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UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR Decanato de Estudios de Postgrado Maestrı́a en Fı́sica MÉTODO DE MONTECARLO PARA SIMULAR LA DINÁMICA DE LA NEUROSECRECIÓN. Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolı́var por Alfredo Enrique Macias Medri. Como requisito parcial para optar al grado de Magister en Fı́sica. Realizado con la tutorı́a del Profesor Ricardo Silva. Julio, 2007. ii iii iv Agradecimientos. En primer lugar quiero agradecer incondicionalmente a mis padres por apoyarme y aconsejarme no sólo en el desarrollo de esta tesis, sino también durante el trayecto de la carrera, aún en los momentos más difı́ciles. Quien sabe como serı́a yo, si no fuese por ellos ..... A mi tutor y amigo, el profesor PhD. Ricardo Silva por su guı́a, sus sabios concejos y por la paciencia que él me tuvo desde el primer dı́a de la realización de esta tesis. La totalidad de las ideas, cálculos, conjeturas y redacciones fueron sabias y detalladamente tutoradas por su persona, ası́ como también del planteamiento y la “limitación” del problema de investigación. A la Universidad Simón Bolı́var, en particular al Departamento de Fı́sica, a la Coordinación de Fı́sica y, muy especialmente, al Laboratorio de Biofı́sica y Electrofisiologı́a, quienes sin el apoyo logı́stico que estos me brindaron, hubiese sido imposible de realizar esta tesis. Estoy altamente agradecido con el personal del Laboratorio de Biofı́sica y Electrofisiologı́a por darme más que un apoyo, una mano amiga con la que siempre conté. Al profesor PhD. Jacinto Liendo (CoTutor), por su valiosa colaboración en la revisión de los cálculos, modelos, redacción y discusión del trabajo de investigación. Al profesor PhD. Luis Lara, quien fue el causante directo de iniciar esta investigación y además, de la significativa colaboración en la discusión de los modelos y la redacción del manuscrito. A mis amigos en general y sin excepción (estudiantes, profesores y empleados de la Universidad Simón Bolı́var), quienes de una u otra forma influyeron positivamente para el desarrollo de esta tesis. v RESUMEN. Se elabora un modelo de simulación basado en dinámica molecular y pasos de MonteCarlo, para el movimiento vesicular, organización espacial dentro de un botón sináptico y reacciones postsinápticas ante estı́mulos repetitivos. Se reemplaza el pool sináptico por un paralelepı́pedo recto y las vesı́culas por esferas. En cada iteración, se calculan las fuerzas que en primera instancia influyen sobre cada vesı́cula (eléctricas, clatrato de agua y fricción). Los elementos eléctricos son la membrana presináptica, el lı́quido extracelular en la hendidura sináptica, el lı́quido intracelular y otras vesı́culas dentro de cierto perı́metro. Se propuso una fuerza del clatrato proporcional al volumen solapado entre dos o más clatratos. El tipo de movimiento vesicular es de arrastre, debido a la fricción con el lı́quido intracelular, donde las ecuaciones de movimiento son las soluciones de la segunda ley de Newton. Dichas ecuaciones contienen suficientes variables que caracterizan el medio y vesı́culas, simulando ası́ una variedad de neuronas. Las constantes implı́citas fueron tomadas de la literatura, estimadas mediante teorı́as fı́sicamente reproducibles o tanteadas computacionalmente obteniendo algún evento deseado. La fusión ocurre cuando la vesı́cula llega a la mebrana y cambia de estado mediante un valor probabilı́stico. Las primeras simulaciones fueron de llenado vesicular (inicialmente sin vesı́culas e incorporando temporalmente mediante una función predeterminada). En equilibrio, se relacionaron las fusiones vesiculares con los potenciales en miniatura y se comprobó que la distribución de fusión es similar a una de Poisson. Se determinaron perfiles de densidad vesicular y se compararon con experimentos realizados en otros estudios. Con los equilibrios del llenado, se cambió periódicamente la probabilidad de fusión, modelando ası́ excitaciones periódicas, evidenciándose propiedades plásticas en los potenciales postsinápticos asociadas a deformaciones de perfiles. Los resultados mostraron que este simulador puede ser una alternativa a desarrollos experimentales para algunos estudios de transmisión sináptica. Palabras Claves .- MonteCarlo Hı́brido, neurosecreción, movimiento vesicular, distribución vesicular, plasticidad sináptica. Índice general. 1 Introducción. 1 1.1 Preámbulo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.2 Planteamiento del problema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.3 Objetivos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.3.1 General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.3.2 Especı́ficos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Estructura de la tesis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.4 2 Fisiologı́a y funcionamiento de la neurona. 9 2.1 La neurona y sus partes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.2 La ecuación de Nernst-Planck. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.3 Potencial de acción y su propagación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.4 Transmisión sináptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 2.5 Ciclo de las VSs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.6 Potenciales en miniatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 2.7 Depresión, facilitación y plasticidad sináptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3 Ecuaciones del movimiento vesicular (EMV). 27 3.1 Modelo de simulación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.2 Campos eléctricos (CEs). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.3 Fuerza eléctrica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.4 Fuerzas del clatrato de agua. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 3.5 Fuerzas de fricción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.6 Desplazamiento vesicular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 4 Metodologı́a. 37 4.1 Simplificación del modelo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 4.2 Estimación de valores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2.1 Variables espaciales (RV , H, L, d y b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2.2 Variables de carga eléctrica (σ, ρ, ρ̃ y ρV ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4.2.3 Constantes del medio (K y µ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 4.2.4 Masa de las VSs (mV ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41 vi vii 4.3 4.2.5 Variable temporal (∆t). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.2.6 Clatrato de agua (p). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.2.7 Fusión de VSs en estados de reposo y excitado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 Detalles de las simulaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 5 Resultados. 46 5.1 Simulaciones de llenado vesicular (SLLVs) en el PS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 5.2 Reescalamiento espacio-temporal. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 5.3 Distribución vesicular (DV) en el PS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 5.4 SLLVs y DVs variando mV , µ y PF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 5.5 Excitaciones periódicas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 6 Análisis de los resultados. 69 6.1 Apectos generales del simulador. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 6.2 Comportamientos aislados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 6.2.1 Variación de ∆t. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 6.2.2 Variación de mV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 6.2.3 Variación de µ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 6.2.4 Variación de PF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 6.3 Equivalencia de los MEPP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 6.4 DVs en el PS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 6.5 Plasticidad sináptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 7 Conclusiones y recomendaciones. 87 A Integrales de la fuerza eléctrica. 99 B Fuerzas magnéticas entre VSs. 102 C Espesor del clatrato de agua. 104 D Cadena de Markov. 109 2+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 +2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 D.1 Captura de Ca D.2 Rechazo de Ca D.3 Fusión de la VS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 D.4 Liberación del neurotransmisor. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 E Códigos de las simulaciones. 114 E.1 Para la neurosecreción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 E.2 Cálculo de DV en masa/carga y energı́a. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 E.3 Cálculo de promedios por sección de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119 E.4 Libreria común (“mlg03.h”). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120 Índice de tablas. 2.1 Potencial transmembrana (∆ψ) en tres tipos de células excitable (mV ). . . . . . . . . . . . 14 4.1 Concentraciones de iones dentro y fuera de la célula (mM/l). En la última fila se ha calculado la carga de la VS con σ = −0.05C/m2 y ρV = 1.1ρ. Para el músculo de rana se ha supuesto que existen VSs dentro de éste, aún cuando se sabe que es un argumento fisiológicamente falso. Radios efectivos de las VSs (10−9 m). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Volúmenes máximos de solapamiento y moléculas de agua para este volumen. . . . . . . . . Fuerzas máximas debido al clatrato y valores de p. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 41 42 44 4.2 4.3 4.4 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 6.1 Orden de las variables que se introducen durante la ejecución del código de la sección E.1. Los valores que poseen el sı́mbolo “#”, indican que en cada simulación se estableció un valor particular, mientras que en las variables restantes, el valor permaneció constante en todas las simulaciones. En la columna Simulación, el sı́mbolo “=” señala que el valor es igual al estimado. La columna indicada como Potencia indica el orden de magnitud que corresponde al valor de la respectiva fila. Nótese que, entre otras, las variables espaciales (sección 4.2.1) se mantuvieron constantes en todas las simulaciones, con valores aproximados a los estimados en el capı́tulo anterior. Las últimas dos variables no se introducen en el simulador como parámetros del código en ejecución, sino como parámetros de comando. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Configuraciones de valores de las constantes para cada simulación (unidades en MKS). El orden de magnitud de cada variable está indicado en la tabla 5.1. Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la casilla de la misma columna en la fila anterior. El sı́mbolo “=” significa que el valor de la casilla corresponde al valor estimado (tabla 5.1). Las simulaciones 11, 12 y 13 se realizaron con la configuración indicada, y los reescalamientos propuestos en la sección 5.2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Resultados de los cálculos de algunas variables que se mantienen constantes durante la ejecución de las simulaciones (las unidades están en MKS). Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la casilla de la misma columna en la fila anterior. Las columnas indicadas como Φ(eq.) y hδri(eq.)/2RV son resultados de las simulaciones que se obtienen en estados de equilibrio, y que se explican más adelante. La última columna es la localización del PD teórico calculado con las ecuaciones 4.3 y 5.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fuerzas que experimenta la VS. X̂ es el signo de X, ρcv ≡ −3σ/RV y ρcl ≡ −σ/d. . . . . . . Configuración de valores para SLLVs con excitaciones periódicas. Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la fila anterior. La columna de cfg (no la de CFG) indica la configuración de parámetros que se encuentran en la tabla 5.2. En las CFG.30-51 se escogió t̃ = 20000 y en las CFG.52-73 se tomó t̃ = 30000, donde t̃ es el número de iteraciones al cual se llevó la simulación antes de ser perturbado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fracciones relativas de VSs en cada fase (dAC, dCC y dCE). La variable ∆Φ̂ es el excedente (cantidad negativa) o sobrante (cantidad positiva) de la distribución ΦdCA + ΦdCC + ΦdCE con respecto a los valores encontrados en las simulaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . viii 47 49 50 58 64 82 Índice de figuras. 1.1 1.2 Red neuronal biológica. “Dissociated culture of rat hippocampal neurons”, Paul De Koninck (2005), http://www.greenspine.ca/en/dissociated culture.html. . . . . . . . . . . . . . . . Sinapsis con neuronas de rata, cultivadas en laboratorio. Los pequeños cı́rculos que se encuentran en el BS (arriba) son las VSs. La transmisión sináptica ocurre cuando una o más VSs llegan a la membrana del BS y liberan el neurotransmisor. . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 2.1 Izquierda, representación de las partes de la neurona. Derecha, neurona de la médula espinal [5]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Representación gráfica de la vaina de mielina que envuelve al axón de la neurona. . . . . . . 2.3 Estimulación de la membrana del axón: (a) y (b) estı́mulos que no llegan al potencial de umbral; (c) la atenuación es propagada; (d) apariencia del PA para un estı́mulo superior al umbral. Las lı́neas punteadas indican el movimiento del impulso. . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Representación de la propagación del PA (difusión lateral de K + y N a+ ). Si existiera la vaina de mielina, el trayecto iónico interno serı́a tan largo como el largo de la célula de Schwann. . 2.5 Microfotografı́a de un corte transversal de una SNM [38]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6 Transmisión sináptica excitatoria (fuente desconocida). Un PA viaja a lo largo del axón de una neurona y llega al BS de ésta, causando una elevación del PM que abre los canales de Ca2+ . El flujo hacia dentro de calcio inicia una serie de eventos que culminan en el acercamiento (hipotético) y fusión de la VS con la MP, liberando el neurotransmisor acumulado en la hendidura sináptica. Luego, las moléculas de neurotransmisor se difunden hasta llegar a los receptores de la próxima célula excitable, desencadenando una variedad de funciones, dependiendo del subtipo de receptor, entre los cuales está la apertura de canales de N a+ , que producen una señal excitatoria postsnáptica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Representación de una VS y sus proteı́nas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.8 Esquematización del ciclo de las VSs (http://www.cip.ed.ac.uk/members/HRB/cousin [Cousin M., 2005]). (1) Exocitósis. Fusión de la VS y liberación parcial o completa del neurotransmisor en el RRP. (2) Si el mecanismo de fusión resulta inefectivo, ocurre Kiss-and-run, donde la VS se devuelve al PS. (3) Transporte de la estructura vesicular sobre la MP hacia fuera de la sinapsis y acoplamiento de clatrinas. (4) Desprendimiento de la estructura ya moldeada por la clatrina. (5) Desacoplamiento de las proteı́nas de clatrina de la VS. (6) Introducción del neurotransmisor en la VS. (7) Transporte de la VS hacia el reservorio. (8) Transporte de la VS hacia el PS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9 MEPPs en una SNM de rana. Fatt y Katz en 1950 [13] (ver también capı́tulo 10 de [38]). . . 2.10 Izquierda, distribución cuantizada de las amplitudes de los EEPPs. El eje vertical es el número de observaciones y el horizontal las amplitudes (mV ). La diferencia entre esta gráfica y los resultados de Boyd y Martin, está en que estos investigadores calcularon el número de observaciones como xvm (vm es el promedio de las amplitudes de los EEPPs para cada contenido cuántico). Derecha, variación del cociente entre las amplitudes del k-ésimo pico con el siguiente, en la distribución cuantizada de los EEPPs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.11 Ilustración de la FS seguida de la DS en una secuencia de estı́mulos repetitivos [53]. . . . . ix 10 12 16 17 18 20 21 22 23 24 26 x 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 Modelo para un PS con VSs: Paralelepı́pedo recto con esferas dentro. . . . . . . . . . . . . Representación del transporte axonal de VSs hacia el PS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aproximación de campo medio para las cargas de las membranas bilipı́dicas . . . . . . . . . La iév en un sistema de coordenadas. El plano z = 0 coincide con la MP. . . . . . . . . . . Una esfera en un CE no-uniforme. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Solapamiento de una sección del clatrato de agua. El radio completo de las VSs es R = RV + R̃, donde RV es el radio de la VS sin el clatrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 28 29 30 32 . . . . . 38 4.1 Esquema sobre los eventos que le ocurren a las N VSs en un paso de MonteCarlo. 5.1 Variación del lugar del PD, z∗ (ver ecuaciones 4.3 y 4.2), como función de la fracción volumétrica vesicular, para tres valores de b. Las DVCs fueron tomadas de la cfg.01 (ver tabla 5.2). . . . SLLVs variando el alcance de los CEs entre VSs, b. (A) Variación temporal (VT) de la fracción volumétrica vesicular (ecuación 5.2) incluyendo todas las interacciones entre las VSs, Φ01 (t). Se observa que después de ≈ 104 iteraciones, Φ01 ≈ 0.13 (13% de ocupación vesicular). (B) Diferencia relativa de las variaciones temporales de Φcf g (t) con respecto a Φ01 (t). Para la cfg.04, el número de VSs en el PS es grande en comparación con la cfg.02 y cfg.03. (C) VT del caminio libre medio para la cfg.01. Después de ≈ 104 iteraciones, hδri01 ≈ 2.1×2R. (D) Diferencia relativa de la variación temporal del DM de configuraciones no-exactas (cfg.0204) con respecto a la variación exacta (cfg.01) (ver [91] con NC = 530). La leyenda que aparece en la gráfica A, corresponde a las curvas de las gráficas B y D. Las lı́neas discontinuas en las gráficas B y D indican el valor de equilibrio de la simulación. . SLLVs variando ∆t. (A) VT de Φcf g para diferentes ∆t. (B) Variación de Φcf g en equilibrio, con cambios de ∆t. Cada punto corresponde al valor de equilibrio encontrado en la gráfica A. (C) VT de hδri para diferentes ∆t (ver [91] con NC = 150). (D) Variación de hδri en equilibrio, con cambios de ∆t. Cada punto corresponde al valor de equilibrio encontrado en la gráfica B. La leyenda corresponde a las curvas de las gráficas A y C. En el orden de esta leyenda, corresponde a la gráfica A de las curvas de abajo hacia arriba y en la gráfica C de arriba hacia abajo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . SLLVs variando λα con β = −1.18. (A) VT de Φcf g para diferentes λα . (B) Φcf g en equilibrio variando λα . (C) VT de hδricf g para diferentes λα (ver [91] con NC = 130). (D) hδricf g en equilibrio variando λα . La leyenda que aparece en la gráfica B corresponde a las curvas de las gráficas A y C. . . . DV o perfil de densidad de 4 configuraciones para dos tiempos. ns = 64 es el número de capas rectangulares sucesivas, paralelas a la MP y de espesor H/ns , que conforman el PS y mediante las cuales se calculó la DV. En la primera fila de gráficos se varia b, y en la segunda se varia ∆t. Se aprecia los diferentes perfiles que pueden producirse con cada configuración. DVs para los 4 casos planteados en la tabla 5.4 (ns = 64). En cada gráfica (caso) se varı́a ρV , ρ y ρ̃ de tal manera que se obtiene una combinación de tipos de fuerzas en particular que experimenta la VS (atracción / repulsión), con el PD y la MP. . . . . . . . . . . . . . . . DVs para la cfg.17 (caso 4) cada 100 iteraciones (ns = 64). . . . . . . . . . . . . . . . . . Valores de equilibrio para Φcf g y hδricf g en las SLLVs, variando mV (gráficas A y B), µ (gráficas C y D) y PF (gráficas E y F). Cada valor fue calculado promediando las últimas 30000 iteraciones de cada SLLV. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DVs o perfiles de densidad vesicular variando (A) mV , (B) µ y (C) PF . Las curvas fueron determinadas para t = 70000 iteraciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 34 46 52 53 56 57 59 60 61 62 xi 5.10 Esquematización de la VT de la probabilidad de fusión para simular excitaciones periódicas. 5.11 SLLVs hasta t̃ iteraciones y posteriormente se excita el sistema cambiando la probabilidad de fusión a PE . Las cuatro gráficas de arriba se realizaron para la cfg.03 (tabla 5.2) y en las cuatro de abajo se mantuvo la probabilidad de fusión excitatoria constante (PE = 0.15). Antes de las t̃ iteraciones el comportamiento de Φ(t) es similar al mostrado en la sección 5.1. 5.12 Simulaciones de excitaciones periódicas, cambiando la probabilidad de fusión de PF a PE y de PE a PF , cada T /2 iteraciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.13 Cálculos de Φ(k) (ecuación 5.4) para las simulaciones presentadas en las gráficas de la figura 5.12 (en el mismo orden de presentación). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 65 67 68 6.1 Izquierda, ajuste de una combinación lineal y exponencial para la variación de hδri con ∆t. Derecha, variación de Φ con hδri al cambiar ∆t. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2 (A) Gráfica 5.8.B ampliada y ajustando una recta. (B) Variación de Φ con respecto a hδri en equilibrio al cambiar mV . Nótese que el rango de hδri/2RV es 0.04, mientras que en la variación de ∆t es 1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 (A) Variación del DM con el inverso de la viscocidad del LI con un ajuste a una parábola. (B) Variación de Φ con respecto a hδri en equilibrio al cambiar µ. . . . . . . . . . . . . . 6.4 (A) Variación − ln Φ vs. − lnhδri. (B) Variación hδri vs. Φ al cambiar PF . . . . . . . . . . 6.5 Histograma normalizado sobre el conteo de VSF con distribución Gaussiana. . . . . . . . . 6.6 Cocientes entre la distribución cuantizada de k VSF y k + 1, entre t y t + n0 ∆t iteraciones. En las cuatro gráficas de arriba se varı́a n0 (cfg.03) y en las cuatro restantes se cambia cfg (con n0 = 3 × 9). Las lı́neas rectas corresponden a la DP. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.7 Cocientes de la distribución cuantizada, variando (A) ∆t, (B) mV , (C) µ y (D) PF . . . . . 6.8 Valores de teóricos (barras oscuras) y de las SLLVs (barras claras) para z∗ . En las simulaciones, z∗ fue encontrado como aquel valor de z en el cual φ era máxmo. . . . . . . . . . . . . . . 6.9 Una DV compuesta por dos distribuciones (z∗ /H = 0.5). (A) Distribución debido a la atracción al PD, (B) distribución asociada a la repulsión de VSs, y (C) suma de las dos anteriores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.10 Ajuste de la ecuación 6.4 (lı́nea continua) para 4 DVs obtenidas en las SLLVs (cuadrados). El error cuadrático medio para todos los ajustes fue ∼ 10−4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.11 Promedio de la fracción volumétrica relativa de VSF, Φ̃(k) (eje vertical), versus el número de excitación, k (eje horizontal). Cada gráfica corresponde al cálculo de la ecuación 6.5 utilizando los datos de Φ(k) que se encuentran en las gráficas de la figura 5.13 para cada configuración (CFG). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 72 73 74 76 76 77 78 79 81 85 A.1 Cada sección diferencial de la esfera (2) percibe una fuerza distinta de otra sección. . . . . . 99 A.2 g2 ∝ F21 como función de γ ∝ z0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 B.1 Un diferencial de carga de la esfera que se mueve produce un campo magnético en ~r. . . . . 102 C.1 Izquierda, nivel de solvatación vs. temperatura para diferentes cargas del ión. Derecha, Nivel de solvatación vs. carga del ión para diferentes temperaturas. . . . . . . . . . . . . . . . . 107 D.1 Secuencia propuesta para un paso de MonteCarlo incluyendo la actividad iónica y proteica. . 110 D.2 Liberación del neurotransmisor como función del calcio capturado. . . . . . . . . . . . . . 113 xii Abreviaturas. de iniciales. Descripción. BS botón sináptico Terminal de la neurona presináptica en la sinapsis. CA cono axónico Parte de la neurona que une el axón con el soma. CE campo eléctrico —– DM desplazamiento medio DM de las VSs medidas en cada iteración (hδri). DP distribución de Poisson Distribución estadı́stica con forma de la ecuación 2.6. Abreviatura. DSC densidad superficial de carga DSC eléctrica. DVC densidad volumétrica de carga DVC eléctrica. distribución vesicular Perfil de densidad vesicular en el eje “z”. EEPP evoked EPP Sumatoria de los MEPP en un instante dado. EMV ecuaciones del movimiento vesicular Ecuaciones temporales del desplazamiento y velocidad de las VSs. EPP end-plate potential PM registrado en la p.m. . facilitación / depresión sináptica Aumento o disminución de los PPs ante excitaciones periódicas. HMC hybrid MonteCarlo Método de simulación computacional con caracterı́sticas iév / jév i-ésima / j-ésima VS —– LE lı́quido extracelular Sustancia que se está inmediatamente en el exterior de las células. LI lı́quido intracelular Sustancia que se encuentra dentro de las células. LV lı́quido intravesicular Sustancia interna a las VSs. miniature EPP PM espontáneo (cuantizado) registrado en la p.m. . MP membrana presináptica Membrana celular del extremo del BS donde se fusionan las VSs. PD plano de difusión Plano en el PS donde las VSs sólo se difunden. PA potencial de acción PM que viaja en una membrana celular mediante el flujo DV FS / DS hı́bridas de dinámica molecular y MonteCarlo. MEPP transversal intercalado y sincronizado de N a+ y K + . PAR PA resultante Sumatoria de los PM que se producen en la neurona. p.m. placa motora Membrana postsináptcia en SNMs (membrana de la fibra muscular). En la figura 2.5 está señalada como end-plate. PM potencial de membrana Potencial electrostático intermembrana. PP potencial postsináptico PM generado en las membranas de las dendritas de la célula postsináptica. PR potencial de reposo PM en equilibrio iónico (ecuación 2.4). PS pool sináptico Zona del BS cercana a la MP donde existe movimiento vesicular. readily releasable pool Cúmulo o grupo de VSs que encuentran dispuestas a ser RRP fusionadas con la MP cuando el PA llega al BS. SLLV SN SNN/SNM VS simulaciones de llenado vesicular Simulaciones donde inicialmente no hay VSs. sistema nervioso —– sinapsis neural-neural/neuromuscular Sinapsis entre una neurona y otra / fibra muscular. vesı́cula sináptica Esfera nanométrica con una membrana similar a la del BS, que se encuentra dentro del BS y que contiene el neurotransmisor. VSF VS fusionadas con la MP —– VT variación temporal —– Capı́tulo 1 Introducción. 1.1 Preámbulo. Desde un punto de vista psicológico, la percepción es mucho más que un canal de entrada por el cual ingresan a la mente informaciones procedentes del medio ambiente, la percepción es la base de cualquier tipo de pensamiento, que permite que nos involucremos en una supuesta realidad externa. Los órganos de percepción tienen por función alertar ante cambios del entorno, tanto externos como internos al individuo, los cuales podrı́an afectar el equilibrio de éste, haciendo necesaria una acción correctiva para su restablecimiento. Tal proceso implica [1, 2]: (1) la detección de cambios que afectan la realidad interna, (2) la transformación de éstos y su transmisión hacia una “unidad central” que los procesa, (3) la conservación temporal de la información durante el proceso inicial de reconocimiento, (4) la conservación o retención definitiva de la información (bajo ciertas condiciones), y (5) la orden de una serie de eventos de la unidad central hacia otros órganos para el restablecimiento del equilibrio. Los procesos psicológicos no ocurren en un “mundo psicológico”, sino que involucran y son en su totalidad el resultado de una realidad material que los sostiene. Es justamente el sistema nervioso (SN) el responsable directo de recibir, transportar (transmitir y propagar), procesar, enviar las señales tanto aferentes (de entrada o estı́mulo) como eferentes (de salida o reacción), ejecutar y almacenar información, de tal forma, de percibir algún evento especı́fico y ejecutar de manera efectiva una acción pertinente. En dicho sistema, la información es transducida en señales electroquı́micas, tales como, flujos ordenados de ciertos iones, los cuales se presentan en las membranas de las células que conforman el sistema nerviso (sección 2.1); en otros casos, en reordenamientos proteicos tales como la apertura efectiva de canales iónicos [3], bombas y motores moleculares [4], etc; y en algunos otras situaciones, la información depende del movimiento de estructuras moleculares en fluidos, tal como es la secreción sináptica o neurosecreción. En este sentido, el mal funcionamiento 1 2 de alguno de estos mecanismos podrá causar que ciertas partes del SN funcionen incorrectamente, y consecuentemente podrı́an producir una errada percepción y/o una fallida acción correctiva. Existen una serie de enfermedades que afectan el SN, como por ejemplo: (1) el mal de Parkinson 1 que afecta a la sustancia nigra del cerebro, siendo una enfermedad neurodegenerativa, (2) la enfermedad de Huntington la enfermedad de Alzheimer 3 2 la cual subyace en la deformación genética de las neuronas, (3) que produce una atrofia cerebral masiva, (4) esclerosis multiple que afecta al cerebro y a la médula espinal, (5) las encéfalo-mielitis equina 5 y miálgica 6 4 (virus epidémicos) que pueden afectar todo el SN central, (6) el sı́ndrome miasténico de Lambert-Eatón 7 que altera la comunicación en la sinapsis neuromuscular; entre muchas otras enfermedades [5], las cuales pueden ser desde fatales en semanas o meses como (7) la esclerosis concéntrica de Baló o la leucoencefalitis aguda hemorrágica 8 o de poco perjuicio como (8) el sı́ndrome del túnel Carpiano 9 que produce una dolencia temporal del nervio medio del antebrazo. En la actualidad, un número importante de estas enfermedades no tiene cura (ej. Parkinson, Huntington, Alzheimer, etc); y debido a ello, surge la necesidad de comprender los eventos y procesos neurobiofı́sicos que se producen en cada rincón del SN [6]. Una suposición fundamental en neurobiofı́sica es que todas las actividades neurales son suceptibles de una explicación basada en la aplicación de leyes fı́sicas y quı́micias conocidas. Desde este punto de vista, la complejidad de las neuronas y sus interconexiones que conforman una extensa y compleja red, son prácticamente barreras para la comprensión del SN (ver por ejemplo figura 1.1), pero no se descarta la idea de encontrar nuevas leyes micro, meso y macroscópicas que permitan explicar la actividad en el SN. Debido a que la electricidad es común en el SN, muchos modelos actuales de la actividad neural son basados en procesos electrodinámicos encontrados en la naturaleza. En 1902, Julius Bernstein hipotetizó que las células estaban rodeadas de soluciones iónicas y que éstas deberı́an de poseer una membrana delgada con propiedades permeables que producı́a un potencial eléctrico transmembrana (PM) [7]. Además, durante la actividad del SN, la permeabilidad de la membrana cambiaba de tal forma que el PM disminuı́a. Estas ideas fueron subsecuentemente desarrollada por muchos investigadores, que culminó en el modelo “fluid-mosaic” de la membrana [8] y el trabajo realizado por Hodgkin y Huxley sobre la dependencia temporal de cambios de permeabilidad en los nervios [9]. 