H; CH3), 3.52 (m, 1H, CHaHbOBn), 3.62 (d, 1H, J = 6.3 Hz; BnOCHCHN), 3.72-3.81 (m, 2H, CHaHbOBn, OCHcHdPh), 4.03 (d, 1H, J = 12.0 Hz; OCHcHdPh), 4.13 (d, 1H, J = 4.5 Hz; CHCHCH2OBn), 4.15 - 4.24 (m, 1H, CHCHCH2OBn), 4.39 (t, 1H, J = 6.3 Hz; NCH), 4.53 (d, 1H, J = 11.6 Hz; OCHeHfPh), 4.54 (s, 2H, CH2OH), 4.60 (d, 1H, J = 11.9 Hz; OCHgHhPh), 4.68 (d, 1H, J = 6.3 Hz; Hanomérico), 4.72 (d, 1H, J = 11.6 Hz; OCHeHfPh), 4.90 (d, J = 11.9 Hz, 1H; OCHgHhPh), 6.60 (s, 1H, NH), 6.86 (s, 1H, NH), 7.19 - 7.52 (m, 15H, Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 22.8 (CH3), 56.3 (NCH), 63.9 (OCHcHdPh, CD), 67.3 (CH2OBn), 71.5 (CHCHCH2OBn), 71.7 (OCHeHfPh), 73.5 (CH2OH), 74.2 (OCHgHhPh), 76.5 (Canomérico), 76.6 (CHCHCH2OBn), 81.3 (BnOCHCHN), 127.9, 127.9, 128.0, 128.1, 128.4, 128.5, 128.7, 137.5, 137.8, 138.0 (Ph) 170.6 (NCOCH3), 174.1 (NCO). 69 (3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-2-oxo1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3-il]acetamida [9a] y (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-N-[6,7-bis(benciloxi)-5-(benciloximetil)-2-oxo1,3a,5,6,7,7a-hexahidropirano[3,2-b]pirrol-3-il]acetamida [9b] BnO BnO OBn (R) (R) O (S) HN (S) (R) O BnO (S) BnO O (S) (S) HN (R) (R) H NHAc (3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9a OBn (R) (R) O NHAc H (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9b El compuesto 8 (47 mg, 0.084 mmol) se disuelve en 1 ml de CH2Cl2. Se le añade 1 ml de una disolución de peryodinano de Dess – Martin en CH2Cl2 y se deja reaccionando bajo agitación durante 1 h, a temperatura ambiente. La reacción se detiene añadiendo una disolución 1:1 de NaS2O3 y NaHCO3 (5 ml) y posteriormente diluida con CH2Cl2 (10 ml). Las fases se separan y la fase acuosa se lava con CH2Cl2 (3x10 ml). La combinación de las fases orgánicas se lava con una disolución saturada de NaCl, se seca con Na2SO4 y se concentra. Por otro lado, se disuelve AgNO3 (139 mg, 0.84 mmol) en H2O y se le añade NaOH al 10% gota a gota. Se va formando un precipitado de color pardo oscuro. Cuando deje de precipitar, se le añade gota a gota NH3OH hasta que el precipitado se redisuelva por completo. Esta disolución se añade sobre el crudo obtenido anteriormente disuelto en CH2Cl2 (5 ml). Se deja reaccionando durante dos horas a 50 qC. Conforme va reaccionando se observa la aparición de un precipitado negro (Ag0). Una vez la reacción 70 ha concluido, se añade HNO3 hasta alcanzar un pH neutro. Se