universidad simón bolívar decanato de estudios de postgrado

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN QUÍMICA
MAESTRÍA EN QUÍMICA
TRABAJO DE GRADO
ANÁLISIS OLFATOMÉTRICO DEL AROMA DE QUESO DE CABRA VENEZOLANO
PRODUCIDO EN LAS TRES FASES DEL PERIODO DE LACTANCIA
Por:
Mirtha Marlene Matute Vargas
Mayo, 2012
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN QUÍMICA
MAESTRÍA EN QUÍMICA
ANÁLISIS OLFATOMÉTRICO DEL AROMA DE QUESO DE CABRA VENEZOLANO
PRODUCIDO EN LAS TRES FASES DEL PERIODO DE LACTANCIA
Trabajo de Grado presentado a la Universidad Simón Bolívar por Mirtha Marlene
Matute Vargas como requisito para optar al título de Magister en Química.
Realizado con la asesoría de la Dra. Aivlé Cabrera
y Dra. Elba Sangronis
Mayo, 2012
v
DEDICATORIA
A mi esposo e hija,
Los amo…
vi
AGRADECIMIENTOS
Al postgrado en química de la Universidad Simón Bolívar, por permitirme ingresar
y así avanzar en mi preparación académica.
A mis tutoras, por la confianza para que desarrollara el presente trabajo y su
apoyo en todo momento.
Al panel sensorial (Profesora Aura Cova, Gabriela Hernandez, Ivan Toro, Ignacio
Buscema, Carlos Faneyth y Señor Edgar Díaz) por su interés e invalorable
tiempo, el cual fue clave para llevar a cabo el proyecto.
A la Sra. Elida María Peña por abrirme las puertas de su hacienda para trabajar
con sus quesos y su total disposición para colaborar.
A la profesora Ursula Ehrmann por su asesoramiento en la adaptación del equipo
de olfatometría.
Al Ingeniero Rafael Santelmo por el diseño del programa de adquisición de datos
para olfatometría.
A Humberto Carvajal por su asesoramiento en los análisis estadísticos y sus
recomendaciones.
Al jurado examinador por sus indicaciones y sugerencias que enriquecieron el
trabajo.
A los excelentes amigos que me apoyaron en todo momento (hasta los nueve
meses de cambios hormonales) Shailili, José Gregorio, Ignacio, Lissette Jimenez,
Patricia Muñoz, Carlos Faneyth, Gabriela Díaz, Ivan Toro.
A Ignacio Buscema por su amistad y apoyo desde el principio, su paciencia y
tiempo para compartir sus conocimientos que siempre me guiaron.
A mi milo, Shailili Moreno por su amistad, sus consejos y el impulso que siempre
me contagio.
A my friend José Gregorio, por su amistad, apoyo y las sonrisas que siempre nos
hicieron todo más fácil.
A la Coordinación de Química, principalmente a Maritza Sotillo por toda la
colaboración que siempre me brindo y su amistad.
A la empresa Flavors Concentrados C.A de Venezuela, por suministrarme los
compuestos que me permitieron culminar la tesis.
vii
Al taller de vidrio de la Universidad Simón Bolívar por la fabricación del puerto de
detección para el equipo de olfatometría.
A mi familia, mi esposo Ronald que siempre me apoyo a continuar y a mi hija Lia
Corina por su paciencia en esperarme para jugar cuando tenía que escribir la
tesis.
A mi madre por su empuje, apoyo y amor que siempre hacen para mí todo más
fácil.
A mi hermanita Miriam por cuidar a Lia Corina con tanto amor y paciencia, para
que me dedicara a terminar la tesis.
A Dios por la fe que me permitió siempre tener la fuerza y el impulso para
continuar.
viii
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
DECANATO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
COORDINACIÓN DE POSTGRADO EN QUÍMICA
MAESTRÍA EN QUÍMICA
ANÁLISIS OLFATOMÉTRICO DEL AROMA DE QUESO DE CABRA
VENEZOLANO PRODUCIDO EN LAS TRES FASES DEL PERIODO DE
LACTANCIA
Por: Matute Vargas Mirtha Marlene
Carnet No.:07-86014
Tutor: Aivlé Cabrera
Co-tutor: Elba Sangronis
Mayo 2012
RESUMEN
La percepción del aroma de los quesos de cabra es uno de los principales criterios
para su aceptación por los consumidores, por ello se planteó estudiar el mencionado
parámetro organoléptico del queso de cabra elaborado artesanalmente con leche de
diferentes periodos de la lactancia, de cabras criadas en un sector del Municipio
Iribarren en el Edo. Lara. La presente investigación se realizó en tres fases: en la
primera se aislaron e identificaron los compuestos volátiles mediante microextracción en fase sólida del espacio en cabeza (MEFS-EC) con el uso de una fibra
de 30/50 µm de DVB/CAR/PDMS y por cromatografía de gases con detector de FID
y Espectrometría de masas (CG/EM). En la segunda fase se realizó el análisis
olfatométrico, mediante el método de frecuencia de detección (FD) con un panel
entrenado de 6 personas. Para la última etapa se realizó un tratamiento estadístico
mediante Multidimensional Scaling (MDS) de los AGL cuantificados y el análisis
olfatométrico. Se lograron identificar compuestos de las familias de ésteres,
aldehídos, alcoholes, cetonas y ácidos grasos libres (AGL) y se cuantificaron
mediante curva de calibración externa. Los resultados demostraron diferencias
estadísticamente significativas del perfil aromático del queso elaborado en cada fase
de lactancia, con un aumento en las concentraciones de los AGL en el segundo
periodo de análisis, por un posible aumento del proceso de lipólisis, caracterizando a
la primera fase de lactancia con aromas a frutas fermentadas, alcoholadas, a la
segunda como floral, madera y a la tercera a floral y verde.
Palabras Clave: queso de cabra artesanal, cromatografía de gases, espectrometría
de masas, ácidos grasos libres, Multidimensional Scaling, curva de calibración.
ix
ÍNDICE GENERAL
APROBACIÓN DEL JURADO
iv
DEDICATORIA
v
AGRADECIMIENTOS
vi
RESUMEN
viii
ÍNDICE GENERAL
ix
ÍNDICE DE TABLAS
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS
xxi
INTRODUCCIÓN GENERAL
OBJETIVOS
1
3
CAPITULO I. MARCO TEÓRICO
5
1.1.
Características fisiológicas del sentido del olfato
5
1.2.
El olor y su percepción
6
1.3.
Olfatometría
9
1.4.
Detección de compuestos de aroma
12
1.5.
Características instrumentales de la técnica de GC-O
13
1.5.1. Puerto de olor
14
1.5.2. Sistema de detección y generación de señal
14
1.5.3. Resolución de la señal cromatográfica
16
1.6.
Condiciones para la detección por olfatometría
17
1.7.
Métodos de tratamientos de datos otenidos por GC-O
17
1.7.1. Método de frecuencia de detección
17
1.7.2. Método de dilución de extractos de aroma
19
x
1.7.3. Método de medición de intensidad olfativa
1.8. Método de extracción y aislamiento de los compuestos volátiles en
20
22
alimentos
1.8.1. Microextracción en Fase sólida
23
1.9. El queso: Generalidades
28
1.9.1. Composición química y propiedades físico-químicas de la
leche de cabra
28
19.1.1 Papel de los diferentes componentes de la leche en la
calidad del queso
30
1.9.2. Principios para la elaboración de quesos
30
Aislamiento de aleloquímicos en especies vegetales
27
1.10. Cambios bioquímicos durante el procesado y maduración del queso
de cabra
34
1.10.1 Glucólisis
35
1.10.2 Lipólisis
35
1.10.3 Proteólisis
37
1.11. Producción de la leche caprina en Venezuela
38
1.11.1. Estado de lactancia de la cabra
39
1.12. Compuestos responsables del aroma y sabor en los quesos de cabra
42
1.12.1. Compuestos neutros
43
1.12.2. Compuestos alcalinos
46
1.12.3. Compuestos acídicos
47
1.13. Importancia de los AGL en queso de cabra
48
1.14. Extracción de compuestos de aromas en quesos
49
CAPITULO II. MATERIALES Y MÉTODOS
53
2.1.
53
Ubicación de la zona de elaboración del queso de cabra
xi
2.2.
Muestras de queso
53
2.3.
Características de las cabras
54
2.4.
Fabricación del queso de cabra usado en el proyecto
54
2.5.
Reactivos y equipos
55
2.5.1. Reactivos
55
2.5.2. Materiales
56
2.5.3. Equipos de laboratorio
57
2.5.4. Sistema de cromatografía de gases - detector ionización de
57
llama (FID)
2.5.5. Sistema de cromatografía de gases – espectrometría de
58
masas (CG-EM).
2.6.
2.5.6. Sistema de cromatografía de gases – olfatometría.
58
Métodos y procedimiento
60
2.6.1. Preparación de las muestras de queso y muestreo por
60
microextracción en fase sólida (MEFS)
2.6.2. Obtención del panel entrenado
61
2.6.2.1.
Reclutamiento de panelistas
61
2.6.2.2.
Selección de panelistas
62
2.6.3. Representatividad del aroma en CG-O
65
2.6.4. Preparación de soluciones estándares de ésteres lineales
2.6.4.1.
Entrenamiento del panel en la detección de los ésteres
66
lineales por olfatometría.
2.6.5. Análisis olfatométrico
67
xii
2.6.6. Curva de calibración externa para los ácidos grasos libres
67
(AGL)
2.6.6.1. Linealidad de los AGL y curva de calibración
68
2.6.6.2. Limite de detección y cuantificación
69
2.6.7. Análisis estadístico de los AGL
70
CAPITULO III. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS
COMPUESTOS VOLÁTILES EN EL QUESO DE CABRA. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
71
3.1.
71
Selección del método de extracción y análisis de los compuestos
volátiles en las muestras de queso de cabra por MEFS-CG-FID.
3.1.1. Selección de la fibra para MEFS
71
3.1.2. Selección de la columna cromatográfica
73
3.1.3. Selección cantidad de muestra de queso
75
3.1.4. Tiempo de extracción
76
3.1.5. Temperatura de extracción
77
3.2. Identificación de los compuestos de la fracción volátil de los quesos de
78
cabra mediante MEFS y CG-EM recolectados en la producción de curva de
lactancia
3.2.1. Compuestos identificados mediante la separación en
78
columna DB-5
3.2.2. Análisis mediante la columna Carbowax.
80
CAPITULO IV.
ENTRENAMIENTO DEL PANEL SENSORIAL Y
ANÁLISIS OLFATOMÉTRICO. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
85
4 .1. Entrenamiento del panel sensorial
85
xiii
4.1.1. Reconocimiento de aromas de alimentos y desarrollo de
85
destreza en asociar descriptores
4.1.2. Determinación del umbral de identificación de aromas de los
86
panelistas
4.1.3. Desarrollo del vocabulario del panel para olfatometría.
4.2. Representatividad sensorial de la extracción del aroma del queso de
87
89
cabra por MEFS
4.3. Análisis olfatométrico del queso de cabra en las tres fases de lactancia
91
CAPITULO V. CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL
QUESO DE CABRA EN LAS TRES FASES DE LACTANCIA.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
97
5.1. Curvas de calibración
97
5.2. AGL en el queso de cabra
100
CAPITULO VI. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS AGL CUANTIFICADOS
EN EL QUESO DE CABRA Y ZONAS DE AROMAS DEL ANÁLISIS
OLFATOMETRICO. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
103
6.1. Análisis de los AGL en las muestras de quesos en las tres fases de
lactancia
6.2. Análisis estadístico de las zonas de aromas obtenidas en el análisis
olfatométrico de los quesos de cabra.
103
CONCLUSIONES
113
RECOMENDACIONES
115
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
116
APÉNDICE I
128
APÉNDICE II
135
APÉNDICE III
136
APÉNDICE IV
139
109
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1. Clases de olores y vocabulario para el panel olfatorio en los
11
análisis por CG-O en alimentos y bebidas alcohólicas
Tabla 1.2. Aplicación de métodos olfatométricos en análisis de
21
compuestos volátiles en diferentes matrices de alimentos.
Tabla 1.3.
Composición media de la leche de vaca, oveja y cabra
29
expresada por 100 g de leche [30].
Tabla 1.4. Propiedades físico-químicas de diferentes leches
30
Tabla 1.5. Diferentes procesos en la maduración enzimática del queso
34
fresco
Tabla 1.6. Efecto del estado de lactancia sobre la composición de la
41
leche en 42 cabras de la raza Alpina
Tabla 1.7.
Variación en la concentración de AGL (mg/100g) en
49
muestras de queso de cabra almacenados a 4°C
Tabla 1.8. Diferentes tipos de fibras para el análisis de compuestos de
51
aromas en quesos.
Tabla 1.9. Compuestos comunes encontrados en diferentes tipos de
52
queso (cheddar, pecorino, azul, parmesano, cabra)
Tabla 2.1. Reactivos usados en el proyecto
56
Tabla 2.2. Compuestos usados para el desarrollo de vocabulario del
64
panel en la detección de aromas.
xv
Tabla 3.1. Compuestos identificados para la muestra de queso
77
recolectada al inicio de la curva de lactancia (MQ1) mediante MEFS-CGEM en una columna DB-5
Tabla 3.2. Compuestos identificados para la muestra de queso
77
recolectada a la mitad de la curva de lactancia (MQ2) mediante MEFSCG-EM en una columna DB-5.
Tabla 3.3. Compuestos identificados para la muestra de queso
78
recolectada a la mitad de la curva de lactancia (MQ3) mediante MEFSCG-EM en una columna DB-5.
Tabla 3.4. Los ácidos grasos libres (AG) identificados en las tres
79
muestras de queso mediante MEFS-CG-EM en una columna Carbowax.
Tabla 4.1. Porcentajes de aciertos individuales y grupal
en el
84
Tabla 4.2. Umbral de identificación individual de los panelistas usando
85
reconocimiento de aromas de alimentos.
acetato de isoamilo.
Tabla 4.3.
Compuestos usados para el entrenamiento del panel en
86
Tabla 4.4. Descriptores de aromas de la serie de ésteres lineales en el
87
olfatometría.
entrenamiento del panel en olfatometría.
Tabla 4.5. Análisis del porcentaje de representatividad del aroma del
queso de cabra extraído con la fibras DVB/CAR/PDMS y CAR/PDMS.
88
xvi
Tabla 4.6. Evaluación de resolución nula en CG-O de los volátiles
89
extraídos con la fibra DBV/CAR/ PDMS del queso de cabra y patrón de
butanoato de etilo.
Tabla 4.7. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 1
92
Tabla 4.8. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 2.
93
Tabla 4.9. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 3
94
Tabla 5.1. Concentración en el espacio en cabeza de los ácidos grasos
99
libres (AGL) en las tres fases de lactancia
Tabla 5.2.
Valores de actividad de olor (VAO) de los ácidos grasos
101
libres (AGL) en el queso de cabra.
Tabla 6.1. Áreas medidas en CG-FID de los AGL en las tres fases de
104
lactancia y sus coeficientes de variación
Tabla 6.2. Coeficientes de correlación de los AGL
105
xvii
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1.1. Morfología interna del olfato
5
Fig. 1.2. Estructuras químicas correspondientes a los olores primarios.
8
Fig. 1.3. Curvas teóricas dosis – respuesta para 2 compuestos diferentes (A 13
y B); n es la pendiente de la recta.
Fig. 1.4. Esquema del equipo de cromatografía equipado con un detector de 14
olor.
Fig. 1.5. Comparación entre una señal cromatográfica convencional y la señal 15
olfatométrica.
18
Aromagrama individual y consenso mediante el método de
Figura 1.6.
frecuencia de detección, cuando cuatro evaluadores participan en el
experimento.
Fig.1.7.
Comparación de resultados obtenidos para 6 compuestos 20
determinados en el mismo extracto mediante CG-O, por diferentes métodos:
(a) AEDA, (b) CharmAnalisis, (c) Frecuencia de Detección y (d) Intensidad
Directa (OSME).
Fig. 1.8. Dispositivo de MEFS.
Fig. 1.9. Clasificación de las fibras de MEFS según si la
23
extracción se 27
produce por absorción o adsorción.
Fig. 1.10. Esquema propuesto para la micela del caseinato de calcio en la 31
leche.
xviii
Fig. 1.11. Esquema general de elaboración de queso.
33
Fig. 1.12. Extracción de compuestos de aroma en una solución modelo por 50
MEFS con diferentes fibras.
Fig. 2.1. Equipo de CG-O. (1) humidificador, (2) detector olfatométrico y/o 59
puerto de olor, (3) teclado para el registro de la señal.
Fig. 2.2.
Generación de la señal olfatométrica obtenida con el programa 60
LabView.
Fig. 2.3. Características de la señal con el detector olfatométrico.
60
Fig. 2.4. Gráfico modelo de curva de calibración usado para determinar LD y 68
LC.
Fig. 3.1. Comparación de cromatogramas de gases de los volátiles aislados 71
del queso de cabra con las fibras DVB/CAR/PDMS (a) y PDMS/CAR (b).
Fig. 3.2. Optimización del tiempo de muestreo por MEFS para las muestras 73
de queso de cabra.
Fig. 3.4. Optimización de las temperaturas de muestreo por MEFS del queso 74
de cabra.
Fig. 3.5.
Cromatogramas del perfil volátil del queso de cabra obtenidos 75
mediante MEFS y analizados en una columna de DB-5 (a) y Carbowax (b).
Fig. 4.1. Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de detección, 90
cuando 6 evaluadores participaron en el experimento para la muestra número
1 de queso de cabra (MQ1)
xix
Fig. 4.2.
Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de 93
detección, cuando 6 evaluadores participaron en el experimento para la
muestra número 2 de queso de cabra (MQ2)
Fig. 4.3.
Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de 93
detección, cuando 6 evaluadores participaron en el experimento para la
muestra número 2 de queso de cabra (MQ3)
Fig. 5.1. Optimización del volumen usado para los patrones de AGL para las 97
curvas de calibración externa.
Fig. 5.2. Curva de calibración del ácido butanoico
98
Fig. 5.3. Curva de calibración del ácido hexanoico
98
Fig. 5.4. Curva de calibración del ácido octanoico.
98
Fig. 5.5. Curva de calibración del ácido decanoico.
98
Fig. 5.6. Distribución de los AGL en las muestras de queso de cabra en las 100
tres fases de lactancia.
Fig. 6.1. Histogramas de los AGL; (a)
Butanoico, (b)
Hexanoico, (c) 104
Octanoico, (d) Decanoico.
Fig. 6.2. Dendograma de las variables (ac. butanoico, hexanoico, octanoico y 106
decanoico) en las tres fases de la curva de lactancia.
Fig. 6.3. Dendograma de las muestras de quesos en las tres fases de la 107
curva de lactancia.
xx
Fig. 6.4. Configuración de dos dimensiones de los AGL para los quesos de 108
cabra en los tres estados de lactancia derivada del modelo de distancia
euclídea.
Fig. 6.5. Perfil de aromas de las muestras de quesos de cabra
109
Fig. 6.6. Dendograma de las variables (familia de aromas obtenidas por el 110
análisis olfatométrico) de los quesos elaborados en las tres fases de la curva
de lactancia.
Fig. 6.7. Configuración en dos dimensiones de los grupos de aromas para las 111
muestras de quesos de cabra.
Fig. 6.8. Configuración en dos dimensiones para todas las muestras de 112
quesos de cabra.
xxi
LISTA DE ABREVIATURAS
AGL: Ácidos grasos libres
CAR: Carboxen
CW: Carbowax
CG - EM: Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
CG - FID: Cromatografía de Gases con Detector de Ionización de Llama.
CG: Cromatografía de Gases
CG - O: Cromatografía de gases - olfatometría
CV: Coeficiente de variación
DVB: Divinilbenceno.
EM: Espectrometría de masas.
EC: Espacio en cabeza.
FD: Frecuencia de detección
IR: Índice de Retención de Kováts.
LC: Limite de cuantificación
LD: Limite de detección
MDS: Multidimensional Scaling
MEFS-EC: Microextracción en Fase Sólida del Espacio de Cabeza.
MQ: Muestra de queso
PDMS:Polidimetilsiloxano.
TDS: Tiempo de duracción
TR Tiempo de retención
Rs: Resolución
VAO: valores de actividad de olor
ZA: Zona de aroma
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
La leche de cabra y sus derivados son recursos alimentarios que han recibido
en los últimos años gran atención mundial. Su producción se ha incrementado
notablemente en las últimas dos décadas y por ello está contribuyendo cada vez
más a mejorar la economía de productores, industriales y a incrementar el aporte
nutricional en varios sectores de consumidores. En algunas regiones la leche de
cabra se consume directa en forma líquida, aunque también se procesa para la
obtención de derivados, principalmente queso. La composición de la leche de cabra
difiere de la de vaca principalmente en el contenido de las diversas fracciones de
caseínas, lo cual puede propiciar rendimientos queseros menores y efectos sobre la
textura del queso. El alto contenido de ácidos grasos libres de la leche de cabra la
hace altamente susceptible a la lipólisis. Los ácidos grasos como butírico, caproico,
cáprico y caprílico, le confieren al queso un sabor diferente, lo cual es atractivo para
los consumidores [1].
Uno de los factores claves en el aumento de la producción y consumo de
leche de cabra y sus derivados en el mundo, es el efecto beneficioso para la salud
humana, ya que genera menos alergias [2] y es más digerible que la leche de vaca [3].
Dicha propiedad se debe a las diferencias de genotipo y fenotipo entre proteínas de
vaca y las de cabra. En general, aquellos infantes y niños que exhiben reacciones
alérgicas a la leche de vaca, toleran perfectamente la leche de cabra y sus derivados
[4]
. También se reconoce la mejor digestibilidad de la grasa de leche de cabra
comparada con la de vaca, probablemente como consecuencia de la diferencia en el
tamaño de los glóbulos grasos [5].
Por otro lado los atributos que más condicionan la aceptabilidad de cualquier
alimento por parte del consumidor son los relacionados con la calidad sensorial, que
incluye la apariencia, el aroma, el gusto y la textura. En este sentido, uno de los
2
rasgos más complejos y determinantes de dicha calidad es el aroma del alimento,
que se puede definir como la sensación global producida al oler los compuestos
que interaccionan con las terminaciones nerviosas sensibles del gusto y del olfato[6].
El aroma está compuesto por centenares de compuestos volátiles y semivolátiles
que pertenecen a distintas familias químicas y que se encuentran a concentraciones
muy variables. La elevada producción y la necesidad de encontrar alimentos
aromáticamente estandarizados, requieren herramientas analíticas eficientes para su
caracterización [6].
La producción de la leche de cabra depende de muchos factores, entre los
que se encuentra el estado de lactancia, el cual determina diferentes niveles de
producción caracterizados en tres fases: ascenso, cúspide o nivel máximo y
descenso o declive, estas etapas no solo hacen variable el nivel de producción de
leche sino también su composición, principalmente en el contenido graso, el cual es
el componente principal en el proceso de lipólisis para la producción de compuestos
responsables del aroma, en los que se encuentran los ácidos grasos libres.
En Venezuela el queso de cabra es un producto que en la última década ha
aumentado su demanda en la dieta diaria de la población, principalmente en la zona
occidental del país. Sin embargo en la literatura no hay reportados estudios previos
acerca de la calidad aromática de este producto. De esta manera se hace necesario
plantear investigaciones que establezcan relaciones entre el origen geográfico, la
tecnología aplicada en la elaboración del producto, la microbiología y las
características sensoriales del queso de cabra, para así establecer la caracterización
de estos productos y plantear mejoras tecnológicas que contribuyan al sistema de
producción y la calidad para el consumidor. Por todo lo expuesto anteriormente, a
continuación se plantea el objetivo en el presente estudio.
3
OBJETIVOS
Objetivo general
Analizar los compuestos químicos responsables del aroma de queso de cabra
venezolano proveniente del estado Lara, elaborado en las tres fases de lactancia y
sus perfiles aromáticos mediante la implementación de la técnica de cromatografía
de gases-olfatometría.
Objetivos específicos
Seleccionar las condiciones experimentales adecuadas para aislar y analizar
cualitativa y cuantitativamente la fracción volátil del queso de cabra
venezolano proveniente del estado Lara, mediante el uso de microextracción
en fase sólida (MEFS) y cromatografía de gases (CG) y cromatografía de
gases - espectrometría de masas (CG-EM).
Comparar los principales compuestos volátiles presentes en el queso de
cabra elaborado en las diferentes fases del periodo de lactancia identificados
por MEFS-CG-EM.
Implementar la técnica de cromatografía de gases acoplada a olfatometría
(CG-O) para la evaluación de compuestos activos de aromas presentes en el
queso de cabra en las tres fases de lactancia mediante el análisis y
comparación de los aromagramas.
Correlacionar los resultados de CG-EM con los obtenidos mediante CG-O
para identificar los principales compuestos que contribuyen al aroma del
queso de cabra.
4
Estudiar la variabilidad en el tiempo de las concentraciones de los ácidos
grasos libres (AGL) mediante su correlación con el periodo de lactancia de las
cabras a partir de tratamientos estadísticos.
5
CAPÍTULO I
MARCO TEÓRICO
1.8.
Características fisiológicas del sentido del olfato
La ubicación de este sentido es la nariz que se abre al exterior por dos
orificios (ventanas nasales) y comunica con el interior de la cavidad bucal por las
fosas nasales (Fig. 1.1) [7].