1 Del Valle G., www.trejos.com/CNS/Parkinson 1.stm, 21/06/2007. MedlinePlus, www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000770.htm, 21/06/2007. 3 Johns Hopkins School of Medicine, www.hipocampo.org/alzheimer.asp, 12/05/2007. 4 Jones P., www.mult-sclerosis.org/whatisms.html, 24/06/2007. 5 Monografias.com, www.monografias.com/trabajos11/ence/ence.shtml, 12/05/2007. 6 Arbitrio M., www.arbitrio.com.ar/1-ECSI-ENMI-Definicion.htm, 12/05/2007. 7 Kleinschmidt P., www.emedicine.com/EMERG/topic292.htm, 24/06/2007. 8 Luchinetti C.F. y Rodrı́guez M., www.fedem.org/revista/n7/patogenia.html, 24/06/2007. 9 National Institute of Neurological D&E, www.ninds.nih.gov/disorders/spanish/tunel carpiano.htm, 24/06/2007. 2 3 Figura 1.1: Red neuronal biológica. “Dissociated culture of rat hippocampal neurons”, Paul De Koninck (2005), http://www.greenspine.ca/en/dissociated culture.html. En este mismo orden de ideas, la descripción cuantitativa de la transmisión sináptica (sección 2.4) en uniones neurales (nervio-nervio) o neuromusculares (nervio-músculo) fueron las contribuciones más importantes para el desarrollo teórico actual en el área de neurobiofı́sica [10]. En particular, las sinápsis quı́micas10 fueron de relevante interés en la década de los 60, debido a que se observó por primera vez la cuantización del neurotransmisor en las terminaciones nerviosas o botones sinápticos (BSs) y la medición indirecta de su posterior liberación; investigaciones realizadas principalmente en sinapsis neuromusculares por Bernard Katz [13]. Katz observó que sin excitación al nervio, se producian pequeñas reacciones postsinápticas, las cuales tenı́an un valor de elevación en el PM cuantizado (detalles en la sección 2.6), que los atribuyó a “cuantos” de neurotransmisor acumulados en la terminación nerviosa. Posteriormente, se observó, mediante microscopı́a electrónica, que el neurotransmisor se encuentra “empaquetado” en vesı́culas sinápticas (VSs) que daban razón a la idea de Katz (ver por ejemplo figuras 1.2, 2.5 y 3.1). En la actualidad se concocen y entienden casi todos los procesos biológicos involucrados en la transmisión sináptica (secciones 2.4 y 2.5), sin embargo, el movimiento y distribución de las VSs en el 10 Se le atribuye este nombre porque la transferencia de información de la neurona a otra célula es mediante la difusión intercelular de una sustancia quı́mica. En el cerebro existen otra clase, denominada sinapsis eléctricas [11], donde las neuronas se ecuentran unidas mediante canales iónicos, y la informacion se transmite mediante el flujo de ciertos iones de neurona a neurona por estos canales. 4 Figura 1.2: Sinapsis con neuronas de rata, cultivadas en laboratorio. Los pequeños cı́rculos que se encuentran en el BS (arriba) son las VSs. La transmisión sináptica ocurre cuando una o más VSs llegan a la membrana del BS y liberan el neurotransmisor. BS parece ser un factor complejo y preponderante en algunas reacciones fisiológicas de las neuronas (ver estudios experimentales recientes en [14, 15]). En general, la dinámica de las VSs determina el número de éstas que liberarán el neurotransmisor y producirán un PM especı́fico en la célula postsináptica, conocido como potencial postsináptico (PP); esto ocurre cuando el neurotransmisor se difunde en el espacio intersináptico, llega a la membrana postsináptica y activa canales iónicos sobre ésta. Evidentemente, cada VS es afectada por un conjunto de factores fı́sicos, quı́micos y biológicos, individuales y colectivos, caracterı́sticos de un problema de muchos cuerpos, que hacen imposible una descripción teórica sobre la dinámica de cada una de las VSs, problema por el cual, resulta conveniente simular numéricamente el movimiento vesicular; es justamente esta situación la que se propone como tema de investigación en esta tesis. En este sentido, las simulaciones de los comportamientos microscópicos de muchas partı́culas en los procesos relacionados con el transporte de información, pueden surgir como una alternativa para monitorear algunos eventos macroscópicos y funcionales en el SN. Existen diferentes tipos de simuladores para modelar dinámica de partı́culas y fluidos, como por ejemplo: (1) molecular dynamics (MD) [16], (2) MonteCarlo method (MC)[18], (3) Markov chains [19, 20], (4) dissipative particle dynamics (DPD) [21], (5) lattice gas y lattice Boltzmann methods (LGM, LBM) [22], (6) smoothed particle hydrodynamics (SPH) [23], (7) stochastic y stochastic multi-scale methods (ver 5 por ejemplo [25]), (8) diferencias y elementos finitos (ver por ejemplo [24]), entre muchos otros modelos de simulación, los cuales pueden ser una combinación entre dos tipos de los 8 mencionados, como por ejemplo, (9) stochastic MD (ver por ejemplo [26]), (10) hydrid MC/MD (HMC) [27], etc. Desde este mismo punto de vista, la escogencia apropiada entre todos los métodos de simulación existentes podrá resolver un determinado problema en un área especı́fica de ciencias o ingenierı́a. En particular, por argumentos que se describen en las próximas secciones, esta tesis se basó en un método de simulación que incorpora propiedades de moviemientos continuos de partı́culas tı́picas de MD y cambios de estado usuales en MC, con lo cual puede aproximarse el modelo a una simulación tipo HMC, aún cuando algunas propiedades de HMC no se usarán. 1.2 Planteamiento del problema. Tal como se ha explicado anteriormente, el simulador que se emplea para modelar el sistema biológico, tiene propiedades, tales que, el modelo de simulación puede clasificarse como un HMC. Esto quiere decir, que el simulador hı́brido se diseñó con una parte dinámica y otra parte estadı́stica, que reproducen la evolución del sistema mediante el procesamiento simultáneo de estos dos procesos. La dinámica depende de cada parámetro que define la morfologı́a y fisiologı́a del BS y la estadı́stica es puramente especulativa y ajustable, de tal forma, que los parámetros probabilı́sticos pueden hallarse mediante el tanteo en cada simulación para reproducir resultados neurobiofı́sicos correctos. La morfologı́a de cada BS depende del tipo de neurona, es decir, que las composiciones de los lı́quidos externos al BS, internos, internos a la VS, membranas del BS, tamaño del BS, etc, varı́an según la función fisiológica que tenga que realizar la neurona para comunicarse con otra célula. En tal sentido, la situación biológica que se desea modelar es el movimiento de las VSs dentro del BS, con todos los factores biofı́sicos que afectan directa y particularmente la comunicación entre células excitables, los cuales serán parámetros del simulador para modelar determinado proceso sináptico. La parte dinámica que se plantea en esta tesis se describe mediante: 1. Una formulación electrostática de todos los elementos fı́sicos que estén presentes en el BS, que posean cargas eléctricas y que pueden afectar en primera instancia el movimiento de las VSs (secciones 3.2 y 3.3). Estos elementos se simplifican tanto para el cálculo teórico, como para la implementación en algún lenguaje de programación que reproduzca cuantitativamente las posiciones y velocidades de cada VS en cada instante discreto de tiempo. 2. La interacción entre capas de solvatación que poseen las VSs a su alrededor (capas de moléculas de agua polarizadas debido a la carga neta que posee la VS) (sección 3.4). 6 3. Introducción de la viscocidad en el fluido intracelular como uno de los elementos hidrodinámicos en el movimiento de las VSs (sección 3.5). Por otro lado, la estadı́stica del modelo de simulación se relaciona con (1) la fusión de la VS con la membrana final del BS en la cara interna o membrana presináptica (MP), la cual producirı́a (2) la liberación del neurotransmisor, y debido a esto, (3) la generación del PP. Para esto se establecerá que cada VS que llege a la MP tendrá cierta probabilidad de fusionarse únicamente. El valor de probabilidad serı́a prestablecido en el algoritmo y tanteado hasta ocurrir en el sistema algún comportamiento neurobiofı́sico deseado. Con el modelo de simulación diseñado y construido en lenguaje C, se procederá a realizar simulaciones que reproducen tres procesos neurobiofı́sicos: 1. Los espontáneos PPs en miniatura, que revelan la existencia de la cuantización del empaquetamiento del neurotransmisor dentro del BS y su posterior liberación con una distribución aproximada a una de Poisson (sección 2.6). 2. Las posibles formaciones de distribuciones poblacionales de VSs [28] (para cada tipo de neurona), que pueden influir en la distribución de la fusión de VSs. 3. Las neurosecresiones debido a perturbaciones o excitaciones periódicas, modeladas mediante la variación de la probabilidad de fuisión y que pueden generar comportamientos plásticos en los PPs (sección 2.7), los cuales pueden asociarse a los reordenamientos de las distribuciones vesiculares en los perı́odos excitatorios. 1.3 Objetivos. 1.3.1 General. Diseñar y construir un modelo de simulación HMC que reproduzca el movimiento de VSs en BSs especı́ficos, de forma tal, que puedan reproducirse simulaciones de PPs en miniatura, distribuciones de VSs y plasticidades sinápticas. 1.3.2 Especı́ficos. 1. Revisión bibliográfica de experimentos y teorı́as recientes acerca de la neurosecresión, en neuronas tı́picas (corteza cerebral, neuromusculares, etc) donde el tamaño de las VSs sea relativamente pequeño en comparación con el BS, para que de esta forma, posteriormente poder estudiar el comportamiento de un número sigificativo de VSs. 7 2. Formulación de un modelo de simulación, que contenga propiedades tipo HMC, tales que, reproduzca tanto el movimiento en el tiempo de las VSs, como del evento de fusión vesicular cuando las VSs llegan a la MP. 3. Cálculo de la interacción electrostática entre esferas donde cada una tenga densidades de carga eléctrica superfical y volumétrica. En lugar de calcular primero el potencial electrostático, y luego, la fuerza electrostática, se decidió realizar el cálculo directamente de la fuerza, integrando sólo las proyecciones de la fuerza de Coulomb en el eje radial. 4. Formulación de la interacción entre capas de solvatación o clatrato de agua que poseen todas las VSs. Las VSs al tener una carga eléctrica neta no-nula y estar sumergidas en un lı́quido acuoso, ciertas moléculas de agua se polarizan ordenadamente alrededor de la VS; dichas moléculas son las que conforman el clatrato de agua, y cuando dos VSs se acercan, los clatratos interactuan, causando una fuerza repulsiva. 5. Determinación de las ecuaciones de movimiento vesicular (EMV). Las fuerzas instantáneas sobre cada VS se aproximarán como constantes durante una trayectoria relativamente corta y cuyo tiempo de recorrido será prestablecido. El tipo de movimiento será de arrastre, debido a la fricción que se produce entre el lı́quido intracelular y la VS. Las posiciones y velocidades se deducirán de la segunda ley de Newton, donde resultará una ecuación diferencial ordinaria de segundo orden. 6. Estimación de los valores de todas las constantes que están implı́citas en las EMV. En primera instancia, se realizará una búsqueda bibliográfica de dichas constantes; las que no se encuentren, se calcularán mediante teorı́as fı́sicas reproducibles; y las restantes, serán tanteadas en el algoritmo. 7. Reproducción de los resultados: (1) Simulaciones de llenado vesicular, es decir, que inicialmente no existirán VSs, y se irán incorporando mediante una función de incorporación, tal como lo hace el citoesqueleto (transporte axonal o reciclaje de VSs). En equilibrio, estas simulaciones deberán representar los potenciales de miniatura (sección 2.6). (2) Distribuciones de VSs a lo largo del eje ortogonal a la MP. (3) Excitaciones periódicas, que deberán reproducir diferentes tipos de plasticidades sinápticas. 8. Desarrollo de los análisis, las conclusiones y recomendaciones en base a los resultados obtenidos. Se compararán los resultados de las simulaciones con los investigados en la literatura, y se discutirán las posibles discrepancias o similitudes. Los resultados que no se pudieran encontrar en la literatura, se estimarán y teorizarán los comportamientos encontrados. 8 1.4 Estructura de la tesis. En base a los objetivos especı́ficos, los capı́tulos siguientes se organizaron de la siguiente forma: • Capı́tulo 2. Información relevante con respecto a la definición, partes y funcionamiento de la neurona, ası́ como también actividades fisiológicas que la neurona genera al ser excitada de una u otra forma. • Capı́tulo 3. Formulación de un modelo matemático de la dinámica vesicular y deducción de las EMV a partir de las fuerzas electrostáticas, la interacción entre clatratos de agua y la fricción entre la VS y el lı́quido intracelular. • Capı́tulo 4. Formulación de un modelo computacional, estimación de las constantes implı́citas en las EMV y demás detalles del modelo de simulación y del algoritmo. • Capı́tulo 5. Presentación de los resultados de las simulaciones de llenado vesicular, distribuciones vesiculares y excitaciones periódicas, variando las constantes implı́citas en las EMV que definen las neuronas. • Capı́tulo 6. Comparaciones con resultados experimentales de otros estudios, discusiones y análisis de las simulaciones obtenidas. Las SLLVs en equilibrio serán relacionadas con los potenciales en miniatura, las DVs con distribuciones experimentales y las secuencias de las VSs fusionadas con plasticidades sinápticas. • Capı́tulo 7. Sumario, discusiones finales de los resultados, conclusiones y posibles mejoras que se pueden implementar en el modelo para lograr resultados más exactos. Capı́tulo 2 Fisiologı́a y funcionamiento de la neurona. El SN de la mayorı́a de los seres vivos representa la culminación de una serie de cambios evolutivos, producto de múltiples adaptaciones al medio ambiente, que surgen de los continuos incrementos en las necesidades funcionales de los organismos. Dichos cambios evolutivos han derivado en sistemas capaces y eficientes en la interpretación y respuesta a una gran variedad de estı́mulos fı́sicos, quı́micos y biológicos a los cuales están sometidos los seres vivos más evolucionados, tales como los mamı́feros, y en especial, el ser humano. El hombre actual puede pensar, razonar y crear, y tiene uno de los más elaborados mecanismos nerviosos de todos los seres vivientes. Este SN es una organización estructural extensa y compleja, que permite captar los cambios que se producen tanto en el medio ambiente externo como el interno del individuo, correlacionarlos e integrarlos, de modo que el individuo reaccione en la forma más adecuada a dichos cambios y pueda seguir subsistiendo como tal. Cada SN es extremadamente complejo, pero los principios básicos sobre los que reside su funcionamineto, son simples. Estos sistemas están compuestos por innumerables células especializadas capaces de cumplir simultáneamente una determinada función y comunicarse con otras células sincronizadas para el traslado y procesamiento de la información. En estos procesos, el cerebro recibe millares de datos de los distintos órganos de los sentidos y, a continuación, los integra y determina las respuestas que debe realizar el cuerpo. Las células que componen el SN son células nerviosas o “neuronas” (solamente en el cerebro de una persona adulta hay 1011 [29]). Estas células son las que se encargan de propagar y transmitir la información desde cada rincón de nuestro cuerpo hasta el cerebro y desde éste hacia cualquier otra parte del cuerpo. En este traslado de información, ocurren dos procesos: la propagación en 9 10 cada neurona y la transmisión de neurona a neurona. El primer proceso está relacionado con la propagación de un potencial eléctrico en la membrana de la célula, lo cual se explica en las secciones 2.2 y 2.3, y el segundo proceso tiene que ver con el flujo de sustancias quı́micas desde la terminación de una neurona hacia la otra (secciones siguientes). Antes de explicar todo esto, primero se describirán algunas nociones sobre las partes de la neurona y las funcionabilidades de éstas. 2.1 La neurona y sus partes. Las neuronas son células excitables especializadas para la recepción de estı́mulos y la conducción del impulso nervioso. Su tamaño y forma varı́an considerablemente, pero cada una posee un cuerpo celular o soma desde cuya superficie se proyectan una o más prolongaciones denominadas neuritas (figura 2.1). Las neuritas que reciben la información y la conducen hacia el cuerpo celular se denominan dendritas. La larga neurita tubular única que conduce impulsos desde el cuerpo celular se denomina axón. Figura 2.1: Izquierda, representación de las partes de la neurona. Derecha, neurona de la médula espinal [5]. El cuerpo de la célula nerviosa, como el de otras células, consiste esencialmente en una masa de citoplasma en la cual está incluido el núcleo, estando limitado externamente por una membrana plasmática. Los cuerpos celulares de las pequeñas células granulares de la corteza cerebral miden aproximadamente 5µm de diámetro, mientras que los de las grandes células de la médula espinal 11 pueden medir hasta 135µm de diámetro. Por otro lado, el núcleo, que almacena los genes, por lo común se ubica en el centro del cuerpo celular y tı́picamente es grande y redondeado. En las neuronas maduras, los cromosomas ya no se duplican y sólo tienen una función genética. La membrana plasmática forma el lı́mite externo del cuerpo celular y sus prolongaciones en la neurona son los sitios de iniciación y conducción del impulso nervioso. La membrana tiene aproximadamente 8nm de espesor, por lo que es demasiado delgada para verse por un microscopio óptico. Esta membrana está compuesta por una capa interna y otra externa de moléculas proteicas dispuestas muy laxamente. Cada capa tiene alrededor de 2.5nm de espesor y están separadas por una capa intermedia de lı́pidos de unos 3nm de espesor. La capa lipı́dica está formada por dos hileras de moléculas fosfolipı́dicas dispuestas de modo que sus extremos hidrófobos están en contacto entre sı́ y sus extremos polares están en contacto con las capas proteicas. Algunas moléculas de proteı́nas se ubican dentro de la capa de fosfolı́pidos y abarcan todo el ancho de la capa lipı́dica. Estas moléculas proporcionan canales hidrófilos a la membrana, a través de los cuales, iones inorgánicos pueden entrar en la célula y salir de ella. Moléculas de hidratos de carbono se encuentran adheridas al exterior de la membrana plasmática y se unen con proteı́nas o lı́pidos, formando lo que se conoce como cubierta celular o glucocálix. Las dendritas son prolongaciones cortas, cuyos diámetros disminuyen a medida que se alejan del cuerpo celular y generalmente se ramifican en abundancia. Muchas veces, las ramas más delgadas presentan proyecciones aún más pequeñas en gran número (espinas dendrı́ticas). El citoplasma de las dendritas es similar al del cuerpo celular, debido a que éstas son simples extensiones del cuerpo celular que aumentan el área de superficie para la recepción de señales provenientes de otras neuronas y escencialmente conducen el inpulso nervioso hacia el cuerpo celular. El axón es la prolongación más larga del cuerpo celular, que surge de una pequeña elevación cónica (cono axónico, CA). Un axón es tubular y tiene un diámetro uniforme, además de poseer una superficie lisa. Poco antes de su terminación, los axones por lo común se ramifican profusamente. Los extremos distales de las ramas terminales a menudo están agrandados; se denominan terminaciones o botones sinápticos (BSs). Los axones pueden ser cortos (0.1mm) como en muchas neuronas del SN central, o extremadamente largos (del orden de los cm ó m, dependiendo del animal) como los que se extienden desde un receptor periférico en la piel de un dedo del pie hastas la médula espinal y desde allı́ al encéfalo. El citoplasma del axón difiere del citoplasma del cuerpo celular, porque no posee gránulos de Nissl ni aparatos del Golgi (no hay sitios de producción de proteı́nas), por lo tanto, la supervivencia del axón depende del transporte de sustancias desde los cuerpos celulares. La membrana del axón es similar a la del cuerpo celular y es justamente aquı́ donde ocurre el proceso de propagación de información. Debido a que existen canales iónicos en la membrana, se 12 produce un potencial a lo largo del axón. Cuando las dendritas perciben las señales eléctricas de otras neuronas, éstas las envian al CA, el cual integra la información y las reenvia por el axón, de la misma forma en que fueron transportadas hacia el CA, esto es, mediante el flujo o movimiento longitudinal de un potencial eléctrico que es transversal a la membrana celular, mediante el paso intercalado y sincronizado de iones de sodio y potasio, lo cual se describe en las próximas secciones. Es menester mencionar, que un número significativo de tipos de neuronas poseen axones con un recubrimiento denominado la vaina de mielina [30], cuya estructura es una célula (célula Schwann) en forma de espiral (ver figura 2.2) que produce un aislamiento eléctrico en todo el axón con excepción de las separaciones de cada célula de Schwann (nodos de Ranvier), debido a las múltiples capas bilipı́dicas en las que se encuentra envuelto el axón. Figura 2.2: Representación gráfica de la vaina de mielina que envuelve al axón de la neurona. La vaina de mielina produce una propagación del potencial eléctrico antes mencionado (que propaga la información) más rápida y efectiva, ya que, como se mencionará más adelante, el flujo iónico transmembrana para esta nueva neurona se realizará sólo en los nodos de Ranvier. Esto significarı́a que se abrirán y cerraran canales iónicos sobre la membrana del axón menos veces que con una neurona sin vaina de mielina. 2.2 La ecuación de Nernst-Planck. Cuando un conjunto de iones se encuentran en una mezcla, existen tres mecanismos que hacen que éstos se muevan: (1) movimiento browniano, debido a la energı́a térmica, (2) fuerzas eléctricas que pueden representarse como el gradiente de un potencial ψ y (3) difusión debido a un gradiente de concentración. El primero de estos mecanismos, da una descripción sobre el comportamiento microscópico de los átomos y/o moléculas, mientras que de los dos últimos resulta el flujo macroscópico de las soluciones iónicas. 13 El flujo debido al tercer mecanismo para un conjunto de iones de tipo C es: (3) ~ J~C = −|ZC |DC ∇[C], (2.1) donde ZC es balance del ión (valencia) y DC es la constante de difusión. Para el cálculo del flujo debido a las fuerzas eléctricas, es necesario notar que la fuerza que percibe cada ión es: ~ = +q E d(m~v ) m~vd = dt τ ⇒ ~vd = + ~ q Eτ ~ = −µ∇ψ, m ~ es el vector campo eléctrico en la dirección de la velocidad instantánea ~v , m es la masa donde E del ión, ~vd es la velocidad promedio, τ es el tiempo promedio entre colisiones de los iones y se ha utilizado la definición de la mobilidad de la carga (µ = qτ /m). Ahora, podemos escribir el flujo eléctrico como: (2) ~ J~C = ~vd ZC F [C] = −µC ZC [C]F ∇ψ, siendo F = NA e+ la constante de Faraday (NA es el número de Avogadro y e+ es la carga del positrón). Utilizando la relación de Nernst-Einstein [31]: DC = µC RT, F ~ (2) J~C = −ZC [C]DC ∇ψ, RT ⇒ (2.2) donde R es la constante universal de los gases y T es la temperatura absoluta. Al sumar ambos flujos (2.1 y 2.2) se obtiene la ecuación de Nernst-Planck (flujo total): F ~ ~ + ZC [C] J~C = −DC |ZC |∇[C] ∇ψ . RT (2.3) Examinemos el caso de una célula excitable que posee iones de K + y Cl− tanto el interior como el exterior de ésta. En estos caso, se tendrán dos ecuaciones de Nernst-Planck: JK = −DK F ∂x ψ , ∂x [K] + [K] RT JCl = −DCl F ∂x [Cl] − [Cl] ∂x ψ , RT donde x̂ es la dirección ortogonal a la membrana de la célula. Como la conservación de la carga de la mezcla (en la corriente) es I = F JK − F JCl = 0, entonces: −DK ∂x [K] + DCl ∂x [Cl] − ⇒ − DK − DCl ∂x [K] F ∂x ψ = RT DK + DCl [K] F (DK [K] − DCl [Cl])∂x ψ = 0, RT ⇒ F DK − DCl [K]o (ψo − ψi ) = ln , RT DK + DCl [K]i 14 Tabla 2.1: Potencial transmembrana (∆ψ) en tres tipos de células excitable (mV ). Axón del calamar Músculo de rana Motoneurona de gato -87.8 -107.6 -88.4 donde se ha incluido el principio de electroneutralidad, [K] = [Cl], y se ha integrado directamente desde adentro (i) y hacia fuera (o) de la célula. Ahora introducimos la relación de Nernst-Einstein, y se llega de la anterior ecuación a: ψo − ψi ≡ ∆ψ = µK − µCl [K]o ln . µK + µCl [K]i Por último, se asume que la membrana es permeable únicamente a los iones de potasio (como ocurre en la mayorı́a de las células excitables), es decir que µCl = 0, implicando: ∆ψ = [K]o RT ln . F [K]i (2.4) La expresión 2.4 es conocida como la ecuación de Nernst y describe el potencial a través de una membrana (PM), la cual es permeable a una especie iónica. Sólo faltarı́a conocer las concentraciones de los iones para calcular el valor del potencial transmembrana de cada célula en particular, lo cual se presenta en la tabla 2.1 (los valores de [K]o y [K]i fueron obtenidos de la tabla 4.1). Los valores de [K]o y [K]i no dependen de la densidad de canales iónicos que posee la membrana, ni tampoco de alguna propiedad de la membrana que modifique el flujo de los iones de K (dependencia de µk ), puesto que si fuese ası́, ∆ψ dependerı́a también de µK , argumento que contradice la ecuación de Nernst. Un punto de vista válido que justifique las variaciones de [K] en cada célula (afuera y adentro), esta relacionado con los contenidos en los lı́quidos extracelular (LE) e intracelular (LI) de cada variedad de células, los cuales pueden poseer otros iones que interactuan con el potasio, concentraciones de agua diferentes que reproducen capas de estas moléculas polarizadas alrededor del ión (dificultando el paso por el canal iónico), proteı́nas captadoras de iones, etc. Es por ello, que [K]o y [K]i son fisiológicamente caracterı́sticos de cada célula. Cabe mencionar, que similarmente a la derivación de la ecuación de Nernst se puede derivar una ecuación compatible con el flujo transmembrana de más de un ión, la cual es conocida como la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz [38]: ∆ψ = PC [C1 ]o + PC2 [C2 ]o + · · · + PCM [CM ]o RT ln 1 , F PC1 [C1 ]i + PC2 [C2 ]i + · · · + PCM [CM ]i PCx = DCx [Cx ]o , (dm /F ) [Cx ]i (2.5) donde los Cx son las especies iónicas que fluyen a través a la membrana con un valor de permeabilidad 15 PCx , M es el número de tipos de iones que son permeables y dm es el espesor de la membrana. 