Tesis - Dirección General de Servicios Telemáticos

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
IDENTIFICACIÓN DE VIRUS DE PAPILOMA HUMANO TIPO 18 EN
PACIENTES CON CÁNCER CERVICO UTERINO, LESIÓN
INTRAEPITELIAL CERVICAL Y SIN LESIÓN
TESIS
para obtener el grado de
DOCTORA EN CIENCIAS MÉDICAS
PRESENTA:
M. en C. ALMA ROSA GUADALUPE FERNÁNDEZ SALINAS
ASESORES:
BÁSICO: D. en C. LUZ MARGARITA BALTAZAR RODRÍGUEZ
CLÍNICO: D. en C. IVÁN DELGADO ENCISO
COLIMA, COLIMA, ENERO DE 2007
iii
AGRADECIMIENTOS:
Mi agradecimiento a la Universidad de Colima, a la Facultad de Medicina, pero
sobre todo al equipo de docentes-investigadores del Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas por el apoyo siempre activo de parte de todos, por sus
consejos pero sobre todo por su amistad.
Al LABORATORIO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, destacando la
colaboración del M. en C. Mario Ramírez Flores y del M. en C. Eloy Gerardo
Moreno Galindo.
A los Servicios de Salud del Estado de Colima, a través de su Secretario Dr. José
Salazar Aviña, al Dr. Carlos César Romero Moreno por la confianza depositada en
mí y al Hospital Regional Universitario en su Clínica de Displasias con la
participación del Dr. Fernando Rendón Medina y la Dra. Nerey Lima Pineda; la
L.T.S. Lidia Navarro Moctezuma; las enfermeras: Leticia Madrueño Dávila y
Raquel Vega Diego.
Al Instituto Mexicano del Seguro Social a través de su Delegada Lic. Concepción
Sevilla Gutiérrez, al Dr. Jorge Molina Padilla, Coordinador Delegacional de
Investigación, por su apoyo incondicional; al Comité de Ética del Hospital General
de Zona No. 1 y a la Clínica de Displasias con la participación de los Ginecólogos
Dr. Pedro Sotelo Virgen y Dr. Arnoldo Muñiz Gómez. Sin olvidar mencionar al Lic.
Carlos Llerenas Tejeda, responsable de la Hemeroteca del H.G.Z.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por haberme becado por 24 meses
para mis estudios, apoyo utilizado en compra de tecnología, compra de material
didáctico y de laboratorio, así como para 6 meses de contratación de personal
técnico para el proyecto.
Al Fondo Ramón Álvarez-Buylla de Aldana por haber apoyado el proyecto para
material de laboratorio.
A los estudiantes de pregrado colaboradores en la logística del proyecto: Ricardo
Cárdenas Orozco, Yuraith Elizabeth Cevallos Luna y Lorena Llerenas González.
iv
DEDICATORIAS
Al Creador de toda molécula que existe en el Universo.
A mi familia: Manuel, Ricardo Emmanuel y Rodrigo Eduardo por su paciencia y por
donarme el tiempo que les correspondía a cada uno.
A mi madre, tía, y hermanas por su apoyo emocional.
A mis amigas por los momentos de convivencia disfrutados.
v
INDICE
Titulo……………………………………………………………………….
i
Carta de terminación …………………………………………………….
ii
Agradecimientos ………………………………………………………...
iii
Dedicatorias ……………………………………………………………. .
iv
Indice ……………………………………………………………………..
v
Tabla de Cuadros y Figuras …………………………………………...
1
Resumen …………………………………………………………………
Summary …………………………………………………………………
Abreviaturas ………………………………………………………………
Introducción ………………………………………………………………
Capítulo I. Marco Teórico ……………………………………………...
1.1. Virus del Papiloma Humano (VPH) …………………..
1.2. Papovavirus ……………………………………………...
1.3. Genoma ………………………………………………….
1.4. Características Moleculares del VPH …………………
1.5. Mecanismo de malignización mediada por VPH …….
1.6. Patología del VPH ………………………………………
1.7. Virus Papiloma Humano tipo 18 (VPH-18) …………..
1.7.1 Región Larga de Control del VPH-18 (LCR) ……
2. Lesiones Intraepiteliales y Cáncer Cérvico-Uterino …….
2.1. Etiología …………………………………………………..
vi
2.2. Epidemiología …………………………………………….
2.3. Etapas de Lesiones Intraepiteliales y Cáncer CérvicoUterino ………………………………………………………..
2.4. Estadificación Histopatológica y Clínica del CaCU ………….
2.5 Tratamiento de las Lesiones Intraepiteliales y Cáncer Cérvico-Uterino.
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA ………………………………………………..
3. Planteamiento del Problema …………………………………………
4. Justificación …………………………………………………………….
5. Hipótesis ………………………………………………………………...
6. Objetivos ………………………………………………………………..
7. MATERIAL Y MÉTODO ……………………………………………..
7.1. Tipo de estudio …………………………………………………….
7.2. Selección de la muestra …………………………………………..
7.3. Criterios de Inclusión ………………………………………………
7.4. Criterios de no inclusión …………………………………………..
7.5. Criterios de exclusión ……………………………………………...
7.6. Tamaño de la muestra …………………………………………….
7.7. Consentimiento informado y encuesta ……………………………
7.8. Procedimiento ……………………………………………………….
CAPÍTULO III. RESULTADOS ………………………………………………….
8.1. Datos sociodemográficos ……………………………………………
vii
8.2. Antecedentes Gineco-obstétricos …………………………………..
8.3. Antecedentes de Riesgo ……………………………………………..
8.4. Datos Clínicos …………………………………………………………
8.5. Diagnóstico de Citología vaginal de envío …………………………..
8.6. Resultado de revisión colposcópica ………………………… ……..
8.7. Resultado histopatológico de biopsia y/o conización ……………..
8.8 Resultado histopatológico en Sistema Bethesda …………………..
8.9. Resultado de tipificación de VPH-18 positivo en biopsias ……….
8.10. Resultado tipificación de VPH de Alto Riesgo (AR) ……………..
8.11 Resultado general de tipificación del VPH-18 ……………………
8.12. Correlación de biopsia-VPH-18 con Sistema Bethesda … ……
8.13. Reclasificación de pacientes por rango de edad ………………….
8.14. Tipificación de VPH-16 ……………………………………………
CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN ……………………………………………………..
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES ………………………………………………..
CAPÍTULO VI. PERSPECTIVAS …………………………………………………
viii
BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………………
ANEXOS ……………………………………………………………………………..
ix
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
ÍNDICE DE FIGURAS, CUADROS Y TABLAS
Figura 1. Imagen electrónica del Virus Papiloma Humano …………………….
12
Figura 2. Estructura Genómica del VPH …………………………………………
16
Figura 3. Región amplificada del LCR del VPH en este trabajo ……………….
18
Figura 4. Árbol Filogenético del Virus Papiloma Humano ………………………
26
Cuadro 1. Etapas de las lesiones precursoras y sus diferentes nomenclaturas
35
Figura 5. Esquematización gráfica de la histopatología de la Neoplasia
Intraepitelial ………………………………………………………………
36
Figura 6. Imagen de Citocepillo ……………………………………………………
46
Figura 7. Diagrama logístico de la metodología de estudio ……………………. 47
Cuadro 2. Oligonucleótidos iniciadores específicos …………………………….. 48
Figura 8. Gel de Poliacrilamida para identificación de VPH-18 ………………… 49
Cuadro 3. Principales variables sociodemográficas ……………………………… 50
Cuadro 4. Principales variables gineco-obstétricas ……………………………… 51
Cuadro 5. Principales factores de riesgo conocido ………………………………
52
Gráfica 1. Motivo de consulta expresado por la paciente ………………………..
53
Gráfica 2. Aspecto clínico del cérvix al realizar la exploración ………………….
54
Gráfica 3. Tratamientos recibidos por la paciente al momento de la
muestra …………………………………………………………………..
55
Gráfica 4. Sistema Bethesda como diagnóstico de citología vaginal de
envío ……………………………………………………………………..
55
Gráfica 5. Resultado de biopsia en Sistema Bethesda ………………………….. 57
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LESIÓN
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Gráfica 6. Resultado de la revisión colposcópica ……………………………….. 57
Gráfica 7. Resultado histopatológico de biopsia o cono ………………………… 57
Gráfica 8. Resultado histopatológico de biopsia o cono en Sistema
Bethesda …………………………………………………………………. 64
Gráfica 9. Distribución de VPH-18 en resultados de Biopsias en Sistema
Bethesda. …………………………………………………………………. 64
Tabla 1. Distribución de VPH-AR ………………………………………………….
Tabla 2. Distribución de VPH-AR eliminando co-infección 18/16 ………………
Tabla 3. Distribución de VPH-AR mediante Sistema Bethesda ………………...
Gráfica 11. Resultado de tipificación VPH- 18 en las muestras con y sin
Biopsia con Sistema Bethesda ……………………………………….. 61
Cuadro 6. Distribución de lesiones citológicas clasificadas en Sistema
Bethesda ………………………………………………………………… 62
Cuadro 7. Distribución de resultados de Biopsias por rango de edad en
Sistema Bethesda ……………………………………………………..
64
Cuadro 8. Distribución de resultados de tipificación de VPH-AR por
rango de edad ………………………………………………………….
65
Tabla 4. Prevalencia del VPH-18 en diferentes publicaciones ………………… 76
Tabla 5. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP …………... 85
Tabla 6. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP …………... 85
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Tabla 7. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP …………... 85
Tabla 8. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP …………... 85
Tabla 9. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP …………... 85
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RESUMEN
Este es un estudio
definió el
descriptivo, retrolectivo, transversal, analítico en el cual se
Virus de Papiloma Humano
tipo 18 (VPH-18) y se determinó su
asociación con Cáncer Cérvico-Uterino In Situ (CIS), Lesiones Intraepiteliales (LIE)
de Bajo o Alto Grado (B o A) o en citologías normales, identificadas mediante
técnicas de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) en un archivo de Ácido
Desoxiribonucleico (ADN) de 67 muestras cervicales positivas a VPH-18 tomadas
por citocepillo, obtenidas en la región de Colima, en el periodo de enero de 2004 a
diciembre de 2005. Se analizaron los datos mediante el método de conteo y se
compararon proporciones entre los diferentes grupos mediante pruebas exactas y
chi-cuadrada. Se buscó asociación de Riesgo mediante Razón de Momios e
Intervalo de Confianza (IC).
Resultados: De un total de 264 muestras, se encontraron positivas a VPH-18 67
(25.4%), para algunos análisis posteriores se eliminaron las co-infecciones con
VPH-16 (n = 16). En total se analizaron 22 ADN’s de mujeres sin lesión; 207 con
LIEB; 35 con LIEA-CIS y se distribuyeron, por criterio citológico, en 10 muestras de
mujeres sin lesión; 50 muestras con LIEB y 7 muestras con LIEA; por criterio
histopatológico: NIC I 63.7% (n= 168). NIC II 7.6% (n= 20). NIC III-InSitu 5.0% (n=
14). VPH 4.6% (n= 12). Adenocarcinoma 0.5% (n=1). Negativa 5.3% (n=14); no se
le practicó biopsia al 13.3% (n= 35). Comparando la prevalencia con Lizano y cols.
(México 2005) para lesiones precursoras (LIEB o A) se encuentra que en las
mujeres de la región de Colima hay una prevalencia mayor de VPH-18 que en la
región central y que además es más prevalente en LIEB (p = 0.0025; RM 5.4. IC
95% 1.6 - 18.1) que en LIEA (p = 0.1311; RM 2.6 IC 95% 0.7- 10.0).
Conclusión: El VPH-18 es más prevalente en la región de Colima con una
asociación a LIEB.
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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SUMMARY:
This is a descriptive, retrolective, transverse and analytical study in wich we defined
Human Papillomavirus type 18 (VPH-18) and decided its association with Cervicaluterine Cancer In situ (CIS), Squamous Intraepithelial Lesions (SIL) of Low or High
Grade (LG or HG) or in normal smears, identified by Polimerase Chain Reaction
technology (PCR) in a Desoxiribonucleic Acid’s file (DNA) of 67 cervical positive
samples to VPH-18 taken by citobrush, obtained in Colima’s region, in the period
from January, 2004 to December, 2005. The information was analyzed by counting
method and proportions were compared among the different groups by exact tests
and chi-square. Association risk was reached by Odds Ratio (OR) and Confidence
Intervals (CI).
Results: From 264 samples, we found positive to VPH-18: 67 (25.4 %), for later
analyses, co-infections with VPH-16 (n = 16) were eliminated. 22 ADN's without
epithelial damage was analyzed; 207 with LGSIL; 35 with HGSIL-CIS and
distributed, by citologyc criterion, in 10 women's samples without damage; 50
samples with LGSIL and 7 samples with HGSIL; for histopathologyc criterion: CIN I
63.7 % (n = 168). CIN II 7.6 % (n = 20). CIN III-InSitu 5.0 % (n = 14). VPH 4.6 % (n =
12). Adenocarcinoma 0.5 % (n=1). Negative 5.3 % (n=14); biopsy was not practised
13.3 % (n = 35). Comparing prevalence with Lizano M, y cols., (México 2005) for
precursor lesions (LG or HG SIL) we show in women from Colima's region there is a
major prevalence of VPH-18 than in central region and in addition is more prevalent
in LGSIL (p = 0.0025; OR 5.4. CI 95 % 1.6 - 18.1) that in HGSIL (p = 0.1311; OR 2.6
CI 95 % 0.7-10.0).
Conclusion: The VPH-18 is more prevalent in Colima's region with an association to
LGSIL.
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ABREVIATURAS:
ADN: Ácido Desoxiribonucleico.
AIS: Adenocarcinoma endocervical in situ
ARN: Ácido Ribonucleico
CaCU: Cáncer Cérvico-Uterino
CaCU-I: Cáncer Cérvico-Uterino Invasor.
CaCU-M: Cáncer Cérvico-Uterino Microinvasor.
ClD: Clínica de Displasias.
CIS: Carcinoma In Situ: Cáncer cérvico-uterino que abarca todo el
grosor del epitelio.
ETS: Enfermedad de Transmisión Sexual.
H.G.Z.M.F.No. 1: Hospital General de Zona y Medicina Familiar No. 1, en
Colima, Col.
H.R.U.: Hospital Regional Universitario en Colima, Col.
I.M.S.S.: Instituto Mexicano del Seguro Social.
LIE: Lesión Intraepitelial.
LIEB: Lesión Intraepitelial de Bajo Grado
LIEA: Lesión Intraepitelial de Alto Grado
MAL: Marco Abierto de Lectura (open reading frame) ORF por sus siglas en inglés
NIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical.
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NIC-I: Neoplasia Intraepitelial Cervical Leve.
NIC-II: Neoplasia Intraepitelial Cervical Moderada.
