Documento Normativo ISP-LNyRI N° 01/2010

Laboratorio Nacional y de Referencia de Inmunología
DOCUMENTO NORMATIVO ISP-LNyRI Nº 01/2010
EN CONSULTA PÚBLICA
DETERMINACIÓN DE AUTOANTICUERPOS EN EL LABORATORIO CLÍNICO DE
INMUNOLOGÍA
I.-INTRODUCCIÓN
El Laboratorio Nacional y de Referencia de Inmunología ha realizado a la fecha cinco
Talleres (17 y 18 de octubre de 1996, 5 de diciembre 1997, 3 de noviembre de 2000, 6 de
diciembre 2004 y 2-3 de septiembre 2010), orientados a la normalización en la determinación de
Autoanticuerpos en el Laboratorio Clínico, con la participación de los Laboratorios de la Red de
Inmunología del país, que incorpora tanto laboratorios públicos como privados.
Actualmente, varios Laboratorios Clínicos han impulsado la implementación de un sistema
de calidad que asegure la confiabilidad de sus resultados. Para ello se requiere, entre muchos
otros factores, normalización de las técnicas, métodos y determinaciones que el laboratorio
realiza. Por todo lo anterior, este documento incorpora nuevos elementos de normalización, que
han sido discutidos, analizados y recomendados por los participantes en los diferentes talleres,
realizados bajo la coordinación del Laboratorio Nacional y de Referencia de Inmunología del
Instituto de Salud Pública e incluye observaciones señaladas por los profesionales de la red en
estos últimos años.
II.-REQUISITOS TÉCNICOS (basados en elementos de calidad analítica y metrológica)
1. Autoanticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFI)
1.1.La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para la determinación de la
mayoria de los autoanticuerpos.
1.2 .En el procedimiento general para la determinación de autoanticuerpos por
inmunofluorescencia indirecta: autoanticuerpos anti-nucleares, anti-DNA, anti-mitocondrial,
anti-músculo liso, anti-células parietales gástricas, anti-LKM1, anti-tiroglobulina, antimicrosomal, anti-endomisio, anti reticulina, anti-membrana basal del glomérulo y ANCA,
considerar los siguientes aspectos:
1
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)
En la utilización de reactivos comerciales, se deben seguir las instrucciones de uso
indicados por el fabricante (inserto técnico en español).
Para la elección del sustrato debe considerar su procedencia, tejido o célula, agentes
fijadores y grado de sensibilidad y especificidad.
El conjugado que se debe utilizar es anti-IgG humana-FITC, relación F/P 2 a 3 para los
autoanticuerpos, a excepción de anti-endomisio (punto 1.6) y ANCA (punto 1.7). Si el
conjugado no es de “kit”, se debe usar en la dilución de trabajo determinada por el
laboratorio por el método” tablero de ajedrez”.
La determinación de autoanticuerpos por IFI debe incluir control positivo con trazabilidad
demostrada para los autoanticuerpos que disponen de material de referencia primario y
control negativo de suero humano. Incluir controles por cada placa.
La lectura de autoanticuerpos debe realizarse en un microscopio de epifluorescencia con
lámpara de mercurio de 100 watts o con iluminación LED. Debería utilizarse un “slide”
control de fluorescencia. Mantener registro de tiempo de uso de la lampara.
Como medio de contraste debería utilizarse Azul de Evans.
El líquido de montaje debe ser tampón fosfato salino-glicerol o Tris-glicerol.
Se recomienda el uso de Tris-glicerol porque da mayor estabilidad al fluorocromo.
Mantener registros actualizados de los reactivos utilizados (Nº de lote, fecha de expiración
y fabricante).
Mantener registro de cada determinación con sus resultados y la identificación del
profesional responsable de la emisión.
Las muestras positivas deben titularse a punto final en diluciones múltiplo de 2 hasta un
titulo final 1/1280.
En el informe de resultado se debe incluir el nombre del sustrato, título, patrón fluorescente
cuando corresponda (AAN, ANCA) y la metodología empleada.
El uso de equipo automatizado para IFI debe seguir las indicaciones del fabricante.
1.3. En el procedimiento de la determinación de anticuerpos antinucleares (AAN) por
inmunofluorescencia indirecta considerar:
a) La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para la
determinación de anticuerpos antinucleares.
b) Los sueros controles a utilizar en el procedimiento debería incluir, además un suero
positivo crítico o de punto final.
c) Las diluciones “screening” en células HEp-2 deben ser 1/40 y 1/160. Antes de
realizar las diluciones medir el pH del tampón preparado en el laboratorio (7,2 +/0,1).
d) La exposición de las láminas (sustratos) al medio ambiente antes de su uso debe ser
el indicado por el fabricante.
e) La incubación de los sustratos con los sueros debe realizarse en cámara húmeda y a
temperatura ambiente (20º a 24ºC). La incubación con el conjugado debe realizarse
además, en oscuridad.