2.3 Potencial de acción y su propagación. En primer lugar, se sabe que bajo condiciones normales de vida celular las concentraciones de sodio intracelular son inferiores a las concentraciones en el exterior de la célula y contrariamente, las concentraciones de potasio intracelular son superiores a las del exterior. También se conoce que la membrana celular posee propiedades semipermeables de iones1 , en principio, de iones de potasio. Esto implica que debido a que existen gradientes de concentración de potasio (entre el exterior e interior de la célula), ciertos iones de K + salen de la célula dejándola cargada negativamente y en consecuencia se establece una diferencia de potencial eléctrico debido al gradiente de iones de potasio exclusivamente. En equilibrio, el potencial resultante, conocido como el potencial transmembrana o “potencial de reposo” (PR), será tal que las fuerzas difusivas sean iguales a las fuerzas eléctricas entre los iones y es descrito por la formulación de Nernst cuando los iones están en equilibrio, tal como se explicó en la sección anterior. Para mantener “en cierta medida” el equilibrio eléctrico entre todas las especies iónicas (ver tabla 4.1), algunos iones (por ejemplo el Cl− ) fluyen a través de la membrana utilizando otros canales, para neutralizar hasta cierto punto las soluciones de cada lado de la membrana. Como estos iones no están exceptos de procesos difusivos, ellos también tendrán un gradiente de concentración, al igual que el potasio. La combinación de todos los efectos da como resultado una diferencia de potencial descrita por la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz (ecuación 2.5). Todas las células poseen este potencial pero sólo ciertas clases le dan un uso; según ésto, pueden clasificarse como células excitables y no-excitables. El cuerpo humano posee ambos tipos, siendo las excitables, las neuronas, células musculares y gliales. En las neuronas y en los músculos, las membranas propagan señales eléctricas mediante los “potenciales de acción” (PA), los cuales son simplemente cambios rápidos en el PM. Cada PA comienza con un cambio brusco del PM a un potencial positivo y termina con una vuelta casi igualmente rápida al potencial negativo (figura 2.3.d). En estos cambios del PM, se pueden identificar cuatro fases (ciclo de Hodgkin): 1. Fase de reposo, es cuando el PM es igual al PR, cuyo valor aproximado es desde −100mV hasta −70mV , dependiendo del tipo de célula excitable y de la función fisiológica que ella realice. 2. Fase de despolarización. Una vez causado el estı́mulo y el PM ha llegado a un valor umbral de 1 Esto es porque en la membrana celular se encuentran acoplados canales iónicos de diferentes especies [3], que se abren o cierran bajo diferentes circunstancias. 16 Figura 2.3: Estimulación de la membrana del axón: (a) y (b) estı́mulos que no llegan al potencial de umbral; (c) la atenuación es propagada; (d) apariencia del PA para un estı́mulo superior al umbral. Las lı́neas punteadas indican el movimiento del impulso. aproximadamente −50mV , la membrana se vuelve súbitamente permeable a los iones de sodio, lo que permite el flujo hacia el interior de la célula de iones N a+ . El estado polarizado normal de aproximadamente −80mV se neutraliza inmediatamente por los iones de sodio entrantes y el PM se eleva rápidamente en dirección positiva hasta aproximadamente +40mV , esto recibe el nombre de despolarización. Si el estı́mulo no es lo suficiente como para que el PM cambie del PR al valor umbral, los canales de sodio no se activarán y el PM se atenuará como un condensador, debido a las propiedades capacitivas que tiene la membrana del axón (ver figura 2.3a-c). Dicho comportamiento da razón de las prodiedades binarias del axón y en general de toda la membrana de la neurona (todo o nada), en el cual serán considerados a integrarse en el CA aquellos estı́mulos, percibidos por las dendritas, que produzcan una elevación del PM superior al umbral. 3. Fase de repolarización. Una diezmilésima de segundo después de que la membrana se hace permeable a los iones de sodio, los canales para este ión comienzan a cerrarse y los canales de potasio se abren más de lo habitual. Entonces, una rápida difusión de iones de potasio hacia el exterior restablece el PR negativo normal de la membrana. 4. Fase de hiperpolarización. En algunas neuronas, la salidad de K + en la repolarización es tan rápida que los canales de éstos se comienzan a cerrar cuando el PM esta muy cerca del PR, ocurriendo luego que el PM sea un poco menor que el PR cuando los canales de K + terminan de cerrarse, esto se conoce como hiperpolarización. Para controlar este exceso, se 17 abren nuevamente los canales de N a+ , los cuales comienzan a entrar hasta que el PM alcance exactamente el PR. Debido a que durante en el PA siempre esta saliendo K + y entrando N a+ de la célula, para mantener el balance atómico (siempre exista potasio intracelular y sodio extracelular), existe un mecanismo proteico denominado la bomba de sodio-potasio en la membrana del axón [32] (con una densidad poblacional similar a la de los canales iónicos), que intercambia 3 iones de sodio intracelular 2 por iones de potasio extracelular. Cuando en algún punto de la membrana se provoca un estı́mulo, las zonas adyacentes suelen excitarse de la misma forma, dando lugar a la propagación del PA a lo largo de la célula. Esto es porque estas zonas conforman el circuito restante donde circulará el potasio hacia el exterior, mientras que el sodio solamente entrará. Tal como se muestra en la figura 2.4, el PA sólo se propagará hacia los extremos de la fibra, porque todavı́a existirá una región donde la membrana no se habrá repolarizado. Figura 2.4: Representación de la propagación del PA (difusión lateral de K + y N a+ ). Si existiera la vaina de mielina, el trayecto iónico interno serı́a tan largo como el largo de la célula de Schwann. Como los PAs provenientes de las dendritas se integran en el CA, allı́ se generará un PA resultante (PAR), que no tendrá otro camino más que ir hacia los BSs por medio del axón, puesto que antes del CA la membrana ya estará reporalizada. Cuando mayor es la duración del estı́mulo inicial, mayor será la despolarización inicial y mayor la propagación en las áreas circundantes de la membrana plasmática. Si se aplican múltiples estı́mulos excitadores a la superficie de una neurona, los efectos pueden sumarse. Por ejemplo, los estı́mulos subliminales pueden pasar por la superficie 18 del cuerpo celular y sumarse en el CA e iniciar ası́ el PAR. Una vez que el impulso nervioso se ha propagado sobre una región dada de la membrana plasmática, no puede provocarse otro potencial de forma inmediata. La duración de este estado no excitable se denomina perı́odo refractario. 2.4 Transmisión sináptica. Cuando el PAR llega al final de la neurona invadiendo los BSs, en la membrana final del BS o MP, se libera una o más sustancias quı́micas denominadas neurotransmisores, que posteriormente son captadas por los receptores de la siguiente neurona, por una fibra muscular u otra célula excitable (por ejemplo, células endocrinas). Tal lugar, donde ocurren todos estos eventos, se denomina sinapsis (neurona-neurona, SNN; neuromuscular, SNM; etc.). Realmente, el proceso biológico es mucho más complejo de lo que se ha explicado. En primer lugar, se sabe que los neurotransmisores se encuentran empaquetados en VSs, cuyas membranas bilipı́dicas son similares a la de la MP (para una SNM, ver [33] y figura 2.5). Figura 2.5: Microfotografı́a de un corte transversal de una SNM [38]. Estas VSs están dentro del BS y la mayorı́a se encuentran predispuestas al movimiento en una región cercana a la MP, denomida pool sináptico (PS). En el instante que el PAR llega a la membrana del BS, en ésta se abren canales de calcio 2 , permitiendo la entrada de Ca2+ . Luego, estos iones son 2 El potencial de activación del canal puede variar desde −50mV hasta −10mV (sección II.D de [3]). 19 capturados por proteı́nas especializadas que se encuentran en la membrana de las VSs, denominadas sinaptotagminas [34], que posteriormente a esto, sufren un cambio conformacional tridemensional junto con otras proteı́nas para formar un ensamble proteico denominado v-SNARE. Éste interactúa con otro que se encuentra en la MP de la parte interior del BS, denominado t-SNARE, para producir un mecanismo proteico que permite la “fusión” de la VS con la MP, produciendo la liberación del neurotransmisor, proceso denominado exocitósis (detalles de las interacciones proteicas en [35, 36], capı́tulo 14 de [12] y sección 21.4 de [37]). Cabe destacar que a menudo el mecanismo de fusión resulta inefectivo, produciendo frecuentemente una liberación parcial del neurotransmisor, y en ocasiones menos probables pero posibles, la liberación es nula; dichos eventos se conocen como kiss-and-run [39]. En estos casos la masa de la VS disminuye, siendo repuesta posteriormente (esto se explicará en la próxima sección). Una vez que el neurotransmisor sale de la VS (liberación completa o parcial), éste se difundirá en una región cuyo medio es el LE y se encuentra entre la MP y la membrana postsináptica (en sinápsis neuronal) o la membrana de la fibra muscular (“muscle end-plate”, en SNMs). Este espacio es conocido como la hendidura sináptica y su espesor es de aproximadamente 1 VSs. Finalmente, cuando el neurotransmisor llega a la membrana postsináptica, este mismo activará ciertos receptores (tipo excitatorio o inhibitorio) en dicha membrana y estos abrirán algunos canales de N a+ (pueden ocurrir otras funciones [40]). Debido a esto, se producirá un flujo hacia el interior de la neurona postsináptica de sodio, donde dichos iones elevarán el PM de la neurona postsináptica, produciéndose un PA postsináptico que viajará nuevamente hacia el CA, el cual sumará todas señales provenientes de las sinapsis [41], para que luego el PAR viaje por el axón de esta neurona, y ası́ sucesivamente de neurona en neurona. Una representación sobre la transmisión sináptica excitatoria se presenta en la figura 2.6. Resulta importante mencionar que existen neurotransmisores que pueden producir una señal inhibitoria al abrir canales de Cl− en lugar de N a+ , con lo que se lograrı́a disminuir el PM (hiperpolarizar). También es importante mencionar, que debido a que el calcio participa cuantitativamente y dinámicamente en la neurosecreción (exocitósis simultánea de muchas VSs en un intervalo de tiempo), éste es considerado por muchos investigadores como un segundo mensajero [42]. De no existir calcio en el LE y en el LI, ninguna VS se fusionará con la MP, puesto que el v-SNARE nunca se formará. Si existe una determinada concentración de calcio extracelular, dicha cantidad determinará cuanto de v-SNAREs se formará sobre las VS, y consecuentemente, en cuantas VS se producirá la exocitósis. De esta forma, el calcio extracelular está intrı́nsecamente relacionado con la liberación del neurotransmisor. 20 Figura 2.6: Transmisión sináptica excitatoria (fuente desconocida). Un PA viaja a lo largo del axón de una neurona y llega al BS de ésta, causando una elevación del PM que abre los canales de Ca2+ . El flujo hacia dentro de calcio inicia una serie de eventos que culminan en el acercamiento (hipotético) y fusión de la VS con la MP, liberando el neurotransmisor acumulado en la hendidura sináptica. Luego, las moléculas de neurotransmisor se difunden hasta llegar a los receptores de la próxima célula excitable, desencadenando una variedad de funciones, dependiendo del subtipo de receptor, entre los cuales está la apertura de canales de N a+ , que producen una señal excitatoria postsnáptica. 21 2.5 Ciclo de las VSs. Después que la VS se ha fusionado con la MP, la estructura de la VS permanece en la MP por un tiempo. Esto es porque las proteı́nas que están en la VS (figura 2.7) no se encuentran en la MP. Para evitar la reconstrucción proteica, los nervios tienen la propiedad de guardar la configuración de cada vesı́cula fusionada y desplazarla fuera de la sinápsis, donde se formará una nueva a partir de esta estructura. Figura 2.7: Representación de una VS y sus proteı́nas. Una vez fuera de la sinápsis, la estructura de la vesı́cula fusionada produce una invaginación sobre ella misma, mediante un conjunto de proteı́nas especializadas (sinapsina y principalmente sinaptobrevina [43]) que encierran a la estructura para formar una esfera nuevamente; dicho proceso es conocido como endocitosis. Además de las proteı́nas de la estructura que forman la nueva VS, existen otras del LI que se unen a la estructura para esta misma función, denominadas clatrinas [44]. Éstas forman un enrrejado alrededor de la VS de manera de encerrarla y sacarla de la MP, además de moldearla. Luego de esto, las clatrinas simplemente se desprenden de la vesı́cula. Posteriormente, el neurotransmisor es introducido en la VS mediante canales iónicos y gradientes de pH, que es producido por bombas de H+ −ATPasa que poseen las VSs y bombean hacia el interior H + (detalles de la reacción quı́mica que se produce en la bomba, en capı́tulo 13 de [45]). Por último, las VSs son transportadas hacia la parte superior del pool (reservorio) y de allı́ a la zona activa del pool o PS. Este transporte es función de un mecanismo proteico, denominado 22 filamentos de actina, que conforman la parte terminal del citoesqueleto de la célula [46, 47, 48]. Las primeras VSs de este sector que se fusionan cuando el PAR llega son las más cercanas a la MP, esta zona es denominada “readily releasable pool” (RRP) [49, 50, 51]. Todos estos procesos están representados en la figura 2.8 y reseñados en [52]. Entre la lı́nea horizontal que divide en dos a la figura y la MP está el PS, y es aquı́ donde se desea modelar el comportamiento de la VS (capı́tulo siguiente). Figura 2.8: Esquematización del ciclo de las VSs (http://www.cip.ed.ac.uk/members/HRB/cousin [Cousin M., 2005]). (1) Exocitósis. Fusión de la VS y liberación parcial o completa del neurotransmisor en el RRP. (2) Si el mecanismo de fusión resulta inefectivo, ocurre Kiss-and-run, donde la VS se devuelve al PS. (3) Transporte de la estructura vesicular sobre la MP hacia fuera de la sinapsis y acoplamiento de clatrinas. (4) Desprendimiento de la estructura ya moldeada por la clatrina. (5) Desacoplamiento de las proteı́nas de clatrina de la VS. (6) Introducción del neurotransmisor en la VS. (7) Transporte de la VS hacia el reservorio. (8) Transporte de la VS hacia el PS. 2.6 Potenciales en miniatura. Tal como se explicó en la sección 2.4, el Ca2+ es imprescindible para que ocurra la transmisión sináptica. Si el PA llega al BS y no existe calcio extracelular, no se producirá la exocitósis. En pocas palabras, el calcio es el causante directo de la fusión vesicular, más no el PA, éste es el indirecto. Por otro lado, en la década de los 60 Katz y colaboradores observaron que aún cuando el PA sea nulo, existen algunas VSs que llegan a fusionarse con la MP liberando el neurotransmisor ([13] y capı́tulo 9 de [53]). Esto es porque en los BSs siempre existen pequeñas concentraciones de calcio intracelular, que pueden provenir de las mitocondrias [54] y del retı́culo endoplasmático [55]. 23 En estos dos lugares se almacena calcio bajo mecanismos excitatorios normales (entrada de calcio al BS cuando el PA llega a éste) y se libera cuando hay escasez, de manera, de mantener una [Ca2+ ] mı́nima, conocida como concentración de calcio residual. Esta concentración es la causante de la fusión de la VS cuando no hay un PA que produce una liberación espontánea del neurotransmisor. En los experimentos de Katz se realizaron mediciones del potencial postsináptico (PP) para comprobar la liberación espontánea y cuántica del neurotransmisor. Se colocó un electrodo detrás de la membrana postsináptica (a unos pocos nm) en una SNM, es decir, en el “muscle end-plate”. Cuando el neurotransmisor neuromuscular (acetilcolina) llegaba al end-plate, éste producı́a un PA sobre la membrana que serı́a registrado por el electrodo. Los resultados que obtuvo Katz fueron una secuencia de pequeñas subidas de potencial en la membrana, con distribuciones aleatorias (ver figura 2.9), tales eventos son denominados “miniature end-plate potentials” (MEPPs). Figura 2.9: MEPPs en una SNM de rana. Fatt y Katz en 1950 [13] (ver también capı́tulo 10 de [38]). Katz también observó y concluyó que los MEPPs pueden superponerse y producir un PP de membrana mayor que un MEPP, pero cuantizado con respecto a este mismo. Es decir, que en el registro del electrodo observó con cierta frecuencia una subida de voltaje que era aproximadamente igual al doble, al triple, etc., que los MEPPs. Dichos potenciales, cuya constitución es la suma de dos o más MEPPs, son denominados como “evoked end-plate potentials” (EEPPs). La estadı́stica de los procesos de liberación fue desarrollada por Del Castillo y Katz en 1954 [56], en la cual mostraron que la aparición de los EEPPs tiene una distribución aproximada a una distribución de Poisson (DP). Consideraron que existen n sitios disponibles de liberación sobre la MP. La probabilidad de liberación de los “cuantos” de neurotransmisor, x, por un impulso, está dado exactamente por la distribución binomial: fn (x) = n! nx = px (1 − p)n−x , N x!(n − x)! donde nx es el número de ensayos donde x es liberado, N es el número total de ensayos y p = f1 (1) 24 es la probabilidad de liberación de un simple “cuanto”. Cuando p se hace pequeña y el número de sitios disponibles de liberación es grande, la distribución es aproximada de forma cerrada a la DP: fm (x) ≈ e−m mx , x! (2.6) donde m ≡ np es el número promedio de “cuantos” liberados por ensayo (en fisiologı́a sináptica, m se le da el nombre de el contenido cuántico). Un ejemplo del uso estadı́stico de la ecuación 2.6, sobre un experimento de células musculares de mamı́fieros, puede ser comparado con las investigaciones realizadas por Boyd y Martin en 1956 [57], quienes aproximaron el contenido cuántico como m ≈ A(EP P s) A(M EP P s) = 2.33, donde EPPs se refiere a los potenciales percibidos en la placa motora (end-plate) cuando la neurona es excitada con un PA, la función A(· · ·) se refiere a la amplitud promedio de las excitaciones y 2.33 fue encontrado para fibras musculares de gato. En dicho experimento, se propuso que la varianza de los EEPPs, σ 2 , 2 , siendo σ 2 la varianza observada aumenta linealmente con la amplitud, es decir, con x (σ 2 = xσm m para los MEPPs). Luego, eleboraron un ajuste de la suma de distribuciones Gaussianas por cada EEPP y con una amplitud de la DP (ecuación 2.6), de la forma: Fm (x) = fm (x) M X i=1 " # (x − i)2 √ exp , −2σ 2 2πσ 2 1 2 σ 2 = iσm , (2.7) 2 = 0.04 y M = 19, se obtuvo donde M es la máxima cuantización de los EEPPs. Para m = 2.4, σm la gráfica de la figura 2.10, la cual concuerda con los resultados reportados por Boyd y Martin. 8 20 6 Fm(0.4k)/Fm(0.4(k+1)) [20/Fm(1)]Fm(x) 15 4 10 2 5 0 Pendiente=0.40 independiente=0.62 2 S =0.9994 0 0 0.5 1 1.5 0.4x 2 2.5 0 5 10 k−esimo pico 15 20 Figura 2.10: Izquierda, distribución cuantizada de las amplitudes de los EEPPs. El eje vertical es el número de observaciones y el horizontal las amplitudes (mV ). La diferencia entre esta gráfica y los resultados de Boyd y Martin, está en que estos investigadores calcularon el número de observaciones como xvm (vm es el promedio de las amplitudes de los EEPPs para cada contenido cuántico). Derecha, variación del cociente entre las amplitudes del k-ésimo pico con el siguiente, en la distribución cuantizada de los EEPPs. 25 2.7 Depresión, facilitación y plasticidad sináptica. Hasta ahora se ha explicado cual es el mecanismo de respuesta ante un PA que invade el BS o debido a la concentración residual de calcio. Sin embargo, lo relevante y más importante en la transmisión sináptica es el transporte de la información completa, es decir, el traslado de una secuencia de PAs, que producen una serie de exocitósis y consecuentemente una serie de PPs. La reacción ante una serie de estı́mulos no es exactamente el de un evento tras de otro y todos iguales. Experimentalmente se sabe que una secuencia de PAs con cierta frecuencia puede provocar que ocurra una secuencia de exocitósis con heterogeneidad, es decir, que las amplitudes de los PPs son diferentes para cada excitación de la secuencia. Dichos comportamientos en la secuencia de exocitósis que son registrados en la célula postsináptica, son conocidos como plasticidad sináptica, y dependen del tipo de célula, del tiempo de aplicación de la excitación y del tiempo entre cada excitación (perı́odo). Para tiempos de excitación y perı́odos cortos (“short-term synaptic plasticity”, ∼ 2ms en SNMs), la plasticidad puede tener tendencias homogéneas durante algunos PPs [58]. Supongamos que cada amplitud de los PPs están etiquetadas sucesivamente en el tiempo como: P P1 , P P2 , ..., P PE , donde E es el número de excitaciones totales. Si ocurre una tendencia homogénea hasta H excitaciones, entonces puede ocurrir cualquiera de estos dos casos: (1) : P P1 < P P2 < · · · < P PH , ∨ (2) : P P1 > P P2 > · · · > P PH . Estos casos son denominados como facilitación (FS) y depresión (DS) sináptica respectivamente ([59, 60] y capı́tulo 9 de [53]), debido a que el i-ésimo estı́mulo (o una combinación de estı́mulos anteriores) aumenta o disminuye la respuesta del (i + 1)-ésimo estı́mulo. En SNMs, suele ocurrir que luego de la FS continue una DS de la forma (ver figura 2.11): P P1 < P P2 < · · · < P PH > P PH+1 > P PH+2 > · · · > P PE , Algunas hipótesis o caracterı́sticas sobre los mecanismos para la FS y DS son: 1. Según los experimentos de Kuno [59], la FS y DS no dependen de los mecanismos postsinápticos y sólo dependen de los eventos que ocurran en el BS. 2. Katz señala que la manera y el momento en que ocurre el reclutamiento del neurotransmisor por la VS es el principal factor de estos dos comportamientos [53]. 3. En algunos casos, la fusión de VS con la MP, alteran significativamente las interacciones posteriores entre los ensambles proteicos v-SNARE y t-SNARE [61]. 26 Figura 2.11: Ilustración de la FS seguida de la DS en una secuencia de estı́mulos repetitivos [53]. 4. En neuronas cerebrales, relaciones estadı́sticas muestran que existe más de un mecanismo biológico que produce la FS y DS [62]. 5. Recientes estudios experimentales [15] muestran que la liberación del neurotransmisor está relacionada con la distribución espacial de las VSs en el PS, y que esta distribución está ligada a la dinámica de las VSs, la cual es afectada cuando el calcio entra al BS. Este factor es el que se estudió en esta Tesis. 6. La plasticidad sináptica puede cambiar de FS a DS cuando un número de VSs que antes estabán en un primer nivel de liberación (o predisposición) se termina, y otros niveles de VSs en el PS toman su lugar. Por otro lado, cuando el tiempo de excitación es prolongado (“long-term synaptic plasticity”, ∼ (10 − 60)min en SNNs), los efectos de plasticidad sináptica pueden significar propiedades de memoria en las neuronas [63]. Los mecanismos para estos casos parecen ser algo diferentes, puesto que se ha observado que una prolongada excitación produce la activación de ciertas proteı́nas que eventualmente pueden producir la plasticidad prolongada o permanente (ver por ejemplo [64]) y también cambios morfológicos en el BS [65]. Es de esperar que las dos caracterı́sticas antes mencionadas modifiquen la dinámica de las VSs; de aquı́ la importancia de estudiar la dinámica y distribuciones de las VSs en el PS, para reacciones plásticas cortas y prolongadas ante uno o más PA. Capı́tulo 3 Ecuaciones del movimiento vesicular (EMV). En este capı́tulo se describen y deducen las ecuaciones de movimiento de las VSs que se encuentran dentro del BS, las cuales están dispuestas a ser fusionadas con la MP, es decir, que estas VSs previamente estuvieron en los procesos de reciclaje o de generación de nuevas, tal como se ha explicado anteriormente. Se plantea que la dinámica que origina el movimiento tiene tres partes. La primera es de tipo electrostático, debido a las cargas que están en las membranas de las VSs, la MP, el LI, el LE y el lı́quido intravesicular (LV). La segunda causa de movimiento es la interacción entre acumulaciones de agua que poseen las VSs a su alrededor (ver por ejemplo [66]). Por último, se considera que en el traslado de las VSs ocurren pérdidas energéticas debido a la fricción con el LI. 3.1 Modelo de simulación. Debido a la complejidad geométrica de los botones sinápticos (figura 2.5 e imágenes de [67]), en las simulaciones solamente se toma una sección transversal del BS que coincide con un paralelepı́pedo recto de altura H, ancho y profundidad L y en cuya base está la MP (ver figura 3.1). Figura 3.1: Modelo para un PS con VSs: Paralelepı́pedo recto con esferas dentro. 27 28 En esta configuración ideal, las VSs son reemplazadas por esferas rı́gidas de radios únicos. Éstas evolucionan simultáneamente hacia nuevos estados caracterizados por su posición y velocidad, dependiendo de condiciones propias de las esferas y de otras condiciones globales del sistema. Como en culquier método de MonteCarlo [17], la evolución es discreta en el tiempo e iterativa, es decir, que la configuración global posterior debe ser calculada a partir de la actual. Como primera hipótesis para el movimiento de cada VS, se asume que los iones de Ca2+ se difunden desde las zonas lejanas hacia las cercanas a la MP. Esta difusión es lo suficientemente rápida como para que las VSs no perciban los cambios temporales en la concentración de calcio, de modo que el Ca2+ puede considerarse distribuido uniformemente en todo instante de tiempo [68]. Debido a que la [Ca2+ ] está relacionada con el mecanismo de fusión de las VSs con la MP [69], se introduce una variable que determina directamente la capacidad de fusión de las VSs. Esta variable es colocada en el simulador como una probabilidad de fusión, PF , tal que si una VS choca con la MP, ésta se fusiona con la MP con probabilidad PF , y de lo contrario, rebota elásticamente con una probabilidad 1 − PF . En el paralelepı́pedo (que emula el PS), el número de esferas (emulando las VSs) N , cambia en el tiempo, debido a la fusión con la MP y a la incorporación de nuevas VSs al PS. Este último proceso se añade al modelo para simular el reciclaje o regeneración de VSs por el citoesqueleto de la neurona (ver figura 3.2) [70]. Figura 3.2: Representación del transporte axonal de VSs hacia el PS. Teniendo como referencia una función periódica y discreta (ej: 0,1,2,0,1,2,,,... etc), en cada instante del tiempo se incorporan al PS un número de esferas correspondiente a cada componente discreta de la función (ej: t → ∆N = 0, t + ∆t → ∆N = 1, t + 2∆t → ∆N = 2, t + 3∆t → ∆N = 0, t + 4∆t → ∆N = 1, t + 5∆t → ∆N = 2, etc, donde ∆t son los pasos de tiempo y ∆N es el número de VSs que son incorporadas). La deposición de nuevas esferas tiene dos caracterı́sticas: (1) la velocidad con la que ingresan las nuevas esferas es nula, justamente para modelar el proceso biológico real [47], y (2) el lugar de deposición se establece como el sector ([0, L]; [0, L]; [Ψ, H]), donde H − Ψ es la penetración que puede tener los filamentos de actina en el PS y se ha propuesto 29 Ψ = H(1 − H/L) como una cantidad geométrica del PS para el cual, si la geometrı́a es un cubo, el lugar de deposición es en todo el PS, tal como puede ocurrir en los sistemas reales [48]. Además de la condición de borde antes mencionada (fusión o rebote en la MP), se incorporan 2 condiciones de borde más. La primera está relacionada a la prohibición de recaptura de VSs por el citoesqueleto. Ya que en general las esferas pueden moverse en cualquier dirección, éstas podrán llegar a la parte superior del paralelepı́pedo. Como en esta parte se encuentran los filamentos de actina del citoesqueleto, las VSs no pueden avanzar más, ni ser atrapadas por éstos, por lo tanto, la única posibilidad es rebotar, que al igual que en el choque con la MP, se propone elástico. La segunda condición de borde que se coloca en el simulador es en los 4 planos restantes, para los cuales se impune la condición de periodicidad con respecto al plano frontal correspondiente. Esta condición garantiza modelar correctamente sólo una sección transversal del PS real, puesto que el flujo en uno de los lados ortoganales a la MP será aproximadamente igual al flujo del lado opuesto. 3.2 Campos eléctricos (CEs). En primer lugar, es necesario observar la distribución de las cargas en las membranas (ver figura 3.3) y darse cuenta que, a escalas superiores a las microscópicas, éstas pueden aproximarse a superficies uniformemente cargadas [71, 72, 73], tal como muchas otras propiedades se aproximan a promedios uniformes (para la presión, véase por ejemplo [74]). Figura 3.3: Aproximación de campo medio para las cargas de las membranas bilipı́dicas Con esta aproximación, los CEs producidos tanto por una VSs como por la MP pueden hallarse por la ley de Gauss [75, 76]. El CE producido por la MP por encima de ésta es: ~ mp = σ ẑ, E 2ǫ (3.1) donde ẑ es la dirección positiva ortogonal al plano de la MP, σ < 0 es la densidad superficial de carga (DSC) constituida por las tres capas que se encuentran relativamente cerca (esta cercanı́a varı́a con el tamaño de los fosfolı́pidos, capı́tulo 9 de [45]) y ǫ es la permitividad eléctrica del LI. Aún cuando la membrana presináptica tiene un área finita (L2 ), las condiciones de borde periódicas hacen válida 30 la ecuación 3.1, puesto que la VS nunca estará cerca de los bordes de una supuesta placa cargada; de esta forma, se simulará como si fuera una superficie infinita con DSC uniforme. Por otro lado, el CE producido por la i-ésima VS (iév) como función de una posición ~rk cualquiera es (ver figura 3.4): ~ i (~rk ) = Qi ~rki , E 3 4πǫ rki rki = ||~rki || ≥ 2R, (3.2) Figura 3.4: La iév en un sistema de coordenadas. El plano z = 0 coincide con la MP. donde ~rki ≡ ~rk − ~ri es un vector medido desde un sistema de coordenadas cuyo origen coincide con el centro de iév, tal como se muestra en la figura 3.4; ~ri es el vector desde el origen de coordenadas al centro de la iév; la carga total de la iév es Qi ≡ σSV + ρi VV + 2Ci e+ ; ρi es la densidad volumétrica de carga (DVC) del LV de la iév, que en una primera aproximación, es del orden de la DVC del LE (las VSs se forman por invaginación de afuera hacia dentro de la célula); SV = 4πR2 es la superficie de la VS (siendo R el radio de la VS); VV = 34 πR3 es el volumen de la VS; Ci = Ci (t) es el número de iones de Ca2+ capturadas por la iév en la superficie; y e+ es la carga del positrón. Utilizando la ecuación 3.2 el CE producido por un conjunto de VSs será: ~ vr (~rk ) = E N X ~rki ~ i (~rk ) = 1 Qi 3 , E 4πǫ i=1 rki i=1 N X rki ≥ 2R. (3.3) Los CEs del LI y LE se calculan integrando capas con espesores diferenciales en el eje z. Esta simetrı́a es debido a 2 aproximaciones: (1) Ambos lı́quidos laterales por separado producen un CE neto aproximadamente nulo dentro del PS sin que afecte considerablemente el movimiento de las VSs hacia los lados, siendo válido aún cuando el PS tenga algunas otras simetrı́as (por ejemplo, un esferoide), y (2) las condiciones de borde periódicas hacen excluir a los efectos laterales, pusto 31 que las VSs nunca se acercan a los bordes reales. Debido a estas consideraciones, el CE que produce por toda la sección de LE es: ~ le = ρd ẑ, E 2ǫ (3.4) donde ρ es la DVC del LE y d es el tamaño del espacio intersináptico (distancia entre la MP y la membrana postsináptica). Para calcular el CE producido por el LI hay que tener en cuenta que en éste están presentes las VSs. Si no hubiera VSs, el CE serı́a: ~ 0 (zk ) = ρ̃ (2zk − H)ẑ, E 2ǫ donde ρ̃ es la DVC del LI, zk es una distancia medida ortogonalmente a partir de la MP. En esta ecuación se ha supuesto que tanto el LI como la concentración de calcio son homogéneos en todo el PS, de forma que ρ̃ = ρo + ρCa2+ , donde ρo es la DVC del PS sin calcio, mayormente constituido por Cl− y también por K + , N a+ y M g2+ , y ρCa2+ > 0 es la DVC de Ca2+ . El CE debido al LI con huecos esféricos de radio R, puede ser calculado sumando a la ecuación anterior el CE producido por esferas con una DVC igual a −ρ̃, que viene dado por: ~ h (~rk ) = − ρ̃VV E 4πǫ N X ~rki i=1 3 rki , rki ≥ 2R. Por lo tanto, el CE debido al lı́quido intracelular es: N X ~rki ~ li (~rk ) = ρ̃ 1 (2zk − H)ẑ − VV E 3 , ǫ 2 4π i=1 rki # " rki ≥ 2R. (3.5) Con las ecuaciones 3.1, 3.3, 3.4 y 3.5, el CE total resulta: ~ rk ) = E ~ mp + E ~ vr (~rk ) + E ~ le + E ~ li (~rk ), E(~ ~ rk ) = (σ̃ + ρ̃zk )ẑ + ⇒ ǫE(~ σ̃ ≡ N 1 X ~rki (Qi − ρ̃VV ) 3 , 4π i=1 rki (3.6) σ + ρd − ρ̃H . 