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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
AISLAMIENTO Y SEROTIPIFICACIÓN DE Salmonella Enteritidis,
Typhimurium, E Infantis EN CARCASAS DE POLLO DESTINADAS PARA
CONSUMO HUMANO EN UN CAMAL INDUSTRIALIZADO DE LA
PROVINCIA DE PICHINCHA.
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar el título de
Médico Veterinario Y Zootecnista.
AUTORA:
Sandra Daniela Villagómez Estrada
TUTOR:
Dr. Christian Vinueza MSc.
Quito, 30 de Julio 2015
DEDICATORIA
A mi Madre y Padre por su amor, enseñanza, ejemplo de valentía y
superación constante.
A mi hermana por todo el apoyo y calor de hogar brindado en estos años
juntas, en la persecución de nuestras metas, lejos de nuestros padres.
A Diego y a mis amigos por todo el cariño, paciencia y apoyo durante este
tiempo juntos.
Sandra Villagómez
ii
AGRADECIMIENTO
A mis padres Ernesto, Ligia y a mi hermana Mariela por el amor, confianza, y
apoyo que me brindaron en este arduo camino.
A la empresa productora por la apertura al realizar esta investigación.
A mi tutor Dr. Christian Vinueza por la oportunidad de ser parte del proyecto,
y el apoyo durante la elaboración de este trabajo.
A los Drs. María Belén Cevallos, María Inés Baquero y Carlos Gómez por sus
enseñanzas y apoyo en el trabajo de laboratorio.
A mis amigos por todas las vivencias, alegrías y esfuerzos juntos a lo largo
de la consecución de nuestro sueño Veterinario.
A los integrantes del Laboratorio de Bacteriología y del Proyecto ETAS de la
Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Central por los buenos
momentos compartidos en este tiempo.
iii
iv
v
vi
ÍNDICE
CONTENIDO
pp
DEDICATORIA ................................................................................................ ii
LISTA DE CUADROS ................................................................................... viii
LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................... ix
RESUMEN ...................................................................................................... x
INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1
CAPÍTULO I .................................................................................................... 3
EL PROBLEMA............................................................................................... 3
Planteamiento del Problema ........................................................................ 3
Justificación ................................................................................................. 6
CAPÍTULO II ................................................................................................... 9
MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 9
Antecedentes de la investigación ................................................................ 9
Fundamentación Teórica ........................................................................... 10
CAPÍTULO III ................................................................................................ 44
METODOLOGÍA ........................................................................................... 44
Determinación de Métodos a utilizar.......................................................... 44
Diseño de la investigación ......................................................................... 44
Descripción de la zona de estudio ............................................................. 44
CAPÍTULO IV................................................................................................ 54
RESULTADOS.............................................................................................. 54
Presentación de Resultados ...................................................................... 54
CAPÍTULO V................................................................................................. 62
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................ 62
Conclusiones ............................................................................................. 62
Recomendaciones ..................................................................................... 63
REFERENCIAS BIBLOGRÁFICAS............................................................... 64
ANEXOS ....................................................................................................... 80
vii
LISTA DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación científica de Salmonella................ ………………….12
Cuadro 2. Especies y Subespecies de Salmonella, y su hábitat .................. 13
Cuadro 3. Serotipos y Serogrupos de Salmonella de la investigación ......... 13
Cuadro 4. Serotipos de Salmonella y sus hospedadores............................. 15
Cuadro 5. Especies de Salmonella y enfermedades que causan en seres
humanos y aves ............................................................................................ 16
Cuadro 6. Prevalencia de Salmonella en carne de pollo en distintos paises
..................................................................................................................... .19
Cuadro 7. Caracterísiticas de las colonias de Salmonella en
medios selectivos ......................................................................................... 37
Cuadro 8. Interpretación de pruebas bioquimicas. ....................................... 38
Cuadro 9. Esquema de Kauffmann-White de los serotipos Enteritidis,
Typhimurium e Infantis. ................................................................................. 40
Cuadro 10.Número de muestras de piel y sacos ciegos tomados por pool
y muestreo .................................................................................................... 46
Cuadro 11. Muestras positivas a Salmonella spp. en contenido cecal y piel
...................................................................................................................... 56
Cuadro 12. Resultados obtenidos de Serotipificacion de cepas aisladas de
muestras de piel y sacos ciegos ................................................................... 58
viii
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Mecanismos usados por Salmonella para internalizarse en las
celulas hospedadoras ..................................................................................... 28
Gráfico 2. Esquema de toma de muestras en planta de faenamiento ........... 47
Gráfico 3. Medios utilizados en el aislamiento de Salmonella spp ................. 54
Gráfico 4. Resultados de Batería Bioquímica ................................................ 55
Gráfico 5. Resultados de muestras de contenido cecal positivas a
aislamiento de Salmonella ssp. en cada muestreo ........................................ 55
Gráfico 6. Resultado de muestras de piel positivas a aislamiento de
Salmonella ssp. en cada muestreo ................................................................ 56
Gráfico 7. Resultado de muestras caracteristicas de serotipificación. ........... 57
ix
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AISLAMIENTO Y SEROTIPIFICACIÓN DE Salmonella Enteritidis,
Typhimurium, E Infantis EN CARCASAS DE POLLO DESTINADAS PARA
CONSUMO HUMANO EN UN CAMAL INDUSTRIALIZADO DE LA
PROVINCIA DE PICHINCHA.
Autor: Sandra Daniela Villagómez Estrada
Tutor: Dr. Christian Vinueza MSc.
Fecha: Julio, 2015
RESUMEN
La salmonelosis es una de las zoonosis de mayor importancia económica ya
que juega un papel importante en la salud pública y en particular en la
seguridad alimentaria. En la mayoría de casos se asocia como agentes
causales a la especie Salmonella enterica serotipos Enteritidis, Typhimurum
e Infantis, siendo las aves el principal reservorio. El proceso de faenamiento
favorece la diseminación de microorganismos y pueden aumentar la
frecuencia de Salmonella spp. en el producto final. El objetivo del presente
estudio fue aislar y tipificar serológicamente S. Enteritidis, S. Typhimurium y
S. Infantis en carcasas de pollo destinadas a consumo humano en un camal
industrializado en la provincia de Pichincha, Ecuador, mediante métodos
microbiológicos y serológicos, para ello se tomaron 15 muestras de piel de
pechuga después de su faenamiento, contenidas en 5 pools y 25 sacos
ciegos representados en 1 pool de contenido cecal después de la
evisceración. Finalizado los dos meses de muestreo se obtuvo 75 muestras
de piel conformadas en 25 pools y 5 pools de heces. Las muestras fueron
pre-enriquecidas, enriquecidas de forma selectiva y aislada según la norma
ISO 6579. De las 25 muestras 20 (80%) fueron positivas a Salmonella spp.
Los resultados de la tipificación serológica para identificar las especies de S.
Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis se realizó en nueve cepas (37.5%)
de las cuales el 100% fue S. Infatis. En conclusión el alto número de
aislamientos de Salmonella spp. y la presencia notable del serotipo Infatis en
carcasas de pollo destinadas a consumo humano en un camal industrializado
en la Provincia de Pichincha es un problema importante de salud pública, por
esta razón se recomienda realizar otros estudios en carcasas de pollo que
permitan obtener más datos sobre esta enfermedad en el Ecuador.
Descriptores:
SALMONELLA ENTERITIDIS/ TYPHIMURIUM / INFANTIS/ CARCASAS DE
POLLO DE ENGORDE/ PICHINCHA/ SEROTIPIFICACIÓN.
x
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ISOLATION AND SEROTYPING OF Salmonella Enteritidis,
Typhimurium and Infantis IN CARCASSES POULTRY INTENDED FOR
HUMAN CONSUMPTION AT INDUSTRIAL SLAUGHTERHOUSE IN
PICHINCHA PROVINCE.
ABSTRACT
Salmonellosis is one of the most economically important zoonosis that is
playing an important role in public health and particularly on food security. In
most cases it is associated as causal agents to the species Salmonella
enterica serotype Enteritidis, Typhimurum and Infantis birds are the main
reservoir. The slaughtering process favors the spread of micro-organisms and
may increase the frequency of Salmonella spp., in the final product. The aim
of this study was to isolate and characterize serologically S. Enteritidis, S.
Typhimurium and S. Infantis in poultry carcasses destined for human
consumption in an industrial slaughterhouse in the province of Pichincha,
Ecuador, using microbiology and serological methods, for this was taken 15
skin samples from breast after its slaughter. It is contained in 5 pools and 25
caeca represented in 1 pool of cecal contents after evisceration. After
completed two months of sampling was obtained 75 samples of skin formed
in 25 pools and 5 pools of stool. The samples were pre-enriched, fortified
selectively and isolated according to the standard ISO 6579. From the 25
samples 20 (80 %) were positive for Salmonella spp. Results of the
serological typing to identify the species of S. Enteritidis, S. Typhimurium and
S. Infantis is held in nine strains (37.5 %) of which 100% was S. Infatis. In
conclusion, the high number of Salmonella spp. isolates, and the significant
presence of the serotype Infatis in poultry carcasses destined for human
consumption from industrial slaughterhouse in Pichincha province, is an
important public health problem, for this reason further research in poultry
carcasses is recommended to obtain more information about this disease in
Ecuador.
Keywords:
SALMONELLA ENTERITIDIS/ TYPHIMURIUM/
CARCASSES/ PICHINCHA/ SEROTYPING
xi
INFANTIS/
POULTRY
INTRODUCCIÓN
La salmonelosis es una enfermedad de amplia distribución causada por
bacterias
del
género
Salmonella,
que
pertenecen
a
la
familia
Enterobacteriaceae (WHO, 2013). Este género está dividido en dos especies:
Salmonella enterica, dividida en seis subespecies, y Salmonella bongori. La
mayoría de serotipos zoonóticos pertenecen a la subespecie enterica, entre
ellos S. Enteritidis, Typhimurium, e Infantis (ECDC, 2014).
Son bacterias gram negativas aerobias o anaerobias facultativas, en forma
de bastón o bacilo. Estos microorganismos son conocidos como “patógenos
universales”, por tener un amplio rango de hospedadores (D’Aoust & Maurer,
2007).
Una amplia gama de productos alimenticios se reconocen como posibles
fuentes de infección de Salmonella spp. humana, pero los productos de aves
de corral han sido identificados como la vía de transmisión más importante
(Kimura et al., 2004).
La contaminación con Salmonella spp. de los productos avícolas puede
ocurrir en varias etapas a lo largo de la cadena alimentaria como: materias
primas para la alimentación animal, granjas de producción, plantas de
sacrificio, centros de elaboración de productos cárnicos, distribución,
comercialización, manipulación y preparación (El-Aziz, 2013). Las plantas de
faenamiento son uno de los puntos más críticos en la contaminación de las
carcasas por Salmonella spp., pues al momento del sacrificio el contenido
intestinal, con altas cargas de microorganismos, puede eventualmente
contaminar la carcasa de los animales por errores en su manipulación o
fallas en la logística del procesamiento.
El enfoque normativo estadounidense en la industria avícola para el control
de patógenos de transmisión alimentaria se centra principalmente en las
1
plantas de procesamiento, pues la presencia de estos organismos en las
aves de corral está afectando la salud pública y el comercio. Es así que
recientemente la detección de Salmonella spp. en productos avícolas
condujo al rechazo de grandes partidas de carne de ave cruda (Berghaus et
al., 2013).
El Centro Europeo para el Control y la Prevención de Enfermedades en el
año 2011 y 2012 estimo la prevalencia de salmonelosis en 31% y 28,96%
respectivamente, siendo S. Enteritidis y S. Typhimurium los organismos
aislados más predominantes en los casos de salmonelosis humana
asociados con el consumo de productos de aves de corral (ECDC, 2013;
ECDC, 2014).
El presente estudio aplicó las técnicas microbiológicas y serológicas
establecidas en el laboratorio de Bacteriología y Micología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia para el aislamiento y serotipificación de
Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis en carcasas de pollos
faenados en un camal industrializado en la provincia de Pichincha.
2
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
La salmonelosis es una de las enfermedades de transmisión alimentaria más
común y mundialmente distribuida, que es causada por la bacteria
Salmonella spp. (OIE, 2010). Se estima que decenas de millones de casos
de salmonelosis humana se producen en todo el mundo cada año y que más
de cien mil casos terminan en muerte (WHO, 2013).
Entre las formas de transmisión más común de salmonelosis, está el
consumo de agua y alimentos contaminados, tanto de origen vegetal como
animal. Dentro de los alimentos de origen animal se ha determinado que el
consumo de leche, huevos y carne de pollo son las principales fuentes de
salmonelosis (FAO/WHO, 2013).
Por su parte la carne de aves se ha convertido en uno de los alimentos más
populares pues la globalización, la apertura económica y el desarrollo de la
industria avícola han permitido un incremento de la producción, distribución,
consumo y por ende la posible transmisión de patógenos como Salmonella
spp. (Suárez & Mantilla, 2000). La contaminación puede darse a lo largo de
toda la cadena de producción desde la granja hasta el matadero (FAO/WHO,
2013), es así que un gran porcentaje de pollos son colonizados por el
microorganismo durante el periodo de crecimiento, la piel y la carne de las
canales a menudo quedan contaminadas por el agente patógeno durante el
sacrificio (OMS, 2002).
3
Los mecanismos de defensa del ave contra los microorganismos como la
Salmonella spp. se pierden con la sangre durante el sacrificio (desangrado),
por lo que es necesario e imprescindible tomar medidas para reducir la
contaminación microbiana existente y minimizar su crecimiento y actividad
durante el faenamiento (López et al., 2004).
Dentro de la planta de faenamiento las operaciones que se sabe aumentan la
contaminación son: escaldado, desplume y evisceración. El desplume y la
evisceración son los puntos críticos de control más importantes durante el
proceso, por la relación directa de una posible ruptura del intestino durante la
evisceración (FAO, 2009). Concluyendo de esta manera en la contaminación
de las canales, que si no tienen un tratamiento térmico adecuado serán las
causantes de salmonelosis en los consumidores.
Es así que a nivel de la Unión Europea en el 2011 la salmonelosis constituyó
