Profesor Patrocinante Dr. Abel Vásquez Unidad de Biotecnología e
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Profesor Patrocinante Dr. Abel Vásquez Unidad de Biotecnología e Inmunobiológicos Instituto de Salud Pública de Chile Profesor Copatrocinante Dr. Juan Guillermo Cárcamo Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ANTÍGENO PorA DE Neisseria meningitidis: EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE EN RATONES INMUNIZADOS POR VÍA ORAL Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico RICARDO AUGUSTO MANZO PAREDES VALDIVIA – CHILE 2008 1. RESUMEN .................................................................................................................. 1 1.1 ABSTRACT ............................................................................................................... 3 2 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 5 2.1 La Porina de Neisseria meningitidis PorA (Omp1) ..................................................... 7 2.2 Diseño de vacunas ........................................................................................................ 8 2.3 Candidato para vacunas ................................................................................................ 9 2.4 Formulación de vacunas ............................................................................................... 10 2.5 Respuesta inmune ......................................................................................................... 11 2.6 Hipótesis .................................................................................................................. 13 2.7 Objetivos .................................................................................................................. 13 2.7.1 Objetivo general ....................................................................................................... 13 2.7.2 Objetivo específico ................................................................................................... 13 3 0 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 14 3.1. Equipos .......................................................................................................... 14 3.2 Reactivos 15 ................................................................................................. 3.2.1 Antibióticos ....................................................................................... 3.2.2 Kits comerciales ................................................................................ 3.3 Tampones y soluciones 17 17 ......................................................................... 17 3.4 Material biológico ........................................................................................... 19 3.4.1 Animales de experimentación .............................................................. 19 3.4.2 Cepas bacterianas .................................................................................... 19 3.4.3 Vector plasmidial...................................................................................... 20 3.5 Cultivos de cepas bacterianas ...................................................................................... 20 3.5.1. Purificación de DNA plasmidial ................................................................. 20 3.5.2 Digestión de DNA con enzimas de restricción ............................................... 20 3.5.3 Electroforesis de DNA en geles de agarosa .................................................... 21 3.5.4 Visualización de DNA ................................................................................... 21 3.6 Transformación bacteriana con DNA plasmidial .......................................................... 21 3.6.1 Transformación de E. coli usando cloruro de calcio .......................... 21 3.6.2 Preparación de células competentes.................................................... 21 3.6.3 Transformación de células competentes ............................................ 22 3.7 Estudios de expresión .................................................................................................... 22 3.7.1 Ensayo de expresión bajo el control de promotores inducibles por IPTG ................................................................ 22 3.8 Análisis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturante. .................................. 23 3.9 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativa. ................................. 23 3.10 Tratamiento con tripsina y quimotripsina..................................................................... 24 3.11 Western Blot para determinar la expresión y purificación de la proteína recombinante PorA .......................................................... 24 3.12 Purificación de la proteína recombinante Por A de Neisseria meningitidis ................ 25 3.12.1 Purificación de proteína mediante cromatografía de afinidad ................................................................................... 25 3.12.2. Determinación de la concentración de proteínas ............................ 26 3.13 Inmunización de ratones BALB/c con la proteína recombinante formulada con el adyuvante AbISCO PorA ................................................... 26 3.13.1 Preparación de la suspensión para inmunización.............................. 26 3.13.2 Inmunización oral ........................................................................... 27 3.14 Colección y preparación de muestras de los ratones inmunizados ............................ 27 3.15 Cuantificación de la respuesta de anticuerpo por ELISA ........................................... 27 3.16 Cuantificación de la subclase de inmunoglobulina por ELISA de captura ................ 28 3.17 Ensayo bactericida del anticuerpo anti-PorA ............................................................. 29 3.18 Análisis de los datos ................................................................................................... 30 4. RESULTADOS ........................................................................................................... 31 4.1 Selección de los clones con el gen PorA 31 .............................................................. 4.1.1 Análisis plasmidial de los clones .................................................... 4.2 Expresión de la proteína recombinante Por A en E. coli BL21 (DE3) ................... 31 33 4.3 Purificación de la proteína recombinante PorA mediante cromatografía de afinidad ......................................................................................................... 36 4.4 Caracterización bioquímica y molecular de la proteína recombinante PorA ............. 39 4.5 Formulación de la proteína recombinante PorA con el adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX) .................................................................................... 41 4.5.1 Formulación de AbISCO+PorA .......................................................... 41 4.6 Análisis de la respuesta de anticuerpos séricos IgG de ratones BALB/cpreviamente inmunizados con la formulación AbISCO+Por A .................. 43 5.6.1 Respuesta humoral anti-PorA. ............................................................... 43 4.7 Análisis de las subclases de IgA a nivel de mucosa en ratones BALB/c inmunizados oralmente con la formulación AbISCO+PorA y PorA .............................................................. 5.7.1 Respuesta de IgA anti-PorA en secreciones mucosas 45 ................ 45 de los grupos experimentales AbISCO+Por A y PorA ............................. 44 4.8. Análisis de las subclases de IgG: IgG1 e IgG2a en sueros 4.9 Análisis de la actividad bactericida de los grupos experimentales ....................... 52 5. DISCUSION ................................................................................................. 56 5.1 Obtención de la proteína PorA de N. meningitidis serogrupo B .................................. 56 5.2. Caracterización bioquímica y molecular de la proteína PorA ................................... 58 5.3 Proyecciones del uso de un tipo de vacuna basada en antígeno específico formulada con AbISCO (ISCOMATRIX) ............................................... 60 5.4 Evaluación en ratones de la respuesta inmune ........................................................... 61 5.4.1 Inducción de anticuerpos anti-PorA 5.4.2 Inducción de subclases 5.4.3 Respuesta bactericida ................................................ 61 ................................................................... 61 ...................................................................... 64 6. CONCLUSIÓN ......................................................................................................... 67 7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 68 8. ANEXO 78 .............................................................................................................. Anexo 1. Análisis estadístico de la determinación de niveles IgG en los grupos experimentales AbISCO+PorA 10 y 5 µg y PorA 10 y 5 µ g ................................... 78 Anexo 2. Análisis estadístico de la determinación de subclases IgG1 en los grupos AbISCO+PorA 10 y 5 µg y PorA 10 y 5 µ g ............................................................ 79 Anexo 3.Esquema del ensayo bactericida cepa N. meneingitidis serogrupo B:15:P1.3 ........................................................................................... 82 LISTA DE TABLAS Tabla 1: Formulación de dosis unitaria de AbISCO+PorA 10µg y PorA 10µ g .................. 25 Tabla 2: Ensayo Bactericida.Formulación: AbISCO+PorA 10 μg y PorA 10 μg .............. 51 Tabla 3: Ensayo bactericida.Formulación: AbISCO+PorA 5 μg y PorA 5 μg.................... 51 Tabla 4: Resumen de actividad bactericida de los grupos experimentales ensayados ..................................................................................................... 52 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Determinación de la presencia del inserto de PorA. .......................................... 31 Figura 2. Expresión de la proteína recombinante PorA ..................................................... 33 Figura 3 Expresión de la proteína recombinante PorA determinada por Western blot ................................................................................................................. 34 Figura 4 Análisis de purificación de la proteína recombinante PorA desde cultivo de E. coli BL21 (DE3). ....................................................................... 36 Figura 5 Análisis de purificación de la proteína recombinante PorA desde cultivo de E. coli BL21 (DE3) mediante Western blot ................................. 37 Figura 6 Análisis conformacional de la proteína recombinante PorA................................. 39 Figura 7 Integridad formulación AbISCO+ PorA .............................................................. 41 Figura 8 Respuesta sérica de IgG posterior a la inmunización oral de de ratones BALB/c con la formulación AbISCO+PorA 10 y 5 g .............. 45 Figura 9 Respuesta sérica de IgG posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la recombinante PorA 10 y 5 g que lleva el antígeno de la Neisseria meningitidis............................................................................ 46 Figura 10 Respuesta sérica de subclase IgG1 posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la formulación AbISCO+PorA 10 g y 5 g ............... 47 Figura 11 Respuesta sérica de subclase IgG1 posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la proteína PorA 10 g y 5 g ..................................... 