2 ~ vr (~rk ) y E ~ li (~rk ) pueden simplificarse tomando Es necesario aclarar que las ecuaciones para E dos consideraciones: (1) Tomar campos de corto alcance (ver sección 12.3.9 de [17]), es decir, que los CEs serán aproximadamente nulos cuando rki > b, donde b es el radio de un perı́metro que establece el alcance de los CE entre VSs, y (2) asociada a la primera, suponer que se conocen las VSs que están en los dos sectores (2R ≤ rki ≤ b y rki > b). Debido a esto, en la ecuación (3.6) ocurre el 32 cambio N → Nk , en donde Nk es el número de VSs que cumplen la condición 2R ≤ rki ≤ b. Como una primera corrección a la anterior aproximación, propuesta en esta Tesis, se supone que las VSs fuera del perı́metro se encuentran distribuidas uniformemente (ocurre al menos fuera del equilibrio hidrodinámico). Debido a ésto, los huecos y VSs que estén contenidos en rki > b, deben estar presentes en ρ̃ “para cada ~rk ”, con lo cual, esta variable queda modificada como: Ñk 1 X VV Ñk ρ̃ → ρ̃k ≈ ρ̃ + (Q̃ − ρ̃VV ) = ρ̃ 1 − V i=1 V ! + Q̃Ñk , V ⇒ σ̃ → σ̃k , (3.7) donde V es el volumen del PS, Ñk = N − Nk es el número de VSs para las que rki > b y Q̃ es el promedio de la carga eléctrica de las Ñk VSs. Para evitar el conteo, Ñk se aproxima como: Ñk → Ñ∗ ≈ N [1 − (b/bm )3 ], bm = q 3 3V /4π, (3.8) donde bm es el valor máximo que puede tomar b. La ecuación 3.8 implica: ρ̃k → ρ̃∗ , 3.3 σ̃k → σ̃∗ . Fuerza eléctrica. ~ rk ), se determina la fuerza electrostática total que experimenta una VS colocada Una vez calculado E(~ en una posición arbitraria ~rj . Cada diferencial de carga de dicha VS tiene un vector posición igual a ~rj + ~r′ , donde ~r′ es el vector posición desde el centro de la VS al diferencial de carga (figura 3.5). Figura 3.5: Una esfera en un CE no-uniforme. La fuerza electroestática sobre la j-ésima VS (jév) será: F~j = σj Z Ω′ ~ rj + Rr̂ ′ )R2 dΩ′ + ρj E(~ Z Γ′ ~ rj + ~r′ )dΓ′ , E(~ (3.9) 33 donde dΩ′ = sin θ ′ dφ′ dθ ′ es el diferencial de ángulo sólido, Ω′ es la región (0 ≤ φ′ ≤ 2π)∪(0 ≤ θ ′ ≤ π), dΓ′ = r ′ 2 dΩ′ dr ′ es el diferencial de volumen esférico, Γ′ es la región de Ω′ ∪ (0 ≤ r ′ ≤ R) y la variable σj ≡ σ + 2Cj e+ /SV representa la DSC total de la jév. Introduciendo la ecuación 3.6 en la ecuación 3.9 se obtiene: ~j ǫF " Z " Z = σj σ̃∗ + ρj σ̃∗ 2 ′ R dΩ ẑ + ρ̃∗ Ω′ ′ dΓ ẑ + ρ̃∗ Γ′ Nj Z 1 X ~rji + Rr̂ ′ (zj + R cos θ )R dΩ ẑ + R2 dΩ′ (Qi − ρ̃∗ VV ) 4π i=1 rji + Rr̂ ′ ||3 Ω′ Ω′ ||~ Z 2 ′ ′ Nj Z ~rji + ~r′ 1 X dΓ′ , (Qi − ρ̃∗ VV ) (zj + r cos θ )dΓ ẑ + ′ ||3 ′ ′ 4π ||~ r + ~ r Γ Γ ji i=1 Z ′ ′ # ′ Esta ecuación se simplifica como: ~j ǫF Nj Z R2 X ~rji + Rr̂ ′ = σj SV (σ̃∗ + ρ̃∗ zj )ẑ + dΩ′ (Qi − ρ̃∗ VV ) ′ ||3 ′ 4π i=1 ||~ r + Rr̂ Ω ji " # Nj Z ~rji + ~r′ 1 X (Qi − ρ̃∗ VV ) dΓ′ , + ρj VV (σ̃∗ + ρ̃∗ zj )ẑ + 4π i=1 rji + ~r′ ||3 Γ′ ||~ # " ǫF~j = Qj (σ̃∗ + ρ̃∗ zj )ẑ + Nj X Qi − ρ̃∗ VV i=1 4π σj R 2 Z Ω′ ~rji + Rr̂ ′ dΩ′ + ρj ||~rji + Rr̂ ′ ||3 Z Γ′ ! ~rji + ~r′ dΓ′ . ||~rji + ~r′ ||3 La simplificación final es (ver apéndice A): ǫF~j = Qj (σ̃∗ + ρ̃∗ zj )ẑ + Nj X i=1 gj (γ) = (Qi − ρ̃∗ VV )gj ρj R 1 σj − γ ln 1 − 2 , γ − 1/γ 2 γ r ji R r̂ji , (3.10) Se pueden distinguir dos tipos de fuerza: (1) Difusiva, debido al CE de las iévs (el término de la sumatoria) y (2) Convectiva, debido al CE resultante de la MP, LI y LE, que puede variar en magnitud y dirección con la ubicación de la jév en el eje z (ortogonal a la MP). Si ocurre que: zj = z∗ ≡ − σ̃∗ , ρ̃∗ (3.11) entonces, la fuerza convectiva será nula y el comportamiento será puramente difusivo. Esto significa, que en el equilibrio dinámico del PS existirá un cúmulo de VSs que estarán cerca del plano z = z∗ que se moverán aproximadamente de forma difusiva en los ejes x y y (plano de difusión, PD). Sólo si existe un fujo transversal de VSs en el PS, estas nuevas VSs podrán empujar a las VSs que están cerca de zj = z∗ , desorganizarlas y hacerlas migrar hacia otras zonas del PS, que eventualmente podrán converger nuevamente hacia el PD o fusionarse con la MP. # 34 La ecuación 3.10 es la fuerza total electrostática que percibe la jév, y es la única a nivel electrodinámico, pues las fuerzas magnéticas producidas por el movimiento de otras VSs son despreciables. En el apéndice B se muestra como se encuentra la fuerza magnética resultante. De las ecuaciones que allı́ se presentan, se nota que la fuerza magnética es proporcional a c−2~vi × ~vj , y a partir de ésto se argumenta que F~jB ≈ ~0 ya que las escalas espaciales del PS son del orden de 101 µm y las temporales de las neurosecresiones son del orden de 10−1 ms por lo que v 2 ∼ 10−2 m2 /s2 es mucho menor que c2 , lo cual hace que la magnitud de la fuerza magnética sea pequeña comparada con la de la fuerza electrostática (detalles en la sección 8.1 de [75] y aplicación de algunos modelos dinámicos en [77]). Además, porque cuando el volumen total de las VSs es del orden del volumen total del sistema, la transición al equilibrio es relativamente rápida, por ende, lo que predomina en el tiempo son estados cercanos al equilibrio. Estos estados pueden ser sólo dos: (1) Cuando hay poco flujo de VSs tanto hacia dentro como hacia fuera, en este caso, las velocidades son aún mucho menores de 10−1 m/s, y (2) cuando las VSs tienen un flujo en alguna dirección, por lo que casi todas las VSs se moveran en las misma dirección, lo que implica que v̂i × v̂j ≈ ~0. 3.4 Fuerzas del clatrato de agua. Además de las fuerzas eléctricas que evitan en parte que las VSs coalescan, existe otra barrera para este fin. Las cabezas de los fosfolı́pidos, cargadas negativamente, que apuntan hacia afuera y hacia adentro de la neurona (capas bilipı́dicas) agrupan moléculas de agua a su alrededor, debido a que las moléculas de agua son polares, y el polo positivo del agua se atrae con las cabezas negativas de los fosfolı́pidos (más detalles en [8] y en el capı́tulo 17 de [78]). Para que dos membranas bilipı́dicas se fusionen, se necesitará remover o al menos penetrar la capa de agua acumulada en las cabezas de los fosfolı́pidos (clatrato de agua). Cuando ésto ocurre, se produce una desorganización de las moléculas de agua, donde intrı́nsecamente hay barrera energética que se venció. El trabajo que se necesitarı́a para lograr ésto, puede asociarse con una fuerza repulsiva que sólo actuarı́a cuando las dos membranas entran en contacto (ver figura 3.6). Figura 3.6: Solapamiento de una sección del clatrato de agua. El radio completo de las VSs es R = RV + R̃, donde RV es el radio de la VS sin el clatrato. 35 Algunos estudios experimentales muestran que esta fuerza depende única y exclusivamente de la separación entre las membranas (rji − 2RV ) o indirectamente del volumen de contacto. A escalas moleculares estas fuerzas son oscilatorias con rji debido a la organización granular que varia al cambiar la distancia entre dos placas que contienen agua entre ellas [79] (ver también sección 13.3 de [78]) y a escalas de 1 ó 2 órdenes superiores, la tendencia es aproximadamente lineal [66]. El volumen de contacto entre dos VSs es el volumen de solapamiento. Siendo R̃ el espesor del clatrato (para una aproximación de R̃ ver el apéndice C) y dado que 2RV ≤ rji ≤ 2RV , donde RV es el radio vesicular sin clatrato, entonces el volumen de solapamiento entre la iév y la jév es: Vij = 2πh2ji hji R− , 3 hji ≡ R − rji , 2 siendo hji la mitad del espesor de la sección solapada. Esta expresión se puede simplificar como: 2 1 1 3 Vij = R3 − R2 rji + rji . 2π 3 2 24 La fuerza del clatrato de agua entre las VSs será entonces: F~ijw (~ri , ~rj ) = pVij r̂ji , donde p es una constante. Incluyendo todas las iévs, la fuerza resultante es: nj nj nj F~jw 2 X ~rji 1 2 X 1 X 2 = R3 − R ~rji + rji~rji , 2πp 3 r 2 24 ji i=1 i=1 i=1 (3.12) donde la sumatoria hasta nj se refiere a las VSs para las que 2RV ≤ rji ≤ 2RV con j 6= i. Cabe señalar que en el movimiento de las VSs, de una iteración a otra, puede existir un solapamiento con rji < 2RV . En tal caso, se implementa una condición que mueve a las VSs hasta rji = 2RV , desplazando a cada VS una cantidad igual a 0.5rji − RV en la dirección r̂ji . 3.5 Fuerzas de fricción. Cuando un objeto se mueve en un fluido, las partı́culas microscópicas de éste chocan sobre la superficie rugosa del objeto, causando una desaceleración. El comportamiento global es una fuerza de roce que es opuesta al movimiento. Según la ley de Stokes, la fuerza de fricción dinámica para una esfera (o jév) es (sección 4.2 de [80]): F~jf (~vj ) = −6πµR~vj , (3.13) 36 kg a 20◦ C) y vj es la velocidad instantánea de la donde µ es la viscocidad del fluido (µH2 O = 10−3 m.s jév. 3.6 Desplazamiento vesicular. Conocida la fuerza F~jp ≡ F~j + F~jw sobre la jév, las EMV se deducen de la segunda ley de Newton. Para la k dirección cartesiana se tiene: mj dvjk p f p − 6πµRvjk , = Fjk + Fjk = Fjk dt p es considerada como constante durante el intervalo ∆t. La solución de esta ecuación donde Fjk diferencial es 1 : vjk (t + ∆t) = ṽjk (t) − [ṽjk (t) − vjk (t)]e−bj ∆t , vjk (t) − vjk (t + ∆t) , rjk (t + ∆t) = rjk (t) + ṽjk (t)∆t + bj (3.14) (3.15) donde: ṽjk (t) ≡ p Fjk 6πµR , bj ≡ 6πµR . mj (3.16) Las ecuaciones 3.14, 3.15 y 3.16 se utilizan para simular el movimiento tridimensional simultáneo de las N VSs que están en PS. Para intervalos de tiempo pequeños (bj ∆t ≈ 0): vjk (t + ∆t) ≈ vjk (t)(1 − bj ∆t) + ṽjk (t)bj ∆t, rjk (t + ∆t) ≈ rjk (t) + vjk (t)∆t. (3.17) Nótese que ṽjk y bj son las únicas variables de interpretación fı́sicamente desconocidas en las EMV, y que éstas pueden cambiar en el tiempo (en general, R y mj pueden cambiar en cada iteración, debido a que la VS puede liberar el neurotransmisor parcialmente). Esto quiere decir que cada VS debe estar caracterizada, además, por R̃j y mj . El modelo se complica aún más al introducir la variable Cj la cual cambia de valor cuando una proteı́na que se encuentra en la membrana de la VS captura o rechaza a uno o varios iones de Ca2+ . En este mismo proceso se debe considerar algún mecanismo (al menos estadı́stico) para simular cada actividad proteı́na-ión por VS (ver el apéndice D para tener una idea de una posible formulación de estos procesos). 1 Parte de la deducción de la solución está en la sección 6-7 de Resnick R., Halliday D. y Krane K., “Fı́sica. Volumen I.”, 4ta.edición, CECSA, ISBN 0-471-80458-4 (1992). Capı́tulo 4 Metodologı́a. En este capı́tulo se describen los detalles tanto del modelo de simulación como del algoritmo programado para realizar los cálculos. 4.1 Simplificación del modelo. En el modelo de simulación completo, cada paso de MonteCarlo tiene 5 partes secuenciales (imagen D.1): (1) Incorporación de nuevas VSs de forma predefinida. (2) Por cada proteı́na de sinaptotagmina de cada VS se captura o rechaza un ión de Ca2+ , con probabilidades distintas y caracterı́sticas de cada VS en el tiempo (PjC y PjR ). (3) Se actualiza la concentración de Ca2+ en el LI, debido a la capatación y rechazo de estos iones en las VSs. (4) Movimiento simultáneo de las VSs dentro del PS, a partir de las fuerzas instantáneas previamente calculdas (tal como se describió en el capı́tulo anterior). (5) La fusión (con probabilidad PjF ) o rebote, y liberación del neurotransmisor (completa o parcial), de cada VS que tocó la membrana presináptica. Como un primer paso a la simulación completa, en esta tesis se tomó a la probabilidad de fusión como un valor constante en toda la simulación (PjF (t) = PF ), y la liberación del neurotransmisor de cada jév será siempre completa. Estas condiciones implicarı́an que Cj sea dispensable, y por ende, no se necesitarı́a acumular Cj , y en conclusión PjC y PjR serı́an también dispensables. Con esta simplificación, la cadena de Markov completa (diagramada en la figura D.1) se simplificó en solo 3 partes, tal como se muestra en la figura 4.1. Por otro lado, debido a esta misma simplificación, la masa y DVC intravesicular de cada VS se convierten en valores comunes e invariantes en el tiempo (mj = mV y ρi = ρV , las cuales se estiman en la próxima sección). Con esto, bj = bV (ecuación 3.16) y Qj = QV son también comunes entre las VSs e invariantes en el tiempo, lo cual significó un ahorro de cómputo considerable, al colocar las masas y las cargas como constantes en todo el algoritmo. 37 38 Figura 4.1: Esquema sobre los eventos que le ocurren a las N VSs en un paso de MonteCarlo. Una segunda simplificación se realizó en el modelo, la cual tiene que ver con el radio de las VSs. Ya que la fuerza debido al clatrato de agua es función del radio total de la VS, R = RV + R̃(S) , donde RV es el radio de la VS sin clatrato, R̃(S) es el espesor del clatrato y S = S(QV , T ) es el nivel de solvatación (siendo T la temperatura), se asumió que la capa de solvatación sólo se formaba hasta el primer nivel (S = 1) y que los demás niveles tenı́an densidades de moléculas de agua polarizadas relativamente bajas. Ası́, el radio efectivo de las VSs serı́a (apéndice C): (1) R = YH2 O |QV | + RV3 1/3 , (1) Y H2 O ≡ K−1 1.33 × 10−11 m3 /C. K (4.1) De esta forma, se simplificó nuevamente el algoritmo al considerar que el radio de las VSs fuesen iguales e invariantes en el tiempo. Con la aproximación de Qj = QV y las ecuaciones 3.7 y 3.8, se llega a: ! N b3 ρ̃∗ (N ) = ρ̃ + QV − ρ̃VV , 1+ 3 V bm σ̃∗ (N ) = σ + ρd − ρ̃∗ H 2 ⇒ z∗ (N ) = (4.2) 1 σ + ρd H− . 2 ρ̃∗ (N ) (4.3) Como z∗ depende del número de VSs en el PS (N ) y esta variable cambia en el tiempo, para que las VSs se acomoden en el PD, primero se tendrá que llegar a un pre-equilibrio donde N permanezca 39 constante en el tiempo y sólo posteriormente las VSs se distribuirán en el PD. 4.2 4.2.1 Estimación de valores. Variables espaciales (RV , H, L, d y b). Las primeras variables que se estimaron para la implemetación de las EMV en el simulador fueron las variables espaciales. Comenzando por el radio de la VS, se apreció que el tamaño de la VS está en el orden de los nm y en concreto se estableció que el tamaño de la VS es de 50nm = 2RV , cantidad que concuerda con VSs de una sinapsis neuromuscular de rana [81] (para sinapsis axónica ver sección 21.1 de [37]). Con este valor de R se calculó la superficie y volumen de las VSs como: SV = 7.854 × 10−15 m2 , VV = 4 π(RV − dm )3 = 2.402 × 10−23 m3 , 3 donde dm = 7.1nm es el espesor de la membrana bilipı́dica (sección 10.2 de [82]). También se estimó la dimensión del PS con las microfotografı́as electrónicas reportadas por Van der Kloot [81] y otros investigadores [67], ası́ como también, mediante microfotografı́as obtenidas con técnica de congelación rápida y grabado profundo [83]. Se aproximaron las dimensiones del PS como H ≈ 10×2RV (altura del PS), L = 2H (ancho y profundidad del PS) y d ≈ 1×2RV [5] (espacio intersináptico). Cantidades similares fueron utilizadas por Shahrezaei [85] para la simulación (via MonteCarlo) de la difusión de iones de calcio con microdominios de VSs en un PS. La última variable espacial que se estimó fue b (alcance de los CEs), la cual fue relacionada con la geometrı́a del PS. Se estableció que b se relacionará con las dimensiones del PS como: b = bo ≡ H2 . 2L (4.4) Esta relación garantiza que cuando el PS sea un cubo, la vecindad de la jév llegará a la mitad del PS, minimizando los efectos periódicos de borde (sección 9.4.1 de [17]). Para H < L, el perı́metro se angosta evitando en promedio los bordes superiores e inferiores. Este mismo razonamiento fue hecho para determinar el lugar de deposición de las nuevas VSs, Ψ, en la sección 3.1. 4.2.2 Variables de carga eléctrica (σ, ρ, ρ̃ y ρV ). La DSC de las membranas, σ, puede tomar valores diversos, dependiendo del tipo de menbrana. Por ejemplo, para membranas bilipı́dicas en soluciones de N aCl, σ = −0.00022C/m2 [72]; para células de liposomas catiónicos, σ está comprendido entre +0.000801C/m2 y +0.0019224C/m2 (rango aproximado por el cual se puede producir la endocitosis y la exocitosis) [86]; para membranas naturales 40 Tabla 4.1: Concentraciones de iones dentro y fuera de la célula (mM/l). En la última fila se ha calculado la carga de la VS con σ = −0.05C/m2 y ρV = 1.1ρ. Para el músculo de rana se ha supuesto que existen VSs dentro de éste, aún cuando se sabe que es un argumento fisiológicamente falso. Axón del calamar. Músculo de rana. Motoneurona de gato. dentro fuera dentro fuera dentro fuera [K + ] 400 15 140 2.5 150 5.5 [N a+ ] 50 450 9.6 118.8 15 150 [Cl− ] 55 550 3 120 9 125 [Ca+2 ] 0.4 10 4.9 2.1 — — [M g+2 ] 10 54 10 54 — — [HCO3 − ] — — 12.4 26.6 — — [CH3 SO4 − ] 270 — — — — — [aspartato− ] 75 — — — — — [otros− ] — — 74 13 — — DVC (106 C/m3 ) 6.83 4.15 8.68 7.13 15.04 2.94 QV (10−16 C) −2.83 −2.04 −3.15 (en base a fosfolı́pidos), σ = −0.05C/m2 [73], entre otros valores, los cuales dependen básicamente de la función fisiológica que desempeñe la célula. Los valores de ρ y ρ̃ fueron calculados apartir de las concentraciones de los diferentes iones tanto externos como internos a las células. Dichas concentraciones fueron obtenidas directamente de la literatura para el músculo de rana, el axón de calamar y la neurona de la médula espinal de gato (o motoneurona), tal como se muestra en la tabla 4.1 (capı́tulo 4 de [53] 1 ). Por otro lado, ρV fue aproximada a un valor mayor pero cercano a ρ (ρV = 1.1ρ). Esto es, porque se supone que todas las VSs (o la menos la mayor parte) proceden del reciclaje vesicular, es decir, que estas se forman de la endocitosis (invaginación de la MP). Es de suponer que en este proceso la VSs se formaban con LE dentro de ella, y que este lı́quido entraba debido a una diferencia de presión. También se sabe que dentro del PS, ciertos procesos biológicos realizan la labor de introducir el neurotransmisor en las VSs y debido a que este compuesto esta cargado (ej: la molécula de acetilcolina está cargada con e+ , ver página 179 de [45]), la DVC dentro de la VS aumenta significativamente. 1 Véase datos de otras fuentes en http://www.unmc.edu/Physiology/Mann/mann3a.html. 41 Tabla 4.2: Radios efectivos de las VSs (10−9 m). 4.2.3 Axón del calamar Músculo de rana Motoneurona de gato 25.00198 25.00143 25.00221 Constantes del medio (K y µ). Estas constantes fueron aproximadas a valores particulares del agua pura a temperatura corporal (37o C) que se encuentran en la literatura: 1. Constante dieléctrica, K = 74.1 (utilizando la ecuación C.12). Con este valor se llega a (1) YH2 O = 1.314 × 10−11 m3 /C, y con YH2 O se pueden calcular los radios efectivos totales de la VS, tal como se muestra en la tabla 4.2. 2. Viscosidad, µ = 0.7 × 10−3 kg/m.s (utilizando una relación lineal entre los valores de 20o C y 40o C, ver página 8 de [80]). Estos valores deben ser diferentes de los valores reales, debido a que en el LI, además del agua, están presentes los iones de la tabla 4.1, mitocondrias, organelos, ciertas proteı́nas y, evidentemente, las VSs. Para aproximar, algo más, los valores de K y µ, serı́a necesario considerar a estas dos constantes como propiedades efectivas del medio. Para K, se estima que el valor efectivo deberá disminuir con respecto al valor homogéneo, ya que K para los iones es menor (igual para la materia orgánica); mientras que para µ deberá aumentar, principalmente porque las mitocondrias, organelos y las VSs conforman ciertos obstáculos para el flujo del agua (ver cálculos de la viscosidad efectiva con esferas en [87]). 4.2.4 Masa de las VSs (mV ). La masa de cada una de las VSs, mV , fue estimada calculando aisladamente las masas de la membrana de la VS (mm ) y del LV (ml ). mm se calculó teniendo como datos la densidad de los fosfolı́pidos en membranas bilipı́dicas ρf = 1g/ml [84] y el espesor de esta misma membrana dm = 7.1nm. El espesor de la membrana de la VS ocupa un volumen: i 4 h 3 π RV − (RV − dm )3 = 4.2 × 10−23 m3 3 ⇒ mm = 4.2 × 10−20 kg. Por otro lado, el volumen ocupado por el LV es: 4 π(RV − dm )3 = 2.4 × 10−23 m3 3 ⇒ ml = 2.3 × 10−20 kg ⇒ mV = 6.5 × 10−20 kg. 42 Tabla 4.3: Volúmenes máximos de solapamiento y moléculas de agua para este volumen. Axón del calamar Músculo de rana Motoneurona de gato Ṽ (10−31 m3 ) 1.547 0.806 1.915 M̃ 0.0279 0.0145 0.0346 El valor real debe ser mucho mayor que el estimado, porque en el cálculo de mm no se ha incluido la masa de las proteı́nas que contiene la VS, ni tampoco, para mli se han incluido el contenido de los algunos iones y el neurotransmisor, cuya molécula es mucho más grande que la del agua. 4.2.5 Variable temporal (∆t). Esta cantidad corresponde al paso del tiempo real en el cual se moverán las VSs con movimiento de arrastre en cada paso de MonteCarlo (ecuaciones 3.14 y 3.15). La estimación de esta variable fue de vital importancia para la correcta reproducción de los resultados, ya que si ∆t fuera mayor que el tiempo total de respuesta excitatoria 2 , las VSs recorrerán trayectorias erróneas, debido a que en tiempos reales, antes del final de las trayectoria simulada, las VSs debieron haberse fusionado para producir la respuesta, evento que posiblemente ocurrirá después de la trayectoria. El tiempo real de respuesta excitatoria es de ∼ 2ms (capı́tulo 2 de [53] y capı́tulo 1 de [38]), donde el tiempo de tráfico vesicular, más la fusión de la VS y la difusion del neurotransmisor en la hendidura (tiempo de retraso3 ), es de 0.8 − 1.5ms. Por lo tanto, el tiempo de tráfico vesicular exclusivamente debe ser ∼ 0.1ms, con lo cual, ∆t se estimó como 0.1ms/P.T., donde P.T. ∼ 106 es el número de iteraciones que se realizarı́an en toda la simulación para que el sistema halla evolucionado completamente. Cabe destacar, que esta éstimación (∆t ∼ 10−9 s) concuerda con las estimaciones realizadas por Schlick para grupos moleculares y proteicos (tabla 12.3 de [17]). 4.2.6 Clatrato de agua (p). Para estimar la constante de proporcionalidad de la fuerza del clatrato de agua, p, se asumió que en el “solapamiento” del clatrato, las moléculas de agua que estén dentro de este sector, tendrı́an que “desligarse un poco” de la carga de la VS para que en el sector puedan acomodarse los dos clatratos (de la iév y la jév). La fuerza de repulsión es más fuerte, cuando rji = 2R + R̃ (nótese de la figura 3.6); es decir, que existirá un volumen máximo de solapamiento (Ṽ ), cuyos valores se presentan en la tabla 4.3. 2 Fisiológicamente, este tiempo es comprendido desde que se aplica el impulso eléctrico en el nervio hasta que es percibido por el músculo o por otra neurona. 3 Capı́tulo 2 de Briar C., Lasserson D., Gabriel C. y Sharrack B., “Lo esencial en sistema nervioso”, UK, 2da.edición, Mosby y Elsevier, ISBN 84-8174-732-7 (2004). 43 En este caso, el número de moléculas de agua que están en el sector de solapamiento será M̃ = 2Ṽ /( 43 πRa3 ), cuyos valores están también en la tabla 4.3, siendo Ra el radio de la molécula de agua cerca del la VS (apéndice C). Es decir, que sólo las M̃ moléculas de H2 O (o al menos una parte de la molécula) produciran la fuerza de repulsión. Debido a que las dos VSs (iév y jév) tienen cargas iguales, el CE sobre las moléculas de agua polarizadas en el sector de solapamiento será aproximadamente cero, y la única interacción que producirá la fuerza de repulsión será entre las mismas moléculas. Esta interacción puede asumirse como un fluido que ejerce una presión entre las paredes de las VSs, cuya ecuación de estado puede aproximarse a la expansión virial (capı́tulo 5 de [88]): P ≈ 1 + Bn, nkB T donde P es la presión, n = N/V es la densidad de partı́culas (siendo N el número de partı́culas y V el volumen), kB es la constante de Boltzamann, T es la temperatura y B es el segundo coeficiente virial. Para el agua pura y otas sustancias, B es calculado apartir del potencial intermolecular de LennardJones (ver [89] y sección 2.2 de [88]), y después de un procedimiento mecánico estadı́stico (sección 5.2 de [88]), se obtiene el valor de B (para el agua a temperatura corporal es B = −1015.86cm3 /mol = −1.687 × 10−27 m3 /moléculas [90]). De esta forma, se podrá calcular el trabajo hecho por la descompresión en el volumen solapado, y de ahı́, la fuerza que produce ese trabajo, el cual será: Fmáx 1 = R̃ Z M̃ VH2 O Ṽ " kB T M̃ M̃ 1 M̃ VH2O P dV = +B − ln VH2 O R̃ Ṽ Ṽ !# , (4.5) donde VH2 O es el volumen efectivo de la molécula de agua a una temperatura dada y se ha supuesto que el número de partı́culas, N = M̃ , permanece constante durante toda la descompresión. Por otro lado, Fmáx se puede calcular de la ecuación 3.12 con rji = 2RV + R̃, como: " # 2R3 R2 (2RV + R̃) (2RV + R̃)3 Fmáx = 2π − + = Ṽ . p 3 2 24 (4.6) Con las ecuaciones 4.5 y 4.6 se puede encontrar el valor p para cada tipo de célula en particular, tal como se muestra en la tabla 4.4. 4.2.7 Fusión de VSs en estados de reposo y excitado. Como se explicó en la sección 4.1, la probabilidad de fusión, PF , fue incorporada para cumplir la función de regular la secreción debido a las simultáneas colisiones que las VSs hacen con la MP. Si 44 Tabla 4.4: Fuerzas máximas debido al clatrato y valores de p. Axón del calamar Músculo de rana Motoneurona de gato (10−7 N ) 5.44 7.54 4.89 p (1024 N/m3 ) 3.51 9.35 2.55 Fmáx no existiera esta probabilidad, todas las VSs que llegan a la MP, se fusionarı́an con ésta sin ningún “contratiempo”, y de esta forma nunca se acumuları́an VSs en el PS, tal como sucede en células reales (cerca de la MP). La zona del PS donde se producen acumulaciones de VSs cerca de la MP se denomina “Readily Releasable Pool (RRP)” [51, 49] (ver también capı́tulo 10 de [12]), debido a que estas VSs están listas para ser liberadas inmediatamente después de que el calcio entre al PS. Las VSs restantes tendrán que reorganizarse y pasar por el RRP antes de ser liberadas. Desde este punto de vista, el valor de PF sólo puede asociarse estadı́sticamente al tamaño del RRP, que no se conoce a priori. Lo único que se hizo en esta tesis para estimar el valor fue comenzar las simulación con un valor relativamente bajo (PF < 0.1, en estados no-excitados) y corregirlo paulatinamente de forma de encontrar un tamaño del RRP deseado. Dicha metodologı́a fue implementada únicamente tanto en estados de reposo o no-excitados, como en estados perturbados o excitados. En estados excitados, esto es, cuando los iones de calcio se introducen en el BS debido a que el PA invade la terminal nerviosa, ocurre un evento para modelar el proceso biológico, esto es, cambiar la probabilidad de fusión abruptamente de PF a PE , donde PE es la probabilidad de fusión en el estado de excitación. La DVC del LI no cambia debido a que se hizo la aproximación: ρ̃ = ρo + ρCa2+ ≈ ρo , donde ρo es la DVC del LI sin calcio y ρCa2+ es la DVC del calcio. Por otro lado, la DVC del LE tampoco cambia ya que se ha supuesto que existen mecanismos externos que restablecen la pérdida del calcio que entró al BS. El valor de PE > 0.1 puede ser tanteado (de igual manera que con PF ) hasta reproducir algún evento fisiológico conocido y medible. 