añade HCl 2N y NH4Cl para formar AgCl y a continuación se filtra en tierra de diatomeas. El filtrado se concentra y se lleva a cabo una extracción con AcOEt y H2O para eliminar sales. La fase orgánica se seca en Na2SO4, se concentra y se purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (CHCl3/MeOH, 95:5) para los compuestos 9a (7 mg, 0.013 mmol, 16 %) y 9b (11 mg, 0.021 mmol, 26 %) en una relación 38:62 (determinada por pesada y por 1H NMR) como aceites viscosos amarillentos. (3S,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9a HRMS (ESI) m/z = 531.2471 (M+H)+; calculado para C31H35N2O6+ = 531.2490. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.06 (s, 3H; CH3), 3.55 (d, 1H, J = 5.0 Hz; BnOCHCHN), 3.70-3.79 (m, 2H; BnOCH2CH), 3.84-3.91 (m, 1H; BnOCHCHN), 4.16 (s, 1H; BnOCH2CHCH), 4.16-4.19 (m, 1H; BnOCH2CH), 4.52 (d, 1H, J = 12.0 Hz; PhCHaHbO), 4.56 (s, 2H; PhCH2O), 4.62-4.69 (m, 3H, PhCHcHdO; Hanomérico), 4.77 (d, 1H, J = 12.0; PhCHaHbO), 4.81-4.90 (m, 2H; PhCHcHdO, HD), 5.86 (s, 1H; NH), 6.03 (d, 1H, J = 8.0 Hz; AcNH), 7.26-7.47 (m, 15H; Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 22.8 (CH3), 52.7 (CHD), 56.8 (BnOCHCHN), 67.3 (BnOCH2), 69.1 (CHanomérico), 72.0 (PhCHaHbO), 72.8 (BnOCH2CHCH), 73.7 (PhCH2O), 74.4 (PhCHcHdO), 76.5 (BnOCH2CH), 80.4 (BnOCHCHN), 127.7, 127.8, 127.9, 128.0, 128.0, 128.5, 128.6, 128.9, 137.5, 137.6, 138.1 (Ph), 170.5 (NCO), 170.7 (NCO). 71 (3R,3aS,5R,6R,7R,7aS)-9b HRMS (ESI) m/z = 531.2471 (M+H)+; calculado para C31H35N2O6+ = 531.2490. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3) G (ppm) 2.08 (s, 3H; CH3), 3.56 (d, 1H, J = 8.2 Hz; BnOCHCHN), 3.67 (m, 2H; BnOCH2CH), 3.92 (t, 1H, J = 8.2 Hz; BnOCHCHN), 4.07 (t, 1H, J = 6.4 Hz; BnOCH2CH), 4.12 (s, 1H; BnOCH2CHCH), 4.2-4.53 (m, 3H; PhCHaHbO, PhCHcHdO, Hanomérico), 4.57 (d, 1H, J = 11.7 Hz; PhCHcHdO), 4.64 (d, 1H, J = 11.5 Hz; PhCHeHfO), 4.73 (d, 1H, J = 11.4 Hz; PhCHaHbO), 4.77-4.83 (m, 1H; HD), 4.86 (d, 1H, J = 11.5 Hz; PhCHeHfO), 6.13 (d, 1H, J = 7.5 Hz; AcNH), 6.31 (s, 1H; NH), 7.26-7.45 (m, 15H; Ph). 13 C NMR (100 MHz, CDCl3) į (ppm) 23.2 (CH3), 50.4 (CHD), 51.7 (BnOCHCHN), 68.3 (BnOCH2), 70.8 (BnOCH2CHCH), 71.6 (PhCHaHbO), 72.4 (BnOCH2CH), 73.6 (PhCHcHdO), 74.7 (PhCHeHfO), 78.0 (CHanomérico), 81.9 (BnOCHCHN), 127.9, 128.0, 128.2, 128.4, 128.5, 128.6, 128.9, 137.4, 137.9, 138.3 (Ph), 171.2 (NCO), 171.9 (NCO). 