NIC-III: Neoplasia Intraepitelial Cervical Severa.
nm: nanómetros (1 nanómetro = 1 millonésima parte de 1 milímetro).
p53: factor regulador de replicación celular.
pA: poliadenilados
Rb: factor regulador del ciclo celular, que se une directamente al factor
transcripcional E2F, que a su vez induce la transcripción de elementos involucrados
con la replicación celular.
RCP: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
RLC: Región Larga de Control, también llamada URR (upstream
regulatory región) y LCR por sus siglas en inglés (Long Control
Region)
R.M.: Razón de Momios.
rpm: revoluciones por minuto
RR: Riesgo Relativo
S.S.E.C.: Secretaría de Salud del Estado de Colima.
Tasa de Mortalidad CaCU: número de muertes por esta causa en mujeres de 25
años o más por 100,000 mujeres en ese grupo de edad.
var: variante viral constituida por cambios en la secuencia de bases
menor del 5%.
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VPH: Virus Papiloma Humano
VPH-18 Virus Papiloma Humano tipo 18
VPH-18 Af: Virus Papiloma Humano tipo 18 variante Africana
VPH-18 E: Virus Papiloma Humano tipo 18 variante Europea
VPH-18 AA: Virus Papiloma Humano tipo 18 variante Asiático-Amerindia
VPH-16 Virus Papiloma Humano tipo 16
VPH-AR: Virus Papiloma Humano de Alto Riesgo, en este estudio 16 y 18
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INTRODUCCIÓN:
El cáncer cervicouterino (CaCU), es una clase común de cáncer en la
mujer, es una enfermedad en la cual existe crecimiento tisular desorganizado
producido por la proliferación continua de células anormales con capacidad de
invasión y destrucción en los tejidos del cuello uterino. El CaCU suele crecer
lentamente por un período de tiempo. Antes de que se encuentren células
cancerosas en el cuello uterino, sus tejidos experimentan cambios y empiezan a
aparecer células anormales [proceso conocido como lesión intraepitelial (LIE)]
detectada generalmente con la citología vaginal (prueba de Papanicolaou);
posteriormente, las células precursoras de LIE comienzan a crecer y se diseminan
con mayor profundidad en el cuello uterino y en las áreas circundantes. Actualmente
la Neoplasia Intraepitelial Cervical (NIC) que se refiere a los cambios neoplásicos
del cuello uterino confinados al epitelio superficial sin invasión del estroma, se
considera equivalente a la LIE, lo que se detalla con precisión en el apartado 2.3.1.
Algunas lesiones regresan o permanecen inalterables durante toda la vida, y sólo un
porcentaje pequeño progresa hacia CaCU: 7,5% de NIC I, 15% de NIC II, y 25% de
NIC III. La presencia de un VPH oncogénico o de alto riesgo, confiere un RR que
va de 65.1-235.7 para el desarrollo de una lesión de alto grado y de 31.1-296.1
para un cáncer invasor. (Lorincz y cols., 1992). En otras palabras, la evolución a
estadios invasores es evitable y depende del individuo y su interrelación con
múltiples factores externos. El tiempo de evolución de las lesiones que progresan
de NIC I a NIC III, y de éste a carcinoma invasor, es muy variable, generalmente de
10 a 20 años, siendo la edad promedio de las mujeres que presentan NIC I y
carcinoma invasor, de 25 y 50 años, respectivamente.
El CaCU es hoy en día una enfermedad de importancia en salud pública a
nivel mundial. La incidencia del CaCU es mucho mayor en países de África y
Latinoamérica que en Europa o Norteamérica. Hay dudas de que el muestreo
inefectivo o ausente, la falta de acceso al sistema de salud, la multiparidad y la
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desnutrición expliquen todas las diferencias de tasas entre estos países en
desarrollo y los desarrollados. Es importante destacar que las variantes noEuropeas del VPH tipos 16 y 18 pueden tener potencial oncogénico incrementado y
esto puede representar un factor de riesgo adicional contribuyente a la
desproporcionadamente alta carga del CaCU en poblaciones en vías de desarrollo
de las diferentes regiones del mundo (Villa LL y cols., 2000. Villa LL y cols., 2002).
La carga viral también es factor de riesgo para desarrollar las lesiones precursoras
y posteriormente, si no hay intervención, neoplasia. Estudios recientes empleando
RCP cuantitativa para estimar la carga viral mostraron asociación entre ésta y la
enfermedad incidente o prevalente (Andersson y cols.,
2005).
Además se ha
determinado la asociación entre alta carga viral y el desarrollo de LIEA con una
R.M. 7.7 (I.C. 1.6-33) en el VPH tipo 16 (van Duin y cols., 2002).
En México el CaCU constituye la segunda causa de muerte por cáncer en
mujeres mayores de 25 años de edad. La primera es cáncer de mama. (Mohar y
cols., 2006). A este respecto, la Organización Mundial de la Salud (OMS), estima
que en 25 años, de no implantarse programas organizados de prevención de cáncer
cervical en países en vías de desarrollo, se presentarán 350,000 muertes anuales
por ésta enfermedad, a pesar de ser una neoplasia que puede ser 100 %
prevenible. (OMS. 2005)
La infección por el VPH es agente etiológico un importante asociado con el
desarrollo de LIE. Como quiera que sea con los métodos más sensibles de
detección, el ADN del VPH ha sido detectado en el 99.7% de los casos de CaCU
invasor (Tirado-Gómez y cols., 2005) y aunque existen algunos casos negativos,
diversos grupos han propuesto que éstos pueden deberse a fallas técnicas en la
toma de las muestras o detección viral (Delgado-Enciso I y cols., 2004); en caso de
de lesiones intraepiteliales de alto riesgo (LIEA) el VPH-16 se encuentra en 40-60 %
y el VPH-18 en 10-20%. Además se puede encontrar VPH-AR en 10-16% de
10
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mujeres sanas sin evidencia clínica o citológica de lesiones cervicales. (Lizano y
cols., 2005).
La infección por VPH es la más frecuente de las transmitidas sexualmente,
debido quizá a los cambios de conducta sexual. Se considera que 2 % de todas las
mujeres sanas en edad fértil tienen VPH y 38% de estas, con actividad sexual,
están infectadas, condición que puede remitir con el paso del tiempo como se
mencionó anteriormente.
En Colima la prevalencia de infección por VPH-AR es de 82.2% (Tamayo LE,
2002), mayor que la tasa de infección de 23.1% reportada por Lizano M. y cols.
(2005). De ésta, la prevalencia de infección por VPH-18 es de 33.8% mayor que la
reportada en este estudio de 4.3%.
El Sistema de Información de Cáncer en la Mujer (SICAM) que registra las
detecciones de CaCU a nivel nacional reporta una tasa mortalidad observada en
2004 de 24.7 y estandarizada de 38.5 por 100,000 mujeres de 25 años y más lo que
dejó a Colima en primer lugar nacional por encima de Chiapas (34), Yucatán (32.5),
Oaxaca y Morelos, con tasas de 31.3 cada una (Salud México 2004. SSA). En 2005,
en mujeres de 25 años y más en el estado de Colima refiere una tasa neta de 14.89
por 100,000 ubicando en el 18vo. lugar a nuestro estado, antes de ajustar las tasas
(Información preliminar. Fuente: Dirección de Planeación. Servicios de Salud del
Estado de Colima. 16/06/2006).
En el presente estudio se analizaron muestras de ADN de mujeres con CIS,
LIE y sin lesión, con o sin la presencia de VPH,
procedentes de la región de
Colima, mediante la técnica de RCP con la utilización de iniciadores específicos
para la identificación del VPH-18.
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CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO
1. Virus del Papiloma Humano (VPH).
Figura 1. Imagen electrónica del
Virus Papiloma Humano
(Fuente: National Cancer Institute)
1.1. Papilomavirus.
El estatus taxonómico de los tipos, subtipos y variantes de VPH está basado en la
secuencia de sus genes L1 que difieren de uno a otro en por al menos 10%, 2-10%
y máximo 2% respectivamente. Los genomas del Virus Papiloma bovino tipo 1
(VPB-1) y el VPH-1a fueron los primeros en ser secuenciados por completo (Chen
EY y cols. 1982 y Danos O y cols 1982). Esta familia fue separada recientemente de
la familia PAPOVA por el Comité Internacional sobre la Taxonomía de los Virus
(ICTV por sus siglas en inglés), (de Villiers EM y cols, 2004), terminando la relación
con los virus Polioma y SV40 (Simian Virus 40). Al menos 200 cepas de papiloma
virus humano han sido identificadas a la fecha, de las cuales más de 100 han sido
registradas en el Gene Bank, y son sujetos de muchos estudios intensivos porque
causan tumoraciones benignas y cancerosas.
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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Los papilomavirus infectan a animales vertebrados incluyendo a los mamíferos
(ejemplo: ganado vacuno, elefantes, humanos, ratones, monos y conejos) pájaros
(ejemplo: pinzón, pollos y pericos) y reptiles (ej. tortugas) (Marantz. 1994).
Los VPH infectan los queratinocitos de la membrana basal del epitelio y se replican
en el núcleo de una manera dependiente de la diferenciación. La expresión genética
viral en células infectadas depende de la diferenciación celular y está
estrechamente regulada en los niveles transcripcionales y post-transcripcionales.
Un rasgo significativo de todas las transcripciones de VPH es que estos virus son
transcritos como una forma bicistrónica o policistrónica que contiene dos o más
MAL’s y están poliadenilados (pA) en cualquier sitio, temprano o tardío (Zheng ZM y
Baker CC, 2006). Sin embargo, la expresión genética viral y la replicación procede
en una manera fuertemente controlada y regulada por la diferenciación del
queratinocito; éste mecanismo no está completamente comprendido, pero hay un
acuerdo general de que, en queratinocitos indiferenciados o medianamente
diferenciados, la expresión génica viral lleva a la expresión de 6 proteínas
regulatorias virales no estructurales (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) desde la región
temprana del genoma viral y dos proteínas estructurales virales de la cápside (L1 y
L2) de la región tardía del genoma, conduciendo a la diferenciación terminal. La
proteína E4 sigue siendo expresada en fase terminal en queratinocitos
diferenciados. E1 y E2 están implicados en la réplica de ADN viral y la regulación de
la transcripción temprana. E4 expresado en una infección productiva se asocia con
el colapso del filamento citoqueratínico. E5, E6, y E7 son oncogenes virales y su
expresión induce la transformación y la inmortalización de la célula. En particular,
E6 y E7 son dos oncoproteínas virales que inactivan, respectivamente, p53 y pRb,
dos proteínas celulares supresoras de tumores (Zheng ZM y Baker CC, 2006).
1.1.1. Morfología.
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Los VPH son partículas esféricas con cápsides hechas de 72 unidades morfológicas
(capsómeras). Todos están descubiertos y se multiplican en el núcleo de las células
infectadas. Tienen un genoma circular de ADN doble trenzado que se asocia con
histonas codificados del huésped en los viriones. Los VPH (∼55 nm de diámetro)
tienen un genoma de ∼8000 pb que codifica dos proteínas estructurales: la proteína
mayor de la cápside L1 (∼510 residuos de aminoácidos y ∼58kDa) y la proteína
menor L2 (∼470 a.a. y ∼51 kDa). Los capsómeros son protrusiones como hongos de
11 a 12 nm de diámetro, con cabezas pentaméricas en forma de estrella. Los
estudios de microscopía y la cristalografía de rayos X han mostrado que todos los
VPH conservan características comunes. Las 72 capsómeras son pentámeros de la
proteína mayor de la cápside y están arregladas en un enrejado icosaédrico T=7.
Doce pentámeros pentavalentes (cada uno rodeado por otros cinco capsómeras)
están centradas sobre el eje de cinco veces icosaedro y 60 pentámeros
hexavalentes (cada uno rodeado por otros seis capsómeros) están centradas sobre
vértices que descansan entre el eje de cinco veces (5-fold axes). (Zheng ZM and
Baker CC. 2006)
1.2. Genoma.
El genoma del papiloma virus consiste de ADN circular de tamaño ∼8 kpb asociado
con histonas celulares para formar una sustancia parecida a la cromatina. Se han
secuenciado al menos 100 genomas de VPH diferentes (y parece que se
adicionarán otros tipos conforme se vayan clonando y secuenciando otros genomas
de VPH) y la organización genética de todos es similar.
El ADN del VPH puede ser dividido, en general, en tres regiones principales:
temprano, tardío, y una región larga de control (LCR por sus siglas en inglés o
región de no codificación [NCR]). Las tres regiones en todo el virus papiloma son
separadas por dos sitios pA: sitios pA temprano (AE) y pA tardío (AL). La región
temprana ocupa más del 50 % del genoma viral desde su mitad 5’ y codifica seis
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MAL’s (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) (Danos O y cols. 1982) que traduce proteínas
individuales como se ha descrito anteriormente. Dos otros MAL’s, E3 y E8, al
principio también fueron asignados a esta región, pero sólo el MAL de E8 en BPV-1
(Lambert PF y cols. 1987. Hubbert NL y cols. 1988. Choe J y cols.1989) y HPV-31
(Stubenrauch F y cols. 2000. Stubenrauch F y cols. 2001) se han comprobado que
codifican una proteína, proteína de fusión empalmada E8^E2C, que funciona como
un regulador negativo de transcripción y replicación viral.
El genoma se replica como episoma (plásmido nuclear multicopiado); se
involucran dos mecanismos para la replicación:
a) Replicación del plásmido: acontece en células de niveles inferiores de la
dermis. Inicialmente, el ADN viral se amplifica de 50-400 copias diploides del
genoma. Después, se replica una vez por cada división celular; el número de
copias por célula permanece constante. La proteína E1 está involucrada en
esta fase de replicación.
b) Replicación vegetativa: ocurre en células bien diferenciadas en la
epidermis. En éstas (o en células en cultivos con detención de crecimiento)
el número de copias control parece estar perdido y el ADN es amplificado un
número muy alto de veces.
El virus es albergado en células epidérmicas y cuando estas son abandonadas es
transmitido por el contacto directo (verrugas, en particular, genitales) y el contacto
indirecto.