4.3 Detalles de las simulaciones. La programación del códgio para las simulaciones y otros cálculos, fueron hechos en Lenguaje C (apéndice E) bajo una estación de trabajo SUSE Linux 10.2 en una PC P4(r) 3.4Ghz, al igual que 45 las compilaciones y ejecuciones de estos códigos. Las ejecuciones comienzan con el código de la sección E.1, en el cual se tienen que introducir las constantes del problema (las nombradas en la sección 4.2) y se generan una serie de archivos que dan información sobre la evolución general del sistema. Luego, se ejecuta el código de la sección E.2 que lee los archivos anteriormente procesados para generar nuevos archivos que dan información sobre la evolución de las distribuciones de VSs a lo largo del eje ortogonal a la MP. Para excitaciones periódicas se ejecuta el código de la sección E.3, el cual produce otros archivos donde está la información de los promedios por cada intervalo de tiempo excitado y noexcitado. Los intervalos tienen que estar acorde con los generados en las excitaciones periódicas (frecuencia). En las primeras simulaciones se tomaron las condiciones iniciales de N (t = 0) = 0 (sin VSs al comenzar la ejecución), para que de esa forma el PS se llene de VSs “relajadamente” y encontrar un equilibrio cercano a estados reales. En este llenado se colocó una función periódica de incorporación vesicular ft = f(9:1) = {0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1}, es decir, de 1 VS cada 9∆t de tiempo. Esto indica que el sistema tendrá que relajarse en 8 iteraciones, de lo contrario, el sistema tendrá siempre estados desordenados. Es necesario aclarar que el valor de ft tiene que estar adecuado para reproducir los potenciales en miniatura (MEPPs, sección 2.6). Por lógica, para que el PS alcance el equilibrio (N (t) = constante), la tasa temporal de fusión vesı́cular que define los MEPPs, τ , tiene que ser igual a la tasa de incorporación de VSs, es decir: ft = f(τ :α) = f(τ /α:1) , τ≈ 10ms , ∆t α ≈ 1, 2, 3, 4. Para ∆t = 1ns, implica que τ /α ∼ 105 , lo que significarı́a un número de iteraciones muy grande que consumirı́a mucho tiempo de computo innecesario, debido a que la relajación al equilibrio con la perturbación de una VS fue alcanzada mucho antes, y es por ello que se colocó a ft con baja frecuencia de incorporación. También, resulta importante mencionar que en el código para la dinámica de la neurosecreción se implementó dos condiciones paralelas para la finalización de la simulación. La primera es contar los pasos de MonteCarlo (iteraciones) hasta un valor predeterminado (pt); y la segunda condición es calcular la desviación estándar en cada iteración y parar hasta que ésta disminuya a un valor determinado, cuyo valor se designó en la variable ϕ. Si cualquiera de las dos condiciones se llega a cumplir en cualquier iteración, el algoritmo se detendrá. Capı́tulo 5 Resultados. En primer lugar, resulta importante aclarar que el orden de las variables que se introducen en el código es como se presenta en la tabla 5.1. Con los valores de dicha tabla, se determinó que para ρV = ρcv = −3σ/RV = 6 × 106 C/m3 la carga eléctrica de la VS será nula en el simulador (ρV < ρcv ⇒ QV < 0, y ρV > ρcv ⇒ QV > 0). Con los valores de la tabla 5.1 y las ecuaciones 4.2−4.3, se determinó la variación de la localización del PD, z∗ , con respecto a Φ = N VV /V (ver figura 5.1), con b = bo = 1.03 × 10−7 m (ecuación 4.4), b = bm = 4.12 × 10−7 m (ecuación 3.8) y b = b̃ = (bo + bm )/2 = 2.57 × 10−7 m. 1 b=bo ~ b= b b=bm 0.8 z*/H 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 Φ 0.6 0.8 1 Figura 5.1: Variación del lugar del PD, z∗ (ver ecuaciones 4.3 y 4.2), como función de la fracción volumétrica vesicular, para tres valores de b. Las DVCs fueron tomadas de la cfg.01 (ver tabla 5.2). 46 47 Tabla 5.1: Orden de las variables que se introducen durante la ejecución del código de la sección E.1. Los valores que poseen el sı́mbolo “#”, indican que en cada simulación se estableció un valor particular, mientras que en las variables restantes, el valor permaneció constante en todas las simulaciones. En la columna Simulación, el sı́mbolo “=” señala que el valor es igual al estimado. La columna indicada como Potencia indica el orden de magnitud que corresponde al valor de la respectiva fila. Nótese que, entre otras, las variables espaciales (sección 4.2.1) se mantuvieron constantes en todas las simulaciones, con valores aproximados a los estimados en el capı́tulo anterior. Las últimas dos variables no se introducen en el simulador como parámetros del código en ejecución, sino como parámetros de comando. Valores (MKS). Orden Descripción Variable Potencia Estimado Simulación 1 Identificación. cfg / / # 2 Altura del PS. H −7 5.0 4.1 3 Ancho y profundidad del PS. L −7 8.2 = 4 Radio de las VSs. RV −7 0.25 = 5 Densidad vesicular inicial. dvi 0 / 0 6 Intervalo de tiempo por iteración. ∆t −9 ∼1 # 7 Alcance de los CEs. b / bo # 8 Interacción del clatrato de agua. p 24 ≥ 2.55 2.41 9 DSC de las membranas. σ −2 −5.0 = 10 DVC del LI. ρ̃ 6 ≥ 6.83 # 11 Constante dieléctrica del LI. K 0 ≤ 74.1 = 12 Espacio intersináptico. d −7 0.50 = 13 DVC del LE. ρ 6 ≥ 2.94 # 14 DVC del LV. ρV 6 ≥ 3.23 # 15 Masa de las VSs. mV −20 ≥ 6.5 # 16 Viscocidad de LI. µ −3 ≥ 0.7 # 17 Tiempo inicial. ti 0 / 0 18 Incorporación de las VSs en el PS. ft / 9:1 = 19 Probabilidad de fusión. PF 0 < 0.1 # 20 Pasos totales de simulación. pt 4 ∼ 100 # 21 Pasos de grabación en archivo. pg 4 < pt 1 / Desviación estándar de parada. ϕ −2 / 1 / Pasos de visualización en pantalla. pv 2 / / 48 En la gráfica 5.1, el eje horizontal está representado por la fracción volumétrica vesicular u ocupación volumétrica relativa de VSs en el PS: Φ(t) ≡ N (t)VV , V donde V es el volumen del PS y VV es el volumen de la VS. Como se puede observar, existe discontinuidad para cierto valor de Φ (o de N ), el cual es atribuible a la corrección que se hizo para ρ̃ (ecuación 3.7). Sin embargo, la discontinuidad aparace cuando Φ ∼ 0.5, y en particular, cuando Φ ≈ 0.65 para b = b̃, valor de b por el cual se obtienen diferencias aceptables con respecto a valores exactos, tal como se explica más adelante, y en estos casos, el valor de Φ nunca pasa el valor de 0.5. El valor de Φ por el cual ocurre la discontinuidad puede calcularse teóricamente mediante las ecuaciones 4.2 y 4.3, donde resulta que dicho valor es: ΦC = " b3 1+ 3 bm ! QV 1− ρ̃VV !#−1 ⇒ Φ ρ̃∗ (Φ) = ρ̃ 1 − . ΦC (5.1) Por otro lado, de todas las variables implı́citas en el modelo, solo algunas fueron cambiadas varias veces para observar los comportamientos con respecto a dichas variables (en la tabla 5.1 están señaladas con “#” en la sexta columna). Las restantes tomaron valores acordes con las estimaciones antes realizadas. Para organizar los datos, las variables que cambian en cada simulación se colocaron en otra tabla donde se asignó una identificación (cfg) para una respectiva configuración (tabla 5.2). Con ésta se creó otra tabla (tabla 5.3) donde se muestran los resultados de los cálculos para algunas (1) variables que son utilizadas por el simulador (QV , YH2 0 , R̃(1) , bV y ΦC ) y los resultados principales de cada simulación (Φ(eq.) y desplazamiento medio (DM) en estados de equilibrio). 5.1 Simulaciones de llenado vesicular (SLLVs) en el PS. Con las configuraciones 01-04 se realizaron SLLVs, esto es, comenzar con un PS vacı́o y llenarlo paulatinamente con la función periódica ft = {0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1}. En estas primeras simulaciones se varió el parámetro b para determinar los efectos secundarios al reducir este valor. En la cfg.01 se omitió el parámetro b para obtener un resultado más real de la simulación (se incluyeron todas las interacciones entre las VSs), mientras que en la cfg.02 se colocó b = bm para realizar una prueba sobre las interacciones entre la “mayorı́a” de las VSs 1 y en las cfg.03 y 04 se impusieron que el valor de b tuviese relación con la aproximación geométrica antes mencionada (bo y b̃). Debido a que esta simulación es una situación biológicamente irreal, es necesario reestimar 1 Con este valor, también, se anula las correcciones propuestas para ρ̃ (ecuación 3.7). 49 Tabla 5.2: Configuraciones de valores de las constantes para cada simulación (unidades en MKS). El orden de magnitud de cada variable está indicado en la tabla 5.1. Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la casilla de la misma columna en la fila anterior. El sı́mbolo “=” significa que el valor de la casilla corresponde al valor estimado (tabla 5.1). Las simulaciones 11, 12 y 13 se realizaron con la configuración indicada, y los reescalamientos propuestos en la sección 5.2. cfg ∆t b ρ̃ ρ ρV mV µ PF pt dvi 01 = / 13.1 2.70 3.43 = 4.4 0.04 7 0.0 02 bm 03 b̃ 04 bo 05 0.9 06 0.8 07 0.7 08 0.6 09 0.5 10 0.4 11 b̃ 11 cfg.03, λα = 0.7 12 cfg.03, λα = 0.8 13 cfg.03, λα = 0.9 14 = b̃ 0.0124 13.1 50.0 3.43 = 4.4 15 0.20 0.20 6.55 56.5 56.5 16 13.1 0.20 3.43 = 3.3 17 8.77 70.0 6.55 16.5 16.5 18 13.1 2.70 3.43 13.0 4.4 19 16.5 20 26.0 21 56.5 22 = 0.02 16 0.04 7 3.3 23 5.5 24 6.6 25 7.0 26 4.4 0.02 27 0.06 28 0.08 29 0.10 0.0 50 Tabla 5.3: Resultados de los cálculos de algunas variables que se mantienen constantes durante la ejecución de las simulaciones (las unidades están en MKS). Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la casilla de la misma columna en la fila anterior. Las columnas indicadas como Φ(eq.) y hδri(eq.)/2RV son resultados de las simulaciones que se obtienen en estados de equilibrio, y que se explican más adelante. La última columna es la localización del PD teórico calculado con las ecuaciones 4.3 y 5.1. (1) cfg QV (10−16 ) YH2 O (10−11 ) R̃(1) /RV bV (1010 ) ΦC Φ(eq.) hδri(eq.)/2RV z∗ /H 01 −1.682 1.315 0.00005 3.19 / 0.134 2.10 0.4920 02 0.418 0.129 2.20 0.4883 03 0.673 0.124 2.343 0.4902 04 0.823 0.139 2.62 0.4905 05 0.673 0.157 2.25 0.4898 06 0.199 2.14 0.4888 07 0.242 1.99 0.4878 08 0.295 1.83 0.4858 09 0.353 1.61 0.4834 10 0.416 1.35 0.4793 11 −0.690 1.100 2.23 0.1231 2.336 0.4902 12 −0.963 1.176 2.55 0.1235 2.339 0.4902 13 −1.293 1.247 2.87 0.1241 2.342 0.4902 14 −1.682 1.315 3.19 0.037 1.31 0.2585 15 +0.360 0.00001 4.71 −0.460 0.039 0.002 0.7249 16 −1.682 0.00005 2.39 0.673 0.118 2.92 0.5046 17 +0.360 0.00001 4.71 0.858 0.034 1.00 0.0005 18 −1.682 0.00005 1.60 0.673 0.132 2.321 0.4902 19 1.26 0.140 2.323 0.4900 20 0.80 0.161 2.335 0.4895 21 0.37 0.205 2.359 0.4885 22 2.39 0.096 2.67 0.4907 23 3.99 0.193 2.14 0.4888 24 4.79 0.250 1.95 0.4873 25 5.08 0.268 1.88 0.4868 26 3.19 0.154 2.53 0.4898 27 0.109 2.24 0.4905 28 0.100 2.17 0.4907 29 0.093 2.11 0.4910 51 algunas cantidades, con el fin de que el DM ,hδri, no pase los lı́mites del PS. Si la primera VS que inicia en el simulador está cerca de H/2, entonces: QV F~jp ≈ (σ + ρd)ẑ 2ǫ ⇒ ṽjz ≈ QV (σ + ρd) . 2ǫbV mV Como las VSs inician con vjk = 0, entonces: vjz (t + ∆t) = ṽjz (1 − e−bV ∆t ), rjz (t + ∆t) = vjz (t + ∆t) H + ṽjz ∆t − . 2 bV Combinando estas dos ecuaciones se obtiene: ∆rjz H ≡ rjz (t + ∆t) − 2 = ṽjz ≈ e−bV ∆t − 1 ∆t + bV ! ṽjz bV ∆t2 bV ∆t ≈ 1− 2 3 ! ! QV (σ + ρd)∆t2 2πµRV ∆t 1− , 4ǫmV mV donde se ha aproximado la exponencial hasta la potencia cúbica. Para que el desplazamiento ∆rjz disminuya, principalmente, se tiene que cumplir: (1) ∆t tiene que disminuir, (2) mV tiene que aumentar y (3) µ tiene que aumentar. Cuando se observó que el número de VSs era relativamente bajo en cada iteración, se supuso que el hδri sobrepasaba los lı́mites del PS. Entonces, se decidió reajustar los tres parámetros antes mencionados, para aumentar las VSs en el PS. Los cambios debido a las correcciones en los parámetros mostraban inestabilidad al variar el 1% ó 2% del valor de los datos (el número de VSs en el PS variaba en 2 ordenes de magnitud). Los valores de la tabla 5.2 están correjidos con 4% lejos de la inestabilidad o porcentajes mayores. Con estas correcciones, los resultados de las SLLVs para las cfg.01-04 se muestran en la figura 5.2. La gráfica 5.2.A representa la variación temporal de Φ(t) para una configuración dada: Φcf g (t) ≡ Ncf g (t)VV , V (5.2) donde Ncf g (t) es el número de VSs en el PS para una configuración dada y en un tiempo t. Las mediciones con esta cantidad señalan cuanto del volumen del PS está ocupado por las VS. En las gráficas 5.2.B y 5.2.D se han calculado las diferencias relativas de los valores, punto a punto, de cada configuración (cfg.02-04) con respecto al valor exacto (cfg.01, gráficas 5.2.A y 5.2.C): ∆Φcf g Φcf g (t) , (t) ≡ 1 − Φ01 Φ01 (t) ∆hδricf g hδricf g (t) . (t) ≡ 1 − hδri01 hδri01 (t) Como se muestra en la gráfica 5.2.B, la mayor diferencia de Φcf g se obtuvo para la cfg.03 (b = b̃), con un valor máximo de ∼ 13%, mientras que para la cfg.04 (b = bo ) el valor máximo fue de ∼ 10%. 52 0.16 0.16 cfg.01 0.14 (A) ∆Φcfg/Φ01 0.08 0.12 0.1 0.08 cfg.02 cfg.03 cfg.04 0.06 0.04 0 −0.08 0.02 0 −0.16 3 0 ∆<δr>cfg/<δr>01 −0.06 2 <δr>01/2R Φ01(t) (B) −0.12 (D) −0.18 (C) 1 −0.24 0 −0.3 0 20000 40000 60000 1000 iteraciones 21000 41000 61000 iteraciones Figura 5.2: SLLVs variando el alcance de los CEs entre VSs, b. (A) Variación temporal (VT) de la fracción volumétrica vesicular (ecuación 5.2) incluyendo todas las interacciones entre las VSs, Φ01 (t). Se observa que después de ≈ 104 iteraciones, Φ01 ≈ 0.13 (13% de ocupación vesicular). (B) Diferencia relativa de las variaciones temporales de Φcf g (t) con respecto a Φ01 (t). Para la cfg.04, el número de VSs en el PS es grande en comparación con la cfg.02 y cfg.03. (C) VT del caminio libre medio para la cfg.01. Después de ≈ 104 iteraciones, hδri01 ≈ 2.1 × 2R. (D) Diferencia relativa de la variación temporal del DM de configuraciones no-exactas (cfg.02-04) con respecto a la variación exacta (cfg.01) (ver [91] con NC = 530). La leyenda que aparece en la gráfica A, corresponde a las curvas de las gráficas B y D. Las lı́neas discontinuas en las gráficas B y D indican el valor de equilibrio de la simulación. 53 Por el contrario, la diferencia para hδri03 (∼ 12%) fue considerablemente menor que con la cfg.04 (∼ 24%). Debido a ésto, se decidió realizar las próximas simulaciones con b = b̃. Conjuntamente con las simulaciones de las cfg.01-04, se realizó una simulación anulando la corrección propuesta para ρ̃, para determinar cuantitativamente los efectos. En esta simulación se tomó la cfg.03, y obviando la transformación ρ̃ → ρ̃∗ (ecuación 4.2), se llegaron a los siguientes resultados: (1) La cfg.03 tuvo una mejora de aproximadamente 2% con respecto a la simulación sin la transformación ρ̃ → ρ̃∗ , es decir, que la cfg.03 tuvo resultados de Φ(t) 2% más cerca al valor exacto (cfg.01) que la otra simulación; y (2) el valor de hδri(t) en equilibrio para la cfg.03 tuvo una mejora de ∼ 6% con respecto a la simulación realizada sin la transformación ρ̃ → ρ̃∗ . Las siguientes simulaciones que se realizaron tienen que ver con la variación de ∆t (cfg.05-10), y se muestran en la figura 5.3. Tal como se muestra en las gráficas, ni Φcf g ni hδri son invariantes ante un simple cambio de ∆t. Para que ocurra la invarianza es necesario reescalar tanto las variables temporales como las espaciales, cuando se trata de fluidos viscosos. 0.4 0.2 Φcfg(eq.) Φcfg(t) 0.3 (B) 0.1 (A) 0 2.5 <δr>cfg(t)/2R ∆t=1.0 (cfg.03) ∆t=0.9 (cfg.05) ∆t=0.8 (cfg.06) ∆t=0.7 (cfg.07) ∆t=0.6 (cfg.08) ∆t=0.5 (cfg.09) ∆t=0.4 (cfg.10) 1.5 1 (C) 0.5 0 0 20000 <δr>(eq.)/2R (D) 2 40000 iteraciones 60000 0.4 0.5 0.6 0.7 −9 ∆t(10 s) 0.8 0.9 1 Figura 5.3: SLLVs variando ∆t. (A) VT de Φcf g para diferentes ∆t. (B) Variación de Φcf g en equilibrio, con cambios de ∆t. Cada punto corresponde al valor de equilibrio encontrado en la gráfica A. (C) VT de hδri para diferentes ∆t (ver [91] con NC = 150). (D) Variación de hδri en equilibrio, con cambios de ∆t. Cada punto corresponde al valor de equilibrio encontrado en la gráfica B. La leyenda corresponde a las curvas de las gráficas A y C. En el orden de esta leyenda, corresponde a la gráfica A de las curvas de abajo hacia arriba y en la gráfica C de arriba hacia abajo. 54 5.2 Reescalamiento espacio-temporal. Siendo λ2 el factor de reescalamiento temporal, el reescalamiento espacio-temporal, para un fluido infinito que está descrito por las ecuaciones de Navier-Stokes (o aproximadamente), será como [92]: t → λ2 t, h → λh ⇒ ~x → λ~x, P → λ2 P, ~v → λ~v , Γ → Γ, donde t es el tiempo, h se refiere a las variables espaciales, ~x es la posición, ~v es la velocidad, P es la presión y Γ(~x, t) es la probabilidad debido a la difusión de encontrar una determinada partı́cula en la posición ~x y en el tiempo t. Según este reescalamiento, al cambiar el tiempo (∆t) y las variables espaciale (H, L, RV y d) se producirı́a los cambios de ~x, ~v y P . Sin embargo, de forma general, se decidió ajustar el siguiente reescalamiento para comprobar la invarianza de Φ(t): t → λs t, h → λα h, σ → λkα σ, D → λ(k−1)α D, donde D se refiere a las DVCs (ρ, ρ̃ y ρV ), y s, α y k son parámetros ajustables. El reescalamiento en D y σ se consideró porque de lo contrario, σ̃∗ (ecuación 4.3) no hubiese reescalado homogenamente y la fuerza eléctrica (ecuación 3.10) tampoco. Con dichos reescalamientos se llega a: QV → λ(k+2)α QV , F~j → λ2(k+1)α F~j , bV → λα bV , ṽjk → λ(2k+1)α ṽjk , (5.3) donde QV es la carga eléctrica total de la VS, F~j es la fuerza eléctrica total de jév (ecuación 3.10), bV y ṽjk son las ecuaciones 3.16. Con las ecuaciones 5.3 y 3.17 se obtiene: vjk →λ ˜ 2(k+1)α+s vjk , rjk →λ ˜ 2(k+1)α+2s rjk , donde vjk y rjk denotan la velocidad y posición de jév en la k coordenada cartesiana y el sı́mbolo “→”indica ˜ que es un resultado para ∆t pequeños. (1) (1) Como la fuerza del clatrato, F~jw , reescala en λ3α (siYH2 O → λα/2 YH2 O ), la fuerza eléctrica y de fricción deberán reescalar en la misma proporción. Se cumplirá esta condición para F~j si: 2(k + 1)α = 3α 1 k= . 2 ⇒ La fuerza de fricción, F~jf , reescala en λα+2(k+1)α+s , por lo tanto: α + 2(k + 1)α + s = 3α ⇒ s = −α. Nótese que con k = 1/2 y s = −α, rjk reescala en λα , demostrando que el reescalamiento en las 55 variables espaciales está acorde con el reescalamiento en los desplazamientos. Por otro lado, la densidad de probabilidad de que una partı́cula (en este caso, VS) llege a la MP por procesos puramente difusivos es [93]: Γ(x, y, t) = Γ̂(x, t)Γ̂(y, t), π Γ̂(x, t) = 4 P∞ 2 2 2 n=0 cos[(2n + 1)(πx/2H)] exp[−(2n + 1) π t/4H ] P∞ . n 2 2 2 n=0 [(−1) /(2n + 1)] exp[−(2n + 1) π t/4H ] El reescalamiento Γ(λα x, λα y, λs t) → λ? Γ(x, y, t) no es trivial, debido a ello, se propuso en este trabajo el siguiente reescalamiento: PF → λβα PF , donde β es una constante que puede ser encontrada mediante el tanteo. Cabe resaltar que todos los reescalamientos propuestos tienen implı́citos dos aproximaciones, las cuales están presentan en el simulador en mediana proporción: (1) ∆t tiene que ser pequeño, lo suficiente como para que hδri sea corto en comparación con H, y (2) en el sistema debe predominar procesos difusivos y no convectivos, es decir, que una VS debe tener mayor influencia con las demás VS que con el medio. Estas dos caracterı́sticas no se presentan en su totalidad en el modelo de simulación y tampoco en BS reales, por ello, el reescalamiento serı́a parcialmente válido, y en consecuencia ocurren heterogeneidades en los resultados para cada valor de β. Para comprobar ésto, se realizaron SLLVs en la cfg.03 con λα = 0.7 y tanteando β hasta obtener una invarianza en Φ(t) y hδri(t) aproximada. En estas simulaciones se implementaron dos condiciones más: (1) f(τ :1) → f(τ λ−s :1) (siendo τ = 9), y (2) dvi = Φ03 (eq.)/10 ≈ 0.0124. La variable dvi significa densidad vesicular inicial, la cual se tomó diferente de cero para dar cierta estabilidad al sistema inicialmente, es decir, que el PS en t = 0 tenı́a una distribución aleatoria con Φcf g (t = 0) = 0.0124, de manera de que las primeras VSs tuvieran interacción con otras. En el tanteo se encontró que β ≈ −1.18, y con este valor fijo se varió λα homogéneamente; dichos resultados son referidos como las cfg.11-13 y se muestran en la figura 5.4. Como puede observarse en la gráfica 5.4.B, las diferencias de Φcf g (eq.) con respecto al valor no reescalado, Φ03 (eq.), son cercanas al 1%; mientras que en la gráfica 5.4.D, las diferencias llegan hasta un 0.2% aproximadamente. Esto demuestra, en parte, la invarizanza de la ocupación volumétrica relativa temporal de VSs y del DM para el reescalamiento propuesto en esta sección. 5.3 Distribución vesicular (DV) en el PS. Para tener una idea sobre la evolución de la distribución de VSs en el PS, se diseña el algoritmo que calcula la neurosecresión (ver sección E.1) con la caracterı́stica de grabar en archivo las posiciones 56 1.04 (B) Φcfg(t)/Φ03(eq.) 1.02 1 α 0.98 λ =0.7 (cfg.11) 0.96 λ =0.8 (cfg.12) α α λ =0.9 (cfg.13) (A) 0.94 <δr>cfg(t)/<δr>03(eq.) 0.92 1.04 (D) 1.02 1 0.98 0.96 (C) 0.94 0.92 0 15000 30000 −9 45000 tiempo(10 s) Figura 5.4: SLLVs variando λα con β = −1.18. 0.7 0.8 α λ (A) VT de Φcf g para diferentes λα . (B) Φcf g en equilibrio variando λα . (C) VT de hδricf g para diferentes λα (ver [91] con NC = 130). (D) hδricf g en equilibrio variando λα . La leyenda que aparece en la gráfica B corresponde a las curvas de las gráficas A y C. 0.9 57 y velocidades de cada VS cada cierto número de iteraciones (pasos de grabación, pg). En cada uno de estos archivos se calcula una distribución continua de VSs a lo largo del eje “z” (ortogonal a la MP), realizando sumatorias de secciones de esferas de radio RV que se encuentran en una región de ancho H/ns (o limitadas entre dos planos paralelos), donde ns es el número de partes que se desea seccionar el PS para el cálculo de la distribución (estos cálculos se realizan en el algoritmo de la sección E.2). La variable que se utilizó para medir la DV en un determinado punto sobre el eje “z” fue φ(z), de manera que: ns Z H 0 φ(z)dz ≡ Φ(t). Los primeros resultados en base a los cálculos de DVs se realizaron utilizando algunas de las SLLVs realizadas anteriormente, tal como se muestra en la figura 5.5. 10 t=pg=10000 t=pt −3 φ(z) (10 ) 8 6 4 2 cfg.01 cfg.03 0 10 −3 φ(z) (10 ) 8 6 4 2 cfg.10 cfg.05 0 0 0.2 0.4 0.6 z/H 0.8 0 0.2 0.4 0.6 0.8 z/H Figura 5.5: DV o perfil de densidad de 4 configuraciones para dos tiempos. ns = 64 es el número de capas rectangulares sucesivas, paralelas a la MP y de espesor H/ns , que conforman el PS y mediante las cuales se calculó la DV. En la primera fila de gráficos se varia b, y en la segunda se varia ∆t. Se aprecia los diferentes perfiles que pueden producirse con cada configuración. 1 58 Tabla 5.4: Fuerzas que experimenta la VS. X̂ es el signo de X, ρcv ≡ −3σ/RV y ρcl ≡ −σ/d. Fuerza de la VS con Q̂V con Se logra con caso MP PD σ̂e ˆ ρ̃ ρV ρ ρ̃ cfg. 1 atracción atracción 6= 6= < ρcv > ρcl >0 14 2 atracción repulsión 6= = > ρcv < ρcl >0 15 3 repulsión atracción = 6= < ρcv < ρcl >0 16 4 repulsión repulsión = = > ρcv > ρcl >0 17 En estos resultados se observa una clara convección de VSs hacia las zonas cercanas del PD, y este comportamiento se debe a dos efectos combinados: (1) La fuerza eléctrica entre el LI y la VS, que es función de las cargas y de zj , y (2) la fuerza eléctrica entre la DSC efectiva σe = (σ + ρd)/2 y la VS, que es función únicamente de las cargas. Al variar ρ̃, ρ y ρV se pueden obtener 4 situaciones diferentes relacionadas con las direcciones de las fuerzas eléctricas de la VS hacia la MP y el plano medio del LI (z = H/2), que producen 4 diferentes DVs (ver tabla 5.4). Las gráficas de la figura 5.5 corresponden al caso 1, ya que QV = −1.68 × 10−16 C, σe = 0.13C/m2 y ρ̃ = 13.1 × 106 C/m3 . Para establecer cada caso en particular, se decidió variar las tres DVCs simultáneamente, además de mV y µ, hasta lograr tanto la estabilidad como una evolución representativa (ver figura 5.6). En estos resultados se observa un comportamiento tı́pico para cada uno de los casos. En el caso 1, tanto σe como ρ̃ producen fuerzas atractivas sobre las VSs, el resultado de la DV en equilibrio es un cúmulo de VSs entre la MP y el plano medio. En el caso 2, σe es atractiva mientras ρ̃ es repulsiva, resultando una DV heterogénea con valores de φ(z) significativamente bajos, en comparación con los otros casos; esto es porque las VSs tienen un único flujo en el PS, hacia la MP. Por otro lado, en el caso 3 (repulsión con σe y atracción con ρ̃) se produce el efecto contrario al caso 2, resultando la mayor acumulación de VSs en el PD entre todos los casos. Por último, en el caso 4, ocurre un efecto de rebote de cúmulos de VSs mayormente entre la MP y el PD. Para visualizar mejor este comportamiento se presenta en la gráfica 5.7 las DVs entre intervalos de iteraciones (tiempos) más cortos (2 órdenes inferiores) que en la gráfica 5.6. En las gráficas de la figura 5.7 se muestra que desde los inicios hasta 1200 iteraciones, se forman dominios de VSs y que éstos crecen y se mueven en todo el PS, debido a la repulsión simultánea de la MP y el PD. El movimiento de estos dominios se muestra aún para t = 160000, lo que puede significar que en este tipo de configuraciones las VSs nunca llegan a un equilibrio dinámico. 59 4 t=10000 t=60000 t=110000 t=160000 cfg.14 (caso 1) −3 φ (10 ) 3 2 1 0 −3 φ (10 ) 1 0.7 cfg.15 (caso 2) 0.4 0.1 −3 φ (10 ) 6 cfg.16 (caso 3) 4 2 0 3 −3 φ (10 ) cfg.17 (caso 4) 2 1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 z/H Figura 5.6: DVs para los 4 casos planteados en la tabla 5.4 (ns = 64). En cada gráfica (caso) se varı́a ρV , ρ y ρ̃ de tal manera que se obtiene una combinación de tipos de fuerzas en particular que experimenta la VS (atracción / repulsión), con el PD y la MP. 1 60 t=100 t=200 t=300 −3 φ(z) (10 ) 2 1.5 t=400 t=500 t=600 1 0.5 0 t=700 t=800 t=900 −3 φ(z) (10 ) 2 1.5 t=1000 t=1100 t=1200 1 0.5 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 1 z/H 0.2 0.4 0.6 0.8 1 z/H Figura 5.7: DVs para la cfg.17 (caso 4) cada 100 iteraciones (ns = 64). 5.4 SLLVs y DVs variando mV , µ y PF . Para observar el comportamiento al variar aisladamente mV , µ y PF , en la cfg.03 se cambiaron cada una de las tres variables 4 veces (para mV son las cfg.18-21, para µ son las cfg.22-25 y para PF son las cfg.25-28). Los resultados con la variación de mV se muestran en las gráficas 5.8.A, 5.8.B y 5.9.A, con µ en las gráficas 5.8.C, 5.8.D y 5.9.B, y con PF en las gráficas 5.8.E, 5.8.F y 5.9.C. En la gráfica 5.8.A se muestra que Φ(eq.) aumenta linealmente con mV , lo cual es parcialmente lógico, debido a que a mayor masa, las VSs se moverán menos hacia los lugares alejados de la estabilidad (el PD), ya que éstas tendrán más inercia a cambiar de movimiento y en consecuencia chocarán menos con la MP. Se aprecia en la gráfica 5.9.A que el reordanamiento al aumentar la masa es alrededor del PD, más no en el PD, es decir, que la concentración máxima por unidad de volumen en el PD no aumenta ni disminuye con cambios de la masa de la VS (φ(z∗ ) 6= φ(mV )). Por otro lado, nótese de la gráfica 5.8.B que el DM aumenta ligeramente al aumentar mV (a excepción del punto con mV = 6.5 × 10−20 kg), lo cual puede explicarce a partir del aumento de inercia, la cual produce aumento en la dificultad para cambiar el movimiento. Dicho comportamiento es diferente a los otros (variando µ, gráfica 5.8.C, y variando PF , gráfica 5.8.F). Φcfg(eq.) 30 mV Figura 5.8: Valores de equilibrio para Φcf g y hδricf g en las SLLVs, variando mV (gráficas A y B), µ (gráficas C y D) y PF (gráficas E y F). Cada valor fue calculado promediando las últimas 30000 iteraciones de cada SLLV. 1.8 2 2.2 2.4 2.6 0.08 0.12 0.16 0.2 0.24 <δr>(eq.)/2RV 0.28 0 10 20 (A) (B) 40 50 3 4 (C) 5 µ (D) 6 7 0.02 0.04 (E) PF 0.06 (F) 0.08 0.1 61 62 mV=13.0 mV=16.5 mV=26.0 mV=56.5 8 (A) −3 φ(z) (10 ) 6 4 2 0 µ=3.3 µ=5.5 µ=6.6 µ=7.0 8 (B) −3 φ(z) (10 ) 6 4 2 0 8 PF=0.02 PF=0.06 PF=0.08 PF=0.10 (C) −3 φ(z) (10 ) 6 4 2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 z/H Figura 5.9: DVs o perfiles de densidad vesicular variando (A) mV , (B) µ y (C) PF . Las curvas fueron determinadas para t = 70000 iteraciones. 1 63 Para la variación de µ, el DM disminuye cuando µ aumenta, tal como era de esperarse (gráfica 5.8.D). Esto podrı́a significar que las VSs llegan con más dificultad a la MP, y por lo tanto, se acumuları́an más en el PS (gráficas 5.8.C y 5.9.B). Nótese también que el aumento de VSs en el PS, cuando aumenta µ, se produce en las cercanı́as del PD (ver gráfica 5.9.B), similarmente que cuando se aumenta mV ; sin embargo, en este caso, se aprecia un crecimiento en el valor de φ(z∗ ). Se observa en las gráficas 5.8.E y 5.8.F que al aumentar PF , disminuye tanto Φcf g como hδricf g . Φcf g disminuye porque la “facilidad” de fusión se está aumentando; mientras que hδricf g disminuye porque Φcf g también disminuye, entonces las colisiones entre VSs se hacen menos frecuentes, produciendo menos cambios en el movimiento de las VSs. Se observa que los cambios de las DVs debido al aumento de PF (gráfica 5.9.C), pueden asociarse a dos reducciones de VSs en el PS. La primera, es una reducción en el PD (φ(z∗ ) disminuye); y la segunda es una disminución de VSs en los alrededores del PD. Nótese en la gráfica de la DV para la cfg.28 (µ = 0.08) una notoria diferencia entre las VSs que pertencen al PD y las VSs que pertenecen a sus alrededores. Cabe destacar que estas mismas variaciones en mV , µ y PF se realizaron en otras configuraciones, mostrando resultados similares a los presentados en esta sección. Se elijió la cfg.03 para realizar estas pruebas porque es la más parecida a una célula excitable y esta misma se utilizará para realizar simulaciones de plasticidad sináptica, las cuales se presentan en la próxima sección. 