48 Figura 12 Respuesta sérica de subclase IgG2a posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la Proteína +AbISCO 10 g y 5 g .........................49 Figura 13 Respuesta sérica de subclase IgG2a posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la Proteína 10 g y 5 g ...........................................50 ABREVIATURAS Amp Ampicilina Br-Et Bromuro de Etidio BSA Seroalbumina de bovino cfu Unidad formadora de colonias D.O600 Densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nanometros IgG Inmunoglobulina G IgA Inmunoglobulina A IgG1 Inmunoglobulina G1 IgG2A Inmunoglobulina G2A IPTG Isopropil--D-tiogalactósido. /Hind III DNA del fago lamda digerido con Hind III /BstE II DNA del fago lamda digerido con BstE II LB Medio de cultivo Luria Bertani LPS Lipooligosacarido Mabs Anticuerpos monoclonales SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio pb Pares de bases PBS 1X Tampon Fosfato Salino. PSA Persulfato de amonio RNasa Ribonucleasa SDS Dodecil sulfato de sodio TSB/A Agar soya triptona suplementado con agar noble Temed N,N,N,N,-Tetremetiletilendiamina. Th1 Células T “Helper” 1 (subpoblacion de linfocitos T) Th2 Células T “Helper” 2(subpoblacion de linfocitos T). Tris-HCL Clorhidrato de tris (hidroximetil) aminometano. 1 RESUMEN La Neisseria meningitidis o meningococo es un patógeno humano exclusivo, el agente causal bacteriano más importante de la enfermedad meningocóccica o meningitis en el mundo. La carencia de una vacuna apropiada contra el meningococo serogrupo B y la recurrencia de brotes epidémicos ha estimulado el estudio de algunas proteínas con potencial inmunoprotector de esta bacteria. Entre las 5 proteínas de la membrana externa del meningococo, se escogió como antígeno protector PorA, porina de carácter catiónico, constituyente mayoritario de la membrana externa, con una configuración clásica de hoja plegada, base de la subtipificación de N. meningitidis con anticuerpos monoclonales y capaz de inducir anticuerpos con carácter bactericida. En el presente trabajo se expresó en la cepa E.coli BL-21(DE3) y purificó la proteína PorA recombinante de la cepa chilena de Neisseria meningitidis B:15:P1.3 (M112/2005) de mayor incidencia en los últimos años según registros del Instituto de Salud Publica de Chile. PorA se ensayó mediante una formulación, utilizando AbISCO100(ISCOMATRIX) como vehículo y adyuvante para inocular ratones por vía oral. Se evaluó la respuesta inmune de un prototipo de vacuna para N. meningitidis serogrupo B en modelo murino. La inmunidad protectora en este modelo de estudio se realizó en forma indirecta debido a la falta de un modelo experimental que reproduzca la enfermedad, es por esto que la determinación de anticuerpos bactericidas es la técnica de referencia para estos efectos. Para estudiar el tipo de balance de Th1/Th2 que genera este prototipo de vacuna en el modelo experimental, se evaluaran parámetros inmunológicos como IgG y sus subclases. Finalmente, se realizaron ensayos bactericidas utilizando sueros de los ratones inmunizados demostrándose la existencia de una actividad significativa. Los datos sugieren que tanto la formulaciones AbISCO+PorA, como la proteína PorA sin adyuvante desarrollaron efectivamente anticuerpos bactericida para N. meninigitidis B:15:P1.3, además estos títulos son protectores según lo descrito en la literatura, por tanto la administración de la proteína PorA formulada con AbISCO , como la proteína PorA sin adyuvante , son una alternativa para el desarrollo de vacunas para N. meningitidis serogrupo B:15:P1.3 1.1 ABSTRACT Neisseria meningitidis or meningococcus, an exclusively human pathogen, is the most important causative bacteriological agent of meningococcal disease, or meningitis, worldwide. The lack of an appropriate vaccine against meningococcus type B and the recurrent epidemic events have stimulated the study of some proteins belonging to this bacterium, in particular those having potential immunoprotective properties. Of the five outer membrane proteins of meningococcus, Por A was chosen as a protective antigen. This protein, a cationic porin and major component of the outer membrane, with a typical sheet protein structure, represents the basis of N. meningitidis subtyping using monoclonal antibodies and is capable of inducing bactericidal antibodies. In this thesis, recombinant Por A protein from Chilean strain B:15:P1.3 (M-112/2005)), of highest incidence in recent years according to available data Chilean Institute of Public Health, was expressed in the E.coli BL-21 and purified. Por A was assayed by formulating it with AbISCO-100, serving as vehicle and adjuvant, for inoculation in mice via the oral route. The immune response against a Neisseria meningitidis vaccine prototype was evaluated in a murine model. The determination of protective immunity in this study was performed indirectly, due to the lack of an experimental model that reproduces the disease, by determining bactericidal antibodies, which is the technique of reference for these effects. In order to study the type of Th1/Th2 balance generated by this vaccine prototype in this experimental model, immunological parameters like IgG and its subclasses were evaluated. Finally, bactericidal assays were done, using sera from immunized mice, demonstrating the existence of significant activity. The data suggests that AbISCO+PorA formulations, as well as non adjuvated PorA, did effectively develop bactericidal antibodies directed against N. meningitidis B:15:P1.3. Additionally, these titers are protective according to what’s been described in the literature. Therefore, the administration of PorA formulated with AbISCO, as well as non adjuvated PorA, are an alternative for the development of vaccines against N. meningitidis, serogroup B:15:P1.3. 2 INTRODUCCION El primer reporte de la meningitis surge en 1805 por Vieusseux, sin embargo, la identificación de la enfermedad y del agente causal Neisseria meningitidis fue en 1887 (Rosenstein et al., 2001). Los agentes bacterianos más importantes causales de esta enfermedad son Streptoccocus pneumoniae, Haemophilus influenzae tipo B y Neisseria meningitidis (Lifely et al., 1992; Jodar et al., 2002). Esta última bacteria es la que presenta una mayor incidencia en los casos de meningitis registrados a nivel mundial (Rosenstein et al., 2001). N. meningitidis es un diplococo Gram-negativo, aerobio, inmóvil, encapsulado, piliado, cuyo reservorio exclusivo es el humano. Se logra aislar cultivando en medios enriquecidos y suplementados (Rosenstein et al., 2001). Las cepas de N. meningitidis se clasifican en serogrupos, serotipos, serosubtipos e inmunotipos. Los serogrupos se basan en las características antigénicamente variables de la cápsula definiendose 13 serogrupos de los cuales 5 de ellos (A, B, C, Y y W135) son los verdaderamente patogénicos (Van der Voort et al., 1996).La serotipificación se refiere a la presencia mutuamente excluyente de las proteínas OMP2 u OMP3 y la subtipificación al reconocimiento de determinados epítopos variables de la proteína de membrana externa clase 1 (OMP 1), también denominada PorA. Los inmunotipos son referidos a los lipooligosacaridos (Hart y Rogers, 1993; Tappero et al., 1999; Rosenstein et al., 2001). Este sistema de clasificación, basado en la reactividad frente anticuerpos monoclonales, tiene sus limitaciones ya que existen cepas, llamadas no tipificables, para cuyos tipos y subtipos no existe aun un anticuerpo monoclonal reactivo. N. meningitidis forma parte de la flora bacteriana normal en las mucosas naso y orofaringe, principalmente en portadores adolescentes y adultos jóvenes (Gold et al. 1978). Su transmisión se realiza por contacto directo, ya sea secreciones orales, nasales o por inhalación existiendo dos formas principales de manifestación clínica de la enfermedad: la meningitis meningocóccica y la meningococcemia o septicemia meningocóccica. La primera es la forma más común, la meningococcemia es menos frecuente, pero altamente letal aún con tratamiento (Tzeng et al., 2000; Schwartz et al., 1989). La meningitis meningocóccica corresponde a la inflamación de las membranas que rodean y protegen al sistema nerviosa central, los síntomas se caracterizan por un inicio súbito de cefalea, fiebre, rigidez de nuca, náusea, vómito, fotofobia y alteraciones neurológicas (Stephens et al., 1999). La meningococcemia es difícil de reconocer fuera del escenario de un brote, sin embargo, se caracteriza por el inicio súbito de fiebre, hay un exantema purpúrico o petequial que puede progresar a septicemia fulminante y finalmente falla orgánica múltiple. El diagnóstico de la meningitis por meningococo se basa en la evaluación del líquido cefalorraquídeo; la punción lumbar constituye un aspecto fundamental. Actualmente, se cuenta con vacunas capsulares tetravalentes, basadas en mezcla de extractos de cápsula, provenientes de los serogrupos A, C, W-135 e Y (Gotchlich et al.,1969).Las vacunas para el serogrupo B basadas en polisacáridos de la cápsula no han resultado por su escasa inmunigenicidad, debido a la semejanza estructural de los polisacáridos capsulares de las cepas del serogrupo B, el cual tiene un polisacárido poco inmunogénico, con un contenido de acido polisiálico, que también se encuentra en células neuronales fetales en humanos. El polisacárido esta constituido por un homopolímero de ácido (2-8) N-acetil-neuroaminico, de composición química similar a las cadenas cortas de ácido neuroamínico que se encuentran en distintas glicoproteínas presentes durante el desarrollo embrionario humano (Finne et al., 1983; Azmi et al., 1995). En el desarrollo de una vacuna efectiva contra N.meningitidis serogrupo B se deben considerar varios aspectos, uno de ellos es la selección de la cepa a partir de la cual se purificará el antígeno a ensayar como prototipo de vacuna. Debido a la variabilidad de las cepas se debe utilizar las de mayor incidencia en la región en que se probará esta vacuna. De hecho en Chile según información del Instituto de Salud Pública de Chile el serogrupo predominante corresponde a la cepa: B: 15:P1.3. Según registros del año 2005 en muestras de líquido cefalorraquídeo de niños menores de un año, el serogrupo B fue un 20%, en niños de entre 1 a 5 años fue un 32%, niños de entre 6 a 14 con un 18,8% y jóvenes entre 15 a 20 con un 4,5 % y finalmente jóvenes mayores de 20 años con un (10%) (Organización Panamericana de la Salud). En esta tesis se propone estudiar; en ratones la respuesta inmune de un prototipo de vacuna para N. meningitidis serogrupo B, basadas en la proteína recombinante PorA formulada con AbISCO (ISCOMATRIX) e inmunizados por vía oral. 2.1 La porina de Neisseria meningitidis - Por A (Omp1) La porina PorA de N .meningitidis es la proteína más abundante presente en la membrana externa de este microorganismo, tiene un peso molecular de 42 kDa (Chao-ming et al., 1981), cuya función es permitir el paso de pequeños solutos catiónicos a través de un poro hidrofilico de membrana. La proteína de membrana externa clase 1(Omp1) o PorA es una proteína trimérica, cada monómero se fija a la membrana a través de estructuras -plegada, proyectando al exterior 8 asas o ´loops` (Van der Ley et al., 1991). Ésta proteína presenta variabilidad principalmente en dos regiones conocidas como asa 1 y asa 4 o región variable 1 (VR1) y región variable 2 (VR2) respectivamente.Dichas asas se relacionan con la antigenicidad de la proteína y constituye dos de los epítopos básicos de la subtipificaciòn, mientras que las asa 2 y 3 están encargados de la interacción monómero–monómero y de la función del poro respectivamente (Derrick et al., 1999; Oomen et al., 2005). Se ha demostrado que esta proteína es capaz de inducir anticuerpos protectivos en humanos (Poolman et al., 1983) y la respuesta humoral inducida en modelo murino presenta un carácter bactericida aún mayor que los inducidos por las proteínas de membrana clase 2 y 3 (Saukkonen et al., 1987). Los antecedentes señalan que la proteína recombinante PorA es un atractivo candidato para el uso como antígeno heterólogo a expresar en un sistema de vectores para la vacunación humana (Humphries et al., 2004). 