1.3. Características moleculares del VPH.
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LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Figura 2. Estructura Genómica del VPH (tomado de National Institutes of Health)
Las partículas virales están compuestas por una cápside proteica, conformada en
un 95% por la proteína L1 y en un 5% por la proteína L2, las cuales se ensamblan
para formar capsómeros heicosaédricos. Hacia el interior de la cápside se
encuentra un DNA circular de doble cadena de aproximadamente 8000 pares de
bases, constituido por ocho genes y una región regulatoria no codificante la cual
contiene sitios de unión para factores proteicos y hormonales del hospedero
necesarios para que el virus pueda completar su ciclo de replicación (Zheng and
Baker. 2006). Los VPH no producen ARNm monocistrónico sino que usan una
forma muy económica de expresar sus genes desde un genoma muy compacto y
los transcritos resultantes son o bicistrónicos o policistrónicos, con MAL’s múltiples
en un único mensaje. Irónicamente, ni siquiera se sabe en la mayoría de los casos,
cuáles transcritos son verdaderos ARNm usados para la traducción proteínica
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Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
durante la infección (Zheng and Baker. 2006). Los VPH han desarrollado
mecanismos complejos para regular el empalme de pre-ARNm individual de una
manera celular específica de diferenciación como se evidencia por la presencia de
múltiples elementos cis- regulatorios en cada especie de pre-ARNm. En los VPHAR, muchos MAL’s importantes, incluyendo E6, E1 y L2, lleva un intrón en sus
regiones de codificación; empalmando del intrón individual, romperá el MAL y
anulará la producción de la proteína completa. La regulación post-transcripcional de
la expresión génica del PVH está fuertemente acoplado a la diferenciación celular.
Esto podría ser atribuible a la participación de factores celulares asociados a la
diferenciación y algunas proteínas virales. La optimización del codón podría causar
la interrupción de elementos negativos o la generación de elementos positivos
reguladores en un ARN. Además, la optimización del codón podría interrumpir los
sitios de unión de microARNs específico de diferenciación, abundantes diminutas
moléculas de ARN (22-nts en el tamaño) recientemente descubierto para estar
implicado en la regulación de un gran número de transcripciones en el nivel de
translación (Zamore PD, Haley B. 2005; Alvarez-Garcia I, Miska EA. 2005).
1.3.1. Conformación del VPH.
El genoma del VPH, lo conforman dos tipos de genes, aquellos que son codificados
en las etapas tempranas de la infección, conocidos como genes E (del inglés Early
= temprano), y aquellos que son codificados durante las etapas tardías del ciclo
replicativo del mismo, conocidos como L (del inglés Late = tardío). Se conocen seis
genes tempranos: E1, E2, E4, E5, E6 y E7 (aunque se considera que E4 es en
realidad un gen tardío), y dos tardíos: L1 y L2. Los genes tempranos codifican
proteínas involucradas en la replicación y regulación viral, así como en su
capacidad carcinogénica. Por otro lado los genes tardíos codifican las proteínas
estructurales que conforman la cápside viral.
La región larga de control (LCR) de los papilomavirus, a veces llamado región
reguladora corriente arriba (URR upstream regulatory region) o región de no
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codificación (NCR), es un segmento genómico, sin Marco Abierto de Lectura
principal (MAL), que contiene un gran número de elementos sensibles a cis- que
gobiernan la expresión y la replicación génica. Su tamaño varía en diferentes VPH’s
aproximadamente del 7 a 11 % del genoma total, formado por aproximadamente
850 pares de bases en el caso de VPH genital, y está colocado entre el final del L1
y el principio del gen E6.
Figura 3. Región amplificada del LCR del VPH en este trabajo. (Editada desde figura tomada de
National Institutes of Health)
La Región Larga de Control operacionalmente está definida como la región de la
terminación del gen L1 a la primera metionina del gen E6 (algunos autores usan el
principio del gen E6). El LCR es la región menos conservada entre papilomas. Esta
contiene al promotor temprano y varios motivos transcriptionales reguladores
incluyendo aquellos de la familia AP-1, YY1, NF-1/CTF, Octa, TEF-2 y Sp1 y los
sitios obligatorios para el regulador viral E2 codificado. El origen de réplica (ori)
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también está localizado dentro del LCR, normalmente centrado entre dos E2 que
une los sitios (http://cinvestav.mx/genetica/MyFiles/Papillomavirus/PAPgeno.htm#LCR).
El ciclo de replicación de los VPH está estrechamente ligado al crecimiento y
diferenciación de las células epiteliales hospederas. El VPH inicia su ciclo
productivo infectando a las células poco diferenciadas de las capas basales del
epitelio, donde inicia la transcripción de sus genes. La forma en que el VPH alcanza
las células de los estratos bajos del epitelio es a través de lesiones, micro-heridas y
abrasiones del tejido.
El VPH exhibe un alto grado de tropismo por el epitelio escamoso en diferentes
regiones corporales. Los tipos virales que inducen lesiones anogenitales se
encuentran solamente en la región genital, mientras que los tipos asociados con
verrugas cutáneas en manos y pies se encuentran restringidos a dichas áreas. Es
posible que las diferencias en la distribución de los receptores para el VPH en
dichas células sea un factor importante para la presencia restringida de tipos
específicos de VPH, sin embrago los elementos más importantes que determinan la
especificidad de los virus son los factores de transcripción producidos por las
células hospederas.
1.4. Mecanismo molecular de malignización mediada por VPH.
El VPH es capaz de transformar las células que infecta mediante la acción directa
de los productos de dos de sus genes tempranos: E6 y E7. Las proteínas E6 y E7
de los VPH de alto riesgo son capaces de interaccionar con moléculas importantes
para la regulación del crecimiento y replicación celular, así como para la reparación
de daños sufridos por el DNA de las células sanas.
La proteína E6 de los VPH de alto riesgo se une con alta afinidad a la molécula
conocida como p53, induciendo su degradación. La proteína p53 es un importante
factor regulador de la replicación celular y es conocido como el principal represor de
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tumores en el ser humano, p53 es capaz de detectar daños sufridos en el DNA en
cualquier célula del organismo. Si el daño ha sido en una etapa del ciclo celular en
la que aún no ha ocurrido la replicación del DNA, p53 envía una señal para que el
ciclo celular se pare y el daño sea reparado, una vez ocurrida la reparación la célula
continúa su ciclo normal. Cuando el daño es sufrido durante o inmediatamente
después de la replicación del DNA, p53 envía una señal para detener el ciclo
celular, y como a este nivel es imposible reparar los daños, la célula sufre un
proceso de eliminación por apoptosis orquestado por la misma p53. Con esto no se
permite que los daños causados al DNA sean heredados a células hijas que
pueden, eventualmente, ser el origen de un tumor maligno.
Una alta proporción de cánceres humanos demuestra tener daños en el gen que
codifica la proteína p53, el cáncer de cérvix es una excepción, ya que en este caso
el gen se encuentra intacto pero la proteína no se encuentra presente en las células
infectadas por VPH, ya que E6 se ha encargado de eliminarla. De esta manera la
célula queda desprotegida y los tumores se desarrollan cuando el número de
mutaciones desfavorables aumenta y a la par, se incrementa la malignidad de las
células.
Por otra parte, la proteína E7 se une específicamente al producto del gen represor
de tumores Rb. Rb fue descubierto y caracterizado en el retinoblastoma, es un
factor regulador del ciclo celular, ya que se une directamente al factor
transcripcional E2F, que a su vez induce la transcripción de elementos involucrados
con la replicación celular. La proteína E7 de los VPH de alto riesgo tiene una alta
afinidad por el sitio de unión de Rb a E2F, cuando la célula ha sido infectada por el
virus, la proteína E7 se une a este sitio en Rb impidiendo que éste mantenga
controlado a E2F, el cual queda libre e induce la replicación celular continua. De
esta manera E6 y E7 cooperan eficientemente en la transformación de las células,
produciendo tumores cervicales a largo plazo.
La mayoría de las infecciones por VPH desaparecen después de algunos meses
posteriores al diagnóstico. El período de incubación luego de la exposición varía
entre tres semanas a ocho meses. Un porcentaje importante de estas infecciones
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
son transitorias y desaparecen espontáneamente dentro de los dos años del
contagio. Las infecciones persistentes, sobre todo si están acompañadas de otros
factores de riesgo, tienen un rol muy importante en la aparición de lesiones
malignas de la mucosa genital. Las infecciones causadas por el VPH-AR pueden
ser detectadas en 10 a 16% de mujeres sanas sin evidencia de lesiones cervicales
clínicas o citológicas. (Lazcano-Ponce. 2001, Lizano. 2005)
1.4.1. Carga Viral.
En una investigación realizada por Ylitalo y col., 2000, mencionó que entre los
casos que tenían una
alta carga viral (HPV-16), la probabilidad de desarrollar
carcinoma cervical in situ, aumentó el 22.7%, desde el primer extendido realizado
hasta después de 15 años. En las pacientes con una carga viral media, en el primer
extendido, la probabilidad de desarrollar carcinoma in situ aumenta a 6.6% después
de 15 años. Y el tiempo de incubación estimado desde la primera confirmación de
infección por VPH y el diagnóstico de cáncer fue de 17 años para las pacientes con
alta carga viral y de 19 años para las pacientes con carga intermedia. En mujeres
con citología anormal mostrando lesiones escamosas atípicas o LEIB, la carga viral
de VPH-AR estuvo asociada significativamente al diagnóstico de LIEA (FerreiraSantos y col. 2003). A pesar del grado de LIE el número promedio de copias por
célula de VPH-AR no fue significativamente diferente en los casos de LIEB y LIEA
pero hubo un amplio rango de valores de carga viral de muchas magnitudes
(Andersson y col. 2005)
1.4.2. Variantes.
Una variante se define como diferencia en la secuencia genómica de 1-5% y es bien
conocido que en los diferentes tipos de VPH ocurren numerosas formas de
variantes, aunque por definición, las diferencias entre los tipos de VPH están en al
menos 10% de la secuencia nucleotídica. Las variantes del VPH difieren por menos
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del 2% en la secuencia nucleotídica de L1, pero ligeramente más en la región larga
de control (LCR), la cual, por no codificar genes, está menos restringida a producir
mutaciones viables (Stewart AC y cols. 1996. Yamada T y cols. 1997). Análisis de
algunos genes críticamente relacionados con la regulación celular y viral del VPH16, han mostrado variaciones de la secuencia intratipo que pueden alterar sus
propiedades biológicas. (Lizano, 2005). Además, la variación de la secuencia de
nucleótidos se usa como una herramienta importante para estudios epidemiológicos
de transmisión y persitencia del VPH (Franco y col., 2002). La variación intratipo del
VPH-16 también ha mostrado ser un factor predictor
de progresión importante
hacia lesiones cervicales relevantes (Xi y col., 1997). Luisa Lina Villa y col. (2000)
refiere que la neoplasia cervical está asociada preferentemente a variantes
moleculares del VPH 16 y 18.
1.5. Patología del VPH.
Como su nombre lo indica, los VPH inducen la formación de papilomas, que en su
mayoría son crecimientos benignos fácilmente controlables. Sin embargo los VPH
de alto riesgo que infectan el tracto genital están asociados con el desarrollo del
cáncer cervical, que es uno de los tipos de cáncer que con mayor frecuencia afecta
a la población femenina de nuestro país.
Los VPH genitales son un agente de transmisión sexual que infectan el epitelio del
tracto genital bajo, produciendo verrugas y papilomas. El proceso neoplásico
asociado con el VPH no se limita al epitelio escamoso, sino que también está
involucrado con el desarrollo de lesiones de células columnares. La infección por
VPH produce cambios importantes en la morfología celular, por ejemplo se observa
la formación de una amplia vacuola perinuclear, el núcleo agrandado, irregular e
hipercrómico, además de ser posible encontrar binucleaciones. Las células que han
sufrido esta serie de cambios son conocidas como koilocitos y son consideradas
como la "huella digital" del VPH. (Gearhart y Randall, 2006)
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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1.5.1. Histopatología.
La manifestación histopatológica más común de la infección por VPH es la verruga
genital (condyloma acuminatum). Las verrugas genitales son comúnmente múltiples
y ocurren con frecuencia en la vulva, extendiéndose hacia el portio vaginalis y el
cérvix, produciendo lesiones filiformes pedunculadas que pueden coalescer
produciendo masas similares a tumores. La verruga es esencialmente una
hiperplasia epitelial benigna con acantosis y papilomatosis considerables. Sin
embargo, la infección por VPH no siempre produce la formación de la lesión papilar
típica, también puede producir lesiones conocidas como condiloma plano, que
comparten las mismas características citológicas del condiloma acuminado, pero no
se alzan sobre la superficie adyacente, por lo que no son visibles a simple vista.
Nosotros sabemos que el Papilomavirus es transmitido por vía sexual, pero en el
proceso de carcinogénesis se involucran otros factores que facilitan la transmisión
(como el inicio a temprana edad de la actividad sexual y los múltiples compañeros
sexuales) o factores que determinen el curso natural de la infección con el abuso
del
tabaco,
anticonceptivos
hormonales,
deficiencias
alimenticias,
estrés,
deficiencias inmunológicas, etc. (Cortés y Rojas. 1995).
Algunos tipos de virus de papiloma humano se conocen como virus de "bajo riesgo"
porque raramente se convierten en cáncer; éstos incluyen los VPH-6 y VPH-11. Los
tipos de virus de papiloma humano que pueden llevar al desarrollo de cáncer se
conocen como "tipos asociados con el cáncer". “Los tipos de virus más importantes
de papiloma humano, transmitidos sexualmente, asociados con el cáncer en
mujeres incluyen los VPH-16, VPH-18, VPH-31.” (National Cancer Institute. 2005).
Estos tipos de virus de papiloma humano asociados con el cáncer causan
crecimientos que normalmente parecen planos y son casi invisibles, comparados
con las verrugas causadas por los HPV-6 y HPV-11.
1.6. VIRUS PAPILOMA HUMANO tipo 18 (VPH-18).
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El genoma del VPH-18 que consta de 7857 pb (Ver Anexo 6) fue originalmente
obtenido y clonado por S.T. Cole y O. Danos en 1987, de una muestra de una
paciente brasileña con carcinoma de cérvix. Baker C.C. describió en 1993 una
revisión en la secuencia en los nucleótidos 2855 a 2860 quedando de “TTGCGT” a
“TGCGTT”. El MAL de E7 está situado inmediatamente enfrente de E1, una
característica común a todos los papilomavirus de la zona genital secuenciados en
el tiempo de la publicación. Mientras en los otros subgrupos, E7 está en uno de los
otros MAL. El genoma del VPH-18 codifica un producto hidrofóbico del gen E5. El
aislado brasileño es la clona de referencia y parece ser una representación de la
variante Americana-India. La LCR de la variante Europea difiere de ésta clona por
mutaciones en las posiciones 7529, 7567, 7592 y 7670, y de la variante Africana por
cambios adicionales en 10 nucleótidos, en un segmento de 320 pares de base (Ong
CK y cols. 1993). La diferencia máxima entre cualquiera de dos variantes es de
7.3% (Calleja-Macías I, y cols. 2004).
El VPH-18 pertenece al Grupo C del árbol filogenético al cual pertenecen también
los siguientes tipos:
•
VPH-39;
•
VPH-45;
•
VPH-59;
•
VPH-68ME180;
•
VPH-CP141;
•
VPH-AE1 y
•
VPH-LVX160.