Fig. 1.1. Morfología interna del olfato [8]
En la parte inferior de la mucosa pituitaria que tapiza las paredes laterales
interiores de las fosas nasales, se observan numerosas glándulas secretoras de
color rojo, que humedecen la cavidad, y en la parte superior se encuentran las
células olfativas con una superficie aproximada de unos 10cm2, de color amarillo[7],
denominadas “células de Schult” y caracterizadas por la presencia de un
alargamiento que se insinúa a través de la membrana y que termina en una vesícula
clara que aparece en la superficie externa de la mucosa. Dicha vesícula contiene
una secreción acuosa, en la cual se encuentran inmersas las pequeñas
6
terminaciones ciliadas de la dendrita de la célula nerviosa. En la parte opuesta de la
célula olfativa hay una prolongación que constituye una de las fibras del nervio
olfativo. Las dendritas ciliadas de la célula olfativa constituyen el receptor del
estimulo olfativo, y se calcula que en el ser humano cada neurona posee entre 30 y
40 cilios, y en estos cilios se observan lugares en los que se encuentran los puntos
de recepción de los aromas [7].
Para ser detectadas, las sustancias odoríferas aspiradas por la nariz, deben
solulbilizarse en la secreción acuosa que recubre las terminaciones ciliadas y luego
entrar en contacto con las terminaciones nerviosas [7].
1.9.
El Olor y su Percepción
El olor es la sensación producida al estimular el sentido del olfato, y el aroma
es la fragancia del alimento que permite la estimulación del sentido del olfato, por
eso en el lenguaje común se confunden y usan como sinónimos
[9]
. El olor se
produce como la respuesta biológica de los sentidos a compuestos químicos en
estado gaseoso, interpretada en el cerebro en el contexto de la experiencia humana
[10]
. De esta manera los aromas existen en virtud de una serie de interrelaciones
complejas entre los sistemas biológicos y los estímulos químicos, donde la química
se ha encargado de la caracterización de los compuestos activos de aromas.
La psicometría es una rama de la psicología que se encarga del estudio del
comportamiento humano ante los estímulos
[11]
. Se ha reconocido que los procesos
psicológicos tales como la atención, la memoria, la cognición y la cultura tienen
influencia en la respuesta humana. La neurofisiología, por su parte, ha estudiado lo
concerniente a los procesos neuronales asociados con el proceso de estímulorespuesta como la percepción de un olor.
A pesar que no se conocen
completamente todos los procesos relacionados con la respuesta humana a los
estímulos físicos, se han encontrado que se cumplen los tres siguientes aspectos en
la percepción del aroma [11]:
7
• Las reacciones de los aromas se presentan en diferentes cualidades o
modalidades, las cuales muestran una especificidad estructural hacia el
estímulo. Es decir, dos compuestos químicos con la misma cualidad de aroma
(por ejemplo olor a rosas secas) y el mismo comportamiento cromatográfico
(tiempo de retención), son el mismo compuesto químico.
Las reacciones a los aromas muestran una respuesta sigmoidal con respecto
a la concentración del compuesto químico.
Las respuestas a mezclas de estímulos están caracterizadas por inhibición y
supresión y no por sinergismo.
Para que un compuesto sea oloroso, éste debe ser volátil a temperatura
ambiente y con un peso molecular menor a 300 uma. Usualmente son compuestos
orgánicos hidrofóbicos que contienen un limitado número de grupos funcionales. Sin
embargo, esto último no es prerrequisito, ya que se han reportado alcanos con
potentes aromas alcanforados, como lo son; 2,4,4-trimetilpentano y ciclooctano [12].
La percepción del olor se produce en la parte superior de la cavidad nasal,
definido como el epitelio olfativo (región olfativa). Este constituye una parte
importante
de la mucosa nasal, que cuenta con 3 a 50 millones de receptores
olfativos. Las sustancias aromáticas volátiles llegan hasta ellas mezcladas con el
aire de la respiración, o bien directamente por la nariz o indirectamente, a través de
la cavidad faríngea posterior (retronasal), donde se liberan por trituración en la
masticación, disolución en la saliva y calentamiento [7].
Los valores de umbral en la percepción de los olores en general dependen de
una serie de factores como son: volumen y duración del flujo de aire que llega a la
mucosa olfativa, la humedad del medio ambiente, así como el efecto de hambre; se
ha demostrado una relación inversa entre éste y la sensibilidad del olfato. Existen
factores de carácter interno relacionados con las variables de cada individuo,
pudiendo citarse entre otros: el estado fisiológico de cada persona y la edad [8].
8
La teoría de las bases químicas del sentido del olfato establecida por
Moncrieff y Amoore
[8]
(1962), se basa en la interacción entre las estructuras
químicas de las moléculas y los receptores olfativos. Se establece que los poros
olfativos poseen receptores con formas distintas donde encajan las moléculas, su
tamaño y forma le permite acoplarse al receptor e interaccionar en él. Se postulan 9
formas distintas de receptores y paralelamente 9 categorías primarias de olores
(olores primarios). De acuerdo a esta hipótesis, todas las restantes impresiones
olfativas resultan de la mezcla de olores primarios (Fig.1.2).
Fig. 1.2. Estructuras químicas correspondiente a los olores primarios. A=
dulce; B= naftalínico; C= Almizclado; D= Alcanforado; E= Jazmínico; F=Anisado; G=
Graso; H= Floral; K= Leñoso[4].
En las moléculas pequeñas que apenas se diferencian entre sí en cuanto a
forma y tamaño, los grupos funcionales desempeñan un papel importante respecto a
la categoría del olor. Entre ellas se encuentran el amoníaco (NH3, grupo funcional –
NH2; olor penetrante), el ácido sulfhídrico y el metil mercaptano (H2S y CH3SH;
grupo funcional –SH, olor a huevos podridos). Al aumentar el tamaño de la molécula,
disminuye la influencia dominante de los grupos funcionales, la forma y el tamaño
molecular determinan en gran medida la categoría del olor [7].
La concentración del odorante puede también afectar las características en su
percepción. El clásico ejemplo son los compuestos químicos pertenecientes al
grupo de los tioles, los cuales a altas concentraciones presentan olores sulfurosos
9
desagradables y a bajas concentraciones, olores frutales muy agradables como
parchita, naranja y piña [12].
El olor desempeña un papel muy importante en la evaluación sensorial de los
alimentos, sin embargo su identificación y las fuentes de las que provienen son muy
complejas. Los seres humanos disponen de unos 1000 receptores conocidos que
parece ser que distinguen unos 10000 olores distintos, sin embargo, a veces el
mecanismo olfativo no funciona adecuadamente y se produce una significativa
pérdida de la capacidad olfativa o ausencia total de la facultad de oler, debido a
varios factores como son: edad, infecciones virales, alergias, consumo de ciertos
fármacos, entre otros. Dicha anomalía se conoce con el nombre de anosmia [8].
En el año 2004, Richard Axel y Linda Back obtuvieron el Premio Nobel de
Medicina, por sus descubrimientos que clarifican la forma en que funciona el sistema
olfativo. Su publicación en el año 1991
[13]
describe la presencia de una familia de
1000 genes distintos (el tres por ciento de los genes humanos) que dan lugar a un
número equivalente de distintos tipos de receptores olfativos. Los mencionados
autores explican que el epitelio olfativo contiene unos 5 millones de neuronas
olfativas que envían mensajes directamente al bulbo olfativo del cerebro. Cuando un
olor excita a una neurona, la señal viaja a lo largo del axón de la célula nerviosa y se
transfiere a las neuronas del bulbo olfativo. Esta estructura, ubicada en la parte más
frontal del cerebro, es el centro de distribución para el sentido del olor. Desde el
bulbo olfativo, las señales del olor se retransmiten a la corteza superior del cerebro,
que maneja los procesos conscientes del pensamiento, y al sistema límbico, que
genera sensaciones emotivas [13].
1.10. Olfatometría
Los estudios por cromatografía con detectores como ionización a la llama (FID) y
selectivos de masas, permiten obtener información, principalmente de los
10
compuestos volátiles mayoritarios en la muestra. Sin embargo, hay notas del aroma
que no pueden explicarse mediante un cromatograma, y para responder a esta
incógnita se realizan los ensayos olfatométricos. Estos se basan en desviar el flujo
de salida de la columna hacia un puerto de olor, de forma que puedan ser
detectados por un panelista, el cual registra los olores y la intensidad de cada uno de
los compuestos luego de eluir de la columna capilar
[14]
. Dicha detección
olfatométrica o sniffing permite determinar el perfil aromático de los alimentos y
bebidas a partir del análisis cromatográfico.
La fracción de volátiles que constituye el aroma de un alimento consiste en
una mezcla de compuestos, en donde solo unos pocos son sensorialmente
relevantes
[15]
. En algunos casos, estos volátiles de impacto se encuentran a nivel de
trazas, por lo que la sensibilidad de los detectores instrumentales comúnmente
usados (ionización a la llama y espectrometría de masas) es muy baja para registrar
su señal. La cromatografía de gases acoplada con olfatometría (GC-O) se convierte
en una herramienta analítica invalorable en la investigación de aromas, debido a que
se pueden caracterizar y correlacionar los olores de los compuestos simples o
mezclas de volátiles con especies químicas. Con este método se aprovecha la alta
sensibilidad del olfato humano para la evaluación de olores, ya que teóricamente la
nariz humana tiene un límite de detección de 10-19 moles para ciertos compuestos de
aroma [16].
El olfatómetro está formado por un panel olfatorio donde un grupo de
personas es debidamente entrenado para oler los compuestos separados a la salida
de la columna del cromatógrafo
[17]
. El panel debe hacer un consenso de los
descriptores a usar en la descripción de los aromas percibidos, para lo cual se han
establecido
grupos de clases de
olores (Tabla 1.1) presentes en análisis de
alimentos y bebidas a partir de la técnica de CG-O, lo cual ayuda al desarrollo del
vocabulario del panel [10]
11
Tabla 1.1. Clases de olores y vocabulario para el panel olfatorio en los análisis por
CG-O en alimentos y bebidas alcohólicas [18]
Clases de olores
Vocabulario usado por el panel (Descriptores)
Ácido – alcohol
Ácido, alcohol, vinagre, ron.
Tierra - suelo
Champiñones, hongos, corteza de árbol, musgo, aserrín, suelo
húmedo.
Tostado- torrefacción
Bizcocho, torta, pan caliente, chocolate, cacao, café, caramelo,
(empireumático)
maní tostado, mantequilla de maní, almendra, avellana, madera
quemada, carne tostada, ceniza de madera.
Frutal – floral
Frutas cítricas, naranja, fresa, dulce de fresa, manzana roja,
manzana verde, kiwi, cambur, melón, piña, vainilla, melcocha,
fruta fermentada, flores, rosas, violetas, lilas.
Verde – vegetales
Hierbas, hierba recién cortada, hierba mojada, legumbres,
zanahoria, papas, lentejas, alcachofas.
Lácteo – queso
Leche, leche fermentada, crema de leche, yogurt, cuajo, vómito,
medias sucias, queso azul, queso emmental, parmesano.
Plástico – químico
Plástico, caucho, plástico derretido, cinta adhesiva, cloro,
detergente, éter, piscina, alcanfor.
Sulfuro - gas
Azufre, huevo, huevo podrido, repollo, repollo cocido, ajo, coliflor.
No clasificado
Agradable, desagradable, fresco, cocina, dulce, metal, gel de
baño, cremas corporales, etc.
1.11. Detección de compuestos de aroma
La detección de los compuestos de aroma va a depender de un parámetro
importante como el valor de actividad de aroma, el cual se define como:
Ax= cx /ax (ec. 1.1)
donde cx es la concentración de un compuesto X en la matriz estudiada, ax el
umbral de olor, el cual es la mínima concentración detectada de un compuesto X.
Un valor alto de Ax indica una mayor contribución del compuesto en el aroma [19].
12
La evaluación de los compuestos volátiles en base al valor de aroma provee
una información no muy detallada del aporte del compuesto al aroma. La
dependencia de la intensidad del olor con la concentración debe ser tomada en
cuenta. De acuerdo con la ley de Steven para un estímulo fisiológico:
E = k (S – So)n (ec. 1.2)
en la cual E= intensidad de percepción, k= constante de proporcionalidad que
depende de cada odorante; S= concentración del compuesto de olor, So = umbral de
detección del compuesto de olor (en unidades de concentración) y n es la pendiente
de intensidad de Steven, la cual es característica para cada compuesto de olor. Esta
ley
establece
que
cada
compuesto
tiene
una
única
función
psicofísica
(concentración-respuesta) de olor, determinado por el valor de n (Fig. 1.3), por lo
que contribuyen con diferentes valores de intensidades a los atributos sensoriales de
un alimento [20].
Fig. 1.3. Curvas teóricas dosis – respuesta para 2 compuestos diferentes (A
y B); n es la pendiente de la recta [20].
La definición de actividad de aroma no debe confundirse con la relación
detallada entre el estímulo y la respuesta descrita por la función psicofísica de dosisrespuesta. Para describir el aroma de un compuesto, se han definido otras
propiedades además de la intensidad descrita anteriormente por la ecuación de
Steven, tales como la potencia (persistencia de un aroma a las diluciones del medio
donde existe) y el carácter (cualidad o descripción) de un olor, los cuales están
13
relacionadas con la función psicofísica, y han sido usadas para discriminar los
compuestos de impacto en el aroma del resto de la fracción de volátiles de un
producto [21].
1.5. Características instrumentales de la técnica de GC-O
La técnica de cromatografía de gases con detección de olor fue publicada por
primera vez en 1964 por George Fuller y colaboradores
[20]
. Ellos determinaron los
componentes de olor de perfumes, para lo cual el detector fue un asesor experto en
el área de perfumes, que olía y describía los aromas detectados.
La determinación del olor es posible gracias a una persona o panel
entrenado, que se encuentra situada en el puerto de olor, conectada en paralelo
muchas veces a otro detector convencional, tal como ionización de llama o
espectrometría de masas (Fig. 1.4), y de esta manera comparar las señales
obtenidas simultáneamente para la caracterización de los analitos eluidos [22].
Fig. 1.4. Esquema del equipo de cromatografía equipado con un detector de olor [22
1.5.1. Puerto de olor
El diseño del puerto de olor consiste en una figura cónica de vidrio con el
borde en forma de la parte inferior de la nariz, la cual se encuentra al final de la línea
de transferencia (Fig.1.4). Esta línea es calentada para prevenir la condensación de
14
analitos semivolátiles en las paredes del capilar. Un gas auxiliar, que suele ser aire
humidificado, es conectado al puerto de olor para prevenir la resequedad de las
mucosas en las membranas odoríferas de la nariz, ya que esto puede causar
incomodidad en el panel, especialmente en análisis de larga duración [22].
1.5.2. Sistema de detección y generación de la señal
El dispositivo electrónico de detección genera una señal analógica, asociada
a un aumento lineal en el voltaje, dependiente del tiempo
[21]
, que se genera al
comenzar a detectar el aroma (presionar el botón, tecla, etc.) y finaliza al dejar de
percibirlo (soltar el botón), y finalmente la señal decae de forma transiente hasta
llegar a voltaje cero o línea base (Fig. 1.5), originando una figura semejante a una
gaussiana (señal olfatométrica), y de esta manera se puede correlacionar con el
patrón de distribución de los compuestos que migran en una columna
cromatográfica, la cual también es del tipo gaussiana.
Fig. 1.5. Comparación entre una señal cromatográfica convencional y la señal
olfatométrica [23].
Los
parámetros
generados
de
la
señal
olfatométrica
(Fig.1.5)
son
característicos para cada compuesto de olor detectado:
tI = tiempo del comienzo del estímulo (detectar un olor característico; floral,
herbáceo; etc.).
15
tF = tiempo final del estímulo.
tDS = Tiempo de duración del estímulo, calculado mediante la resta de tF y tI.
tE = Tiempo de elución olfatométrica, la cual es calculada; tE = tI + ½ tDS y
corresponde al máximo de la señal olfatométrica la cual se asume que posee una
distribución gaussiana.
Las diferencias en los valores de tDS pueden ser relacionadas con la cantidad
del compuesto presente, ya que el ancho de la banda cromatográfica puede ser
proporcional a la cantidad del odorante [23].
El orden de elución de los compuestos de olor en la columna, el carácter del
olor, y la intensidad de olor percibido de un odorante, están directamente
influenciados por la intensidad de olor percibido por los compuestos de aroma que
eluyen antes y después de éste. Esto se denomina el efecto contraste
[21]
, y puede
ser corregido balanceando el orden de presentación de los odorantes. Esto se logra
cambiando algunos parámetros cromatográficos tales como temperatura del horno,
presión, gas de arrastre, y usando al menos dos columnas de fases diferentes (no
polar, medianamente polar y polar).
1.5.3. Resolución de la señal cromatográfica
La resolución (Rs) de una columna cromatográfica constituye una medida
cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos y está definida por la
ecuación:
Rs = (¼ (L/H)) (α – 1/ α)( k / k + 1) 1/2 ) (ec. 1.3)
Donde L es la longitud de la columna; H es la altura de plato teórico, α es la
selectividad que depende de la fase estacionaria y k es el factor de retención
promedio de dos picos adyacentes.
16
A partir de la ecuación anterior y para una fase estacionaria dada, la
resolución puede mejorarse alargando la columna, aumentando así el número de
platos. Una consecuencia negativa del aumento del número de platos es el
incremento del tiempo requerido para la separación, por lo que una reducción del
diámetro de la columna reduciría la altura del plato teórico sin aumentar el tiempo de
corrida cromatográfica [24].
En un estudio del envejecimiento de cerveza por CG-O
[21]
, se compararon 2
columnas cromatográficas que solo se diferenciaban en sus longitudes para
establecer las zonas de aromas características; separación de alta resolución (30 m
de largo) y separación de mediana resolución (12 m de largo), concluyéndose que
no hubo diferencias en el número y tipo de zonas de olor encontradas en los perfiles
de aromas, y el análisis por CG-O por mediana resolución se llevó en la mitad del
tiempo que el requerido para el análisis de GC-O de alta resolución.
Además del análisis de los compuestos separados en alta y mediana
resolución, se realiza el análisis en condición de resolución nula (columna sin fase
estacionaria), el cual permite evaluar si la técnica usada para aislar los compuestos
volátiles es la más idónea, ya que el evaluador debe percibir una única zona de olor
(idealmente), característica al aroma del producto cuando es consumido, lo que se
denomina representatividad del aroma en GC-O [25].
1.6.
Condiciones para la detección por olfatometría
Para los análisis por olfatometría, los panelistas deben evitar el uso de
perfumes o jabones con aromas fuertes, y una o media hora antes deben abstenerse
de consumir alimentos y bebidas, para evitar de esta manera posible olores que
interfieran con los eluidos en la separación cromatográfica [22.]
17
El laboratorio donde se realizarán los análisis debe estar libre de olores y
ruido, evitando posibles fuentes cercanas, debe mantenerse una temperatura
constante y mantenerse cerrado durante el tiempo que transcurra el análisis [20] [22].
1.7.
Métodos de tratamientos de datos obtenidos por CG-O
Existen varios métodos para el tratamiento en la adquisición de la data
obtenida en CG-O, clasificados para determinar la intensidad (OSME), potencia
(AADE y Charm) y frecuencia de los olores detectados (FD) y su relativa influencia
en el olor de las muestras. Estos métodos se describen a continuación:
1.7.1. Método de frecuencia de detección
En este método el panel está conformado de 6 a 12 personas, las cuales
analizan la misma muestra. Se cuantifica el número de personas que detecten un
compuesto en el mismo tiempo de retención, y luego se clasifican los compuestos
más frecuentemente detectados
como los de mayor influencia en el olor de la
muestra analizada [22].
Los resultados de cada zona de olor detectada por cada panelista bajo las
mismas condiciones de CG-O son resumidas en un cromatograma (aromagrama)
consenso (Fig. 1.6), en el cual la altura total de pico es el número de veces que la
zona de olor fue detectada por el panel, y se define como Frecuencia de Impacto
Nasal (FIN). Adicionalmente, el tiempo de duración del estímulo, el cual corresponde
al ancho de la zona de aroma, puede ser medido, lo que permite calcular el área de
cada pico, denominada Área de Frecuencia de Impacto Nasal (AFIN).
El beneficio del método basado en la frecuencia de detección en comparación
con los otros métodos olfatométricos es su simplicidad, para lo cual no se requiere
un panel evaluador calificado. El método es repetible y los resultados reflejan las
diferencias en sensibilidad entre los evaluadores, la cual puede ser relacionada con
18
diferencias que presente la población del panel usado. Este método es el que menos
tiempo consume y es el mas fácil de realizar a diferencia del método de dilución de
umbral [22].
Figura 1.6. Aromagrama individual y consenso mediante el método de frecuencia
de detección, cuando cuatro evaluadores participan en el experimento [22].
Adicionalmente de las frecuencias de las zonas de aromas obtenidas con este
método, se ha propuesto usar escalas de 4 puntos para obtener información
intensidad del olor percibido ( 0= no detectado, 1= débil, 2= medio y 3= intenso). La
señal obtenida es denominada porcentaje de frecuencia modificada (FM), la cual es
calculada por la formula propuesta por Dravnieks [26].
FM (%) = (F (%) x I (%))1/2 (ec. 1.4)
Donde F es la frecuencia de detección de un olor percibido expresado como
porcentaje e I es la intensidad promedio expresada como porcentaje de la intensidad
máxima.
1.7.2. Método de dilución de extractos de aroma
En estos métodos denominados Análisis de Aroma por Dilución del Extracto
(AADE) y Charm Análisis, se evalúa la potencia relativa de olor de los componentes
eluidos, con diluciones seriales del extracto de una muestra. Las zonas de aromas
en el aromagrama son obtenidas por evaluación olfatométrica de las sucesivas
19
diluciones del extracto inicial hasta una dilución
ninguna zona de olor
tal que el panelista no perciba
[27]
. En esta metodología se asume que el valor de dilución
obtenido para cada odorante del extracto es proporcional al Valor de Actividad de
Olor (VAO) de cada compuesto, de esta manera, mientras más alto sea el valor de
dilución al cual el odorante es detectado por olfatometría, mayor será la contribución
de dicho compuesto al olor total del alimento. Las diluciones seriales se hacen con el
mismo solvente que se preparó el extracto, generalmente diluciones sucesivas 1:2 y
1:3 y se presentan de manera aleatoria al panel evaluador [28].
El método AADE mide la máxima dilución del extracto en la que el olor es
percibido y se reporta este valor como el factor de dilución (FD) (Fig. 1.7a). En
comparación Charm toma en cuenta la duración del olor percibido y genera un pico
cromatográfico, donde el área es expresada adimensionalmente como valores de
Charm y los grafica contra los índice de retención (Fig. 1.7b). El valor de Charm
puede ser calculado mediante la siguiente formula:
c = d n-1 (ec. 1.5)
donde n es el número de respuestas coincidentes y d es el factor de dilución .
1.7.3
Método de medición de intensidad olfativa
El método de tiempo-intensidad llamado OSME se basa en estimar la
magnitud de la intensidad del olor percibido y fue desarrollado por McDaniel y
colaboradores
[29]
. Este método usa una escala estructurada de 16 puntos (15 cm),
en la cual los extremos están identificados de la siguiente manera; 0 = no hay
ninguna intensidad percibida y 15 = la intensidad extrema
[30]
y el panelista debe
expresar la característica del olor. Cada muestra debe contener 4 réplicas por cada
asesor y luego se realiza un aromagrama consenso, denominado Osmegrama (Fig.
1.7d), donde se registran los datos de intensidad de aroma (promedio) y el índice de
retención para cada odorante, así como la duración del olor (d).
20
Fig.1. 7. Comparación de resultados obtenidos para 6 compuestos determinados en
el mismo extracto mediante CG-O, por diferentes métodos: (a) AEDA, (b)
CharmAnalisis, (c) Frecuencia de Detección y (d) Intensidad Directa (OSME) [22].
Una diferencia importante de OSME con los otros métodos descritos
anteriormente, es que éste se rige por la teoría psicofísica del olor representada por
la ley de Steven
[20]
, ya que mide la intensidad percibida del olor detectado, a
diferencia de los métodos de dilución, en los cuales no se mide la intensidad.
La técnica de olfatometría ha aumentado su aplicación en el análisis de
diferentes matrices. En la Tabla 1.2 se presenta un cuadro de variadas aplicaciones
de esta técnica:
21
Tabla 1.2. Aplicación de métodos olfatométricos en análisis de compuestos volátiles
en diferentes matrices de alimentos.
Método
olfatométrico
Referencia
Bibliográfica
FD
31
(%) FM
32
FD
33
AADE
34
Caracterización del perfil volátil en aceite de pescado
AADE
35
Determinación de los compuestos activos de aroma en jamón
FD
36
AADE, FD
37
FD
38
Objetivo del estudio
Análisis de compuestos activos de olor originados en la
fabricación de papel para empaques de alimentos
Análisis cuantitativo de la calidad de aromas de vinos tintos
españoles
Evaluación del aroma de mejillones cocidos durante el proceso
de producción
Determinación de compuestos activos de aroma en la
producción de manzanas Fuji
ahumado Bayonne
Análisis de la composición aromática de dos especies de
hongos
Caracterización de los cambios en el aroma de leche materna a
-19 ºC
FD= frecuencia de detección; %FM= porcentaje de frecuencia modificada; AADE= análisis
del aroma por dilución del extracto.