el 31% de todos los brotes reportados en humanos (ECDC, 2013). Durante el
mismo año en Estados Unidos la salmonelosis fue la segunda causa más
común de las ETA´s en humanos (11%), además fue la primera causa de
hospitalizaciones y muertes (CDC, 2013).
Según la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y
Agricultura (FAO) en los últimos dos decenios, Salmonella Enteritidis ha
llegado a ser una variante sérica causante de infecciones en seres humanos,
siendo la fuente principal del patógeno: los huevos y carne avícola, debido a
la capacidad excepcional de esta variante sérica de colonizar la piel y la
carne de las canales durante el crecimiento, sacrificio y elaboración de
subproductos (FAO, 2008). Cerca del 50 % de las epidemias de salmonelosis
son el resultado de la transmisión por aves y productos avícolas
contaminados (Koneman, 2013).
El Centro Europeo para la prevención y control de enfermedades, en el año
2012 determinó que los cinco serotipos más comúnmente reportados como
causantes de salmonelosis humana fueron: S. Enteritidis (41.3%), S.
4
Typhimurium (22.1%),
S. Typhimurium monofásico (7.2%),
S.
Infantis
(2.5%), y S. Stanley (1.4%) (ECDC, 2014).
Durante Septiembre del 2004 a Julio del 2006 se llevó a cabo en Brasil el
estudio de datos del Programa Nacional de Brasil para la Supervisión de la
Prevalencia de la Resistencia Bacteriana en Pollos (PREBAF), en la que se
determinó una prevalencia de Salmonella spp. de 2.7%, identificándose 18
serotipos, siendo los más frecuentes S. Enteritidis (48.8%), S. Infantis (7.6%),
S. Typhimurium (7.2%) y S. Heidelberg (6.4%) de un total de 2 679 canales
examinadas (Medeiros et al., 2011).
En Ecuador, según la Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador
(CONAVE) el consumo anual per cápita de carne de pollo en el año 2013 fue
de 35 kg, y al ser la carne de pollo contaminada una de las principales
fuentes de salmonelosis consideramos de gran interés su estudio, sobre todo
al no existir estudios previos en el país sobre el Aislamiento y Serotipificación
de Salmonella Enteritidis, Typhimurium, e Infantis en carcasas de pollo
destinadas para consumo humano en un camal industrializado de la
provincia de Pichincha.
5
Justificación
La salmonelosis es una de las zoonosis de mayor importancia económica,
por que juega un papel importante en la salud pública y en particular en la
seguridad alimentaria (OIE, 2010). En la actualidad se reconocen
aproximadamente 2 600 serotipos de Salmonella spp. mediante la
clasificación de Kauffmann–White, sin embargo este número está en
constante aumento (Ryan & Ray, 2004). Los serotipos más comunes que
causan infección en humanos y en animales de abasto pertenecen a la
subespecie enterica (Velge et al., 2012)
Los productos alimenticios provenientes de aves de corral han sido
identificados como la vía de transmisión más importante de salmonelosis en
humanos (Kimura et al., 2004). La contaminación por Salmonella spp. de la
carne de pollo puede ocurrir durante toda la cadena de producción. La
transmisión puede ser de tipo vertical por parte de los reproductores al huevo
y horizontal en la incubadora, granja, transporte al camal y faenamiento, lo
cual conlleva al aislamiento de una mayor variedad de serotipos (Heyndrickx
et al., 2002).
La normativa estadounidense del control de patógenos de transmisión
alimentaria en la industria broiler se centra principalmente en las plantas de
procesamiento, pues la presencia de estos organismos afecta la salud
pública y el comercio, es así que la detección de Salmonella spp. en
productos avícolas estadounidenses condujo al rechazo de grandes partidas
de carne de ave cruda (Berghaus et al., 2013).
La Comisión del Codex Alimentarius (CAC) en el año 2007 elaboró un
conjunto de directrices para el control de Salmonella spp. en aves de corral,
marcando como prioridad la planificación logística en el camal con el fin de
evitar patógenos que pudieran transferirse de un lote a otro por medio de
equipos y operadores. Las prácticas esenciales incluyen la eliminación de la
6
materia fecal y plumas de maquinaria y equipos. Las operaciones que se
sabe aumentan la contaminación son escaldado, desplume y evisceración,
por la relación directa de la contaminación fecal (FAO/WHO, 2009).
El estudio de la estructura antigénica del género Salmonella permite tipificar
las bacterias que lo componen en serovariedades (serotipos). De esta
manera la serotipificación es un importante complemento de la identificación
bioquímica y se basa en el esquema de Kauffman-White mediante la
determinación de los antígenos propios de cada cepa (OMS, 2009).
A nivel mundial a través de la historia se ha concluido que la propagación de
S. Enteritidis y S. Typhimurium aumentó a partir de la segunda mitad del siglo
XX, es así que en algunos países los problemas de salmonelosis han
incrementado 20 veces entre las décadas de 1980 y 1990, y aunque existen
ejemplos de países que han logrado limitar y aun revertir estos
acrecentamientos, se ha determinado que a nivel de la Unión Europea y
México más del 70% de casos en humanos fueron ocasionados por S.
Enteritidis, S. Typhimurium, S. Hadar, S. Derby, S. Agona, S. Anatum.
(Bäumler et al., 2000; Wierup M et al., 1995; Velge, Cloeckaert, & Barrow,
n.d.; Gutiérrez–Cogco L et al., 2000)
En Brasil, se determinó que de un total de 82 cepas de Salmonella spp.
aisladas de granjas de pollo de engorde el 14.63% corresponde al serotipo S.
Infantis, ubicándola como el segundo serotipo más frecuente (Voss-Rech et
al., 2015).
Por su parte en Ecuador investigaciones extra oficiales de serotipificación de
cepas aisladas de Salmonella spp. en la Provincia de Pichincha, reportaron
una notable incidencia de S. Infantis, catalogándola como un serotipo
prevalente en la zona (Com.pers., Vinueza C., 2015), razón por la cual la
presente
investigación
consideró
dicho
epidemiológica.
7
serotipo
y
su
importancia
Así, a la culminación de la presente investigación la información que se
generó permitió a la empresa productora tomar decisiones para el control y
erradicación de Salmonella spp. reduciendo de esta manera los costos
asociados con interrupciones en el comercio, y decomiso de productos no
aptos para consumo humano, conforme a los parámetros establecidos en la
Norma INEN 1338:2010 segunda revisión, beneficiando finalmente a los
consumidores, al contribuir en la disminución del impacto de la salmonelosis
en la salud humana.
Objetivos
Objetivo General:
Identificar S. Enteritidis, S. Typhimurium y S. Infantis en carcasas de pollo
destinadas al consumo humano en un camal industrializado en la Provincia
de Pichincha.
Objetivos Específicos
•
Identificar mediante cultivo bacteriológico y de enriquecimiento
Salmonella enterica en muestras de carcasas de pollo después de su
faenamiento en un camal industrializado en la Provincia de Pichincha.
•
Serotipificar cepas de Salmonella Enteritidis, Typhimurium e Infantis,
obtenidas mediante cultivo utilizando el esquema de Kauffman White.
8
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes de la investigación
En Ecuador se han realizado investigaciones relacionadas a la salmonelosis,
entre ellas la influencia de salmonelosis en los huevos comerciales de gallina
(Estrada & Valencia, 2012; Sánchez, 2013), en sacos ciegos de aves
(Valseca, 2014; Larco, 2015), monitoreo en pollos bebe (Melo, 2015), en
estudios experimentales de alimentación avícola (Guevara & Pijal, 2012) y en
alimentos cárnicos (Paucar & Tenecora, 2013). Sin embargo con respecto al
aislamiento y serotipificación de Salmonella spp. en carne de pollo no se ha
realizado ningún estudio previo, a pesar de ser la salmonelosis en el Ecuador
una de las enfermedades de notificación obligatoria.
El brote histórico más grande de salmonelosis humana en Estados Unidos
ocurrió en 1985 en Illinois y estados circundantes, con 16 000 casos
confirmados por cultivo, con datos epidemiológicos que indicaban que se
infectaron en realidad 150 000 a 20 0000 personas, por una válvula
defectuosa de suministro de leche (Koneman, 2013).
En el Reino Unido la salmonelosis aumento drásticamente entre el año 1969
y 1999, con 151 casos y 6700 casos respectivamente, predominando el
serotipo S. Enteritidis (OMS, 2008).
Entre los años 1989 y 2000, los dos serotipos más frecuentes aislados en
reportes de infecciones en Uruguay, fueron S. Typhimurium (50,28%) y
9
S. Enteritidis (20,86%), determinando que el 80% de las cepas de animales
fueron aisladas de aves de granja (OPS/OMS, 2008).
En México durante el año 2008 se registraron 122 422 casos de
salmonelosis humana (Hernández, Aguilera, & Castro, 2011).
Por su parte la historia ecuatoriana con respecto a la salmonelosis humana
no es disímil a la ocurrida en otros países, pues en el año 1990 se reportaron
9 908 casos de salmonelosis; en el 2001 esta cifra aumentó bruscamente a
18 772, período desde el cual el número ha ido disminuyendo
paulatinamente con 3 286 casos en el 2008 (MSP, 2008). En el 2014 los
casos de salmonelosis fueron 3 164, que en su mayoría fueron reportados
por las provincias Guayas,
Manabí y Los Ríos (75.3%), siendo el grupo
poblacional más afectado entre 20 a 49 años, mayoritariamente de sexo
femenino (MSP, 2014). Durante los tres primeros meses del año 2015 se
reportaron 782 casos de salmonelosis (MSP, 2015). La información
reportada nos permite concluir que la salmonelosis sigue siendo una de las
enfermedades de mayor ocurrencia en nuestro país, especialmente en las
provincias de la región Litoral, ya sea por las condiciones de salubridad o por
su nivel de educación que no permite mejorar sus costumbres alimenticias.
Fundamentación Teórica
Historia de Salmonella
En el año 1874, William Budd fue el primero en relacionar que las fiebres
tifoideas habían sido transmitidas por el agua y los alimentos. Salmonella
Typhi, agente etiológico de la enfermedad, fue descubierta en el año 1880
por Eberth y el microorganismo fue aislado en 1884 por Gaffky (ICMSF,
1996). El nombre del género fue acuñado por Ligniéres en el año 1900 en
honor a los trabajos realizados por el doctor D.E Salmon, bacteriólogo
americano que aisló y caracterizó los bacilos causantes del cólera del cerdo
(ICMSF, 1996).
10
La primera vez que un laboratorio confirmó un brote de toxiinfección
alimentaria provocado por salmonelosis, se vieron implicadas 57 personas
que comieron carne de un animal enfermo. Salmonella Enteritidis fue aislada
de los órganos de una de las personas fallecidas y de la carne y la sangre
del animal (ICMSF, 1996). Desde entonces la Salmonella spp. ha sido
reconocida como la mayor causante de fiebres entéricas y gastroenteritis.
Entre otros eventos relacionados con este patógeno se encuentra el famoso
caso de Mary Mallon, también conocida como “María la Tifosa”, ejemplo claro
de un portador crónico, siendo la primera persona en ser identificada como
una portadora sana de Fiebre Tifoidea en Estados Unidos. Ella trabajó como
cocinera en Nueva York y en Long Island a comienzos del siglo XX, en casas
de huéspedes e instituciones de beneficio. En análisis realizados en las
heces de esta mujer, se hallaron gran cantidad de Salmonella Typhi, agente
etiológico de la fiebre tifoidea. Ella se opuso a recibir tratamiento y escapó de
las autoridades sanitarias cuando determinaron que constituía un foco de
infección. En Nueva York, infectó a 22 personas, pasó por diferentes familias,
diseminando el agente, cambió su nombre e infectó a 25 personas más, y
causó dos muertes. Un tiempo después fue capturada, conducida a prisión y
permaneció bajo custodia en Nueva York durante 23 años. Falleció en 1938,
por neumonía no relacionada a Salmonella spp. (Brock, 1999).
Taxonomía de Salmonella
El género Salmonella está ampliamente distribuido en la naturaleza sin
embargo su nomenclatura es bastante controvertida. En el año 2005
Salmonella enterica obtuvo finalmente la aprobación oficial para ser
considerada como especie del género Salmonella (Agbaje et al., 2011).
Además, otra especie ha sido aprobada y reconocida en el género
Salmonella, a saber, Salmonella bongori que por estudios de hibridación de
ADN se constató que es una especie distinta (Análisis Microbiológico de los
Alimentos, 2011). Adicionalmente la OIE propuso una tercera especie,
Salmonella subterranea, tras el aislamiento de una única cepa ambiental
11
poco usual (OIE, 2008). Continuamente se descubren nuevos serotipos y sus
fórmulas antigénicas se basan en el esquema de Minor White-Kauffmann-Le
actualizadas por el Centro Colaborador de la Organización Mundial de la
Salud para Referencia e Investigación de Salmonella en el Instituto Pasteur,
París, Francia (Agbaje et al., 2011).
Cuadro 1. Clasificación científica de Salmonella
Dominio
BACTERIA
Filo
Proteobacteria
Clase
Gammaproteobacteria
Orden
Enterobacteriales
Familia
Enterobacteriaceae
Género
Salmonella
Tomado de: Koneman, 2013
Elaboración: La Autora
La especie enterica comprende seis subespecies, que incluyen más del 99%
de los serotipos más frecuentemente aislados en infecciones en humanos y
animales superiores (Uzzau et al., 2000).
12
Cuadro 2. Clasificación de las especies, subespecies de Salmonella y su
hábitat.
Especie
Subespecie
Hábitat
Salmonella enterica
enterica
Hombre
(I)
Animales de sangre
caliente
salamae
(II)
arizonae
(III a)
diarizonae (III b)
houtenae
(IV)
indica
(VI)
Salmonella bongori
Animales de sangre
fría
Medio ambiente
Animales de sangre
fría
Tomado de: Stanchi, 2007
Elaboración: La Autora
Cada subespecie a su vez se conforma de varios serotipos, habiéndose
identificado más de 2 500 mediante la clasificación de Kauffmann–White
(OIE, 2010). En el caso específico y de interés en la presente investigación
de S. enterica subsp. enterica se divide en cinco serogrupos: A, B, C, D y E,
a su vez cada serogrupo comprende múltiples serovariedades o serotipos.
Entre los que se ubican los de interés de esta investigación como se observa
en el siguiente cuadro.
Cuadro 3. Clasificación de serogrupos y serotipos a investigar.
Especie
Subespecie
Serogrupo
Serotipo
Salmonella enterica
enterica (I)
D
Enteritidis
B
Typhimurium
C
Infantis
Tomado de: Manual Antisueros Difco, 2012
Elaboración: La Autora
13
Morfología
Su morfología corresponde a la de la familia Enterobacteriaceae, se trata de
bastones Gramnegativos, de 0.7 a 1.5 μm de ancho y 2.0 a 5 μm de largo,
móviles por flagelos distribuidos en forma perítrica. Únicamente dos especies
son inmóviles: S. Gallinarum y S. Pullorum, responsables del tifus aviar y
pullorosis respectivamente, aunque el fenómeno de inmovilidad también
puede presentarse en algunas cepas de otras subespecies de Salmonella
debido a la perdida de sus flagelos. Son anaerobios facultativos y no
formadores de esporas (Stanchi, 2007).
La Salmonella es oxidasa negativa, catalasa positiva, positivo para las
pruebas de rojo de metilo, citrato, fermentación de la glucosa, arginina
dihidrolasa y decarboxilación de lisina y ornitina, negativa para las pruebas
de indol, voges proskauer y ureasa. Productora de gas y ácido sulfhídrico
(Stanchi, 2007). Al ser una bacteria omnipresente y resistente que puede
sobrevivir en un entorno seco y varios meses en agua (OMS, 2013).
Son bacterias mesófilas, su crecimiento óptimo es a temperaturas entre 35 y
37 ºC, pero en general su rango de crecimiento es de 5 a 46 ºC. Mueren a
temperatura de pasteurización (mayor a 70°C), son sensibles a un pH bajo
(4.5 o menos) aunque prefieren crecer en pH neutro (6,6-8,2) y no se
multiplican a una actividad de agua (Aw) de 0.94. Las células sobreviven
largos periodos en estado de congelación y deshidratación. Tienen la
capacidad de multiplicarse en muchos alimentos sin afectar las cualidades
que lo hacen apetecible (Ray, 2010).
Los distintos serotipos de Salmonella spp. están determinados por los tres
tipos de antígenos: somático (O), flagelar (H) y de virulencia (Vi). Los
antígenos somáticos son lipopolisacáridos componentes de la pared celular,
se han identificado más de 60 antígenos diferentes. Los antígenos flagelares
son proteínas localizadas en el flagelo móvil. El antígeno de virulencia es un
polisacárido termolábil localizado en la cápsula (OIE, 2010).
14
Epidemiología
Los microorganismos integrantes del género Salmonella spp. están
extensamente
diseminados en la naturaleza, como comensales y como
patógenos del aparato digestivo de los animales domésticos y salvajes. Son
frecuentes en animales productores de alimentos, tales como aves de corral,