5.5 Excitaciones periódicas. Para realizar estas simulaciones se realizaron SLLVs hasta que el sistema llegara a equilibrio (Φ ≈ ctte, en t̃ iteraciones). Luego, se causa la excitación al sistema, cambiando la probabilidad de fusión de PF a PE , tal como se explicó en la sección 4.2.7. Después de T /2 iteraciones (T denota el perı́odo de una oscilación), se restaura el sistema a su estado original, cambiando nuevamente la probabilidad de fusión a PF , hasta otras T /2 iteraciones y ası́ completar una oscilación completa o perturbación. Pueden aplicarse otras consecutivamente, de manera de excitar y relajar al sistema NP veces, tal como se esquematiza en la figura 5.10. Las variables cfg, t̃, PE , T y NP , para los resultados de esta sección se organizaron en la tabla 5.5, en la cual se asignó una nueva identificación (CFG.) para un conjunto de valores. Las primeras simulaciones de este tipo se realizaron con el objetivo de observar el comportamiento al variar T /2 y determinar cuanto tiempo se necesita para lograr un equilibrio después de la excitación; dichos resultados se muestran en las gráficas de la figura 5.11. En las cfg.03 y 16, al variar T /2 se observa que Φ(t) alcanza el “equilibrio excitado” (cuando la probabilidad de fusión ha caido a PE ) cuando han pasado aproximadamente tE = 2000 iteraciones, 64 Figura 5.10: Esquematización de la VT de la probabilidad de fusión para simular excitaciones periódicas. Tabla 5.5: Configuración de valores para SLLVs con excitaciones periódicas. Si una determinada casilla está vacı́a, su valor lo indica la fila anterior. La columna de cfg (no la de CFG) indica la configuración de parámetros que se encuentran en la tabla 5.2. En las CFG.30-51 se escogió t̃ = 20000 y en las CFG.52-73 se tomó t̃ = 30000, donde t̃ es el número de iteraciones al cual se llevó la simulación antes de ser perturbado. CFG cfg PE T /2 NP CFG cfg PE T /2 NP CFG cfg PE T /2 NP 30 03 0.15 1000 1 46 14 0.11 1000 2 58 03 0.45 250 14 31 2000 47 2000 59 0.55 32 3000 48 3000 60 0.65 33 6000 49 6000 61 0.75 34 9000 50 1000 62 0.45 35 1000 51 3000 63 0.55 36 2000 52 64 0.65 37 3000 53 2000 65 0.75 54 3000 66 67 0.65 68 0.45 69 0.65 38 0.35 1000 2 1 16 1000 2 1 14 0.45 39 2000 55 6000 40 3000 56 1000 41 6000 57 3000 42 9000 — — — — — 70 43 1000 — — — — — 71 0.65 44 2000 — — — — — 72 0.45 45 3000 — — — — — 73 0.65 2 2 16 0.45 1300 250 1300 250 1300 65 Φ(t) 0.12 NP=1 y PE=0.15 0.10 0.08 NP=2 y PE=0.15 T/2=1000 (CFG.30) T/2=2000 (CFG.31) T/2=3000 (CFG.32) T/2=6000 (CFG.33) T/2=9000 (CFG.34) T/2=1000 (CFG.35) T/2=2000 (CFG.36) T/2=3000 (CFG.37) NP=1 y PE=0.35 NP=2 y PE=0.35 0.06 Φ(t) 0.12 0.10 T/2=1000 (CFG.38) T/2=2000 (CFG.39) T/2=3000 (CFG.40) T/2=6000 (CFG.41) T/2=9000 (CFG.42) 0.08 0.06 20000 25000 30000 35000 T/2=1000 (CFG.43) T/2=2000 (CFG.44) T/2=3000 (CFG.45) 20000 25000 iteraciones 30000 35000 iteraciones 0.040 Φ(t) 0.035 0.030 cfg.14 y NP=1 0.025 T/2=1000 (CFG.46) T/2=2000 (CFG.47) T/2=3000 (CFG.48) T/2=6000 (CFG.49) cfg.14 y NP=2 T/2=1000 (CFG.50) T/2=3000 (CFG.51) 0.020 0.015 0.11 cfg.16 y NP=2 Φ(t) cfg.16 y NP=1 0.09 T/2=1000 (CFG.52) T/2=2000 (CFG.53) T/2=3000 (CFG.54) T/2=6000 (CFG.55) T/2=1000 (CFG.56) T/2=3000 (CFG.57) 0.07 0.05 20000 25000 30000 iteraciones 35000 20000 25000 30000 35000 40000 iteraciones Figura 5.11: SLLVs hasta t̃ iteraciones y posteriormente se excita el sistema cambiando la probabilidad de fusión a PE . Las cuatro gráficas de arriba se realizaron para la cfg.03 (tabla 5.2) y en las cuatro de abajo se mantuvo la probabilidad de fusión excitatoria constante (PE = 0.15). Antes de las t̃ iteraciones el comportamiento de Φ(t) es similar al mostrado en la sección 5.1. 66 es decir, que para T /2 < tE , Φ(t) sigue decayendo y para T /2 > tE , Φ(t) ≈ ctte. También se aprecia en las gráficas de la figura 5.11 que la restauración al “equilibrio relajado”, para estas mismas configuraciones, se tarda más que al equilibrio excitado (con tiempo tR ); en pocas palabras, significa que el llenado vesicular es más lento que el vaciado vesicular. El valor de tR depende de T /2, pues si la perturbación es corta, se necesitarán pocas VSs para volver al equilibrio relajado. También es importante notar, en las simulaciones con NP = 2, que el valor mı́nimo al que baja Φ(t) cuando se ha causado la k-ésima perturbación, cambia de una perturbación a la otra, esto podrı́a indicar alguna especie de plasticidad. Para estudiar este comportamiento mejor, se definió: (k) Φcf g T /2 2 X T ≡ Φcf g t̃ + (k − 1) + n , T n=1 2 k = 1, 2, · · · , 2NP , (5.4) (k) que indica un promedio sobre la k-ésima media perturbación (para k impar Φcf g promedia una excitación y para k par promedia una relajación). Las simulaciones con NP > 2 sin utilizar esta (k) definición se muestran en las gráficas de la figura 5.12, y utilizando la definición de Φcf g para las mismas simulaciones se presenta en las gráficas de la figura 5.13. En este punto, es necesario recordar que Φ(t) establece directamente el número de VSs que están dentro del PS en un instante dado, salvo una constante. De esto se supone que cuando Φ(t) disminuye entonces la tasa de fusión de VSs con la MP aumenta. Por lo tanto, se puede interpretar en las gráficas para las cfg.58-61 y 70-71 que existe un aumento en la cantidad de VSs que se fusionan a medida que aumenta el número de perturbación k (desde 1 hasta ≈ 4). Este comportamiento se visualiza de mejor forma en las gráficas de la figura 5.13, donde se observa claramente que Φ(k) se atenua hasta k ≈ 6 para las configuraciones antes mencionadas. Significativamente, la mencionada atenuación puede asociarse a una FS, que es producto de una relajación interrumpida, es decir, que mientras el sistema evolucionaba al equilibrio relajado, se interrumpió e invirtió el proceso hacia el equilibrio excitado o inversamente (del excitado al relajado). Para las cfg.62-65, 68-69 y 72-73 los resultados muestran un comportamiento periódico tanto para Φ(t) como para Φ(k) . Esto puede significar que T /2 fue lo suficientemente largo como para que el sistema llegara a algún estado cercano a los equilibrios excitado y relajado después de cada perturbación. También se observan fluctuaciones significativas entre las magnitudes de los picos superiores e inferiores, que pueden asociarse a plasticidades suaves, es decir, debido al cambio de φ(z) en el tiempo sin perder la estructura. En cambio, en las cfg.66-67 se observa que Φ(k) cambia lo suficiente, que los picos superiores e inferiores comienzan a confundirse, atribuible a que la estructura de las DVs se deforma en cada perturbación tanto que tratan de evolucionar a otro tipo. El resultado es una plasticidad sináptica heterogénea y caótica que no puede clasificarse como una DS o FS. 67 PE=0.45 (CFG.58) PE=0.55 (CFG.59) PE=0.65 (CFG.60) PE=0.75 (CFG.61) Φ(t) 0.09 0.08 [ T/2=250 ] 0.07 0.06 30000 32000 34000 0.11 36000 PE=0.45 (CFG.62) PE=0.55 (CFG.63) PE=0.65 (CFG.64) PE=0.75 (CFG.65) [ T/2=1300 ] Φ(t) 0.09 0.07 0.05 30000 35000 40000 45000 50000 55000 60000 65000 iteraciones 0.032 Φ(t) 0.027 cfg.14, PE=0.45 y T/2=1300 (CFG.68) cfg.14, PE=0.65 y T/2=1300 (CFG.69) cfg.14, PE=0.45 y T/2=250 (CFG.66) cfg.14, PE=0.65 y T/2=250 (CFG.67) 0.022 0.017 0.012 cfg.16, PE=0.45 y T/2=1300 (CFG.72) cfg.16, PE=0.65 y T/2=1300 (CFG.73) Φ(t) 0.077 0.067 cfg.16, PE=0.45 y T/2=250 (CFG.70) cfg.16, PE=0.65 y T/2=250 (CFG.71) 0.057 0.047 30000 32000 34000 36000 30000 iteraciones 40000 50000 60000 iteraciones Figura 5.12: Simulaciones de excitaciones periódicas, cambiando la probabilidad de fusión de PF a PE y de PE a PF , cada T /2 iteraciones. 68 PE=0.45 (CFG.58) PE=0.55 (CFG.59) PE=0.65 (CFG.60) PE=0.75 (CFG.61) 0.1 0.09 Φ (k) [ T/2=250 ] 0.08 0.07 0.06 PE=0.45 (CFG.62) PE=0.55 (CFG.63) PE=0.65 (CFG.64) PE=0.75 (CFG.65) [ T/2=1300 ] Φ (k) 0.08 0.07 0.06 1 6 11 16 21 26 k 0.029 cfg.14, PE=0.45 y T/2=1300 (CFG.68) cfg.14, PE=0.65 y T/2=1300 (CFG.69) cfg.14, PE=0.45 y T/2=250 (CFG.66) cfg.14, PE=0.65 y T/2=250 (CFG.67) Φ (k) 0.024 0.019 0.014 0.082 Φ (k) 0.076 cfg.16, PE=0.45 y T/2=1300 (CFG.72) cfg.16, PE=0.65 y T/2=1300 (CFG.73) cfg.16, PE=0.45 y T/2=250 (CFG.70) cfg.16, PE=0.65 y T/2=250 (CFG.71) 0.07 0.064 0.058 0.052 1 11 21 1 k 11 21 k Figura 5.13: Cálculos de Φ(k) (ecuación 5.4) para las simulaciones presentadas en las gráficas de la figura 5.12 (en el mismo orden de presentación). Capı́tulo 6 Análisis de los resultados. 6.1 Apectos generales del simulador. 1. En primera instancia, es necesario resaltar que en casi todas las simulaciones los valores del número de VSs en el PS, N (t) = V VV Φ(t) ≈ 4469Φ(t), son considerablemente parecidos a los valores experimentales reportados por Nikonenko [94], quien reporta valores entre 430 y 800 VSs en neuronas hipocampales (corteza cerebral) de ratones, que equivalen a valores de Φ entre 0.0962 y 0.1790, los cuales se observan en todas las SLLVs (ver Φ(eq.) en la tabla 5.3), con excepción de la cfg.15, la cual no produce ninguna DV; por lo tanto, esta configuración se descarta como una válida para reproducir resultados neurobiofı́sicos correctos. 2. La corrección propuesta en ρ̃ (ecuación 4.2), debido a la reducción del alcance de los CEs entre las VSs, que se establece en el parámetro b, tiene resultados favorables en comparación con las simulaciones realizadas sin la corrección. Las mejorı́as para Φ(t) no son significativas, sin embargo, en hδri(t) se genera una diferencia favorable hasta aproximadamente 6%, lo cual puede significar que con la corrección ρ̃ → ρ̃∗ las transiciones hacia un determinado equilibrio pueden ser más reales que sin la corrección. 3. En el capı́tulo anterior no se han presentado algún resultado referente a la energı́a del sistema, aún cuando el código (sección E.1) fue programado para reportar valores de velocidad en cada paso de grabación (pg) y con estos datos, pueden calcularse perfiles de energı́a (potencial y cinética) a lo largo del eje “z” (sección E.2, implementando la ecuación A.6). No se reportaron estos valores porque simplemente en el estudio de las DVs y las neurosecreciones (miniatura y con excitaciones periódicas) no se necesitaron. Sin embargo, es importante mencionar, que con los valores de energı́a se puede calcular la energı́a térmica que producen las VSs al realizar trabajo la fuerza de fricción sobre el LI. 69 70 4. Los resultados obtenidos utilizando el reescalamiento propuesto en la sección 5.2 muestran invarianza tanto en Φ(t) como en hδri, tal como debe ocurrir. El DM reescala en λα , es decir que hδricf g = λα hδri03 , donde cf g = 11, 12, 13. Como hδricf g = 2RV λα Xcf g y hδri03 = 2RV X03 , donde Xcf g ≡ hδricf g (eq.)/2RV son los valores observados (reportados en la última columna de la tabla 5.2), entonces: Xcf g = X03 , cf g = 11, 12, 13. Lo cual ocurre hasta un margen de error de 0.2%. El reescalamiento tanteado para PF se debe principalmente a la dificultad de (1) encontrar la probabilidad de que una VS llege a la MP en el intervalo ∆t, debido a procesos difusivos y convectivos, y (2) deducir el reescalamiento de la probabilidad con los reescalamientos propuestos para el tiempo, las variables espaciales y las distribuciones de carga. Al conseguir el valor de β, se puede afirmar que el modelo de simulación cumple significativamente los reescalamientos propuestos en la sección 5.2, que incluyen reescalamientos espaciales, temporales y de distribuciones de carga. 6.2 Comportamientos aislados. En las próximas subsecciones se evaluará los comportamientos de Φ y hδri bajo variaciones de 4 parámetros del simulador: ∆t, mV , µ y PF . La metodologı́a del análisis es: (1) determinar una ecuación para el DM mediante las ecuciones de moviento que dependa de la variable en estudio, (2) ajustar una curva con la forma de la ecuación del DM en los datos encontrados en las simulaciones y si fuése necesario comparar términos, (3) establecer algún criterio o fuentes del comportamiento, y (4) relacionar las fuentes del comportamiento con la variación de Φ con respecto a hδri. Vale la pena mencionar, que en ninguna de las 4 variaciones se modifica la tasa de fusión dentro del sistema, puesto que si en el PS en algún momento se llega a N ≈ ctte, la tasa de salida de VSs debe ser igual a la tasa de entrada, la cual está controlada por ft y ésta no se ha modificado. 6.2.1 Variación de ∆t. De las ecuaciones 3.14 y 3.15 se deduce que el DM como función de ∆t es: hδri(∆t) = hṽj i∆t + ṽj vj = = q hvj − ṽj i [1 − exp(−b̃V ∆t)], b̃V v˜jx 2 + v˜jy 2 + v˜jz 2 , q vjx 2 + vjy 2 + vjz 2 , (6.1) 71 donde b̃V es una constante, que en teorı́a deberá ser aproximada a bV . Tomando la forma de esta ecuación se ajustó la gráfica 5.3.D tal como muestra en la figura izquierda de la imagen 6.1. 2.3 0.4 Y=0.8261744−0.2961914X Φ(eq.) <δr>(eq.)/2RV 2.1 1.9 1.7 −0.511578X Y=4.51941X+17.1263(1−e ) 0.3 0.2 1.5 1.3 0.4 0.6 0.8 1 0.1 1.3 ∆t (10 ) −9 1.5 1.7 1.9 <δr>(eq.)/2RV 2.1 2.3 Figura 6.1: Izquierda, ajuste de una combinación lineal y exponencial para la variación de hδri con ∆t. Derecha, variación de Φ con hδri al cambiar ∆t. Con dicho ajuste, se compararon las constantes encontradas con los términos en hδri: hṽj i = 4.51941 × 109 s−1 , 2RV hvj i − hṽj i = 17.1263, 2RV b̃V = 0.511578 × 109 s−1 . Nótese que b̃V difiere de bV en dos órdenes de magnitud, lo cual es causa del redondeo decimal en las operaciones aritméticas de lenguaje C. En las operaciones del desplazamiento de arrastre se realiza la operación 1 − exp(−bV ∆t), y como bV = 3.19 × 1010 y ∆t = 1 × 10−9 (máximo), entonces exp(−bV ∆t) = 1.399606747... × 10−14 , por lo tanto, la suma queda 1 − exp(−bV ∆t) = 0.9999999999999860039325..... Con la variable double, este resultado dará 16 cifras significativas es decir 0.9999999999999860 y los otros decimales se perderán. En una simulación de P T iteraciones con N VSs en el estado de equilibrio, se realizarán N × 3 × P T ≈ 108 operaciones las cuales acumularán y propagarán esta desviación. 108 veces una desviación en el decimal 16 (para ∆t = 10−9 ) da un error de 10−7 , lo cual es despreciable para el cálculo del desplazamiento total, sin embargo, parte de la información de la atenuación del movimiento fue desvanecida, ya que solo 3 dı́gitos fueron tomados como parte del cálculo y es por ello que b̃V tiende dos (2) órdenes de magnitud menos que bV . A pesar de esto, el comportamiento de hδri versus ∆t no se perdió. El ajuste de los resultados en las simulaciones con la forma de la ecuación 6.1, es tal, que todos los puntos coinciden con la curva ajustada con un error relativo menor al 1%. Este hecho implica que la velocidad promedio de 72 las VSs, hvj i, y la fuerza parcial promedio, hFjp i, son constantes a pesar que se cambia ∆t, hFjp i = 6πµRhṽj i = 4.685N, hvj i = 664.04m/s. Por otro lado, Φ disminuye cuando aumenta ∆t. Tal como se explicó, esto se debe al hecho de que cuando ∆t disminuye, las VSs necesitan más iteraciones para llegar a un mismo punto, produciendo una organización más lenta en el PS permitiendo la cabida a más VSs. Para tener una idea del comportamiento de la permición de VSs al variar el DM, se graficó Φ versus hδri (ver figura derecha de la imagen 6.1), donde se observa que cuando el DM disminuye se acumulan más VSs en el PS. La forma en la que varı́a Φ con hδri es aproximadamente lineal “en el rango de valores obtenidos” (cuando ∆t → 0 debe ocurrir que Φ(eq.) → 1). 6.2.2 Variación de mV . Los cambios de Φ(eq.) y de hδri(eq.) debido a la variación de mV se deben principalmente a que se está cambiando la inercia de las VSs. El DM sube ligeramente al aumentar mV (ver gráfica 6.2.A), lo que puede indicar que a mayor masa, se necesitará más esfuerzo tanto para iniciar el movimiento como para detenerlo (principalmente, ya que la mayorı́a se encuentran en constante movimiento). Al ser más dificil cambiar de movimiento, también, será más dificil lograr una DV estable, lo que implica que se podrán incorporar más VSs al PS, tal como muestran los resultados. 2.36 Y=2.310206+0.0008779233X Y=−4.211387+1.872108X 0.2 0.18 2.34 0.16 Φ(eq.) <δr>(eq.)/2RV 2.35 (B) (A) 2.33 0.14 2.32 0.12 0 10 20 30 40 50 2.32 mV 2.33 2.34 2.35 2.36 <δr>(eq.)/2RV Figura 6.2: (A) Gráfica 5.8.B ampliada y ajustando una recta. (B) Variación de Φ con respecto a hδri en equilibrio al cambiar mV . Nótese que el rango de hδri/2RV es 0.04, mientras que en la variación de ∆t es 1. La relación entre hδri y mV puede hallarse de la ecuación 6.1, b̃V = bV y despreciando la exponencial: hδri(mV ) ≈ hvj i∆t + hvj − ṽj i mV . 6πµRV (6.2) 73 Al comparar esta ecuación con el ajuste de la gráfica 6.2.A se obtiene: hvj i∆t = 2.310206 2RV ⇒ hvj i = 115.51m/s, hvj − ṽj i = 0.0008779233kg −1 1̃2πµRV2 ⇒ hṽj i ≈ hvj i. Esto implica que para valores de mV relativamente altos (aproximadamente mayores a 6.5×10−20 kg), el efecto de fricción y el cambio de movimiento promedio son casi nulos. A diferencia del caso anterior (con ∆t), el DM no está relacionado con Φ de la misma forma (organización lenta), porque la variación de hδri es de 1 ó 2 ordenes de magnitud menor. Se intuye que esta relación estarı́a más ligada a los cambios de inercia. Si una determinada VS se encuentra cerca del PD con una velocidad relativamente baja, cambiará de movimiento cuando un cúmulo de VSs se acerquen a ella y la empujen, y en tal caso, las VSs del cúmulo también lo harán. Esto significa que existirán momentos en los que un grupo de VSs estará relativamente quieto y en otros en los que este mismo grupo estará con velocidad relativamente alta. El producto de este comportamiento, es una DM que fluctua significativamente en el tiempo, y justamente es lo que se observó. 6.2.3 Variación de µ. De la ecuación 6.2 y con un ajuste parabólico de los resultados (gráfica 6.3.A), se obtiene: hδri(µ) ≈ hvj i∆t + mV 6πRV mV hvj i = 8.641kg/s.m, 12πRV2 hFjp i 1 1 , hvj i − 6πRV µ µ ! mV hFjp i 72π 2 RV 3 (6.3) = 8.503kg2 /s2 .m, donde se ha despreciado el término independiente, ya que µ−1 → 0 implicarı́a hδri → 0. 2 Y=0.8317+8.641X−8.503X 2.4 0.2 2.2 0.15 (A) 2 (B) 0.1 1.8 0.13 Y=0.859665−0.3132094X 0.25 Φ(eq.) <δr>(eq.)/2RV 2.6 0.05 0.17 0.21 1/µ 0.25 0.29 1.8 2 2.2 2.4 2.6 <δr>(eq.)/2RV Figura 6.3: (A) Variación del DM con el inverso de la viscocidad del LI con un ajuste a una parábola. (B) Variación de Φ con respecto a hδri en equilibrio al cambiar µ. 74 Independientemente de los valores de hvj i y hFjp i, se observa una tendencia aceptable sobre los valores encontrados, y se comprueba que a mayor viscocidad, el DM se hace cada vez más pequeño. Al igual que con la variación de ∆t, se observa que Φ disminuye linealmente a medida que aumenta hδri, con aproximadamente la misma pendiente y hasta que hδri/2RV ≈ 2.3 (ver gráfica 6.3.B). Sin embargo, era de esperarse que cuando hδri > 2.3 (o de algún otro valor) la tendencia cambie a una curva con una ası́ntota en Φ = 0, ya que Φ no puede ser menor que cero. El último punto de la gráfica (cfg.22) muestra significativamente el cambio del comportamiento lineal al asintótico, validando en cierto aspecto el simulador sobre el comportamiento de Φ(hδri). 6.2.4 Variación de PF . Las variables ∆t, mV y µ están explicitamente en las EMV, pudiendo ası́, obtener una ecuación que describe la tendencia o forma del comportamiento del DM con respecto a cada una de estas variables, y debido a esta tendencia, estimar alguna otra para φ, tal como se ha desarrollado en las secciones anteriores. Por otro lado, PF no se encuentra en ninguna ecuación, aun cuando al cambiar de valor se puede regular tanto Φ como hδri. Por lo tanto, resulta conveniente, primero determinar empı́ricamente una relación entre Φ y PF con los resultados obtenidos en las simulaciones, para luego estimar las fuentes del comportamiento entre hδri y Φ. Por otro lado, N (t) aumenta cuando disminuye PF (gráfica 5.8.E). Es lógico que ocurra, ya que para mantener la tasa de fusión constante disminuyendo la probabilidad, tendrán que ocurrir más colisiones por unidad de tiempo, y esto pasará sólo si se (1) aumenta N (eq.) y/o (2) aumenta hδri, condiciones que se observan significativamente en los resultados de las simulaciones (ver gráficas 5.8.E y 5.8.F). Se encontró que la relación empı́rica Φ(PF ) es de tipo potencial con el exponente negativo, tal como se muestra en la gráfica 6.4.A, y hδri(Φ) es de tipo lineal con pendiente positiva (gráfica 6.4.B), por lo tanto, la relación hδri(PF ) es de tipo potencial con el exponente negativo. 2.4 Y=1.482033+6.864819X 2.5 2.3 2.2 2.4 2.1 2.3 2 <δr>(eq.)/2RV −Ln[Φ(eq.)] (A) (B) 2.2 1.9 Y=3.08021−0.3086006X 1.8 2.2 2.1 2.5 2.8 3.1 −Ln[PF] 3.4 3.7 4 0.09 0.11 0.13 Φ(eq.) 0.15 Figura 6.4: (A) Variación − ln Φ vs. − lnhδri. (B) Variación hδri vs. Φ al cambiar PF . 75 El hecho que Φ aumente a medida que aumenta hδri, no contradice la relación Φ(hδri) que se encontró cuando se varió ∆t y µ, puesto que los aumentos en Φ y hδri, debido a la disminución de PF , surgen como reacciones independientes. Si alguno de los dos comportamientos ocurriera contrariamente, éste costrarrestarı́a el efecto del otro para nivelar la tasa de fusión. Esta forma de evolución del sistema ocurre porque las EMV no dependen de PF , y por tanto, las VSs evolucionan con otras condiciones. Lo que indica la gráfica 6.4.B es que hδri y Φ varı́an aisladamente con PF . 6.3 Equivalencia de los MEPP. Un resultado importante que se obtiene en todas las SLLVs es que existe un equilibrio de Φ(t), aún cuando se siguen incorporando VSs. Como N (t) se mantiene aproximadamente constante en el equilibrio relajado, la frecuencia promedio del número de VSs que se fusionan tiene que ser igual a la frecuencia de incorporación ν = (9∆t)−1 , tal como mencionó anteriormente. Esto no necesita ninguna comprobación sobre los resultados, ya que si se calcula el promedio del número de VSs fusionadas con la MP (VSF) en una secuencia temporal de n′ iteraciones cerca del equilibrio serı́a: (1) hNvf i 1 = ′ n "t ′ X 0 +n t=t0 N (t + ∆t) − N (t) + ft # 1 = , 9 ya que cerca del equilibrio (t0 ≈ teq. ) los promedios dan hN (t + ∆t)i = hN (t)i = N (eq.). Como la fusión de las VSs representa los PP, es necesario determinar la distribución de la fusión, la cual puede asociarse a la distribución de los MEPPs que se presentan las simulaciones en los estados de equilibrio. Para ello se contaron las VSs que se fusionaron en intervalos de tiempo de n0 ∆t, en una secuencia de tiempo cerca del equilibrio (∼ 10000 iteraciones) y con ello, se calculó un historial sobre el fusionamiento vesicular observado para cada k-ésimo intervalo de tiempo, como: hk (n0 ) = 2 Ok (n0 ), k donde Ok (n0 ) es el número de VSF observadas en el k-ésimo intervalo de tiempo de magnitud n0 ∆t, que fueron contadas directamente en el simulador y el término 2/k fue colocado porque en registros fisiológicos se observan distribuciones continuas, lo que implica que en los conteos deberı́an estar los términos no enteros, resultando un espectro del tipo Gaussiano (Boyd y Martin [57]). Si cada conteo representa el área de una Gaussiana, la forma de ésta puede aproximarse a un triángulo cuya base es k (sección 2.6) y por lo tanto, la altura de la Gaussiana serı́a hk (n0 ). Los histogramas para dos configuraciones se muestran en la figura 6.5. Con estos histogramas se determinaron los cocientes hk /hk+1 (sección 2.6) para la DP (figura 2.10). Dichos cálculos se muestran en la figura 6.6. 76 20 cfg.03 (n0=3x9) [20/h1(n0)]hk(n0) 15 cfg.16 (n0=3x9) 10 5 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 k 4 5 6 7 k Figura 6.5: Histograma normalizado sobre el conteo de VSF con distribución Gaussiana. 5 n0=2x9 4 n0=3x9 hk/hk+1 3 2 1 0 n0=5x9 n0=4x9 4 hk/hk+1 3 2 1 0 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 6 8 10 5 cfg.14 4 cfg.15 hk/hk+1 3 2 1 0 4 cfg.16 cfg.17 hk/hk+1 3 2 1 0 0 2 4 6 k 8 0 2 4 k Figura 6.6: Cocientes entre la distribución cuantizada de k VSF y k + 1, entre t y t + n0 ∆t iteraciones. En las cuatro gráficas de arriba se varı́a n0 (cfg.03) y en las cuatro restantes se cambia cfg (con n0 = 3 × 9). Las lı́neas rectas corresponden a la DP. 77 En tales gráficas se observa cierta semejanza con la DP (lı́nea recta), en particular para n0 = 3 × 9 se aprecia el mayor parecido. Esto es porque para n0 = s × 9 el promedio de VSF es aproximadamente s, y en tal caso, la frecuencia de aparición de s′ 6= s VSF es cada vez menor a medida de que s′ se aleje de s. Como se incorporan VSs a una frecuencia baja, la estructura de la DV se reacomoda de tal manera que interrumpe parcialmente el proceso de difusión que es el causante de la distribución de Poisson. Con esto significarı́a que para 3 × 9 iteraciones el reacomodo ha sufrido una relajación, de tal forma, que la difusión de VSs en el PS es preponderante. También se demuestra en las gráficas, que se obtiene el mayor ajuste a la distribución de Poisson en la cfg.15, tal como debe ocurrir, ya que en esta configuración no se obtiene ninguna DV que interrumpa la difusión. Las VSs simplemente se difunden desde el primer momento que son soltadas por los filamentos de actina, y no pasan nunca por alguna estructura de VSs, ni se reacomodan para formar una. Por el contrario, la cfg.17 muestra la mayor diferencia con la DP, porque en este caso las estructuras están en constante transformación, de tal forma, que la difusión sea poco frecuente y la convección predomine en el sistema. Para las cfg.03,14-16 la semajanza de los cocientes entre amplitudes de las cuantizaciones EEPPs con los resultados obtenidos para la DP, son significativas hasta aproximadamente la sexta cuantización (para s = 3), afirmando que los resultados de las simulaciones reproducen parte de la DP. Evidentemente, el modelo de simulación reproduce ciertas DV que distorsionan la DP debido a la convección de VSs hacia el PD o sus cercanı́as, por lo tanto, parte de la distribución de fusión representa la convección. Por esta razón, se realizó un último análisis relacionado con la distribución de fusión, variando los cuatro parámetro estudiados en la sección 6.2 (ver gráficas de la figura 6.7). 4 Distribucion de Poisson ∆t=1.0 (cfg.03) ∆t=0.4 (cfg.10) Distribucion de Poisson mV=6.5 (cfg.03) mV=56.5 (cfg.21) hk/hk+1 3 (B) (A) 2 1 Distribucion de Poisson µ=3.3 (cfg.22) µ=7.0 (cfg.25) Distribucion de Poisson PF=0.02 (cfg.26) PF=0.10 (cfg.29) hk/hk+1 3 (D) (C) 2 1 1 2 3 4 5 k 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 k Figura 6.7: Cocientes de la distribución cuantizada, variando (A) ∆t, (B) mV , (C) µ y (D) PF . 78 Se observa en las gráficas A, B, C y D de la figura 6.7 que (1) no existen cambios significativos al variar ∆t y µ, en la distribución de fusión, que se alejen o se acerquen a la DP, y (2) existe un acercamiento de la distribución de fusión a la DP, al aumentar mV o PF . Este último comportamiento concuerda con el hecho de que se está aumentando el DM, hδri, y por ende, se estarı́a evitando en parte la convección, y esto conllevarı́a a que las VSs se transporten desde el PD hacia la MP por procesos mayormente disfusivos [95]. 6.4 DVs en el PS. Tal como se muestran en los resultados sobre DVs, existen cúmulos o grupos de VSs relativamente cerca al PD, cuando el sistema se encuentra en equilibrio (relajado o excitado), simulando de esta forma estructuras de VSs dentro del PS [96]. La mayorı́a de dichas estructuras tienen una densidad máxima de VSs en el plano z = z∗ , donde z∗ está descrito por la ecuación 4.3. Los valores teóricos de z∗ están calculados en la última columna de la tabla 5.3; y en la gráfica de la figura 6.8 se comparan los valores teóricos y de simulación. 1 ∆t b 0.8 mV α λ µ PF z*/H 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 cfg. Figura 6.8: Valores de teóricos (barras oscuras) y de las SLLVs (barras claras) para z∗ . En las simulaciones, z∗ fue encontrado como aquel valor de z en el cual φ era máxmo. En la gráfica se aprecia cierto parecido de los valores encontrados en las simulaciones con los valores teóricos, y especificamente se obtiene el mayor parecido cuando (en MKS): b = b̃, ∆t = 1 × 10−9 , λα = 0.7 mV = 6.5 × 10−20 , µ = 6.6 × 10−3 , PF = 0.06. Todas y cada una de las VSs que se encuentran en el PS pueden fusionarse eventualmente con la MP, por lo tanto, el grupo en general de VSs pertenece al RRP. Por otro lado, se presume que 79 las diferencias para z∗ entre los valores de las simulaciones y los teóricos se deben principalmente a que existen dos distribuciones superpuestas que contribuyen a la distribución del RRP, φ, y que en ocasiones una de ellas sobrepasa a la otra. Estas dos distribuciones se deben a (1) la atracción de las VSs hacia el PD, donde resulta una distribución tipo Gaussiana, y (2) la repulsión tanto eléctrica como del clatrato, que produce una separación entre cúmulos de VSs. La distribución Gaussiana tiene su valor pico en z∗ , mientras que en la segunda, existen dos valores máximos que se encuentran simetricamente distanciados de z∗ (véase figura 6.9). Consecuentemente, las DVs o perfiles de densidad vesicular pueden ajustarse como: φ(z) = 1 ΥB A1 (z) + 2 ΥB A2 (z) − 3 ΥB A3 (z), Υyx (z) " z − z∗ ≡ x exp − y 2 # , (6.4) 2 donde las Ai y Bi son constantes. El término ΥA A1 está asociado a la atracción eléctrica hacia el PD, A6 4 y el término ΥA A3 − ΥA5 reproduce la distribución causante por la repulsión entre VSs, tal como se muestra en la siguiente gráfica. 8 6 (A) Υ7 0.5 4 cluster core 2 0 8 (B) 6 Υ −Υ 9 5 1 4 cluster edge active cluster 4 2 0 8 (C) 6 Υ7 +Υ5 −Υ4 0.5 9 1 readily−releasable−pool 4 2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 z/H Figura 6.9: Una DV compuesta por dos distribuciones (z∗ /H = 0.5). (A) Distribución debido a la atracción al PD, (B) distribución asociada a la repulsión de VSs, y (C) suma de las dos anteriores. 80 Para simplificar el modelo, se hizo la suposición de que en el centro del PS no deberı́an haber VSs debido a la repulsión, lo que implicarı́a que A3 = A2 y B2 > B3 . También se logrará con esta condición evitar valores de Φ negativos, en la distribución causada por la repulsión, al momento de ajustar los parámetros, lo cual se explica a continuación. De las gráficas de la figura 6.9, se pueden identificar tres dominios de VSs o fases [97]: 1. El grupo activo (“active cluster”, dAC), que son las VSs que se encuentran dispuestas a ser fusionadas en primera instancia. Estas son las VSs que están en el grupo de la repulsión y más cercanas a la MP, es decir, en la montaña de la izquierda de la gráfica 6.9.B. La fracción volumétrica de ocupación vesicular, Φ, debido a esta fase es: ΦdAC = ns Z 0 z∗ h 2 ΥB A2 (z) − i 3 ΥB A3 (z) √ z∗ z∗ π dz = ns A2 B2 ERF − B3 ERF , 2 B2 B3 donde ns es el número de capas rectangulares que se utilizaron para calcular la DV y ERF (· · ·) es la función de error. 