1.8. Métodos de extracción y aislamiento de los compuestos volátiles en
alimentos
Los aromas son esenciales para la evaluación de la calidad de los productos
frescos y procesados. La determinación de los compuestos volátiles es uno de los
retos con más dificultad en el análisis de alimentos, debido que es necesario
determinar la diversidad de compuestos en bajas concentraciones y de
características físico-químicas distintas. Por su condición volátil, el instrumental
analítico que se requiere para su detección y separación es un cromatógrafo de
gases. Sin embargo, las distintas técnicas propuestas se distinguen por la
22
preparación de la muestra, la extracción, el aislamiento y la concentración de los
analitos, etapas previas a la cromatografía de gases, y que repercuten en la
reproducibilidad, precisión y sensibilidad.
Así el perfil aromático de un alimento está estrechamente relacionado con el
procedimiento de aislamiento utilizado, el cual debe ser representativo de la
muestra, por lo que se considera un paso crucial en el análisis de los compuestos
volátiles. De acuerdo a las propiedades de los odorantes, la preparación puede
incluir: extracción con solvente (ES), destilación - extracción simultánea (DES),
extracción con fluido supercrítico (EFS), extracción con soxhlet, hidrodestilación
asistida con microondas (HDAM), espacio en cabeza (EC), entre otras [39].
La
extracción
con
solvente,
hidrodestilación
y
extracción-destilación
simultánea son las técnicas más usadas, sin embargo requieren grandes cantidades
de muestras, solventes y en general los tiempos de extracciónson largos. Además,
tienen el inconveniente de que las altas temperaturas de trabajo puedan producir la
degradación de algunos volátiles y/o la formación de nuevos compuestos
[39]
.
Posteriormente y para minimizar la cantidad de solvente a emplear, se desarrolló la
extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction SPE), que usa un material
adsorbente para extraer compuestos orgánicos de muestras acuosas. Sin embargo,
ambas técnicas requieren de una fase posterior de concentración para eliminar el
exceso de disolvente, por lo que se limitan a compuestos volátiles y semivolátiles
con puntos de ebullición superiores a la temperatura de ebullición del solvente. Las
restricciones de la SPE (como múltiples artefactos) se superan al poner una
pequeña cantidad de fase sólida en una delgada fibra de sílice fundida, lo que
constituye una microextracción que permite mayor rendimiento. La pequeña
geometría permite una mayor rapidez de transferencia de masa durante la
extracción y desorción térmica directa de los compuestos en los equipos analíticos
[40] [41]
.
23
1.8.1. Microextracción en Fase Sólida (SPME, Solid Phase Microextraction)
En los años 90 Pawliszyn y colaboradores[42] desarrollaron la técnica de
microextracción en fase sólida (MEFS) inicialmente usada para la determinación de
compuestos clorados en aguas contaminadas. La técnica se basa en la extracción
de los analitos de la matriz de la muestra mediante una fibra de sílice fundida de 5 y
10 mm de longitud, recubierta por un adsorbente de 80-100 µm (del orden de 0,5
µL; casi siempre polimérico). El pequeño tamaño de la fibra y su geometría cilíndrica
permiten incorporarla en una jeringa. De esta forma se facilita la manipulación y se
protege la fibra cuando ésta no se utiliza
[43]
(Fig. 1.8).
Fig. 1.8. Dispositivo de MEFS [43].
Esta técnica de preparación de muestra, extrae y concentra los analitos
directamente sobre una fibra cubierta por una fase que incluye un tipo o más de
polímeros adsorbentes o absorbentes. El método es rápido, fácil de aplicar, de bajo
costo y, a la vez, respetuoso con el medio ambiente, ya que no usa ningún tipo de
disolvente orgánico. Se emplea combinado con cromatografía de gases (CG),
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y
olfatometría (CG-O), entre otros y es aplicado a un amplio rango de compuestos
volátiles y semivolátiles en muestras biológicas, ambientales y de alimentos. La
MEFS se ha introducido también como técnica acoplada a cromatografía líquida
24
(HPLC) y cromatografía líquido- espectrometría de masas (CL-EM) para analizar
compuestos semi volátiles o bien compuestos termolábiles.
Las principales ventajas de la técnica de MEFS son:
•
Gran simplicidad
•
Bajo costo
•
Utiliza pequeños volúmenes de muestra
•
No necesita disolventes orgánicos
•
Fácilmente transportable
•
Útil para todo tipo de muestras
•
Posibilidad de automatización
•
Permite la concentración de compuestos volátiles y semivolátiles
•
Bajo límite de detección (del orden de ppt) [43].
Los principales inconvenientes de la técnica de MEFS son:
•
Limitada capacidad de las fibras debido a que contienen una cantidad de
recubrimiento muy pequeña.
•
La presencia de materia suspendida en la muestra puede dañar el recubrimiento de
la fibra durante la agitación por efecto de abrasión.
•
Los compuestos de elevado peso molecular pueden adsorberse irreversiblemente en
la fibra cambiando sus propiedades.
•
La formación de burbujas de gas en la superficie de la fibra puede afectar a la tasa
de transferencia de masa
•
Pueden aparecer problemas de sensibilidad, ya que depende de la cantidad de
analitos extraídos de la muestra; si el volumen de la muestra (Vs) es muy elevado,
será muy superior al producto entre la constante de distribución (Kfs) y el volumen
de recubrimiento (Vf) de la fibra (Kfs×Vf<<Vs) y, por tanto, aunque se aumente el
volumen de muestra no se consigue aumentar la sensibilidad [43].
25
La MEFS se basa fundamentalmente en la partición de los analitos entre la
matriz de la muestra y el recubrimiento de la fibra [44]. Así el transporte de los analitos
desde la matriz de la muestra hasta la fibra comienza cuando la fibra entra en
contacto con la muestra. La extracción por MEFS se considera completa cuando la
concentración del analito alcanza el equilibrio de distribución entre la matriz de la
muestra y el recubrimiento de la fibra
[45]
, lo que en la práctica significa que, una vez
llegado al equilibrio, la cantidad extraída es constante y por tanto, será
independiente de un incremento del tiempo de extracción. El modelo matemático
que explica la dinámica del proceso de absorción cuando la fibra se introduce
directamente en la muestra fue desarrollado por Louch en 1992. En este modelo se
confirma la relación lineal que existe entre la cantidad de analito absorbida por la
fibra en el estado de equilibrio (n) y la concentración de éste en la muestra (Co).
Esta relación se muestra en la siguiente ecuación:
(ec. 1.6)
n= moles de analito absorbido por la fibra
Vf= volumen de fibra
Vs= volumen de muestra
Kfs= coeficiente de partición (constante de distribución) del analito entre
fibra/muestra: Kfs= Cf/Cs
Co= concentración inicial de analito en la muestra
Se asume que la matriz de la muestra es una única fase homogénea y no se
considera el efecto del espacio de cabeza ni de las paredes del recipiente.
El modelo matemático de MEFS para la extracción de los analitos del espacio de
cabeza fue desarrollado posteriormente. Las ecuaciones y conclusiones a las que se
llegan son similares a las de la extracción por inmersión, pero teniendo en cuenta
una tercera fase gaseosa
[44]
. La cantidad de analito extraída en el equilibrio,
utilizando extracción por espacio en cabeza o inmersión directa, es la misma,
siempre que el volumen de muestra y del espacio de cabeza se mantengan
26
constantes. Esto es debido a que la concentración en el equilibrio es independiente
de dónde se encuentre la fibra, ya sea en el espacio de cabeza o en la muestra. El
modelo matemático que explica la dinámica del proceso de absorción cuando la fibra
se expone al espacio de cabeza se ajusta a la siguiente ecuación:
(ec. 1.7)
n= moles de analito absorbido por la fibra
Vf= volumen de fibra
Vs= volumen de muestra
Vh= volumen de espacio de cabeza
Kfs= coeficiente de partición del analito entre fibra/muestra: Kfs=Cf/Cs
Khs= coeficiente de partición del analito entre muestra/espacio cabeza: Khs=
Ch/Cs
Co= concentración inicial de analito en la muestra
El proceso de MEFS se puede ver afectado por una serie de variables
experimentales que influyen sobre el equilibrio de analito extraído o bien sobre su
desorción. Estas variables pueden ser modificadas para incrementar la eficacia del
proceso de extracción, pero cualquier modificación de las variables o condiciones
experimentales repercute en la cantidad de analito que se determina y, por
supuesto, en la reproducibilidad del análisis
[43]
.Los parámetros que pueden afectar
el proceso de absorción/adsorción en la extracción de los analitos son los siguientes:
tiempo y temperatura de extracción, pH, volumen de la muestra, agitación, y sales
en la muestras (salting out).
En general, los procesos de extracción empiezan con la adsorción de los
analitos en la interfase fibra/matriz. Posteriormente, los analitos difunden dentro del
volumen de la fase extractiva. Si el coeficiente de difusión de los analitos en la fase
extractiva es elevado, la partición de los analitos es completa entre las dos fases y
27
se llega a la absorción. Sin embargo, si el coeficiente de difusión es bajo, el analito
se mantiene en la interfase y tiene lugar la adsorción. La principal ventaja de la
absorción, también llamada partición, es que presenta una isoterma lineal en un
amplio rango de concentraciones y las propiedades de la fibra no cambian
sustancialmente hasta que la cantidad extraída no llega al 1% del peso de la fase
extractiva [41].
Las fibras comerciales se pueden clasificar según el proceso de extracción
que se produzca mayoritariamente bien sea por absorción o adsorción (Fig. 1.9),
entre las que se encuentran: Polidimetilsiloxano (PDMS), poliacrilato (PA),
Carbowax-Divinilbenceno (CW/DVB), Carboxen (CAR) y Divinilbenceno (DVB).
Fig. 1.9. Clasificación de las fibras de MEFS según
si la extracción se produce por absorción o adsorción.
1.9. El Queso: Generalidades
El queso se define como el producto fresco o madurado, en el que la
proporción entre las proteínas de suero y la caseína no sea superior a la de la leche,
obtenido por la coagulación y separación de suero de leche, nata, leche
parcialmente desnatada o por una mezcla de estos productos [46].
La norma COVENIN define al queso como el producto blando, semiduro, duro
o extraduro, madurado o no madurado y que puede estar recubierto, donde la
28
proporción entre las proteínas solubles y la caseína no sea superior a la de la leche,
obtenido mediante coagulación total o parcial de las siguientes materias primas:
leche y /o productos obtenidos de la leche, por efecto del cuajo u otros coagulantes
idóneos, y por escurrimiento parcial del suero que se desprende como consecuencia
de dicha coagulación [30].
1.9.1. Composición química y propiedades físico-químicas de la leche de
cabra
Entre los principales componentes de la leche de cabra se encuentran: agua,
glúcidos, lípidos, sustancias nitrogenadas, sales minerales, vitaminas, ácidos
orgánicos, enzimas, gases y flora microbiana
[48]
. Los valores medios de los
componentes químicos pertenecientes a las leches de las especies más usadas en
la fabricación de quesos (vaca, oveja, cabra) se presentan en la Tabla 1.3.
El componente más abundante de la leche es el agua y en ella se encuentran
en disolución, las sales y los azúcares; las proteínas, en su mayor parte en estado
coloidal, y la materia grasa en emulsión.
El conjunto de los componentes no acuosos y gaseosos de la leche constituye el
extracto seco de la leche (ES). El contenido en extracto seco es uno de los factores
que más influyen en las características de la leche para hacer queso y dentro de él
la materia seca útil (MSU=Grasa+Proteína). Dicho extracto seco varía según la raza,
individuo, periodo de lactancia y la especie del mamífero. Si al extracto seco se le
resta el contenido en grasa de la leche, se obtiene el extracto seco magro o
desengrasado (ESM o ESD), que es un valor más constante y más representativo
[30]
.
29
Tabla 1.3. Composición media de la leche de vaca, oveja y cabra expresada por
100 g de leche [30].
Componentes
Agua
Glúcidos (lactosa)
Lípidos
Sust. Nitrogenadas
*Caseínas
*Proteínas del suero
*Nitrógeno no
proteico
Unidad
Minerales
Na
K
Ca
Mg
P
mg
Fe
Cu
Zn
Las
g
µg
propiedades
Vaca
87,70
4,70
3,60
3,30
2,70
0,42
Oveja
81,69
4,27
7,51
5,62
4,30
1,05
Cabra
87,1
4,60
4,30
3,30
2,47
0,56
0,18
0,27
0,27
50
150
120
12
95
48
121
186
18
127
40
180
130
20
110
0,40
0,22
4,19
0,76
0,31
6,88
0,40
0,50
3,50
la
de
físico-químicas
de
leche
cabra
son
consecuencia de su composición y estructura. Como existen variaciones en cuanto a
la composición química entre las leches de vaca, oveja y cabra, tambien se
observan diferencias en sus propiedades fisico-químicas . En la Tabla 1.4 se puede
apreciar que los valores del índice de refracción, punto de congelación, acidez y
viscosidad son superiores en la leche de oveja. El pH es muy similar en las tres
leches [30].
Tabla 1.4. Propiedades físico-químicas de diferentes leches [30].
Propiedad
Leche de vaca
Leche de
oveja
Densidad a 20 °C (g/mL)
Viscosidad ( mPa.s)
Tensión superficial (N/m)
1,0270-1,0320
1,236
50
1,0340-1,0350
2,936
49,9
1,0260-1,0420
1,186
52
1,3440-1,3485
-0,55
0,15-0,18
6,50-6,70
1,3490
-0,583
0,18-0,22
6,60-6,68
1,3454-1,4548
-0,570
0,16-0,18
6,50-6,80
20
Índice de refracción (N0 )
Temperatura de congelación (°C)
Acidez (% ácido láctico)
pH
Leche de
cabra
30
1.9.1.1. Papel de los diferentes componentes de la leche en la calidad del
Queso
A continuación se presentan los diferentes componentes presentes en la
leche, los cuales son los responsables de la calidad del queso:
•
Agua: favorece el crecimiento microbiano y por lo tanto la maduración; afecta la
textura, el rendimiento e influye en la vida comercial.
•
Grasa: aporta textura, sabor, rendimiento y color de los quesos.
•
Lactosa: influye en el desuerado, textura, sabor y maduración.
•
Caseína: contribuye en el rendimiento, sabor y olor de los quesos.
•
Proteínas del Suero: aporta valor nutritivo y la maduración. Pueden afectar la
coagulación.
•
Minerales: participan en la coagulación, influyen en el desuerado y textura de la
cuajada [47]
1.9.4. Principios para la Elaboración de Quesos
La fabricación del queso tiene como principio la concentración de la caseína y
grasa en un factor de 6 a 12, según la variedad. En la producción tradicional, esta
concentración se consigue por coagulación de la caseína, que forma un gel donde
queda retenida la grasa. Las caseínas son un grupo de proteínas que contienen
fósforo y son específicas de la leche, que se encuentran casi siempre en forma de
micelas y precipitan a un pH de 4,6. Se conocen seis tipos de caseínas: a s1 (alfa s1),
a
s2
(alfa s2), b (beta), g (gamma), k (kappa) y l (lambda). La caseína k tiene
propiedades físico-químicas únicas, si se compara con las otras proteínas de la
leche. Algunas de estas propiedades son: insensibilidad a precipitación por iones
calcio, por lo que se mantiene soluble en soluciones de calcio con concentraciones
que precipitan a todas las demás caseínas; efecto estabilizador sobre las otras
caseínas cuando el calcio está presente en la suspensión; sufren hidrólisis por
quimosina en un enlace peptídico específico, lo que resulta en la desestabilización
31
de las micelas y la formación de precipitados; además, es la única de las caseínas
que contiene residuos de cisteína y glúcidos en su estructura [49].
La caseína aparece en la leche en forma de sal cálcica. La estructura del
caseinato de calcio es bastante compleja. En realidad las caseínas alfa y beta no
son solubles en la leche en presencia del calcio (el grupo fosfato es muy insoluble en
presencia de calcio). Sin embargo si se añade caseína k, el conjunto se solubiliza al
formar una estructura para la que se postula la siguiente forma: Las tres fracciones
se disponen formando submicelas (Fig. 1.10) (caseína dispuesta en forma de balón
de rugby).
Fig. 1.10. Esquema propuesto para la micela del caseinato de calcio en la leche [49].
La caseína se dispone de manera que interacciona por su parte hidrófoba
(hacia dentro de la micela) quedando la parte hidrófila hacia fuera. Normalmente
habrá entre 25 y 30 caseínas por submicela. La caseína k no tiene menos fosfato
pero tiene carácter hidrófilo debido a la presencia de trisacáridos (azúcares de 3
monómeros) y también tienen en el extremo hidrófilo una alta proporción de grupos
carbonilos (grupos ácidos de aminoácidos como el glutámico o el aspártico)
[50]
. Las
submicelas se unen unas con otras y se forman las micelas gracias a la formación
de fosfato cálcico por la presencia de los grupos fosfato y de calcio disuelto en la
leche.
La
caseína puede ser coagulada y precipitada para dar productos como
queso, yogur, cuajada, nata o leche agrias y otros derivados. Los procedimientos
para precipitar la caseína son dos: acidificación que protona los grupos fosfato (y
otros) que solubilizan a la caseína k y por acción de un enzima llamado cuajo animal
32
(rennet) que descompone un pequeño trozo de la caseína k precipitando la micela
completa.
En la precipitación por el uso del cuajo animal se produce una hidrólisis
enzimática de las caseínas. El proceso es más lento ya que la enzima tarda varios
minutos u horas en hacer efecto. En el cuajo se usan enzimas en forma de caldo
(Cynara cardunculus). Esta quimosina es específica de la caseína K y logra romper
la caseína K se rompe en sus dos partes: La hidrófila y la hidrófoba (para-Kcaseína). Como el péptido era la parte hidrófila donde estaban los grupos ácidos,
ahora se pierden y ya no se repelen las micelas, precipitando las caseínas. La parte
hidrófoba al mantener los enlaces fosfatos, forma el coágulo y precipitando el
caseinato. El proceso puede representarse de la siguiente manera [50]:
(ec.1.8)
El gel de la caseína se corta o se rompe y se contrae (sinéresis), para liberar el
lactosuero, que contiene principalmente proteínas solubles, la lactosa y una parte
de los componentes salinos. La sinéresis depende fundamentalmente de la
temperatura, pH, agitación, concentración proteica y de los iones calcio. Durante la
fabricación se establecen estos parámetros a fin de controlar el contenido en
humedad de la cuajada y así de los diferentes futuros quesos [49].
Un tipo de coagulación especialmente extendido en la fabricación de quesos de
cabra es la coagulación mixta (ácida/enzimática) que suele realizarse con
concentraciones elevadas de fermentos lácticos y muy diluidas de cuajo, así como a
temperatura baja (20°C), muy inferior a la óptima de crecimiento de microorganismos
y de la actividad enzimática. El tiempo de obtención de cuajadas por esta vía es muy
largo, de 8 a 22 horas, con poca producción de desuerado. El producto así obtenido
tiene unas características reológicas intermedias entre la cuajada ácida y la
enzimática y se utiliza para la obtención de quesos de pasta blanda [51]. Los procesos
consecutivos a la formación de la cuajada depende del tipo de queso a fabricar, si es
33
un queso de grano fino el proceso de removido y cortado será rápido para evitar un
alto porcentaje de nucleación de la cuajada para luego realizar el moldeado y
prensado, si es un queso de alto grado de maduración los procesos bioquímicos
(proteólisis, lipólisis y glucólisis) tendrán un tiempo de acción más prolongado
(Fig.1.11) [52].
Fig. 1.11. Esquema general de elaboración de queso [52].
1.10. Cambios bioquímicos durante el procesado y maduración del queso de
cabra
Durante la maduración del queso intervienen numerosos fenómenos
bioquímicos (Tabla 1.5) como la glucólisis, lipólisis y proteólisis, esta última
especialmente importante en el queso de cabra, que se traduce en una digestión
enzimática de los constituyentes de la cuajada, reacciones que le confieren
características nuevas modificando su composición, su aspecto y su textura,
desarrollando el sabor y la formación de compuestos aromáticos
se lleva a cabo por la acción enzimática de varios agentes:
[51]
. La maduración
34
•
La quimosina o la enzima coagulante empleada.
•
Las enzimas endo y exocelulares producidas por los microorganismos presentes.
•
Las enzimas propias de la leche [49].
Tabla 1.5. Diferentes procesos en la maduración enzimática del queso fresco [48].
PRÓTEOLISIS
LIPÓLISIS
GLUCÓLISIS
ENZIMAS MICROBIANAS
LIPASAS
BACTERIAS LÁCTICAS
CASEINA
GRASAS
PROTEOSAS PEPTONAS
TRIGLICÉRIDOS
PEPTIDOS
DIGLICÉRIDOS
LACTOSA
ÁCIDO LACTICO
AMINOACIDOS
AMINAS
CETOACIDOS
AMONIACO
ALDEHÍDOS
MONOGLICÉRIDOS
ÀCIDOS GRASOS LIBRES
ÁCIDO PROPIONICO Y
ACETICO
•AROMA CARACTERíSTICOS Y
DEFECTOS
•ASPECTO DE LA PASTA
(OJOS DEL QUESO)
ALCOHOLES
•ABLANDAMIENTO DE LA TEXTURA
•INCREMENTO DEL pH
•CONTRIBUCIÒN AL SABOR
1.10.1. Glucólisis.
La glucólisis es el principal proceso bioquímico en la fabricación de muchas
variedades de quesos, el cual se basa en la fermentación de lactosa residual (≈98%
se pierde en el lactosuero) en ácido láctico, producida por las bacterias lácticas del
fermento añadido o bien por la flora natural de la leche fabricados con leche cruda
[53]
.
Las bacterias ácidos lácticas realizan un proceso homofermentativo,
obteniéndose un 85-95% de ácido láctico y por un proceso heterofermentativo, en el
que se obtiene un 50% de ácido láctico, además de ácido acético, succínico,
35
fórmico, anhídrido carbónico, alcohol etílico, acetona, diacetilo, y otros productos
volátiles. El ácido láctico es la base para los restantes procesos bioquímicos de la
maduración; además el carácter ácido que da al medio inhibe el crecimiento de
determinadas bacterias indeseables y favorece el buen desarrollo de la microflora
importante para la maduración. Los productos resultantes de su crecimiento serán
los responsables en parte de los cambios en la apariencia, textura, olor, gusto y
aroma del queso [53]
1.10.2. Lipólisis
En el queso de cabra
los ácidos grasos libres pueden provenir
de los
presentes en la leche recién ordeñada y/o como consecuencia de la lipólisis
(hidrólisis enzimática de los glicéridos neutros y/o lípidos) que ha podido sufrir la
materia grasa mientras estaba en la leche o posteriormente en el queso. Como
resultado de la hidrólisis de los triglicéridos (glicéridos que más abundan en la grasa
de la leche), se obtendrá por cada molécula de triglicérido una molécula de glicerol y
tres ácidos grasos libres, aumentando así su contenido en ácidos grasos [52].
Los lípidos forman entre el 3,50 a 5,25 % de la leche, variando entre razas de
bovinos y de acuerdo a la nutrición. La grasa se encuentra presente en la leche
como pequeños glóbulos en suspensión en el agua; el tamaño de los glóbulos es
también una característica de la raza (típicamente es 3 µm o 1000 por mililitro). A
medida que la lactancia progresa, el tamaño de los glóbulos de grasa tiende a
decrecer. Cada glóbulo se encuentra rodeado por una capa de fosfolípidos, que
tienden a impedir que se unan entre sí repeliendo a los otros glóbulos y atrayendo
agua. Siempre que esta estructura se mantenga intacta, la grasa de la leche
permanece como una emulsión [48].
Las proporciones de ácidos grasos de diferente longitud determinan el punto
de fusión de la grasa y pueden variar con la alimentación que el animal está
recibiendo. La leche caprina contiene una baja cantidad de ácidos grasos de cadena
36
media (4-10 carbonos). Estos incluyen algunos como ácido butanoico (butírico) y
ácido octanoico (caprílico), que son los responsables de su sabor característico
[48]
.
Los ácidos grasos de cadena larga de la leche son principalmente insaturados
(18 átomos de carbono), siendo el oleico el predominante. Entre los poliinsaturados
están el linoleico y linolénico. Los dos últimos ácidos grasos son componentes
importantes de la leche ya que el cuerpo no puede sintetizarlos y deben provenir de
la dieta. Un porcentaje muy pequeño (menos del 2%) de la grasa se encuentra en la
forma de ácido graso saturado, como el ácido palmítico (cadena de 16 carbonos) [53].
Los agentes responsables de la lipólisis son las lipasas propias de la leche
cruda, las del coagulante (esterasas pregástrica), las bacterias y las de las levaduras
y mohos. La acción de hidrólisis de estas enzimas suele producirse de modo
selectivo y escalonado, por ejemplo, la lipasa de la leche actúa preferentemente
sobre los ácidos grasos que ocupan las posiciones 1 y 3 de la molécula de glicerol
de los triglicéridos. Esto lleva a que se formen diglicéridos 1,2 y 2,3, los cuales
también
sufren
la
lipólisis
y
se
formarán
monoglicéridos;
se
obtendrán
predominantemente acilgliceridos [54].
El papel principal de la lipólisis, aun en los quesos en que ésta es pequeña,
es el de formar compuestos (ácidos grasos y sus productos derivados) que
contribuyan a formar el conjunto olfato-gustativo, siendo los ácidos grasos de
cadena corta (hasta 12 átomos de carbono), los de más influencia [53].
1.10.3. Proteólisis.
La proteólisis, proceso mediante el cual la caseína se hidroliza a compuestos
de menor peso molecular como péptidos y aminoácidos libres, es uno de los
fenómenos más importantes que tienen lugar durante la maduración de muchos
tipos de quesos, pues contribuye tanto a la textura como al aroma y sabor del
producto terminado.