cerdos, ganado vacuno y en las mascotas, incluyendo perros y gatos, aves y
reptiles como las tortugas (WHO, 2013). Al estar ampliamente distribuidos
existen diferentes serotipos que se han adaptado a varias especies para
causar infección tanto al hombre como a los animales.
Cuadro 4. Serotipos de Salmonella spp. y sus hospedadores.
Serotipos adaptados
Serotipos adaptados a los animales
al hombre
S. Typhi
Aves
S. Pullorum; S. Gallinarum
S. Paratyphi A, B, y C
Ganado Vacuno
S. Dublin
S. Sendai
Ganado Ovino
S. Abortusovis
Ganado Equino
S. Abortusequi
Ganado Porcino
S. Cholerasuis
Tomado de: CReSA, 2008
Elaboración: La Autora
El grado de adaptación a los anfitriones varía entre los serotipos de
Salmonella spp. y determina la patogenicidad. Los serotipos adaptados a los
humanos como S. Typhi y S. Paratyphi A, B, C causan fiebre tifoidea
sistémica sin embargo no son patógenos para los animales. Otros serotipos
son relativamente específicos de un hospedador como S. Typhisuis y S.
Pullorum que son responsables de infecciones sistémicas graves en cerdos y
aves respectivamente (Hoelzer et al., 2011). Algunos serotipos, sobre todo S.
Typhimurium, S. Anatum, y S. Newport, afectan a una amplia gama de
hospedadores, contribuyendo a la difusión inter especie de la infección (Scott
et al., 2009). Serotipos como S. Enteritidis, y S. Typhimurium generalmente
15
causan infecciones gastrointestinales en los seres humanos y en los
animales (Hoelzer et al., 2011).
Cuadro 5. Especies de Salmonella y enfermedades que causan en seres
humanos y aves.
Serotipos
Enfermedad en
Enfermedad en pollos
humanos
Salmonella Typhi
Fiebre tifoidea
No produce enfermedad
Salmonella Paratyphi
Fiebre
No produce enfermedad
paratifoidea
Salmonella Gallinarum
No produce
Tifoidea aviar
enfermedad
Salmonella Pullorum
No produce
Pullorosis
enfermedad
Salmonella Enteritidis
Salmonelosis
Paratifoidea aviar
(Salmonelosis)
Salmonella Typhimurium
Salmonelosis
Paratifoidea Aviar
(Salmonelosis)
Salmonella Infantis
Salmonelosis
Paratifoidea Aviar
(Salmonelosis)
Tomado de: Barrow, 2000; OMS, 2010; OIE, 2008
Elaboración: Melo, 2015
Distribución geográfica y reservorios
Las especies de Salmonella enterica están ampliamente distribuidas en
productos alimenticios, agua y fómites, causando anualmente decenas de
millones de casos con gastroenteritis autolimitada a la fiebre tifoidea en
seres humanos y animales (Velge et al., 2012; OMS, 2013), cobrando
cada año la vida de aproximadamente 2 millones de personas en su
16
mayoría niños, especialmente en países en vías de desarrollo (OMS,
2014)
Los principales reservorios de Salmonella spp. son los animales domésticos
y salvajes, que a menudo transportan y excretan la bacteria sin manifestar
síntomas clínicos (ECDC, 2015), contaminado a los cultivos o a las aguas
superficiales, a través de las heces infectadas (Wiedemann et al., 2015). La
infección por Salmonella spp. en los mamíferos se establece después de la
ingestión de elementos contaminados y depende de la capacidad de las
bacterias para sobrevivir a las renuentes condiciones del tracto gástrico
(Rosselin et al, 2011).
La Organización Mundial de la Salud determina que Salmonella spp. puede
atravesar toda la cadena alimentaria, desde los piensos para animales hasta
los hogares y establecimientos de servicio de comida (OMS, 2013). A partir
de los brotes de salmonelosis ocurridos en la Unión Europea se ha estimado
que el contacto directo con animales o personas infectadas y una amplia
variedad de productos alimenticios de origen animal (huevos, ovoproductos,
carne bovina y porcina) y origen vegetal pueden transmitir la bacteria al
actuar como vehículos o fuentes de infección (ECDC, 2015). Si bien ya se
han mencionado numerosos vehículos potenciales de transmisión, se ha
identificado a la carne de pollo comercial como uno de los vehículos de
trasmisión alimentaria más común e importante (FAO/WHO, 2013).
El Sistema Europeo de Vigilancia de Salmonelosis en el 2013 reporto un total
de 82 694 casos confirmados de salmonelosis lo que resulta en una tasa de
notificación de 20.4 casos por cada 100 000 habitantes, representando una
disminución del 7.9% en comparación con el 2012. (ECDC, 2015)
En el año 2012 el Centro de Prevención y Control de Enfermedades de
Estados Unidos, revelo que del total de enfermedades humanas las
17
Enfermedades de Transmisión Alimentaria representan el 33% y de estas la
salmonelosis constituye el 25%, siendo el patógeno alimentario de la carne
de pollo responsable de la mayoría de hospitalizaciones (CDC, 2012).
En países latinoamericanos Salmonella spp. es uno de los patógenos más
significativos que afectan a la salud de las poblaciones, es así que en Brasil,
de 1999 al 2008, hubo 6602 brotes de enfermedades transmitidas por los
alimentos, y Salmonella spp. estuvo presente en el 43% de los casos ( MS
Brasil, 2008). En México, el Sistema de Vigilancia Epidemiológica en el año
2008 reportó 122 422 casos de salmonelosis humana (MS México, 2009).
En Ecuador la Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica del Ministerio
de Salud Pública reportó durante el año 2014 un total de 3 164 casos de
salmonelosis humana (MSP, 2014). En lo que respecta al 2015 los casos
reportados durante los meses de Enero a Marzo son 782, ocurriendo con
mayor frecuencia en las provincias de Manabí y Guayas (MSP, 2015).
Con respecto a la distribución geográfica de los serotipos de Salmonella spp.
de interés de esta investigación, se ha informado que en la Unión Europea
los serotipos más comunes aislados de infecciones humanas y aviares en el
año 2013 fueron S. Enteritidis y S. Typhimurium. Mientras que los casos de
S. Infantis, el cuarto serovar más común, se incrementaron en un 26,5% en
comparación del año 2012 (ECDC, 2015). En Estados Unidos los principales
serotipos en brotes de salmonelosis humana fueron S. Enteritidis, S.
Typhimurium y S. Newport (CDC, 2012). En México, Gutiérrez-Cogco et al.,
(2000), en su investigación señala que los serotipos más frecuentes en
salmonelosis humana y animal son: S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Derby,
S. Agona y S. Anatum (Gutiérrez-Cogco et al.,2000). En granjas de pollo de
engorde en Brasil de un total de 82 cepas de Salmonella se identificaron 15
serotipos entre los más frecuentes se encuentran S. Minnesota, S. Infantis,
S. Heildelberg y S. Senftenberg (Voss-Rech et al., 2015). En Colombia se
18
identificó a los serotipos S. Paratyphi B tartrato-positivo, S. Heidelberg, S.
Enteritidis, S. Typhimurium, y S. Anatum como los más frecuentes en la
carne de pollo (Donado-Godoy et al., 2014).
La prevalencia de Salmonella spp. en canales de pollo broiler en América
Latina y otros países ha sido reportada en diferentes investigaciones,
resumiéndose en el siguiente cuadro.
Cuadro 6. Prevalencia de Salmonella spp. en carne de pollo en distintos
países.
País
Prevalencia %
Argentina
20
%
Colombia
27
%
Brasil
42
%
Estados Unidos
4,2
%
Reino Unido
4,0
%
España
35,8 %
Bélgica
36
%
Portugal
60
%
Vietnam
53,3 %
China
52,2 %
Tailandia
57
Australia
43,3 %
Nueva Zelanda
3,0
%
%
Tomado de: Jiménez et al., 2002; Donado-Godoy et al., 2012; Fuzihara et
al., 2000; Zhao et al., 2011; Meldrum & Wilson, 2007; Dominguez et al.,
2002; Antunes et al., 2003; Uyytendaele et al., 1999; Pointon et al., 2008;
Van et al., 2007; Yang et al., 2011; Padungtod et al., 2006; Wong et al., 2007
Elaboración: La Autora
Estos datos estadísticos de la presencia de Salmonella spp. tanto en
infecciones de humanos y animales, así como la prevalencia en carne de
19
pollo, proporcionan una idea generalizada de la difusión y la importancia que
representa el monitoreo de este género bacteriano.
Transmisión
La fuente principal de la salmonelosis humana es causada por animales de
granja, que pueden ser frecuentemente portadores intestinales del
organismo. Con mayor frecuencia los cerdos y aves de corral. Los productos
alimenticios como la leche y los huevos pueden contaminarse durante la
recolección con materia fecal (transmisión horizontal) y en el caso de los
huevos también internamente por la vía transovárica (transmisión vertical)
(Oosterom, 1991).
La infección humana se produce cuando los productos animales se manejan
inadecuadamente durante la preparación previa al consumo. En la mayoría
de los casos la infección se relaciona con la contaminación cruzada de la
carne a los alimentos que se consumen sin tratamiento adicional, como el
pan, ensaladas y frutas, la cocción parcial de los productos de origen animal,
o incluso al consumo de productos animales crudos, como el caso de la
carne y la leche (Oosterom, 1991).
La excreción fecal de Salmonella spp. por pacientes humanos y animales
salvajes y domésticos portadores, así como la eliminación de despojos de
masacre y aguas residuales contribuyen a una difusión general de
Salmonella spp. en el medio ambiente. Esto puede dar lugar, a través de la
contaminación de las aguas superficiales y colonización de pájaros, roedores
e insectos, a la contaminación de los alimentos para animales o contribuir
directamente a la recolonización de los animales de granja (Oosterom, 1991)
Transmisión en Plantas de Faenamiento
Logue et al., (2003) en su investigación menciona que la contaminación por
Salmonella spp. de animales domésticos como las aves de corral, se ha
20
demostrado que se produce a nivel de la granja (Bryan
& Doyle, 1995;
Pearson et al., 1996;. Manie et al., 1998; Rajashekara et al., 2000). Como
consecuencia de ello, la transferencia del patógeno entre los animales de la
misma parvada puede ocurrir cuando los niveles de estrés son elevados.
Este ha sido demostrado durante el transporte, donde la materia fecal ha
dado lugar a un aumento de la carga de patógenos (Whyte et al., 2001).
Tales eventos pueden dar lugar a que los animales empiecen el
procesamiento
de
faena
con
cargas
bacterianas
considerablemente
mayores, lo que servirá como una fuente importante de contaminación
cruzada para otros animales y el entorno de procesamiento (Logue et al.,
2003). Debido a que generalmente no hay síntomas de la enfermedad, estos
animales suelen pasar la inspección veterinaria en el camal sin restricciones.
Sin embargo durante el faenamiento, el material intestinal, que a menudo
contienen Salmonella spp., contamina la superficie de las canales, que en
etapas posteriores pueden llevar a la extensa contaminación por Salmonella
spp. de la carne y sus productos (Oosterom, 1991). Estudios han demostrado
que el agua fría y el proceso de enfriamiento (chilling) puede ser una
importante
fuente
de
contagio
de
patógenos
contribuyendo
a
la
contaminación cruzada entre las canales durante el enfriamiento (Izat et al.
1989). Como consecuencia, un pequeño número de canales contaminadas
pueden tener un gran impacto en la difusión de la contaminación. Estudios
similares han demostrado que otros procedimientos, como la manipulación
inadecuada, pueden también contribuir a la contaminación cruzada entre las
canales (Beery et al., 1988). En los últimos años, se ha sugerido que los
trabajadores pueden desempeñar un papel en la promoción de agentes
patógenos durante el procesamiento (Lisle et al., 1998; Rowe et al., 1998;
Norwood & Gilmour, 2000). La contaminación cruzada en los mataderos,
mercados, carnicerías y cocinas puede agravar el problema.
21
Patogenia y Factores de Virulencia
Salmonella spp. es un parásito intracelular que se encuentra en los
macrófagos por medio de los cuales se disemina por todo el organismo
aprovechando la vía linfática y sanguínea (Stanchi, 2007). Una característica
esencial de la patogenicidad de Salmonella spp. es su capacidad para
atravesar los mecanismos de defensa del hospedador por medio de
diferentes etapas: fijación y adhesión a las superficies y la producción de
factores bacterianos (Velge et al., 2012;Wiedemann et al., 2015).
Adhesión a la superficie de los hospedadores
La adhesión es considerado uno de los primeros acontecimientos cruciales
en la colonización exitosa de Salmonella spp. (Cevallos et al., 2012). En los
animales, la adhesión bacteriana ocurre cuando Salmonella spp. interactúa
con las células eucariotas antes de la invasión o cuando las bacterias inician
la formación de biopelículas en superficies de acogida, tales como epitelio
intestinal. Para adherirse fuertemente a las superficies, los serotipos de
Salmonella spp. utilizan varios componentes de la misma (Wiedemann et al.,
2015). Las diferentes estructuras que utiliza Salmonella spp. para adherirse
se describen a continuación.
 Estructuras fimbriales
Las fimbrias son apéndices superficiales proteicos de 0,5-10 μ de longitud y
2-8 nm de ancho, en su parte distal contiene una proteína que interactúa con
su receptor de acogida. De este modo se da la mediación de la adhesión de
las bacterias a los hospedadores o superficies inertes. En la actualidad son
más de 10 operones fimbriales los que han sido identificados en los genomas
de Salmonella spp. y el número y tipo de estos operones fimbriales
dependen del serotipo (Wiedemann et al., 2015). Debido a las dificultades
encontradas para estudiar las fimbrias, su respectivo receptor de células y
tipos celulares específicos en sus huéspedes animales, las fimbrias son
conocidas sólo en pocos serotipos. La fimbria Tipo I, que contribuye a la
22
colonización intestinal del ratón, cerdo y pollo, se caracteriza por
hemaglutinación, aglutinación de levadura, y la unión a células eucariotas
que expresan el receptor α-D-manosa (Van Asten & Van Dijk, 2005). Algunas
fimbrias también contribuyen a la formación de biopelícula en los animales y
las plantas, sobre todo la fimbria curli. Se requiere estos tipos de fimbrias
para la formación de biopelícula en las células epiteliales intestinales y
superficies de la piel de pollo, además de que promueven la supervivencia de
Salmonella en las plantas (Wiedemann et al., 2015).
 Adhesinas no fimbriales
Se han descrito dos tipos de adhesinas no fimbriales en Salmonella spp. de
acuerdo con su vía de secreción: PABA y SIIE son secretadas por un sistema
de secreción de tipo 1, mientras que ShdA, MisL, y SadA son de
autotransporte conocidos como sistemas de secreción de tipo V (W). PABA
(386 kDa) y SIIE (595 kDa) son las mayores proteínas de Salmonella spp. y
comparten las características de tener numerosos dominios de tipo
inmunoglobulina bacterianos. Los genes que codifican estas dos proteínas
están altamente conservados entre los serotipos de Salmonella spp. PABA
ha demostrado estar involucrado en la formación de biopelícula en S.
Enteritidis, mientras que en S. Typhimurium es menos clara su acción. SIIE
es una adhesina codificada por la Isla de Patogenicidad 4 de Salmonella.
Esta adhesina media la adhesión inicial de Salmonella spp. para el lado
apical de las células epiteliales polarizadas a través de múltiples
interacciones con glicoestructuras con terminal de N-acetil-glucosamina y/o
α-2,3 vinculado a ácido siálico (Wiedemann et al., 2015).
 Proteínas de membrana externa
PagN (26 kDa), es una proteína de membrana externa que media la
adhesión y la invasión a las células epiteliales mediante la interacción con
proteoglicano hepático (Rosselin et al., 2010).
23
Rck (19 kDa), es codificada por el gen rck en el plásmido de virulencia
mayor de las bacterias. Además de las capacidades de adhesión y de
entrada, Rck también confiere un alto nivel de resistencia a la actividad
bactericida
del
complemento,
independiente
de
la
estructura
de
lipopolisacárido (LPS), mediante la inhibición de la polimerización de C9
componente del complemento en la membrana bacteriana. Rck pertenece a
una familia de cinco proteínas homólogas de membrana externa,
caracterizado en Salmonella (Rck y pagC), E. coli (Lom), Yersinia
enterocolitica (Ail) y Enterobacter cloacae (ompX). La proteína Rck es
codificada por varios serotipos, incluyendo S. Enteritidis y S. Typhimurium
(Rosselin et al., 2010).
 Islas de Patogenicidad
Las Islas de Patogenicidad son elementos genéticos integrados en el núcleo
del genoma de las bacterias, que confieren una virulencia fenotípica a las
mismas (Ochman & Groisman, 1996; Shames et al., 2009). Actualmente se
han identificado 21 diferentes islas de patogenicidad de Salmonella spp.
(SPI) (Blondel et al., 2009), sin embargo no se han definido claramente las
funciones de todas las islas en la patogénesis de Salmonella spp. (Blondel et
al., 2009; Groisman & Ochman, 1997). A continuación se describirán cinco
de ellas, consideradas las más importantes.