2.2 Diseño de vacunas El desarrollo de vacuna se han focalizado principalmente en utilizar antígenos de superficie, proteínas de membrana externa (OMPs) o vesículas de membrana externa (OMVs) (Jodar et al., 2002). Previos diseños de vacunas meningocales han incluido la utilización de mezclas antigénicas que contienen OMPs, OMVs del serogrupo B y polisacáridos del serogrupo C como en Brasil (B:4:P1.15), Cuba(B:4P1.15), Chile(B:15:P1.3) y Noruega (B:15:P1.7, 16) (De Moraes et al., 1992; Sierra et al., 1991;Boslego et el.,1995; Bjune et al., 1991),mostraron que las vacunas no confieren protección en el grupo de mayor riesgo de adquirir la enfemedad,es decir,bajo los 4 años de edad. Todas estas vacunas se basaron en cepas del país de origen, lo que pueden ofrecer escasa protección contra otras cepas en otros países, es el caso del uso de la vacuna cubana en Brasil (De Moraes et al., 1992). Una vacuna promisoria sería de antígenos de cepas locales y de estructura conservada en distintas cepas de Neisseria miningitidis para el uso a nivel mundial. 2.3 Candidato para vacuna Las porinas de bacterias Gram negativas son candidatas muy atractivas para la elaboración de vacunas recombinante contra patógenos de esas características. Estas son proteinas de membranas externas de la bacteria, tienen una función biológica claramente definida en el transporte de nutrientes y ofrece grandes posibilidades para la elaboración de una vacuna contra la meningitis meningocócica (Niebla et al., 2003). La proteína Por A de N. meningitidis serogrupo B se ha expresado y purificado a partir de cepas recombinantes, facilitando la producción de proteína libre de otros antígenos del meningococo. Este sistema es de mucha utilidad para estudiar otras proteínas de la membrana externa que se encuentran en bajas concentraciones o que están sometidas a control ambiental (Ward et al., 1996; Qi et al., 1994). Esta además es responsable de la diferencia de los serotipos encontrados en varios países (Van Der Ley et al., 1995), induce respuesta inmune bactericida (Heikkila et al., 1995) y esta asociada con la producción de anticuerpos contra la proteína (Rosenqvist et al., 1995; Peeters et al., 1996). La identificación de nuevos candidatos que protejan contra la enfermedad meningococal, se basan principalmente en la secuenciación del genoma, lo que supone que los productos genicos pueden servir para desarrollar títulos bactericidas protectores. Aún no se ha logrado identificar secuencias altamente conservada a través de una gama de cepas y que estas induzcan anticuerpos bactericidas, una propiedad conocida que correlaciona la eficacia de una vacuna meningococal (Pizza et al., 2000). 2.4 Formulación de vacuna En los últimos años se han utilizado los Complejos Inmunoestimulantes (ISCOMs), para la formulación de vacunas. Los ISCOMs están formados por una mezcla de lípidos, colesterol y saponinas (Barr y Mitchell, 1996; Kersten et al., 1991; Sjolander y Cox, 1998), que interactúan entre sí a través de interacciones hidrofóbicas, repulsiónes electrostáticas, factores estéricos y puentes de hidrógeno. Cuando los ISCOMs no tienen proteínas se les denomina AbISCO-100 (ISCOMATRIX) (Barr y Mitchell, 1996; Kersten et al., 1991; Sjölander et al., 1998) a los que se les puede insertar proteínas en su estructura con un fin inmunológico. El AbISCO son estructuras esféricas, compuestas por varias micelas, las cuales se disponen en una forma anular con un poro hidrofóbico en su parte central. La disposición final de estas micelas asemeja a una “jaula” y su tamaño oscila entre los 40 y 100 nm de diametro (Barr y Mitchell, 1996; Bengtsson y Sjölander, 1996; Kersten et al., 1991; Copland et al., 2000). Cada uno de los componentes tiene una función especifica.Las saponinas, extraídas de la Quillaja saponaria, poseen una actividad adyuvante propia, aumentando de manera no específica, la actividad inmunológica (Barr et al., 1998; Yuki y Kimono, 2003). El ácido glucurónico, que está presente en las cadenas de azúcares de la saponina, le confiere al ISCOM una carga superficial negativa (Barr y Mitchell, 1996; Kersten et al., 1991; Barr et al., 1998; Kersten y Crommelin, 1995; Pearse y Drane, 2005). El colesterol, permite la interacción entre la saponina y los fosfolípidos, dándole estabilidad a la estructura. Los fosfolípidos permiten la fluidez y favorecen la disposición de las proteínas dentro de la membrana (Barr y Mitchell 1996; Kersten y Crommelin 1995; Sjölander et al., 1998).En este contexto, los ISCOMs, debido a su propiedad adyuvante (O`Hagan et al., 2001), servirían para transportar proteínas de Neisseria meningitis (Peeters et al., 1999). Se han realizado estudios clínicos usando vacunas basadas en AbISCO (ISCOMATRIX), en los cuales se incluye las oncoproteinas del virus papiloma humano que son asociadas con cáncer cervical, para la inmunoterapia del cáncer (Stewart et al., 2004). Estos resultados demuestran el potencial del adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX) de estimular respuestas inmune celular y humoral frente a los antígenos endógenos usado como blanco. 2.5 Respuesta Inmune Los mecanismos inmunes naturales y adquiridos son importantes durante la infección con meningococo, y la inmunidad está dada por la presencia de anticuerpos en el suero capaces de inducir la actividad bactericida mediada por el complemento (Al-Bader et al., 2003; Goldschneider et al., 1969). Estos mecanismos inmunes están dirigidos al reconocimiento de moléculas antigénicas específicas definidas como patrones moleculares asociado a patógeno (PAMPS), tales como, Lipooligosacárido, LPS (Kopp et al., 1999) por receptores de reconocimiento de patrones específico, el cual incluye la familia de receptores tipo Toll (TLRs) (Ozinsky et al., 2000;Kopp et al.,1999). Es probable que dentro de la mucosa nasofaringe, el meningococo entero y la vesícula de membrana externa (OMV) actuan recíprocamente con las células especializadas en la presentacion de antígeno llamadas células dendríticas (DC). Las células dendríticas residen en varios órganos, entre ellos, la vía respiratoria. Estas células cuando están en un estado inmaduro expresan TLRs. Una vez que las DC interactúan con componentes microbianos, captura, procesa y presenta los antígenos.La DC presentan los antígenos foraneos en su superficie en forma de complejo péptido-MHC, lo que permite activar las céulas T. La evidencia sugiere que la naturaleza del estímulo recibido por las células dendríticas desde agentes foráneos, puede condicionar o modular su interacción con las células T y por lo tanto determinar el tipo de respuesta de Th1 o Th2 (Al-Bader et al., 2003). La naturaleza de los estímulos derivados de los microorganismos, los cuales son recibido por las células dendríticas también determina los patrones de expresión de MHC y coestimulan moléculas que son criticas para influenciar la diferciación de Th1 o Th2.Así, después de la presentación del antígeno por las DC a las células T, las señales coestimuladoras entre estas células y el efecto neto de las citoquinas pro inflamatoria e inhibitorias se propagan para dirigir el desarrollo de las respuestas primarias de la células T. Es posible que las respuestas celulares de las DC a los antígenos de la membrana externa meningococcal (OM) son necesarias para la iniciación de una respuesta inmune específica dependiente de anticuerpos que va a ser regulada por los linfocitos de Th2. Así, el conocimiento entre las DC al estímulo con OM es importante no solamente para entender el proceso de la enfermedad sino también para el desarrollo de vacunas eficaces (Al-Bader et al., 2003). 2.6 Hipótesis Dado a que los AbISCO son potentes adyuvantes para el desarrollo de vacunas, la proteína PorA de N. meningitidis serogrupo B es uno de los principales antígenos descritos para desarrollo de vacunas y la vía de estimulación de la respuesta inmune vía mucosa es una atractiva alternativa para el desarrollo de vacunas, se propone la siguiente hipótesis: “La proteína PorA de N. meningitis serogrupo B formulada con AbISCO (ISCOMATRIX), ensayada mediante inmunización vía oral, induce inmunidad protectora” 2.7 Objetivos 2.7.1 Objetivo General Evaluar la inmunidad protectora en ratones inmunizado mediante vía oral, con la proteína recombinante PorA de N. meningitidis segrupo B, formulada con el adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX.). 2.7.2 Objetivos Específicos 1.- Obtención de la proteína PorA de N. meningitidis serogrupo B de la cepa de mayor incidencia en Chile (B:15:P1.3) por expresión heteróloga en E. coli BL21(DE3). 2.- Formulación de una vacuna de subunidad del tipo AbISCO (ISCOMATRIX) con PorA de N. meningitidis serogrupo B como antígeno inmunizante. 3.- Evaluación de la respuesta inmune en ratones inmunizados con la proteína recombinante PorA formulada como AbISCO (ISCOMATRIX) y administrada vía oral. 3.0. MATERIALES Y METODOS 3.1 Equipos Agitador Termo regulado VWR Scientific Inc. modelo Iia. Agitador magnético Thermolyne modelo Nova II. Agitador oscilante Thomas modelo 3623. Autoclave Conbraco Ind modelo AC50. Baño termorregulado Memmert modelo D91126. Bomba Peristáltica Bio-Rad modelo EP-1 Econo Pump. Balanza Analítica Chyo modelo JK-180. Centrifuga Sorvall modelo RC2-B superspeed, rotor SS-34. Centrifuga Hermle modelo Z323 K, rotor vaculante 221.05 V01. Cámara de electroforesis y electrotransferencia de geles marca Bio-Rad modelo Mini Protean II. Calentador de muestras Trilab Instruments. Concentrador de proteína Milipore Centriprep YM-10,10 kDa Colector de fracciones Bio-Rad modelo 2110. Espectrofotómetro Spectronic modelo Genesys 2. Estufa de cultivo Jouan modelo S 35. Estufa de cultivo de CO2 VWR Scientific Inc. modelo 1720. Fuente de poder E-C Apparatus Corporation modelo 3115FS. Gabinete de bioseguridad clase II Esco modelo AC2-3AI. Gabinete de bioseguridad clase II Napflow modelo 12NF Horno de esterilización Heraeus modelo TU-60/60. Lector de Elisa Bio-Rad modelo 550. Microcentrifuga de sangre Jenetzki modelo TS. Microcentrifuga de sangre Jenetzki modelo TS. Microondas Somela modelo 2200. Medidor de Ph Hanna HI 9321 con electrodo Corning HI 1332. Refrigerador -80 °C Forma Scientific Inc. modelo 938. Refrigerador -20 °C Samsung modelo Tornado. Sonicador Fisher Scientific modelo 100. Transiluminador Vilber Lourmat modelo TFX-35M Visualisador de geles Bio-Rad 2111. Vortex Thermolyne modelo Maxi mix II. Vitrina refrigerada PH Electrónica modelo S12. Shaker Lab. Companion modelo SI-600. 3.2 Reactivos - Applichem Gmblt: PMSF, bromuro de etidio - Bio-Rad Laboratories Inc., Melville, NY, USA: reactivo Bradford, estándar de BSA - BBL, Beckton, Dickinson and Company, USA: suplemento isovitalex y diluyente - Calbiochem, Inc.la jolla, Ca, USA: guanidina, BCIP/NTB - Invitrogen, BenchMark, USA: estándar de peso molecular de proteínas de rango amplio preteñido. - Us-biological, USA: IPTG, RNAsa, azarosa - Difco Lab. Ditroit, MI, USA: agar-agar, SS-agar, extracto de levadura, triptona pancreática digerida de caseína, agar soya-triptona, infusión cerebro corazón, agar noble, agar granulado. - Gibco BRL, Maryland, USA.: estándar de peso molecular, glicina, papel de nitrocelulosa. - Fermentas Inc. USA: estándar de peso molecular de proteínas de rango amplio - J. T.Baker, S.A de C.U: bicarbonato de sódio, fosfato de potasio monobásico, fosfato de sódio dibasico, carbonato de potasio, azul de coomasie R-250. - Isconova AB, Uppsala, Sweden: adyuvante AbISCO. - Invitrogen corporation, Carlsbad, Ca, USA: agarosa de Ni-NTA - Merck, Darmstadt, Alemania: agarosa, glucosa, etanol, acido acético glacial, hidróxido de sodio, acido sulfúrico 37%, cloruro de sodio, urea, metanol, glicerol, sulfato de níquel, cloruro de níquel, hidróxido de sodio, dimetilsulfoxido (DMSO), SDS, carbonato de sodio, azida de sodio. - Nalge Nung, Internacional, Denmark: placas Inmuno-Nunc de superficie plana. - New England Biolabs Inc., Beverly, MA, USA.: marcador de proteínas preteñido rango amplio. - Novagen Corporation, Madison, USA: resina Ni-NTA His-Bind. - Nipro Corp, Osaka, Japan: sonda pediátrica orogastrica 25Gx3/4 T.W. (0,5X19). -. Sigma Chemicals Co., St Louis, USA.: acrilamida, bisacrilamida, kanamicina, anti-IgG de ratón , EDTA, TEMED, estreptomicina, azul de bromofenol, β-mercaptoetanol, cloruro de calcio, Tween-20, BSA, Cloruro de carbamilcolina (carbacol), p-nitrofenil fosfato sal disodica. 