24
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Los demás grupos están conformados como sigue (Fig. 4):
•
Grupo A: VPH 16, 31, 33,35, 35h, 52, 58, 67
•
Grupo B: VPH 6b, 11, 13, 34, 44, 55, 64, MM9
•
Grupo D: VPH 26, 30, 51, 53, 56, 66, 69, ISO39, L1AE2, MM4
•
Grupo E: VPH 61, 62, CP4173, CP6108, CP8304, LVX82, MM7, MM8
•
Grupo F: VPH 2a, 3, 7, 10, 27, 28, 29, 32, 40, 42, 43, 54, 57, CP8061
•
Grupo G: VPH 1a, 4, 41, 63, 65
•
Grupo H: VPH 5, 5b, 5d, 8, 9, 12, 14d, 15, 17, 19, 20, 21, 25, 47, 49, y
•
Grupo I: Virus Animales COPV, CRPV, EEPV, DPV, BPV1, 2, 4, PCPV1,
MnPV, RhPV1.
La comparación de las distancias evolutivas para la mayoría de los tipos
cercanamente relacionados con 28 subtipos y variantes del VPH-2, VPH-5,VPH-6,
VPH-16 y VPH-18 apoyan el tipo como una unidad taxonómica natural con subtipos
y variantes que son expresiones de diversidad genómica intratipo menor similar a la
encontrada en las poblaciones naturales de todas las especies biológicas (Chan SY
y cols. 1992).
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Fig. 4 Árbol Filogenético del Virus Papiloma Humano
Tomado de: The Human Papillomavirus Compendium OnLine
Los VPH que se consideran paradigmas son el tipo 16 y el 18 que son de particular
interés por estar asociados al cáncer genital y por lo tanto están clasificados como
de “alto riesgo” (VPH-AR) (Munoz N y cols. 2003). Los VPH 16 y 18 pertenecen al
grupo A y C respectivamente los cuales forman cada uno, junto con otros tipos de
VPH, dos ramas filogenéticas separadas, las cuales actualmente son llamadas
“especies” (de Villiers EM y cols. 2004). Una tercera rama ó especie de VPH’s de
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AR es la D de la cual se considera potencialmente oncogénicos a los tipos 30, 53,
56 y 66. (Prado JC y cols. 2005).
El rol etiológico de los VPH 16 y 18 en la carcinogénesis, está apoyado en sus
propiedades de inmortalización de líneas celulares epiteliales in vitro. Pueden
inmortalizar queratinocitos humanos en cultivo primario, resultando una resistencia
al estímulo de la diferenciación terminal (Romanczuk H y cols. 1991). El ADN del
VPH-18 es más eficiente que el VPH-16 en la inmortalización de células epiteliales
(Barbosa M y Schlegel R. 1989. Schlegel R y cols. 1988. Villa LL y Schlegel R.
1991) suministrando así apoyo experimental a la sugerencia de que el VPH-18 se
comporta más agresivamente in vivo. Los genes E6 y E7 de los VPH 16 y 18,
juntos, son necesarios y suficientes para la eficiente inmortalización de células
epiteliales escamosas humanas (Hawley-Nelson P y cols. 1989. Hudson JB y cols.
1990. Kaur P y cols. 1989. Münger K y cols. 1989). Fragmentos subgenómicos
conteniendo las regiones largas de control (LCR’s) de VPH-16 ó VPH-18 y los
genes E6 y E7 inmortalizan las células con diferente grado de eficiencia, semejando
las funciones de los respectivos genomas completos (Villa LL y Schlegel R. 1991).
Pero, el VPH-18 es aproximadamente 10 a 50 veces más eficiente que el VPH-16
en su potencial inmortalizador (Barbosa M y Schlegel R. 1989. Schlegel R y cols.
1988. Villa LL y Schlegel R. 1991). Esta diferencia observada no se puede contar
para únicamente los genes E6 y E7 por sí solos; es posible, sin embargo, que hay
otros
componentes
de
los
transcripcionales regulatorios
genomas
virales
además
de
los
elementos
de LCR y los genes virales transformadores, los
cuales pueden afectar la eficiencia de inmortalización de los genomas virales que
permanecen en investigación (Romanczuk H y cols. 1991). Otra característica
específica del VPH-18 publicada en 1999 (Harris SF y Botchan MR) es que la
proteína E2 regula la transcripción viral y la réplica de ADN por interacciones con
proteínas celulares y virales. El dominio de activación amino-terminal, que
representa una clase de proteína cuyos temas estructurales son mal entendidos,
contiene los residuos claves que median estos contactos funcionales. En el dominio
de activación de la región E2, tiene una estructura de corazón cristaloide resistente
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a la proteasa que revela un novedoso pliegue que crea una forma de castaña con
una hélice alfa rica en glutamina embalada contra un marco de hoja beta. La
superficie de la proteína muestra el traslape extenso de determinantes para la
replicación y transcripción. Esta estructura amplía el concepto de activadores para
incluir proteínas con estructuras potencialmente maleables, pero ciertamente
ordenadas. Los experimentos de Bellanger S y cols., (2001) mostraron que la
proteína E2 del HPV18 fue degradada por la vía del dominio de la enzima ubiquitinproteasoma mediante la transactivación amino-terminal. La estrecha regulación de
la estabilidad de la proteína E2 del HPV-18 puede ser esencial para evitar la
acumulación de un potente represor transcriptional y el agente antiproliferativo
durante el ciclo viral vegetativo. Badal S y cols. (2004) reportan la metilación
frecuente de genomas de HPV-18 en cultivos celulares y en situ. Es generalmente
conocido que la metilación de ADN conduce a la represión transcriptional debido a
cambios en la cromatina.
De la Cruz-Hernández y cols. (2005) publicaron un empalme diferencial de la
región E6 de las diferentes variantes del VPH-18 investigando los mecanismos
moleculares que subyacen en la diferencia de los cambios en la transcripción
temprana del gene y muestran, sin duda, que las variantes del VPH-18 exhibieron
diferencias únicas en los transcriptos de E6 in vivo. Compararon los niveles de
transcritos de E6 de la variante Asiática-Amerindia contra Africana encontrando
menores niveles de p53 en AA que afectaron los niveles de proteínas celulares
reguladas por ésta, por ejemplo, Bax. Como consecuencia directa, se encontraron
niveles mayores p53 en la presencia de E6 Africana; se observaron cambios
similares en los niveles relativos de transcriptos de E6 cuando se analizaron
tumores conteniendo variantes de E6 de VPH-18. La habilidad para formar tumores
en ratones desnudos fue considerablemente mayor cuando las células expresaron
E6 AA. Un análisis de mutagénesis de la clona AA mostró que el cambio C491 A
revierte el fenotipo, sugiriendo que los diferentes patrones de empalme de E6
dentro de las variantes del VPH-18 pueden tener implicaciones biológicas en la
tumorigénesis viral.
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1.6.1. Región Larga de Control del VPH-18 (Long Control Region: LCR)
La LCR del VPH-18 puede ser analizada en tres secciones. El Segmento 1 es un
área rica en purina+timidina, la cual contiene la señal de poliadenilación para los
genes tardíos. El Segmento 2 que es de cerca de 200 pb de largo y solamente
aparece en los VPH genitálicos. El Tercer segmento es el mejor conservado entre
todos los PVH. Contiene tres palíndromes VPH-específicos y cajas TATA y CAAT;
los VPH genitálicos tienen una caja TATA. La región LCR es hipervariable, así
teóricamente facilita la detección de una diversidad mayor de variantes que cuando
se analizan genes mejor conservados (Bernard y col., 1994).
1.6.2. Epidemiología de las Variantes del VPH-18.
Aún no hay estudios claros de si las variantes en el VPH 18 tiene que ver con el
amplio espectro de patologías que existen en CaCU, pero sí se conoce que el VPH
16 predomina en los tumores escamosos mientras que el 18 en otros tipos como los
adenocarcinomas (Lizano y col. 1997). No está bien establecido que tanto de tales
diferencias cuantitativas en la diversidad entre tipos de VPH contribuyen a las
diferencias geográficas del CaCU (Calleja-Macías, 2004).
Pocas diferencias nucleotídicas encontradas en las variantes del VPH corresponden
a cambios en los aminoácidos. Sin embargo, es de gran interés definir las
alteraciones que puedan interferir con las propiedades funcionales o antigénicas de
proteínas virales específicas. En los años pasados recientes, se ha propuesto que
variaciones genómicas mínimas dentro de un dado tipo oncogénico del VPH estén
implicadas en las diferencias observadas en el comportamiento de lesiones
premalignas. Algunos estudios proponen que variantes intratípicas del VPH pueda
conferir niveles de riesgo diferenciales para el cáncer cervical (Bernard HU y cols.
1994. Xi LF y cols. 1997. Zehbe I y cols. 1998. Hildesheim A y cols. 2001). Se ha
sugerido que cierto tipo de variantes de VPH-18 principalmente las encontradas en
lesiones premalignas, pueden representar aislados con el potencial oncogénico
29
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
disminuido (Hecht JL y cols. 1995). La incidencia de CaCU es mucho mayor en
países africanos y Latinoamericanos que en Europa y Norteamérica. Hay dudas
acerca de que los siguientes parámetros expliquen todas las diferencias en las
tasas de CaCU entre estos países en desarrollo y desarrollados: el programa
preventivo no se lleve a cabo o que sea tan ineficaz; la falta de acceso a los
servicios de salud; la multiparidad y la malnutrición. También es importante resaltar
que las variantes no Europeas (Africana y AsiáticaAmerindia) del VPH 18
incrementan el potencial oncogénico y esto puede representar un factor adicional
contribuyente a la carga desproporcionadamente alta de CaCU en poblaciones en
desarrollo en las diferentes regiones del mundo. (Villa, 2000).
2. Lesiones Intraepiteliales o Precursoras y Cáncer Cervico-Uterino.
2.1. Etiología.
El Cáncer Cérvico-Uterino (CaCU) es una patología de etiología multifactorial.
Dentro de los factores de riesgo más involucrados son el inicio temprano de
relaciones sexuales, número de parejas, uso de anticonceptivos orales, deficiencia
de ciertas vitaminas, tabaquismo y las infecciones virales de tracto genitourinario. El
principal virus asociado al CaCU es el virus del papiloma humano (VPH). Alrededor
de 200 tipos de VPH se han identificado a la fecha y más de 35 se asocian a
afecciones anogenitales (De la Cruz-Hernández y col. 2005) subclasificándose de
acuerdo a su relación con CaCU y lesiones intraepiteliales de alto (LIEA) y de bajo
(LIEB) grado en:
1) De bajo riesgo: tipos 6, 11, 42, 43, 53 y 55, se asocian principalmente a
condilomas y LIEB;
2) De alto riesgo: tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 que se
encuentran en 93% de la LIEA y de los CaCU (Ferenczy y Franco . 2002);
30
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
3) De riesgo intermedio: tipos 30, 32, y 66, se asocian a ambos grados de LIE y
ocasionalmente a cáncer (Vargas, 1996).
La asociación entre VPH y LIE/CaCU está bien establecida (Zur Hausen, 2002). Las
técnicas moleculares ofrecen una mayor sensibilidad y especificidad para el
diagnóstico para VPH. Las mujeres positivas a VPH por medio de reacción en
cadena de la polimerasa (RCP) tuvieron 3.8 veces más riesgo de presentar lesiones
intra-epiteliales de bajo grado de malignidad y un riesgo de 12.7 veces más de
desarrollar lesiones de alto grado de malignidad (Liaw, 1999); el VPH se asocia a
LIE 10 veces más que en grupos controles; la citología negativa a VPH pero con
ADN positivo demostró 11 veces más riesgo de desarrollar LIEA en los próximos
dos a tres años; las mujeres con VPH tipos 16 y/o 18 tienen aún más riesgo que
aquellas con VPH de mediano o bajo riesgo de desarrollar CaCU a partir de una
LIE. Tirado-Gómez y col., 2005 encontraron que la presencia de VPH alto riesgo
incrementa en 78 veces la probabilidad de presentar CaCU invasor; si el virus
detectado es tipo 16 la razón de momios (RM) sube a 429.7; cuando el virus es de
alto riesgo diferente al tipo 16 el riesgo se disminuye a 64.1.
Se considera que el 2% de todas las mujeres en edad fértil con actividad
sexual tienen VPH y el 30% de ellas están infectadas; alrededor de 25 a 65% de
las personas que han tenido contacto sexual con personas infectadas la adquieren.
La edad más frecuente de la infección es entre los 16 y 25 años, con predominio en
las mujeres blancas sobre las negras (2:1). El intervalo entre la exposición y
manifestaciones clínicas es entre tres semanas a ocho meses. Una tercera parte
permanecerá con la infección, en otra cederá sola la infección, y en el resto la
infección estará en un estado latente, por lo tanto este comportamiento está
relacionado con otros factores. (Tamayo, 2002).
Por lo que factores demográficos, sociales u otros agentes biológicos están
implicados en los múltiples estadios de progresión de la infección viral a cáncer.
Dentro de estos últimos puede ser el factor viral en donde se propone que ciertas
31
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
variantes de VPH están implicadas en las diferencias observadas en la historia
natural y el comportamiento clínico de CaCU y LIE. En población mexicana se ha
observado la presencia de tres aislados de VPH 18 denominados Var-1, Var-2 y
referencia. También hay una asociación aparentemente exclusiva entre la Var-2 y
tumores de células escamosas, los cuales presentan mejor pronóstico que el
adenocarcinoma y el carcinoma de células pequeñas, en los cuales se ha aislado
solamente la clona de referencia y la Var-1 (De la Cruz-Hernández , 2002).
2.2. Epidemiología.
El CaCU (y LIE) es una patología de gran importancia en salud pública a nivel
mundial ya que es la segunda causa de muerte, superada sólo por el cáncer
mamario en la población adulta femenina (Mohar, 2006) y es la enfermedad
neoplásica más frecuente en la población femenina en los países en vías de
desarrollo. Se estima según datos en 2004 de la Organización Mundial de la Salud
que 500 000 mujeres de todo el mundo la desarrollan anualmente, de las cuales el
45% fallecen (World Health Organization, 2004). En México, el CaCU ocupa el
segundo lugar de muerte en la población general y el primero en mujeres mayores
de 25 años de edad y equivale al 20% de los padecimientos oncológicos en mujeres
en el Instituto Nacional de Cancerología (De la Garza, 2006). En el estado de
Colima la Secretaría de Salud en 2005 diagnosticó por citología 803 casos de
displasia, 36 de las cuales fueron severas; y 30 casos de CaCU. Por diagnóstico
Colposcópico e Histopatológico confirmado se reportaron en la misma fecha 311
casos de LIE-CaCU: 237 LIEB; 54 LIEA; 15 CIS; 1 CaCU-M; 4 CaCU-I. Nuestro
estado ocupó en 2004 (Salud Méx. 2004) el primer lugar de mortalidad por CaCU en
el país, con una tasa de 38.5 por 100,000 superior a la media nacional que fue de
20.7 tanto en población femenina mayor de 25 años, como en tasa de mortalidad en
población general, siendo la edad más afectada tanto para CaCU como para el
desarrollo de LIEs la de 25 a 44 años de edad. Por ello la Norma Oficial Mexicana
NOM-014-SSA2-1994 concibe como principal finalidad lograr la reducción de la
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
morbi-mortalidad por CaCU.