SPI-1: Implicado en la penetración inicial de la bacteria a las células.
Codifica el sistema de secreción tipo III (T3SS). Cuenta con dos
genes: InvA: de invasión del tejido epitelial del intestino en humanos y
animales, y Stn: causa efecto teratóxico en células epiteliales (Hensel,
2004; Figueroa Ochoa & Verdugo Rodríguez, 2005).

SPI-2: Importante para los siguientes estadios de la infección
sistémica; se relaciona con la capacidad de la bacteria de sobrevivir
dentro de los macrófagos y de multiplicarse dentro de SVCs en los
fagocitos y en células eucariotas. Consta de 32 genes que regulan la
24
supervivencia y replicación bacteriana en los compartimentos
intracelulares de fagocitos y células epiteliales (Hensel, 2004).

SPI-3: Relacionada con la supervivencia intracelular en macrófagos.
Provee productos esenciales para el crecimiento en condiciones
limitadas de Mg2 (Hensel, 2004).

SPI- 4: No se tiene información tan detallada de estas islas. Se cree
participa en la adaptación de Salmonella al ambiente intracelular en
los macrófagos (Figueroa Ochoa & Verdugo Rodríguez, 2005).

SPI-5:
Codifica
proteínas
SPI1-SPI2;
las
proteínas
efectoras
involucradas en la secreción fluida y reacción inflamatoria en la
mucosa intestinal (Figueroa Ochoa & Verdugo Rodríguez, 2005)
como: SopB (Fosfatasa implicada en el desencadenamiento de la
secreción de fluidos que resulta en síntomas de diarrea) (Hensel,
2004).
De todas las Islas de Patogenicidad solamente SPI-1, SPI-4, y SPI-9 están
presentes en Salmonella Bongori y Enterica, lo que sugiere que estas fueron
adquiridas en el comienzo de la evolución de Salmonella spp. y antes de su
especiación (Velge et al., 2012)
 Mecanismos de internalización
El principal mecanismo de internalización de Salmonella spp., y el que se ha
estudiado más ampliamente, requiere el T3SS-1.
T3SS-1: Es codificado por la Isla de Patogenicidad 1 de Salmonella
(SPI-1), es crítico en la patogénesis de muchas bacterias patógenas
incluyendo Salmonella spp. y es una jeringa molecular que inyecta proteínas
efectoras bacterianas directamente en las células huésped, permitiendo la
invasión bacteriana a través de un mecanismo de disparo (Rathinavelan,
Tang & De Guzman, 2011; Rosselin et al., 2010). De entre todos los factores
de virulencia de Salmonella spp. este es el mejor caracterizado y el que
25
provoca la entrada de la bacteria en una amplia gama de células eucariotas
(Velge et al., 2012).
T3SS-2: Codificada por la Isla de Patogenicidad 2 (SPI-2), permite la
supervivencia intracelular y la multiplicación de Salmonella spp. dentro de la
vacuola (Rathinavelan, Tang & De Guzman, 2011; Rosselin et al., 2010)
 Plásmidos de virulencia de Salmonella
Muchos serovares de Salmonella spp. albergan plásmidos de virulencia
importantes para la infección sistémica de los animales de experimentación
después de la inoculación oral. El plásmido de virulencia de Salmonella spp.
varía en tamaño, dependiendo del serovar por ejemplo el tamaño para S.
Typhimurium, S. Enteritidis y S. Dublin es de 95kb, 60kb y 80kb
respectivamente. La región spv parece promover la supervivencia y el
crecimiento rápido de la Salmonella spp. en el huésped, lo que aumenta la
virulencia. Sin embargo, varios grupos han estudiado el papel de spv in vitro
en los macrófagos, y no encontraron ninguna relación entre la expresión de
genes spv y supervivencia intracelular. Por lo tanto, el papel del plásmido de
virulencia de Salmonella spp. es más complejo de lo pensado y espera un
mayor estudio (Wiedemann et al., 2015).
 Otras estructuras
Los flagelos y LPS son factores bacterianos cuya función principal es la de
mediar en la adhesión. Los flagelos confieren la motilidad, la quimiotaxis y el
estímulo de la respuesta inmune innata del hospedador (Wiedemann et al.,
2015). Los LPS son un componente principal de la membrana externa de la
mayoría de las bacterias Gram-negativas, y los protege de compuestos
tóxicos, tales como antibióticos o sales biliares. LPS están compuestos de
tres partes: el lípido A, que está incrustado en la membrana bacteriana, el
oligosacárido de núcleo, y lo más externo, el antígeno O. También es una
endotoxina responsable de shock séptico en huéspedes animales y, como
flagelos que estimula la respuesta inmune innata (Marcus et al., 2000).
26
Invasión
En general, todos los patógenos bacterianos intracelulares entran en las
células eucariotas no fagociticas a través de dos mecanismos: mecanismo de
"Trigger"
o
“Gatillo”
que
implica
un
dramático
reordenamiento
de
citoesqueleto conocido como "volantes membrana" (Fig. A y C). En contraste,
en el mecanismo de "Cremallera", o "Entrada mediada por el receptor", las
bacterias invasoras se unen fuertemente a la membrana de la célula
huésped, los reordenamientos de proteínas del citoesqueleto son de menor
importancia y son iniciados por el contacto específico entre ligandos
bacterianos (adhesina) y los receptores de superficie celular del hospedador.
Una importante diferencia mecánica entre el mecanismo de gatillo y
cremallera es que en el primero la vía de acción es desde "dentro" a través
de la acción de los efectores bacterianos entregados por sistemas de
secreción, mientras que la segunda se promueve desde "fuera" a través de la
activación de los receptores de la célula huésped (Velge et al., 2012).
Se cree que el paso de Salmonella spp. a través de la pared intestinal es
iniciado por la transcistosis, es decir, la invasión de cualquiera de los
enterocitos o células M del lado apical, la migración hacia el lado basolateral,
y exocitosis en el espacio intersticial de la lámina propia (Takeuchi, 1967;
Clark et al., 1994; Muller et al., 2012). También se ha observado la captura
directa por parte de CD18 + fagocitos directos y CD11b +, CD11c +, altos
fagocitos CX3CR1 (Vázquez-Torres et al., 1999; Müller et al., 2012).
Dentro de la lámina propia, S. Typhimurium se recoge al azar por los
diferentes
fagocitos
(macrófagos,
células
dendríticas,
y
células
polimorfonucleares) y se difunde rápidamente a través de la linfa eferente en
los ganglios linfáticos mesentéricos y a través de la corriente de la sangre en
el bazo y el hígado (Salcedo et al., 2001) .Sin embargo, se han observado
diferentes comportamientos dependiendo del serotipo y el anfitrión. En el
ganado vacuno, S. Dublin transita rápidamente a través de la capa epitelial y
27
asociados con MHC de clase II-células positivas en la lámina bacterias
propias. S. Typhi, igual que S. Typhimurium, es capaz de entrar en la murina
del epitelio intestinal a través de las células M. Salmonella Typhimurium,
destruye el epitelio y aparece en las placas de Peyer después de entrar a las
células M (Pascopella et al., 1995).
Rosselin et al., (2010) citado en Velge et al., (2012) menciona que
recientemente se informó de que Salmonella spp. es la primera bacteria que
mostro ser capaz de entrar en las células utilizando tanto estos mecanismos.
Gráfico 1. Mecanismos Gatillo (A) y Cremallera (C) usados por Salmonella
spp. para entrar en las células hospedadoras.
Multiplicación
Inicialmente se creía que la infección por Salmonella spp. empezaba con la
unión de la bacteria al íleon y luego penetraba el intestino a través de la
célula M, sin embargo estudios determinaron que primero la infección se
produce en el intestino delgado y en parte del colon, especialmente la región
cercana al recto, según las últimas observaciones hechas en humanos y
monos Rhesus. En estudios con monos Rhesus, todo parece indicar que la
entrada del microorganismo se asocia más con las microvellosidades de los
enterocitos que con las células M, además la bacteria se puede encontrar en
28
los enterocitos varios días después de la infección. La respuesta inflamatoria
inducida por Salmonella, conduce a la migración de neutrófilos en la luz
intestinal y la posterior liberación de especies reactivas de oxígeno. Este
hecho demora la entrada de la bacteria al torrente sanguíneo, permitiendo la
acción de los macrófagos activados para eliminar la bacteria. (Wiedemann et
al., 2015; Marcus et al., 2000).
Salmonelosis aviar
Es causada principalmente por Salmonella enterica serovariedad Gallinarum
y Pullorum causando las enfermedades Tifoidea y Pullorosis aviar
respectivamente. Durante la infección en la interacción con el sistema
inmune se produce en tres fases principales:
1. La invasión a través del tracto gastrointestinal: la infección con S.
Pullorum o S. Gallinarum no causa inflamación considerable, a
diferencia de S. typhimurium o S. Enteritidis. La ausencia de flagelos
en S. gallinarum y S. pullorum significa que no son reconocidos por
TLR5, que se cree que juega un papel clave en la iniciación de la
respuesta
inflamatoria,
aunque
otros
factores
patógenos
son
propensos a estar involucrados (Chappell et al., 2009).
2. Establecimiento de la infección sistémica en la que Salmonella invade
los macrófagos y las células dendríticas, trasladándose probablemente
al bazo y el hígado, donde se produce la replicación. La supervivencia
de Salmonella depende de la Isla de Patogenicidad 2 de sistema de
secreción tipo III, la cual inhibe la actividad antimicrobiana mediante la
prevención de fusión de lisosomas con la vacuola fagocítica y por la
modulación de MHC y la expresión de citoquinas (Chappell et al.,
2009).
3. La última fase consiste en la replicación de Salmonella, que cuando
no se controla provoca la muerte del animal por lo general. Si el
29
sistema inmune innato no es capaz de controlar la replicación
entonces
las
respuestas
celulares
y
humorales,
mediadas
principalmente a través de citoquinas asociadas a Th1, son capaces
de eliminar la infección. En S. pullorum los animales desarrollan una
infección persistente de los macrófagos esplénicos ocasionando un
estado de portador. En los animales portadores la persistencia puede
conducir a la infección del tracto reproductivo y huevo (Chappell et al.,
2009).
Síntomas
 Humanos
Salmonella spp. es una bacteria que por lo general se ubica en el aparato
digestivo del hombre y animales y se transmite por contacto con individuos
enfermos o portadores sanos, aunque, por lo general las enfermedades
tienen
un origen
alimentario
debido a la
ingesta
de
comestibles
contaminados con este microorganismo. En el ser humano tiene mayor
incidencia en lactantes, niños de corta edad y ancianos (Stanchi, 2007). La
susceptibilidad a salmonelosis es universal y desde el punto de vista
epidemiológico, puede manifestarse casos esporádicos o brotes con un
número variable de afectados (Análisis Microbiológico de los Alimentos,
2011). El tamaño del inóculo de Salmonella spp. requerido para causar
enfermedad sintomática en humanos es entre 105 y 106 (Caballero & Herrera,
2002),
sin
embargo
estudios
determinaron
que
menos
de
1000
microorganismos fueron suficientes para instaurar la enfermedad en seres
humanos (Gorbach, Bartlett & Blacklow, 2004).
Las manifestaciones clínicas de la salmonelosis se caracterizan por la
aparición brusca de fiebre, dolor abdominal, diarrea, náuseas y a veces
vómitos. La aparición de los síntomas se produce después del período de
incubación de 36-72 horas después de la ingestión de alimentos
contaminados, durando de 7 a 20 días la enfermedad. Al ser los síntomas
30
relativamente leves los pacientes pueden lograr una recuperación sin
tratamiento específico en la mayoría de los casos. Sin embargo, en algunos
casos, especialmente en los más jóvenes y en los pacientes de edad
avanzada, la deshidratación asociada puede llegar a ser grave y
potencialmente mortal (WHO, 2013).
Los largos períodos de infección subclínica y convalecencia aseguran de
forma generalizada la distribución de los microorganismos sin control. Brotes
clínicos están correlacionados con los estados inmunes deprimidos, como en
los animales recién nacidos y animales adultos bajo estrés, por ejemplo
vacas recién paridas, equinos sometidos a cirugía y cerdos con
enfermedades virales sistémicas (Scott et al., 2009).
 Aves
En las aves los signos clínicos y patológicos no son patognomónicos,
asemejándose a los de la pullorosis. Las lesiones macroscópicas incluyen
yemas coaguladas, hígado, bazo y ampollas cecales congestionados y con
focos necróticos. En la infección por S. Enteritidis, pericarditis y poliserositis
también son comunes. La artritis también puede ser una de las secuelas.
Para un diagnóstico completo el organismo debe ser aislado. Serología en
las aves, dependiendo de la edad, también puede ser indicativo (Barrow,
2000). En las aves se puede presentar síntomas clínicos producidos por S.
Enteritidis y S. Tiphymurium (Paratifosis aviar), o como portadores
asintomáticos eliminando a través de las heces fecales al patógeno siendo
foco de contagio para la parvada, instrumental, materiales y equipos de los
galpones. Los síntomas que presentan las aves, van de acuerdo al serotipo
de Salmonella spp. y en lo que concierne a las cepas móviles: S. Enteritidis
generalmente no produce sintomatología clínica convirtiendo a las aves en
portadores asintomáticos. Pueden existir síntomas de manera ocasional
como depresión, anorexia y diarrea (OIE, 2008).
31
Resistencia Antimicrobiana
Los antibióticos dependiendo de sus propiedades químicas y estructura
entran en la bacteria y pueden tomar distintas rutas (Jeon, Muraoka, &
Zhang, 2010). Las granjas de pollo utilizan ampliamente antimicrobianos
como método profiláctico y estimulante del crecimiento. Este uso extensivo
de los antibióticos y en dosis subterapéuticas en la dieta puede contribuir a
una mayor prevalencia de bacterias resistentes a múltiples fármacos en la
medicina humana y veterinaria (Pessanha & Gontijo, 2001). Estas bacterias
pueden diseminarse a través de la cadena alimentaria y un grupo de genes
de resistencia pueden ser transferidos a los humanos, reduciendo la
disponibilidad de moléculas eficaces para el tratamiento de enfermedades
infecciosas causadas por estos agentes (Hasman et al., 2005). El aislamiento
creciente de Salmonella spp. con resistencia a los antimicrobianos en seres
humanos y animales es un problema de salud pública (Varma et al., 2005).
Algunos estudios utilizando electroforesis en gel de campo pulsado
sugirieron que carne de pollo puede ser una fuente de resistencia