3.2.1 Antibióticos Se emplearon los siguientes antibióticos para ser usadas en medios de cultivo y placas de agar. Kanamicina: Concentración de trabajo 50 ug/mL. Ampicilina: Concentración de trabajo 100 ug/mL. 3.2.2 Kits comerciales. Determinación de concentración de proteínas en solución: Bio-Rad Protein Assay Basado en el Método Bradford. Kit de purificación de ácidos nucleicos :E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kid I (Omega) Cuantificación de subclase de inmunoglobulina G de ratón: Kit ELISA, (BD Biosciences). 3.3 Tampones y soluciones. Solución salina tampón fosfato (PBS 10X) NaCl 2,7mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4 .10 mM, KCl 2,7 mM PH 6,8. Tampones para anticuerpos, (soluciones de lavado y bloqueo) PBS 1X, PBS-BSA 5 % PBS-BSA1%, PBS-Tween 20 0,01 %, PBS-leche descremada 1 %. Revelado de Western blot: sustrato para la enzima peroxidasa (BCIP-NBT): 0,57 mM BCIP 0,122mM NBT. Tampón para transferencia de proteínas: Tris base 125 mM, glicina 192 mM, metanol 20 %. Solución activadora de placa de ELISA: tampón carbonato/bicarbonato: 0,05 M pH 9,6. Solución de acrilamida –bis: 30% de acrilamida y 0,8% de bisacrilamida. Solución de persulfato al 10%. Solución A: Tris –HCL 1,5 M pH 8,8, SDS 10%. Solución B: Tris –HCL 0,5 M pH 6,8, SDS 10%. Solución de carga (2x): Tris-HCL 0,125 M pH 6,8, SDS 6%, glicerol 20%, Β-mercaptoetanol 10%, azul de bromofenol 0,005%. Solución de teñido de geles de poliacrilamida :metano50 %l, ácido acético10 %, Azul de Coomassie 0, 25 %. Solución de desteñido de geles metanol 45 %, ácido acético7 %,agua 40% Solución de corrida de electroforesis: Tris-HCL 0,125, glicina 192 mM, SDS 1% Solución de diálisis 20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 8,0 Solución de lisis de bacterias.: Tris–HCl 0,125 mM pH 6.8, SDS 10%, ß mercaptoetanol 10%, glicerol 20%, azul de Coomassie 0,05%. Solución de lisis condición denaturante: guanidina 6 M, fosfato de sodio 20mM pH 7,8, NaCL 500 mM. Solución de unión condición denaturante: urea 8 M, fosfato de sodio 20mM pH 7,8, NaCL 500 mM. Solución de lavado condición denaturante: urea 8 M, fosfato de sodio 20mM pH 6,0, NaCL 500 mM. Solución de elusión condición denaturante: urea 8 M, fosfato de sodio 20mM pH 4,0, NaCL 500 mM. Solución A (10x) condición denaturante: fosfato de sodio monofasico 200 mM, NaCL 5 M. Solución B (10x) condición denaturante: fosfato de sodio dibasico 200mM, NaCL 5 M. Solución de Hanks: NaCO3 4 mM , glucosa y seroalbumina de bovino 0,1 %. 3.4 Material Biológico 3.4.1 Animales de experimentación. Ratones BALB/c, hembras de 8 a 12 semanas, procedentes del Bioterio del Instituto de Salud Publica de Chile. 3.4.2 Cepas bacterianas Las cepas utilizadas fueron las siguientes: Neisseria meningitidis: Cepas aisladas de cuadros invasivos B:15:P1.3(1) (M-225/2003;M-11/2005).(1) Escherichia coli BL-21 (DE3): F΄ompT hsdSB (rB- m B-derivada de E. coli B) con un profago λ portador de gen de la RNA polimeresa del fago T7. (2). Escherichia coli DH5 α: F΄lendA1 hsdR17 (rk- m k-) glnv44 thi-1 recA1gyrA (Nalr) relA1Δ (laclZYAçargF) u169 deoR (Ø80LacZ ΔM15) (3). (1) Sección de Bacteriología general, Laboratorio de Referencia de Neisseria meningitidis, Instituto de Salud Publica de Chile (2) y (3) Cepario del Laboratorio de la Unidad de Biotecnología e Inmunobiológicos del Instituto de Salud Publica de Chile. 3.4.3 Vector plasmidial. Se uso el vector plasmidial: pET21a (NOVAGEN) que contiene el gen de la proteína por A de la cepa bacteriana de Neisseria Meningitidis B:15:P1.3 disponible en el Laboratorio de la Unidad de Biotecnología e Inmunobiológico del Instituto de Salud Publica de Chile. 3.5 Cultivo de cepas bacterianas Las cepas de Neisseria meningitidis serogrupo B de cuadros invasivos B:15:P1.3 (M112/2005) fueron incubadas en placas de agar sangre, realizándose traspasos sucesivos y incubadas finalmente por 18-24 h a 37º C en 5% C02. Las cepas de E.coli BL-21 (DE3) se inocularon en caldo Luria a 37º C con agitación durante toda la noche a 220 rpm, mientras que las cepas transformadas con el vector plasmidial pET21a-PorA se incubaron en caldo Luria a 37º C y 30º C con agitación durante toda la noche a 220 rpm con el antibiótico correspondiente. 3.5.1 Preparación del DNA plasmidial La purificación de los plásmidos recombinantes se realizó utilizando el kit E.Z.N.A Plasmid Miniprep I, según las instrucciones del fabricante, alternativamente se utilizó el método de lisis alcalina (Birnboim & Doly, 1979) 3.5.2 Digestión de DNA con enzimas de restricción Se incubaron 50 µL de volumen total de los siguientes componentes: 10 µL (100 ng) de templado, 3 µL de cada enzima Hind III y NdeI ,10 µL de amortiguador y 24 µL de agua de biología molecular, la mezcla se incubo a 37 0C por toda la noche, para su posterior análisis. 3.5.3 Electroforesis de DNA en geles de agarosa El análisis de los fragmentos resultante de la digestión DNA se realizó en geles de agarosa al 1%. La muestra fue incubada en solución de carga 6X (Fermenta), luego fueron cargadas y resueltas en tampón TAE 1X a 90 mA por 1 h. 3.5.4 Visualización del DNA Las bandas de DNA fueron teñida en una solución de bromuro de etidio (1 µg/mL) por 20 min para ser analizadas en un transiluminador U.V . 3.6 Transformación bacteriana con DNA plasmidial 3.6.1 Transformación de E. coli usando cloruro de calcio La transformación se realizó según Weston et al. (1981) que se basa en la permeabilización de las células con CaCl2 0,075mM. 3.6.2 Preparación de células competentes Se cultivaron inoculos de E .coli en 3 mL de medio LB toda la noche a 37ºC en agitación. Se inocularon 100 mL de medio LB con 1mL de cultivo saturado y se incubó con agitación hasta alcanzar una O. D600nm: 0,4-0,6 .A esta O.D. se encuentra en una fase exponencial lo que se asocia a un estado de mayor desarrollo metabólico de la bacteria, luego se mantuvieron en hielo por 10 min. Las células se centrifugaron en tubos estériles por 10 min a 4000 x g en centrifuga Sorvall RC2-B con un rotor SS-34 a 4º C, se descarto el sobrenadante y las células se resuspendieron en 5 mL de una solución fría y estéril de CaCl2 0,075mM. Finalmente, las células se almacenaron en alícuotas de 200 µL en tubos estériles con glicerol al 15%, y se congelaron a -70ºC. 3.6.3 Transformación de células competentes La transformación de células competentes fue llevada a cabo con 20µL de E. coli BL-21(DE3) a los que se les adicionó 2 µL del DNA plasmidial (pET21-porA), luego fueron incubadas en hielo durante 45 min y posteriormente sometidas a un pulso de temperatura de 42ºC por 1 min. Esta mezcla se agrega a 1 mL de medio LB y se incuba a 37 ºC por 1h con agitación, luego se centrifugó a 1min a 4000 rmp. El pellet que contiene el DNA plasmidial en las células E. coli BL-21(DE3) se resuspendió, de ese medio de cultivo se sembraron 100 µL en placas con agar Luria el que contenía como medio de selección el antibiótico ampicilina. 3.7 Estudios de expresión. 3.7. 1 Ensayo de expresión bajo el control de promotores inducibles por IPTG. Una colonia aislada transformada de E.coli BL-21(DE3)-pET21a-PorA se inoculo en 50 mL de medio LB suplementado con 500 µL glucosa estéril (0.4%) y 250 µL de ampicilina(100mg/mL) , toda la noche a 37 ºC con agitación a 220 rpm, luego se incubo 1000 mL de caldo Luria con 10 mL de cultivo saturado(1/100) a 37ºC con agitación hasta una O.D.600nm entre 0,4-0,5 .Posteriormente se adicionó IPTG a una concentración final de 1mM a 30º C en agitación por 3 h aproximadamente hasta inducir la expresión de la proteína recombinanate PorA. Finalmente las muestras se centrifugaron por 15 min a 5000 rmp a 4 º C usando una centrífuga Sorvall RC2-B, con un rotor SS-34, las cuales fueron lisadas con tampón de lisis 2x. La expresión de la proteína recombinante PorA fueron analizadas en geles de poliacrilamida al 12% en condiciones denaturante y por Western blot. 3.8 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturante. El análisis de la expresión y de purificación se realizó mediante geles de poliacrilamida al 12%. Las muestras fueron mezcladas con tampón de carga 2x durante 5 min a 100º C, cargadas y resueltas en tampón por 1h a 100 V hasta que el indicador alcanzó un centímetro del borde del gel. Finalmente el gel fue extraído y teñido con una solución colorante azul de coomasie R-250 por 30 min, para ser desteñido mediante una solución decolorante ,hasta que las bandas se observen sobre un fondo claro. 3.9 Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones nativa El análisis de las muestras de proteína recombinante PorA incubadas con las enzimas tripsina y quimotripsina, se realizaron en geles de poliacrilamida nativa al 12%. Las muestras fueron en seguida mezclados con tampón de carga 2x y incubadas por 10 min a dos temperaturas diferentes: temperatura ambiente y 100 ºC.Las electroforesis fueron corridas por 4-5 h a 20mA a temperatura controlada de 4 ºC para evitar la denaturación, se utilizaron estándares preteñidos de proteína con tamaños conocidos como referencia del patrón de migración.Finalmente el gel fue teñido con una solución colorante azul de coomasie R-250 por 30 min, para ser desteñido mediante una solución decolorante, hasta que las bandas se observen sobre un fondo claro. 3.10 Tratamiento con tripsina y quimotripsina de la proteína recombinante PorA La resistencia a la digestión de tripsina y quimotripsina fue realizada con el fin de determinar en que estructura conformacioal se encontraba la proteína recombinante PorA al momento de ser inmunizada. La muestra de proteína recombinate PorA fue incubada con 50µg/mL de tripsina y quimotripsina a temperatura ambiente por 15 min. Posteriormente las muestras fueron mezcladas con inhibidor de proteasa 1x (1µl/mL) para detener el proceso de digestión y luego mantenidas en hielo por 10 min. Previo a la electroforesis en condiciones nativa, la muestra de proteína tratada con las enzimas, se cargaron con tampón de carga 2x, luego las muestras fueron incubadas a temperatura ambiente y 100 0 C por 10 min. Para los geles resolutivos como concentrador de poliacrilamida fue eliminado el SDS y resueltos a 20mA a temperatura controlada de 40 C por alrededor de 3-4 h. Finalmente el gel nativo fue transferido a una membrana de nitrocelulosa y la electrotransferencia se realizó 20 mA durante 4-5 h, para posteriormente ser revelado. 3.11 Western Blot para la determinar la expresión y purificación de la proteína recombinante PorA Las muestras de proteínas recombinantes son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, luego transferida a una membrana de nitrocelulosa a 200 mA durante 1 h. Posteriormente la membrana de nitrocelulosa con las proteína transferidas, se incubaron en una solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h o 4º C por 10 h.Una vez bloqueado los sitios libres de la membrana de nitrocelulosa, se incubó durante 1 h a temperatura ambiente en agitación con sueros policlonales de conejo en solución de bloqueo en una dilución 1:1000, los anticuerpos unidos en forma inespecífica se eliminaron lavando 3 veces por 10 min con la solución de lavado. Los anticuerpos que se unieron a las proteínas presentes en la membrana de nitrocelulosa se visualizaron incubando 1 h a temperatura ambiente en agitación con anticuerpo anti-IgG de conejo, conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:1000 en la solución de bloqueo luego de lavar en las condiciones ya descrita, los anticuerpos unidos inespecíficamente se eliminaron .El conjugado unido fue revelado incubando la membrana de nitrocelulosa con 20 mL BCIP/NBT, la reacción se detuvo agregando abundante agua destilada. 3.12 Purificación de la proteína recombinante Por A de Neisseria meningitidis. 