37
Los fenómenos proteolíticos pueden dividirse en proteólisis primaria y
secundaria. La proteólisis primaria corresponde a la hidrólisis de las caseínas,
liberando péptidos de distintos tamaños. Como resultado de la acción del cuajo
(quimosina y pepsina) de las proteasas nativas de la leche (plasmina) y en menor
medida de las proteasas de las bacterias lácticas del fermento. La proteólisis
secundaria convierte estos péptidos en aminoácidos libres, y estos sirven de
substrato para la producción de otras sustancias sápidas como aminas, tioles y
tioésteres. Los microorganismos del queso son los principales responsables de la
proteólisis secundaria, tanto bacterias lácticas como mohos y levaduras [54]. Entre las
aminas formadas, podemos encontrar: putrescina, cadaverina, histamina, taurina,
asparagina, glutamina y triptamina.
En la proteólisis también se originan compuestos responsables de
características sensoriales no deseadas como aminoácidos que imparten amargor,
cuyo nivel puede superar el umbral de percepción sensorial del gusto amargo.
Dichos aminoácidos son: Leucina, Glicocola, Leucina, Tirosina, Alanina, Triptófano,
Fenilalanina, Lisina, Arginina, Valina y Prolina [55].
La proteólisis influye en la textura del queso debido a la rotura de la malla
proteica, al incremento de pH por formación de NH3 y a la mayor capacidad de
retener agua por los grupos aminos y carboxilos formados. La formación de péptidos
de pequeño tamaño molecular y aminoácidos influye directamente en el sabor
básico (dulce, ácido, amargo y salado) del queso. Además, los aminoácidos son
precursores de otros compuestos responsables del aroma
[54]
.
1.11. Producción de la leche caprina en Venezuela
Se estima que la población caprina en América es de 39 millones de cabezas,
de las cuales el 57% está localizado en América Latina. Venezuela tiene una
población estimada de 1.320.00 caprinos (FAO, 2005), constituyéndose en el cuarto
país de América Latina en población de estos animales. Esto probablemente se
38
debe a que los sistemas de producción caprina se adaptan bien a las zonas de vida
áridas y semiáridas, por lo cual tienen un nicho ecológico natural abundante en
Venezuela. En el país existe una superficie de 41.023 km2 de estos ecosistemas, lo
cual representa el 4,75 % del territorio nacional, enmarcado básicamente en los
estados Lara, Falcón, y Zulia, pero con la característica principal de que el 94 % de
las explotaciones son del tipo extensivo – tradicionales, con producciones de leche
muy bajas, básicamente para el autoconsumo [52].
Estos sistemas de producción se caracterizan por la utilización de cabras
principalmente del tipo Criollo, ausencia de prácticas racionales de manejo de los
rebaños, con pastoreo en vegetación natural, muy baja productividad de los rebaños,
de 200 a 250 g de leche por día, en lactancias que no sobrepasan 100 días, propios
de la zona semiáridas
[52]
. Sin embargo, aunque la mayoría de las explotaciones de
caprinos en Venezuela son de tipo extensivo, esta especie tiene un gran potencial
productivo y social en la población, ya que aparte de poder utilizar ecosistemas no
útiles para otras especies domésticas, tiene la posibilidad de tener un mayor número
de animales por unidad de área que otras especies, un corto intervalo generacional y
una elevada prolificidad, además del valor agregado de los productos derivados
(principalmente queso) y adicionalmente la leche de cabra es mucho más digerible
para los pacientes que no toleran la leche de vaca por alergias a sus proteínas o el
tamaño de sus glóbulos de grasa
[56]
, todo lo cual hace que la explotación de esta
especie sea altamente rentable y sus productos derivados sean muy apreciados.
La
producción cuantitativa y cualitativa de leche de cabra
depende de
muchos factores. Estos factores pueden ser agrupados en intrínsecos del animal
(genética, raza, nivel de producción, estado de lactancia, estado fisiológico) y
extrínsecos (estación, temperatura, prácticas de manejo, sistema de ordeño,
alimentación, estado de salud, duración del periodo seco) [52].
39
1.11.1. Estado de lactancia de la cabra
El estado de la lactancia de un animal es el tiempo que dura la producción de
leche después del parto, determina diferentes niveles productivos caracterizados en
tres fases. Estas fases son independientes del genotipo animal, sin embargo,
factores básicamente de manejo, alimentación y/o sanidad pueden incidir
negativamente sobre la ocurrencia de la misma en su forma característica, y éstos
afectarán indudablemente la producción total de la leche de la cabra
[57]
Las fases
señaladas anteriormente son:
Ascenso: es la primera etapa después del parto, se caracteriza por un incremento
progresivo en el nivel productivo (kg leche/día), el cual se debe a la conjunción de
algunos factores, tales como: aumento en el número de células alveolares,
descongestionamiento de la glándula mamaria y reducción del edema preparto.
Factores como la condición corporal al parto, el ordeño a fondo y la alimentación
pueden modificar significativamente los cambios durante esta fase. La adecuada
condición corporal permite que el animal utilice sus propias reservas alimenticias
para promover la síntesis láctea, debido a que la transformación de los nutrientes
que vienen por vía de los alimentos es más lenta de lo que el animal requiere.
Cúspide o nivel máximo: es una fase muy breve donde la producción se encuentra
estabilizada en su nivel máximo. Esta fase es consecuencia y dependiente de la
anterior. La alimentación es quizá el factor de manejo más importante en ella debido
a su influencia sobre la disponibilidad de nutrientes para la síntesis láctea,
especialmente energía.
Descenso o declive: comprende la disminución progresiva de la producción de
leche, hasta hacerse prácticamente cero, en esta fase el contenido graso en la leche
aumenta ya que la cabra se comienza a preparar para el periodo seco y un futuro
parto e iniciar luego un nuevo período de producción láctea.
40
La lactancia no sólo es variable en cuanto al nivel de producción de leche que
se produce sino en cuanto a los componentes que conforman la leche en cada fase.
La variación en los componentes de la leche depende de la naturaleza del mismo, ya
que cada uno se comporta de forma diferente. El contenido de grasa es el que más
varía, se ha observado que a mayor nivel de producción de leche menor es el
contenido de grasa y viceversa. La fracción proteica exhibe un comportamiento
similar al de la grasa pero menos acentuado [59].
A medida que aumenta la lactancia, aumenta el contenido porcentual de
grasa, proteína, caseína, minerales, sólidos totales, sólidos no grasos, sodio, calcio,
fósforo, magnesio y acidez titulable, mientras que el contenido de lactosa, potasio y
citrato disminuyen significativamente como se observa en Tabla 1.6 [58].
Al final de la etapa de producción de leche se requiere un tiempo mínimo de
descanso para las cabras (periodo seco) de 45-50 días entre lactancia, para obtener
una óptima producción de leche en el
próximo periodo de producción. Se han
reportado que periodos muy cortos o muy largos reducen la producción de leche en
la lactancia subsiguiente [59].
Se necesita un promedio de 34 días
de periodo seco, o de descanso
productivo, para que el tejido glandular de la ubre sufra un proceso de involución y
posterior regeneración de un nuevo tejido mamario que garantice una próxima
lactancia adecuada. Un mayor número de días secos (> 60 días) también determina
reducción de la producción de la próxima lactancia, pues hay degeneración del
sistema de conductos [60].
41
Tabla 1.6. Efecto del estado de lactancia sobre la composición de la leche en
42 cabras de la raza Alpina [58].
S e m a n a s d e l a c ta n c ia
C o m p o s i c ió n e n la le c h e
8 -1 2
1 7 -2 1
2 6 -3 0
3 5 -3 8
3 9 -4 2
G ra s a (% )
3 ,3 4
2 ,9 3
3 ,1 5
4,10
4,58
P ro te ín a (% )
2 ,7 9
2 ,9 5
3 ,3 2
3,91
4,25
C aseína ( % )
2 ,1 1
2 ,1 7
2 ,4 0
2,87
3,15
L a c to s a (% )
4 ,4 6
4 ,4 2
4 ,3 5
4,08
3,96
M in e ra le s (% )
0 ,7 2
0 ,7 8
0 ,8 0
0,82
0,84
S ó lid o s t o ta le s (% )
11,17
10,98
1 1 ,5 4
12 ,7 8
1 3 ,4 7
S ó lid o s n o g ra s o s (% )
7 ,8 3
8 ,0 5
8 ,3 9
8,68
8,89
pH
6 ,5 8
6 ,6 1
6 ,5 7
6,54
6,52
A c id e z tit u la b le
16,60
16,30
1 6 ,6 5
17 ,3 8
1 7 ,4 4
D e n s id a d
1,031
1,030
1,030
1 ,0 2 8
1,027
N a (m g /1 0 0 g )
50,20
52,20
5 4 ,0 0
54 ,7 5
5 5 ,5 0
K (m g / 1 0 0 g )
1 7 0 ,4 0
166,00
155,20
1 4 6 ,7 5
1 44 ,5 0
Na / K
0 ,2 9
0 ,3 1
0 ,3 5
0,37
0,39
C a (m g /1 0 0 g )
1 3 4 ,5 1
135,80
139,75
1 4 5 ,4 0
1 49 ,5 0
P (m g / 1 0 0 g )
99,44
104,20
112,40
1 1 7 ,2 5
1 21 ,5 0
Ca / P
1 ,3 6
1 ,3 0
1 ,2 4
1,24
1,23
M g ( m g /1 00 g)
12,85
13,08
1 3 ,5 0
14 ,3 0
1 4 ,8 7
C itra to (m g /1 0 0 g )
1 4 5 ,4 2
114,50
9 9 ,6 4
88 ,2 3
8 1 ,1 7
En Venezuela existe un número creciente de rebaños que son manejados de
manera tecnificada. Estos están conformados principalmente por animales mestizos
obtenidos de los cruzamientos de las razas Alpina Francés, Nubia, Saanen y
Toggenburg con Criollo
[64]
y más recientemente por animales mestizos de la raza
Canaria obtenidos de la utilización de machos principalmente del tipo Majorero
introducidos al país por un grupo de productores de origen español en cruzamiento
con la base mestiza existente. Como lo señalan Dickson y colaboradores
[64]
, los
resultados preliminares de este mestizaje han sido bastante halagadores, hecho que
les ha otorgado una gran popularidad para la producción quesera, con un promedio
de duración de lactancia de 192,4±37,7 días [64].
42
1.12. Compuestos responsables del aroma y sabor en los quesos de cabra.
A los componentes particularmente responsables del aroma característicos de
un alimento se les denomina compuesto de impacto (caracter impact compound), y
de acuerdo con la presencia de estas sustancias claves, se distinguen cuatro grupos
[19]
:
•
Grupo I: el aroma es debido de modo decisivo a un solo compuesto. La presencia de
otras sustancias aromáticas sólo sirve para matizar el aroma característico que se
percibe del alimento.
•
Grupo II: varios compuestos, de los cuales uno juega un papel principal. Crean o
determinan el aroma típico del alimento.
•
Grupo III: el aroma sólo puede reproducirse con gran fidelidad gracias a un gran
número de compuestos. Ordinariamente no está descrito ningún compuesto de
impacto.
•
Grupo IV: el aroma del alimento no se puede reproducir fielmente, ni utilizando gran
número de compuestos volátiles.
El estudio de los compuestos volátiles responsables del aroma en los
alimentos ha tenido una
importante atención en los últimos años por su
representatividad de la calidad de los productos. Mas de 600 compuestos volátiles
han sido identificados en quesos
[55]
, sin embargo solo una pequeña fracción de
estos compuestos es reportada en la literatura como responsables del aroma y
sabor de estos productos.
Las familias de compuestos químicos reportados en la literatura como
responsables de los aromas en los quesos están conformadas por compuestos
neutros, alcalinos y ácidos. Entre estos compuestos se tiene:
43
1.12.1. Compuestos Neutros
1.12.1.1. Alcoholes.
Se han propuesto diferentes vías metabólicas en la biosíntesis de los alcoholes
presentes en los quesos: metabolismos de la lactosa y amino ácidos, reducción de
metil cetonas y la degradación de los ácidos linoleico y linolénico [66].
Los ácidos linoleico y linolénico son los precursores de compuestos de aroma
de ocho carbonos, produciendo el 3-octen-1-ol, el cual es el alcohol más
comúnmente encontrado en muchos tipos de quesos como compuesto de impacto.
En los quesos de cabra españoles se ha identificado el feniletanol y el 3octen-1-ol con aromas a rosas y champiñones respectivamente como compuestos
importantes característicos para este tipo de queso [67].
1.12.1.2. Aldehídos.
Los aldehídos se originan de los aminoácidos y ácidos grasos, aunque son
compuestos transitorios en los quesos ya que son rápidamente reducidos a
alcoholes primarios u oxidados a sus correspondientes ácidos.
Los aldehídos de cadenas lineales, tales como n-butanal, n-pentanal, nhexanal y n-nonanal son compuestos comúnmente considerados en el aroma de los
quesos y
presentan olores característicos a grama y herbáceos pero si las
concentraciones presentes exceden sus umbrales, pueden afectar la calidad
aromática produciendo olores desagradables [67].
44
1.12.1.3. Cetonas.
Las cetonas son constituyentes comunes de muchos productos derivados de
leche. A causa de sus típicos aromas y bajo umbral de percepción, las cetonas y
especialmente las metil cetonas, son conocidas principalmente por su contribución al
aroma de los quesos madurados. La síntesis de estos compuestos está relacionada
a la actividad enzimática presente en la maduración. Entre los microorganismos
identificados como productores de cetonas en los procesos de proteólisis se tienen
al Penicillium roqueforti, Penicillium caseicolum y Geotrichum candidum [50].
Los aromas a frutas, flores y moho son asociados a metil cetonas tales como;
2-octanona, 2-nonanona, 2-decanona y 2-undecanona y una de las más importantes
dicetonas es la 2,3-butanodiona (diacetilo), ya que este compuesto volátil es muy
apreciado por su aroma característico a mantequilla [67].
1.12.1.4. Ésteres.
Los ésteres son los compuestos volátiles más comúnmente encontrados en
los quesos. Su producción es atribuida a las reacciones de esterificación entre
ácidos grasos de cadenas cortas y medianas y alcoholes primarios y secundarios
derivados de la fermentación de la lactosa o del catabolismo de aminoácidos [69].
La mayoría de los ésteres encontrados en queso presentan notas aromáticas
a frutas, caramelos y flores. Especialmente los etil ésteres son conocidos por su
importante rol en la formación del carácter frutal en quesos.
En los quesos de cabra españoles se han reportado el hexanoato de etilo y el
butirato de etilo como ésteres que originan aromas a moho y a manzanas [70].
45
1.12.1.5. Lactonas.
La hidrólisis de los triglicéridos seguido por una ciclación es la
vía de
formación que se ha propuesto para la formación de lactonas en los quesos.
Las lactonas están generalmente asociadas con descriptores de aroma tales
como coco, albaricoque, melocotón, siendo la δ-decalactona una de las más
importantes reportadas en quesos.
En quesos de cabra españoles se han reportado las δ-octalactona y δdodecalactona, como responsables de aromas a frutas, queso y coco [70].
1.12.1.6. Furanos.
Los furanos están presentes en muchas frutas y alimentos procesados y son
conocidos por sus fuertes sabores y olores, y a causa esta propiedad son
sintetizados a escala industrial y son ampliamente usados como saborizantes en
alimentos y bebidas. Sin embargo, se conoce muy poco sobre estos compuestos en
el sabor y olor del queso. Entre los furanos reportados con una fuerte influencia en el
aroma del queso se encuentra el 4-hidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-furanona (furaneol) y 5etil-4-hidroxi-2-metil-3(2H)-furanona (homofuraneol), con aromas a caramelo, azúcar
y ahumado [67].
1.12.2. Compuestos Alcalinos
1.12.2.1. Pirazinas.
Las pirazinas han sido reportadas como importantes compuestos que
contribuyen al sabor y aroma en los quesos. Una vía de formación, es a partir de los
46
aminoácidos
presentes.
Entre
estos
compuestos
se
destacan
2-etil-3,5-
dimetilpirazina, 2-isopropil-3-metoxipirazina y 2,3-dietil-5-metilpirazina, con aromas a
tierra, suelo, papas fritas y moho [71].
1.12.2.2. Compuestos azufrados.
Los compuestos azufrados esencialmente se originan de la degradación de la
metionina (aminoácido). Estos compuestos son responsables de los fuertes aromas
a queso madurado y ajo.
El 3-metiltiopropanal (metional) es el compuesto más común reportado en
quesos, el cual aporta aroma a papas cocidas [67].
1.12.2.3. Terpenos
Los terpenos son compuestos característicos de quesos que se producen a
partir de un proceso artesanal. Estos compuestos provienen del pasto que consume
el animal, siendo transferido luego a la leche y finalmente al queso, por lo que son
importantes marcadores para determinar el origen geográfico del tipo de queso
fabricado. Entre los terpenos frecuentemente identificados se encuentra el α-pineno
y el linalool, que aportan aromas a madera y pino [72]
1.12.3. Compuestos Acídicos
1.12.3.1. Compuestos fenólicos.
Estos compuestos son producidos por la acción de levaduras sobre la tirosina
(aminoácidos). Entre los más importantes reportados se encuentran el 4-metilanisol,
2-metoxifenol (guayacol) y 4-metilfenol (p-cresol), los cuales aportan a la calidad
47
sensorial de los quesos notas de aromas a moho, queso, especias, ahumado,
vainilla, medicinal y mantequilloso [67].
1.12.3.2. Ácidos grasos libres (AGL).
Los ácidos grasos libres son muy importantes en el sabor y aroma de los
quesos, ya que son predominantes en su composición. Estos compuestos no solo
aportan aromas por sí mismos, sino que también son precursores de metil cetonas,
alcoholes, lactonas y ésteres [66].
En general las cadenas largas de ácidos grasos (> 12 átomos de carbonos)
juegan un rol minoritario en el aroma y sabor, ya que poseen un alto umbral de
percepción. Las cadenas más cortas de 4 a 12 carbonos poseen umbrales más
bajos y son los que contribuyen más a los aromas característicos de estos
compuestos.
Desde el punto de vista sensorial, los ácidos nonanoico,
4-etiloctanoico,
hexanoico (caproico), octanoico (caprílico), decanoico (cáprico), y butírico son los
principales contribuyentes al aroma y sabor en quesos de cabra europeos, los
cuales aportan el aroma característico de la piel de las cabras
[67] [73]
.
1.13. Importancia de los AGL en queso de cabra.
Los quesos fabricados de leche de cabra son muy apreciados por sus
particulares características organolépticas. La lipólisis juega un rol esencial en las
propiedades sensoriales de los quesos, algunos ácidos grasos libres (AGL) han
demostrado contribuir directamente al aroma de muchos tipos de quesos, o
indirectamente como precursores de otros compuestos de aroma. Los ácidos grasos
hexanoico, octanoico y decanoico han sido considerados responsables del aroma
característico del queso de cabra, dando lugar a sus nombres más conocidos como
48
lo son, ácidos caproico, caprílico y cáprico, respectivamente. Adicionalmente, ciertos
ácidos grasos libres no lineales contribuyen por sí mismos al sabor y aroma cabral
del queso [74] [75] [76].
En el queso de cabra, el aroma es el principal atributo sensorial evaluado para
su calidad comercial, y los compuestos responsables de su olor característico son
atribuidos a los AGL. En un estudio realizado por Condurso y colaboradores en 2008
[99]
, se cuantificaron mediante adición de estándar los AGL presentes en queso de
cabra, fabricado de manera artesanal en un periodo de almacenaje de 0 a 21 días a
4°C, para evaluar la variación en sus en el tiempo (Tabla 1.7) y determinar su
influencia en la aceptación comercial. No se encontraron diferencias significativas de
las concentraciones de los AGL entre los días 0 al 15 y no hubo rechazo al ser
evaluado sensorialmente, pero el queso fue rechazado en el estudio de calidad en el
día 21, ya que se obtuvieron valores de concentraciones superiores a las
determinadas anteriormente, concluyendo que el queso de cabra estudiado presenta
un máximo de 15 días de vida útil.
Tabla 1.7. Variación en la concentración de AGL (mg/100g) en muestras
de queso de cabra almacenados a 4°C[99].
Días de almacenamiento
AG L
0
7
15
21
Ácético
32,5 a
37,3a
35,6 a
44,2b
Butanoico
18,1 a
22,5a
17,6 a
39,1b
Hexanoico
9,6a
9,8 a
9,7a
12,5b
Octanoico
17,8 a
15,9a
16,5 a
29,4b
Decanoico
13,0 a
13,2a
13,7 a
25,2b
Decenoico
7,8a
9,8 a
7,3a
12,9b
Dodecanoico
10,7 a
14,4a
9,0a
41,7b
Tetradecanoico
8,8a
7,4 a
11,2 a
29,5b
Total
118,3
130,3
120,6
234,5
El análisis fue realizado por triplicado. Diferentes letras en una fila indican diferencias
significativas en las concentraciones (p<0,05); AGL=ácidos grasos libres
49
La determinación de los AGL en quesos son usados como marcadores en los
análisis de caracterización de sus perfiles aromáticos y su variabilidad en el tiempo,
comparación de quesos artesanales e industriales
[77]
[73]
, asignación de origen
y un
parámetro importante de estudio enfocado a la vida útil de dicho producto.
1.14. Extracción de compuestos de aromas en quesos
En general la percepción del aroma de los quesos es uno de los principales
criterios para la aceptación y preferencia por parte de los consumidores. Los aromas
típicos de estos productos resultan del balance de una mezcla compleja de
componentes químicos (ácidos, cetonas, alcoholes, etc.) presentes en una correcta
proporción. Sin embargo con el tiempo, este balance cambia y en consecuencia el
olor también.
Para la caracterización del aroma de los quesos se ha reportado el uso de
varios métodos de extracción de los compuestos volátiles, tales como; extracción
con solventes, destilación al vacío y análisis de espacio en cabeza (headspace)
mediante microextracción en fase sólida (MEFS). Esta última es la técnica más
simple y sensible [79].
En el análisis de espacio en cabeza con MEFS, la selección del tipo de fibra
es determinante para una extracción exitosa de los compuestos de aroma. Lecanu y
colaboradores realizaron un estudio en queso madurado (concha negra)
[79]
, donde
se comparó la efectividad de cuatro fibras en el análisis de una solución modelo
formada por ocho compuestos responsables del aroma del queso en estudio. Se
analizó el área generada por cada fibra en las señales cromatográficas por CG-FID
(Fig. 1.12), y la fibra que resultó más eficiente fue la recubierta con CAR/PDMS 75
µm.
50
Compuestos de Aromas
A=dimetil sulfuro, B=acetona, C=butanona, D=dimetil disulfuro, E=3-metil-butanol,
F=2-hidroxipropanona, G= dimetil trisulfuro, H=ácido 3-metilbutanoico
Fig. 1.12. Extracción de compuestos de aroma en una solución modelo por
MEFS con diferentes fibras [79]
En la Tabla 1.8 se muestra un resumen realizado sobre diferentes tipos de
fibras reportadas en la literatura para el análisis de compuestos de aromas en
quesos. Las fibras compuestas por CAR-PDMS 75 µm y por DVB-CAR-PDMS 50:30
µm de espesor resultaron ser las más sensibles para el análisis de volátiles en las
diferentes muestras de quesos tratadas. Esto se atribuye a su amplia distribución en
el tamaño de poros (macro, meso y microporos) que le confiere el Carboxen (CAR),
la cual combinada con PDMS y DVB incrementan la extracción de moléculas con
pequeños pesos moleculares, característico de los compuestos de aroma para este
tipo de productos lácteos [80].
51
Tabla 1.8. Diferentes tipos de fibras para el análisis de compuestos de aromas en
quesos.
Fibra
Objetivo del estudio
Muestras
Referencias
PDMS 100 µm,
PDMS-DVB 65 µm,
PA 85 µm,
*CAR-PDMS 75 µm,
CW-DVB 65 µm,
DVB-CAR-PDMS
StableFlex 50 µm.
Determinación de
compuestos de aroma
y comparación de
fibras
Queso de Oveja
“Terrincho” de
Portugal
80
76
PDMS 100 µm
PA 100 µm,
CAR-PDMS 75 µm,
CW-DVB 70 µm,
*DVB-CAR-PDMS 50:30
µm
Determinación de
compuestos de aroma
y comparación de
fibras
Queso de Cabra
Siciliano de Italia
CAR-PDMS 75 µm
Caracterización de
compuestos de aroma
Quesos Cheddar,
Azul, Parmesano,
Pecorino y Grana
Pedano de Australia
Diferencia en volátiles
de quesos artesanales
e industriales
“Piacentinu”
CW-DVB 65 µm,
PA 85 µm,
*CAR-PDMS 75 µm,
CW-DVB 65 µm,
Análisis de volátiles en
quesos tratados con
enzimas modificadas
81
Queso de Oveja
de Italia
77
Queso Cheddar
Frances
67
*Fibras seleccionadas por los autores con mejor respuesta en el análisis en base a sensibilidad.
La cromatografía de gases acoplada a la olfatometría permite evaluar la
contribución da cada compuesto volátil en el aroma global, lo que ha hecho que
dicha técnica se utilice ampliamente en estudio relacionados con el aroma de los
alimentos[39]. Aunque una serie de compuestos activos de olor han sido identificados
y reportados en la literatura mediante la técnica de CG-O para diferentes tipos de
quesos, en general para estos productos se encuentran reportados varios
compuestos en común (Tabla 1.9)
52
Tabla 1.9. Compuestos comunes encontrados en diferentes tipos de queso
(cheddar, pecorino, azul, parmesano, cabra) [82].