antimicrobiana a Salmonella spp. en seres humanos (Kang et al., 2009;
M’ikanatha et al, 2010). La presencia de Salmonella spp. multirresistente en
el pollo y la presencia de genes bla (CMY), son responsables de la
resistencia mediada por plásmidos a ceftiofur y ceftriaxona (M’ikanatha et al,
2010).
El serotipo Enteritidis ha mostrado ser resistente a algunos antibióticos en
diferentes grados, entre ellos a ceftriaxona y ceftiofur, una cefalosporina de
tercera generación que se utiliza para tratar la salmonelosis humana invasiva
(Medeiros et al, 2011). En Estados Unidos en el año 1997, las cepas de
origen humano eran sensibles a las cefalosporinas, mientras que sólo el
1,6% de las cepas de origen aviar fueron resistentes a ceftiofur. Desde el año
2003, la resistencia a ceftiofur aumentó a 5,2% y 7,4% entre las cepas
aisladas de humanos y aves de corral, respectivamente, y la susceptibilidad
a la ceftriaxona se redujo (FDA, 2006). En Brasil, el desarrollo de resistencia
32
en Salmonella spp. en los pollos se ha informado de al menos 10 años (Baú,
Carvalhal & Aleixo, 2001) al igual que la presencia de cepas resistentes en
diferentes alimentos implicados en brotes de salmonelosis (De Oliveira,
Brandelli, & Tondo, 2006). Los resultados sugieren que un grupo clonal
resistente del serotipo Enteritidis se ha distribuido recientemente en aves de
corral, los alimentos y las cepas humanas en el sur de Brasil (Vaz et al.,
2010)
Técnicas de Diagnóstico de Salmonella spp.
Aislamiento e Identificación de la bacteria
En el aislamiento del organismo a partir de tejidos recogidos asépticamente,
heces o hisopos rectales, muestras ambientales, alimentos, productos y
piensos, puede utilizarse una variedad de técnicas que pueden incluir preenriquecimiento en agua peptonada tamponada, para reavivar salmonelas
subletalmente dañadas, medios de enriquecimiento selectivos, que contienen
sustancias inhibidoras para suprimir organismos como caldo selenito o caldo
tetrationato o medio MSRV y agares selectivos para diferenciar las
salmonelas de otras enterobacterias tales como agar verde brillante y sus
modificaciones y agar xilosa lisina desoxicolato (OIE, 2010). Varias pruebas
bioquímicas, serológicas y moleculares se pueden aplicar al cultivo puro para
proporcionar una confirmación definitiva de una cepa aislada. Este método
es también propuesto por la Organización Internacional de Estandarización
(ISO) que estableció la ISO 6579:2002. Los diferentes serotipos pueden ser
identificados por los sueros de tipificación específica, y el serovar puede
determinarse por referencia de las fórmulas antigénicas del esquema de
Kauffman-White (OIE, 2010).
Toma y Transporte de Muestra
Las muestras de contenido cecal de los pollos después del proceso de
evisceración y piel de la pechuga se deben obtener de forma aséptica y
33
transportarlas en temperaturas entre
2 y 4°C, siendo 25 gramos de
contenido cecal y piel suficiente para la detección de Salmonella spp.
empleando la norma ISO 6579. Las muestras se pueden procesar no más de
3 días después de la toma de muestra (Larsen et al., 2014).
Aislamiento de Salmonella spp.
Para el aislamiento de Salmonella spp. de los distintos tipos de muestras en
la industria animal disponemos de algunos procedimientos estandarizados
por diferentes organismos reguladores y que son de uso universal. (OIE,
2008). Uno de los métodos es el propuesto por la Organización Internacional
de Estandarización (ISO) que estableció la ISO 6579:2002. Las técnicas y
medios de cultivo con los mejores resultados en una situación diagnóstica
dependen de una variedad de factores que incluyen el tipo de muestra, tipo
de Salmonella spp., la experiencia del microbiólogo y la disponibilidad de
medios de enriquecimiento selectivo y de medios selectivos en placas (OIE,
2008).
Lo esencial del método estándar es el protocolo basado en preenriquecimiento de la muestra en agua de peptonada tamponada, el
enriquecimiento
en medio
Rappaport–Vassiliadis (MSRV) semi-sólido
modificado y el aislamiento en agar xilosa-lisina-dexosicolato (XLD) (OIE,
2008; ISO 6579:2002 amd 2007; De Busser et al., 2013).
Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de
calidad y permitir el crecimiento del microorganismo sospechoso a partir de
un inóculo pequeño (OIE, 2008).
 Medios de pre-enriquecimiento
El principal desafío para el aislamiento de Salmonella spp. es durante la
etapa de pre-enriquecimiento, por la baja concentración de bacterias en las
muestras, las malas condiciones fisiológicas de las bacterias debido a
factores de estrés ambientales, tales como alta temperatura, el estrés
34
osmótico, o bajo pH (Taskila et al., 2011). Por lo que es necesario utilizar
medios pre-enriquecidos que faciliten el aislamiento, como el agua de
peptona tamponada o el caldo universal de pre-enriquecimiento, los cuales
permitirán la multiplicación de la escasa población de Salmonella spp. sin
que mueran por los efectos tóxicos de los medios de enriquecimiento (OIE,
2008). La muestra se siembra de preferencia en agua peptona bufferada
(BPW) a temperatura ambiente y luego se incuba a 37ºC ± 1ºC durante 1824 h ± 2 h (Análisis Microbiológico de los Alimentos, 2011).
 Medios de enriquecimiento
“Como su nombre lo indica, un medio de enriquecimiento se utiliza para
aumentar el crecimiento de ciertas especies bacterianas mientras se inhibe el
desarrollo de microorganismos no deseados” (Koneman, 2008, p215). En
muestras de heces se utiliza para la recuperación de Salmonella spp. y
Shigella spp. en las cuales la cantidad de microorganismos puede ser tan
solo de 200 por gramo de heces (Koneman, 2008). Los medios de
enriquecimiento son medios líquidos o semisólidos, sin embargo se ha
demostrado que los medios semi-sólidos como el MSRV mostraron una
mayor sensibilidad significativa que los medios líquidos como el caldo
selenito, caldo tetrationato-novobiocina de Muller-Kauffman, caldo tripticasasoya, caldo rappaport – vassiliadis con soja (De Busser et al., 2013; Yue et
al., 2014; Análisis Microbiológico de los Alimentos, 2011).
Los
medios
de
enriquecimiento
selectivo
semisólidos
aumentan
la
sensibilidad de aislamiento de Salmonella spp. móvil como es el medio
semisólido Rappaport Vasiliadis o medio semisólido para el diagnóstico de
Salmonella (DIASALM) (De Busser et al., 2013). La temperatura de
incubación del MSRV que se recomienda en norma ISO 6579, 2002 / Amd
2007 es de 41, 5°C, temperaturas diferentes pueden resultar inhibidoras
como por ejemplo, los medios de tetrationato y Rappaport–Vassiliadis
inhiben las cepas termosensibles, especialmente S. Dublin.
35
 Medios selectivos en placa
Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un
crecimiento diferencial, inhibiendo el crecimiento de bacterias distintas a
Salmonella spp. y suministran información sobre algunas de las principales
características bioquímicas diferenciales, normalmente la incapacidad de
fermentar lactosa y la producción de sulfuro de hidrógeno (OIE, 2008).
Actualmente se dispone de una amplia variedad de medios selectivos sólidos
como: el Agar Verde Brillante (BG), el Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),
el Agar Salmonella Shigella (SS), el Agar Citrato Desoxicolato, el Agar
Rambach, el Agar Sulfito de Bismuto, y Agar Hektoen (HE), aunque en la
literatura y en los catálogos de medios pueden encontrarse muchos más
(OIE, 2008; Caffer & Terragno, 2001). El agar Verde Brillante se usa para el
aislamiento de Salmonella spp. a excepción de S. Typhi y S. Paratyphi,
mientras el agar Sulfito de Bismuto es efectivo para el aislamiento de S.
Typhi (Gray, 1995).
Los resultados se obtienen después de 24 y 48 horas de cultivo a 37°C. En
dichos medios Salmonella spp. forma colonias características que son
distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la posible
excepción de Proteus spp., Pseudomonas spp. y Citrobacter spp. En
ocasiones, se pueden aislar salmonelas fermentadoras de lactosa y la
producción de H2S puede ser variable (OIE, 2008). Las características de las
colonias en medios selectivos se indican en el siguiente cuadro.
36
Cuadro 7. Características de las colonias de Salmonella spp. en medios
selectivos.
Medio de Cultivo
Selectividad
Aspecto de las colonias
Agar SS
Alta
Incoloras con centro negro
Agar XLD
Alta
Rojas con centro negro
Agar HE
Alta
Verde-azuladas con centro negro
Agar BG
Alta
Rosadas pálidas
Tomado de: Caffer & Terragno, 2001
Elaboración: La Autora
 Identificación Bioquímica de colonias sospechosas
Las colonias sospechosas se subcultivan en medios sólidos selectivos y no
selectivos para asegurar la ausencia de posibles contaminantes como
Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las colonias
sospechosas se pueden probar por aglutinación en porta con sueros
polivalentes para la tipificación de Salmonella (Lindberg & Le Minor, 1984).
En algunos casos, la colonia sospechosa puede no aglutinar o autoaglutinar
y es necesario entonces utilizar pruebas bioquímicas para confirmar la
identificación. Estas pruebas se pueden realizar con azúcares en agua de
peptona o con sistemas comerciales, tales como el sistema Índice de Perfil
Analítico (API) (OIE, 2008). En caso de existir colonias aisladas se puede
proceder a la confirmación bioquímica inoculando directamente del medio
selectivo en Agar TSI, LIA, MIO, Agar Urea y en dos tubos de TSA (ISO
6579,2002). Se pueden necesitar pruebas bioquímicas adicionales para
identificar algunas variantes serotípicas, por ejemplo, la del d-tartrato que
permite diferenciar S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B, además
pruebas como medio Voges Proskauer, β-Galactosidasa, Rojo de Metilo,
Citrato de Simons (OIE, 2008; Caffer & Terragno, 2001).
37
Cuadro 8. Interpretación de Pruebas Bioquímicas Salmonella spp.
Pruebas Bioquímicas
Salmonella spp.
Agar triple azúcar hierro (TSI)
K/A + Gas + H2S
Agar hierro lisina (LIA)
Positivo (violeta)
Agar movilidad indol ornitina (MIO)
Negativo (anillo amarillo)
Agar urea
Negativo (amarillo)
Rojo de metlilo
Positivo
Voges proskauer
Negativo
Citrato de Simmons
Positivo
Tomado de: ISO 6579, 2002; Caffer & Terragno, 2001; Análisis
Microbiológico de los Alimentos, 2011
Elaboración: La Autora
Identificación de especies de Salmonella spp.
La identificación de las distintas especies de Salmonella spp. es útil para
definir, monitorear y controlar brotes y epidemias (Análisis Microbiológico de
los Alimentos, 2011). En la actualidad se usan y comercializan numerosos
métodos alternativos de detección de Salmonella spp. Estos incluyen
métodos basados en la conductancia e impedancia eléctrica, en la
separación inmunomagnética, ELISA, métodos de la PCR (Cook, 2003). Sin
embargo muchos de estos métodos no han sido validados para muestras
fecales y ambientales. Los métodos rápidos suelen ser más costosos que los
cultivos convencionales, pero pueden resultar económicamente viables para
analizar materiales donde se espera una prevalencia baja de contaminación
o donde los materiales, como los alimentos, están pendientes de una prueba
negativa. Un método de enriquecimiento en combinación con un ELISA o
PCR puede proporcionar resultados en 24 horas. En la actualidad, ninguno
de los métodos rápidos se ha mostrado adecuado para la detección directa
de Salmonella spp., de modo que se necesitan etapas de enriquecimiento
selectivo o no selectivo (OIE, 2008)
38
 Serotipificación
La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación
bioquímica y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la
prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas, así también
es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infección
y las vías de transmisión (Caffer & Terragno, 2001). El uso de reacciones
antígeno – anticuerpo para la serotipificación de las bacterias se basa en que
los microorganismos presentan diferencias en su constitución antigénica, aún
entre grupos de microorganismos relacionados. Los microorganismos
expresan una gran variedad de antígenos (Ag): componentes estructurales
de la célula (pared, cápsula, fimbrias); productos de excreción (exotoxinas,
enzimas extracelulares) (Caffer & Terragno, 2001).
El método que se utiliza con frecuencia para la serotipificación de Salmonella
spp. es el esquema de Kaufmann-White, el cual, se basa en la detección de
la presencia de los antígenos O somáticos (46), Vi capsulares y H flagelares
(119), los cuales han permitido la caracterización de 2 541 serotipos de
Salmonella spp. (Análisis Microbiólogico de Alimentos, 2011; Lavalett et al.,
2009). Se realiza por aglutinación en placa con los sueros apropiados a partir
de colonias puras. La aglutinación de anticuerpos específicos para los
diversos antígenos O se emplea para agrupar Salmonellas en 6 serogrupos:
A, B, C1, C2, D y E. Posteriormente a la determinación del serogrupo
somático se procede con la identificación de los antígenos flagelares H que
determinarán finalmente el serovar (Pui et al., 2011). Los serotipos de
importancia para esta investigación y su fórmula antigénica se muestran en
el siguiente cuadro.
39
Cuadro 9. Esquema de Kauffman-White serotipos Enteritidis, Typhimurium e
Infantis.
SEROVAR
S. Enteritidis
S. Typhimurium
S. Infantis
ANTIGENO O
1,9,12
1,4,5,12
6,7,14
ANTIGENO FLAGELAR H
Fase 1
Fase 2
Gm
I
1,2
R
1,5
Tomado de: Caffer & Terragno, 2011
Elaboración: La Autora
Prevención
A causa de la compleja epidemiologia y la estrecha asociación del ser
humano con las posibles fuentes de Salmonella spp. como los animales, es
necesario un enfoque completo desde la granja hasta el consumo de
productos avícolas, para ello es claro que existan diversos métodos eficaces
para reducir el riesgo de infección.
a) Crianza en el Plantel Avícola
Las medidas para prevenir la colonización de Salmonella spp. en los pollos
de las granjas, empieza con la adquisición de pollitos bb procedentes de
parvadas de reproductores libres de Salmonella spp. (OIE, 2008). Durante la
crianza es indispensable asegurar un ambiente libre de contaminantes como
agua, pienso, roedores, y demás vectores del microorganismo. Para ello se
ha implementado algunas prácticas de manejo avícola como son la exclusión
competitiva, vacunación, y uso de antibióticos (OIE, 2008; Codex
Alimentarius, 2011).