3.12.1 Purificación de la proteína PorA mediante cromatografía de afinidad Para la purificación de la proteína recombinante se empleó una resina Ni-NTA HisBindR (Novagen) según las indicaciones del fabricante. El pellet bacteriano proveniente de la expresión (E. coli BL-21DE3-pET21-porA) fue tratado con la resina Ni-NTA His-BindR. De este pellet se obtuvieron 0,5 g de células en peso seco de un volumen 50mL, los que se resuspendieron en 8 mL de tampón de lisis en condiciones denaturante, luego se agrego 8 mg de lisozima y fue incubada en hielo por 30 min.El extracto fue lisado por sonicación (Sonicador Fisher Scientific- modelo 100) y se centrifugó durante por 15 min a 5000x g a 4º C. El sobrenadante se filtro y aplicó a la resina Ni-NTA, previamente tratada con tampón de unión, luego la mezcla fue incubada durante 1 h a 4º C y lavadas 2 veces con 8 mL de tampón de lavado. Finalmente la mezcla fue eluida con tampón de elusión .Las muestras eluídas fueron analizadas por geles de poliacrilamida y Western Blot. 3.12.2 Determinación de la concentración de proteínas A cada muestra de trabajo se le determinó la concentración de proteínas a través del método de Bradford usando seroalbúmina bovina como estándar. 3.13 Inmunización de ratones BALB/c con la proteína recombinante Por A formulada con el adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX). 3.13.1 Preparación de la suspensión para inmunización. Se prepararon dosis en una cantidad 10 y 5 µg de proteína recombinante purificada, formuladas con el adyuvante AbISCO y dosis de 10 y 5 µg de proteína recombinante sin adyuvante según las indicaciones del fabricante. Para la formulaciones AbISCO+proteína, se mezclaron 50 µL de AbISCO con 10 y 5 µg de proteína llevando a un volumen final de 250 µL con buffer bicarbonato al 10%. Para las dosis de 10 y 5 µg de proteína recombinante sin adyuvante, se procedió de la misma forma descrita anteriormente. (Tabla 1) Tabla N0 1 Formulación de dosis unitaria Grupo experimental Cantidad -proteina AbISCO Volumen (µg) (µL) (µL) G1: Control ----- ----- 250 G2: AbISCO+PorA 10 50 250 G3: PorA 10 ----- 250 G4: AbISCO+PorA 5 50 250 G5: PorA 5 ----- 250 Total 3.13.2 Inmunización oral Se inmunizaron grupos de 8 ratones BALB/c de 8 a 12 semanas, hembras, por vía oral con sonda orogástrica pediátrica de 0,5x19mm de diámetro según indicaciones del fabricante, con las distintas formulaciones indicadas en la tabla N01. La inmunización primaria consistió en 3 dosis administradas en un periodo de 6 días y un booster o inmunización secundaria de dosis única, después de 20 dias. 3.14 Colección y preparación de muestras de los ratones inmunizados. Se recolectaron muestras de suero y saliva un día antes de iniciar la inmunización (muestras pre-inmune), 4 semanas después de la inmunización primaria (muestras prebooster) y 10 días después del booster o inmunización secundaria (muestras booster). Los ratones fueron anestesiados con éter etílico sobre algodón, en una cámara hermética para la inmunización. Las muestras de suero se obtuvieron por vía ocular retro orbital en una cantidad de 200 uL de sangre utilizando un capilar de 75 mm de largo según indicaciones del fabricante. Los sueros fueron almacenados a -20 ºC hasta su uso. La saliva se colecto mediante una micropipeta después de 5 min de estimular el flujo salival en el animal con una inyección intraperitoneal de 5 µg de carbacol diluido en 200 µL de PBS estéril. Las muestras de saliva se almacenaron a -20ºC. 3.15 Cuantificación de la respuesta de anticuerpo por ELISA. Placas de ELISA fueron activadas con 1 μg de proteína recombinante Por A en un volumen de 100 µL por pocillo durante toda la noche a 4ºC, luego se bloqueó la placa con 200 µL con solución de bloqueo por 1 h a temperatura ambiente y posteriormente fueron lavados 3 veces con 200 µL de solución de lavado por 10 min. En seguida se agregó 100 uL de las diluciones seriadas de las muestras de suero y saliva de los ratones inmunizados en solución de bloqueo y se dejó incubar 1 h a 37ºC .Luego los pocillos fueron lavados 3 veces con 200 µL de solución de lavado y dos veces con PBS, inmediatamente se agregó anti IgG o anti IgA de ratón conjugado con fosfatasa alcalina a una dilución 1/1000 por 1h a 37ºC. Posteriormente los pocillos fueron lavados con solución de lavado. Finalmente, el conjugado fue revelado con 100 µL de solución p-nitrofenilfosfato (Pnpp) por 30 min a temperatura ambiente en oscuridad, siendo detenida la reacción con una solución de 50 µL de hidróxido de sodio 3 M. La medición de absorbancia fue realizada a 405 nm. 3.16 Cuantificación de subclase de inmunoglobulina por ELISA de captura. Placas de ELISA fueron activadas con 50 µL con anticuerpo monoclonal (de captura) específico para el subtipo IgG1 o IgG2a, diluido en PBS 1x según las indicaciones del fabricante, incubándose a 37ºC por 1 h a temperatura ambiente. Luego cada pocillo fue lavado con 200 µL de solución de lavado por 10 min. y bloqueados con una solución de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente. En seguida se agregó 100 µL de las muestras de suero y saliva a una dilución 1/1000 durante 1 h a temperatura ambiente, inmediatamente fue lavado 3 veces con 200 µL de solución de lavado. Posteriormente se agregó el anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente, luego se lavó 2 veces por 10 min con solución de lavado. Finalmente se reveló con 100 µL de sustrato para la enzima peroxidasa (HRP) proporcionada por el fabricante. La reacción se llevó a cabo por 10 min a temperatura ambiente y siendo detenida con una solución proporcionada por el fabricante. La absorbancia fue determinada a 450nm. 3.17 Ensayo bactericida del anticuerpo anti-PorA Este ensayo se realizó de acuerdo a lo descrito por Rokbi et al. (1997) con las modificaciones en el protocolo del ensayo bactericida del Nacional Center for infection Diseases, C.D.C, Atlanta USA., en la Sección de Bacteriología General, Laboratorio de Referencia de Neisseria meningitidis, Instituto de Salud Publica de Chile, bajo normas de bioseguridad para esta patógeno Se descongeló una alícuota de N meningitidis a -70ºC y se realizó traspasos sucesivos en placas de agar sangre incubadas a 37ºC en 5% de CO2 por 3 días, luego una colonia se traspasó a un caldo soya triptona, suplementada con agar noble 0,9 % (TBS/A) y fué incubada por 4 horas. El producto del crecimiento bacteriano de esta placa será resuspendida en 5 mL de solución de Hanks, en 0,1% de suero fetal bovino a pH: 7,8, hasta obtener una DO600 de 0,35, lo que equivale a 5x108 cfu/mL. Esta concentración de trabajo de cultivo de N.menigitidis fue diluida hasta obtener una concentración de 1x104 cfu/mL. En una microplaca de fondo plano y estéril, se agregarán en los pocillos del 1-10 las siguientes componentes: 1.- 25 µL de solución de Hanks. 2.- 50 µL de suero de ratón inmunizados (o plasma), las cuales se diluirán al doble en forma seriada (1/2, 1/4, 1/8,…..hasta 1/1024), tomando 25 µL hasta la columna 10. 3.- 12,5 µL de solución de trabajo bacteriano (1x104 cfu/mL) 4.- 12,5 µL de suero normal humano como fuente de complemento. Los controles positivos y negativos serán dispuestos en los pocillos de las columnas 11 y 12 respectivamente en la siguiente forma: - Control de muerte independiente del complemento: 25 µL solución de Hanks, 10 µL solución de trabajo bacteriano y 12,5 µL suero de ratón inmunizado inactivado por calor. - Control de complemento: 25 µL solución de Hanks, 12,5 µL solución bacteriana y 12,5 µL de fuente de complemento. - Control viabilidad del complemento: 37,5 µL de solución de Hanks y 12,5 µL de solución bacteriana. Finalmente la microplaca se incubó a 37º C por 30 minutos y se agregará 100 µL de caldo soya triptona, en agar noble al 0,9 % evitado la formación de burbujas. La microplaca fue incubada por 14 a 16 horas a 37 º C en 5% CO2. La actividad bactericida se determinó contando colonias bacterianas; visibles por microscopio o lupa; en cada dilución del suero. El título bactericida es definido como el reciproco de la dilución en que el número de colonias sea inferior o igual al 50% de las colonias que crecieron en el pocillo control. 3.18 Análisis de los datos. Se utilizó el programa estadístico Statgraphies. V 5.0. Si bien se conservará el criterio de usar α=0,05, se emplearán intervalos de confianza según las exigencias del comité internacional de directores de publicación biomédicas. La prueba estadística empleada para este fin fue la comparación de las regresiones lineales de los grupos experimentales. 4. RESULTADOS 4.1 Selección de los clones con el gen de porA. Se comenzó a trabajar con los clones disponible en la Unidad de Biotecnología e Inmunobiológicos. La estrategia general fue aprovechar la construcción disponible con el gen de la proteína recombinante Por A de N. meningitidis clonado en el vector pET21a. 4.1.1 Análisis plasmidial de los clones Con el fin de chequear la construcción, la estabilidad y la integridad de los plamidos que fueron usados,se purificó el DNA plasmidial desde cultivos bacterianos saturados (E. coli DH5 α-pET21a-porA) mediante el Kit E.Z.N.A Plasmid Miniprep Kit I y fueron analizados en gel de agarosa. Los clones plasmidiales fueron digeridos con las enzimas de restricción NdeI y Hind III, para analizar su migración y detectar la presencia del tamaño del inserto .En la figura 1 se muestra el análisis electroforético de los productos de la digestión, en un gel de agarosa al 1%. Los resultados demostraron que la construcción pET21a-PorA liberó el inserto deseado que correspondió a un tamaño de 1158 pb, presente en los carriles 3, 5, y 7, mientras que la construcción control pET21a-PorA sin digerir presentó un tamaño de 6103pb, presente en los carriles 2, 4, y 6, lo que permite seleccionar los clones positivos, su DNA fue utilizado para transformar en E. coli BL21 (DE3) y realizar el estudio de expresión de la proteína recombinante PorA. 1 2 3 4 5 6 7 8 6103pb 1371pb 1264pb 2027 pb 1158 702pb Figura 1. Caracterizacion de plasmidos recombinantes. Carril 1 estándar de DNA /Bst II, carril 2,4y 6 DNA plasmidial pET21a-por A sin digerir. Carril 3, 5 y 7, DNA plasmidial de pET21a-porA digerido con las enzimas de restricción Nde I-Hind III. Carril 8, estándar DNAr /Hind III. 4.2 Expresión de la proteína recombinante Por A en E. coli BL21 (DE3). El estudio de expresión de la proteína PorA permitió determinar el tiempo optimo de inducción para extracto total bacteriano .Estas muestras fueron inducidas, no inducidas (IPTG) y lisadas a diferentes tiempos provenientes de la construcción E. coli BL21 (DE3)pET21a-PorA, analizando la expresión por electroforesis en SDS-PAGE y Western blot. La figura 2 muestra que el tiempo óptimo para recolectar las células después de la inducción, la cual se alcanzó a las 2 h después de adicionar IPTG al cultivo, como cuerpo de inclusión y solubilizada en urea 6 M, al igual que los resultados obtenidos (Jansen et al.,2000).El análisis por Western Blot (figura 3) permitió confirmar la identidad de la proteina PorA desde los resultados anteriormente descritos, en donde se aprecia bandas similares al peso de 42 kDa de la PorA ,en los carriles 4 y 6 de extracto total bacteriano a 1y 2 h posterior a la inducción con IPTG, además en este estudio de expresión se observa que existe un nivel basal de expresión, pero es en menor grado, en el carril 2 del extracto total bacteriano en el punto de inducción con IPTG y en los carriles 3 y 5 sin inducir a 1 y 2 h . En esta técnica fue utilizado un anticuerpo anti-PorA desarrollado en el laboratorio del Dr. Alejandro Venegas (Laboratorio de Bioquímica, Universidad Católica de Chile) kDa 1 2 3 4 5 6 85 60 50 40 25 190 20 15 10 60 50 40 25 20 15 10 10 Figura 2. Expresión de la proteína PorA recombinante. Carril 1, estándar de peso molecular (Fermenta). Carril 2 extracto total bacteriano en el punto de inducción con IPTG. Carriles 3 y 5 , controles negativos sin inducir a 1y 2 h.Carriles 4 y 6 extracto total bacteriano a 1y2 h posterior a la inducción con IPTG. La cantidad de proteína cargada en cada carril fue de 10 µg kDa 45 1 2 3 4 5 6 42kDa 35 Figura 3. Expresión de la proteína recombinante PorA determinada por Western Blot. Carril 1, estándar de peso molecular preteñido (Fermenta). Carril 2 extracto total bacteriano en el punto de inducción con IPTG. Carriles 3 y 5 controles negativo sin inducir a 1 y 2 h. Carriles 4 y 6 extracto total bacteriano a 1y 2 posterior a la inducción con IPTG. La cantidad de proteína cargada en cada carril fue de 10 µg 4.3 Purificación de la proteína PorA mediante cromatografía de afinidad Para la purificación de la proteína recombinante PorA se empleó la resina Ni-NTA His-BindR (Novagen) según indicaciones del fabricante. En la figura 4 A aparece en el perfil de elusión.Carril 1,estándar de peso molecular de amplio rango(Fermenta), carriles 2 al 10 la detección de una proteína de peso molecular aproximado de 42 kDa equivalentes a lo ya descritos para la proteína recombinante de N .meningitidis serogrupo B (Kersen et al., 1999),mientras que en la figura 4 B aparece en el perfil de elución, carril 11 estándar de peso molecular de amplio rango ,carriles 12 al 15 la detección de una proteína de peso molecular aproximado de 42 kDa. Cada etapa del proceso de purificación se monitoreó mediante gel de poliacrilamida y Western blot.En la figura 5A se muestra el analisis por Western blot realizado al perfil de elusión con el fin de verificar la identidad de la proteina recombinante PorA anteriormente descrito en donde se aprecia en el carril 1, estándar de peso molecular preteñido, carriles 2 al 10 la deteccion de una proteína de 42 kDa, mientras que en la figura 5B, Carril 11, estándar de peso molecular preteñido (Fermenta).Carriles 12 al 15 fracciones de proteínas purificadas por columna cromatografica, resultado concordante con la Figura 4.A-B A kDa 55,4 1 2 3 4 5 6 B 7 8 9 10 11 12 13 14 15 55,4 PorA 36,5 36,5 Figura 4. Análisis de la purificación de la proteína rPorA desde cultivo de E. coli BL21 (DE3). A: Carril 1, estándar de peso molecular (Fermenta). Carril 2 extracto total bacteriano sembrada en la columna de purificación. Carriles 3 al 10 fracciones de proteína purificada. B: Carril 11, estándar de peso molecular (Fermenta).Carril 12 al 15 fracciones de proteinas purificadas desde la columna cromatografica. 