Compuesto
Descriptor de olor
2,4-nonadienal
Floral, grasa
4-heptenal
Aceite, grasa
1-nonen-3-ona
Champiñones
1-octanol
Champiñones, metálico
2,3-butanediona
Mantequilla, crema de leche
2-heptanona
Canela, especias, frutal
2-nonanona
Floral, verde
2-undecanona
Floral rosas, frutal cítrico
3-metil-butanal
Malta, verde
Acetaldehído
Pungente
Ácido acético
Vinagre, pungente
Ácido butírico
Queso, ácido, rancio
Diacetilo
Mantequilla
Dimetil sulfuro
Azufre
Butanoato de etilo
Frutal, piña, cambur
Caproato de etilo
Pastel de frutas, piña, cambur
Heptanal
Nuez, grasa, aceite, mantequilla
Hexanal
Verde, herbal
Homofuraneol
Dulce, caramelo
Indol
Fecal, mohoso
Ácido isovalérico
Rancio, queso, fecal, sudor, pútrido
Metional
Papas cocidas
Nonanal
Floral, verde
Ácido propiónico
Rancio, pungente
Decalactona
Coco, melocotón
53
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. UBICACIÓN DE LA ZONA DE ELABORACIÓN DEL QUESO DE CABRA
Los muestreos de los quesos de cabra se realizaron en una granja comercial
de nombre “Quesos Doña Elida”, ubicada en el sector El Sanchero, Parroquia
Aguedo Felipe Alvarado, Municipio Iribarren, Estado Lara, Venezuela, dedicada a la
ganadería caprina y la producción de quesos artesanales, con cuatro rebaños de
animales mestizos cuyas razas predominantes son Canaria y Saanen. Esta zona
posee un clima caliente semiárido con una temperatura anual promedio entre 20 y
30°C, con precipitaciones medias anuales de 464 mm, siendo los meses más
húmedos abril, mayo, junio y julio, y los meses más secos diciembre, enero, febrero
y marzo. Está conformado básicamente por un valle intramontañoso con pendientes
entre el 2 y 5% y en la zona pie de cerro con pendientes del 6 al 25 % [83].
2.2. MUESTRAS DE QUESO
Las muestras de queso se adquirieron en tres fechas diferentes de
elaboración, de acuerdo a las tres fases de lactancia en la que se encontraban las
cabras, las cuales fueron: La muestra 1 correspondiente al inicio o ascenso de la
curva de lactancia, elaborada en
marzo (04/03/09), la muestra 2 asignada al
máximo de la curva, elaborada en junio (17/06/09) y la tercera muestra de la etapa
final o descenso de la curva se adquirió en septiembre (9/09/09).
En cada muestreo se tomaron 3 kg de queso, que fueron trasladados bajo
refrigeración en una cava con hielo del sitio de origen hasta el laboratorio en bolsas
plásticas herméticas. Allí se cortaron en piezas de 200±1 g y se guardaron al vacío
54
en bolsas FoodSaverTM usando un equipo Oster FoodSaverTM. Estas fueron
catalogadas por su fecha de elaboración y almacenadas a -5 ºC hasta su uso.
2.3. CARACTERÍSTICAS DE LAS CABRAS
Las cabras fueron mestizas del cruce entre cabras criollas del Estado Falcón
y cabras españolas de raza Canarias. El rebaño que se utilizó para la elaboración de
quesos estuvo constituido por: 20 cabras para las cuales fue su primer parto y con
un peso promedio de 58-60 Kg, y 60 cabras para las cuales fue su segundo parto,
con un peso promedio de 65-70 Kg.
Estas cabras fueron suplementadas con 1,3 kg/animal/día de un alimento
concentrado comercial a base de maíz (Procría® 18%), 1 kg/animal/día de heno y 1
kg/80animales/día de minerales lecheros de un concentrado comercial (Bayer®),
suministrados en comederos comunes. La cantidad de agua que consumían fue de
400 L/80animales/día.
2.4. FABRICACIÓN DEL QUESO DE CABRA USADO EN EL PROYECTO
A continuación se describen las etapas de elaboración del queso de cabra
usado en la unidad de producción de la granja Quesos Doña Elida:
2.4.1. Ordeño y recepción: esta etapa se inicia en horas de la mañana (6-8 am): El
productor lavaba sus manos y la ubre del animal para luego realizar un ordeño de
cada pezón para verificar si la leche estaba en buen estado (evidenciado por la
presencia de grumos en la leche o cambio de color hacia rosado o marrón). En caso
positivo se ordeñaba en envases plásticos de 5 litros que finalmente eran
trasladados al lugar donde se elaboraba el queso.
2.4.2. Filtrado: se eliminaban residuos sólidos que pudieran provenir del proceso
de ordeño mediante el uso de tela de liencillo.
55
2.4.3. Higienización: se calentaba la leche cerca de los 40 ºC por un tiempo
máximo de 15 minutos.
2.4.4. Salado: se realizaba junto con el proceso de higienización, y se agrega en
una relación de 150 gramos de sal por 40 litros de leche.
2.4.5. Coagulación: la cuajada se obtuvó al añadir el cuajo natural (preparado
enzimático proveniente del estómago de cabritos) a la leche previamente calentada
en la etapa higienización. La relación fue aproximadamente 10 mL de cuajo por litro
de leche.
2.4.6. Desuerado y corte de cuajada: El desuerado se realizaba amasando con las
manos la cuajada producida en el proceso de coagulación durante aproximadamente
10 min. para obtener pequeños trozos de cuajada que luego eran cortadas con
cuchillos de acero inoxidable.
2.4.7. Moldeado y prensado: se usaban moldes de plástico con perforaciones, que
facilitan el desuerado y se colocaban pesas de metal sobre la cuajada durante 2
horas con una relación de peso de 3 a 4 veces superior a la masa de queso a
producir.
2.5. REACTIVOS Y EQUIPOS
2.5.1. Reactivos
Los compuestos de aroma usados (Tabla 2.1) para el entrenamiento del
panel, para la identificación y la cuantificación fueron suministrados por los
Laboratorios Docentes y de Investigación de Química Orgánica de la Universidad
Simón Bolívar y por la empresa Flavors Concentrados C.A de Venezuela.
56
Tabla 2.1. Reactivos usados en el proyecto
Compuesto
Número
Marca
Pureza (%)
Riedel-de Haen
99,8
Ungerer and Company
98
CAS
Etanol
64-17-5
Propianoato de etilo
105-37-3
Butanoato de etilo
105-54-4
Hexanoato de etilo
123-66-0
Octanoato de etilo
106-32-1
Decanoato de etilo
110-38-3
Dodecanoato de etilo
106-33-2
Acetato de isoamilo
123-92-2
Merck
98
Vainillina
121-33-5
Sigma- Aldrich
98
Benzaldehído
100-52-7
Riedel-de Haen
97
Isoamilalcohol
123-51-3
Merck
98
p-Anisaldehído
123-11-5
Merck
98
Furfural
98-01-1
Merck
98
Iso-Butiraldehído
78-84-2
Merck
98
2-Butanona
78-93-3
Merck
99
Geraniol
106-24-1
Sigma- Aldrich
99
Alfa-pineno
80-56-8
Sigma- Aldrich
99
Ácido butanoico
107-92-6
Ácido hexanoico
142-62-1
Ungerer and Company
98
Ácido octanoico
124-07-2
Ácido decanocio
334-48-5
2.5.2. Materiales
Los materiales usados para la microextracción en fase sólida de los volátiles
en las muestras de queso de cabra fueron:
• Fibras (Supelco); CAR/PDMS 75 µm y DVB/CAR/PDMS 30/50 µm
• Insertos de vdrio para MEFS de 0,75 mm de diámetro interno para el puerto
de inyección (Supelco)
•
Viales de 20 mL para headspace (Perkin Elmer)
57
• Microjeringa de 10 µL (Hamilton ±0,1µL)
• Tapas de aluminio con sellos de teflón- silicona de 9 mm de diámetro para
viales de headspace (Supelco)
• Helio, hidrogeno, aire presurizados grado UAP (AGA).
2.5.3. Equipos de laboratorio
• Balanza analítica (apreciación 0,0001g), marca PioneerTM Ohaus Corporation.
• Congelador freezer/coder H400, marca Electrolux
• Baño de agua termostatizado (apreciación ± 0,1 ºC) marca PRECISION
• Estufa (apreciación ± 1 ºC) marca PRECISION
• Cronómetro (apreciación ± 0,01 segundo) marca Athletic Works WR 100ft
• Equipo para vacío marca Oster FoodSaverTM
2.5.4. Sistema de cromatografía de gases – detector ionización de llama (CGFID).
Los análisis se realizaron en un equipo de cromatografía de gases Hewlett
Packard modelo 5890 serie II con un detector FID y como gas portador se usó helio
A.P, con el inyector en modo splitless con un tiempo de apertura de válvula de
0,7min, y una presión de entrada de 10 psi. Se utilizaron dos columnas
cromatográficas, las cuales fueron HP-5® (5% fenil metil Silicona) capilar de sílica
fundida de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm espesor de la película y Carbowax®
(Quadrex) de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm espesor de la película.
El programa de calentamiento para la columna HP-5 se inició con
una
temperatura de 30 °C, durante 3min con un incremento de 4 °C/min hasta 120 °C
mantenidos durante 5min y finalmente un segundo incremento de 15 °C/min hasta
300 °C mantenido durante 5min.
58
El programa de calentamiento para la columna Carbowax se inició con una
temperatura de 60 °C durante 5min, con un incremento de 4 °C/min hasta 120 °C
mantenidos durante 5min y finalmente un segundo incremento de 15 °C/min hasta
200 °C mantenido durante 20min.
El análisis de los cromatogramas para la identificación de las señales se
realizó a partir de los índices de Kovats determinados con una serie de n-alcanos
(C6-C44). Como los análisis cromatográficos se realizaron con programación de la
temperatura del horno, la ecuación del cálculo de IR usada fue:
 t −t
s
I x = 100 N + 100 n R , x R , N
t
 R ,( N + n ) − t R , N

 (ec. 2.1)


s
Ix = índice de retención para el componente “x” en la fase estacionaria “s”.
N = número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del analito.
n = diferencia en número de átomos de carbono de los n-alcanos entre los que se encuentra el
componente.
tRx, tRN, tR(N+n) = tiempos de retención del componente x, y los n-alcanos entre los que eluye este
componente.
2.5.5. Sistema de cromatografía de gases - espectrometría de masas (CG-EM).
Los análisis se realizaron en un equipo de cromatografía de gases Agilent
Technologies 7890A acoplado a un detector selectivo de masas 5975C, en la opción
de ionización por impacto electrónico (70 eV) y como gas portador se uso helio
U.A.P, con el inyector en modo splitless con un tiempo de apertura de válvula de
0,7min, con una presión de entrada de 12 psi.
Se uso la columna Carbowax (Quadrex) de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm
espesor de la película con el mismo programa de calentamiento usada en los
análisis usadas en el equipo de CG-FID. La señales de los cromatogramas fueron
identificadas a través de los índices de Kovats y sus espectros de masa con ayuda
del algoritmo de comparación de espectros con la base de datos del software, NIST98
59
2.5.6. Sistema de cromatografía de gases-olfatometría
Los análisis se realizaron en un equipo de cromatografía de gases Shimadzu
modelo 14 A (Fig. 2.1). La columna para la separación fue una Carbowax (Quadrex)
de 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm espesor de la película, con helio A.P como gas
portador con un flujo de 30 mL/min y un flujo de aire del gas humidificador de 30
mL/min (44). El programa de calentamiento se inicio con una temperatura de 60 ºC
durante 6 minutos seguido por una rampa de calentamiento de 6 ºC/min hasta
alcanzar una temperatura final de 170 ºC, la cual se mantuvo durante 2 min.
Fig. 2.1. Equipo de CG-O. (1) humidificador, (2) detector olfatométrico y/o puerto de
olor, (3) teclado para el registro de la señal.
Para el sistema de registro de señal se usó un mini teclado Targos modelo
PAUK 10U conectado al computador ViewSonic E70, procesador Intel Pentium III
868 MHz, 256 MB de RAM, con Windows XP Professional versión 2002 como
sistema operativo. El programa de detección y registro de la señal olfatométrica para
realización del proyecto fue diseñado con el programa LabView 8.5, el cual traduce
la señal analógica a digital
del pulso emitido, generando una señal periódica
cuadrada positiva por un periodo de tiempo en el cual se mantiene el pulso (Fig.
2.2). Mediante el uso de algoritmos del programa mencionado para la adquisición de
60
datos, se determinó el tiempo (min) inicial y final de la señal olfatométrica
correspondiente a los tiempos en el que el panelista comenzaba y dejaba de
detectar el aroma, registrando simultáneamente el tiempo (s) de duración del atributo
sensorial evaluado (tDS) (Fig. 2.3).
Fig. 2.2. Generación de la señal olfatométrica obtenida con el programa LabView
8.5.
Fig. 2.3. Características de la señal con el detector olfatométrico
2.6. MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS
2.6.1. Preparación de las muestras de queso y muestreo por microextracción
en fase sólida (MEFS)
El queso mantenido en refrigeración se llevó a temperatura ambiente antes de
su uso y se removieron todos los bordes (aprox. 0,5 cm) por posibles pérdidas de
volátiles de esta zona más expuesta al ambiente.
61
El procedimiento consistió en colocar las muestras de queso en un vial de 20
mL sellando con un septum de teflón-silicona, luego se dejó reposar (durante 20
min) para que se estableciera el equilibrio entre la muestra y el espacio en cabeza a
una temperatura dada, la cual inicialmente fue temperatura ambiente.
Se evaluaron cada uno de los siguientes parámetros en forma univarido, para
seleccionar la mejor combinación.
• Cantidad de muestra de queso: 1,2, y 3 g.
• Tiempo de exposición de la fibra para la extracción: 30, 60, 90 min.
• Temperatura de muestreo: 25, 35 y 45 ºC.
Para la extracción se usó la fibras de tres fases (DVB/CAR/PDMS 30/50 µm) y
cada combinación de parámetros se evaluó por triplicado en el equipo de CGFID, con la columna de Carbowax®.
Los parámetros seleccionados se analizaron al comparación del área
obtenida de los compuestos bajo cada condición de análisis, seleccionando aquella
combinación con la cual se obtuvo mayor señal en la extracción de los analitos.
2.6.2. Obtención del panel entrenado
Para disponer de un panel entrenado se cumplieron etapas recomendadas
por varios autores [82] [83] [84], las cuales se describen a continuación:
2.6.2.1. Reclutamiento de panelistas
Se realizó una encuesta a la comunidad del Departamento de Procesos
Biológicos y Bioquímicos (empleados, estudiantes y profesores) de la Universidad
Simón Bolívar, empleando un cuestionario diseñadas para tal fin (Apéndice 1.1). En
base a la información recaudada en el cuestionario, las características más
62
importantes para decidir la participación de los candidatos a panelistas fueron:
interés en participar en las actividades de entrenamiento, disponibilidad y estado de
salud [84].
2.6.2.2. Selección de panelistas
De acuerdo con los resultados obtenidos en el cuestionario de reclutamiento,
y considerando principalmente la motivación y disponibilidad de tiempo, se realizó la
preselección del grupo conformado por 10 personas. Se realizó una reunión de
carácter informativo y motivacional, en la cual se explicaron los objetivos, la
importancia de este estudio y las consideraciones fundamentales para pertenecer a
un panel evaluador en alimentos [81].
El panel quedó conformado por 2 mujeres y 4 hombres (entre 27-40 años) y
se identificaron con códigos de una letra y dos dígitos, con la finalidad de no revelar
sus nombres y evitar sentimientos de desmotivación en caso de que sus resultados
no presentaran un buen desempeño. A su vez, considerando los resultados
individuales, la líder del panel (mi persona) dedicó más tiempo en realizar
repeticiones y explicaciones de la metodología en caso de que los jueces lo
requirieran. Las pruebas aplicadas para el entrenamiento se indican a continuación:
2.6.2.2.1. Identificación de aromas
Se presentaron 15 muestras de alimentos
[84]
, condimentos o esencias en
envases tapados a fin de concentrar los compuestos volátiles y no dejar ver a los
panelistas el contenido en cada frasco. Se les pidió abrir huecos (4-6) al momento
de oler y describir el aroma percibido sin ver la muestra presente, y como agente
neutralizante se uso café en granos, el cual se les pidió usar antes y después de oler
cada muestra (Apéndice 1.2).
63
Las muestras se seleccionaron de acuerdo a aromas lácteos y fueron: leche
condensada, ajo en polvo, queso parmesano, salsa de soya, café instantáneo en
polvo, vinagre, mostaza, nata de leche, vainilla, sirope de chocolate, adobo, mezcla
de chicha, queso cheddar, canela en polvo y yogurt natural. Para evaluar esta
prueba se calificó con 1 punto los aciertos en muestras correctamente identificadas y
con ½ punto a las asociaciones y se calculó el porcentaje de aciertos en la
identificación de aroma por panelista y del grupo total.
2.6.2.2.2. Determinación de umbrales de detección e identificación de aromas
Se presentó un grupo de soluciones en concentraciones crecientes de acetato
de isoamilo (ISO 5496:2006 (E)) con la finalidad de determinar la mínima
concentración en la que cada panelista era capaz de detectar e identificar el aroma
del mencionado compuesto. Las soluciones se presentaron en el siguiente orden de
concentración (ppm):
0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 50
Se les pidió abrir los frascos uno a uno con la boca cerrada para evitar la
detección del aroma vía retronasal
[85]
, y una vez que la decisión hubiera sido
tomada, se debía cerrar el frasco y responder en la planilla de evaluación (Apéndice
1.3). No hay una metodología estricta que plantee que los panelistas huelan todos
los frascos en un intervalo determinado de tiempo y en la misma forma, por ejemplo
en inhalaciones cortas, respiración profunda, etc.
La determinación se realizó por triplicado y en días diferentes, con la finalidad
de evitar fatiga y saturación de los receptores olfativos.
2.6.2.2.3. Desarrollo del vocabulario del panel
Para el desarrollo del vocabulario a usar en la descripción de los aromas
percibidos en los análisis olfatométricos, se presentó un total de 13 soluciones de
64
diferentes compuestos (ISO5496:2006 (E)) (Tabla 2.2) preparados con la
concentración promedio de identificación arrojada por el panel en la prueba de
umbral. Se usaron 20 mL de cada patrón en tubos de 40 mL de ensayos con tapas,
y café en granos como agente neutralizante de los aromas. Para esta prueba se
aplicaron 3 metodologías en la detección de los aromas, las cuales fueron:
a- Detección directa de las soluciones: se les indicó abrir los frascos uno a
uno con la boca cerrada y describir el aroma percibido, realizando máximo
3 repeticiones y describir en la planilla suministrada (Apéndice 1.4).
b- Detección con tiras olfativas: se les indicó abrir los frascos uno a uno con
la boca cerrada, sumergir las tiras olfativas de papel de filtro poroso (10
cm de largo x 1 cm de ancho), airear durante unos segundos, oler el
papel y describir el aroma percibido, realizando un máximo 2 repeticiones.
c- Detección del espacio en cabeza de los patrones: se equilibraron durante
20 min las soluciones patrones en los tubos de ensayos con tapa, luego se
extrajo el contenido de las soluciones para dejar solo la fase de vapor del
compuesto y se les indicó abrir los frascos para rápidamente detectar y
describir el olor percibido en una sola medida. Esta última metodología se
realizó para entrenar la rapidez en el momento de describir, simulando la
detección en el equipo de olfatometría.
Todas las metodologías para el desarrollo de vocabulario se realizaron por
triplicado y cuando fue necesario se discutieron individualmente con los
panelistas los descriptores de los aromas percibidos.
65
Tabla 2.2. Compuestos usados para el desarrollo de vocabulario del panel en la
detección de aromas.
Compuesto
Aroma
Acetato de isoamilo
Vainillina
Benzaldehído
Alcohol isoamílico
p-Anisaldehído
Furfural
Iso-Butiraldehído
2-Butanona
Geraniol
Alfa-pineno
Esencia de naranja
Esencia de limón
Esencia de frambuesa
Cambur
Vainilla, caramelo
Almendra, azúcar quemada, papelón
Whisky, malta, cebada, tostado
Menta, caramelo
Pan dulce, almendra, caramelo
Malta, verde, pungente
Éter, solventes
Pino, madera, verde
Monte, madera dulce
Fruta cítrica, naranja
Fruta cítrica, limón, limonada
Fresa, frambuesa, tutti fruti
2.6.3. Representatividad del aroma en CG-O
Este análisis tuvo la finalidad de validar sensorialmente la extracción del
espacio en cabeza de las muestras de queso realizadas con las 2 fibras utilizadas
(CAR/PDMS y DVB/CAR/PDMS).
Para esta prueba, el CG-O fue provisto de una columna de 70 cm de longitud
y sin fase estacionaria, teniendo de esta manera condición de resolución nula. Se
usó helio A.P como gas portador con un flujo de 30mL/min y un flujo de aire
humidificador el puerto de olor de 25 mL/min. La temperatura del inyector fue 250 ºC,
la de la interfase fue 200ºC y el horno se mantuvo a 50ºC. Una muestra de 2 g de
queso de cabra fue llevada a temperatura ambiente durante 20 min en el vial para
headspace herméticamente cerrado, en el que se expuso la fibra durante 30 min
para la extracción. Luego se realizó la desorción en el inyector durante 2 min.
El panel inicialmente olió directamente muestras de quesos tratadas de igual
manera que las extraídas con las fibras en los viales para headspace y luego
detectaron el aroma eluido en el CG-O. Se les pidió comparar los dos aromas
66
percibidos y para ello se usó una escala no estructurada de 15 cm de largo: la
izquierda de la escala se asignó como ninguna igualdad y a la derecha como total
igualdad (Apéndice 1.5).
El procedimiento fue realizado por duplicado para los 6 panelistas, en días
diferentes.
2.6.4. Preparación de soluciones estándares de ésteres lineales y su uso para
la determinación de índices de retención
La serie de ésteres lineales para realizar la posible identificación de los
compuestos responsables del aroma del queso de cabra estudiados por la técnica
de CG-O fueron: propianoato de etilo, butanoato de etilo, hexanoato de etilo,
octanoato de etilo, decanoato de etilo y dodecanoato de etilo. Para ello se
prepararon 250 mL de una solución patrón de 1000 ppm (m/v) en etanol, a partir de
la cual se realizaron diluciones de 5, 10 y 20 ppm para el entrenamiento y
determinación de los tiempos de retención por parte del panel en los análisis
olfatométricos.
La serie de ésteres se analizó en el equipo CG-FID y CG-O con la
metodología expuesta en la sección 2.5.6 para estudiar si había una buena
identificación de las zonas de aromas obtenidas de los ésteres mediante CG-O y los
tiempos de retención obtenidos mediante CG-FID a partir de los índices de Kovats
determinados con la serie de n-alcanos C6-C44. Luego el resultado sería extrapolado
para identificar las zonas de aromas obtenidas del análisis de los quesos.
2.6.4.1. Entrenamiento del panel en la detección de los ésteres lineales por
olfatometría
Se utilizaron los patrones de ésteres en tres concentraciones: 5, 10 y 20 ppm
(m/v), para el entrenamiento del panel y la determinación de las zonas de aromas.
67
Con cada panelista y para cada patrón, se realizó una corrida para que el
panelista se familiarizara con los aromas característicos de cada compuesto y así
discutir el vocabulario a usar en los descriptores de cada zona de aroma detectada.
Posteriormente se realizaron 2 corridas con el patrón donde hubo mejor detección
por panelista para obtener sus frecuencias de detección (FD) y los tiempos de
retención. Este último permitió determinar los índices de retención de las zonas de
aromas de los análisis de los quesos para su posible identificación. El total de
corridas para el entrenamiento del panel fue de 12 y para el análisis olfatométrico
definitivo del patrón de ésteres también fueron 12 corridas.
2.6.5. Análisis olfatométrico
Las muestras de quesos fueron tratadas para su extracción y análisis según
los parámetros de análisis establecidos en el procedimiento de selección de
condiciones del método de extracción (2.6.1) y las condiciones para el programa de
calentamiento fue el expuesto en el apartado 2.5.6.
Con cada panelista y para cada muestra de queso, se realizaron dos corridas
de entrenamiento para familiarizarse con los aromas de las muestras y discutir el
vocabulario a usar en los descriptores de cada zona de aroma detectada.
Posteriormente se realizaron 2 corridas por panelista con cada muestra de queso
(las tres etapas de la curva de lactancia) para obtener las zonas de aromas y sus
frecuencias de detección (FD). El total de corridas para el análisis olfatométrico de
cada muestra de queso fue de 24. Se tomó una FD > 6 para ser considerada una
zona de aroma de impacto al aroma del queso. Para su posible identificación se
emplearon los índices de retención calculados con la serie de ésteres lineales
(2.6.4).
68
2.6.7. Análisis de los ácidos grasos libres (AGL)
Se realizaron las mediciones de áreas de los AGL mediante CG-FID para su
cuantificación por el método de patrón externo bajo las condiciones ya
seleccionadas. Los AGL cuantificados fueron ácido butanoico, hexanoico, octanoico
y decanoico.
