cancer

IMPACTO CLINICO DE LA
INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR IV:
Ciclo celular en estados neoplásicos y preneoplásicos.
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl
Caracterización fenotípica
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Microscopio
epifluorescencia
Anticuerpos
ELISA
Citometría de Flujo
Southern blot
Northen blot
Western blot
PCR
Caracterización genotípica
Utilidad clínica
CICLO CELULAR
CICLO DE VIDA DE UNA CELULA (24HRS)
MITOSIS
M
1 hr
G2(4n)
G0 (2n)
4 hr
Post Síntesis DNA
10 hrs
9 hr
Síntesis ADN
S
G1 (2n) Pre-síntesis ADN
Los tiempos de cada fase varían según el modelo celular evaluado
Comparison of a typical normal (A) and malignant
(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein
Comparison of a typical normal (A) and malignant
(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein
Cáncer
Células cancerosas difieren de las normales
1. Pérdida de funciones diferenciadas.
2. Expresión de “neo antígenos” no típicos del
estado diferenciado.
3. Capacidad de invadir tejidos no nativos.
4. Metabolismo diferente.
5. Inestabilidad genética elevada.
6. Morfología anormal.
7. Progresión hacia malignidad.
Alteraciones fenotípicas y genotípicas
Histología
Inmunohistoquímica
Inmunofenotipíficación
Ciclo celular (CF)
Genéticas
Citogenéticas
Análisis citogenético
Análisis citogenético
Hibridización in situ fluorescente
Cariotipo espectral
Análisis de ADN polimórfico
de un tumor mediante PCR
Microarray Information
Figure from:
David J. Duggan et al. (1999) Expression Profiling using cDNA microarrays. Nature Genetics 21: 10-14
Micro Array assay
RNA
CF
HISTOLOGIA
PROTEINAS
DNA
CANCER
FISH
SKY
IHQ
CICLO
CELULAR
MICRO ARRAY
Múltiples eventos
se requieren para
la expresión de un
cáncer humano:
modelo de
carcinogénesis de
colon.
Genes supresores
Oncogenes
Genética del cáncer:
Clases de genes implicados en el cáncer
• Oncogenes
• Genes supresores
• Genes reparadores de DNA
Genes reparadores de ADN
Genes supresores actúan como frenos
Tumor suppressor p53:
“guardian of the genome”
(Inactivado en la mayoría de los tumores por
mutación y LOH)
Oncogenes accionan el acelerador
(apoptosis)
Tumor suppressor p53
Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer de mama
Molecular Cancer 2004, 3:9
Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer de próstata
Molecular Cancer 2004, 3:9
Modelo de progresión de eventos para el desarrollo de cáncer colorectal
Molecular Cancer 2004, 3:9
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
ESTUDIO DE PLOIDIA DE
ADN Y CICLO CELULAR
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN.
ID: Razón de la Cantidad de ADN de la
Muestra v/s el control.
INDICE ADN (ID): Medición de Ploidia de ADN
PLOIDIA
INDICE ADN
ADN Diploide
ADN Aneuploide
ADN Hiperdiploide
ADN Hipodiploide
Contenido ADN Células Muestra
Contenido ADN Células Control
ID =
=1
=1
>1
<1
Rev. Méd. Chile vol. 127 n.11 Santiago Nov. 1999
DNA Analysis
300
300
DNA Analysis
225
225
DNA index 1.21
150
75
Counts
150
0
0
75
Counts
Aneuploid peak
0
200
400
2N
600
800
4N
PI Fluorescence
Purdue University Cytometry Laboratories
1000
0
200
400
600
PI Fluorescence
Purdue University Cytometry Laboratories
800
1000
Transbordador espacial Challenger, 28 enero 1986
D. Hansemann (Virchows Arch Pathol Anat 119:299-326 ;1890)
Descubrió el balance anormal de
cromosomas en células cancerosas
¿Por qué?
Theodor Boveri (Alemania, 1914)
Transbordador espacial Challenger, 28 enero 1986
Mitosis multipolar causa aneuploidía, un balance
anormal de cromosomas, y que ésta produce cáncer
Células cancerosas difieren de las normales
Década 60s
Las investigaciones se centraron en entender las
alteraciones de genes específicos que conducen al
cáncer:
• p53 mutante
• Genes reguladores de la mitosis
• Sobre expresión de proteínas asociadas al
centrosoma
1. Pérdida de funciones diferenciadas.
2. Expresión de “neo antígenos” no típicos del
estado diferenciado.
3. Capacidad de invadir tejidos no nativos.
4. Metabolismo diferente.
5. Inestabilidad genética elevada.
6. Morfología anormal.
7. Progresión hacia malignidad.
Science 271:1744 (1996)
Nature Genet 20:189 (1998)
Science 284: 2089 (1999)
“El cáncer es producido por mutaciones de
genes específicos, llamados oncogenes y
genes supresores de tumores.”