42kDa A KDa 49 1 2 3 4 B 5 6 7 8 9 10 11 13 14 15 49 PorA 35 12 42 kDa 35 Figura 5 Análisis de purificación de la proteína PorA recombinante desde cultivo de E. coli BL21 (DE3) mediante Western blot. A: Carril 1, estándar de peso molecular preteñido (Fermenta). Carril 2 extracto total bacteriano sembrada en la columna de purificación. Carriles 3 al 10, fracciones de proteínas purificadas por columna cromatografica.B: Carril 11, estándar de peso molecular preteñido (Fermenta).Carriles 12 al 15 fracciones de proteínas purificadas por columna cromatografica 4.4 Caracterización bioquímica y molecular de la proteína PorA La proteína PorA en su forma nativa se encuentra en forma de trímero, formando un poro en la membrana externa de N. meningitidis, La digestión con tripsina y quimotripsina se llevan a cabo con el fin de demostrar la resistencia de la PorA a estas enzimas proteoliticas abundantes en el tracto digestivo y determinar su estructura conformacional presente como proteina recombinante purificada mediante cromatografia de afinidad .La proteína PorA recombinante fue incubada en presencia de estas enzimas y fue analizada en gel nativo de poliacrilamida de acuerdo a la metodología descrita. El gel nativo fue transferido a una membrana de nitrocelulosa y analizado mediante Western blot, utilizando un anticuerpo policlonal anti-PorA. Los resultados de la digestión muestran en la figura 6, carril 1 la proteina recombinante PorA nativa en forma de trimero con un peso molecular aproximado de 120 -130 kDa.Esta formacion trimerica especifica detectada se revierte a monomero al ser incubada a 100ºC, carril 3, con peso molecular de 42 kDa.Ademas fue posible determinar que la proteína recombinante PorA nativa es resistente a la digestión con tripsina y quimotripsina, carril 4 y 5 respectivamente. 1 2 3 4 5 Trímero kDa 120 Monómero 42 Figura 6. Análisis conformacional de la proteína recombinante PorA Carril 1, PorA. Carril 2, estándar de peso molecular preteñido. Carriles 3, PorA incubada a 100°C por 10 minutos. Carril 4, PorA digerida con tripsina. Carril 5, PorA digerida con quimotripsina 4.5 Formulación de la proteína recombinante PorA con el adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX) 4.5.1 Formulación de AbISCO+PorA Con el objetivo de analizar la respuesta inmune de la formulación de AbISCO+PorA, utilizando una cantidad determinada de AbISCO, en el cual se adsorbe la proteína recombinante PorA en una concentración conocida, se utilizó el producto comercial AbISCO-100 de ISCONOVA, siguiendo las indicaciones descritas por el fabricante, utilizando para la inmunización oral el doble de la cantidad indicada para una aplicación subcutánea. En la figura 7 se observa en los carriles 2 y 4 la formulaciones AbISCO +PorA 10 y 5 µg respectivamente previo a ser inmunizadas a los grupos experimentales mostrando la integridad de la formulación al momento de ser inmunizada vía oral en ratones BALB/c. Los carriles 3 y 4 muestra la proteína PorA sin adyuvante 10 y 5 µg al momento de ser inmunizada vía oral en modelo murino. El carril 6 se aprecia la muestra de proteína PorA purificada por cromatografía de afinidad como control con un peso molecular de 42 kDa similar a las formulaciones, lo que nos asegura que las formulaciones fueron correctamente preparada y administrada. kDa 1 2 3 4 5 49 6 42 kDa 35 Figura 7. Integridad formulación AbISCO+PorA Carril 1, estándar de peso molecular preteñido (Fermenta). Carril 2, AbISCO + rPorA 10 μg. Carril 3, rPorA 10 μg. Carril 4, AbISCO + rPorA 5 μg. Carril 5, rPorA 5 μg. Carril 6, rPorA purificada. 4.6 Análisis de la respuesta de anticuerpos séricos IgG de ratones BALB/c inmunizados con la formulación AbISCO + Por A. 4.6.1 Respuesta humoral anti-Por A. Para caracterizar la respuesta inmune humoral de ratones BALB/c ante las formulaciones descritas en metodologia, se midió titulo de anticuerpos anti- Por A, por ELISA. Al comparar las muestras se observó que los resultados experimentales nos indican que los animales de experimentación respondieron a las formulaciones ensayadas. Se aprecia que la respuesta de IgG en la formulaciones AbISCO+PorA 10 g, AbISCO +PorA 5 µg y control presentaron según el análisis estadístico de regresión lineal una diferencia significativa (p<0,05), con un intervalo de confianza de 95%. La mayor respuesta de producción de IgG se obtuvo con el grupo experimental AbISCO+PorA 10 µg con un título de anticuerpos de 1/409. Los grupos experimentales de AbISCO+PorA 5 µg con titulo de 1/111 (Figura 8). La respuesta serica de IgG para la proteína recombiante PorA 10 µg, PorA 5ug (sin adyuvante) y control se observaron diferencias significativas entre ellos (p<0,05), con un intervalo de confianza de 95%.La mayor respuesta de producción de IgG se obtuvo con el grupo experimental PorA 10 µg con un título de anticuerpos de 1/297, mientras que los grupos experimentales PorA 5 µg presento un título 1/69 (figura 9).Se puede establecer que tanto las formulaciones con la proteina recombinante PorA, como proteina PorA sin adjuvante es capaz de inducir una respuesta serica y esta aumenta a una mayor dosis de PorA. 4.7 Análisis de la respuesta de IgA a nivel de mucosas en ratones BALB/c inmunizados oralmente con la formulación AbISCO-Por A. y Por A. 4.7.1 Respuesta de IgA anti-Por A en secreciones mucosas Se analizaron las muestras de saliva de los animales inmunizados con las formulaciones ya descritas, pero debido a la insuficiente homogeneidad en las muestras recolectadas, fue dificultoso obtener resultados confiables y reproducibles. Por este motivo los resultados no fueron incluidos en esta tesis. 4.8 Análisis de las subclases de IgG: IgG1 e IgG2a en sueros de los grupos experimentales de AbISCO+PorA y Por A Para el análisis de las subclases de IgG: IgG1 e IgG2a se utilizó el kit comercial Mouse Immunoglobulin Isotyping Elisa Kit (B.D. PharmingenTM) según las indicaciones del fabricante. La respuesta de subclase de IgG fue estadísticamente significativa (p<0,05) del tipo de IgG1 (figura 10) para la formulación AbISCO+PorA 10µg y AbISCO+PorA 5µg solo al comparar el control en forma separada con las muestras pre-booster y booster. Esta diferencia estadísticamente significativa no es apreciable al comparar los grupos prebooster y booster entre ambos En relación a la respuesta de subclase de IgG1 para la proteína recombinate PorA 10µg y PorA 5µg (figura 11).Esta presenta una diferencia significativa (p<0,05), con un intervalo de confianza de 95%, al comparar la proteína PorA 10µg y PorA 5µg en forma separada pre-booter y booster con respecto al control, sin embrago esta diferencia no se aprecia al comparar los grupos pre-booster y booster entre ambos. Por el contrario la subclase de IgG2a presentó resultados bajos en comparación con la repuesta de IgG1, los cuales no fueron estadísticamente significativo tanto para las formaciones AbISCO+PorA 10µg y AbISCO+PorA 5µg (figura 12), como para proteína recombinante PorA 10µg y 5µ g sin adjuvante (figura 13) Contenido IgG (OD.:405nm) 2 Control Proteina+AbISCO 10 g Proteina+AbISCO g 1 0 1 0.1 0.01 0.001 Diluciones seriada -1 Figura 8. Respuesta sérica de IgG posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la formulación AbISCO-PorA 10 y 5 g. La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según se describe en metodología. El ensayo ELISA se realizó en un lector Bio-Rad 550, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 3.7. Contenido IgG (OD.:405nm) 3 Control Proteina g 2 Proteina g 1 0 1 -1 0.1 0.01 0.001 Diluciones seriada Figura 9. Respuesta sérica de IgG posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la rPorA 10 y 5 g, que lleva el antìgeno de la Neisseria meningitidis. La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según describe en la Tabla 3.El ensayo ELISA se realizó en un lector Bio-Rad 550, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 6.1. Contenido IgG1(OD 450 nm ) 3 * * * * Control Pre-booster Booster 2 1 0 Proteina+AbISCO 10 g Proteina+AbISCO 5 g Figura 10.Respuesta sérica de Subclase IgG1 posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la formulación AbISCO+PorA 10 g y 5 g. La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según describe en la Tabla 3 .Las muestras de sangre se obtuvieron mediante microcapilares aplicados al plexo retro-orbitalmente según se describe en la sección 5.9.El ensayo ELISA se realizó en un lector Thermo Labsystem 355, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 6.1. * Diferencia estadísticamente significativo 3 Contenido IgG1(OD 450) * * * * Control Pre-booster Booster 2 1 0 Por A 10 g Por A 5 g Figura 11.Respuesta sérica de Subclase IgG1 posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la proteína PorA 10 g. y 5 g.La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según describe en la Tabla 3 .Las muestras de sangre se obtuvieron mediante microcapilares aplicados al plexo retro-orbitalmente según se describe en la sección 5.9.El ensayo ELISA se realizó en un lector Thermo Labsystem 355, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 6.1. * Diferencia estadísticamente significativo Contenido IgG2A(OD 450nm) Control Pre-booster Booster 2 1 0 Proteina+AbISCO 10g Proteina +AbISCO 5g Figura 12 .Respuesta sérica de Subclase IgG2a posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la Proteína +AbISCO 10 g. y 5 g La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según describe en la Tabla 3 .Las muestras de sangre se obtuvieron mediante microcapilares aplicados al plexo retro-orbitalmente según se describe en la sección 5.9.El ensayo ELISA se realizó en un lector Thermo Labsystem 355, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 6.1 Contenido de IgG2A(OD 450 nm) Control Pre-booster Booster 2 1 0 Proteína 10 g Proteína 5 g Figura 13.Respuesta sérica de Subclase IgG2a posterior a la inmunización oral de ratones BALB/c con la Proteína g. y 5 g. La inmunización se evaluó en grupos de 8 ratones siguiendo el protocolo según describe en la Tabla 3 .Las muestras de sangre se obtuvieron mediante microcapilares aplicados al plexo retro-orbitalmente según se describe en la sección 3.6.3.El ensayo ELISA se realizó en un lector Thermo Labsystem 355, de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 3.8. 