2. El núcleo del grupo (“cluster core”, dCC), donde se encuentran las VSs con menos movilidad, debido a la atracción electrostática que ejerce el LI. Esta fase corresponde a la gráfica 6.9.A, ΦdCC = ns Z H 0 1 ΥB A1 (z)dz. √ π H − z∗ = ns A1 B1 ERF 2 B1 + ERF z∗ B1 . 3. El borde del grupo (“cluster edge”, dCE), donde se encuentran las VSs que en última instancia son fusionadas. Es decir, que una VS que pertenece a este grupo se fusionará con la MP, después de pasar, primero por el dAC y luego por el dCC. El valor de Φ para este caso es: ΦdCE = ns Z Hh z∗ 2 ΥB A2 (z) − i 3 ΥB A3 (z) √ " π H − z∗ dz = ns A2 B2 ERF 2 B2 − B3 ERF H − z∗ B3 # . Nótese que se verifica que si z∗ = H/2 entonces ΦdAC = ΦdCE . En estado relajado, las VSs del dAC serán las únicas en fusionarse directamente, mientras que las restantes pueden cambiar de fase esporádicamente de forma de mantener ΦdAC , ΦdCC y ΦdCE equilibradas antes de fusionarse. Se especula que las etapas del llenado vesicular son: (1) Las nuevas VSs son depositadas en el PS en un sector superior al PD, tal como se realiza en el simulador. (2) Estas VSs son transportadas por procesos convectivos hacia las cercanı́as del PD, reproduciendo el dCC. (3) Si las VSs que están en el dCC sobrepasan en un cierto número (caracterı́stico de cada configuración), entonces algunas de ellas comienzan a migrar hacia el dAC y dCE, mediante procesos difusivos. (4) Si las VSs que están en el dAC sobrepasan en otro cierto número (también 81 caracterı́stico de cfg), entonces las VSs comienzan a fusionarse, en la misma proporción en que entran VSs al PS. (5) Cuando ocurre una excitación (aumento abrupto en la probabilidad de fusión) el número de VSs en el dAC comienza a disminuir, y para volver a un equilibrio electrostático (diferente al equilibrio en el estado relajado), ocurre un reordenamiente entre las 3 fases. Para determinar cuantas VSs hay en el dAC, dCC y dCE, se necesitará encontrar los vectores ~ cf g = {A1 , A2 } y B ~ cf g = {B1 , B2 , B3 }. Con la ecuación 6.4 y mediante un ajuste no lineal1 , se A determinaron los vectores, para algunas simulaciones, cuyas curvas se muestran en la figura 6.10. 0.008 cfg.01 (t=70000) φ(z) 0.006 0.004 0.002 cfg.03 (t=70000) 0 cfg.16 (t=160000) φ(z) 0.006 0.004 0.002 cfg.24 (t=70000) 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 0.2 z/H 0.4 0.6 0.8 1 z/H Figura 6.10: Ajuste de la ecuación 6.4 (lı́nea continua) para 4 DVs obtenidas en las SLLVs (cuadrados). El error cuadrático medio para todos los ajustes fue ∼ 10−4 . ~ cf g y B ~ cf g , se puede determinar las fracciones relativas: Con los vectores A Φ̂dAC ≡ ΦdAC , Φ Φ̂dCC ≡ ΦdCC , Φ Φ̂dCE ≡ ΦdCE , Φ para conocer que porcentaje de VSs pertenecen a cada fase para cada configuración. Con los valores obtenidos en los ajustes, se determinaron estas cantidades, las cuales se presentan en la tabla 6.1. 1 Se empleó la función “Non-linear curve fitting” del programa computacional Xmgr 4.1.2 para Linux. 82 Tabla 6.1: Fracciones relativas de VSs en cada fase (dAC, dCC y dCE). La variable ∆Φ̂ es el excedente (cantidad negativa) o sobrante (cantidad positiva) de la distribución ΦdCA + ΦdCC + ΦdCE con respecto a los valores encontrados en las simulaciones. (10−4 ) (10−3 ) (×100%) cfg A1 A2 B1 B2 B3 Φ̂dAC Φ̂dCC Φ̂dCE ∆Φ̂ 01 35 39 129 252 70 29.80 38.22 29.86 +2.11 02 48 41 85 233 61 30.88 35.88 30.93 +2.32 03 64 41 56 225 46 33.48 32.79 33.51 +0.22 04 69 37 114 224 114 16.54 64.19 16.56 +2.70 05 61 49 93 236 63 30.49 40.99 30.53 −2.01 06 58 68 148 240 108 25.40 48.93 25.46 +0.21 07 64 17 93 216 124 22.72 54.89 22.75 −0.36 08 76 960 99 201 182 34.89 28.93 34.98 +1.20 09 81 836 142 228 204 31.63 36.96 31.92 −0.51 10 86 930 267 268 251 19.87 62.08 20.58 −2.54 11 70 36 245 74 245 23.25 55.77 23.29 +0.69 12 53 43 278 152 239 13.69 71.56 13.8 +0.89 13 71 35 236 60 236 26.60 42.83 26.64 +3.92 14 39 24 52 139 86 19.06 62.18 19.50 −0.74 15 7 6 538 990 557 15.02 80.71 1.37 +2.89 16 55 40 42 236 37 38.15 22.21 38.13 +1.52 17 29 500 66 248 242 1.91 62.41 50.05 −14.37 18 57 36 69 272 48 34.20 33.80 34.31 −2.31 19 55 44 74 242 51 33.87 32.98 33.92 −0.77 20 53 22 170 307 64 18.26 63.48 18.39 −0.13 21 60 644 136 187 172 26.67 45.15 26.70 +1.48 22 44 13 154 280 155 9.32 80.07 9.38 +1.23 23 64 92 48 216 63 41.29 18.06 41.32 −0.66 24 77 151 81 226 123 35.11 28.30 35.18 +1.41 25 75 997 91 189 172 35.79 28.89 35.83 −0.50 26 80 46 54 245 45 33.69 31.82 33.75 +0.74 27 61 40 45 208 40 34.93 28.57 34.95 +1.56 28 60 38 44 194 38 38.61 29.95 33.61 +2.83 29 65 33 60 195 58 27.56 47.57 27.56 −2.69 83 Los valores de Φ̂dAC , Φ̂dCC y Φ̂dCE dan una idea sobre la organización de las VSs en el PS, la cual es similiar a la propuesta por Rizzoli y Betz [97]. Dichos investigadores muestran experimentalmente (en SNM de rana) que existen estos tres grupos de VSs (el dAC de 0 a 100nm de la MP, el dCC de 100 a 150nm y el dCE mayores de 150nm) y en las distribuciones de VSs que ellos miden, se observa valores similares a los presentados en la tabla 6.1, demostrando de esta forma, la validez tanto de las simulaciones como del modelo de distribución propuesto en esta sección (ecuación 6.4). Además de Rizzoli y Betz, otros investigadores también muestran que el máximo del número de VSs no está cerca de la MP (ver por ejemplo [28, 98, 99, 96]) y que la tendencia en la DV es parecida a un polinómio cóncavo o una Gaussiana donde el máximo está cerca del PD; estas caracterı́sticas son evidenciadas en la mayorı́a de las simulaciones. La ventaja de realizar este tipo de simulaciones, es ahora evidente. Mientras que en los experimentos se pueden observar y medir DVs para un tipo de neurona, en las simulaciones, cambiando el valor de alguna de las constantes implı́citas en las ecuaciones del simulador, se obtiene una célula diferente, que puede reproducir una DV diferente. De esta manera se pueden determinar DVs para un número significativo de tipos de células, las cuales pueden variar en el modo que realizan la neurosecreción para realizar una tarea especı́fica en una pequeña parte de un sistema biológico. ~ cf g y B ~ cf g tienen que ser Como cada configuración representa una neurona diferente, los vectores A diferentes para cada configuración y estos valores son los que definen las DVs, y en consecuencia los diferentes comportamientos de las DVs al variar mV , µ y PF , representando una serie de tipos células, pueden estudiarse directamente de los de dichos vectores. Una aplicación directa donde se involucra la forma y el tamaño del RRP son los PPs. Moulder y Mennerick [50] muestran experimentalmente que no sólo la señal postsináptica inicial es afectada por el tamaño del RRP, sino también que una excitación periódica o “tren presináptico”, puede reproducir una señal postsináptica con propiedades plásticas ajustables cuando se manipula el tamaño del RRP inicialmente. Esta caracterı́stica indica que la forma del RRP cambia a medida que se ~ cf g y B ~ cf g en cada instante del tiempo. genera cada excitación, cambiando los valores de A 6.5 Plasticidad sináptica. En primer lugar, hay que tener en cuenta que las gráficas de las figuras 5.11, 5.12 y 5.13 se está graficando indirectamente el número de VSs que están dentro del PS y no el número de VSF, Ok , que son las que producen los PPs. Esta cantidad, además de observarse directamente tal como se aplicó en la sección 6.3, puede calcularse a partir de la fracción volumétrica de fusión vesicular, Φ̃, 84 entre los tiempos t1 y t2 , la cual es calculable como: Φ̃(t1 , t2 ) = Φ(t2 ) − Φ(t1 ) + VV V t2 − t1 , τ t2 > t1 , donde τ = 9 es el número de iteraciones que transcurren hasta que una VS es liberada por el citoesqueleto (ver sección 4.3). Si se evalua en la k-ésima media excitación durante T /2, resulta: T T Φ̃[k, t̃] ≡ Φ̃ t̃ + (k − 1) , t̃ + k 2 2 = Φ t̃ + k T 2 − Φ t̃ + (k − 1) T 2 + T VV , 2τ V o bien, se toma los promedios (similar a la ecuación 5.4): Φ̃(k) = Φ(k) − Φ(k−1) + T VV = hΦ̃[k, t̃]i, 2τ V (6.5) La ecuación 6.5 es una cantidad que debe estar asociada directamente a los PPs, pues Φ̃(k) representa el número de VSF (debe coincidir con Ok VVV ), y es el contenido del neurotransmisor de estas vesı́culas que activa el PM en la célula postsináptica. A partir de esta ecuación, se utilizaron los resultados obtenidos en la gráfica 5.13 y se calculó Φ̃(k) (véase las gráficas de la figura 6.11). Los resultados de estos cálculos presentran plasticidades sinápticas que en ciertas zonas pueden ser identificadas como FS y DS. En las gráficas de la figura 6.11, se observa FS en las CFG.58-61, 70 y 71 desde k = 1 hasta k ≈ 5, resultados que son similares a algunos resultados experimentales reportados por Fuhrmann [62], Dittman [100] y Wong [101]. En las CFG.70 y 71 se muestra que al aumentar las excitaciones (k ≈ 5) se obtienen cada vez más VSF, hasta un punto donde el comportamiento se comienza a estabilizar (salvo un “ruido sináptico”). Se sospecha que durante la FS, las DVs se encuentran en una etapa de cambios continuos y eventualmente comienzan a adoptar una morfologı́a constante, que es el estado donde se comienzan a estabilizar los PPs. Por otro lado, en las CFG.58-61 se observa que existe un ruido significativo en la estabilización, el cual se puede clasificar como “plasticidad dinámica”, porque ocurren secuencias de FS y DS sin un determinado orden e indicando que en el tiempo las DVs no llegan a una configuración constante. Los resultados para las CFG.62-69, 72 y 73 son oscilatorias, es decir, que la excitación periódica a la cual se sometió el PS, fue tal, que el sistema se relajó lo suficiente en cada perturbación como para que llegará a los estado de equilibrio (relajado y excitado), generando valores de Φ̃(k) acordes con cada equilibrio (intercalados y periódico). Los PPs que se producen en estos casos tienen forma de “plasticidades heterogéneas” [100], ya que los valores pico de las secuencias pares de k y las impares fluctuan heterogenamente, pero sin que se confundan las series. Nótese de la tabla 5.5 que de las CFG.58-61 a las CFG.62-65 lo único que se cambió fue el 85 0.01 0.005 0 CFG.58 CFG.59 CFG.60 CFG.63 CFG.64 CFG.61 −0.005 −0.01 0.03 0.01 CFG.62 CFG.65 −0.01 0.02 0.015 0.01 0.005 0 CFG.66 CFG.67 −0.005 CFG.68 −0.01 CFG.69 0.04 0.03 0.02 CFG.70 CFG.71 CFG.72 CFG.73 0.01 Figura 6.11: Promedio de la fracción volumétrica relativa de VSF, Φ̃(k) (eje vertical), versus el número de excitación, k (eje horizontal). Cada gráfica corresponde al cálculo de la ecuación 6.5 utilizando los datos de Φ(k) que se encuentran en las gráficas de la figura 5.13 para cada configuración (CFG). 86 intervalo T /2 de 250 a 1300, y el resultado de este cambio fue notorio, al convertir una respuesta con plasticidad dinámica a una heterogénea oscilatoria. De las CFG.66-69 a las CFG.70-73 lo que se cambió fue el tipo de neurona (al cambiar de la cfg.14 a la cfg.16) y de este cambio resultó una variación en la estabilización de la respuesta unicamente para periodos cortos (T /2 = 250). Para la cfg.16 (CFG.70 y 71) los PPs tienen un valor constante con una pequeña fluctuación con valores donde las series pares (relajación) e impares (excitación) se confunden, y cuando se cambia de cierta manera la neurona, estas fluctuciones comienzan a aumentar en magnitud y las series comienzan a separase. Esto muestra que cada tipo de neurona tiene reacciones diferentes ante una serie estı́mulos iguales. Capı́tulo 7 Conclusiones y recomendaciones. En este trabajo se logra formular, diseñar y construir un método de simulación, basado en dinámica molecular para modelar la dinámica de cada VS y en el método de MonteCarlo para simular la fusión vesicular, que reproduce: 1. El movimiento individual y colectivo de VSs (ver algunos estudios experimentales en [15, 102]) en PSs de varios tipos de neurona (cambiando la cfg). Cada neurona o célula excitable fue caracterizada mediante un conjunto de variables que definı́an tanto el medio donde se mueven las VSs como las propiedades de las VSs, las cuales fueron consideradas como iguales. 2. Estados de equilibrio del RRP mediante SLLVs, que presentan valores de la ocupación vesicular (Φ) y del DM (hδri) acordes con las dimensiones del PS y relativemente similares a resultados experimentales realizados en otros trabajos (ver por ejemplo [95]). En estas simulaciones se observa liberación espontánea del neurotransmisor con una frecuencia igual a la incorporación vesicular. 3. DVs o perfiles de densidad vesicular para cada tipo de neurona, que pueden ser monitoreadas en cualquier instante del tiempo. Las DVs mostraron una variedad tal, que se puedo clasificar en 4 tipos (ver figura 5.6), las cuales dependen de los parámetros que definen a la célula excitable (ver tabla 5.1) y del calcio intracelular en un instante dado, caracterizado por la probabilidad de fusión. Estos resultados tuvieron cierto parecido a estudios experimentales (por ejemplo, compárese la gráfica 5.6.A con los resultados obtenidos por Leenders [99]). 4. Un PD en la mayorı́a de las DVs y cuya posición (z∗ ) corresponde en cierta medida con los valores teóricos (ecuación 4.3). El PD fue evidenciado en los resultados por notar que existe un valor máximo en φ o simplemente un punto aproximado de simetrı́a en la DV. 5. Los PPs (lineal a Φ̃(k) ) producidos por un o una serie de estı́mulos. Se observaron una serie 87 88 de respuestas postsinápticas, al cambiar el tipo de neurona y el tipo estı́mulo, que pueden clasificarse como FS, DS, ruido sináptico, plasticidad heterogénea y plasticidad dinámica. En este mismo orden de ideas, los resultados de las simulaciones mostraron que: 1. Se pueden reescalar los valores de Φ y hδri en equilibrio de las SLLVs, si se reescalan las variables espaciales en λα , las variables temporales en λ−α , las DSCs en λα/2 , las DVCs en λ−α/2 y la probabilidad de fusión en λβα , donde λα es cualquier número real positivo y β es un valor que se tiene que “tantear”, que es generalmente negativo y dependen de cada tipo de neurona. 2. Los comportamientos de hδri con respecto a ∆t, mV y µ, corresponden, con significativa precisión, a las formas deducidas de las EMV. De estas relaciones se obtuvo Φ(hδri) para las tres variables. También se determinó la forma empı́rica Φ(PF ), y con ésta, se obtuvo hδri(Φ) debido a la variación de PF . Las constantes que se obtuvieron del ajuste de hδri, pueden interpretarse como valores promedios de ciertas cantidades (según la forma de la ecuación), al variar ∆t, mV ó µ. 3. Similarmente a lo que ocurre en la mayorı́a de las sinapsis, la distribución de fusión vesicular, en estados de equilibrio para SLLVs, tiene una DP cuando el intervalo de observación es igual a 3τ , donde τ es el tiempo que transcurre entre la incorporación de una VS y la siguiente. Es necesario mencionar, que se hizo la suposición de que todas las VSFs que se observaron en las simulaciones eran las causantes de los PPs. 4. Las DVs pueden ajustarse a una distribución compuesta por 3 Gaussianas, en cuya combinación resulta la definición de 3 “cluster” o cúmulos de VSs del RRP, correspondientes a las VSs más activas y cercanas a la MP (dAC), las VSs del núcleo (dCC) y las VSs del borde superior y recién depositadas por el citoesqueleto (dCE). Esta formulación fue basada en los estudios experimentales de Rizzoli [97], quien midió el número de VSs de cada grupo (dAC, dCC y dCE) en SNMs de rana y cuyos resultados (en proporciones de cada grupo) son significativamente similares a los obtenidos en las simulaciones. 5. La forma o tipo de plasticidad sináptica depende del tipo de neurona que se este excitando y del tipo de perturbación (por ejemplo, depencia de la frecuencia [60]). Se determinó que al variar la configuración del PS, la amplitud de perturbación, la frecuencia o simultaneamente varias de éstas, se pueden obtener los 5 tipos de plasticidades antes mencionados. 6. Se presume que cuando se causa una excitación (cambiando la probabilidad de fusión) la DV se deforma, de tal manera, que en equilibrio se obtendrá una DV nueva y diferente. Si durante 89 este proceso de transformación se vuelve a excitar (cambiando nuevamente la probabilidad de fusión), la DV sufrirá una nueva deformación, provocando una dinámica vesicular difusa, que puede producir efectos convectivos en diferentes regiones del PS momentaneamente. Durante estos instantes, la distribución de fusion vesicular cambia produciendo una disminución o aumento en los PPs, de manera tal, que si se excita a la neurona periodicamente durante lapsos cortos (sin llegar al equilibrio), se generará una serie de PPs con alguna plasticidad (FS, DS, ruido, heterogénea o dinámica). Por otro lado, algunas de las mejoras o recomendaciones que se proponen en este trabajo son: 1. Implememtar el modelo de interacción VS-calcio-proteı́nas que se explica en el apéndice D, para incrementar el realismo al modelo de simulación, al individualizar las propiedades de cada VS. Es de esperar, que las VSs que permanezcan más tiempo en el PS, tendrán más oportunidad de fusionarse, ya que el ión Ca2+ será capturado más veces por las proteı́nas de la VS. De esta forma, las VSs que están en el PD podrán renovarse de forma más real. 2. Cambiar la probabilidad de fusión de un valor constante a una función espacial sobre la MP, PF = PF (x, y), ya que en la mayorı́a de las sinapsis la fusión vesicular sólo ocurre en ciertas zonas “privilegiadas” de la MP (ver por ejemplo [98]), que en parte se debe a que existen microdominios de Ca2+ en el PS [103] (nótese en los lugares indicados por las flechas de la imagen de la izquierda de la figura 3.1). 3. Cambiar la función de incorporación vesicular, ft , por una función dinámica que dependa del número de VSF o simplemente del número de VS en el PS. Cuando un nervio es excitado constantemente (por ejemplo, una persona que corre muy rápido) se liberan grandes cantidades de neurotransmisor (acetilcolina) para excitar al músculo muchas veces, o bien, se fusionan muchas VSs. Para compensar las grandes cantidades de VSF, el citoesqueleto tiene que enviar más VSs al PS, de lo contrario, el PS se quedarı́a sin VSs. Por último, resulta indispensable mencionar, que en esta Tesis se formuló y estudió un método computacional para modelar la dinámica de la neurosecreción, como una alternativa ante los estudios experimentales relacionados con la transmisión sináptica en sinápsis quı́micas. Mientras que en una preparación experimental se requiere una serie de instrumentos y sustancias, en el modelo que se ha presentado en este trabajo, sólo se necesitará determinar los parámetros tanto de la neurona (o de una variedad de neuronas), de la excitación y condiciones iniciales de las VSs; esto bastarı́a para reproducir resultados similares a los experimentales para una considerable variedad de tipos de neuronas. Bibliografı́a. [1] Goldstein E.B., “Sensation and perception”, USA, Wadsworth, 6ta.edición, ISBN 0-534-539645 (2002). [2] Para una explicación más extendida sobre la interacción entre la percepeción y la memoria, ver capı́tulo IV, Ginet C., “Knowledge, Perception, and Memory”, USA, The internet-first University Press, ISBN 9-02770-574-7 (2004). Para conocer sobre la fisiologı́a de esta interacción, ver Murray E. y Richmond B., “Role of perirhinal cortex in object perception, memory, and associations”, Current Opinion in Neurobiology, 11, 188 (2001). 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En lugar de resolver directamente las integrales, primero tomemos el caso de dos esferas cargadas con densidades volumétricas y densidades superficiales ρ1 , ρ2 , σ1 y σ2 respectivamente, una colocada en el origen y otra a una altura z0 sobre el eje z (véase figura A.1). Figura A.1: Cada sección diferencial de la esfera (2) percibe una fuerza distinta de otra sección. ~ r) = Tal como se muestra en la figura, el campo eléctrico que produce la esfera (1) es E(~ K1 r −2 r̂ donde K1 = (σ1 SV + ρ1 VV )/4πǫ. Debido a la simetrı́a del sistema, la fuerza que sufrirá la ~ tendrá dirección ẑ, y las demás componentes serán nulas, de aquı́ que sólo esfera (2) debido a E, serı́a necesario calcular la fuerza en esta dirección. 99 100 La proyección del diferencial de fuerza en z para un diferencial de carga de la esfera (2) es ~ cos θdq, donde θ es el ángulo entre ẑ y ~r. Dicho ángulo puede hallarse por la ley del coseno ||E|| como: cos θ = z02 + r 2 − r ′ 2 z0 + 2r ′ cos θ ′ =q . 2rz0 r ′ 2 + z02 + 2r ′ z0 cos θ ′ (A.1) Por lo tanto, la fuerza resultante en z, F21 , será: F21 K1 = σ2 R 2 + ρ2 Z 0 π Z Z 0 2π R2 + z02 + 2Rz0 0 RZ π 0 z0 + 2R cos θ ′ q 2π Z 0 2 cos θ ′ (R + 1 sin θ ′ dφ′ dθ ′ + 2Rz0 cos θ ′ ) z02 z0 + 2r ′ cos θ ′ q ′2 r + z02 + 2r ′ z0 ′2 cos θ ′ (r + z02 1 2 r ′ sin θ ′ dφ′ dθ ′ dr ′ , ′ ′ + 2r z0 cos θ ) la cual se simplifica como: F21 = σ2 R 2 2πK1 Z π (z0 + 2R cos θ ′ ) sin θ ′ dθ ′ + ρ2 (R2 + z02 + 2Rz0 cos θ ′ )3/2 0 Z 0 (z0 + 2r ′ cos θ ′ )r ′ 2 sin θ ′ dθ ′ dr ′ (r ′ 2 + z02 + 2r ′ z0 cos θ ′ )3/2 RZ π 0 (A.2) Utilizando el cambio de variable t = cos θ ′ , la fuerza se simplifica como: F21 − 2πK1 F21 z0 4πK1 = σ2 R 2 Z −1 1 = σ2 R 1 − z0 + 2Rt dt + ρ2 2 (R + z02 + 2Rz0 t)3/2 R2 R2 − z02 + ρ2 Z R 0 r′ 1 − Z R r ′2 r ′ 2 − z02 −1 1 0 r′2 Z z0 + 2r ′ t dtdr ′ , (r ′ 2 + z02 + 2r ′ z0 t)3/2 dr ′ . Resolviendo la integral se obtiene: R2 F21 z0 = σ2 R 1 − 2 4πK1 R − z02 − R2 ρ2 z02 ln 1 − 2 . 2 z0 (A.3) Definiendo z0 ≡ γR, de la ecuación anterior se llega a: σ2 1 F21 = − D2 γ ln 1 − 2 ≡ g2 (γ), 4πK1 γ − 1/γ γ (A.4) donde D2 ≡ ρ2 R/2. Variando los valores de σ2 y D2 se obtienen una variedad de formas para la fuerza intervesicular, tal como se muestra en la figura A.2. De esta gráfica se debe considerar sólo la región γ > 2, ya que z0 > 2R. La ecuación anterior representa la solución de las integrales en la fuerza eléctrica, realizando los cambios necesarios en γ, en las cargas y en la dirección de la fuerza. Es decir, que en la fuerza eléctrica: Qi − ρ̃∗ VV 4πǫ σj R 2 Z Ω ~rji + Rr̂ ′ dΩ′ + ρj ||~rji + Rr̂ ′ ||3 Z Γ ~rji + ~r′ dΓ′ ||~rji + ~r′ ||3 ! = 4πKi∗ gj (rji /R)r̂ji = F~ji , (A.5) 101 7 σ2=+1 σ2=+3 σ2=+1 σ2=−1 σ2=+3 σ2=−7 6 5 4 g2(γ) 3 D2=+1 D2=+1 D2=+9 D2=−1 D2=−8 D2=+15 2 1 0 −1 −2 −3 −4 1 2 3 4 γ 5 6 7 Figura A.2: g2 ∝ F21 como función de γ ∝ z0 . donde Ki∗ = (Qi − ρ̃∗ VV )/4πǫ y gj (γ) tiene la misma forma que g2 (γ), pero con: σ2 → σj , D2 → Dj = ρj R/2. Para fines posteriores, ahora se calculará la energı́a potencial electrostática de la jév (con única influencia de la iév) como: Uj ⇒ Uj 4πKi∗ R = Z = σj F~ji · d~rji = 4πKi∗ R Z γ dγ − Dj 2 γ −1 Z Z gj (γ)dγ γ ln 1 − γ −2 dγ σj 2 ln γ − 1 − Dj γ 2 ln 1 − γ −2 + ln γ 2 − 1 2 σj = − Dj ln γ 2 − 1 − Dj γ 2 ln 1 − γ −2 . 2 = (A.6) Apéndice B Fuerzas magnéticas entre VSs. Aún cuando todo el sistema esté eléctricamente cargado, sólo habrán fuerzas magnéticas entre las VSs, puesto que sólo ellas se moverán. Inclusive, si éstas llegan a estar en equilibrio estático el efecto magnético será nulo. Sólo se producirá algunos pequeños efectos magnéticos entre las VSs cuando se esté realizando la secreción. El campo magnético producido por el movimiento de una partı́cula puntual con velocidad ~v en algún punto ~r desde el centro la partı́cula, según la ley de Biot-Savart, es [75, 76]: µ Q (~v × r̂). 4π r 2 (B.1) ~ para Si se trata de un diferencial de carga, la ecuación será la misma pero tomando un dB un dQ. Para una esfera con densidad de carga volumétrica ρ y radio R, se tiene el campo total (véase figura B.1): µ ρ~v × 4π Z Γ′ ~r − ~r′ ′ 3 dΓ . ′ ||~r − ~r || (B.2) Figura B.1: Un diferencial de carga de la esfera que se mueve produce un campo magnético en ~r. 102 103 Nótese que ||~r − ~r′ ||2 = r 2 + r ′ 2 − 2rr ′ cos γ, donde γ = θ − θ ′ es el ángulo formado entre ~r y ~r′ . Por lo tanto, la ecuación (B.2) quedará: µ ρ~v × 2 Z 0 RZ π 0 (~r − ~r′ )r ′ 2 sin θ ′ dθ ′ dr ′ . 2 2 ′ ′ ′ 3/2 [r + r − 2rr cos(θ − θ )] (B.3) La solución de esta ecuación conforma el campo magnético de la carga interna de una VS colocada en el origen. La parte superficial se calcula como: µ σj ~v × 4π Z Ω′ Z π ~ sin θ ′ dθ ′ ~ µ (~r − R) ~r − R 2 ′ 2 R dΩ = σ R ~ v × j 2 2 ′ 3/2 2 ~ 3 0 [r + R − 2rR cos(θ − θ )] ||~r − R|| (B.4) La suma del campo magnético producido por la parte interior y la parte superficial es el ~ 0 (~r). Para Nk campo magnetico total de una VS colocada en el origen, que lo denominaremos B VSs, cada una de las iév esta desplazada del origen un vector ~ri , el campo magnético resultante será: ~ r) = B(~ Nk X i=1 ~ 0 (~r − ~ri ). B (B.5) ~ para la jév colocada en el origen, la fuerza magnética Como la fuerza magnética es Q~v × B, resultante serı́a (sobre cada elemento diferencial de carga de la jév): " ~jB = ~vj × ρj F Z Γ′ ~ r ′ )dΓ′ + σj B(~ Z Ω′ ~ r ′ )dΩ′ B(~ # (B.6) Esta es la fuerza magnética que habrı́a que sumarle a la fuerza total, si las direcciones de las velocidades entre las VSs fueran aproximadamente ortogonales y las magnitudes fueran del orden de la velocidad de la luz. Apéndice C Espesor del clatrato de agua. En primer lugar, suponemos que la molécula de agua posee un momento dipolar dado y que en cada polo se encuentra una carga de ±q = ±10e+ (8 del oxı́geno y 2 de los hidrógenos). Además, se gas liq = 0.598kg/m3 ) como = 958kg/m3 y DH conoce tanto la densidad de la masa del agua (DH 2O 2O masa molar de esta misma sustancia (MH2 O = 0, 0180 kg/mol). La segunda suposición que se hizo, fue asumir que toda la carga eléctrica de la VS se encuentra en “equilibrio polarizado”, es decir, que cada Qj de carga eléctrica que contenga la jév, se encontrará asociada a K̃Qj de las cargas de las moléculas de agua en la primera capa de solvatación (K̃ ≡ 1 − 1/K, donde K = ǫ/ǫ0 es la constante dieléctrica, sección 4.6 de [75]). De esta manera, se podrán determinar cuantas moléculas de agua hay hasta la S-ésima capa de solvatación del clatrato de la jév como: (S) M̃j =S K̃|Qj | . q (C.1) Con las constantes experimentales del agua lı́quida, se puede determinar el volumen de cada molécula de agua como: VH 2 O = 1 DH2 0 MH2 O 1 = 3.12 × 10−29 m3 . NA (C.2) Suponiendo que sólo las moléculas de agua polarizadas hasta la S-ésima capa de solvatación son las que producen la fuerza de repulsión, y que existe un volumen efectivo para esta misma fuerza, donde sólo están las moléculas polarizadas ocupando todo el volumen, este mismo volumen del clatrato para la jév serı́a entonces: (S) Ṽj = 9 (S) 9 K̃|Qj | VH2 O , M̃ VH2 O = 2 S 2π j 2π q 104 (C.3) 105 donde el término 9/2π fue colocado con la suposición de que en el volumen efectivo, cada molécula de agua está ocupando un volumen cúbico, y el primer 2 da a suponer que las moléculas de agua no-polarizadas tienen la suficiente movilidad dentro del clatrato como para llegar a cada una de las moléculas de agua polarizadas y aumentar el volumen efectivo de éstas [104]. Por otro lado, si el clatrato de la jév tiene una capa de espesor R̃j y la VS tiene un radio RV (o para un simple ión, Rion ), entonces el volumen de la capa esférica del clatrato es: 4 4 Ṽj = π(RV + R̃j )3 − πRV3 . 3 3 (C.4) Igualando las ecuaciones C.3 y C.4, se obtiene: (S) (S) = (YH2 O |Qj | + RV3 )1/3 − RV , 27VH2 O K −1 ≡ S K̃ =S 1.33 × 10−11 m3 /C. 2 4π q K R̃j (S) Y H2 O Cada jév tendrá un clatrato de agua con espesor especı́fico. Sin embargo, la ecuación anterior puede aproximarse a un valor medio tomando el promedio de las cargas sobre las VSs del PS: (S) R̃j (S) → R̃(S) = (YH2 O |Q̃| + RV3 )1/3 − RV . El valor de S (o Sj para la jév) puede hallarse suponiendo que para la Sj -ésima capa de solvatación, la densidad de moléculas de agua polarizadas ha disminuido hasta una cantidad aproximadamente igual a una densidad crı́tica (ρc ), es decir, que la interación entre el ión y la molécula de agua es lo suficientemente débil como para que la molécula de agua no se mantenga polarizada. Para ello, primero se calculó la densidad de moléculas de agua polarizadas por capa de solvatación, y se obtuvo (tomando densidades de carga de un sólo polo de la molécula, que tuvieran distribuciones esféricas): (S) ρj = 4πRa [( 31 + Sj2 K̃|Qj | ≈ ρc , − S)Ra2 + RV2 + RV (2Sj − 1)Ra ] (C.5) donde Ra ≈ 1.383 × 10−10 m es el radio promedio de la molécula de agua cerca del ión [89]. De esta ecuación se obtiene que: K̃|Qj | 1 , Sj2 Ra2 + Sj (2RV − Ra )Ra + Ra2 + RV2 − RV Ra = 3 4πRa ρc (C.6) 106 cuya solución con sentido fı́sico es: RV 1 S̃j ≡ Sj + = 1+ Ra 2 s ! K̃|Qj | 1 − , πRa3 ρc 3 (C.7) en donde ρc y K varian con la temperatura. El valor de ρc es encontrado relacionándolo con un valor crı́tico de polarización promedio, o bien, un ángulo crı́tico de polarización promedio, θc (ángulo formado por el campo eléctrico y el momento dipolar permanente). Esta relación se asumió como una función de distribución liq 10 3 homogénea con respecto a la densidad de carga polar del agua (ρliq a = q/VH2 O ≈ 5.13 × 10 C/m y gas 7 3 ρgas a = q/VH2 O ≈ 3.20 × 10 C/m ): ρc = (1 − hcos θc i)ρa (T ), 0 > hcos θc i ≥ 1 gas liq gas liq 2T ρa − ρ a ρa + ρ a + tanh , ρa (T ) = 2 2 ∆T (C.8) donde ρa (T ) se ha planteado como una variación suave, a presión constante y con una interface de espesor ∆T ≈ 1o C. Ası́, ρc se confundirá con el fluido homogéneo en el borde de la capa. Por otro lado, cuando un conjunto de dipolos con distribución de Boltzmann es sometido a un campo eléctrico, el ángulo promedio está descrito por la fórmula de Langevin-Debye para altas temperaturas absolutas (ver sección 5.3 de [75]): hcosθi ≈ ~ |~ p| 1 |Qj | |~ p||E| , = 3T̃ 3T̃ 4πǫ r 2 T̃ ≡ kB T, (C.9) donde kB = 1.38 × 10−23 J/K es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta del medio, ~ es el campo eléctrico. |~ p| = 6.2 × 10−30 C.m es el momento dipolar permanente del agua y E En el borde de la capa de solvatación (r = Ra S̃j ) se tiene: ρc ≈ 1 − ξ1 |Qj | ρa (T ), T̃ K S̃j2 ξ1 ≡ |~ p| ≈ 0.97J/C 12πǫ0 Ra2 (C.10) Combinando las ecuaciones C.7 y C.10 se obtiene: " # T̃ K (K − 1)|Qj |T̃ 2 ξ1 |Qj | T̃ K S̃j4 − T̃ K S̃j3 + − ξ1 |Qj | − =0 Sj + ξ1 |Qj |S̃j − 3 ξ2 ρa (T ) 3 (C.11) ξ2 ≡ 4πRa3 ≈ 3.324 × 10−29 m3 . Nótese que en los coeficientes del polinómio, un parámetro importante es K el cual cambia 107 la intensidad de campo eléctrico que perciben los dipolos. Experimentalmente se ha observado que K y la temperatura se relacionan de forma inversa [105]. Entre 0o C y 20o C, K está en el orden de 80 − 87, pero en altas temperaturas K puede disminuir hasta cerca de la unidad. Debido a este comportamiento, es válido formular alguna relación empı́rica que reproduzca estos resultados, para que de esta manera, se pueda resolver aproximadamente la ecuación C.11. Un modelo que reproduce cantidades aproximadas de los resultados experimentales entre K y T es: " KTC − K∞ K(T ) = K∞ + (K0 − K∞ ) K0 − K∞ #T /TC , (C.12) donde K∞ ≈ 1 (altas tempuraturas), K0 = 87.8 (punto de conjelación) y TC es algún valor conocido donde se conoce K (ej: K(20) = 80.1 = KTC < K0 , ver página 111 de [75]). Combinando C.12, C.8 y C.11, y resolviendo numéricamente el polinómio, con Qj fijo o con T fijo, se obtienen los resultados de las gráficas C.1 (obtenidas en Mathematica 5.0). 