Science 194:23-28 (1976)
Nature 289:353-357 (1981)
Science 285:210-211 (1999)
Science 285:251-254 (1999)
“Un gen mutado o la combinación de
ellos no es suficiente para
transformar una célula normal en
neoplásica”
Science 267:1407-1408 (1995)
Biochem J. 340:621-630 (1999)
Cell cycle 3:823-828 (2004)
Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)
Science 284:2089 (1999)
Science 297:544-546 (2002)
Algunos ejemplos
P53 mutado se ha encontrado en menos de la mitad de los cánceres de colon
inestables genéticamente.
“Casi todos lo cánceres son aneuploides y tienen centrosomas
anormales”
Cell Motil Cystoskel 41:281 (1998)
Cancer Res 58:3974 (1998)
Cell cycle 3:823-828 (2004)
Science 284:2089 (1999)
Nature 392:300 (1998)
Sólo 12% de los cánceres de mama primarios contiene kinasas mutadas.
Nature Genet 20:189 (1998)
Sólo 2 de 19 cánceres de colon aneuploides contienen el gen “checkpoint”
mutado.
Nature 392:300 (1998)
The Aneuploidy-Cancer theory
The Aneuploidy-Cancer theory
Aneuploidía al azar
“Propone que el cáncer es causado por la dosificación anormal
de miles de genes normales”
Estado de Aneuplodía
Desestabiliza genes
y cromosomas
“Esta dosificación anormal de genes es generada por la
ganancia o pérdida de cromososmas específicos o segmentos de
cromosomas, alias aneuploidía”
Proc Natl Acad Sci USA 94:14506-11 (1997)
Biochem J 340:621-30 (1999)
Proc Natl Acad Sci USA 97:3236-4 (2000)
Cell Motil Cystoskel 47:81-107 (2000)
Cell cycle 2:202-10 (2003)
IUBMB life 56:65-81 (2004)
Nature Biotechnol 21:13-14 (2003)
GENES VII (Lewin B.)
Des balance en grupos
de proteínas que
segregan, sintetizan y
reparan cromosomas
Reordenamientos y
acortamientos cromosómicos
Muerte celular por aneuplodía:
Near diploid (2n)
Baja inestabilidad
Cell cycle 3:823-828 (2004)
Near triploid (3n)
Alta inestabilidad y
adaptabilidad
• Nulisomias
• Acortamientos cromosómicos
no viables
• Mutaciones letales
The Aneuploidy-Cancer theory
The Aneuploidy-Cancer theory
Hipodiploidía
¿Cuál es el origen de la aneuplodía?
Ganancia o pérdida cromosómica durante la
división celular:
• Espontánea
• Inducción química
Indice de ADN 0.75 – 1.0
Límite para viabilidad
Hiperdiploidía
Indice de ADN mayor a 1.0
1.5 = triplodía
2.0 = tetraploidía
Mutat Res. 410:3-79 (1998)
Biochem J. 340:621-30 (1999)
Cytometry 22:307-316 (1995)
Biochem J. 340:621-30 (1999)
“La hiperdiploidía prima sobre la hipodiploidía”
The Aneuploidy-Cancer theory
Aneuploidía
Relevancia Clínica de la Aneuploidía en cáncer
Célula no cancerosa
Bajo el límite para el cáncer
1. Malignidad es proporcional al grado
de aneuplodía
Aneuploidía
Célula cancerosa
2. Aneusomias cáncer específico
3. Terapia y prevención del cáncer
Se alcanza o sobre pasa el
límite para el cáncer (en
forma gradual o abrupta)
Cytometry 22:307-316 (1995)
Biochem J. 340:621-30 (1999)
basada en a neuploidía precancerosa.
INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR
Caracterización Morfológica celular y funcional:
•
Conceptos generales de células eucariontes y procariontes.
•
Microscopia luz, epifluorescencia, electrónica, anticuerpos
monoclonales, Técnicas ópticas (láser). marcadores
proteicos/enzimáticos.
Cáncer:
•
Secuencia de mutaciones
•
Teoría de la aneuploidía
Próxima reunión:
•
Relevancia clínica de la aneuploidía en cáncer
•
Ejemplos clínicos
IMPACTO CLINICO DE LA
INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR IV:
Ciclo celular en estados neoplásicos y preneoplásicos.
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.
Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de Flujo
Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl
Caracterización fenotípica
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Microscopio
epifluorescencia
Anticuerpos
ELISA
Citometría de Flujo
Southern blot
Northen blot
Western blot
PCR
FISH
Sky
Microarray
Caracterización genotípica
Utilidad clínica