4.9 Análisis de la actividad bactericida de los grupos experimentales La determinación de la actividad bactericida se realizó en diluciones seriada de suero inmune de los ratones vacunados oralmente, los cuales se incubaron con un volumen fijo 12,5 uL de bacteria de acuerdo a lo descrito en metodología. El número colonias control de N. meningitidis B:15P1.3 fue de 122 y 100 y debido a que el título bactericida se define como el reciproco de la más alta dilución que produce una disminución del 50% o más de las colonias comparado con el control, la presencia de 61y 50 colonias o menos respectivamente, se considera un resultado positivo. (Tabla 2 y 3) Para el ensayo bactericida, se trabajó con los grupos experimentales descrito en la tabla 4, los cuales alcanzaron un titulo 1/8 para los grupos G2, G3, G4, mientras que para el grupo G5 un titulo 1/16. Tabla 2: Ensayo Bactericida.Formulación: AbISCO+PorA 10 μg y Por A 10 μg Control de viabilidad bacteriana: 122 colonias. NC: no contable DILUCIONES SERIADAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/12 1/25 1/51 1/102 8 6 2 4 AbISCO+Por A. 28 34 60 81 NC NC NC NC NC NC PorA 22 55 53 102 NC 84 NC NC NC NC Tabla 3.Ensayo Bactericida.Formulación: AbISCO+PorA 5 μg y Por A 5 μg. Control de viabilidad bacteriana: 100 colonias. NC: no contable. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 AbISCO+Por A. 32 33 48 75 81 92 NC NC NC NC PorA 13 33 35 48 59 N/C N/C NC NC NC DILUCIONES SERIADAS Tabla 4: Resumen de actividad bactericida de los grupos experimentales ensayados en este estudio. Título Grupo de experimental bactericida G1:Control ----------- G2:AbISCO-PorA (10 μg) 1/8 G3:PorA (10 μg) 1/8 G4.AbISCO+ PorA (5 μg) 1/8 G5:PorA (5 μg ) 1/16 de actividad 5. DISCUSION Para el desarrollo de este trabajo se contaba con el gen por A de la cepa de N. meningitidis B:15:P1.3 clonado en el vector pET21a .Este gen se obtuvo por PCR a partir de aislados clínicos serotipificados en el laboratorio de referencia de N. meningitidis del Instituto de Salud Publica de Chile en el año 2005(M225/2003). El objetivo de esta tesis fue evaluar en ratones BALB/c, la capacidad de la proteina PorA de inducir una respuesta inmune formulada con un adyuvante AbISCO (ISCOMATRIX) para el desarrollo posteriormente de una vacuna oral. Se opto por este enfoque dado que los diseños de vacuna desarrolladas en Chile (Zollinger et al., 1991, Boslego et al., 1995) y en desarrollo en otros paises para el serogrupo B, han obtenido resultados muy pocos alentadores lo que motivaron a buscar y estudiar ciertas OMPs de N. meningitidis capaces de inducir una respuesta inmunogénica bactericida. Dados los antecedentes anteriores, para el desarrollo de una vacuna contra el serogrupo B, se selecciono la proteína recombinante Por A como uno de los candidato a partir de una cepa chilena (N.meningitidis B: 15:P1.3), ya que es conocida su función, composición, responsabilidad en la respuesta inmune bactericida y como uno de los componenetes más prometedor para el desarrollo de una vacuna menigococcal (Humphries et al., 2004). 5.1. Obtención de la proteína PorA de N. meningitidis serogrupo B. Para el ensayo de expresión de la proteína recombinante Por A se utilizó la inducción de cultivos saturados para E .coli BL21 (DE3). Esto permitió establecer las condiciones necesarias en relación al tiempo posterior a la inducción para una óptima detección de la proteína con el objetivo de obtener niveles elevados de expresión. Para encontrar clones de E. coli Bl-21DE3-pET21a-porA que expresen la proteína recombiante Por A se escogieron colonias aisladas producto de la transformación .Se consideró positivo aquellos clones con un nivel de expresión detectable por tinción de coomassie y Western blot. Fue posible considerar como falsos positivos clones con niveles de expresión por bajo el nivel de detección de la tinción de Coomassie. No se consideró necesario verificar la existencia de la construcción en la cepa de expresión, ya que la aparición de una banda de proteína dependiente de la inducción con IPTG acorde a un tamaño esperado, bastó para determinar la expresión positiva. Los resultados de expresión evidencian una diferencia en la velocidad de producción de la proteína recombinante Por A en las condiciones definidas en nuestro ensayo (cultivo saturado). A partir de 1 h post-inducción con IPTG, no es posible detectar Por A en las muestras de lisado bacteriano total y solo es alcanzando un máximo aparente aproximadamente a las 2 h, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Gutierrez y cols. La expresión de Por A en E. coli BL21 (DE3) produjo interesantes resultados, fue posible obtener clones transformantes con el gen PorA clonado en pET21a con altos niveles de expresión. Estudios previos demuestran que el proceso de purificación mediante cromatografía de afinidad utilizando la resina Ni-NTA es una alternativa más simple y rápida que hace uso de una característica particular: una secuencia corta de aminoácidos que es capaz de fusionarse con una proteína recombinate (Schmitt et al., 1993). Este principio de separación , utiliza la afinidad diferenciada de las proteínas para los iones inmovilizados en metal para efectuar el proceso, la cual deriva de los enlaces de coordinación formados entre los iones de metal y las cadenas laterales de cierto numero de aminoácidos expuestos en la superficie de las moléculas de proteínas(residuos de histidina)(kees et al., 2000). Nosotros utilizamos la resina que posee alta afinidad y selectividad para residuos de histidina presente en proteínas recombinantes, en donde la Por A fue tratada bajo condiciones denaturantes, ya que la mayoría de las proteínas expresadas en bacterias se obtienen como cuerpos de inclusión. La solubilización se realizó con clorhidrato de guanidina 6 M lo cuál permitió inactivar las enzimas proteolíticas presentes en el extracto bacteriano. Luego la resina NiNTA que contenía el extracto fue sometida a sucesivos lavados y eluida finalmente de la columna obteniéndose aproximadamente 2 mg de proteína Por A desde 2 lt de cultivo. Los resultados aquí obtenidos permitirán optimizar el proceso de purificación mediante cromatografía de afinidad usando como resina Ni-NTA, la cuál es utilizada en la purificación de otros tipos de proteinas recombinantes: T5 (19.6 kDa) de Mycobacterium leprae, TonB (31.6 kDa) de Haemophilus Influenza, ferritin (23.8 kDa) de Mycobacterium tuberculosis, y la E7 (14.2 kDa) del serotipo 16 del virus HPV) (Kees et al. 2000). 5.2 Caracterización bioquímica y molecular de la proteína PorA Las porinas de E. coli son conocidas por su alta resistencia a la tripsina, la cuál puede ser usada como un parámetro para estimar un correcto plegamiento (Jansen et al., 2000). El objetivo de esta investigación es desarrollar un prototipo de vacuna en base a la proteína PorA, mejorar las vacunas en base OMVs (vesículas de membrana externa) , OMPs (proteínas de membrana externa) en ausencia de componentes tóxicos (Los) y que induzcan una adecuada respuesta inmune protectora Las muestras (rPorA) fueron tratadas con dos enzimas proteolíticas o proteasas: tripsina y quimotripsina. Estas enzimas son especificas con relación a los enlaces que fragmentan; se secretan al tracto digestivo donde cortan las proteínas para su posterior digestión, los sitios característicos de estas enzimas se centran R1:Lys, Arg; R2≠Pro para tripsina y R1 :Tyr,Phe,Leu,LLe,Val,Trp e His a un pH elevado y R2≠Pro. (Comité de nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica, Enzyme Nomenclatura, Academic Press: Orlando, Fla., 1994). Estas muestras al igual que estudios anteriores no fueron digeridas, generando una estructura trimerica a alrededor de 120-130 kDa, sin generar fragmentos típicos de una digestión entre 16 y 18 kDa. Sin embargo, cuando la muestra rPor A fue calentada a 100ºC para ser denaturada se generó una estructura conformacional monomérica típica. (Jansen et al., 2000; Arigita et al., 2004) Es probable que la resistencia a las enzimas digestivas este asociada a su estructura trimérica, la cuál permitiría el paso gastrointestinal a pesar de que la Neisseria meningitidis no está en contacto con condiciones extremas como sales bilares y proteasas en el intestino, como las porinas de E. coli (Jansen et al., 2000). La estructura conformacional trimérica propuesta en este estudio, descrita por otros autores, permitiría una mejor accesibilidad a epitopos expuestos que son reconocidos por anticuerpos anti-PorA (Peeters et al., 1999; Jansen et al., 2000; Arigita et al., 2004). 5.3 Proyecciones del uso de un tipo de vacuna basada en sub unidad de proteinas formuladas con AbISCO (ISCOMATRIX). Las vacunas formuladas con AbISCO (ISCOMATRIX) se encuentran en fase experimental tanto en modelo animal como humano (Kersten et al., 2003). La capacidad del adyuvante AbISCO tiene el potencial de reducir sustancialmente la dosis del antígeno requerida en vacunas lo cuál trae múltiples beneficios ante una eventual necesidad de producción de grandes cantidades, donde la demanda exceda la capacidad de producción y en las vacunas que por necesidad deba contener más de un antígeno. (Boyle et al., 2007).Varios estudios confirman la utilidad del AbISCO administrada por vía oral, los que incluyen vacunas formuladas con proteínas de rotavirus, virus de la influenza, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), Virus Epstein-Barr. Luego de evaluar las formulaciones, concluyeron que todas las vacunas indujeron títulos estadísticamente significativos de anticuerpos específicos del tipo IgG séricos (Van Pinxteren et al., 1999). Considerando estos aspectos se deben tomar en cuenta numerosas variables para el desarrollo óptimo de una vacuna, tales como la seguridad de su formulación, fácil administración, mantenimiento de la cadena de frío, personal calificado, costo y dosis mínima (Giudice et al. ,2006). Basándose en estas variables la vacuna oral formulada con AbISCO (ISCOMATRIX), presenta ventajas comparativas con las vacunas administradas por vía parenteral que incluyen la liberación de antìgeno en el sitio del contagio imitando la vía de ingreso del patógeno, la inducción especifica de la respuesta inmune en la superficie mucosal y el potenciamiento de la respuesta inmune ante la presencia de antígenos pobremente inmunogénicos (Van Pinxteren et al., 1999). Los datos demuestran el potencial de una vacuna basada en (ISCOMATRIX) AbISCO y la proteina PorA por si sola para estimular el sistema imune,inducción de titulos altos de IgG a bajas dosis, inducción de diferentes patrones de subclase y de preferencia la subclase IgG1, inducción de anticuerpos bactericidas protectores, resultados comparables con los resultados obtenidos por Peeters et al.1999 en donde se demostró una inducción de titulos de IgG, subclase IgG1 y anticuerpos bactericidas protectores mayores comprarables con el adyuvante Al(OH)3 unico adyuvante aceptado para humano.Ademas los resultados confirman lo descrito en literatura, en relacion a la caracteristicas inmunogenicas de la proteína PorA, estos estudios indican que esta proteina por si solo, es capaz de activar células dendríticas (Al-Bader et al., 2004). La respuesta de las formulaciones ensayadas fue diferente, lo que sugiere que la estimulación lograda con la formulación AbISCO+PorA y PorA lo convierte en un buen candidato a considerar para el desarrollo de un prototipo de vacuna. Basándose en la evidencia, se establece una oportunidad para investigar los diferentes aspectos de la respuesta inmune involucrados en la infección provocada por la Neisseria meningitidis y disponiendo de los antigenos y las formulaciones adecuadas desarrollar una vacuna óptima contra esta bacteria. 