f) Para los lavados manuales post incubación con suero y conjugado (evitar que se
mezclen entre sí los sueros de los pacientes y controles), deben efectuarse 2 lavados
de 10 minutos cada vez en tampón fosfato salino 0,01M; pH 7,2 a temperatura
ambiente (20º a 24ºC) en agitación constante. Se recomienda utilizar un agitador
2
magnético. Considerar este punto en la determinación de cualquier autoanticuerpo
por IFI.
g) El conjugado debe utilizarse en la dilución indicada por el fabricante o la
establecida por el laboratorio. El conjugado diluido debe mantenerse en la
oscuridad hasta su uso. En los conjugados prediluidos debe evitarse cambios
continuos de 2 a 8 ºC a temperatura ambiente. Debería alicuotarse y almacenar a la
temperatura indicada.
h) El informe de resultado debería expresarse en UI/mL, cuando el laboratorio
disponga de material de referencia terciario o controles expresados en UI/mL,
además del título correspondiente.
1.4. En la determinación de anticuerpos anti-DNA por inmunofluorescencia indirecta, las
diluciones de “screening” deben ser 1/5 y 1/10.
1.5. En la determinación de anticuerpos anti-músculo liso, anti-mitocondrial, anti-célula
parietal gástrica, anti-LKM1, anti-tiroglobulina, anti-microsomal, y anti-reticulina
por inmunofluorescencia indirecta, las diluciones de “screening” deben ser 1/20 y
1/100. La titulación a punto final es optativa a cada laboratorio.
1.6. En la determinación de anticuerpos anti-endomisio por inmunofluorescencia
indirecta, las diluciones de “screening” deben ser 1/2,5 y 1/5. Si no se utilizan
reactivos comerciales, usar conjugado anti-IgA humana-FITC en la dilución de
trabajo determinada por el laboratorio. En pacientes pediatricos incorporar
conjugado anti-IgA/anti-IgG humana-FITC. La titulación a punto final es optativa a
cada laboratorio.
1.7. En la determinación de ANCA por inmunofluorescencia indirecta considerar:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
La dilución de “screening” para ANCA debe ser 1/20 y 1/100 usando sustrato fijado
en etanol.
Se debe incluir controles positivos para pANCA, cANCA y un control negativo.
Si no se usan reactivos comerciales, el conjugado debe ser anti-IgG humana F(ab`)2 FITC utilizado en la dilución de trabajo determinada por el laboratorio.
En sustrato fijado con etanol, si el patrón es cANCA, debería titularse la muestra a
punto final.
En sustrato fijado con etanol, si el patrón es pANCA, debe confirmarse con sustrato
fijado con formalina y debería titularse a punto final.
La lectura por IFI debería ser realizada a lo menos por dos operadores diferentes y
competentes.
Para informar la presencia de anticuerpos anti-PR3 y anti-MPO en patrones cANCA
o pANCA positivos debe realizar ELISA.
1.8. El operador de lectura e interpretación de autoanticuerpos por inmunofluorescencia
indirecta debe tener competencia cumpliendo con las exigencias del “Procedimiento de
certificación en lectura e interpretación de autoanticuerpos por inmunofluorescencia
indirecta” del Instituto de Salud Pública de Chile o similares.
3
2.
En el procedimiento general para la determinación de autoanticuerpos por
enzimainmunoanálisis (ELISA) considerar los siguientes elementos:
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
i)
En la utilización de reactivos comerciales se deben seguir las instrucciones de uso
indicados por el fabricante (inserto técnico en español).
Conocer la procedencia, caracterización y pureza del antígeno que recubre los
pocillos de la placa: nativo, purificado por proceso químico, columnas
cromatográficas o por inmunoadsorción, sintético u obtenido por ingeniería genética.
La exposición de los pocillos al medio ambiente debe seguir las indicaciones del
fabricante.
Verificar la trazabilidad de los calibradores o controles cuando corresponda según la
disponibilidad de material de referencia primario.
Se debe verificar la conformidad del control de calidad interno indicado por el
fabricante. Llevar registros.
Las lecturas de Absorbancia debe realizarse en un lector de placas debidamente
calibrado en la escala de longitud de onda y absorbancia UV-VIS, con un programa
de mantenciones preventivas al día. Mantener registros.
El laboratorio debería verificar el valor de corte positivo propuesto por el fabricante.
Si corresponde se debería modificar el valor adecuándolo a la población chilena.
Las determinaciones por ELISA de autoanticuerpos antinucleares, anti-DNA, antitiroglobulina, anti-TPO, anti-membrana basal del glomérulo, anti-MPO, anti-PR3
deben confirmarse por inmunofluorescencia indirecta.
El informe debe incluir el resultado expresado en las unidades indicadas en el inserto,
el método, el intervalo y/o valor de referencia señalado por el fabricante o el utilizado
por el laboratorio.
3. En la determinación de Factor Reumatoideo considerar:
a)
b)
c)
NOTA:
Los resultados deben informarse en UI/mL.
El calibrador o control utilizado debe tener trazabilidad.
En el informe de resultados debe indicarse el método, y el valor de referencia
indicado por el fabricante o el utilizado por el laboratorio.
-El término “debe” señala que se aplica.
-El término “debería” señala que su aplicación es opcional.
Santiago, septiembre 2010
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