La aplicación de campañas masivas de detección temprana de CaCU, junto con los
avances terapéuticos, ha permitido en las últimas dos décadas una disminución
notable en la incidencia y mortalidad de este padecimiento en los países
desarrollados, pero aún así continúa siendo un campo de investigación primordial,
lo que hace necesario un diagnóstico temprano y preciso de factores de riesgo
adicional involucrados en el desarrollo de dicha patología, ya que la consulta por
este padecimiento en los hospitales participantes representa casi la totalidad de la
consulta de la clínica de displasia y también es de consideración en el servicio de
urgencias. Por otro lado el costo de manejo de paciente con esta patología
representa un alto porcentaje del gasto total hospitalario, lo que hace necesaria la
implementación de medidas que disminuyan la morbi-mortalidad del CaCU lo que
repercutiría en disminuir el número de consulta a nivel de especialidad y urgencia,
así como los costos de atención en hospitales de 2do y 3er nivel. (Tirado-Gómez,
2005).
2.3. ETAPAS DE LESIONES INTRAEPITELIALES y CÁNCER CERVICOUTERINO
2.3.1. Conceptos precursores.
En 1910, Rubin (New York, USA) habla de cáncer incipiente para nominar el
concepto de transformación neoplásica confinada al espesor del epitelio. En 1912,
Schottländer y Kermauner (Berlín, Germany) utilizan el término de carcinoma
temprano para designar los cambios que observaban en el epitelio adyacente al
carcinoma cervical invasor. Veinte años mas tarde, Broders (New York, USA),
basándose en su experiencia en Dermatopatología, emplea el término de carcinoma
in situ (CIS) al describir este cuadro histológico. Pese a la proliferación de estos y
otros muchos sinónimos, el término acuñado por Broders es el que ha permanecido
para designar estas lesiones caracterizadas por la completa sustitución del epitelio
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
por células anómalas semejantes a las células del carcinoma invasor. Es de resaltar
que, de forma paradójica, en el trabajo inicial del afortunado Broders no figuraba la
localización cervical dentro de los ejemplos de CIS.
En 1949, Papanicolaou introduce los términos de «displasia» en histopatología y
«discariosis» en citología para designar dichos cambios. Posteriormente, en 1953,
Reagan (Cleveland, USA) consagra el término en histopatología cervical al
denominar a estas lesiones, menos severas que el CIS, hiperplasias atípicas o
displasias, señalando que la mayoría de ellas, dejadas a su evolución, regresan o
permanecen inalteradas por mucho tiempo. Así pues, es Papanicolaou y no Reagan
el que introduce por primera vez el término «displasia» en patología cervical. En
1961, en el Primer Congreso Internacional de Citología celebrado en Viena, se
acuerda que los términos para designar citológicamente las tres lesiones cervicales
mayores sean: carcinoma invasor, carcinoma in situ y displasia. Esta última fue
graduada como leve, moderada, y severa o grave, a las que habría que añadir el
CIS ya definido. La clasificación, utilizada tanto en material histológico como
citológico, tuvo dos problemas fundamentales; por un lado, el gran desacuerdo
respecto a cuándo una lesión debía ser considerada displasia grave o CIS, y por
otro, el que muchos clínicos asumían que el CIS y la displasia eran dos lesiones
biológicamente distintas e independientes, con distinto potencial maligno, no
requiriendo tratamiento las lesiones displásicas.
34
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
AUTOR
CLASIFICACIÓN LESIONES PRECURSORAS
Papanicolaou
(1949)
R. Richart
(1967)
¿VPH?
Displasia
Leve
Displasia
Moderada
NORMAL
NIC I
NIC II
NORMAL
Displasia
Severa
°CIS
NIC III/CIS
VPH
Sistema
Bethesda
(1989)
NORMAL
*LIE-BG
+LIE AG
(incluye VPH)
Cuadro 1. Etapas de las lesiones precursoras y sus diferentes nomenclaturas. Modificado de LacruzPelea, 2003. (°Cáncer In Situ. *Lesión Intraepitelial de Bajo Grado. +Lesión Intraepitelial de Alto Grado)
Para solventar estos problemas Ralph M. Richart (Nueva York, USA), en 1967,
propuso el término de neoplasia intraepitelial cervical (NIC-CIN) con tres grados
progresivos (I, II, III), incluyéndose en el grado III la displasia grave y el CIS de la
clasificación anterior. La ventaja principal, sobre esta, es el reconocimiento de la
unidad del proceso patológico lo cual conlleva una relación con las técnicas
terapéuticas. Esta clasificación ha sido considerada bastante adecuada durante
más de 20 años y por lo tanto la más utilizada internacionalmente. No obstante, un
número creciente de publicaciones señalaron el hecho de la sorprendentemente
baja seguridad diagnóstica, tanto en material cito como histológico, en la parte
menos severa del espectro. Se sugirió, por lo tanto, que este sistema de gradación
debía ser modificado y sustituido por un sistema binario que segregara los procesos
con atipia celular muy discreta de aquellos con atipia franca (Lacruz-Pelea, 2003).
En el cuadro 1 se esquematizan las diferentes clasificaciones. En la figura 5 se
observa la esquematización de los cambios del epitelio cervical según el avance de
la lesión escamosa.
35
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Figura 5. Esquematización gráfica de la histopatología de la Neoplasia Intraepitelial.
(Fuente: www.stanford.edu)
2.3.2. Lesión Intraepitelial Escamosa (Bajo-Alto Grado)
Las razones anteriormente expuestas, junto con los avances en el conocimiento de
la carcinogénesis cervical y en el diagnóstico citológico, motivaron una reunión de
representantes de organismos internacionales, científicos y profesionales, en el NCI
de Estados Unidos en Bethesda (Maryland, USA). Fruto de dicha reunión fue un
nuevo sistema de nomenclatura para informes citológicos ginecológicos (Sistema o
Clasificación de Bethesda), en el que se unificaron criterios y se adoptaron
recomendaciones que la experiencia general acumulada aconsejaba. La parte
fundamental de esta nueva clasificación fue la elaboración de un sistema binario
para catalogar las anormalidades.
El termino «alto grado» incluye el NIC II y NIC III de la clasificación de Richardt, y el
termino «bajo grado» el NIC I y las alteraciones celulares producidas por
papilomavirus (PVH). Esta clasificación fue difundida en 1988, mínimamente
modificada en 1991, y actualizada recientemente en 2001(Bethesda, USA).
36
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Es preciso comentar aquí que el sistema Bethesda, aunque universalmente
conocido y ampliamente utilizado, no ha sido adoptado en todos los países. Así, en
Inglaterra, se sigue utilizando la nomenclatura «B.S.C.C».; en los países de habla
alemana, el «sistema Munich»; en Australia, una modificación del propio sistema
Bethesda. Etc. La Sociedad Española de Citología (SEC), consciente de la
necesidad de unificar criterios y considerando que son más las ventajas que aporta
que los inconvenientes que suscita, adoptó esta clasificación como su nomenclatura
oficial aconsejando su utilización a todos sus miembros. En México por la
Normatividad oficial se aplica la clasificación de Richardt de Neoplasia Intraepitlial
Cervical (NIC).
Aparte de los datos de identificación y de localización de la toma, la clasificación de
Bethesda en su versión de 2001 tiene los siguientes apartados por lo que respecta
a las lesiones cervicales (Solomon D, y cols., . 2002):
2.3.2.1. Negativo para lesiones intraepiteliales o malignidad (Se utiliza esta
categoría cuando no hay evidencia de neoplasia, independientemente de si se
observan, o no, microorganismos u otros hallazgos no neoplásicos).
2.3.2.2. ANOMALÍAS CELULARES EPITELIALES
2.3.2.2.1 EN CÉLULAS ESCAMOSAS
2.3.2.2.1.1 Células escamosas atípicas (ASC)
– de significado indeterminado (ASC-US)
– no puede excluirse LIEA (ASC-H)
2.3.2.2.1.2. Lesión intraepitelial escamosa de bajo grado (LIEB), comprendiendo:
– displasia leve/CIN 1
– PVH
2.3.2.2.1.3. Lesión intraepitelial escamosa de alto grado (LIEA), comprendiendo:
37
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
– displasia moderada, severa y CIS/CIN 2 y 3
– con características sugestivas de invasión (si se sospecha invasión)
2.3.2.2.1.4 Carcinoma epidermoide.
2.3.2.3. EN CÉLULAS GLANDULARES
2.3.2.3.1. Células glandulares atípicas (AGC)
– endocervicales (NOS o especificar en comentarios)
– endometriales (NOS o especificar en comentarios)
– glandulares (NOS o especificar en comentarios)
2.3.2.3.2. Células atípicas, sugestivas de neoplasia
– endocervicales
– glandulares
2.3.2.3.3. Adenocarcinoma endocervical in situ (AIS)
2.3.2.4. Adenocarcinoma
– endocervical
– endometrial
– extrauterino
– no específico (NOS)
El término «lesión» en lugar de «neoplasia», aunque etimológicamente es poco
específico (significa «cualquier daño»), es utilizado para resaltar el potencial
biológico incierto del proceso.
Otra de las aportaciones importantes del sistema Bethesda es el concepto de
«atípia escamosa» que en la reciente modificación de 2001 incluye los dos
apartados siguientes:
38
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
2.3.2.5. Atipia escamosa de significado indeterminado (ASC-US)
ASC-US son las siglas de «Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance»
ó células escamosas atípicas de significado indeterminado o incierto. El término fue
introducido para intentar acotar con más precisión la «zona gris» entre los cambios
celulares benignos y la lesión intraepitelial, por lo que la catalogación de un proceso
como ASCUS se realiza por exclusión. Es decir: los cambios observados pueden
deberse a un proceso benigno, pero intenso, o a una lesión potencialmente grave;
por lo tanto, y debido a que no pueden ser inequívocamente clasificados, son
interpretados como de significado indeterminado o incierto. Desde el punto de vista
morfológico, estos cambios deben ser más acusados que los de un proceso reactivo
pero, bien cuantitativamente o cualitativamente, insuficientes para clasificarlos con
seguridad como LIE. Como se puede deducir de la definición, esta categoría no es
reproducible y algunos autores piensan que es una invención norteamericana como
parte de una práctica citológica a la defensiva para evitar, en la medida de lo
posible, falsos negativos que puedan conllevar acciones legales. No obstante, se ha
comprobado que un 10-20% de casos de ASCUS corresponden realmente a una
lesión intraepitelial, incluso de alto grado, que no se ha puesto en evidencia en el
extendido citológico, por lo que eliminar el término no parece prudente. Todos estos
datos han sido contemplados en la versión 2001 de Bethesda en la que el término
ASCUS pasa a ser definido como «alteraciones citológicas sugestivas de una LIE
pero cuantitativamente y/o cualitativamente insuficientes para una interpretación
definitiva». Es decir, se elimina el ASCUS- probablemente reactivo, reservándose el
término únicamente para cuando exista sospecha de lesión intraepitelial. Como
consecuencia, no debe malograrse el interés práctico del mismo siendo
exageradamente utilizado. Como guía de frecuencia, se recomienda que no debiera
exceder en 2-3 veces la tasa de LIE de un laboratorio determinado (Association of
Directors of Anatomic and Surgical Pathology. 1989).
2.3.2.6. Atipia escamosa. No puede excluirse LIEA (ASC-H).
39
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Este término sustituye al previo «ASCUS-posible LIE». En él se recogen aquellos
casos en los que las alteraciones celulares son bastante acusadas pero, bien por
las características de la extensión (inflamación, hemorragia, etc.) o bien por la
escasez de estas células, no pueden considerarse totalmente conclusivas.
Como se comprueba también en el apartado de «anomalías celulares epiteliales»,
el término «AGUS» (células glandulares atípicas de significado indeterminado) de la
versión anterior, ha sido sustituido en la de 2001 por el de «células glandulares
atípicas» solamente, con ello desparece esta sigla de sonido gutural no demasiado
eufónico, lo cual es un motivo de satisfacción, evitándose su confusión con ASCUS
(Lacruz-Pelea, 2003)
2.4
ESTADIFICACÍON
HISTOPATOLÓGICA
Y
CLÍNICA
DEL
CÁNCER
CERVICOUTERINO (Hill EC. 1993).
2.4.1. Carcinoma in situ: De acuerdo con la definición de la OMS, es una lesión en
la que todo el epitelio o la mayor parte de él muestra el aspecto celular de
carcinoma. No hay invasión del estroma subyacente.
2.4.2. Carcinoma micro invasor del cuello uterino: 1 a 1 invasión mínima al estroma
no mayor a 1 mm., 1 a 2 invasión al estroma menor de 5 mm. y con una extensión
horizontal no mayor de 7 mm.
2.4.3. Carcinoma Invasor: toda extensión histopatológica de las células malignas
mayor de 7 mm.
40
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
2.4.4. Estadificación Clínica:
2.4.4.1. Etapa 0 o carcinoma in situ
El carcinoma in situ es un cáncer en su etapa inicial. Las células anormales
se encuentran sólo en la primera capa de células que recubren el cuello uterino y no
invaden los tejido más profundos del cuello uterino.
2.4.4.2. Etapa I
El cáncer afecta el cuello uterino, pero no se ha diseminado a los
alrededores.
2.4.4.2.1. Etapa IA: una cantidad muy pequeña de cáncer que sólo es visible
a través del microscopio se encuentra en el tejido más profundo del cuello
uterino
2.4.4.2.2. Etapa IB: una cantidad mayor de cáncer se encuentra en el tejido
del cuello uterino.
2.4.4.3. Etapa II
El cáncer se ha diseminado a regiones cercanas, pero aún se encuentra en
la región pélvica.
2.3.4.3.1. Etapa IIA: el cáncer se ha diseminado fuera del cuello uterino a los
dos tercios superiores de la vagina.
2.3.4.3.2. Etapa IIB: el cáncer se ha diseminado al tejido alrededor del cuello
uterino.
2.4.4.4. Etapa III
El cáncer se ha diseminado a toda la región pélvica. Las células cancerosas
pueden haberse diseminado a la parte inferior de la vagina. Las células también
pueden haberse diseminado para bloquear los uréteres que conectan los riñones a
la vejiga.
41
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
2.4.4.5. Etapa IV
El cáncer se ha diseminado a otras partes del cuerpo.
2.4.4.5.1. Etapa IVA: el cáncer se ha diseminado a la vejiga o al recto
(órganos cercanos al cuello uterino).