Exclusión Competitiva
El tracto gastrointestinal representa una superficie mucosa vulnerable al
ataque por patógenos entéricos. En las aves de corral, la susceptibilidad a la
infección por Salmonella spp. puede reducirse notablemente mediante la
Exclusión Competitiva, que se puede definir como el establecimiento primario
de microflora anaeróbica del ciego, para evitar la colonización por
enteropatógenos como Salmonella spp., mediante un tratamiento oral o en
40
aerosol, ocupando los sitios de la colonización intestinal, produciendo ácidos
y otras sustancias inhibidoras y estimulando las respuestas inmunes
generalizadas de tipo local y mucosal (Caricilli et al., 2014; Barrow &
Methner, 2013). En algunos países este tratamiento se utiliza con frecuencia,
pero en otros solo se emplea como ayuda para descontaminar granjas con
infección persistente (OIE, 2008; Van Immerseel et al., 2005).

Vacunación
El uso generalizado de antibióticos ha llevado a la aparición de múltiples
bacterias resistentes, especialmente S. Typhimurium. Estos problemas han
indicado a los organismos de la industria y del gobierno una exigencia cada
vez mayor de vacunas más sensibles para el control de esta importante
zoonosis (Barrow & Methner, 2013). Se utilizan muchas vacunas inactivadas
contra salmonelosis por diferentes serotipos en varias especies animales,
incluyendo una vacuna combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium
para el empleo en aves. En varios países también se han utilizado vacunas
vivas; estas incluyen las cepas semi-rugosas, tales como la 9R para la tifosis
aviar. Otras vacunas atenuadas incluyen mutantes autotróficos y “de deriva
metabólica”, que se usan en Alemania para evitar infecciones por Salmonella
spp. en animales de granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis y S.
Typhimurium en aves de corral. Se han desarrollado vacunas mutantes,
atenuadas racionalmente por supresión de genes mediante técnicas de
biología molecular, para aves de corral y para otras especies. Normalmente,
en Europa no se permite el uso de vacunas con microorganismos
genéticamente modificados (OIE, 2008).

Uso de Antibióticos
Los antibióticos se utilizan para fines quimioterapéuticos y promotores del
crecimiento. Esto es eficaz, pero produce efectos secundarios adicionales, a
saber, la selección de cepas bacterianas resistentes a los antibióticos, la
transferencia in vivo de resistencia a los antibióticos y, en algunos casos, el
aumento de la colonización intestinal y la excreción fecal de Salmonella spp.
41
Por tanto, estos aspectos negativos se deben considerar cuando se utilizan
estos productos químicos para el tratamiento de aves de corral que pueda
estar infectado con Salmonella spp. (Barrow, 2000).
b) Planta de Faenamiento
Evitar la contaminación de las canales en el matadero es fundamental en el
cumplimiento de la inocuidad alimentaria y prevención de salmonelosis
humana (EFSA/ ECDC, 2013)
El Comité del Codex sobre Higiene de los Alimentos (CCFH, 2007) establece
que durante el procesamiento puede incrementarse la contaminación
cruzada de la canal especialmente en el escaldado, desplumado y
evisceración (Brian & Doyle, 1995).
La implementación y mejoramiento de las Buenas Prácticas de Manufactura
(BPM), las Buenas Prácticas de Higiene (BPH), incluyendo el buen diseño,
mantenimiento y limpieza del equipo, así como la implementación de los
principios de análisis de peligros y puntos críticos de control (APPCC) en los
centros
de
beneficio
a
disminuido
significativamente
el
riesgo
de
contaminación y propagación de Salmonella spp. en canales de pollo durante
el faenamiento (FAO/OMS, 2003; Heyndrickx et al., 2002).
Tratamiento
La aplicación temprana del tratamiento es fundamental para su éxito.
Existen dos tratamientos:

Sintomático, como por ejemplo, rehidratación del animal.