12 25 + T=TC Qj=21e 10 20 8 + 15 Sj+Rion/Ra Sj+Rion/Ra Qj=11e 6 o T=301 C o T=81 C 10 o T=1 C 4 + Qj=1e 2 0 0 1000 2000 o T( C) 3000 5 0 0 50 100 + Qj/e 150 200 Figura C.1: Izquierda, nivel de solvatación vs. temperatura para diferentes cargas del ión. Derecha, Nivel de solvatación vs. carga del ión para diferentes temperaturas. En ambas gráficas se muestra que los órdenes en los niveles de solvatación se mantienen, aún cuando |Qj | ó T aumenten. En la primera gráfica para bajas temperaturas, se muestra la evidencia de que al aumentar T , K disminuye lo suficiente como para que el campo eléctrico aumente significativamente (E ∝ K −1 ), y por lo tanto, más moléculas de agua se acerquen al ión. Después de una temperatura crı́tica (TC ≈ 1363.7o C), la energı́a térmica es tan fuerte que el campo eléctrico ya no es lo suficiente como para aumentar el número de las moléculas de agua polarizadas después de un pequeño aumento en T . 108 El comportamiento S̃j (|Qj |) no varı́a mucho cuando T cambia en algunos grados, tal como se muestra en la gráfica inferior (es similar inclusive para altas temperaturas). Dicho comportamiento es aproximadamente logarı́tmico para poca carga eléctrica del ión y lineal para Qj >> e+ . Estos comportamientos son significativamente correctos, puesto que es de esperarse que cuanto más carga tenga el ión (o la VS), más fuerte será el campo eléctrico, y por lo tanto, más moléculas de agua se podrán polarizar. Por último, resulta indispensable aclarar que en ambas gráficas se está calculando S̃j y no el nivel de solvatación puro Sj . La diferencia entre ambas cantidades es Rion /Ra , donde dicha cantidad se tendrá que restar a las gráficas anteriores para cada caso en particular, ya sea un simple ión (Rion /Ra ∼ 1 y |Qj | ∼ e+ ), una VS (RV /Ra >> 1 y |Qj | >> e+ ) u otros casos, tales como moléculas, proteı́nas, estructuras hidratadas macroscópicas (ver por ejemplo [106]), etc. Apéndice D Cadena de Markov. En este apéndice se plantea y elabora una secuencia de probabilidades de una cadena de Markov [19, 20] para la incorporación de ésta en el modelo de simulación de dinámica de las VSs que se ha desarrollado en esta tesis. La idea de esta parte es que las VSs tengan actividades iónicas y proteicas, y que los nuevos estados de las VSs dependan de estas actividades, tal como ocurre en los procesos reales (ver sección 2.4). La actividad iónica es por parte del ión Ca2+ , que como se ha explicado antes, es parte de la carga de la jév (Cj ). De esta forma, la actividad iónica del Ca2+ afectará el movimiento de la jév. Además de ésto, se espera que, mediante la incorporación de la cadena de Markov propuesta, la fusión de VSs sea particular de cada una de ellas, porque cada una deberá tener diferentes número de proteı́nas dispuestas para este proceso (las proteı́nas que cumplen esta labor, surgen de un cambio conformacional tridimensional relacionados con el concentración de calcio capturado por la VS). Para simular todo esto, se ha construido un modelo de probabilidades sobre los eventos de los iones de calcio y las proteı́nas asocidas a los cambios de configuración de las VSs, como lo son: la captura de cada ión de calcio por cada proteı́na que tenga la VS, el rechazo de cada ión de calcio, la fusión o semi-fusión de cada jév y la liberación completa o parcial del neurtransmisor. La secuencia de los eventos sobre los posibles cambios de estado de las VSs, iones de calcio y proteı́nas, se muestra esquemáticamente en la figura D.1 y se explica a continuación. D.1 Captura de Ca2+. En primer lugar, se hizo la idealización de que cada VS contiene M proteı́nas captadoras de una molécula de Ca+2 (sinaptotagmina). Luego, se supuso que la captación ocurre con alta probabilidad cuando el calcio está cerca de la VS, esto es, cuando el camino libre medio del calcio sea mayor o igual a una distancia crı́tica, la cual está relacionada con la concentración intracelular de Ca+2 . Es 109 110 Figura D.1: Secuencia propuesta para un paso de MonteCarlo incluyendo la actividad iónica y proteica. 111 decir, que existirá una primera probabilidad temporal de captación de calcio: " Z(t) P Z (t) = Zc #α , (D.1) donde Z(t) es la concentración intracelular actual de calcio, Zc es una concentración intracelular crı́tica para el cual el calcio siempre es captado y α > 0 es una constante. Esta última puede hallarese normalizando: Z Zc P Z (t)dZ(t) = 1 0 ⇒ Zc = α + 1. (D.2) En segunda instancia, la probabilidad de que una molécula de calcio sea captada debe depender de la superficie libre que tenga la jév, Sj (t) ≈ SV (1 − Cj /M ), lo que quiere decir: PjS (t) " Sj (t) = SV #SV −1 (D.3) Un tercer y último factor se consideró en este trabajo, el cual tiene que ver con la cinética de las reacciones entre las concentraciones en la superficie de la jév de sinaptotagmina libre de Ca+2 , [Sy], y el calcio, [Ca+2 ]. En la superficie de la jév, las proteı́nas de sinaptotagmina están a la vez capturando y rechazando calcio. Estos dos procesos simultáneos pueden considerarce como una reacción quı́mica en la cual se está produciendo [SyCa2+ ]j (acoplamiento entre la sinaptotagmina y el calcio) y se está disociando este compuesto al mismo tiempo. La ecuación que describe esta reacción en equilibrio quı́mico es 1 : [Sy]j + [Ca+2 ] KC ⇀ ↽1/KC [SyCa+2 ]j , (D.4) donde KC es la constante de disociación en la reacción. De aquı́, que la probabilidad para que se produzca la reacción será (sección 5.3.B de [19], ver también por ejemplo [85, 107]): PjK (t) ! [Sy]j + [Ca+2 ] M + VV Z(t) = KC = KC −1 , +2 [SyCa ]j Cj (D.5) donde se ha considerado a las cantidades de las concentraciones como número de partı́culas por unidad de volumen ([Sy]j = (M − Cj )/VV , [Ca2+ ] = Z(t) y [SyCa2+ ]j = Cj /VV ). La probabilidad total de captación será: PjC (t) =P Z (t)PjS (t)PjK (t) Zc −1 = AZ(t) SV −1 Sj (t) ! M + VV Z(t) −1 , Cj A ≡ KC Zc1−ZcSV1−SV 1 Como KC = [SyCa2+ ]j /([Sy]j [Ca2+ ]), se entiende que KC debe ser proporcional a la velocidad de la captura de calcio, por lo tanto, KC debe ser inversamente proporcional a ∆t. 112 D.2 Rechazo de Ca+2. Una vez captado calcio, la molécula puede ser rechazada (expulsada) de la jév en el tiempo con una probabilidad total que dependa de tres factores: el primero, de la cantidad actual de calcio que contenga la VS (habrá menos probabilidad de rechazo si previamente se ha captado poco); el segundo, de la superficie libre que tenga la VS para la expulsión; y el tercero, de la cinética del desacoplamiento. PjR (t) = BCjβ Sj (t)SV −1 !−1 M + VV Z(t) −1 Cj , B= (1/KC )SV1−SV , HM (−β) donde β es una constante relacionada con una cantidad mı́nima de calcio para la cual el rechazo es nulo, y Hn (x) ≡ Pn k=0 k −x es una función denominada número armónico. Las constantes involu- cradas en B, fueron halladas al normalizar cada uno de los términos de probabilidad asociados a cada uno de los factores que se mencionaron. En cada iteración, la concentración intracelular de calcio cambia debido a las moléculas capturadas y rechazadas por las VSs. Nuevamente, ocurre una rápida difusión de manera que la concentración de calcio se vuelva homogénea. Tanto en la captura como en el rechazo, en cada iteración del algoritmo, se debe generar un número aleatorio por cada proteı́na de sinaptotagmina que tenga cada VS, es decir, M × N veces. Cada uno de estos números se debe comparar con las probabilidades previamente calculadas y posteriormente generar M × N eventos. Por el contrario, se generará un sólo evento en la fusión de la VS y otro en la liberación del neurotransmisor. D.3 Fusión de la VS. Cada interacción entre una proteı́na de v-SNARE y t-SNARE (iVT) produce una fuerza F̃ aproximadamente constante de corto alcance. Si existen Cj iVT, entonces la fuerza resultante será F̃R = Cj F̃ entre la VS y la MP. La probabilidad de que una VS se fusione está relacionada con F̃R . Con alta probabilidad ocurrirá la fusión cuando F̃R sea mayor a una fuerza crı́tica, o bien, Cj sea mayor que una cantidad umbral CM . Con esta idea, se pensó que un modelo de probabilidad de fusión donde influya la posición (altura zj medida desde la MP) y Cj , podrı́a ser: PjF (t) = R − zj 2R !λ Cj ! , CM ! −R ≤ zj ≤ R, (D.6) 113 donde los términos factoriales están relacionados con las ocupaciones ordenadas de las proteı́nas de sinaptotagmina en las VSs. Al normalizar cada término de PjF se obtienen los valores λ y CM : Z −R +R R − zj 2R dzj = ⇒ λ + 1 = Λ(R) ⇒ CM ! = donde Λ(x) es la solución de w en la ecuación D.4 !λ M X M X Cj ! Cj =0 CM ! =1 i!, i=0 w 2x = xw − (−x)w . Liberación del neurotransmisor. Una vez fusionada la VS, ésta puede liberar tanto el contenido completo como sólo una parte del neurotransmisor. Experimentalmente se encuentra que existe una concentración crı́tica de calcio para la cual antes de ella la liberación es continua y después de ella la liberación es total (ver capı́tulo 14 de [12]). La tendencia de la concentración del neurotransmisor liberado en la jév, [n]j , como función de la cantidad de moléculas de calcio capturado por la misma jév, en la parte continua, es aproximadamente como Cj−q donde q ≥ 1 (ver figura D.2), y especı́ficamente como: [n]j = [n]∗ (C∗ /Cj )q , Cj < C∗ , (D.7) y [n]j = [n]todo cuando Cj ≥ C∗ , donde C∗ es la concentración crı́tica de calcio para la cual, después de este valor, la liberación es completa y antes de éste [n]j < [n]∗ . Figura D.2: Liberación del neurotransmisor como función del calcio capturado. Apéndice E Códigos de las simulaciones. E.1 Para la neurosecreción. #include <stdio.h> #include <stdlib.h> #include <math.h> #include "mlg03.h" int main(numero,arg) int numero; char *arg[]; { int N,i,j,k,PT,PG,t,Nmax,Vf,*secuencia,ns,inicio,npv=-MaxEnt; double **POS,**pos,**VEL,**vel,**temp,H,L,T,R,b,Pf,p,rji,s,C,Vv,Sv,rV; double I,X,Vp,Z,tc,tc2,trj,csL,R3,rcm,mu,dcal,desvM,NP,NP2; char *ident,fiv[64]; FILE *inicial,*vt; double stf1[3],stf2[3],stf3[3],stf4[3],cs1,cs2,cs3,cs4,cs5,cs6,cs7,cs8,cs9; double dme=(double)MaxEnt,E,Le2,deposita,dr[3],Qv,clm; /* (1) */ ident=PreStr("Identificacion en data/.:= ",16); if(ident[0]==’*’) { ident=Trozo(ident,1,strlen(ident)); sprintf(fiv,"rm -f data/%s_*.ug data/%s_evolu.dat",ident,ident); system(fiv); } desvM=dcal=0.0; /* Desviacion maxima del promedio temporal de N */ if(numero>1) { dcal=0.0; sscanf(arg[1],"%lf",&dcal); if(dcal>0.0 && dcal<100.0) desvM=(dcal/100.0)*(dcal/100.0); system("rm -f dina5_stop.b"); if(numero>2) { sscanf(arg[2],"%d",&npv); npv=fmax(1,npv); } } tc=pow(1.0/dme,2.0); /* (2) */ H=PreDou("Altura del pool:= ",tc,dme); /* (3) */ L=PreDou("Largo y profundidad del pool:= ",H,dme); Le2=L/2.0; /* (4) */ R=PreDou("Radio de las vesiculas:= ",tc,Le2); R3=R*R*R; cs2=H/2.0; cs5=2.0*R; Vp=L*L*(H+R); cs4=M_PI*R; Sv=4.0*cs4*R; Vv=M_PI*R3/0.75; t=MaxPoints/(4+8+8*2*3+8*2*3); rV=Vp/Vv; Nmax=MinInt((int)rV,t); deposita=H*(1.0-H/L); /* (5) */ rji=PreDou("Factor de densidad vesicular inicial:= ",0.0,1.0); N=(int)(rji*(double)Nmax); pos=(double **)calloc(3,sizeof(double *)); POS=(double **)calloc(3,sizeof(double *)); vel=(double **)calloc(3,sizeof(double *)); VEL=(double **)calloc(3,sizeof(double *)); for(i=0;i<3;i++) { POS[i]=(double *)calloc(Nmax,sizeof(double)); pos[i]=(double *)calloc(Nmax,sizeof(double)); VEL[i]=(double *)calloc(Nmax,sizeof(double)); vel[i]=(double *)calloc(Nmax,sizeof(double)); } /* (6) */ T=PreDou("Pasos de tiempo real:= ",tc*tc,dme); dr[0]=pow(0.75*Vp/M_PI,1.0/3.0); dr[1]=0.5*H*H/L; dr[2]=0.5*(dr[0]+dr[1]); printf("\n10^-7(bm=%lf bo=%lf ~b=%lf)\n",dr[0]*1.0e7,dr[1]*1.0e7,dr[2]*1.0e7); /* (7) */ b=PreDou("Perimetro de alcance:= ",-dme,dme); if(b<0.0) b=dr[2]; b=fmax(fmin(b,dr[0]),dr[1]); /* (8) */ p=2.0*M_PI*PreDou("Intensidad de repulsion del clatrato:= ",0.0,dme*dme*dme); 114 115 /* (9) */ s=PreDou("DCS de las membranas:= ",-dme,dme); /* (10) */ C=PreDou("DCV intracelular:= ",-dme,dme); /* (11) */ E=PreDou("Constante dielectrica intracelular (E/Eo):=",1.0,dme); /* (12) */ I=PreDou("Espacio intersinaptico := ",tc,H); /* (13) */ X=PreDou("DCV extracelular:= ",-dme,dme); /* (14) */ Z=PreDou("DCV intravesicular:= ",-dme,dme); /* (15) */ rcm=PreDou("Masa de las vesiculas:= ",tc*tc,1.0); /* (16) */ mu=PreDou("Viscosidad intracelular:= ",tc,dme); cs6=(1.0-4.0*M_PI*b*b*b/(3.0*Vp))/Vp; cs1=1.33e-11*(1.0-1.0/E); E=E*8.854e-12; cs3=(s+X*I)/2.0; Qv=s*Sv+Z*Vv; Z*=0.5; /* (17) */ inicio=PreInt("Inicio en el tiempo:= ",0,MaxEnt-1); /* Lee o se genera aleatoriamente: posicion y velocidad inicial */ sprintf(fiv,"data/%s_%d.ug",ident,inicio); srand(getpid()); NP=NP2=0.0; if((inicial=fopen(fiv,"r"))!=NULL) { i=0; while(fscanf(inicial,"%lf\t",&tc)>=0 && i+1<Nmax) { dr[0]=tc; fscanf(inicial,"%lf\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\n",&dr[1],&dr[2],&vel[0][i],&vel[1][i],&vel[2][i]); for(k=0;k<3;k++) pos[k][i]=dr[k]*H; for(j=0;j<i;j++) { /* Elimina la singularidad, si existe. */ if(pos[0][j]==pos[0][i] && pos[1][j]==pos[1][i] && pos[2][j]==pos[2][i]) { pos[0][i]=Aleatorio(fmax(0.0,pos[0][i]-R),fmin(L,pos[0][i]+R)); pos[1][i]=Aleatorio(fmax(0.0,pos[1][i]-R),fmin(L,pos[1][i]+R)); pos[2][i]=Aleatorio(fmax(0.0,pos[2][i]-R),fmin(H,pos[2][i]+R)); j=i; }} i++; } N=i; fclose(inicial); sprintf(fiv,"data/%s_evolu.dat",ident); if((inicial=fopen(fiv,"r"))!=NULL) { sprintf(fiv,"data/%s_evolu.tmp",ident); i=0; if((vt=fopen(fiv,"w"))!=NULL) { while(fscanf(inicial,"%lf\t",&I)>=0 && i<inicio) { j=(int)(I*rV+0.5); fscanf(inicial,"%lf\t%d\n",&clm,&k); fprintf(vt,"%lf\t%lf\t%d\n",I,clm,k); tc=(double)j; NP+=tc; NP2+=tc*tc; i++; } tc=(double)i; NP/=tc; NP2/=tc; if(inicio!=0) { N=fmin(N,j); I=(double)N/rV; for(j=inicio;j<i;j++) fprintf(vt,"%lf\t%lf\t%d\n",I,clm,0); } fclose(vt); } fclose(inicial); if(i!=0) { sprintf(fiv,"rm -f data/%s_evolu.dat\nmv data/%s_evolu.tmp data/%s_evolu.dat",ident,ident,ident); system(fiv); }}} else { inicio=0; tc=2.0*R/T; dr[0]=dr[1]=L; dr[2]=H; for(i=0;i<N;i++) { for(k=0;k<3;k++) { pos[k][i]=Aleatorio(0.0,dr[k]); vel[k][i]=Aleatorio(-tc,tc); } k=0; for(j=0;j<i;j++) if(pos[0][j]==pos[0][i] && pos[1][j]==pos[1][i] && pos[2][j]==pos[2][i]) k=j=i; if(k>0) i--; }} dme=pow(cs1*fabs(Qv)+R3,1.0/3.0); /* tR=dme-R, dme es el radio completo */ mu=6.0*M_PI*dme*mu; rcm=mu/rcm; cs9=exp(-rcm*T); /* (18) */ secuencia=VNE(PreStr("Secuencia de deposicion de vesiculas:= ",64),’,’); /* (19) */ Pf=PreDou("Probabilidad de fusion:= ",0.0,1.0); /* (20) */ PT=PreInt("Pasos totales:= ",1,MaxEnt); /* (21) */ PG=PreInt("Pasos de grabacion:= ",1,PT); if(dcal<0.0) PT=PG=(int)(-dcal); npv=fmin(PT-inicio+1,npv); sprintf(fiv,"data/%s_evolu.dat",ident); if((vt=fopen(fiv,"a"))==NULL) { printf("\n:(\n NO HAY ACCESO A ESCRIBIR EN data/.\n\n"); exit(-1); } ns=1; if(NP==0.0 && NP2==0.0) { NP=(double)N; NP2=NP*NP; } printf("\n:)\n Vesiculas (iniciales,maxima,memoria) = (%d,%d,%.4lf).\n\t(~R/R)i = %lf\n:|\n", N,Nmax,100.0*(double)Nmax/(double)t,100.0*(dme/R-1.0)); csL=2.0*dme; cs5=cs5+(dme-R); cs7=p*dme*dme/(2.0*mu); cs8=cs7*dme/0.75; p=p/(24.0*mu); E=E*mu; cs3=Qv*cs3/E; I=1.0-cs9; if(b<csL) { printf("\n:(\n El valor de b no puede ser mayor que %lf\n",csL); exit(-2); } for(t=1+inicio;t<=PT;t++) { /**** Pasos de MonteCarlo ****/ Vf=0; 116 for(j=0;j<secuencia[ns];j++) { /**** DEPOSICION ****/ if(N+1<=Nmax) { pos[0][N]=Aleatorio(0.0,L); pos[1][N]=Aleatorio(0.0,L); pos[2][N]=Aleatorio(deposita,H); vel[0][N]=vel[1][N]=vel[2][N]=0.0; N++; }} if((ns+=1)==secuencia[0]) ns=1; tc2=cs6*(double)N; trj=C*(1.0-tc2*Vv)+Qv*tc2; tc2=(Qv-trj*Vv)/E; trj=Qv*trj/E; R3=cs3-trj*cs2; clm=0.0; for(j=0;j<N;j++) { stf1[0]=stf1[1]=stf1[2]=stf2[0]=stf2[1]=stf2[2]=stf3[0]=stf3[1]=stf3[2]=stf4[0]=stf4[1]=stf4[2]=0.0; for(k=0;k<3;k++) { tc=pos[k][0]; pos[k][0]=pos[k][j]; pos[k][j]=tc; } for(i=1;i<N;i++) { /**** Recorrido de interaccion ****/ for(k=0;k<3;k++) dr[k]=pos[k][0]-pos[k][i]; /* Componentes de rji */ if(fabs(dr[0])>Le2) dr[0]-=copysign(L,dr[0]); /* L*Signo(dr[0]); */ if(fabs(dr[1])>Le2) dr[1]-=copysign(L,dr[1]); /* L*Signo(dr[1]); */ rji=sqrt(dr[0]*dr[0]+dr[1]*dr[1]+dr[2]*dr[2]); if(rji<=b) { if(rji<csL) { if(rji<cs5) { /* Desolapamiento */ tc=dr[2]/rji; dcal=dr[1]/dr[0]; dr[2]=cs5*tc; dr[0]=cs5*sqrt((1.0-tc*tc)/(1.0+dcal*dcal)); dr[1]=dr[0]*dcal; rji=cs5; } tc=rji*rji; /* terminos del clatrato de agua */ for(k=0;k<3;k++) { stf2[k]+=dr[k]/rji; stf3[k]+=dr[k]; stf4[k]+=tc*dr[k]; } } /* c.e. proporcional a g(rji/R=gamma) */ tc=rji/R; dcal=1.0/tc; tc=(s/rji)/(tc-dcal)-Z*log(1.0-dcal*dcal); for(k=0;k<3;k++) stf1[k]+=tc*dr[k]; }} /* Ahora se calcula la fuerza, directamente en dr[]*mu */ for(k=0;k<3;k++) dr[k]=tc2*stf1[k]+cs8*stf2[k]-cs7*stf3[k]+p*stf4[k]; dr[2]+=R3+trj*pos[2][0]; for(k=0;k<3;k++) { /**** Desplazamiento de ARRASTRE ****/ VEL[k][j]=I*dr[k]+cs9*vel[k][j]; dr[k]=T*dr[k]+(vel[k][j]-VEL[k][j])/rcm; POS[k][j]=pos[k][0]+dr[k]; } clm+=sqrt(dr[0]*dr[0]+dr[1]*dr[1]+dr[2]*dr[2]); for(k=0;k<2;k++) { /* Condiciones de borde periodicas en el largo y profundidad */ POS[k][j]+=L*(double)((POS[k][j]<0.0)-(POS[k][j]>L)); if(POS[k][j]<0.0 || POS[k][j]>L) { POS[k][j]=Aleatorio(0.0,L); VEL[k][j]=0.0; } } if(POS[2][j]>H) { POS[2][j]=H-POS[2][j]; VEL[2][j]*=-1.0; } /* Rebote en la parte superior */ } /* Fin de j */ if(N!=0) clm/=csL*(double)N; temp=pos; pos=POS; POS=temp; /* Intercambian los apuntadores de las capas */ temp=vel; vel=VEL; VEL=temp; for(j=0;j<N;j++) { /****** FUSION ******/ if(pos[2][j]<=0.0) { if(Aleatorio(0.0,1.0)<=Pf) { N--; /* El lugar de j va a ser ocupado por la ultima, y la ultima es eliminada. */ for(k=0;k<3;k++) { pos[k][j]=pos[k][N]; vel[k][j]=vel[k][N]; } Vf++; j--; } else { /* Rebote en la MP */ pos[2][j]*=-1.0; vel[2][j]*=-1.0; }} if(pos[2][j]<0.0 || pos[2][j]>H) { pos[2][j]=Aleatorio(0.0,H); vel[2][j]=0.0; } } tc=(double)N; tc2=(double)t; dcal=1.0-1.0/tc2; tc2=tc/tc2; NP=dcal*NP+tc2; NP2=dcal*NP2+tc*tc2; dcal=(NP2/(NP*NP)-1.0)/tc2; tc/=rV; if((t-inicio)%npv==0) { printf("%lf %lf %lf %d %d",100.0*sqrt(desvM/dcal),clm,tc,N,t); printf("\n"); } k=(int)(dcal<=desvM && dcal!=0.0); /* error relativo */ fprintf(vt,"%lf\t%lf\t%d\n",tc,clm,Vf); /* Graba o.v.v., neurosecrecion y C.L.M. */ /* Graba en un archivo, la informacion completa en el paso de grabacion */ if(t%PG==0 || t==PT || k==1) { sprintf(fiv,"data/%s_%d.ug",ident,t); if((inicial=fopen(fiv,"w"))!=NULL) { for(i=0;i<N;i++) fprintf(inicial,"%lf\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\n", pos[0][i]/H,pos[1][i]/H,pos[2][i]/H,vel[0][i],vel[1][i],vel[2][i]); fclose(inicial); } 117 if(k==1) { if((inicial=fopen("dina5_stop.b","w"))!=NULL) { fprintf(inicial,"#!/bin/sh\ndina5_ui=%d",t); fclose(inicial); } t=MaxEnt; }}} fclose(vt); } E.2 Cálculo de DV en masa/carga y energı́a. #include <stdio.h> #include <stdlib.h> #include <math.h> #include "mlg03.h" #define cex2 3.2e-19 #define Eo 8.854e-12 #define REESY 1.0 double *A,R; double Segmento(z,k) double z; int k; { double u1=fabs(z-A[k]),u2=fabs(z-A[k+1]),w1=0.0,w2=0.0,hh; if(u1<R || u2<R) { if(z<A[k] && z+R<A[k+1]) { w1=R; w2=u1; } /* (1) */ if(z<A[k] && z+R>=A[k+1]) { w1=u2; w2=u1; } /* (2) */ if(z>=A[k] && z-R<A[k] && z+R<A[k+1]) { w1=R; w2=-u1; } /* (3) */ if(z>=A[k] && z<A[k+1] && z-R<A[k] && z+R>=A[k+1]) { w1=u2; w2=-u1; } /* (4) */ if(z-R>=A[k] && z+R<A[k+1]) { w1=R; w2=-R; } /* (5) */ if(z-R>=A[k] && z+R>=A[k+1] && z<A[k+1]) { w1=u2; w2=-R; } /* (6) */ if(z-R<A[k] && z>=A[k+1]) { w1=-u1; w2=-u2; } /* (7) */ if(z-R>=A[k] && z>=A[k+1]) { w1=-u2; w2=-R; } /* (8) */ hh=fabs(w1-w2); w1=R*R-w1*w1; w2=R*R-w2*w2; return((M_PI*hh/6.0)*(hh*hh+3.0*(w1+w2))); } else return(0.0); } int main(numero,arg) int numero; char *arg[]; { int Np,t,PT,PG,i,j,Nmax,n,k,inicio,fin; double H,L,S,Ri,K,EI,Re,*his[4],Vv,Sv,Vp,EC,QeM,rji,W,z; double DVC,velX,velY,velZ,*pos[3],DVI,DT,b,p,E,Qv; double tS,g,Rvi,mu,Pf,Sie,Sic,tc1,tc2,dr[3],Le2,depC,cs1,hl; char almacen[32],data[32],secuencia[32]; FILE *adat,*amax; if(numero!=3 && numero!=2) { printf(" Numero de parametros invalido.\n Ejecute ./perf3 [c.i.] [puntos].\n"); exit(-1); } if((adat=fopen(arg[1],"r"))==NULL) { printf("\n No se puede leer el archivo %s.\n",arg[1]); exit(-2); } fscanf(adat,"%s\n",almacen); /* (1) */ if(almacen[0]==’*’) { sscanf(almacen,"*%s",almacen); sprintf(secuencia,"rm -f data/%s_*.pf data/%s_maxim.dat",almacen,almacen); system(secuencia); } fscanf(adat,"%lf\n",&H); /* (2) */ fscanf(adat,"%lf\n",&L); /* (3) */ fscanf(adat,"%lf\n",&R); /* (4) */ fscanf(adat,"%lf\n",&DVI); /* (5) */ fscanf(adat,"%lf\n",&DT); /* (6) */ fscanf(adat,"%lf\n",&b); /* (7) */ fscanf(adat,"%lf\n",&p); /* (8) */ fscanf(adat,"%lf\n",&S); /* (9) */ fscanf(adat,"%lf\n",&Ri); /* (10) */ fscanf(adat,"%lf\n",&K); /* (11) */ 118 fscanf(adat,"%lf\n",&EI); /* (12) */ fscanf(adat,"%lf\n",&Re); /* (13) */ fscanf(adat,"%lf\n",&Rvi); /* (14) */ fscanf(adat,"%lf\n",&QeM); /* (15) */ fscanf(adat,"%lf\n",&mu); /* (16) */ fscanf(adat,"%d\n",&inicio); /* (17) */ fscanf(adat,"%s\n",secuencia); /* (18) */ fscanf(adat,"%lf\n",&Pf); /* (19) */ fscanf(adat,"%d\n",&PT); /* (20) */ fscanf(adat,"%d",&PG); /* (21) */ fclose(adat); Sv=4.0*M_PI*R*R; /* Superficie de las vesiculas */ Vv=Sv*R/3.0; /* Volumen de las vesiculas */ Qv=S*Sv+Rvi*Vv; /* Carga de la vesicula */ Vp=L*L*(H+R); /* Volumen del pool */ E=K*Eo; /* Permitividad electrica */ tS=(S+Re*EI-Ri*L)/2.0; /* tildeSigma */ p=2.0*M_PI*p; Le2=L/2.0; depC=(H+H*(1.0-H/L))/2.0; cs1=1.33e-11*(1.0-1.0/K)*REESY; Nmax=MinInt((int)(3.0*Vp/(Sv*R)),MaxPoints/(4+8+8*2*3+8*2*3+4*8+2)); for(n=0;n<3;n++) pos[n]=(double *)calloc(Nmax,sizeof(double)); Np=0; if(numero==3) sscanf(arg[2],"%d",&Np); Np=MaxInt(Np,1+(int)(H/R)); for(n=0;n<4;n++) his[n]=(double *)calloc(Np,sizeof(double)); for(n=0;n<4;n++) for(k=0;k<Np;k++) his[n][k]=0.0; A=(double *)calloc(Np+1,sizeof(double)); hl=H/(double)Np; for(k=0;k<=Np;k++) A[k]=hl*(double)k; sprintf(data,"data/%s_maxim.dat",almacen); if((amax=fopen(data,"a"))==NULL) { printf("\nNo se puede escribir en el directorio data/.\n",almacen); exit(-4); } fin=PT+inicio; if((adat=fopen("dina5_stop.b","r"))!=NULL) { fscanf(adat,"%s",data); fscanf(adat,"%s",data); sscanf(Trozo(data,9,31),"%d",&fin); fclose(adat); } Pf=0.0; for(t=inicio;t<=PT+inicio;t+=PG) { if(t>fin && t-PG<fin) t=fin; sprintf(data,"data/%s_%d.ug",almacen,t); if((adat=fopen(data,"r"))!=NULL) { for(k=0;k<Np;k++) his[0][k]=his[1][k]=his[2][k]=his[3][k]=0.0; n=i=0; while(fscanf(adat,"%lf\t",&pos[0][n])>=0 && n<Nmax) { fscanf(adat,"%lf\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\n",&pos[1][n],&pos[2][n],&velX,&velY,&velZ); for(k=0;k<3;k++) pos[k][n]=pos[k][n]*H; /* Posiciones */ EC=0.5*(fabs(Qv)/QeM)*(velX*velX+velY*velY+velZ*velZ); /* Energia cinetica */ z=pos[2][n]; g=Qv*(tS+Ri*z/2.0)*z/E; /* Energia potencial (MP, LI y LE) */ if(z>depC) i++; for(k=0;k<Np;k++) { if((W=Segmento(z,k))>0.0) { his[0][k]+=W; his[1][k]+=W*EC; his[2][k]+=W*Qv; his[3][k]+=W*g; } } n++; } fclose(adat); mu=(double)i/(double)n; Pf+=mu; for(j=0;j<n-1;j++) { EC=pow(cs1*fabs(Qv)+R*R*R,1.0/3.0); tc1=EC*EC*EC/1.5; tc2=EC*EC/4.0; DVC=(double)n*(1.0-4.0*M_PI*b*b*b/(3.0*Vp)); /* Nj */ DVC=Ri*(1.0-Vv*DVC/Vp)+Qv*DVC/Vp; /* tildeRho_j */ DVC=DVC*R/2.0; /* tRj*R/2 */ Sie=Sic=0.0; for(i=0;i<n-1;i++) { if(i!=j) { for(k=0;k<3;k++) dr[k]=pos[k][j]-pos[k][i]; if(fabs(dr[0])>Le2) dr[0]-=copysign(L,dr[0]); if(fabs(dr[1])>Le2) dr[1]-=copysign(L,dr[1]); rji=sqrt(dr[0]*dr[0]+dr[1]*dr[1]+dr[2]*dr[2]); 119 if(rji<2.0*R) rji=2.0*R; /* Quita el solapamiento */ g=rji/R; Sie+=0.5*S*log(g*g-1.0)-DVC*(g*log(1.0-1.0/(g*g))+log((g+1.0)/(g-1.0))); if(rji<=2.0*EC) { g=rji*rji; Sic+=tc1*rji-tc2*g+g*g/96.0; } }} g=n*(1.0-4.0*M_PI*b*b*b/(3.0*Vp)); /* tNj */ g=Ri*(1.0-Vv*g/Vp)+Qv*g/Vp; /* tRj */ Sie*=(Qv-g*Vv)*R/E; /* Uj */ g=Sie+p*Sic; /* UTj */ z=pos[2][j]; for(k=0;k<Np;k++) his[3][k]+=Segmento(z,k)*g; } tc1=tc2=Sie=Sic=0.0; velX=velY=velZ=DVC=-1.0; W=H/(double)Np; for(k=0;k<Np;k++) { rji=W*(double)k; g=fabs(his[0][k]); if(g>tc1) { tc1=g; velX=rji; } g=fabs(his[1][k]); if(g>tc2) { tc2=g; velY=rji; } g=fabs(his[2][k]); if(g>Sie) { Sie=g; velZ=rji; } g=fabs(his[3][k]); if(g>Sic) { Sic=g; DVC=rji; } } sprintf(data,"data/%s_%d.pf",almacen,t); if((adat=fopen(data,"w"))!=NULL) { tc1=tc2=Sie=Sic=Vp; for(k=0;k<Np;k++) fprintf(adat,"%e\t%e\t%e\t%e\n",his[0][k]/tc1,his[1][k]/tc2,his[2][k]/Sie,his[3][k]/Sic); fclose(adat); } fprintf(amax,"%d\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\t%lf\n",t,mu,velX/H,velY/H,velZ/H,DVC/H); }} t=1+(int)((double)PT/(double)PG); printf("\n:)\n\t Porcentaje de vesiculas en deposito = %lf.\n:)\n",100.0*Pf/(double)t); close(amax); sprintf(secuencia,"ls -l data/%s_maxim.dat",almacen); system(secuencia); // free(his); } E.3 Cálculo de promedios por sección de datos. #include <stdio.h> #include <stdlib.h> #include "mlg03.h" int main(numero,arg) int numero; char *arg[]; { int i,j,fin,k,l,NC,*sectores,lineas; double actual,*valores,resto; FILE *archivo,*destino; char arde[32]; if(numero!=3 && numero!=4) { printf("\nNumero de parametros invalido."); printf("\nEjecute ./pros.x [archivo] LS1,LS2,.... |[columnas]\n"); exit(-1); } if((archivo=fopen(arg[1],"r"))==NULL) { printf("\nNo se puede abrir el archivo [%s].\n",arg[1]); exit(-2); } sprintf(arde,"%s.sp",arg[1]); if((destino=fopen(arde,"w"))==NULL) { printf("\nNo se puede abrir el archivo [%s].\n",arde); exit(-3); } sectores=VNE(arg[2],’,’); NC=1; if(numero==4) sscanf(arg[3],"%d",&NC); valores=(double *)calloc(NC,sizeof(double)); for(i=1;i<=sectores[0];i++) { if(i!=sectores[0]) fin=sectores[i]; else fin=-1; l=0; for(k=0;k<NC;k++) valores[k]=0.0; for(j=0;j<fin || fin<0;j++) { l++; for(k=0;k<NC;k++) { if(fscanf(archivo,"%lf",&actual)>=0) valores[k]+=actual; else { k=NC; fin=0; } }} if(l!=0) { 120 for(k=0;k<NC;k++) fprintf(destino,"%lf\t",valores[k]/(double)l); fprintf(destino,"\n"); }} fclose(archivo); fclose(destino); } E.4 Libreria común (“mlg03.h”). #define MaxEnt 2147483646 /* Maximo entero */ #define MaxPoints 2146258927 /* Maximas casillas en un vector */ int PreInt(msg,desde,hasta) char msg[32]; int desde,hasta; { /* Leida y validada */ int valor; do { printf(msg); valor=0; scanf("%d",&valor); } while(valor<desde || valor>hasta); return(valor); } double PreDou(msg,desde,hasta) char msg[32]; double desde,hasta; { /* Leida y validada */ double valor; do { printf(msg); valor=0.0; scanf("%lf",&valor); } while(valor<desde || valor>hasta); return(valor); } char *PreStr(msg,L) char msg[32]; int L; { /* Leida y no validada */ char *VC=(char *)calloc(L,sizeof(char)); printf(msg); scanf("%s",VC); return(VC); } int MaxInt(valor1,valor2) int valor1,valor2; { /* Maximo entre dos valores */ if(valor1>valor2) return valor1; return valor2; } int MinInt(valor1,valor2) int valor1,valor2; { /* Minimo entre dos valores */ if(valor1<valor2) return valor1; return valor2; } char *Trozo(cadena,ini,fin) char *cadena; int ini,fin; { /* Devuelve un trozo de cadena */ int i; char *pedazo; if(ini>fin) return NULL; pedazo=(char *)calloc(fin-ini+1,sizeof(char)); for(i=ini;i<=fin;i++) pedazo[i-ini]=cadena[i]; return pedazo; } int Nchar(cadena,caracter) char *cadena,caracter; { /* Cuenta caracteres en una cadena */ int i=0,j=0,c=(int)caracter; while(cadena[i]!=0) { if(cadena[i]==c) j++; i++; } return j; } double *VectorizacionNumerica(cadena,separador) char *cadena,separador; { int nc=Nchar(cadena,separador),i=0,j=0,s=(int)separador,k=1; double *VN; VN=(double *)calloc(nc+2,sizeof(double)); while(cadena[i]!=0) { if(cadena[i]==s) { sscanf(Trozo(cadena,j,i-1),"%lf",&VN[k]); k++; j=i+1; } i++; } sscanf(Trozo(cadena,j,i+1),"%lf",&VN[k]); VN[0]=(double)(nc+2); return VN; } int *VNE(cadena,separador) char *cadena,separador; { /* Vectorizacion numerica entera */ int *vector,n,i; double *VND; VND=VectorizacionNumerica(cadena,separador); n=(int)VND[0]; vector=(int *)calloc(n,sizeof(int)); for(i=0;i<n;i++) vector[i]=(int)VND[i]; return vector; } double Aleatorio(n1,n2) double n1,n2; { return(n1+(n2-n1)*(double)rand()/(double)RAND_MAX); }

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