2.4.4.5.2. Etapa IVB: el cáncer se ha diseminado a órganos dístales como
los pulmones.
2.4.4.6. Recurrente.
La enfermedad recurrente significa que el cáncer ha vuelto (reaparecido)
después de haber sido tratado. Puede volver al cuello uterino o a otro lugar.
2.5. Tratamiento de las Lesiones Intraepiteliales y Cáncer Cérvico-Uterino.
En la actualidad existen varios tratamientos para las LIE’s, pero no son
efectivos para el VPH. Vamos a hacer mención general de las diferentes opciones
sin ser específicos ya que el alcance de este escrito no es terapéutico en general.
Estos tratamientos comprenden citotoxicidad inducida químicamente y métodos
ablativos que permiten la destrucción y/o escisión del tejido infectado, como:
crioterapia, electrocoagulación diatérmica, termocoagulación, vaporización con láser
de CO2, asa diatérmica, conización con bisturí e histerectomía. (Hernández-Quijano
y col. 2006). Existen tratamientos químicos tópicos como: ácidos orgánicos, ácido
tricloroacético y bicloroacético, y los antimetabolitos que comprenden al 5fluorouracilo y agentes antimitóticos, como la podofilina y la podofilotoxina.
También existen vacunas terapéuticas; antivirales como el aciclovir y la virabidina y
por último los agentes inmunomoduladores como el interferón-alfa y el imiquimod
que estimula la producción del factor de necrosis tumoral alfa y otras citocinas en
las células infectadas, que se postula pueden terminar con el VPH. (HernándezQuijano y col. 2006).
42
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
CAPÍTULO II. METODOLOGÍA
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Es probable que en mujeres de nuestra región con LIE-CaCU exista asociación con
el VPH-18 pero se desconoce la frecuencia real de la distribución de LIE-CaCU con
VPH-18 positivo y en consecuencia si existe dicha asociación.
El desarrollo de metodología de vanguardia basada en técnicas moleculares como
es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP), permite investigar la presencia
de infección por VPH-18, y con ello hacer análisis para determinar asociación entre
el VPH-18 y LIE-CaCU.
En virtud de la importancia que en materia de Salud Pública de nuestro país tienen
los padecimientos oncoginecológicos, en especial el CaCU, y la magnitud de su
posible asociación con VPH-18 (riesgo relativo), fue necesario conocer si existía
dicha asociación en nuestra región.
3.1 Pregunta de investigación.
¿Existe una asociación entre la frecuencia de VPH-18 que nos hable de riesgo
relativo para el desarrollo de los diferentes tipos de LIE-CaCU en nuestro estado?
4. JUSTIFICACIÓN
4.1. Relevancia y pertinencia.
En orden de prioridad, el CaCU es la segunda de las patologías consideradas
dentro del programa nacional de salud; por lo tanto es pertinente y necesario
43
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
dilucidar a nivel molecular, factores que concedan susceptibilidad o protección para
el desarrollo de LIE y su evolución a cualquiera de los diferentes tipos de CaCU.
El trabajo se realizó en el
Laboratorio de Genética y Biología Molecular en el
Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas de la Facultad de Medicina de
la Universidad de Colima.
5. HIPÓTESIS: El VPH-18 es más prevalente en la región de Colima que en otras
regiones de México.
6. OBJETIVOS
6.1. Objetivo General.
Investigar y determinar la asociación entre LIE-CaCU con el VPH-18, mediante
técnicas de biología molecular en una muestra de mujeres de la región de Colima.
6.2. Objetivos Específicos.
6.2.1. Conocer la prevalencia de VPH-18 en cérvix de pacientes con LIE y CaCU,
así como en una población aparentemente sana.
6.2.2. Identificar la frecuencia de la infección del VPH-18 en los diferentes estadios
de evolución, desde pacientes sin evidencia clínica o histológica de cambios en
cérvix hasta mujeres con lesiones precursoras y Cáncer In Situ.
6.2.3. Conocer si hay asociación de riesgo entre las diferentes fases de evolución,
desde pacientes sin evidencia clínica o histológica de cambios en cérvix hasta
mujeres con lesiones precursoras y Cáncer In Situ y la positividad del VPH-18.
44
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
6.2.4. Identificar diferencias entre las frecuencias encontradas en el presente
estudio y frecuencias encontradas en otras regiones del país y reportadas en
artículos arbitrados.
7. MATERIAL Y MÉTODO
7.1. Tipo de estudio: El estudio es observacional, retrolectivo, transversal.
7.2. Selección de la muestra.
Muestras de ADN’s positivas a VPH-18 de pacientes con diagnóstico de LIE- CaCU
y normales o aparentemente sanas que acudieron a control a las clínicas de
Displasia del Hospital Regional Universitario de la Secretaria de Salud del Estado y
del Hospital General de Zona # 1 del IMSS en el período comprendido de 20042005.
7.3. Criterios de Inclusión. El grupo de pacientes consistió en mujeres con
diagnóstico clínico de LIE-CaCU, así como pacientes aparentemente sanas que
acudieron a revisión a las clínicas de Displasias.
7.4. Criterios de no inclusión. No se incluyeron mujeres con tratamiento antiviral.
7.5. Criterios de exclusión. Se excluyeron aquellas participantes cuyo ADN fue
insuficiente en cantidad o calidad.
7.6. Tamaño de la muestra. Se analizó una base de 264 ADN’s de mujeres con
diagnóstico de CaCU, LIE de Bajo y Alto Grado y de mujeres sin patología cervical.
45
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
7.6.1. Cálculo de Tamaño Muestral.
n= ______Nz2 (p q)___________
(N – 1) E2 + z2 (p q)
Z = 1.96
p = .8 (Tamayo-Acevedo, L.S. 2002)
q = .2
E2 = .05
N = 250,000
n = 245 (mínimo a estudiar)
7.7. Consentimiento informado y encuesta (Anexo 1): Todas las personas
participantes firmaron una carta de consentimiento informado una vez que
aceptaron participar de manera voluntaria en el trabajo; también se elaboró una
encuesta que contiene los datos adicionales que se reportan.
7.8. Procedimiento:
A todas las participantes se tomó una muestra vaginal
con citocepillo para realizar la búsqueda de VPH-AR.
Las muestras de las participantes se sometieron a los
siguientes procedimientos de laboratorio:
Figura 6. Imagen de Citocepillo.
46
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
METODOLOGÍA
(Consentimiento informado)
TTO
RAA
UEESSTTR
MU
DEE M
MAA D
OM
(Citocepillo)
EEXXTTR
DN
DEELL AAD
ND
ÓN
CIIÓ
RAAC
N
(Método SDS-PK)
C
N
DN
DEELL AAD
ND
ÓN
CIIÓ
CAAC
NTTIIFFIIC
UAAN
CU
(Espectrofotometría)
C
NTTR
CEEN
NC
ON
CO
N
DN
DEELL AAD
ND
ÓN
CIIÓ
RAAC
AAM
N YY TTIIPPIIFFIIC
ÓN
CIIÓ
CAAC
N
DN
MPPLLIIFFIIC
DEELL AAD
ND
ÓN
CIIÓ
CAAC
(Reacción en cadena de la polimerasa- iniciadores específicos)
IID
ND
ÓN
CIIÓ
CAAC
NTTIIFFIIC
OSSIITTIIVVAASS
DEEN
H--1188 PPO
RAASS VVPPH
UEESSTTR
MU
DEE M
(Electroforesis en gel de poliacrilamida 6%)
(Elaboración de base de datos)
Figura 7. Diagrama logístico de la metodología de estudio.
47
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
7.8.1. Extracción del ADN por métodos convencionales (Anexo 2)
7.8.2. Cuantificación del ADN (Anexo 3)
7.8.3. Dilución del ADN. Después de la verificación de la calidad y cantidad del
ADN se prepararon alícuotas de ADN a una concentración de 100 ng/μl, para lo
cual se utilizó la siguiente fórmula: (V1) (C1)= (V2) (C2)
7.8.4. El ADN se sometió a PCR (Anexo 4) con la utilización de iniciadores
específicos (Cuadro 2) para la identificación de VPH-18. El producto amplificado fue
visualizado en un gel de poliacrilamida al 6% (Anexo 5).
7.8.4.1. Amplificación del gen LCR por RCP con oligonucleótidos específicos, los
cuales flanquean toda la secuencia del gen LCR (518 pb).
VPH-18
LCR
5’
CCTTACAGCATCCATTTTATCCTAC
forward
VPH-18
LCR
reverse
3’
TTGTGGTGTGTTTCTCACATCTTTT
Cuadro 2. Oligonucleótidos iniciadores específicos
7.8.4.2. El producto de RCP se corrió en un gel de poliacrilamida al 6% y se
identificó los genes amplificados.
48
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
1
2
3
(+)
(+)
4
6
5
7
8
(+)
(+)
9
10
HeLa
(-)
Ctrl
mpm
Figura 8. Gel de Poliacrilamida para identificación de VPH-18 [Control negativo (-);
HeLa Control positivo; muestras positivas a VPH-18 (+); mpm marcador de peso
molecular]
7.8.5. Registro de resultados en Base de Datos computarizada capturada con el
programa Excel® y analizada con el programa SPSS 10®. Gráficos elaborados con
el programa Excel®.
7.9. Análisis estadístico: medidas
de
tendencia
central,
comparación
de
proporciones con Χi cuadrada no paramétrica, pruebas exactas; razón de momios e
intervalo de confianza con EPI-INFO 6.04.
49
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
CAPÍTULO III. RESULTADOS.
8.1. Datos sociodemográficos: Se obtuvieron un total de 264 muestras las cuales
fueron obtenidas en 78% (n= 206) del Hospital Regional Universitario (HRU); 15.9%
(n= 42) del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS); el 6.1% de consultorios
particulares. Con domicilio en el estado de Colima el 80.3% (n= 212) y 19.7 % (n=
52) de zonas circunvecinas principalmente de Jalisco.
8.1.1. La edad promedio fue de 37,6 (D.E. 10.17) años con mínima de 16 y máxima
de 74. En el siguiente Cuadro (3) se describen otras variables investigadas:
Variable
n
Moda
%
Escolaridad
116
Primaria
43.9
Ocupación
178
Hogar
67.4
Estado Civil
179
Casada
67.8
Cuadro 3. Principales variables sociodemográficas.
8.2. Antecedentes Gineco-Obstétricos se describen en el siguiente cuadro (Cuadro
4). Recategorizando el número de parejas sexuales en A (1-3); B (4-9) y C (≥10)
resulta: A: 93.5% (n= 247); B: 4.7% (n= 12); C: 1.8% (n= 5).
8.2.1. Método anticonceptivo más usado: Oclusión Tubaria Bilateral (OTB) (n= 95,
36.0%), seguido de: Dispositivo Intrauterino (DIU) 24.6% (n= 65); ningún método
20.8% (n= 55), Hormonales 11.4% (n= 30) y Locales (preservativo, ritmo y coito
interrupto) 7.2% (n= 19).
50
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Variable
promedio
mínima
máxima
Edad
37,6
16
74
Menarca
12,8
8
21
IVSA
18,6
12
35
Parejas
1,0
1
>10
Gestaciones
4,0
0
17
Edad
primer
19,7
13
36
Tiempo
uso
Método
de
Planificación
Familiar
4,0
0
27
Menopausia
49,0
38
55
sexuales
parto
Cuadro 4. Principales variables gineco-obstétricas.
8.3. Antecedentes de riesgo. (Cuadro 5). Familiares con antecedente de cáncer
cervicouterino: madre 7.2% (n= 19), hermana 3.4% (n= 9), abuela materna 3.0%
(n= 8), otra familiar 2.3% (n= 6), tía materna 1.2% (n=3); sin antecedente 83% (n=
219).
51
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Nombre
SI (n)
Porcentaje
NO (n)
Porcentaje
Antecedente
45
17.0
219
83.0
Otro Ca
39
14.8
225
85.2
ETS
38
14.4
226
85.6
Tabaquismo
36
13.6
228
86.4
CaCU
Cuadro 5. Principales factores de riesgo conocido
8.3.1. Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS): NO 85.6% (n= 226) y SI 14.4%
(n= 38). De éstas: VPH 6.8% (n= 18); condiloma acuminado 4.2% (n= 11); gonorrea
1,5% (n= 4); gardnerella vaginalis 1.5% (n= 4); sífilis 0.4% (n= 1). Acumulando el
antecedente de VPH con Condiloma da un total de 29 (73.6%) pacientes de las 38
que refirieron conocer antecedente de ETS.
8.3.2. Tabaquismo: NO 86.4% (n= 228) y SI 13.6% (n= 36). De éstas: No han
dejado de fumar 20 pacientes con un tabaquismo leve (de 1 a 3 cigarrillos diarios)
17 pacientes; tabaquismo moderado (de 4 a 10 cigarrillos diarios) 10 pacientes y
tabaquismo severo (más de 10 cigarrillos diarios) 9 pacientes; edad de inicio del
tabaquismo: (moda) 17 años con una mínima de 14 y máxima de 38; refieren
tabaquismo pasivo 31.8% (n=84); tiempo promedio 12.35 años (∑= 1038 años),
moda 10 años, mínimo 1 (n=5) y máximo 50 años (n= 1).
8.3.3. Citología vaginal previa: Nunca se habían realizado Citología vaginal: 27
pacientes (10.2%). La frecuencia de citologías previas realizadas fue de 1 a 25 con
moda de 1 y 10 (33 cada una).
52
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
8.4. Datos Clínicos: El motivo de
consulta o sintomatología expresada por la
paciente fue principalmente envío por una citología vaginal anormal 42% (n= 111),
seguida de asintomática 32.6% (n= 86), leucorrea 11.4% (n= 30) y dispareunia 7.6%
(n= 20), principalmente. (Gráfica 1).
Motivo de Consulta en Clínica de Displasias
120
111
100
86
80
n 60
40
30
20
20
0
Citología anormal
Asintomática
Leucorrea
Dispareunia
Gráfica 1. Motivo de consulta expresado por la paciente para acudir a la Clínica de Displasias
8.4.1. Exploración: Al momento de la exploración para la toma de la muestra se
observó leucorrea en 40.9% (n= 108).
8.4.2. Sangrado: Tuvo sangrado al momento del cepillado: 33.7% (n= 89).
8.4.3. Aspecto macroscópico del cérvix al momento de la toma: sano 18.6% (n= 49),
congestivo-inflamatorio: 17.0% (n= 45), pseudoerosión. 16.3% (n= 43), mosaico
15.2% (n= 40), puntilleo 14.4% (n= 38), ectropión 11.4% (n= 30) y epitelio aceto53
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
blanco: 7.2% (n= 19). Agrupando los cambios colposcópicos puntilleo, mosaico y
epitelio aceto-blanco resulta un grupo de cambios epiteliales de n= 97. (Gráfica 2).