Específico con antibióticos para los animales ya enfermos, siendo
recomendable realizar un antibiograma de Salmonella spp., debido a
las frecuentes resistencias y multirresistencias y al riesgo de prolongar
el estado de portador.
42
La evolución de las cepas resistentes a los antimicrobianos comúnmente
usados es un problema de preocupación significativo en medicina veterinaria
y en salud pública. En aves el tratamiento antibiótico es de eficacia limitada,
ya que se trata de una enfermedad con tendencia a la cronicidad y que
produce portadores asintomáticos (WHO, 2005).
43
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Determinación de Métodos a utilizar
Tipo de investigación
El tipo de investigación del presente proyecto fue observacional, no
probabilístico.
Diseño de la investigación
El diseño que se utilizó en esta investigación fue transversal descriptivo ya
que no se manipuló de manera voluntaria las variables. Este estudio nos
permitió identificar los serotipos de Salmonella Enteritidis, Salmonella
Typhimurium y Salmonella Infantis presentes en carcasas de pollo
destinadas para consumo humano en un camal industrializado en la
Provincia de Pichincha.
Descripción de la zona de estudio
El trabajo de campo se realizó en la planta industrial de faenamiento avícola,
ubicada en la Provincia de Pichincha, en la parroquia de Calderón
perteneciente al cantón Quito. El trabajo de laboratorio se realizó en el
laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
44
Población y muestra
La población objeto de estudio se conformó por las diferentes parvadas de
aves provenientes de un mismo galpón y lote que fueron faenadas durante
dos meses en el camal industrializado propiedad de la empresa productora
en la Provincia de Pichincha.
El nombre de la empresa se mantuvo en absoluta reserva, ya que se
estableció un acuerdo de confidencialidad, por lo cual para identificar las
muestras se estableció un código alfanumérico tanto en las muestras como
en los resultado.
Muestra
El tipo de muestreo que se empleó en la investigación fue aleatorio simple ya
que se intentó incluir a todos los sujetos accesibles como parte de la
muestra. Para la identificación de Salmonella spp. se tomó cinco pools, cada
uno de tres muestras de piel de la pechuga al salir la carcasa del chilling,
cada pool pesó veinte y cinco gramos, como cita la norma ISO
6579:2002/Amd, 2007. Se tomó en total 75 muestras de piel procedentes de
75 aves procesadas durante la investigación, representadas en 25 pools.
Con la finalidad de evaluar la posible contaminación de la piel de la pechuga
con la contaminación cecal inicial, se tomó un pool de veinte y cinco gramos
de heces provenientes de veinte y cinco sacos ciegos, según lo establecido
por el “Estudio de Prevalencia y Resistencia a los antibacterianos de
Campylobacter spp.. Escherichia coli BLEE y Salmonella spp. en muestras
gastrointestinales de pollos faenados en camales industriales de la Provincia
de Pichincha-Ecuador”, al cual pertenece la presente investigación.
En el Cuadro 10, se muestra el número de muestras de piel y sacos ciegos
que se tomó por pool y muestreo durante la investigación.
45
Cuadro 10. Número de muestras de piel y sacos ciegos tomadas por pool y
muestreo.
Muestreo
Muestras
Pools
Total de
Muestras
Pool
Total de
por pool
piel
muestras
por pool
sacos
sacos
piel /
sacos
ciegos
ciegos /
muestreo
ciegos
piel
muestreo
Primero
3
5
15
25
1
25
Segundo
3
5
15
25
1
25
Tercero
3
5
15
25
1
25
Cuarto
3
5
15
25
1
25
Quinto
3
5
15
25
1
25
Total
-
25
75
-
5
75
Tomado de: Investigación directa
Elaboración: La Autora
Se colocó las muestras en fundas plásticas estériles, identificadas y
refrigeradas para su transporte al Laboratorio de Bacteriología y Micología de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (FMVZ).
Procedimiento de la Investigación
1. Fase de campo (muestreo)
La
identificación
de
Salmonella
enterica
serovariedades
Enteritidis,
Typhimurium e Infantis en el presente estudio se realizó mediante la toma
aséptica de cinco pools de piel de pechuga después del chilling (McEvoy et
al.,2005; Berrang et al., 2014; Cox et al., 2014) y un pool de veinte y cinco
sacos ciegos tomados después del eviscerado (Valseca, 2015;Larco, 2015;
Norma ISO 6579:2002/Amd, 2007).
46
Se colocó las muestras en fundas plásticas estériles, identificadas y
refrigeradas para su transporte al Laboratorio de Bacteriología y Micología de
la FMVZ.
Recepción de aves vivas
Aturdimiento / Desangrado
Escaldo/Desplume
Eviscerado
Toma Sacos
Ciegos
Lavado / Pre-chilling
Chilling
Toma de
muestras piel
Empacado
Gráfico 2. Toma de muestras en Planta de Faenamiento
2. Fase de laboratorio.
a. Procesamiento
Se procesó las muestras tanto de piel como de sacos ciegos de la siguiente
manera:

Piel: Cada pool se conformó por tres muestras de piel del área de la
pechuga procedentes de tres carcasas diferentes con un peso de 25
gramos.
47