2.6.7.1. Linealidad de las señales cromatográficas los AGL y curva de
calibración
Se realizaron curvas de calibración en el intervalo lineal para cada AGL de 0-500
ppm (m/v), mediante patrones preparados en etanol para obtener el rango lineal del
método para cada compuesto. Para ello se colocaron 2 mL de cada solución
(volumen seleccionado) en un vial sellado de 20 mL y se analizaron bajo las mismas
condiciones inicialmente seleccionadas en la extracción de la muestras de quesos.
Se utilizaron 5 patrones de los AGL con concentraciones seleccionadas en el
rango lineal determinado para uno, con un mínimo de 3 réplicas. Se graficaron las
áreas obtenidas en función de las concentraciones para luego determinar el la
ecuación de la recta y el coeficiente de correlación (R) y por el método de mínimos
cuadrados.
Para seleccionar el volumen para los patrones, se usaron volúmenes de 1, 2, 3 y
4 mL con el patrón de menor concentración (10 ppm) y se selecciono el que arrojó
mayor área de la señal cromatográfica.
69
2.6.7.2. Limite de detección y cuantificación
El límite de detección (LD) y el límite de cuantificación (LC) se calcularon a partir
de datos obtenidos de las curvas de calibración de cada compuesto (Fig. 2.4),
mediante las relaciones con las siguientes ecuaciones [86]:
LD = yBn=3 + 3SB
LC = yB(n=3) + 10SB
(ec. 2.1)
(ec. 2.2)
y= medidas del blanco usado
SB= Desviación estándar del blanco
Los valores de yB y SB se obtuvieron experimentalmente de las curvas de
regresión lineal para la calibración. Un supuesto fundamental del método de los
mínimos cuadrados sin ponderar es que cada punto en la representación gráfica
(incluido el que representa al blanco o ruido de fondo) tiene una variación distribuida
normalmente (solo en la dirección de y) con una desviación estándar estimada Sy/x,
por lo tanto es apropiado utilizar Sy/x en lugar de SB en la estimación del límite de
detección. El valor de a, la ordenada en el origen calculada, se utilizó para la
estimación de yB [86].
Fig. 2.4. Gráfico modelo de curva de calibración usado para determinar LD y LC.
70
2.6.8.
Análisis estadístico
Se realizó el análisis estadístico de los AGL cuantificados y los aromagramas
obtenidos de los quesos elaborados en las tres fases de lactancia, mediante el
programa de STATISTICA® Versión 6, aplicando Multidimensional Scaling (MDS)
para obtener la correlación en las medidas, con un nivel de STRESS < 0,5.
Para el tratamiento estadístico de usó las áreas de los AGL obtenidas por CGFID de las tres muestras de queso analizadas por microextracción en fase sólida y
en el caso de los aromagramas se utilizó el número de zonas de aromas que
tuvieran un n>6 mediante el método de frecuencia de detección clasificadas en
grupos de familias de aromas.
El MDS es una familia de procedimientos las cuales permite la exploración de
tendencias y la futura transformación de la matriz de datos a representaciones
gráficas de 2 o 3 dimensiones. Los datos que se pueden utilizar con esta
metodología deben presentarse en forma de disimilaridades. El primer tipo de matriz
indica que tan diferentes son cada par de observaciones entre sí. En general estos
coeficientes de disimilaridades están relacionados de manera inversa con los
coeficientes de similaridad. Existen una serie de medidas de similaridad (ó
disimilaridad) sin embargo, la más popular y conocida es la distancia Euclidiana [110].
El método clásico de MDS consiste en la reducción de dimensionalidad de
una matriz de puntos basada en la disimilaridad existente entre las observaciones
que conforman dicha matriz. La matriz de disimilaridades es convertida en una
matriz de distancias euclidianas a la cual se le va a someter a un procedimiento de
reducción, resultando un espacio de dimensión reducida que realiza una exacta
representación del espacio original[110]. El Stress, nombre dado por Kruskal (1964) a
la varianza residual normalizada, es la medida de la bondad de ajuste de la
configuración obtenida con respecto a la configuración original.
71
CAPÍTULO III
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS
VOLÁTILES EN EL QUESO DE CABRA. RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
3.1. Selección de las condiciones más adecuadas de extracción y análisis de
los compuestos volátiles en las muestras de queso de cabra por MEFS-CGFID.
La primera etapa llevada a cabo en este proyecto de investigación fue plantear un
método analítico que presentara una serie de ventajas respecto a los utilizados
clásicamente, por lo cual se seleccionó la microextracción en fase sólida como la técnica a
aplicar. Esta cual ha sido muy usada para la determinación del perfil volátil en productos
lácteos variados como quesos, yogurt, leche, entre otros. Esta técnica es rápida, simple y
con capacidad discriminativa, cualidad indispensable para detectar cualquier modificación de
la calidad del queso evaluado. La evaluación de los parámetros analíticos adecuados para
obtener la mayor sensibilidad de la técnica en la extracción de los compuestos volátiles se
realizó de manera separada, obteniendo los efectos individuales para cada variable [87].
3.1.1. Selección de la fibra para MEFS
Inicialmente se seleccionó la fibra a usar para la extracción de los compuestos
volátiles en el espacio en cabeza de las muestras de quesos de cabra, para ello se usó las
condiciones iníciales de análisis para la extracción (1 g de queso, 20 min de equilibrio, 30
min de muestreo y 25 °C como temperatura de muestreo ). Se estableció como guía de
72
escogencia la fibra que aislara el mayor número de volátiles y abundancia (porcentaje del
área). En la Figura 3.1 se reproducen los cromatogramas obtenidos para cada una de las
fibras evaluadas mediante CG-FID y una columna DB-5®.
Fig. 3.1. Comparación de cromatogramas de gases de los volátiles aislados del queso de
cabra con las fibras DVB/CAR/PDMS (a) y PDMS/CAR (b).
Al comparar los cromatogramas obtenidos con las dos fibras evaluadas se observó
una mayor afinidad de los compuestos volátiles presentes en el queso de cabra con la fibra
DVB/CAR/PDMS. Este resultado es coherente con la literatura que indica que por lo general
las fibras compuestas con múltiples fases facilita la eficacia de la extracción. En esta fibra,
una primera capa de PDMS/CAR se cubre con una segunda capa de PDMS/DVB, donde las
73
moléculas pequeñas con mayores coeficientes de difusión llegan a la capa interior más
rápido y son adsorbidas por la fase de Carboxen (CAR) y las moléculas más pesadas son
retenidas en la capa exterior de DVB. Esta configuración facilita también la desorción
[88]
. En
estudios previos realizados con quesos de diferentes variedades reportaron la fibra de 3
fases como la más eficiente para el estudio por MEFS, atribuyéndolo principalmente a la alta
polaridad de los analitos [71] [89].
Adicionalmente para la selección de la fibra, se evalúo el % de
representatividad del aroma del queso de cabra con la técnica olfatométrica, donde
también se obtuvo un mejor valor de representatividad con la fibra de 3 fases,
resultado que se expondrá en la sección 4.2.
3.1.2.
Desempeño
de
las
diferentes
fases
estacionarias
de
las
columnas
cromatográficas
El segundo parámetro a seleccionar fue la escogencia de las columnas
cromatográfica, usando como criterios, la elución de los compuestos en un tiempo
razonable de análisis y una buena resolución de los picos cromatográficos,
importante para una posterior identificación de los compuestos mediante la inyección
de
patrones, y su cuantificación. La columna constituye la parte esencial
del
sistema cromatográfico y de la que depende en gran parte el éxito del análisis. En
ella está contenida la fase estacionaria, que determina la selectividad y la eficacia de
las separaciones.
En la Fig. 3.2 se observa el perfil cromatográfico volátil obtenido mediante
MEFS de queso de cabra con columnas de fases de diferentes polaridades.
74
Fig. 3.2. Cromatogramas del queso de cabra obtenidos mediante MEFS y analizados en
una columna de DB-5 (a) y Carbowax (b).
La columna con la cual se obtuvo una mejor resolución de las señales
cromatográficas en el análisis de los volátiles del queso de cabra fue Carbowax, lo que
permitió inferir que los compuestos presentes en las muestras de quesos analizadas
probablemente eran de características polares.
Los picos cromatográficos fueron asimétricos en la elución de los compuestos en la
columna DB-5, observándose una sobrecarga de las señales como consecuencia de una
mayor retención de los compuestos por la columna, lo cual origino señales anchas, y debido
a la insuficiente resolución no era posible medir las áreas o altura de las señales.
En estudios previos de compuestos volátiles en quesos, se ha reportado la columna
Carbowax como la ideal para los análisis cualitativos y cuantitativos, ya que esta matriz se
caracteriza por presentar compuestos polares y de bajos pesos moleculares
[71]
. Los
resultados del presente trabajo corrobora que la columna Carbowax® posee la fase
estacionaria adecuada para este tipo de muestra, sin embargo se utilizaron ambas columnas
para los análisis de los volátiles en el queso, ya que hubo una buena identificación mediante
los índices de Kovats obtenidos con la columna DB-5® y para la cuantificación de los AGL,
75
la selección de los parámetros de extracción de los volátiles y los análisis olfatométricos se
usó la Carbowax®.
3.1.3. Cantidad de muestra de queso
Una vez seleccionada la fibra y las columnas, se procedió a variar la cantidad de
muestra de queso para la extracción, se comenzó con 1g y los parámetros restantes
permanecieron constantes (20 min de equilibrio, 30 min de muestreo y 25 °C como
temperatura de muestreo) y se aumento la cantidad de muestra hasta 3 g.
En la figura 3.3 se observa el efecto de aumentar la cantidad de muestra de queso
de cabra sobre la sumatoria del área total de sus picos cromatográficos. Para las tres
cantidades usadas no se observó diferencias significativas mediante el análisis de varianza
(P<0,05), sin embargo al evaluar la señales cromatográficas individuales se obtuvo una
mayor área para algunos picos cuando se usó 2 g, siendo esté la cantidad seleccionada
para la extracción.
Fig. 3.3. Selección de la cantidad de muestra de queso en el muestreo por MEFS
Al aumentar la cantidad de muestra la concentración de los compuestos volátiles
debió aumentar en el espacio en cabeza y en consecuencia reflejarse en un aumento en el
área de las señales cromatográficas obtenidas, sin embargo esto no se evidencio, por lo que
la fibra pudo encontrarse saturada.
76
3.1.4. Tiempo de extracción
En el análisis de los compuestos volátiles en el queso de cabra se trató de asegurar
la eficiencia del proceso de extracción usando el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio
entre la matriz de la muestra y la fibra. Para la optimización de esta variable, se estudió la
eficiencia de extracción (representada por las áreas de las señales cromatográficas) de los
analitos a distintos tiempos de extracción, los cuales fueron 30, 60 y 90 min y se mantuvo
constante los otros parámetros (2 g de muestra, 20 min de equilibrio, y 25 °C como
temperatura de muestreo) En la Fig. 3.4 se observa que no hubo diferencias significativas
(P<0,05) en las áreas de las señales para los 3 tiempos, por lo que se tomó el menor tiempo
para los análisis por MEFS.
Fig. 3.4. Optimización del tiempo de muestreo por MEFS para las muestras de queso de
cabra.
Cuando se analiza la fracción volátil y semivolátil de un alimento, los tipos de
compuestos que se extraen con la técnica MEFS son muy diferentes por pertenecer a
diversas familias como alcoholes, ésteres, cetonas, entre otros, causando que se necesiten
tiempos muy variables para alcanzar el equilibrio. Para algunos compuestos el tiempo
necesario para llegar al punto de equilibrio es muy elevado, mientras que para otros es
corto. Generalmente, en estos casos se fija un tiempo de extracción de compromiso. Se
suele optar por seleccionar tiempos de extracción inferiores para no alargar el tiempo de
análisis, con lo cual para algunos analitos se trabajará en condiciones de no equilibrio [44], sin
77
embargo esto no se observó al no encontrar diferencias, por lo que este resultado puede
afirmar que la fibra en la extracción de los volátiles se encontraba saturada.
3.1.5. Temperatura de extracción
La temperatura juega un papel fundamental en el proceso de extracción de los
volátiles, ya que ésta influye en las tasas de transferencia de masa y en los coeficientes de
partición de los analitos. Se evaluaron tres temperaturas (Fig. 3.5) para obtener la mayor
eficiencia en la extracción de los compuestos presentes en el queso de cabra. Se inició con
la temperatura ambiente del laboratorio donde se realizaron los análisis (25 °C) y se fue
aumentando hasta un máximo de 45 y los parámetros restantes se mantuvieron constantes
(2 g de muestra, 20 min de equilibrio y 30 min de muestreo). Se obtuvó un incremento en la
eficiencia del proceso al aumentar las temperaturas, reflejada en mayores áreas de los picos
cromatográficos, aunque las mayores señales correspondieron a 45 °C. Se escogió la
temperatura de 35 °C ya que a partir de 45 °C se observó que las muestras de queso de
cabra presentaban una variación en el color (amarillo) y en la textura, lo que implica que
pudieron ocurrir reacciones químicas que alteraran los compuestos de aroma.
Fig. 3.5. Optimización de las temperaturas de muestreo por MEFS del queso de cabra.
La temperatura fue el parámetro más crítico en seleccionar ya que se buscaba una
alta sensibilidad en la extracción pero que no cambiara las características de la matriz del
queso de cabra y afectara la fracción volátil a estudiar. Se sabe que la temperatura puede
78
afectar los compuestos que se encuentran originalmente en la materia prima, pudiendo
desaparecer, modificarse o bien pueden aparecer nuevas moléculas, afectando el aroma
original del alimento [90].
El aroma que se percibe de un alimento depende del equilibrio entre los diferentes
compuestos volátiles, de su concentración y también de la matriz. La naturaleza química de
los compuestos aromáticos y la composición y estructura de los productos alimenticios son
las principales características que influyen en la transferencia entre las diferentes fases del
alimento (acuosa, sólida y vapor) y su liberación. Así la variación de temperatura afecta la
distribución de los compuestos de aromas en las diferentes fases y se puede ver reflejada
en el cambio de textura de la matriz del alimento
[91]
. Es por esta razón que no se usó
temperatura mayor a 35 °C en los análisis de las muestras de queso de cabra por MEFS.
3.2. Identificación de los compuestos de la fracción volátil de los quesos de cabra
mediante MEFS y CG-EM recolectados en la producción de curva de lactancia
3.2.1. Compuestos identificados mediante la separación en columna DB-5
La identificación de los compuestos se determinó mediante la comparación e
interpretación de los espectros de masas y la comparación de los índices de Kovats con los
reportados en la librería de la Nist -98.
En el análisis de la muestra número 1 de queso, recolectada al inicio de la curva de
lactancia se identificaron un total de 13 compuestos (Tabla 3.1). Los compuestos
mayoritarios fueron los alcoholes, los cuales poseen aromas herbáceos, frutales y
alcoholados dulces. En la muestra número 2, recolectada a mitad de la curva de lactancia,
se identificaron un total de 15 compuestos (Tabla 3.2), permaneciendo como
mayoritarios
compuestos
los alcoholes. Para la muestra número 3 se identificaron un total de 18
compuestos (Tabla 3.3).
79
Tabla 3.1. Compuestos identificados para la muestra de queso recolectada al inicio de la
curva de lactancia (MQ1) mediante MEFS-CG-EM en una columna DB-5
Número
compuestos
Compuesto
Iones
principales
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
isobutanol
3-hidroxi-2-butanona
3-metil-butanol
2-metil-butanol
2-heptanona
ácido hexanoico
hexanoato de etilo
2-etil-hexanol
butanoato de isoamilo
acetofenona
nonanal
ácido octanoico
octanoato de etilo
43, 55, 74
43,45,58,88
43,45,58,88
41,57,70,88
43,58,71,114
41,60,73,116
43,60,88,99,144
41,57,130
43,51,71,158
77,105,120
41,57,70,98
41,60,73,85
57,88,101,172
Índice de Kovats
Teórico Experimental
619
720
742
744
889
999
999
1031
1062
1066
1102
1188
1193
616
724
742
745
888
996
999
1031
1058
1064
1102
1179
1197
negrita=pico base
Tabla 3.2. Compuestos identificados para la muestra de queso recolectada a la mitad de la
curva de lactancia (MQ2) mediante MEFS-CG-EM en una columna DB-5.
Número
compuestos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
negrita=pico base
Compuesto
3-hidroxi-2-butanona
3-metil-butanol
2,3-butanodiol
butanoato de etilo
3-metil-ácido butanoico
hexanol
2-heptanona
2-heptanol
benzaldehído
ácido hexanoico
hexanoato de etilo
octanol
nonanal
ácido octanoico
octanoato de etilo
Iones
principales
43, 45, 58,88
31, 42, 55, 70, 88
32, 45, 57, 90
43, 60, 71, 88, 116
41,60, 87, 102
43, 56, 69, 102
43, 58, 71, 114
45, 55, 70, 83, 116
51, 77, 105, 106
41, 60, 73, 116
43, 60, 88, 99, 144
41, 56, 70, 84, 130
41, 57, 70, 98, 142
41, 60, 73, 85, 144
57, 88, 101, 172
Índice de Kovats
Teórico Experimental
720
722
742
738
782
758
799
802
848
856
867
869
889
890
906
900
958
959
999
996
999
999
1069
1073
1102
1102
1188
1180
1193
1197
80
Tabla 3.3. Compuestos identificados para la muestra de queso recolectada al final de la
curva de lactancia (MQ3) mediante MEFS-CG-EM en una columna DB-5.
Número
compuestos
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Compuesto
3-hidroxi-2-butanona
3-metil-butanol
pentanol
2,3-butanodiol
butanoato de etilo
furfuril alcohol
hexanol
acetato de isoamil
2-heptanona
hexanoato de etilo
limoneno
octanol
butanoato de pentilo
heptanoato de etilo
nonanal
pentanoato de pentilo
octanoato de etilo
decanal
Iones
Índice de Kovats
principales
Teórico Experimental
43,45,58,88
720
716
31,42,55,70,88
742
741
32,42,55,70,88
761
762
32,45,57,90
782
787
43,60,71,88,116
799
803
41,53,81,98
850
862
43,56,69,102
869
874
43,55,70,87,130
876
881
43,58,71,114
889
891
43,60,88,99,144
999
999
68,79,93,136
1028
1029
41,56,70,84,130
1069
1069
43,55,71,89,158
1094
1094
43,60,88,113,158
1099
1098
41,57,70,98,142
1102
1103
41,57,70,85,113
1183
1181
57,88,101,172
1193
1197
43,57,70,82,156
1207
1202
negrita=pico base
A diferencia de las dos primeras muestras de queso los compuestos mayoritarios en
la etapa final de producción fueron los pertenecientes a la familia de los ésteres, los cuales
aportan características a caramelos.
3.2.2. Análisis mediante la columna Carbowax.
Las muestras de queso también fueron evaluadas en una columna Carbowax® para
identificar y corroborar las señales de los AGL, ya que no fueron identificados
satisfactoriamente mediante su elución en la columna DB-5, debido a que no hubo buena
resolución de la serie de n-alcanos usados para el cálculo de los índices de kovats.
81
Como se observa en la Tabla 3.4, los cuatro AGL evaluados están presentes en las
tres muestras de quesos, resultado que se obtuvo mediante la coelución con los
compuestos puros.
Tabla 3.4. Los ácidos grasos libres (AGL) identificados mediante los compuestos puros en
las tres muestras de queso mediante MEFS-CG-EM en una columna Carbowax.
Compuesto
ácido butanoico
ácido hexanoico
ácido octanoico
ácido decanoico
Iones principales
41, 60, 73,88
41, 60, 73,116
41, 60, 73, 85,144
60, 73, 87, 129,172
MQ1
21,817
28,518
31,099
33,610
Tr (min.)
MQ2
21,810
28,541
31,105
33,610
MQ3
21,787
28,517
31,093
33,604
negrita=pico base
Los compuestos identificados en las muestras de quesos de cabra analizados ya han
sido reportados en la literatura anteriormente y pertenecen a las siguientes familias de
compuestos:
Alcoholes
Las muestras de quesos 1 y 2 presentaron como mayor número de compuestos los
pertenecientes a la familia de los alcoholes, los cuales son importantes en la contribución al
aroma de los quesos, particularmente los de alta maduración, desarrollando los aromas
característicos a dulce y frutales. Se han reportado alcoholes primarios y secundarios como
compuestos importantes para el desarrollo de los aromas en los quesos Parmigiano,
Roquefort y Cheddar
[99]
, en los que se encuentra el 2-etil-hexanol. Estos alcoholes pueden
ser producidos por la reducción de metil cetonas y acción de bacterias ácido lácticas como
Lactococci, las cuales producen alcohol de la lactosa, y adicionalmente por el catabolismo
de aminoácidos. Los metil alcoholes en el queso de cabra se han reportado como derivados
de las cadenas ramificadas de los aminoácidos leucina, isoleucina y valina, y contribuyen a
los aromas frutales que este presenta [100].
82
Ésteres
Los ésteres son compuestos que se caracterizan por contribuir al aroma de los
alimentos con notas frutales y florales y pueden llegar a ser importantes para minimizar
olores desagradables por la presencia de altas concentraciones de ácidos grasos libres y
aminas
[95]
. Estos compuestos fueron los segundos más abundantes identificados en el
espacio de cabeza en las muestras de queso de cabra, siendo mayoritarios en la muestra
número tres. El hexanoato y octanoato de etilo han sido reportados como compuestos
importantes para el aroma de los quesos y son producidos principalmente por reacciones
enzimáticas o reacciones químicas de los ácidos grasos con los alcoholes primarios [101] y la
concentración del alcohol es usualmente el factor limitante, aunque también se pueden
formar por la transesterificación de los glicéridos [102].
Cetonas
Las cetonas también son de gran importancia en el aroma de los quesos con alto
grado de maduración como el queso azul, y son de bajo impacto para quesos de poca
maduración como los quesos de cabra. Como una de las más importantes para quesos
frescos se encuentra la 2-heptanona
[79]
(aroma a moho, madera, dulce), la cual fue
identificada para las muestras de queso en las tres fases de lactancia.
Aldehídos
Los aldehídos fueron compuestos minoritarios en todas las muestras de queso
analizadas, probablemente debido a que son rápidamente convertidos a alcoholes o a sus
correspondientes ácidos [97].
Los tres aldehídos que fueron aislados e identificados, nonanal, benzaldehído y
decanal, aportan al queso aromas característicos a herbal, flores, ramas y verde
[97]
respectivamente. Son también compuestos importantes como indicativos de que el queso
ha alcanzado una maduración óptima, debido a que concentraciones elevadas pueden
causar aromas desagradables
[98]
. El nonanal es uno de los más importantes para el aroma
83
de
quesos que son madurados como Mozzarella, Grana Padano, Buffalo y Pecorino,
aportando aromas y sabores herbáceos [99].
Terpenos
El único terpeno identificado fue el limoneno en la muestra de queso tres. Estos
compuestos son importantes en los quesos elaborados artesanalmente, ya que son usados
como marcadores de la región de producción cuando el producto tiene designación
protegida de origen, ya que son constituyentes de las plantas usadas en la alimentación
animal, los cuales son transferidos a la leche y finalmente al queso [96]. Un ejemplo de ello es
el queso Bitto, el cual posee designación de origen, ya que es producido solo al norte de
Italia en los meses de junio hasta septiembre, manteniendo al ganado alimentado solo con
el pasto producido en
esa época del año
[97]
. Aunque las cabras fueron alimentadas
mediante el mismo maíz comercial durante todas las etapas de lactancia, esté pudo variar
su composición reflejándose en el limoneno identificado.
Ácidos grasos
Los ácidos grasos libres fueron identificados en todas las muestras de quesos;
ácidos butanoico, hexanoico, octanoico y decanoico han sido reportados anteriormente en la
literatura como los compuestos de principal importancia para el aroma del queso de cabra
debido a sus bajos umbrales aromáticos
[98]
, por lo que serán los compuestos a cuantificar
en las muestras de quesos analizadas.
Durante la maduración de los quesos, los ácidos grasos libres se pueden originar a
partir de tres vías bioquímicas principales: lipólisis, proteólisis y fermentación de lactosa
[88].
Las enzimas con actividad lipolítica (estereasas, lipasas) pueden causar la liberación de
ácidos grasos de cadena lineal (butanoico, pentanoico, hexanoico, heptanoico, octanoico,
decanoico y dodecanoico), mientras que las enzimas proteolíticas son responsables de la
formación de ácidos grasos de cadena ramificada (2-metilpropanoico y 3-metilbutanoico)
mediante la desaminación de aminoácidos tales como valina, leucina e isoleucina
[88]
. En
este caso, como el queso fue elaborado de leche cruda, la lipólisis podría deberse a la
acción de las lipasas propias de la leche y al cultivo iniciador proveniente de las enzimas del
84
estómago del cabrito. Otro ácido graso que contribuye al aroma rancio y lácteo del queso es
el 3-metilbutanoico, el cual fue identificado en la muestra dos.
En el caso del queso de cabra los ácidos grasos de cadena corta son importantes
para el aroma conocido como cabral
[100]
. Todos los compuestos identificados tienen
asociado un descriptor de olor característico (Apéndice IV) que en conjunto originan el
aroma del queso de cabra analizado.
85
CAPÍTULO IV
ENTRENAMIENTO DEL PANEL SENSORIAL Y ANÁLISIS
OLFATOMÉTRICO. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4 .1. Entrenamiento del panel sensorial.
4.1.1. Reconocimiento de aromas de alimentos y desarrollo de destreza en asociar
descriptores.