5.4 Evaluación de la respuesta inmune 5.4.1 Inducción de anticuerpos anti-Por A En este estudio se encontró un nivel de inducción estadísticamente significativo de anticuerpos séricos anti-Por A en ratones vacunados oralmente con las formulaciones ya descritas. El grupo de ratones inmunizados con la formulación AbISCO+Por A 10µg presentó el mayor titulo de IgG, 3,6 veces mayor que lo obtenido con la formulación AbISCO+ Por A 5µg, mientras que la proteína recombinante Por A 10µg presentó un titulo 4 veces mayor que la proteína recombinante Por A 5 µg. Esto podría deberse a que este antígeno Por A es altamente inmunogénico, una característica propia de esta proteína, o a que sus epítopos reconocidos están dados por aminoácidos de diferentes partes de la secuencia, que se han juntado por la disposición espacial permitiendo que se procesen mas eficientemente para su presentación a los linfocitos T a través del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II).Resultados descritos con posterioridad confirman lo obtenido, se demostró altos títulos de IgG con bajas dosis de antígeno (vía subcutánea) y altos títulos de anticuerpos bactericida (Peeters et al., 1999). Cabe recordar que la inmunoglobulina IgG es la principal clase de anticuerpo presente en suero y representa la respuesta inmune secundaria acompañada por un aumento en la avidez del anticuerpo y la generación de la memoria inmunológica. Los anticuerpos específicos de IgG y un sistema de complemento funcional se consideran de importancia crucial en la defensa del huésped contra la enfermedad meningococal (Meyer et al 1999; Goldscneider et al., 1969). 5.4.2 Inducción de subclases IgG Los niveles de subclase de IgG determinados en este estudio experimental mostraron que los niveles de inducción son estadísticamente significativos de anticuerpos anti-IgG1, presentes tanto en las formulaciones AbISCO+PorA 10 y 5 µg, como Por A 10 y 5µg. Las cuatro subclases de IgG difieren en su capacidad de activar el complemento y la unión a los receptores de membrana Fc. Los anticuerpos IgG1 e IgG3 activan el complemento muy eficientemente, mientras que IgG2 es solamente efectivo en la alta densidad del epitopo, mientras que IgG 4 no es efectivo (Meyer et al., 1998). Los anticuerpos de las subclase IgG pueden facilitar fagocitosis directamente por unión a los receptores de Fc o indirectamente activando la cascada del complemento, dando por resultado un depósito de los factores del complemento C3b y iC3b en las bacterias. Esto conduce eventualmente a la unión de los receptores del complemento CR1 y CR 3 (CRs) en los fagocitos (Michaelsen et al., 1994).Todas las subclases de IgG tienen la capacidad de inducir la fagocitosis mediada por FcgR y CR, pero solamente IgG1 e IgG3 son regularmente altamente efectivas (Meyer et al., 1999). La subclase de IgG2a puede ser altamente efectiva en la inducción de fagocitosis y lisis mediada por el complemento, siempre y cuando los epitopos presenten una alta densidad. Los bajos niveles de anticuerpos de la subclase IgG2a, que no fueron estadísticamente significativos, podrían deberse a la última consideración (Michaelsen et al., 1994). Se han realizado estudios en los cuáles según sea la presentación del antígeno en la superficie mucosal y el diseño de la vacuna, es el tipo de respuesta que se obtiene, dependiendo de las citoquinas secretadas por los linfocitos T “Helper”. Así , las células T “helper” pueden favorecer a la respuesta inmune celular (Th-1) o la respuesta inmune humoral (Th-2) .Estos dos tipos de células ejercen su acción secretando diferentes tipos de citoquinas Tipo Th-1 ;IFN-γ, IL-2 y estas inducen a las células B a secretar IgG2a o tipo Th-2; IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-10 que inducen la secreción de IgG1, IgE e IgA. Es por eso que es posible modificar la inducción y regulación de la respuesta según sea el requerimiento de la vacuna contra un blanco especifico(Jackson et al., 1993;Xu-Amano et al., 1992). En base a estos resultados se determinó que los ratones inmunizados con estas formulaciones desarrollan una respuesta inmune apropiada y conlleva a una producción de anticuerpos del tipo IgG1 y en menor grado IgG2a. Esta afirmación confirma lo descrito en la literatura en relación a la inducción de anticuerpos del tipo IgG1, la cual cuadruplica los títulos de IgG1 realizadas con la formulación OMV+Al (P0)4 y bajos titulos para IgG2a, IgG2B y IgG3.cita Los patrones se subclase inducidos por AbISCO+PorA y PorA, de preferencia IgG1 sugiere una fuerte respuesta tipo Th-2. 5.4.3 Respuesta bactericida La actividad bactericida es la prueba utilizada para evaluar el grado de protección de prototipos de vacuna, tanto en animales de experimentación como en estudios clínicos en humanos respectivamente. Un título es considerado protector cuando es ≥1:4 en Europa y de ≥1:8 en Estado Unidos (Santos et al., 2001). Como resultado del ensayo bactericida (tablas 2, 3 y 4), podemos observar que se obtienen un titulo protector en todos los grupos experimentales.Segun investigacines desarrolladas en el pasado, (Goldschneider et al.1969a; Goldschneider et al., 1969 b; Santos et al., 2001), se determino que mientras más alto es el titulo se otorga un mayor margen de seguridad en una proteccion. Un completo entendimiento de la enfermedad meningocóccica requiere de un modelo animal que asegure un proceso de infección similar que al huésped humano, y por tal motivo los ensayos bactericidas séricos proveen evidencia de protección de la enfermedad meningocóccica, ya que este ensayo se correlaciona con la aparición y título de anticuerpos bactericidas en el suero (Goldschneider et al., 1969).Este es un ensayo clásico para medir los anticuerpos antimeningococcales in vitro ,evita recurrir a los clásicos ensayos de desafió, hasta que se presente la aparición de un modelo animal validado. El SBA presentan varios problemas para ser estandarizados a pesar de estar constituidos por tres elementos esenciales: bacteria, anticuerpo y complemento. Estas dificultades se centran principalmente en el número de cfu por pocillo, tampón de ensayo, fuente de complemento, crecimiento bacteriano, concentración del complemento y diluciones séricas del inicio. Por otro lado el uso del complemento presenta también ciertas limitaciones, principalmente el complemento humano adulto , el cual posee anticuerpos adquiridos naturalmente para grupos específicos de polisacáridos (meningococcal) ,LPS, y otras proteínas de la membrana externa (Rodríguez et al.,2002). Estos anticuerpos activan el complemento y producen una bacteriolisis meningococcal que interfiere con los resultados del SBA. Por tal motivo el suero humano se somete a varios controles, con el fin de que el complemento no elimine la bacteria por si sola, ya sea por contener antibióticos contra la cepa o contener otra entidad bactericida. Por otro lado la fuente de complemento debe ser probada con un suero positivo contra la cepa meningococcal para tener la seguridad de que la fuente del complemento es funcional (Hoiby et al., 1991; Frasch et al., 1978).Por esta razón algunos investigadores han sustituido el suero humano por el suero de conejo como fuente de complemento exógeno debido a la carencia intrínseca de actividad bactericida. Dado que los estudios principales demuestran una correlación entre actividad bactericida en suero y la protección contra el desarrollo de la enfermedad meningococcal (Goldschneider et al., 1969), se considera que la mejor solución para predecir la protección de actividad bactericida es medir los niveles de títulos sericos. En resumen todos los grupos ensayados desarrollaron anticuerpos bactericidas para N. meningitidis B: 15:P1.3 y según lo descrito en la literatura, estos títulos son protectores, por tanto la administración de la proteína PorA formulada con AbISCO, como la proteína PorA sin adyuvantes, son una atractiva alternativa para el desarrollo de vacunas para N. meningitidis serogrupo B. 6. CONCLUSION 1. La proteína recombinante Por A fue exitosamente expresada y purificada bajo el control de promotores inducibles por IPTG. 2. La proteína recombinante PorA formulada experimentalmente con AbISCO (ISCOMATRIX) fue capaz de inducir anticuerpos bactericida y protectores al ser ensayada vía oral en modelo murino para N. meningitidis. 3. La proteína recombinante PorA al ser administrada vía oral; sin adyuvante; es capaz de inducir una respuesta inmune protectora. Esta observación permitirá postular diferentes estrategias experimentales tendientes a buscar una respuesta a este comportamiento peculiar de esta proteína. 4. Estos resultados abren una nueva alternativa de estudio para el desarrollo de una vacuna para N. meningitidis serogrupo B 7. BIBLIOGRAFIA Arigita, C., Kersten, G., Hazendonk, T., Hennink,W.E., Crommelin, D.A., and W. Jiskoot . (2003).Restored functional immunogenicity of purified meningococcal Por A by incorporation into liposomes. Vaccine 21:950-960. Al-Bader, T., Jolley, K.A., Humphries, H.E., Holloway, J., Heckels, J.E., Semper, A.E., Friedmann, P.S. and Christodoulides. M.(2003).Cell Microbiol. 6:651-662 Al-Bader, T., ChristodouLides, M., Heckels, J. E., Holloway, J., Simpers, A.E. and Friedmann1. S. (2003).Activation of human dendritic cells is modulated by components of the outer membranes of Neisseria meningitides. Infect. Immune. 71:5590-5597. Barr, I., and Mitchell G. 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Análisis estadístico de la determinación de niveles de IgG en los diferentes grupos experimentales en base (ISCOMATRIX) AbISCO+PorA y Por A 10 y 5 µg 1a.- Comparación de regresión lineal de los grupos experimentales en la determinación de niveles de IgG, (ISCOMATRIX) AbISCO + PorA 10 y 5 ug. Comparison of Regression Lines - Absorbancia versus Log 10 inv Dilución . Further ANOVA for Variables in the Order Fitted ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------InversDilucion 1,63373 1 1,63373 651,80 0,0000 Intercepts 2,9173 2 1,45865 581,95 0,0000 Slopes 1,17994 2 0,589972 235,38 0,0000 ----------------------------------------------------------------------------Model 5,73098 5 Comparación de Regresiones 1,6 Fo r m ulacion ABS O BANCIA 40 5 C ontr ol P r ot A B IS C O 10 ug 1,2 P r ot A B IS C O 5u g 0,8 0,4 0 1 1,4 1,8 2,2 2,6 3 3,4 Log 10 (1/ Dilución) 1b.- Comparación de regresión lineal de los grupos experimentales en la determinación de niveles de IgG, PorA 10 y 5 ug Further ANOVA for Variables in the Order Fitted ----------------------------------------------------------------------------Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------Log 10 inv Diluci 2,05574 1 2,05574 246,38 0,0000 Intercepts 3,01977 2 1,50989 180,96 0,0000 Slopes 1,51021 2 0,755107 90,50 0,0000 ----------------------------------------------------------------------------Model 6,58573 5 Comparación de Regresiones 1,8 Fo r m ulac Absorbanc ia 40 5 nm C ontr ol 1,5 P r oteina 10 ug P r oteina 5u g 1,2 0,9 0,6 0,3 0 1 1,4 1,8 2,2 2,6 3 3,4 Anexo 2. Análisis estadístico de la determinación de niveles de subclases IgG1 en los grupos experimentales de AbISCO + PorA 10 y 5 ug y Por A 10 y 5 µg 2a.- Comparación de regresión lineal de los grupos experimentales en la determinación de niveles de IgG1, AbISCO – PorA 10 y 5 µg. MuLtiple Range Tests for Absorbancia 450nm by Inmunización -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Inmunización Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------Control 4 0,833 0,0556934 X Preinmune 4 1,267 0,0556934 X Booster 4 1,4695 0,0556934 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------Booster - Control *0,6365 0,241666 Booster - Preinmune 0,2025 0,241666 Control - Preinmune *-0,434 0,241666 -------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference 1,28 1,25 1,22 1,19 1,16 1,1 P r ot A B IS C O 5u g 1,13 P r ot A B IS C O 10 ug Absorbancia 450nm Means and 95,0 Percent Scheffe Intervals Fo r m ulacion es 2b.- Comparación de regresión lineal de los grupos experimentales en la determinación de niveles de IgG1, PorA (10 y 5 ug). MuLtiple Range Tests for Absorbancia 450nm by Inmunización -------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD Inmunización Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------Control 4 0,833 0,0939609 X Booster 4 2,3595 0,0939609 X Preinmune 4 2,36625 0,0939609 X -------------------------------------------------------------------------------Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------Booster - Control *1,5265 0,407718 Booster - Preinmune -0,00675 0,407718 Control - Preinmune *-1,53325 0,407718 -------------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference. 2,1 2 1,9 1,8 1,7 P r ot 1 0ug 1,6 P r ot 5u g Absorbancia 450nm Means and 95,0 Percent Scheffe Intervals Fo r m ulacion es Anexo 3: Esquema del ensayo bactericida cepa N.meneingitidis serogrupo B15:P1.3