Sacos Ciegos: Se colocó en un vaso de precipitación con alcohol al
70% por cinco minutos, posteriormente se extendió los mismos sobre
la superficie de una funda estéril quitando el exceso de alcohol, se
cortó cada ciego en su ampolla cecal y se tomó aproximadamente un
gramo de heces por cada uno, hasta obtener el pool de 25 gramos
b. Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo.
Se requirió 225 ml de agua peptonada tamponada para cada pool de 25
gramos (dilución 1:10), posteriormente se homogenizó en el stomacher y se
incubó a 37 ° C ± 1 ° C durante 18 h ± 2 h. (ISO 6579:2002/Amd, 2007)
c. Enriquecimiento
En placas con medio semisólido selectivo Modified Semi-solid RappaportVassiliadis (MSRV) se inoculó el cultivo obtenido en el pre-enriquecimiento.
Con un micropipeta se tomó 100 μL del cultivo y se colocó 3 gotas de
manera equidistante en el medio formando un triángulo. Se incubó cada
placa a 42°C por 24± 3 horas. (ISO 6579:2002/Amd, 2007)
d. Cultivo: medio selectivo
Con las muestras positivas en la placa de enriquecimiento se procedió a
sembrar en agar selectivo Xilosa, Lisina, Desoxicolato (XLD).
Con el asa de platino se tomó pequeñas azadas de la periferia del halo
blanquecino formado en el MSRV, y se sembró por estriaciones en la caja
Petri con el medio XLD. Se incubó a 37°C por 24 horas (ISO 6579:2002/Amd,
2007).
Las colonias positivas a Salmonella spp. se presentaron definidas y rodeadas
por un halo rosado con centro color negro por la producción de H 2S, otras no
produjeron gas observándose en el medio un halo rosa con el centro oscuro.
Algunas Salmonellas pueden ser lactosa positiva, y sus colonias se observan
de color amarillo y el centro negro (ISO 6579:2002/Amd, 2007).
48
e. Pruebas Bioquímicas
Se sometió a pruebas bioquímicas las muestras positivas en el medio
selectivo para la confirmación del aislamiento de Salmonella spp. se tomó
dos colonias típicas de cada medio selectivo. Se utilizó: Agar triple azúcar
más hierro (TSI), Caldo Urea, Lisina e Indol. (Anexo1).
f. Respaldo de las cepas (Criocongelación)
Se respaldó las muestras positivas a las pruebas bioquímicas en 300 μL de
caldo triptosa contenidas en un tubo Ependorf. Se tomó el cultivo del medio
TSI y se sembró en el caldo mencionado, se incubó durante 24 horas a 37°C.
Posterior a la incubación se añadió 600 μL de glicerol para su congelación y
conservación a -75°C en cajas criogénicas.
g. Tipificación serológica
La tipificación se realizó mediante el esquema de Kauffmann-White que
divide a este género bacteriano en diferentes serotipos en base a los
antígenos de Salmonella: somáticos (O), flagelares (H) y capsular (Vi)
(Becton Dickinson, New Jersey- USA).
Análisis de la cepa aislada para determinar la autoaglutinación
1. Se transfirió a partir de un cultivo de prueba en medio no selectivo, un
asa llena de crecimiento a una gota de solución salina estéril al 0,85%
en un portaobjetos limpio, y se emulsionó.
2. Se revolvió suavemente el portaobjetos durante 1 min y se observó si
se produjo aglutinación.
3. Se realizó el método de prueba del portaobjetos al organismo que no
produjo ningún tipo de aglutinación. (Anexo 2).
Método de prueba del portaobjetos: Antisueros para Salmonella O y Vi
Se utilizó este procedimiento para analizar el aislado con cada antisuero
seleccionado.
49
1. Se colocó 1 gota (35 µL) de cada antisuero por analizar en un
portaobjetos de aglutinación y se mezcló con una pequeña azada del
organismo en prueba desde un agar nutritivo.
2. Control negativo: se colocó 1 gota de solución de NaCI al 0,85%
estéril en un portaobjetos de aglutinación y se mezcló con una
pequeña azada de crecimiento.
3. Control positivo: se colocó 1 gota de cada “Difco BD (Becton
Dickinson, New Jersey- USA) Salmonella O Antiserum” a ser analizado
en un portaobjetos de aglutinación. Se añadió 1 gota de “Difco BD
Antigen Salmonella” (Becton Dickinson, New Jersey- USA) apropiado o
de cultivos de referencia cuya identificación serológica es conocida.
4. Se revolvió el portaobjetos durante 1 min y se efectuó la lectura para
determinar si se produjo aglutinación. Los resultados se leyeron de
manera inmediata (máx. 1 min). (Anexo 2)
Procedimiento de prueba en tubo Antisueros para Salmonella H
1. Se preparó un tubo de ensayo de 12 x 75 mm para cada muestra a
analizar.
2. Antisuero diluido: se dosificó 0,5 mL en cada tubo.
3. Aislado de prueba: se añadió 0,5 mL al tubo correspondiente.
4. Control positivo: se añadió 0,5 mL de control positivo del antígeno a
un tubo con 0,5 mL de antisuero.
5. Control negativo: se añadió 0,5 mL de solución de NaCI al 0,85% a un
tubo con 0,5 mL de aislado de prueba.
6. Se incubó todos los tubos en baño María a 50 ± 2 °C durante 1 h.
7. Se determinó si se produjo floculación (aglutinación).
8. Se repitió la prueba en tubo con un organismo de prueba con fase
inversa. (Anexo 3).
50
Inversión de fase
Originalmente se había descrito el procedimiento que indica el manual Difco,
sin embargo por cuestiones de economía se decidió modificar levemente el
procedimiento de inversión de fase basado en el método de puente de papel
descrito por Chiou et al., (2005). (Anexo 4).
1. Se preparó medio de Agar Tripticasa de Soya.
2. Se recortó tiras de papel filtro de 3mm de ancho por 3 cm de largo y
se esterilizó.
3. Se reconstituyó los antisueros flagelares necesarios. Por ejemplo, la
incubación de Salmonella Infantis fase 1[r] con antisuero r permitió el
crecimiento y la propagación de S. Infantis fase 2 [1,5].
4. Se diluyó (1:10) cada antisuero flagelar en solución salina 0,85%.
5. Se extrajo del centro de la placa con agar tripticasa de soya una tira
de 1 cm de ancho, utilizando un instrumento de corte (bisturí)
esterilizado.
6. Se expuso la placa de agar en la cabina de flujo laminar durante unos
minutos para eliminar el agua libre en la superficie del medio.
7. Se colocó tres tiras de papel filtro a través de la ranura de la placa
formando tres puentes equidistantes.
8. Se tomó con una micropipeta 2 μL de cada antisuero contra la fase a
identificar y se colocó en el centro de cada puente papel.
9. Se inoculó el cultivo bacteriano perforando el extremo izquierdo de
cada puente de papel.
10. Se incubó cada placa a 35 – 37 °C durante 24 h.
11. Se observó después de esta incubación, crecimiento bacteriano
alrededor de la tira de papel, en el extremo opuesto del sitio de
inoculación.
12. Se transfirió este crecimiento bacteriano a un medio líquido, 5 ml de
Caldo Tripticasa de Soya, con un asa desechable estéril y se incubó
por 24 horas a 35-37°C.
51
13. Posterior a esta incubación se mezcló la solución cultivada con un
volumen igual de solución salina formalizada al 0,6% hasta alcanzar
escala n° 3 de Mc Farland, para proseguir con el procedimiento de
prueba en tubo: Antisueros para Salmonella H (Chiou et al., 2005).
Resultados de la prueba en portaobjetos
Se leyó y registro los resultados considerando como positivo: a la reacción
de aglutinación (fondo transparente a ligeramente lechoso) y como negativo:
a ningún indicio de aglutinación. Se continuó con la identificación de antígeno
de Salmonella H (Difco, 2012).
Resultados de la prueba en tubo
Se leyó y registró los resultados como positivos a aquellos que mostraron
aglutinación (fondo transparente a ligeramente lechoso) y resultados
negativos a ningún indicio de aglutinación (Difco, 2012).
Registro y Análisis de Datos
a. Registro de Datos
La información proveniente de la planta de faenamiento relacionada con las
características, ubicación y estado sanitario de las aves de cada una de las
granjas, se almacenaron en una base de datos al igual que los resultados
obtenidos de la fase de laboratorio se registraron en una base de datos a
través de Hojas de Excel.
b. Análisis de los Datos
Los datos obtenidos tanto del aislamiento de Salmonella spp. como de la
tipificación
de
los serotipos
Enteritidis, Tiphymurium
e
Infantis
se
representaron por medio de histogramas porcentuales de la relación: entre la
proporción de positivos con el total de muestras tomadas, el porcentaje de
52
positividad en cada muestreo, la relación de muestras positivas de piel y de
contenido cecal y la identificación del serotipo involucrado.
Este análisis permitió establecer medidas de higienización durante el
faenamiento de las aves así como el establecimiento de una mejor crianza
por la posible relación de la contaminación de ciegos con piel de carcasa.
Para el análisis de los datos se utilizó Microsoft Excel®.
53
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Presentación de Resultados
Los medios de cultivo utilizados en el aislamiento de Salmonella spp.
presentaron características fenotípicas propias, como se muestra a
continuación.
a
b
c
d
Grafico 3. Medios utilizados en el aislamiento de Salmonella spp. a) MSRV
sin inocular; b) MSRV positivo a Salmonella spp.; c) XLD sin inocular; d) XLD
positivo a Salmonella spp.
54
Tsi
Urea
Indol Lisina
Tsi
K/A
Urea
Neg
Indol Lisina
Neg.
Pos.
b
a
Gráfico 4. Batería Bioquímica: a) Sin inocular b) Positiva a Salmonella spp.
Durante las 10 semanas que duró el muestreo se obtuvo cinco pools de
contenido cecal, de los cuales se identificó Salmonella spp. en 4 (80%).
Resultado de Aislamiento de Salmonella
spp. en contenido Cecal
20%
MUESTRAS DE CONTENIDO
CECAL NEGATIVAS
MUESTRAS DE CONTENIDO
CECAL POSITIVAS
80%
Grafico 5. Resultado de muestras de contenido cecal positivas al aislamiento
de Salmonella spp.
55
Al finalizar el muestreo se obtuvo 75 muestras de piel de pechuga de 5
granjas de la empresa productora de pollo de engorde. De los 25 pools de
piel procesados y analizados durante esta investigación, 20 (80%) fueron
positivos a Salmonella spp. como se muestra en el siguiente gráfico.
Resultado de Aislamiento de Salmonella
spp. en piel
MUESTRAS DE PIEL NEGATIVAS
MUESTRAS DE PIEL POSITIVAS
20%
80%
Grafico 6. Resultado de muestras de piel positivas a Salmonella spp.
La relación de positividad al aislamiento de Salmonella spp. entre las
muestras de contenido cecal y las muestras de piel se observa en el
siguiente cuadro.
56
Cuadro 11. Muestras positivas a Salmonella spp. de contenido cecal y piel.
MUESTREO
N° MUESTRAS POSITIVAS
Sacos Ciegos
Piel
Piel %
Primero
1
5
100%
Segundo
1
5
100 %
Tercero
0
5
100 %
Cuarto
1
2
40 %
Quinto
1
3
60 %
Elaboración: La Autora
De cada muestra positiva se aisló y se conservó dos cepas características de
Salmonella spp. para estudios posteriores.
Para la identificación de los serotipos de Salmonella spp. se utilizó el
esquema de Kauffman-White con antisueros comerciales (Becton Dickinson,
New Jersey-USA) de los antígenos somáticos “O” y flagelares “H” para los
serotipos Enteritidis, Typhimurium e Infantis. De la totalidad de cepas de
Salmonella spp. aisladas de muestras de piel y de contenido cecal (24 en
total) se identificó los serotipos de 9 de ellas, tomando una cepa de piel y una
cepa de contenido cecal de cada muestreo. Los resultados obtenidos en la
serotipificación
evidenciaron
que
el
100%
de
los
aislamientos
correspondieron a Salmonella enterica subespecie enterica serotipo Infantis
con la siguiente fórmula antigénica O: 6, 7, 14: H: r; 1,5. (Cuadro 12).
57
Grafico 7. Muestras características de: a) Inversión de fase b) Aglutinación
con antisueros: prueba en portaobjetos c)
Aglutinación con antisueros:
prueba en tubo (floculación)
ᵃ
Cuadro 12. Resultados de la serotipificación de cepas aisladas de piel y
sacos ciegos.
MUESTREO
ESPECIE SEROTIPIFICADA
Muestras de sacos ciegos
Muestras de piel
Primero
Infatis
Infatis
Segundo
Infatis
Infatis
Tercero
-
Infatis
Cuarto
Infatis
Infatis
Quinto
Infatis
Infatis
Elaboración: La Autora
Discusión de Resultados
El objetivo de la presente investigación fue identificar Salmonella Enteritidis,
Typhimurium e Infantis en carcasas de pollo destinadas a consumo humano
en un camal industrializado de la provincia de Pichincha, utilizando muestras
de sacos ciegos y de piel de pechuga. El aislamiento de Salmonella spp. en
contenido cecal (n=5) y en piel (n=25) mostró que el 80% de las muestras
58
fueron positivas. Así, se demostró la efectividad del método de muestreo
utilizado tanto en contenido cecal como en la mezcla de escisiones de piel.
La presencia de Salmonella spp. en contenido cecal reportada en la presente
investigación (80 %) sugiere que el proceso de evisceración representa un
riesgo importante en la contaminación de las canales durante el sacrificio.
Estudios
realizados en el país difieren en cuanto a los datos obtenidos en
esta investigación. Así, un estudio realizado en granjas avícolas industriales
reporta una presencia de Salmonella spp. del 5% (n=141) (Díaz, 2014). Otros
estudios en contenido cecal de pollos faenados en camal industriales de la
Provincia de Pichincha han reportado aislamientos de Salmonella spp. en el
8,45
%
(n=142)
y 18,78%
(n=34)
(Valseca,
2015;
Larco,
2015).
Investigaciones en otros países Latinoamericanos muestran una presencia
de Salmonella spp. que difiere a la informada en esta investigación. Así, en
Perú se aisló Salmonella spp. en contenido cecal de pollos faenados en un
32.4% (n=170) (Zambrano, 2012), mientras que en Colombia se determinó la
prevalencia de Salmonella spp. en
41% (n=917) en contenido cecal de
pollos faenados (Donado-Godoy et al., 2012). Estas diferencias se pueden
atribuir al pequeño número de muestras analizadas en este estudio, ya que
el fin del mismo no fue determinar un valor de prevalencia, sino la dinámica
de contaminación de Salmonella spp. en la planta de faenamiento.
Por otro lado, la presencia de Salmonella spp. en piel reportada por el
presente estudio (80%) puede ser consecuencia de la contaminación
cruzada entre las distintas fases del procesamiento. Es por eso que, la
evisceración, el lavado, y la inmersión en el chiller son considerados los
puntos críticos más importantes en el proceso de contaminación de las
carcasas (Rasschaert et al., 2008; Rivera-Pérez, Barquero-Calvo, & ZamoraSanabria, 2014; Schambach et al., 2014). Estudios similares de aislamiento
de Salmonella spp. en carcasas de pollo han reportado datos semejantes a
59
los obtenidos por la presente investigación. Así,
países como Estados
Unidos, Polonia, y Portugal reportaron una presencia de Salmonella spp. de
94.5 %, (n=52 lotes), 76,41% (n=106) y 60% (n=60) respectivamente
(Berghaus et al., 2013; Maka et al., 2014; Antunes et al., 2003). En contraste,
otros estudios demuestran prevalencias más bajas de Salmonella spp. en
carcasas de pollos broiler. Reportes en Bélgica, España, Reino Unido y
Alemania informaron la presencia del patógeno en carcasas de pollo en el
36,7% (n=772), 35,8% (n=198), 6,6% (n=139) y 17% (n=89) respectivamente
(Uyttendaele et al., 1998; Domínguez, Gómez, & Zumalacárregui, 2002; Little
et al., 2008; Schwaiger et al., 2012). De manera similar países
latinoamericanos como: Argentina, Perú, México, Bolivia, Colombia y Brasil
reportan una presencia de Salmonella spp. en carcasas de pollo del: 20%
(n=20), 23,5% (n=170), 25.2%, 26%, 28,57% (n=26), 37% (n=378) y 42%
(n=100) (Jiménez et al., 2002; Zambrano, 2012; Fonseca et al., 2010; WHO,
2008; Donado-Godoy et al., 2014; Fuzihara, Fernandes & Franco, 2000). Las
diferencias entre los datos reportados de la presencia de Salmonella spp. en
canales de pollo podrían atribuirse a variaciones en esquemas de muestreo,
tipo de muestras, protocolos de detección de Salmonella spp., y sistemas de
manejo en planta de sacrificio.
En cuanto a la identificación de los serotipos involucrados en los aislamientos
de Salmonella spp., se determinó que el 100% de las cepas aisladas fueron
S. Infantis. Estos datos difieren con los reportados en infecciones humanas
en la Unión Europea y los Estados Unidos, donde los serotipos más
prevalentes son S. Enteritidis y S. Typhimurium (ECDC, 2014; CDC, 2014).
De manera similar estudios en carcasas de pollo en la Unión Europea han
reportado a S. Enteritidis, S. Hadar y S. Typhimurium como los serotipos
más prevalentes (Domínguez et al., 2002; Uyttendaele et al., 1998; Little et
al., 2008). En América del Norte y Latinoamérica los serotipos más comunes
en carcasas de pollo son S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Agona y S.
60
Heidelberg (Logue et al., 2003; Gutiérrez-Cogco et al.,2008; Donado-Godoy
et al., 2014).
Aunque la incidencia de gastroenteritis humana causada por S. Infantis no ha
sido evidente como la causada por otros serotipos de Salmonella spp., cabe
mencionar que este serovar está presente entre los 10 primeros serotipos
aislados de brotes de salmonelosis humana en la Unión Europea y los
Estados Unidos (ECDC, 2014; CDC, 2014). En la industria avícola, S. Infantis
está mundialmente distribuida (Cox, Woolcock & Sartor, 2002). Es así que en
diferentes países S. Infantis ha sido aislada en carcasas de pollo. En Polonia
se reportó a S. Infantis en carcasas de pollo en 18.5 % (segundo serotipo
más frecuente) (Maka et al., 2014). En Brasil el 7.6 % de carcasas de pollo
fueron identificadas con S. Infantis (segundo serotipo más frecuente)
(Medeiros et al., 2011). Los datos reportados en la presente investigación
junto con los anteriormente mencionados confirman la notable presencia de
Salmonella Infantis en granjas y en canales de pollos broiler, lo que
representa un importante riesgo para los consumidores y salud pública en
general en el Ecuador.
61
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones

El aislamiento de Salmonella spp. en el contenido cecal puede ser
una fuente importante de contaminación cruzada de las carcasas
de pollo.

El alto porcentaje de aislamiento de Salmonella spp.en canales de
pollo de engorde destinadas al consumo humano constituye un
importante riesgo para la salud.

Salmonella Infantis puede estar presente en una gran parte de las
carcasas de pollo destinadas al consumo humano en la provincia
de Pichincha, mientras que otros serotipos internacionalmente
identificados como importantes (S. Enteritidis y S. Typhimurium)
pueden tener una baja prevalencia en la avicultura ecuatoriana.
62
Recomendaciones

Realizar estudios complementarios sobre la relación filogenética de
las cepas de Salmonella Infantis identificadas en muestras de piel y
en contenido cecal que puedan ayudar a confirmar una relación de
contaminación cruzada de las carcasas por ruptura de sacos
ciegos durante el faenamiento.

Replicar esta investigación en diferentes puntos críticos de
contaminación dentro de la planta de faenamiento de pollo de
engorde.

Ejecutar estudios de identificación y aislamiento de Salmonella
spp. en carcasas de pollo de engorde en distintos niveles de
expendio en varias regiones del país.
63
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79
67(12),
5431–5436.
ANEXOS
80
Anexo 1. Diagrama Aislamiento Salmonella spp.(Cepas Móviles)
TOMA DE MUESTRAS EN CAMAL INDUSTRIALIZADO
MUESTRAS SACOS CIEGOS
MUESTRAS DE PIEL
CIEGOS
PROCESAMIENTO DE MUESTRAS EN LABORATORIO
Colocarlos en alcohol por 5 minutos
Colocar tres muestras por funda
Cinco repeticiones
Secar los ciegos en sobre una superficie y cortarlos sobre la ampolla cecal
Pesar 25 gr, tomando
8,33 gr de cada una
muestra
Incubar a 37°C por 24 horas
Pesar 25gr de heces, tomando un gramo por cada ciego y homogenizar la muestra
Adicionar 225ml de Agua Peptonada
Sembrar 3 gotas de la muestra incubada en el agar MSRV
Incubar por 24 – 48 horas a 42°C
POSITIVA
(Presencia de halo blanco alrededor del inóculo)
NEGATIVA
Autoclavar
Tomar una azada del extremo del halo y sembrar en XLD
Incubar de 24 - 48h a 37°C
POSITIVA
(Presencia de colonias
transparentes con centro negro)
NEGATIVA
NEGATIVA
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Incubar a
37°C por 24
horas
POSITIVA
TSI
K/A+G
TSI
Urea
Indol
Adicionar 600µl de glicerol
y guardar los tubos a -80°C
Lisina
Incubar a 37°C por 24
horas
Urea
Neg
81
Tomar dos asadas desde TSI y
colocarlos en un tubo
epperdorff con 300µl de TSB
Indol
Neg
Lisina
Pos
Anexo 2. Esquema Para El Uso De Salmonella O Poly A-I Y Vi
Anexo 3. Esquema Para L Uso D Salmonella O Poly Grupos A,B,C,D,E,F
YG
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