Para el trabajo sensorial, el panel estuvo conformado finalmente por 6 personas. La
falta de interés y motivación del personal con el que se contó para las entrevistas y
reclutamiento no permitió tener un mayor número de miembros en el panel, ya que se
recomienda un número de 10 a 20 personas, atribuido a que la variabilidad de los resultados
incrementa en paneles menores a 10 personas
[84]
. Por esta razón se dedicó un mayor
tiempo de entrenamiento para un buen desempeño individual de los panelistas y mejorar así
la variabilidad en las respuestas del grupo
[81]
. En la Tabla 4.1 se muestran los resultados
obtenidos en la prueba de reconocimientos de aromas para el desarrollo de destreza en
asociar descriptores.
Tabla 4.1. Porcentajes de aciertos individuales y grupal en el reconocimiento de aromas de
alimentos.
Panelistas*
% de aciertos en la prueba
K11
82,1
I19
89,3
C41
78,6
F61
75,0
G71
75,0
D51
92,9
% Acierto del grupo
82,1
*panelistas identificados con códigos
86
En base a los resultados para esta prueba, el panel arrojó un promedio de grupo de
82,1 % de aciertos, lo cual según la ASTM E-18 nos ubica en el porcentaje aceptado a
considerar como un panel entrenado para la prueba de reconocimiento de aromas, el cual
exige un mínimo de 70% en aciertos. Para esta prueba se realizaron repeticiones hasta
alcanzar los valores aceptados (sección 3.6.2.2.1). En cuanto a los valores de aciertos
individuales, también se obtuvieron valores superiores al 70 %.
4.1.2. Determinación del umbral de identificación de aromas de los panelistas
Para la determinación del umbral de detección e identificación del panel se usó el
acetato de isoamilo preparado en concentraciones según la norma ISO 354-E. Este
compuesto posee un olor característico a cambur. Los resultados obtenidos se presentan en
la Tabla 4.2.
Tabla 4.2. Umbral de identificación individual de los panelistas usando acetato de isoamilo.
Promedio de concentración de
Panelistas*
umbral de identificación (ppm)
D.E.
Rango de identificación
N= 3
(ppm)
K11
6,7
2,9
3,8 – 9,6
I19
0,8
0,3
0,5 – 1,1
C41
0,7
0,3
0,4 – 1,0
F61
8,3
2,9
5,4 – 11,2
G71
8,3
2,9
5,4 – 11,2
D51
3,7
2,3
1,4 – 6,0
*panelistas identificados con códigos; D.E: desviación estándar
El umbral de identificación del panel estuvo dividido en 2 grupos; un grupo con un
rango de umbral bajo de (0,4 – 1,1) ppm y otro con un umbral más elevado (1,4 – 11,2) ppm,
por lo que se trabajó con un valor promedio de 5 ppm para entrenar el grupo, valor para el
cual el primer grupo detectó e identificó el olor de los patrones sin dificultad. Se trabajó
individualmente con el segundo grupo hasta disminuir su umbral de detección y así se logró
que ambos grupos trabajaran bajo esta concentración, la cual fue la usada para el desarrollo
de vocabulario a usar en la detección de aromas en olfatometría.
87
4.1.3. Desarrollo del vocabulario del panel para olfatometría.
En el desarrollo del vocabulario del panel, la mejor metodología para la percepción y
descripción de los olores fue la usada con las tiras olfativas (sección 2.6.2.2.3), ya que los
panelistas realizaron una mejor y más detallada descripción y con menos repeticiones de
secciones de entrenamiento. La otra metodología usada fue la del espacio en cabeza de los
patrones, la cual fue muy útil y eficaz para entrenar al panel en la rapidez para describir los
olores, de esta manera cuando los panelistas realizaron detecciones en el equipo de
olfatometría hubo mayor confianza y fluidez en la descripción de los olores.
Para las sesiones de trabajo en el equipo de olfatometría se usaron una serie de
ésteres lineales con aromas característicos reportados (Tabla 4.3), con concentraciones de
5, 10 y 20 ppm, siendo el patrón de 10 ppm el seleccionado para el entrenamiento ya que el
panel detectó e identificó mejor esta concentración. Con el patrón de 5 ppm no hubo buena
descripción ya que argumentaban baja intensidad de los olores y para el patrón de 20 ppm
los aromas percibidos saturaban muchas veces a los panelistas.
Tabla 4.3. Compuestos usados para el entrenamiento del panel en olfatometría.
compuestos
Aroma
Propianoato de etilo
frutal, dulce
Butanoato de etilo
frutal, piña
Hexanoato de etilo
frutal, concha de manzana
Octanoato de etilo
fruta, rancio, manzana madura
Decanoato de etilo
fruta cítrica, uva
Dodecanoato de etilo
papel, verde
Al comparar los descriptores reportados para los compuestos usados en el desarrollo
del vocabulario del panel (Tabla 4.3) y los arrojados por el panel (Tabla 4.4), se obtuvo una
buena correlación en cuanto a los descriptores.
88
Tabla 4.4. Descriptores de aromas de la serie de ésteres lineales en el entrenamiento del
panel en olfatometría.
Corridas olfatométricas
1
2
tR
tD
tR
tD
Descriptores de aromas
(min) (seg) (min) (seg)
6,59 7,99 7,04 2,45
crema de leche, yogurt, colita
9,14 4,71 9,34 1,77
frutal, como níspero, coco, licor dulce
13,34 1,20 14,06 3,49
caramelo de frutas, madera ahumada
I91
frutal, como cambur, plátano, frambuesa
18,57 4,31 18,10 8,13
24,04 5,22 24,48 2,17
manzanilla, floral, leche hervida, cebo
floral, verde, concha de fruta pero no reconoce cual
28,07 3,76 27,46 4,61
6,01 0,28 6,09 0,31
floral, herbal
9,24 0,32 9,15 0,22
frutal, níspero, herbal
té verdes, grama, lavanda
13,41 0,19 14,02 0,32
K11
18,21 0,26 18,17 0,25
frutal, esencia de frambuesa, cereza
24,07 0,31 23,58 0,33
hojas de té verde, dulce, refresco de uva
27,56 0,34 27,15 0,30
menta, verde
5,32 0,41 5,19 0,30
harina de trigo, dulce
9,43 0,30 9,11 0,26
licor dulce, alcohol, fruta cítrica
14,43 0,30 14,36 0,22
lavanda, floral
C41
18,28 0,29 18,24 0,22
frutal, concha de fruta no reconoce cual, cambur
24,17 1,13 24,15 0,33 caramelo, refresco de manzanita, concha de cambur
28,17 0,27 27,38 0,31
verde, café dulce, tierra
6,43 0,31 5,10 0,75
dulce criollo, menta, herbal
9,51 0,84 9,28 0,46
durazno, níspero maduro, fruta fermentada, alcohol
13,28 1,06 14,55 0,25
suavizante de flores, menta
D51
18,30 1,17 18,27 0,51
tutti fruti, caramelo, frutal
24,31 0,55 24,11 1,39
hojas de té dulce, fruta madura no reconoce
frutal, concha de cambur, grama, monte
27,35 0,18 27,44 0,40
6,11 4,18 6,31 1,36
perfume floral, flores frescas
9,39 1,59 9,13 1,44
lavanda, flores frescas, níspero maduro
14,01 1,62 13,54 1,86
floral, grama, monte, dulce, fruta cítrica limón
G71
18,22 2,27 18,14 1,76
caramelo de frutas, concha de cambur
24,12 3,09 24,00 2,31
queso madurado, rancio, lácteo, yogurt de fruta
28,13 1,58 27,41 1,35
monte, grama, floral
6,34 0,51 6,22
1,00
frutal, caramelo
9,03 0,30 9,24
1,02
fermento lácteo, agrio-dulce, durazno maduro
13,53 0,77 14,20 1,21
cebo, rama, grama, floral
F61
19,06 0,54 19,04 0,73
caramelo de fruta, concha de cambur
24,54 0,74 23,44 0,65
no reconoce bien, como frutal, camelo
27,48 1,08 28,03 0,61
herbal, tabaco dulce, concha de cambur maduro
*panelistas identificados con códigos, tR= tiempo de retención, tD= tiempo de duración.
*
Panelista
89
Adicionalmente los tiempos de retención de la serie de ésteres lineales fueron
usados para calcular los índices de retención y tratar de identificar las zonas de aromas,
pero no hubo buena correlación entre los valores calculados y los valores reportados para
una posible identificación de los compuestos por el método olfatométrico.
4.2. Representatividad sensorial de la extracción del aroma del queso de cabra por
MEFS.
Para el análisis olfatométrico se evaluó inicialmente la representatividad sensorial de
la muestra de queso de cabra con las fibras analizadas en la optimización del método
analítico para la extracción de los compuestos volátiles por MEFS en espacio en cabeza
(sección 2.1.1).
En la Tabla 4.5 se presentan los valores obtenidos para el estudio de
representatividad del aroma del queso de cabra en resolución cromatográfica nula mediante
la extracción con las dos fibras DVB/CAR/PDMS y CAR/PDMS.
Tabla 4.5. Análisis del porcentaje de representatividad del aroma del queso de cabra
extraído con la fibras DVB/CAR/PDMS y CAR/PDMS.
Promedio de medidas *
% Representatividad
Fibras
± D.E (cm) n=20
DBV/CAR/ PDMS
11 ± 1
72
CAR/ PDMS
5±1
32
*escala no estructurada de 15 cm; D.E= desviación estándar
Como se observa, se obtuvo un mayor porcentaje de representatividad con la fibra
de tres fases DBV/CAR/PDMS, resultado coherente con las evaluaciones realizadas
mediante CG-FID. El valor es aceptado como representativo del aroma extraído por MEFS
para el queso evaluado [83].
Para verificar que el aroma del queso fue analizado en condiciones de resolución
nula, se realizó un análisis adicional con un compuesto de aroma reportado para el queso de
90
cabra (butanoato de etilo). El tiempo muerto para la sustancia fue de 0,19 min. (n=20, 2
evaluaciones con cada uno de los 10 panelistas). En la Tabla 4.6 se presentan los de
tiempos de retención promedio en la evaluación de la representatividad del aroma del queso
obtenido con la fibra de tres fases, y para el butanoato de etilo.
Tabla 4.6. Evaluación de resolución nula en CG-O de los volátiles extraídos con la fibra
DBV/CAR/ PDMS del queso de cabra y patrón de butanoato de etilo.
Evaluación del
Zonas de
Descripción del
Tiempo de retención
FD
aroma
aromas
olor
promedio
n=20
tr ± D.E (min)
n=20
Queso de cabra
1
Queso madurado
0,21 ± 0,01
20
Butanoato de etilo
1
Queso , lácteo
0,19 ± 0,01
20
FD= frecuencia de detección; D.E=desviación estándar
En cromatografía de gases el factor de retención se define como:
k´ = tD – tM / tM (Ec. 4.1)
tD= tiempo de detección; tM= tiempo muerto
Aplicando la Ec.10 a los valores reportados en la Tabla 4.6 para el cálculo del factor
de retención (k) en cromatografía de gases
[24]
, se obtienen valores para k próximos a cero,
lo cual demuestra que los análisis de representatividad para el aroma del queso de cabra
evaluados con diferentes fibras, fue realizado a resolución nula (R=0).
Para
demostrar
que
los
tiempos
de
estadísticamente iguales, se realizo una prueba t
retención
promedios
(n=20)
fueran
[86]
, para 38 grados de libertad, obteniendo
un valor de 0,63 para un P=0,05 menor al valor critico (t=2,01), aceptando así la hipótesis
nula para la cual los dos tiempos eran iguales y en consecuencia se corrobora que el
análisis se realizo en resolución nula.
91
4.3. Análisis olfatométrico del queso de cabra en las tres fases de lactancia
El estudio olfatométrico se realizó para verificar las zonas aromáticas individuales más
importantes en cada etapa de producción del queso de cabra a partir del inicio de la curva de
lactancia, y correlacionar los descriptores arrojados por el panel con los olores característicos
de los compuestos identificados por CG-EM.
Para las tres muestras de queso de cabra se realizó un total de 12 corridas olfatométricas
para cada una y se realizó luego un aromagrama consenso (Apéndice III) para determinar las
zonas de aromas con su correspondiente frecuencia de detección y los descriptores
característicos de cada zona. La muestra 1 presentó un total de 31 zonas de aromas (Fig. 4.1),
de las cuales 11 zonas presentaron una frecuencia de detección (FD) mayor al promedio,
importantes de esta manera en la contribución del aroma del queso. Estas zonas están en su
mayoría descritas por el panel como aromas a frutas fermentadas, dulces y alcoholadas (Tabla
4.7).
Series
n<6
n=6
n>6
Fig. 4.1. Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de detección, cuando 6
evaluadores participaron en el experimento para la muestra número 1 de queso de cabra (MQ1)
El aromagrama correspondiente a la muestra 2 presentó un total de 43 zonas de
aromas (Fig. 4.2), de las cuales 27 zonas poseen un n>6. El panel describió estas zonas en
su mayoría como florales, lavanda y madera (Tabla 4.8).
92
Por su parte el aromagrama de la muestra 3 presentó un total de 52 zonas de
aromas (Fig. 4.3) y sólo 17 zonas presentaron un n mayor a 6, caracterizadas como aromas
florales, monte y grama; en general aromas verdes (Tabla 4.9).
Fig. 4.2. Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de detección, cuando 6
evaluadores participaron en el experimento para la muestra número 2 de queso de cabra
(MQ2)
Series
n<6
n=6
n>6
Fig. 4.3. Aromagrama consenso mediante el método Frecuencia de detección, cuando 6
evaluadores participaron en el experimento para la muestra número 2 de queso de cabra
(MQ3)
93
Como se observa en los aromagramas obtenidos, el número de zonas de aromas
detectadas aumenta con el progreso de la lactancia, lo cual es coherente con los resultados
obtenidos en el análisis de CG-EM e indicando también un aumento en la complejidad del
aroma hacia la última etapa de lactancia. También se puede confirmar la mayor sensibilidad
del olfato en comparación con el detector por espectrometría de masas.
Como se dijo anteriormente, no se lograron identificar las zonas de aromas
detectadas por olfatometría a partir de la serie de ésteres lineales para realizar la
comparación con los compuestos identificados en los análisis mediante CG-EM. Sin
embargo se observó que la mayoría de los descriptores usados por el panel en la detección
corresponden a los aromas característicos de los compuestos identificados previamente por
CG-EM. Hay escasas zonas de aromas con altos valores de frecuencia de detección que se
pueden correlacionar a partir de los tiempos de retención y aromas a los compuestos
identificados en los análisis cromatográficos
En la muestra 1 se describieron dos zonas con una alta frecuencia de detección
(n>6): una zona descrita con aromas a lácteo, leche dañada y/o queso rancio a un tiempo de
16,13 min (Apéndice III) y en el análisis CG-EM se identifico el ácido hexanoico a un tiempo
de elución de 15,39 min., el cual presenta estos descriptores para su aroma. La segunda
zona en 20,91min descrita como frutal, fruta fermentada, floral y cítrico, la cual se puede
asociar con el nonanal, identificado en el análisis cromatográfico en un tiempo de 19, 54min.
94
Tabla 4.7. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 1.
negrita= descriptor usada con una frecuencia > 3
En la muestra de queso 2 se obtuvo, al igual que la muestra 1, una zona con un alto
valor de FD en un tiempo de retención de 20,89 min que se puede asociar también con el
compuesto nonanal. Adicionalmente esta muestra presentó dos zonas con altas frecuencias
de detección (FD=10) (Apéndice III), la primera en un tiempo de elución 14,38 min con
descriptores a grasa, cebo, lácteo, rancio, la cual se puede correlacionar con el ácido
hexanoico identificado en un tiempo de elución de 15,35 min y una segunda zona en 8,33
min descrita como frutal, ensalada de frutas, la cual se puede asociar con el butanoato de
etilo, el cual fue identificado a los 7,55 min y se caracteriza por poseer aroma frutal a
manzana.
95
Tabla 4.8. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 2.
negrita= descriptor usada con una frecuencia > 3
Se pudo observar la zona número 49 de la muestra 3 con descriptores como concha
de naranja, mandarina, limón, fruta cítrica, irritante, con un tiempo de retención de 27,26 min
(Apéndice III), y si se observan los compuestos identificados para esta muestra, se observa
que solo está presenta el compuesto decanal, el cual posee un aroma a concha de naranja
(Tabla 3.3) en un tiempo de 23,32 min.
96
Tabla 4.9. Zonas de aromas (ZA) para la muestra de queso 3.
negrita= descriptor usada con una frecuencia > 3
97
CAPÍTULO V
CUANTIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS DEL QUESO DE
CABRA EN LAS TRES FASES DE LACTANCIA. RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
5.1. Curvas de calibración
La cuantificación de los ácidos grasos libres (AGL) en las muestras de queso de
cabra se realizó mediante el método de estándar externo usando MEFS-CG-FID.
Inicialmente para el análisis se optimizó el volumen total a usar de los patrones para
la extracción, ya que este parámetro debe permanecer constante para que no haya
variación en la cantidad de compuestos extraídos por la fibra
[87]
. En la Fig. 5.1 se observa
que las áreas para los ácidos butanoico y hexanoico aumentaron gradualmente de forma
constante al aumentar el volumen a diferencia de los ácidos de octanoico y decanoico los
cuales presentaron variabilidad en el proceso de extracción, muy marcado para el ácido
decanoico, posiblemente debió al fenómeno de competencia de los otros AGL presentes por
los espacios activos de la fibra, por lo que se tomó 2 mL como el volumen a usar de los
patrones ya que se observó una mayor sensibilidad en la extracción para la mayoría de los
AGL, reflejada en el área de las señales cromatográficas y se trató de usar la menor
cantidad posible de los compuestos puros.
Se usaron 5 patrones de AGL para cada curva de calibración (Apéndice II) con un
rango de concentración de 10 a 800 ppm, obteniendo valores de coeficientes de variación
(CV) bajos, comprendidos en un rango de 1-9 % para un n=3.
98
Área (adimensional)
6000
5000
4000
Ac. Butanoico
3000
Ac. Hexanoico
Ac. Octanoico
2000
Ac. Decanoico
1000
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Volumen (mL)
Fig. 5.1. Optimización del volumen usado para los patrones de AGL para las curvas de
calibración externa.
En otros estudios realizados en cuantificación de compuestos volátiles en alimentos
por la técnica de MEFS en espacio en cabeza han reportado valores de CV que no exceden
el 10 %. Díaz
[96]
en el análisis de volátiles en especias, reportó valores de 1,4 - 9,3 % y
estudios de volátiles en quesos han reportado rangos de 2,5 - 7,9 %
[92]
. La reproducibilidad
fue difícil de controlar ya que el tiempo de muestreo fue un parámetro crítico a controlar
para obtener precisión en el proceso de extracción y mantener la linealidad de las curvas de
calibración, resultado que es atribuido al fenómeno de competencia de los compuestos y
afinidad por la fibra [87].
Las curvas de calibración arrojaron buenos coeficientes de correlación (R2) próximos
a 1(Fig. 5.2, 5.3, 5.4 y 5.5), mostrando una relación lineal entre las áreas de las señales
cromatográficas y las concentraciones de los patrones de los AGL, en el intervalo estudiado.
30000
y = 63,93x + 617,0
R² = 0,998
25000
Área
20000
15000
10000
5000
0
0
100
200
Concentración (ppm)
300
400
Fig. 5.2. Curva de calibración del ácido butanoico
Área
99
y = 54,21x + 554,87
R 2 = 0,9994
50000
45000
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
0
200
400
600
800
Concentración (ppm)
Fig. 5.3. Curva de calibración del ácido hexanoico
25000
y = 55,419x - 765,35
R2 = 0,9999
Áreas
20000
15000
10000
5000
0
0
100
200
300
Concentración (ppm)
400
Áreas
Fig. 5.4. Curva de calibración del ácido octanoico.
y = 17,89x + 418,8
R² = 0,999
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
0
100
200
300
400
500
600
700
Concentración (ppm)
Fig. 5.5. Curva de calibración del ácido decanoico
100
5.2. AGL en el queso de cabra
En la Tabla 5.1 se presentan las concentraciones obtenidas de los AGL en el espacio
en cabeza del queso de cabra analizado. Se observa que todos los compuestos aumentaron
su concentración en el máximo de la curva de lactancia, posiblemente debido a la mayor
acción de las lipasas propias de la leche cruda y/o del coagulante (provenientes del
estómago del cabrito) en el proceso de lipólisis
[52]
. Otros factores que pudieron ocasionar el
aumento de los AGL en el queso elaborado en la fase dos de lactancia, fue una mayor
concentración inicial de ácidos grasos libres propios de la leche y una mayor cantidad de
grasa.
Tabla 5.1. Concentración en el espacio en cabeza de los ácidos grasos libres (AGL) en las
tres fases de lactancia
AGL
LD
(ppm)
LC
(ppm)
Concentración promedio
n=3 (ppm)
MQ1
MQ2
MQ3
Butanoico
25
83
<LC
133
<LC
Hexanoico
29
95
268
490
131
Octanoico
4
16
166
235
129
Decanoico
19
65
448
663
333
a= y= TIC área, x= concentración (ppm), LD= límite de detección, LC=límite decuantificación, MQ: muestra de queso,
(1) al inicio de la curva de lactancia; (2) en la mitad de la curva de lactancia y (3) al final de la curva de lactancia
Al realizar una prueba estadística aplicando un análisis de varianza de una vía para
comparar cada AGL en cada fase de lactancia, se obtuvo que existen diferencias
significativas entre cada una de las concentraciones de los AGL en las muestras de quesos
en las tres fases de lactancia (Fig. 5.6). Estas diferencias serán tratadas posteriormente
mediante el método Multidimensional Scaling (MDS).
101
Fig. 5.6. Distribución de los AGL en las muestras de queso de cabra en las tres fases de
lactancia
La cuantificación de los ácidos grasos libres permitió calcular sus valores de
actividad de olor (VAO), los cuales son necesarios para estimar la contribución de cada
compuesto al aroma del queso de cabra analizado. Este parámetro fue calculado para cada
AGL cuantificado y con valores de umbrales de aromas reportados en la literatura (Tabla
5.2). Los valores de VAO para el ácido butanoico y hexanoico fueron mayores a 1, lo cual
indica que las concentraciones de los compuestos son mayores que el umbral sensorial y de
esta manera los compuestos contribuyen potencialmente al aroma característico del queso
de cabra, siendo clasificados entonces como compuestos activos de aroma
[72,78]
. Para el
acido octanoico, el VAO fue solo mayor a 1 en el máximo de la curva de lactancia por lo que
es en este estado de producción del queso, donde este compuesto es importante,
contribuyendo al olor rancio característico y apreciado por los consumidores.
Tabla 5.2. Valores de actividad de olor (VAO) de los ácidos grasos libres (AGL)
en el queso de cabra.
AGL
Umbral
[72,78]
sensorial
VAO
MQ1
MQ2
MQ3
Butanoico
7,74
7,08
17,12
3,63
Hexanoico
31,74
8,46
15,43
4,14
Octanoico
203,49
0,82
1,16
0,63
Decanoico
NR
-
-
-
VAO: valores de actividad de aroma, MQ: muestra de queso, (1) al inicio de la curva de lactancia;
(2) en la mitad de la curva de lactancia y (3) al final de la curva de lactancia, NR: no reportado
102
Cuando se analiza la actividad de los compuestos de aromas en alimentos, el pH es
una variable importante para las medidas de los valores de umbrales, ya que se considera
su efecto en el estado de los compuestos, si están disueltos, libres o unidos a otros
compuestos. De esta manera las características del medio limita la volatilidad de los
compuestos, influenciados por sus polaridades y coeficientes de partición
[95]
. Así el análisis
de los compuestos de aroma puede llegar a ser muy complicado a causa de los múltiples
mecanismos que afectan a los componentes,
tales como transferencia de masa,
impedimentos estructurales e interacciones con la matriz
[91]
. En el caso del queso, la
caseína puede tener un efecto en la retención de los compuestos importantes para el aroma,
ya que ésta proteína tiene regiones tanto hidrofóbicas como hidrofilicas en su estructura
que pueden actuar como sitios de enlaces para los compuestos
[92]
, de esta manera para
calcular los umbrales de olor lo ideal sería realizarlo en el alimento en estudio o en una
réplica de la matriz.
Los valores de umbrales usados en el presente trabajo para calcular los VAO, fueron
tomados de la literatura en trabajos realizados en leche, por lo que la diferencias en el pH y
efectos de matriz podrían arrojar valores con pequeñas desviaciones, sin embargo se han
[93]
reportado VAO para AGL en quesos con valores similares
, por lo que se estima que los
VAO reportados en el presente trabajo son valores razonables.
En un estudio realizado acerca del efecto de la lipólisis en la evolución de los
compuestos de aromas en el tiempo en queso de cabra
[73]
, fue reportado un valor promedio
de 203,49 ppm para el ácido octanoico, muy similar al reportado en el presente trabajo, pero
con valores menores para los ácidos butanoico y hexanoico, los cuales fueron de 10,34 ppm
y 42,65 ppm, respectivamente, por lo que el ácido octanoico fue el AGL con mayor potencial
en el aroma del queso de cabra para ese estudio con un VAO de 8,7 y en nuestro caso los
ácidos butanoico y hexanoico influyen más en el aroma del queso analizado.