Aspecto del Cérvix a la Exploración
Cambios
Epitelio 37%
Sano 19%
Ectropión 11%
Pseudo
erosión 16%
Congest
Inflamat 17%
Gráfica 2. Aspecto clínico del cérvix al realizar la toma de la muestra con el citocepillo
8.4.4. Tratamientos anteriores: ninguno 34.1% (n= 90), biopsia 25.4% (n= 67), local
(óvulos vaginales) 22.0% (n= 58), crioterapia 11.0% (n= 29), y cono 7,6% (n= 20).
(Gráfica 3).
54
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Tratamientos anteriores
100
90
80
70
60
n 50
40
30
20
10
0
90
67
58
29
20
Ninguno
Biopsia
Local
Crioterapia
Cono
Gráfica 3. Tratamientos recibidos por la paciente al momento de la muestra.
8.5. Diagnóstico de la citología vaginal de envío: NIC I: 73.5% (n= 194); NIC II: 9.1%
(n= 24); Negativo 8.3% (n= 22); VPH 4.9% (n= 13); NIC III-InSitu: 4.2% (n= 11).
8.5.1. Sistema Bethesda de los resultados citológicos descritos arriba: LIEB 78,4%
(n= 207); LIEA 13.3% (n= 35) y Negativo 8.3% (n= 22). (Gráfica 4)
55
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Citología en Sistema Bethesda
207
250
200
150
100
35
22
50
0
Negativo
LIE A
LIE B
Gráfica 4. Sistema Bethesda como diagnóstico de citología vaginal de envío.
8.6. Resultado de la revisión colposcópica: NIC I + VPH 34.1% (n= 90); NIC I 30.7%
(n= 81); VPH 10.2% (n= 27); NIC II 3.8% (n= 10); NIC II + VPH 3.4% (n= 9); NIC IIIInSitu 2.3% (n= 6); NIC III + VPH 0.4% (n= 1); Cáncer invasor 0.4% (n=1).
Negativas 14.9% (n= 39).
8.7. Resultado histopatológico de biopsia y/o conización: No se le practicó biopsia al
13.3% (n= 35). NIC I + VPH 50.4% (n= 133); NIC I 13.3% (n= 35) en total NIC I
63.7% (n= 168). NIC II + VPH 3.8% (n= 10); NIC II 3.8% (n= 10) en total NIC II 7.6%
(n= 20). NIC III + VPH atípico 0.8% (n= 2); NIC III-InSitu 4.6% (n= 12) en total NIC
III-InSitu 5.0% (n= 14). VPH 4.6% (n= 12). Adenocarcinoma 0.5% (n=1). Negativa
5.3% (n=14).
56
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
8.8. Resultado histopatológico clasificado en Sistema Bethesda: LIEB: 68.2% (n=
180); LIEA: 13.3% (n= 35); Negativo 5.3% (n= 14) (Gráfica 5).
Resultado biopsia en Sistema Bethesda
14
Negativo
35
LIE A
LIE B
180
0
50
100
150
200
n
Gráfica 5. Resultado histopatológico de biopsia o cono en Sistema Bethesda.
8.9. Resultado de Tipificación del VPH-18 positiva (n= 67) en biopsias o cono: NIC I
(n= 42) 62.7%; NIC II (n= 3) 4.0%; NIC III-InSitu (n= 4) 6%; VPH (n= 1) 1.5%;
Negativa (n= 3) 4.0%. No se les practicó biopsia a 14 pacientes VPH-18 positivas.
Trasladando el resultado de tipificación del VPH-18 en resultados de biopsias al
Sistema Bethesda quedaría según se muestra en la siguiente gráfica (Gráfica 6):
57
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Resultado tipificación VPH-18 positiva en Biopsia
Sistema Bethesda
No Biopsia
14
Negativa
3
LIE A
7
LIE B
43
0
10
20
30
40
50
n = 67
Gráfica 6. Resultado de tipificación VPH-18 en biopsia o cono. Sistema Bethesda
8.10. Tipificación de VPH-16. Paralelamente a la tipificación de VPH-18 hicimos
tipificación de VPH-16, como un adicional a favor del control clínico de las pacientes
a las cuales se tomó muestra y como apoyo a los médicos especialistas que
colaboraron en este trabajo,
clasificando en consecuencia una variable
denominada VPH-AR y se encontró la siguiente información: VPH-AR Negativo:
57.2% (n= 151) y Positivo 42.8% (n= 113) (Gráfica 7).
58
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Muestras Positivas a Virus Papiloma
Humano Alto Riesgo (VPH-AR)
43%
57%
VPH-AR (+)
VPH-AR (-)
Gráfica 7. Resultado de tipificación VPH-AR POSITIVO (n = 113).
8.10.1. Diferenciando el VPH-AR positivo entre tipos: VPH-18 en 51 (19.3%), VPH16 en 45 (17.0%) y 18-16 (co-infección) en 17 (6.5%). Resultando así la siguiente
tabla (1):
59
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
VPH AR TIPO
Virus Papiloma Humano Alto Riesgo
NO
TOTAL
SI
NINGUNO
151
0
151
18
0
51
51
18-16
0
17
17
16
0
45
45
TOTAL
151
113
264
Tabla 1. Distribución de VPH-AR
8.10.2. Eliminando la co-infección de VPH-18/16 se determina la siguiente tabla:
VPH
18
16
Negativos
Total
TOTAL
51
45
151
247
Tabla 2. Distribución de VPH-AR eliminando co-infección 18/16
8.10.3. Agregando la co-infección de VPH-18/16 se determina la siguiente tabla:
60
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
VPH
18
16
Negativos
Total
TOTAL
67
46
151
264
Tabla 3. Distribución de VPH-AR agregando co-infección 18/16
8.10.4. Reclasificando la infección con VPH-AR mediante Sistema Bethesda se
obtiene la siguiente distribución (Tabla 4):
LIEB
LIEA
Normales
Negativos
Total
89
13
11
151
264
Tabla 4. Distribución de VPH-AR mediante Sistema Bethesda
8.11. Resultado general de tipificación del VPH-18 en la muestra (n= 264). Positivo:
25% (n= 67); Negativo: 75% (n= 197).
61
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Tipificación del VPH-18 en la muestra (n= 264)
VPH-18
positivo
25%
VPH-18
negativo
75%
Gráfica 8. Resultado de tipificación del VPH-18 en la muestra: VPH-18 positivo n = 67.
8.12 Correlación VPH-18 con Sistema Bethesda del resultado de biopsia, se
describen a continuación en la gráfica 9. De las pacientes a las que NO se les
practicó biopsia (n= 35) resultaron VPH-18 positivas 14 (40%) y 21 VPH-18
negativas (60%).
Distribución de VPH-18 en Biopsias Sistema Bethesda
3
VPH-18 Pos Biop Neg
11
VPH-18 Neg Biop Neg
7
VPH-18 Pos LIE A
28
VPH-18 Neg LIE A
43
VPH-18 Pos LIE B
137
VPH-18 Neg LIE B
0
20
40
60
80
100
120
140
Gráfica 9. Distribución de VPH-18 en resultados de Biopsias en Sistema Bethesda. 14 muestras
VPH-18 positivas NO se les practicó biopsia.
62
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
8.13. Reclasificación de pacientes por rango de edad en base a la edad
reproductiva: 1.0
Jóvenes (≤ 24 años): n= 31 (11.7%); 2.0 Edad reproductiva
normal (25-55 años): n= 219 (83%); 3.0
Postmenopáusicas (≥56 años): n= 14
(5.3%).
8.13.1. Distribución de lesiones citológicas clasificadas en Sistema Bethesda:
(Cuadro 6).
Negativo
LIEB
LIEA
TOTAL
≤ 24 años (1)
3
26
2
31
25-55 años (2)
19
174
26
219
≥56 años (3)
0
7
7
14
TOTAL
22
207
35
264
Cuadro 6. Distribución de lesiones citológicas clasificadas en Sistema Bethesda.
8.13.2. Distribución de resultados de Biopsias en el Sistema Bethesda: (Cuadro 7).
63
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
NO
Negativo
LIEB
LIEA
TOTAL
≤ 24 años (1)
2
1
24
4
31
25-55 años (2)
33
13
147
26
219
≥56 años (3)
0
0
9
5
14
TOTAL
35
14
180
35
264
Cuadro 7. Distribución de resultados de Biopsias por rango de edad en Sistema Bethesda.
8.13.3. Resultado de tipificación de VPH-AR (18-16) por rango de edad (Cuadro 8):
No
18
16
16-18
TOTAL
≤ 24 años (1)
17
3
7
4
31
25-55 años (2)
125
45
36
13
219
9
3
2
0
14
151
51
45
17
264
≥56 años (3)
TOTAL
Cuadro 8. Distribución de resultados de tipificación de VPH-AR por rango de edad .
64
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
CAPÍTULO IV. DISCUSIÓN
Este proyecto contempló la inclusión 245 muestras como mínimo, obteniendo
264 muestras de pacientes en todos los estadios de evolución desde la normalidad
o ausencia de cambios clínicos e histopatológicos, hasta pacientes con desarrollo
de lesiones precursoras y Cáncer Cérvico-Uterino In Situ; y a la distribución de la
frecuencia de positividad a los VPH-AR, específicamente al VPH-18, considerando
la nomenclatura que actualmente se reconoce a nivel internacional que es el
Sistema Bethesda. Recordemos que en México la NOM utiliza el sistema NIC para
reportar todos los resultados, por lo que mencionaremos (cuando sea pertinente)
ésta clasificación y el Sistema Bethesda (LIEB ó LIE A) entre paréntesis.
No se contempló la inclusión de pacientes con CaCU Invasor considerando
que actualmente su frecuencia va disminuyendo y que, operacionalmente hablando,
es diferente del sistema de manejo dentro de las instituciones de salud a las que
acudimos a recolectar muestras y datos, ya que estas pacientes son referidas al
Oncólogo de la unidad.
En este estudio la edad media de las participantes fue de 37,6 años sin haber
diferencia significativa entre otros estudios publicados, para el desarrollo de
lesiones precursoras ya que el principal diagnóstico citológico, colposcópico e
histopatológico fue NIC I (LIEB), sin dejar de mencionar que hubo 2 pacientes de 24
años o menos con LIEA por citológico y 4 por diagnóstico histológico. El número de
parejas sexuales en rangos A (1-3), B (4-9) y C (>10) muestra que la minoría (6.5
%) tienen 4 parejas o más, no habiendo diferencia significativa con la presencia de
VPH-18; el número de gestaciones promedio fue 4, que es diferente de la media de
gestaciones referida a población general nacional y estatal de 2 (Fuente: Consejo
Nacional de Población, CONAPO. 2006) confirmando la multiparidad como factor de
riesgo.
65
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
En este trabajo se reporta 10.2% (n= 27) de pacientes que al efectuarse su
primera citología vaginal es detectada con LIE-CaCU y se refiere a Clínica de
Displasia (ClD) para su revisión. Este dato debe ser confiable ya que las pacientes
no saben con exactitud cuántas citologías se han efectuado anteriormente, pero sí
saben exactamente las que se efectuaron su primera citología y las derivan a
revisión especializada.
El VPH-18 aumenta su prevalencia (21.4%) en mujeres mayores de 56 años
análisis que se obtiene al separar a las pacientes postmenopáusicas de las
pacientes de edad reproductiva y las jóvenes lo que podría explicarse por la
ausencia crónica de estrógenos y progestágenos que induce a cambios epiteliales
de atrofia y por lo tanto de susceptibilidad a la infección por el VPH-18 en
comparación con las mujeres de menor edad. En el Cuadro 7 podemos observar
que a pesar de ser de pacientes jóvenes, 4 muestras presentaron LIE A,
necesitando análisis estadísticos posteriores para determinar la relación de la edad
de inicio de relaciones sexuales, número de parejas sexuales y presencia del VPH18 contra diagnóstico de LIE B ó A.
Una comparación de frecuencias de VPH-18 publicadas por diferentes
autores muestra que la región de Colima tiene significativamente más prevalencia
de VPH-18 con un 25.4%. La tabla 5 muestra las diferentes prevalencias
específicas del tipo 18 según región las cuales varían desde 1.6 a 43.4 por ciento.
Todas las referencias son recientes de menos de 10 años a la fecha. De Boer MA y
cols., (2005) encontraron en Asia una prevalencia de VPH-18 de 23.2% muy similar
a la encontrada en este estudio, no pudiendo comparar las diferentes clasificaciones
por falta de datos en la publicación.
66
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
AUTOR
AÑO
PAÍS
REGIÓN
*PREV
DISEÑO CONTROLES
(%)
(%)
Lizano,
M
2005
Méx
De Boer,
MA
Centro
15.5
C/C
4.33
Indonesia
2005
Asia
Surinam
23.2
Descript
ND
2005
Holanda
Centro
13.3
Descript
ND
2005
Suecia
Estocolmo
5.6
Descript
ND
2004
Méx
Noreste
1.7
Descript
ND
2003
USA
Noreste
6.2
C/C
ND
2003
Chile
2.7
Descript
ND
2003
Multi
Multi
14.3
Meta-an
9.7
2000
Arg
Central
43.4
Descript
ND
6.6
C/C
6.4
De Boer,
MA
Andersson,
S
Calleja,
I
Burk,
RD
Melo,
AA
IX
Muñoz,
N
Picconi,
MA
Liaw,
KL
Portland,
1999
USA
OR
Tabla 5. Prevalencia (*PREV) del VPH-18 en diferentes publicaciones.
67
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
Esto puede estar relacionado con el hecho de que la región de Colima está
ubicada cercana a un puerto marítimo que recibe navíos de la Cuenca del Pacífico,
que es Asia y Lejano Oriente, junto con Indonesia y Australia, pudiendo ser una
puerta de entrada directa para el VPH-18, lo que sería una causa directa asociado a
la alta incidencia del cáncer Cérvico-Uterino que tenemos en Colima en relación a la
media nacional, y también el VPH-18 está relacionado con mayor agresividad en su
comportamiento clínico y biológico como hemos señalado en el capítulo 1.6 que
dice que el ADN del VPH-18 es más eficiente que el VPH-16 en la inmortalización
de células epiteliales, suministrando así apoyo experimental a la sugerencia de que
el VPH-18 se comporta más agresivamente in vivo y que el VPH-18 es
aproximadamente 10 a 50 veces más eficiente que el VPH-16 en su potencial
inmortalizador (Barbosa M y Schlegel R. 1989. Schlegel R y cols. 1988. Villa LL y
Schlegel R. 1991) y así ser la causa de morbilidad aumentada en base a baja
respuesta a tratamientos lo que se traduciría en mayor índice de mortalidad, en la
que Colima ocupa los primeros lugares nacionales desde hace años, muy por
encima de la media nacional también.