74 En este anexo se presentan los espectros de 1H RMN, 13C RMN y las correspondientes correlaciones 1H – 1H (COSY) y 1H – 13C (HSQC) de todos los compuestos cuya nueva preparación ha sido expuesta en la Parte Experimental de esta memoria. 7.2 6.8 6.4 6.0 5.6 5.2 4.8 4.4 f1 (ppm) 4.0 3.6 6.00 5.11 1.84 0.89 1.98 1.96 4.98 4.95 4.86 4.83 4.77 4.76 4.73 4.70 4.57 4.56 4.54 4.50 4.48 4.44 4.43 4.39 4.28 4.26 4.24 4.14 4.11 4.10 4.09 4.06 4.03 3.70 3.66 6.61 1 7.51 0.97 0.94 2.01 0.91 16.46 7.37 7.35 7.33 7.32 7.29 7.26 7.25 7.21 7.20 7.19 75 H RMN 300 MHz en CDCl3 3.2 2.8 2.4 2.0 170 160 150 6.2 5.8 13 5.4 140 130 120 5.0 110 4.6 f1 (ppm) 100 90 f1 (ppm) 4.2 80 3.8 70 60 52.98 6.6 3.4 C RMN 100 MHz en CDCl3 3.0 2.6 50 40 30 20.74 24.59 2.81 2.95 1.18 1.31 0.78 3.03 1.25 2.05 1.18 2.02 1.19 1.15 1.20 1.22 1.00 15.68 1.98 2.60 4.80 4.80 4.74 4.69 4.65 4.53 4.51 4.45 4.06 4.05 4.04 3.91 3.90 3.89 3.88 3.86 3.85 3.83 3.77 3.72 3.65 3.64 3.63 3.62 5.07 5.05 7.38 7.37 7.35 7.34 7.33 7.32 7.31 7.29 7.29 7.28 7.27 7.26 7.25 1 77.48 77.16 76.84 75.39 74.45 73.07 72.99 72.74 69.66 69.30 65.93 63.24 7.0 128.56 128.53 128.53 127.86 127.82 119.10 7.4 138.14 137.63 137.56 169.90 168.75 165.06 76 H RMN 400 MHz en CDCl3 2.2 20 77 COSY en CDCl3 HSQC en CDCl3 20 30 40 50 70 80 90 100 110 120 130 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 f1 (ppm) 60 170 160 150 140 130 120 4.6 4.2 f1 (ppm) 110 100 90 f1 (ppm) 3.8 80 3.4 70 5.98 1.00 1.02 0.97 3.00 1.96 5.02 2.02 0.97 5.0 3.0 60 50 17.98 16.92 13 5.4 51.63 5.8 73.92 73.50 72.32 71.90 69.10 68.69 67.50 57.84 6.2 80.58 6.6 0.98 0.97 15.03 1.62 1.59 4.97 4.96 4.95 4.92 4.73 4.70 4.67 4.64 4.61 4.55 4.38 4.36 4.17 4.15 4.14 3.80 3.78 3.77 3.76 3.72 3.71 3.70 3.69 3.58 3.56 3.49 7.40 7.39 7.37 7.36 7.34 7.29 1 103.00 7.0 128.66 128.54 128.44 128.07 127.83 127.81 127.75 127.74 127.72 108.14 7.4 138.20 138.12 137.69 154.75 173.57 78 H RMN 400 MHz en CDCl3 2.6 2.2 40 1.8 30 1.4 C RMN 400 MHz en CDCl3 20 1 79 COSY en CDCl3 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 4.5 f1 (ppm) 3.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 HSQC en CDCl3 10 20 30 40 50 70 80 90 100 110 120 130 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 f2 (ppm) 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 f1 (ppm) 60 170 160 150 6.6 140 6.2 13 130 (R) O 5.8 120 5.4 110 5.0 4.6 f1 (ppm) 100 90 f1 (ppm) 4.2 80 3.8 70 6.01 (S) 3.19 HN O 2.10 BnO 2.10 (R) 1.00 1.99 5.08 (R) (R) 3.4 60 23.17 20.91 7.0 0.96 BnO 55.95 7.4 0.98 15.45 1.98 1.96 4.89 4.86 4.71 4.69 4.68 4.59 4.56 4.52 