103
CAPITULO VI
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS AGL CUANTIFICADOS EN EL
QUESO DE CABRA Y ZONAS DE AROMAS DEL ANÁLISIS
OLFATOMETRICO. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Análisis de los AGL en las muestras de quesos en las tres fases de lactancia
Las diferencias o similitudes en el perfil de los ácidos grasos libres durante la
elaboración del queso de cabra en las tres fases de la curva de lactancia fueron analizadas
mediante el método estadístico "Multidimensional Scaling" (MDS Kruskal 1964). El punto de
partida fue generar una matriz de proximidades entre las áreas cromatográficas medidas
para cada AGL para cada fase de análisis de muestras, y estudiar el espacio
multidimensional con el mínimo número de dimensiones posible. La representación de los
datos de manera gráfica permite visualizar las distancias entre variables y las muestras.
Este método de análisis origina cluster que proporcionan una base para la interpretación de
la estructura de la distribución del conjunto de variables o grupos de compuestos en cada
estado. Este método estadístico es ampliamente usado en análisis sensorial de alimentos
[102]
, donde se obtiene poca data por lo restringido de trabajar con los sentidos, ya que está
presente el factor fatiga de los panelistas. En quesos, se han reportado trabajos para
análisis de texturas y sabor con panelistas entrenados y consumidores[103][104], y de aromas
generados por microorganismos en quesos modelos [105].
Para el tratamiento estadístico inicialmente se calcularon las desviaciones estándar y
los coeficientes de variación para cada AGL de los quesos elaborados en los tres estados
de lactancia (Tabla 6.1). Se encontró el mayor porcentaje de variación para el ácido
butanoico, con un 58%. Se obseva una mayor diferencia en las medidas para este
compuesto en las tres fases de la elaboración del queso de cabra, como se representa en el
histograma (Fig. 6.1a) con un mínimo de 2343 y un máximo de 9593. A diferencia del
butanoico, el compuesto que menor dispersión presentó en los tres estados de lactancia fue
el ácido decanoico (Figura 6.1d), con un 24% en el coeficiente de variación.
104
Tabla 6.1. Áreas medidas en CG-FID de los AGL en las tres fases de lactancia y sus
coeficientes de variación
AGL
Prom.
Áreas
n=9
Mínimo
Máximo
Desvest.
% CV
Butanoico
5207
2343
9593
3035
58
Hexanoico
16627
6765
29658
8581
52
Octanoico
9029
5793
13047
2681
30
Decanoico
7030
4164
8955
1653
24
cv.=coeficiente de variación, prom=promedio
Histogram: Butanoico
K-S d=.26140, p> .20; Lilliefors p<.10
Expected Normal
Histogram: Hexanoico
K-S d=.21326, p> .20; Lilliefors p> .20
Expected Normal
3
2
No. of obs.
No. of obs.
3
1
2
1
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0
10000
0
5000
X <= Category Boundary
10000
(a)
20000
25000
30000
8000
9000
(b)
Histogram: Decanoico
K-S d=.28023, p> .20; Lilliefors p<.05
Expected Normal
Histogram: Octanoico
K-S d=.17743, p> .20; Lilliefors p> .20
Expected Normal
3
No. of obs.
3
No. of obs.
15000
X <= Category Boundary
2
2
1
1
0
3000
0
5000
6000
7000
8000
9000
10000
11000
12000
13000
4000
14000
5000
6000
7000
X <= Category Boundary
X <= Category Boundary
(d)
(c)
Fig. 6.1. Histogramas de los AGL; (a)
Decanoico.
Butanoico, (b)
Hexanoico, (c) Octanoico, (d)
Para proveer una estimación cuantitativa de la relación lineal de la data mediante la
configuración realizada por MDS, se calcularon los coeficientes de correlación para todos los
105
ácidos grasos libres (Tabla 6.2). Obteniendo valores mayores a 0,7 para la mayoría de los
AGL a un nivel de significancia de 0,05.
Tabla 6.2. Coeficientes de correlación de los AGL
AGL
Butanoico
Hexanoico
Octanoico
Decanoico
Butanoico
1,00
0,98
0,94
0,69
Hexanoico
0,98
1,00
0,93
0,78
Octanoico
0,94
0,93
1,00
0,73
Decanoico
0,69
0,78
0,73
1,00
Con el objetivo de representar la estructura jerárquica en la formación de los grupos
o conglomerados de los AGL en los quesos, se utilizó el dendograma. Este gráfico nos
permitió visualizar las distancias de enlace y obtener los valores de correlaciones de
Pearson ayudándonos a establecer los grupos de los compuestos según sus similitudes. El
diagrama se realizó inicialmente con las correlaciones de las variables, que fueron los AGL
(Fig. 6.2), en el cual se formaron tres grupos (A, B y C). En el grupo A se encuentra el ac.
butanoico y hexanoico con una misma distancia de enlace de 0,02 arrojando una correlación
positiva de similitud del 100%, luego se encuentra el ac. octanoico en el grupo B con una
distancia de enlace de 0,06 y una correlación del 67 % con el grupo B. Finalmente se
encuentra en el grupo C, el ac. decanoico con la mayor distancia de enlace de 0, 22, lo cual
origina una correlación muy baja respecto a los grupos A y B, con un 9 y 27%.
106
Fig. 6.2. Dendograma de las variables (ac. butanoico, hexanoico, octanoico y decanoico) en
las tres fases de la curva de lactancia.
De acuerdo a la información obtenida de la Fig. 6.2, se podría inferir que los ácidos
butanoico y hexanoico se encuentran en un mismo grupo jerárquico para los quesos de
cabra en todas las fases de elaboración, siendo estos los AGL que aportaron mayor
contribución al aroma, ya que presentaron los valores más altos de actividad de olor. Según
Urbach
[106]
, en quesos producidos con leche cruda la principal ruta bioquímica de
producción de los AGL lineales de cadenas corta y mediana es la lipólisis, siendo muchas
veces los productos más importantes los ácidos butanoico y hexanoico, el cual se evidencia
en investigaciones realizadas a otros queso como el Provola del Nebrodi
[108]
y en la Serena
[107]
, Parmigiano
[109]
.
En la estructura del dendograma realizado para obtener la distribución de los quesos
en las tres fases de la curva de lactancia respecto a las variables (Figura 6.3), se obtuvieron
nuevamente tres grupos, donde se observa una relación del queso 1 (grupo A) con el queso
3 (grupo C) y luego estos dos grupos con el queso 2 (grupo B). Esto se podría atribuir a que
los AGL presentaron un máximo en sus concentraciones en el queso elaborado a mitad de
la curva de lactancia y fueron menores en los quesos elaborados al principio y final de
107
producción. Aunque por lo pequeñas de las distancia de enlace para este diagrama (0,00 –
0,05) no se pudo concluir una correlación más detallada de los tres estados.
Tree Diagram for 9 Cases
Single Linkage
1-Pearson r
Grupo A
Q1a
Q1c
Q1b
Grupo B
Q3a
Q3c
Q3b
Q2a
Grupo C
Q2b
Q2c
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
Linkage Distance
Fig. 6.3. Dendograma de las muestras de quesos en las tres fases de la curva de lactancia.
En la Figura 6.4 se muestra la disposición de las variables en cuanto a sus
disimilitudes a partir de la iteración realizada por el algoritmo en MDS para obtener los
gráficos en dos dimensiones, el cual presento un buen ajuste del método con un bajo valor
de stress (0,000), el cual según Kruskal
[110]
es un valor excelente de ajuste. La
configuración 6.4a muestra una similitud de los ácidos butanoico y hexanoico con valores
bajos de correlación tanto para la dimensión 1 como para la 2, presentando este conjunto
diferencias con los ácidos restantes, ya que el octanoico
presenta un valor alto en al
dimensión 2, y el decanoico se ubica con un valor alto en la dimensión 1, arrojando de esta
manera el mismo comportamiento obtenido en el análisis de los cluster. Al tratar de
correlacionar la distribución de los AGL con la distribución de los quesos (Figura 6.4b), se
podría inferir que la muestra de queso 2 se ubica con valores más altos hacia los ácidos
108
butanoico, hexanoico y octanoico, diferenciándose así de las muestras de quesos 1 y 3 que
se encuentran con valores más altos en la dimensión 1.
Q1= queso inicio; Q2= mitad; Q3=Final curva de lactancia; A,B,C= replicas
Fig. 6.4. Configuración de dos dimensiones de los AGL para los quesos de cabra en los tres
estados de lactancia derivada del modelo de distancia euclídea.
El comportamiento de la distribución de los quesos en relación a los AGL en la
configuración del gráfico de dos dimensiones se podría correlacionar con los resultados
obtenidos de la cuantificación de los mencionados compuestos, ya que se obtuvo que la
109
concentración de todos los ácidos aumentaban en la muestra de queso 2, siendo el ácido
decanoico el que presentó el valor más alto de concentración, diferenciándose de esta
manera el queso 2 de los quesos 1 y 3.
6.2. Análisis estadístico de las zonas de aromas obtenidas en el análisis olfatométrico
de los quesos de cabra.
Para describir el aroma general de cada muestra de queso se agruparon las zonas
descritas con frecuencias de detección mayores a 6 en 7 familias de aromas, las cuales
fueron; frutal-dulce, caramelo-dulces, frutas fermentadas, floral-lavanda, herbal, lácteorancio y frutal-herbal. Esto permitió construir un grafico con sistemas de coordenadas
concéntricas (Fig. 6.5). Esta representación se realizó con el fin de generar un perfil del
producto en cada etapa de producción de acuerdo a la curva de lactancia y apreciar las
diferencias prevalecientes entre productos por descriptores de aromas. En este perfil se
observo que las muestra 1 y 2 presentaron un mayor número de zonas características con
aromas frutales y dulces y la muestra 3 una marcada diferencia con aromas herbales.
Frutal, dulce
6
5
4
Frutal, Herbal
Caramelo, dulces
3
2
1
MQ1
0
Lácteo, rancio
MQ2
Fruta fermentada
Herbal
MQ3
Floral, lavanda
Fig. 6.5. Perfil de aromas de las muestras de quesos de cabra
Para el análisis de los grupos de aromas conformados para generar un perfil de los
quesos se realizó un análisis estadístico mediante MDS con la finalidad de estudiar las
diferencias y semejanzas que existen entre los perfiles de aroma. Inicialmente se realizó el
análisis de conglomerados (Fig. 6.6) a partir de la correlación de las variables (familias de
aromas). Según las distancia de enlaces de las variables se pueden identificar 4 grupos. En
el grupo 1 se encuentra ubicado el aroma frutal-dulce con una correlación positiva de
110
igualdad del 100% con el aroma a fruta fermentada, luego se tienen los aromas floral
lavanda y lácteo-rancio en el grupo 2 con una correlación positiva con el grupo 1 de 40% y
del 99 % con el grupo 3, el cual está compuesto por las variables caramelo-dulces y frutalherbal y por último se encuentra el grupo 4 con el descriptor herbal el cual tiene una mayor
distancia de enlace y como consecuencia una baja correlación con los primeros tres grupos.
Tree Diagram for Variables
Single Linkage
1-Pearson r
Frutal-dulce
Grupo 2
Grupo 1
Fruta fermentada
Floral-lavanda
Lácteo-rancio
Frutal-herbal
Grupo 4
Grupo 3
caramelo-dulces
Herbal
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Linkage de
Distance
Distancia
enlace
Fig. 6.6. Dendograma de las variables (familia de aromas obtenidas por el análisis
olfatométrico) de los quesos elaborados en las tres fases de la curva de lactancia.
La similitud entre las familias de aromas para cada muestra de queso se puede
apreciar mejor en la Figura 6.7, donde los aromas frutal-herbal y caramelo-dulces
presentaron mayores semejanzas entre ellos como se obtuvo en el análisis de las variables
en el dendograma, agrupándose en el cuadrante inferior izquierdo entre -0,4 y -0,8,
clasificado como el grupo 2. El aroma a herbal se clasificó como el grupo 3 y se ubicó en el
cuadrante derecho inferior entre 1,8 y -0,2 presentando diferencia con el grupo 2. Los
grupos de aromas restantes presentaron similitud y se clasificaron en el grupo 1 ubicándose
en el cuadrante superior izquierdo entre -0,1 y 0,6, diferenciándose de las zonas de herbal y
111
frutal-herbal y caramelos-dulces. De esta manera se obtuvo que las muestras de quesos se
diferencian en tres zonas de aromas, en base a los datos de las variables estudiadas
(herbal; frutal-herbal, caramelo-dulce y frutal-dulce, fruta fermentada, lácteo-rancio). El valor
de stress asociado a esta configuración fue bajo (0,00), lo cual indica un buen ajuste del
modelo para las familias de descriptores de aromas en el mapa de dos dimensiones
realizado [110].
Scatterplot 2D
Final Configuration, dimension 1 vs. dimension 2
0,8
0,6
Floral-lavanda
Lácteo-rancio
Fruta fermentada
0,4
Frutal-dulce
Grupo 1
Dimension 2
0,2
0,0
Grupo 3
Herbal
-0,2
-0,4
-0,6
-0,8
Grupo 2
Frutal-herbal
caramelo-dulces
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Dimension 1
Fig. 6.7. Configuración en dos dimensiones de los grupos de aromas para las muestras de
quesos de cabra.
Para correlacionar los quesos con los tres grupos de aromas generados en el
análisis de las variables, se realizó el gráfico de dos dimensiones para todas las muestras
de quesos (Fig. 6.8). En este análisis se obtuvo que la muestra de queso 1 se ubicó hacia el
cuadrante superior izquierdo correlacionándose así con la ubicación de la familia de aromas
del grupo 1 (frutal-dulce, fruta fermentada, lácteo-rancio). Esta muestra en el análisis por
CG-EM presentó como compuestos mayoritarios los alcoholes, los cuales pueden contribuir
con aromas característicos al grupo 1. La muestra de queso 2 se ubicó en el cuadrante
inferior derecho, correlacionándose así con el grupo de aromas 3 (herbal), este resultado se
puede atribuir a que esta muestra presentó las mayores concentraciones en el espacio en
112
cabeza de los ácidos grasos libres, adicionalmente se observa que esta muestra presenta
un componente en el mismo cuadrante de la muestra de queso 1 y esto puede ser atribuido
a que al igual que la muestra 1, posee como compuesto mayoritario los alcoholes.
Finalmente la muestra 3 se ubica en el cuadrante inferior izquierdo correlacionándose con la
ubicación del grupo 2 (frutal-herbal, caramelo-dulces), ya que para esta muestra se identificó
como compuestos mayoritarios los ésteres, aunque con un número igual de alcoholes que
los presentes en la muestra de queso 1, por lo que se observa en el gráfico un componente
de la muestra 3 junto con la muestra 1.
Scatterplot 2D
Final Configuration, dimension 1 vs. dimension 2
0,8
MQ2C
0,6
MQ1A
MQ1B
MQ3B
MQ3C
0,4
Dimension 2
0,2
0,0
-0,2
MQ3E
MQ3D
MQ3F
MQ2B
MQ2A
-0,4
MQ3A
-0,6
-0,8
-1,4
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Dimension 1
Fig. 6.8. Configuración en dos dimensiones para todas las muestras de quesos de cabra
113
CONCLUSIONES
•
Se aislaron e identificaron los compuestos responsables del aroma del queso
de cabra a lo largo del período de lactancia, siendo los pertenecientes a la
familia de los alcoholes los mayoritarios en las muestras de queso unos y
dos, y los pertenecientes a la familia de los ésteres los mayoritarios en la
muestra tres.
•
El aroma del queso de cabra se hace más complejo a lo largo del período de
lactancia, evidenciándose al aumentar el número de compuestos identificados
y el número de zonas de aromas descritas en los análisis olfatométricos.
•
Se implementó el análisis olfatométrico mediante el acoplamiento del detector
de olor al equipo de cromatografía de gases, con el funcionamiento un
programa de detección y registro de la señal olfatométrica con el programa
LabView 8.5.
•
Los aromas a frutas fermentada alcoholadas para la muestra al inicio del
periodo de lactancia; floral, lavanda para la muestra número dos y floral,
verde para la muestra final caracterizaron el perfil aromático de los quesos de
cabra en las fases de lactancia evaluadas.
•
No se lograron identificar las zonas de aromas obtenidas en los análisis
olfatométricos mediante el uso de ésteres lineales para la correlación con los
compuestos identificados en el análisis mediante CG-EM.
•
Los AGL se cuantificaron mediante curva de calibración externa y presentaron
concentraciones que están de acuerdo con los valores que se encuentran en
114
la bibliografía, presentado un aumento en la muestra de queso de cabra
analizada en la segunda fase de la curva de lactancia.
•
La comparación entre el perfil de los AGL cuantificados y los análisis
olfatométricos mediante el uso del MDS permitió diferenciar los quesos de
cabra elaborados con leches provenientes de tres estadios de lactancia,
ubicando la muestra número uno y tres en el mismo grupo jerárquico con una
relación positiva a partir de los ácidos butanoico y hexanoico y con zonas de
aromas características a aromas lácteos, fermentadas.
115
RECOMENDACIONES
El estudio realizado permite hacer las siguientes recomendaciones:
•
Entrenar al panel para la determinación de intensidad de los olores en el análisis
olfatométrico y así realizar cálculos de porcentajes de frecuencias modificadas para
posibles análisis estadísticos de los aromagramas obtenidos.
•
Realizar un estudio de aceptabilidad para correlacionarlo con las concentraciones de
los AGL cuantificados en el espacio en cabeza del queso de cabra en los tres
estados de lactancia, y de esta manera proponer en cual fase de lactancia el
producto tendría una mayor demanda para consumo.
•
Correlacionar los compuestos identificados en el queso de cabra mediante el análisis
de CG-EM con las zonas de aromas obtenidos por olfatométria mediante el método
retention time locking para una posible identificación de los compuestos por CG-O.
•
Realizar los análisis de extracción de los volátiles mediante MEFS usando
cantidades menores de 1g de muestras de quesos para verificar la saturación de la
fibra.
•
Determinar el contenido de grasa en las muestras de queso en las tres fases de
lactancia para correlacionarlo con las concentraciones de los AGL.
•
Realizar investigaciones que permitan estandarizar los procesos de elaboración de
quesos artesanales en el país y esto permitiría una consecuente mejoría en la
caracterización del producto, como lo es el aroma.
116
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110. Kruskal, B. (1964). Nonmetric Multidimensional Scaling: A Numerical Method.
Psychometrika. 2: 115-129.
128
APÉNDICE I
A 1.1 Planilla de reclutamiento para la conformación de un panel entrenado para
análisis olfatométrico
Se desea formar un panel entrenado para evaluar aromas, una actividad que formará parte
de una tesis de grado. En este sentido se extiende una invitación a Ud. para formar parte de
este panel. A continuación se le presentan una serie de preguntas que nos permitirá hacer la
selección de panelistas. Muchas gracias por su colaboración.
Datos personales
Nombre y Apellido
Lugar de trabajo
Teléfono
Edad
Sexo
F
M
Disponibilidad
1-¿Está Ud. dispuesto(a) a recibir entrenamiento para formar parte de un panel evaluador
de aromas en diversos alimentos?
2-¿Cuál sería su disponibilidad de tiempo para esta actividad? Indíquelo en horas y días
semanales.
Experiencia
1-¿Ha participado en evaluaciones sensoriales?
2- ¿Cuantas veces
3-¿En que tipo de pruebas?
4-¿Hace cuanto tiempo?
Estado de salud
1-¿Considera que tiene buena salud?
2-¿Padece de alguna alergia?
3-¿Sufre de algún problema con el sistema respiratorio, como asma?
129
4- ¿Toma algún medicamento que afecte sus sentidos, o cause efectos como irritabilidad en
el sistema olfativo?
5- ¿Es fumador? ¿Cuántos cigarrillos o tabacos al día?
Hábitos alimentarios
1-¿Usualmente a que hora desayuna?
2-¿Usualmente a que hora almuerza?
Observaciones o comentarios
130
A 1.2 Planilla de reclutamiento para el entrenamiento de reconocimiento de aromas
Método de prueba: Reconocimiento de aromas
Nombre del juez: ________________________________________________
Fecha: ______________________
Instrucciones:
1- Se le presenta una serie de ----- muestras. Huélalas en el mismo orden en que le fueron
presentadas y diga la sensación que percibe en cada una de ellas.
2- Puede repetir si considera necesario.
3- Realice la prueba con la boca cerrada
Nº. de muestra
Nombre de la sustancia,
descripción del olor o asociación
Comentarios
Gracias por su colaboración ¡
131
A 1.3 Planilla para el entrenamiento de Umbral de aromas
Método de prueba: Umbral de Aroma
Nombre del juez: ________________________________________________
Fecha: ______________________
Instrucciones:
4- Se le presenta una serie de ----- muestras. Huélalas en el mismo orden en que le fueron
presentadas y diga la sensación que percibe en cada una de ellas.
5- Puede repetir si considera necesario en el mismo orden.
6- Realice la prueba con la boca cerrada
Nº. de
muestra
¿Percibe Ud.
(1)
El olor?
Si
(1)
No
¿Reconoce Ud.
(1)
El olor?
Si
Nombre de la sustancia,
descripción del olor o
asociación
Comentarios
No
Colocar una (x) en la columna
Gracias por su colaboración ¡
132
A 1.4 Planilla para el entrenamiento en desarrollo de vocabulario
Método de prueba: Entrenamiento de desarrollo de vocabulario
Nombre del juez: ________________________________________________
Fecha: ______________________
Instrucciones:
7- Se le presenta una serie de ----- muestras. Huélalas en el mismo orden en que le fueron
presentadas y diga la sensación que percibe en cada una de ellas.
8- Puede repetir si considera necesario.
9- Realice la prueba con la boca cerrada
Nº. de muestra
Nombre de la sustancia,
descripción del olor o asociación
Comentarios
Gracias por su colaboración ¡
133
A 1.5 Planilla para el entrenamiento de representatividad
Método de prueba: Representatividad en olfatometría
Nombre del juez: ________________________________________________
Fecha: ______________________
Instrucciones:
1- Detecte los aromas directamente en el vial y luego en el puerto de olor del equipo de
olfatometría y marque con una línea vertical sobre la escala no estructurada.
Ninguna igualdad
Total igualdad
Comentarios:
Gracias por su colaboración ¡
134
APÉNDICE II
A.2.1. Áreas de las señales cromatográficas para el patrón del ácido butanoico
Patrones
Ác. Butanoico
(ppm)
10
30
100
200
400
Áreas señal cromatográfica
1
1646
2268
6176
14313
25878
2
1528
2405
6564
13545
26333
3
1540
2278
6650
14187
25884
Promedio
áreas
1571
2317
6463
14015
26032
Desvest.
% CV
65
76
253
412
261
4
3
4
3
1
CV=coeficiente de variación
A.2.2. Áreas de las señales cromatográficas para el patrón del ácido hexanoico
Patrones
Ác. Hexanoico
(ppm)
30
100
300
600
800
Áreas señal cromatográfica
1
1615
5991
18648
32078
44261
2
1635
6038
16362
35103
40077
3
1544
6741
16596
32970
43375
Promedio
áreas
1598
6257
17202
33384
43539
Desvest.
% CV
48
420
1258
1554
3163
3
7
7
5
7
CV=coeficiente de variación.
A.2.3. Áreas de las señales cromatográficas para el patrón del ácido octanoico
Patrones
Ác. Octanoico
(ppm)
50
100
200
300
400
Áreas señal cromatográfica
1
1946
5080
10990
15816
21846
2
2228
4936
9514
15510
20313
3
1902
4510
10131
16099
22268
Promedio
áreas
2025
4842
10212
15808
21476
Desvest.
% CV
177
296
741
295
1029
9
6
7
2
5
CV=coeficiente de variación.
A.2.4. Áreas de las señales cromatográficas para el patrón del ácido decanoico
Patrones
Ác. Decanoico
(ppm)
50
100
300
500
700
Áreas señal cromatográfica
CV=coeficiente de variación.
1
1289
2432
6072
10079
12866
2
1275
2154
5328
8978
12679
3
1112
2247
5871
9448
13016
Promedio
áreas
1225
2278
5757
9502
12854
Desvest.
% CV
98
142
385
552
169
8
6
7
6
1
135
APÉNDICE III
A.3.1. Tiempos de retención y tiempos de duración de las zonas de aromas para la muestra
de queso 1.
136
A.3.2. Tiempos de retención y tiempos de duración de las zonas de aromas para la muestra
de queso 2.
137
A.3.3. Tiempos de retención y tiempos de duración de las zonas de aromas para la muestra
de queso 3.
138
APÉNDICE IV
A.4.1 Compuestos identificados en las muestras número 1, 2 y 3 de queso de cabra y
descriptores de aromas reportados.
Número
compuesto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Compuesto
isobutanol
3-hidroxi-2-butanona
3-metil-butanol
2-metil-butanol
2-heptanona
ácido hexanoico
hexanoato de etilo
2-etil-hexanol
butanoato de isoamilo
acetofenona
nonanal
ácido octanoico
octanoato de etilo
2,3-butanodiol
butanoato de etilo
hexanol
2-heptanol
benzaldehído
octanol
pentanol
alcohol furfuril
acetato de isoamilo
limoneno
butanoato de pentilo
heptanoato de etilo
pentanoato de pentilo
decanal
Aromas[88,95]
alcohol, vino
mantequilla,
whisky, malta
cebolla
jabón
sudor
cáscara de manzana
rosas, verde
frutal, caramelo
floral, almendras
cítrico, verde,
queso, rancio
frutal
frutal, cebolla
manzana
resina, flores, verde
champiñones
almendras, caramelo, miel
metal, tostado, solvente
balsámico, menta
tostado, heno, moho
cambur
menta, cítrico
cambur, pera
frutal
manzana
cáscara de naranja