4.50 4.47 4.44 4.32 4.30 4.28 4.28 4.25 4.13 4.11 4.07 4.06 3.66 3.65 3.64 3.62 3.61 3.59 3.59 3.57 6.17 6.41 7.36 7.35 7.33 7.32 7.30 7.29 7.28 7.27 7.26 1 81.21 76.54 75.70 74.41 73.52 71.70 71.52 67.79 63.25 63.16 7.8 138.29 138.10 137.60 128.82 128.55 128.45 128.27 127.98 127.88 127.84 127.77 172.36 170.74 170.13 80 H RMN 400 MHz en CDCl3 OBn (S) NHAc OAc 7 3.0 2.6 50 2.2 40 1.8 C RMN 400 MHz en CDCl3 30 20 81 COSY en CDCl3 HSQC en CDCl3 170 160 150 13 140 130 5.5 120 5.0 110 4.5 f1 (ppm) 100 90 f1 (ppm) 4.0 80 3.5 70 3.0 60 2.5 50 40 30 22.76 6.0 29.73 6.5 56.34 7.0 3.09 2.17 1.30 1.19 1.00 2.03 3.98 1.01 1.01 0.92 1.05 0.86 0.86 15.07 2.03 4.92 4.89 4.74 4.71 4.69 4.67 4.61 4.58 4.54 4.52 4.39 4.20 4.19 4.18 4.17 4.14 4.12 4.05 4.02 3.77 3.75 3.63 3.61 3.54 3.53 6.60 7.41 7.39 7.38 7.36 7.33 7.32 7.30 7.28 7.26 6.86 1 81.28 76.52 74.23 73.47 71.66 71.51 67.33 63.85 7.5 138.00 137.80 137.52 128.72 128.54 128.42 128.17 127.97 127.90 127.85 127.68 170.55 174.10 82 H RMN 400 MHz en CDCl3 2.0 1.5 C RMN 400 MHz en CDCl3 20 83 COSY en CDCl3 HSQC en CDCl3 170 160 150 140 6.2 13 130 5.8 120 110 4.2 100 90 f1 (ppm) 80 3.8 70 60 2.89 0.99 2.06 3.89 3.74 3.73 3.55 3.54 1.02 5.0 4.6 f1 (ppm) 2.00 4.16 1.98 6.04 6.02 5.86 1.96 0.98 1.97 2.97 0.82 4.88 4.85 4.83 4.78 4.75 4.66 4.63 4.56 4.54 4.51 5.4 22.83 6.6 52.71 7.0 56.84 7.4 0.84 14.95 7.42 7.41 7.38 7.36 7.36 7.34 7.33 7.31 1 80.41 76.47 74.43 73.69 72.76 72.03 69.07 67.26 7.8 138.11 137.61 137.51 128.94 128.63 128.48 128.00 127.96 127.87 127.84 127.73 170.72 170.53 84 H RMN 400 MHz en CDCl3 3.4 3.0 50 2.6 40 2.2 C RMN 400 MHz en CDCl3 30 20 85 COSY en CDCl3 HSQC en CDCl3 86 1 H NOESY en CDCl3 2.0 2.5 3.0 3.5 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 f2 (ppm) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 f1 (ppm) 4.0 170 160 150 140 5.8 13 130 5.4 120 5.0 110 4.6 f1 (ppm) 100 90 f1 (ppm) 4.2 3.8 80 70 3.4 60 3.0 50 2.6 40 30 23.22 6.2 32.06 29.83 6.6 51.67 50.42 7.0 2.89 1.00 2.16 0.98 1.05 0.95 0.98 1.01 1.01 1.02 1.00 2.98 0.82 0.88 15.05 2.08 4.87 4.84 4.82 4.80 4.78 4.74 4.72 4.66 4.63 4.59 4.56 4.50 4.47 4.45 4.12 4.07 3.92 3.70 3.68 3.67 3.66 3.65 3.57 3.55 6.31 6.14 6.12 7.40 7.39 7.37 7.36 7.35 7.33 1 81.95 77.98 74.72 73.64 72.37 71.64 70.81 68.31 7.4 138.33 137.94 137.37 128.85 128.58 128.50 128.39 128.22 127.99 127.95 171.88 171.16 87 H RMN 400 MHz en CDCl3 2.2 C RMN 400 MHz en CDCl3 20 88 COSY en CDCl3 HSQC en CDCl3 89 1 H NOESY en CDCl3