Para finalizar, en la comparación de las frecuencias de este trabajo con el
reportado por Marcela Lizano y cols. (México, 2005) que fue el estudio mexicano
que describe en su metodología datos comparables con el presente estudio,
tenemos que decir que ellos encontraron una relación directamente proporcional del
porcentaje de positividad del VPH-AR con el grado de lesión intraepitelial y cáncer
invasor, es decir, a mayor grado de lesión mayor frecuencia de muestras positivas
al ADN del VPH-AR (ver Tabla 6). En nuestra muestra de pacientes, la LIEB tuvo
una frecuencia mayor que se asoció con la mayor positividad del VPH-18, con alta
significancia estadística (p= 0.00001), y una RM de 5.414 (IC 95% 1.619-18.103)
contra LIEA con una p = 0.131 y RM 2.687 (IC 95% 0.719-10.034).
68
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
LIEB
LIEA
Normales
Negativos
Total
Reporte actual
89
13
11
151
264
M. Lizano
16
27
21
213
277
Χ2 = 69.07 p = 0.0000001 (3 g.l.) [IC 95% 5.414 (1.619-18.103)]
Tabla 6. Distribución de frecuencias de Lesión Intra Epitelial de Bajo y Alto grado, normales y
negativos en éste reporte y el de la Dra. Lizano (México 2005).
Además esta diferencia está asociada a la alta positividad del VPH-18, aún
eliminando las muestras con co-infección: n= 17), con una significancia estadística
de p = 0.00000005 (ver Tabla 7):
18
16
Negativos
Total
Reporte actual
51
45
151
247
M. Lizano
12
52
213
277
Χ2 = 33.60 p = 0.00000005 (2 g.l.)
Tabla 7. Comparación de proporciones de muestras positivas a VPH-18 Y VPH-16 a las
cuales se les eliminó las co-infecciones.
La combinación de reportes clínico-epidemiológicos y la comparación de
prevalencias del VPH-18 entre la región central y de nuestro estado de Colima,
69
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
soportan los hallazgos de éste estudio dejando abierta la necesidad de seguir
investigando al VPH-18 en nuestra región, para buscar otras posibles causalidades,
(por ejemplo: la determinación de variantes del VPH-18 y VPH-16) en el hecho de
tener en Colima una alta incidencia y prevalencia de Lesiones Precursoras y Cáncer
Cérvico-Uterino y una alta mortalidad de pacientes, sobre todo en edad
reproductiva, lo que se confirma en nuestro estudio, en el cual 4 pacientes de 24
años o menos, ya presentaron el diagnóstico de Lesión Intra Epitelial de Alto Grado
confirmada histopatológicamente, lo que no deja lugar a dudas de la alta prioridad
que el VPH-AR tiene en nuestra comunidad.
70
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
CAPÍTULO V. CONCLUSIONES
1.- El VPH-18 es más frecuente en la región de Colima que en otras regiones de
México.
2.- La LIEA es más frecuente en mujeres menores de 24 años (4/31 = 13%), aunque
la positividad del VPH-18 es de 10.4% lo que no ha sido reportado por otros
estudios.
3.- El VPH-18 aumenta su prevalencia (21.4%) en mujeres mayores de 56 años.
4.- Es necesario continuar investigando otros factores asociados a la persistencia
del VPH-AR como carga viral y variantes intratípicas.
5.- Las diferencias regionales en el tipo de prevalencia del VPH-AR tiene
implicaciones epidemiológicas, ya que está próxima a usarse una vacuna
preventiva de parte del Sistema de Salud, aunque estas vacunas tienen
cobertura para el VPH-18 lo que protegería a las pacientes usuarias de ésta
herramienta preventiva en nuestro estado.
71
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LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
CAPÍTULO VI. PERSPECTIVAS
Los virus han existido desde antes que apareciera la especie humana en el
contexto universal y hay datos de que han coexistido con el hombre durante
milenios (Gross L, 1997).
Existen también algunas evidencias de factores genéticos asociados al
desarrollo del CaCu, ya que el riesgo de una mujer de padecer cáncer es mayor
cuando alguna hermana o la madre lo padecieron previamente. Por medio de la
medicina genómica se podrá identificar pequeñas regiones en el ADN que faciliten
el determinar si una mujer tiene un riesgo muy alto o es resistente a desarrollar la
enfermedad o cáncer. Esta información podrá ser importante para el diseño más
eficiente de las campañas de Detección Oportuna de Cáncer (DOC) de cérvix.
Además, la información genómica será útil para predecir el pronóstico de la
enfermedad. También con la farmacogenómica, (que es la generación de
medicamentos más efectivos y menos tóxicos con base en la estructura genómica
de cada población), se identificará cuales tumores cancerosos son sensibles y
cuáles resistentes a la quimioterapia y radioterapia, y predecir el grado de toxicidad
de éstos tratamientos en cada paciente. Por otra parte, es probable que se podría
identificar blancos terapéuticos dentro del tumor, que permita el diseño de drogas
anticancerosas específicas que contribuyan a los recursos terapéuticos que
actualmente existen (Berumen-Campos J, 2005).
72
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
En el contexto nacional, la gran mortalidad por cáncer cervicouterino ha sido
desplazada por el emergente cáncer de mama y la perspectiva siempre ha sido el
control preventivo de la enfermedad por medio de la DOC y la posible desaparición
del CaCU como problema de salud pública (Crum CP, 2002. Shiffman M y Castlle
PE, 2005. ).
La forma de controlar a las enfermedades causadas por virus son las
vacunas que previenen contra la persistencia de la enfermedad, atacando y
controlando la infección. Con la reciente disponibilidad de vacunas polivalentes
contra las infecciones más frecuentes con virus de bajo y alto riesgo, se vislumbra el
control de la incidencia de verrugas genitales e infección asintomática persistente
por VPH’s entre la población que inicia su actividad sexual y combinado con la DOC
se podría terminar con el problema de la mortalidad del CaCU invasor.
Lo que queda por hacer es:
•
Nunca detener y, por el contrario, fortalecer el programa de DOC con
recursos suficientes y personal capacitado, para detectar alteraciones
citológicas tempranas (Hidalgo-Martínez AC, 2006).
•
Una vez detectada la alteración celular, tamizar a la paciente para VPH’s con
iniciadores generales y si es positiva identificar por iniciadores específicos
que tipo de VPH porta y además, referir a clínicas de Displasia a control
estricto de la evolución clínica.
73
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
•
Vacunar a los niños y adolescentes contra
los VPH’s más frecuentes
(Steinbrook R, 2006);
•
Informar a la población sexualmente activa del riesgo de contraer otros tipos
virales no cubiertos por la vacuna polivalente, que también pueden provocar
lesiones intraepiteliales a largo plazo (Katz IT y Wright AA, 2006).
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LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
ANEXOS
ANEXO 1
CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO.
Por medio de la presente hago constar que estoy informada de la realización del proyecto:
“IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE VPH 18 Y CANCER CERVICO UTERINO O
LESION INTRAEPITELIAL CERVICAL”
y se me explicó que con datos y la obtención de células del cuello de la matriz tomadas con el
citocepillo para la obtención de mi muestra de papanicolou o en la revisión de control en mi clínica de
displasias, se realizarán estudios especiales de biología molecular que ayudarán a entender las
posibles causas del desarrollo del cáncer de cuello de la matriz y sus lesiones previas.
Se me informó que los resultados de la muestra que proporciono le dará información a mi médico
tratante en la clínica de displasias, que servirá para apoyar mi control del problema que presento.
También se me dijo que mi participación es importante, pues los resultados de este estudio podrían
ayudar en un futuro a que se realicen medidas preventivas o de diagnóstico temprano en las
generaciones venideras.
Las pruebas que se realizarán no tendrán ningún costo para mí y la finalidad del proyecto es
exclusivamente de investigación. También quedó claro que mi participación es voluntaria y que la
aceptación o negación a participar en este estudio no representará ningún cambio en la atención
médica que estoy recibiendo.
Entendido lo anterior, accedo de manera voluntaria a contestar el cuestionario que me será hecho, a
que se recaben datos de mi expediente clínico y a donar las células remanentes de mi muestra de
citología cervical o del bloque de parafina en caso de que me hayan tomado biopsia previamente
como parte de mi tratamiento. Así mismo autorizo a las personas que realizan esta investigación a
que utilicen los datos y las muestras biológicas para realizar las investigaciones que consideren
necesarias en el entendido de que mi persona será mantenida en absoluta confidencialidad.
Si tengo dudas puedo comunicarme con la Dra. Alma Rosa Guadalupe Fernández Salinas al
laboratorio de biología molecular al teléfono (312) 316 11 29 o en horarios fuera de oficina: 044 312
311 96 38. También con el Dr. _________________________________ de la clínica de displasias a
la que acudo.
Colima, Col., a ____ de _______________________ de 2006
Nombre y firma de la paciente
Nombre de quien toma la muestra
_______________________________
________________________________
Testigo (1)
Testigo (2)
_______________________________
_______________________________
75
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LESIÓN
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UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA.
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR.
“IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES DE VPH-18 Y CANCER CERVICO UTERINO
O LESION INTRAEPITELIAL CERVICAL”
IDENTIFICACIÓN-ENCUESTA.
Nombre del encuestador: __________________________________________ Fecha: __________
I. Nombre de la paciente: ____________________________________________ Edad: _________
Afiliación: __________________________________ No. Consultorio _______ Turno M ( ) V ( )
Domicilio: ________________________________ Colonia: _______________________________
C.P. ________________ Municipio: __________________________ Estado: __________________
Ocupación: ___________________________________ Estado Civil: S ( ) C ( ) UL ( ) D ( ) V ( )
TEL. 01 (
) ____________________________________________________________________
II. SINTOMATOLOGÍA: marque con una X
(1) ASINTOMÁTICA (2) DOLOR PÉLVICO (3) SANGRADO GENITAL ANORMAL (4) SANGRADO
POSTCOITO (5) FLUJO (6) DISPAREUNIA (7) CITOLOGÍA ANORMAL (8) OTRO: __________
III. CÉRVIX (al momento de la toma de la muestra con citocepillo y/o biopsia):
9. LEUCORREA SI ( ) NO ( ) 10. ASPECTO: (a) sano (b) congestivo/inflamatorio (c) ectoprión
(d) pseudoerosión (e) leucoplaquia (f) mosaico (g) puntilleo (h) otro: __________________
11.- SANGRA a la toma con citocepillo: SI ( ) NO ( )
IV. FACTORES DE RIESGO:
12.- ESCOLARIDAD: (1) analfabeta (2) primaria (3) secundaria (4) técnica (5) universitario (6) otro:
13.- A que edad inició relaciones sexuales? ________
14.- Cuántas parejas sexuales ha tenido durante toda su vida: ______
15.- Cuántas parejas sexuales ha tenido el último año: _______
16.- Con que frecuencia ha tenido relaciones sexuales el último año? 1) diario 2) cada tercer día
3) 2 o 3 veces por semana 4) cada semana 5) cada 15 días 6) cada mes 7) ocasional 8) sin
relaciones
17.- ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS: G __ P ___A __C __EDAD 1er PARTO: _____ FUP ______
FUA _____ FUC ______ EDAD MENARCA: ______ EDAD MENOPAUSIA: _____ FUM _____
18.- Antecedentes familiares CaCU: 1) Madre 2) Abuela materna 3) Hermana 4) Tía materna
5) Otra: _____ 6) Otro tipo de cáncer:
7) NO CÁNCER__________
19.- Que métodos ANTICONCEPTIVOS ha usado en toda su vida? 1) Hormonales tiempo: _______
2) DIU cuánto tiempo _________ 3) Barrera 4) OTB/Vasectomía 5) Otros _______________
20.- Enfermedades de transmisión sexual (ETS): SI ( ) cuál: _________________________ NO ( )
21.- Fuma o fumó: NO ( ) SI ( ) Cuántos cigarrillos fuma al día? _____ A que edad comenzó a
fumar? ___ a que edad dejó de fumar? ___FUMADORA PASIVA: NO ( ) SI ( ) cuánto tiempo? __
V. EXÁMENES, DIAGNÓSTICOS Y RESULTADOS:
22.- Se ha realizado citologías anteriores a esta? NO ( ) SI ( ) Cuántas? ______ FUDOC _______
23.- Ha tenido tratamientos vaginales anteriores? NO ( ) SI ( ) hace cuanto? FUTto. ____________
Óvulos/cremas vaginales ____ Conización ____ Electrocauterización ____ Congelación ______
Biopsia _________ Otro: _________________________________________________________
24.- REPORTE POR CITOLOGÍA: ____________REPORTE POR COLPOSCOPÍA: _____________
25.- REPORTE POR BIOPSIA: _______________________________________________________
26.- ADN VPH NO ( ) SI ( ) TIPO (S) ______________________________________
76
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Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
ANEXO 2
EXTRACCIÓN DEL ADN A PARTIR DE CITOCEPILLO:
1. Centrifugar las muestras con el citocepillo, por 20 seg. a 10 000 rpm.
2. Con movimientos circulares sacar el citocepillo.
3. Centrifugar de nuevo a 10 000 por 25 min. y quitar el sobrenadante con el
cuidado de no tirar el botón.
4. Agregar a las muestras 100 ul de buffer de digestión que contiene 200 ug/ml
de Proteinasa K. Si la cantidad de muestra es mucha agregar 200 ul.
5. Dejar en baño maría a 37º C de 48 hr. hasta 1semana.
6. Inactivar la Proteinasa K a 98º C por 8 min.
7. Agregar volumen igual (300 a 500 ul) de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico
(25:24:1). Mezclar bien, separar las dos fases por centrifugación a 10 000
rpm por 10 min. a 4º C. Tomar la fase acuosa superior y pasarla a otro tubo,
cuidando de no tomar la interfase.
8. Agregar volumen igual
(200 a 300 ul) de cloroformo-alcohol isoamílico
(24:1). Mezclar bien. Centrifugar a 10 000 rpm por 10 min. a 4º C. Tomar la
fase acuosa cuidando no tomar la interfase, transfiriendo a otro tubo.
9. Agregar dos volúmenes de alcohol absoluto frío y una décima de volumen
de acetato de sodio 3 M a un pH 5.2. Permitir que el ADN precipite a 20º C al
menos por una hora.
10. Centrifugar a 7 000 rpm por 10 minutos. Eliminar el exceso de alcohol,
cuidando de no tirar el botón.
11. Agregar 50 ul de Alcohol al 70 %, centrifugar a 7 000 rpm por 10 min. y
decantar con el cuidado de no tira el botón.
12. Secar el botón con el tubo destapado por lo menos 2 horas.
13. Posteriormente disolver con 100 ul de Buffer TE 1X estéril pH 7.5 el botón y
dejar en baño maría a 37º C por 24 horas.
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ANEXO 3
CUANTIFICACIÓN DE ADN:
Para cuantificar la cantidad de ADN o ARN, deben tomarse las lecturas de la
densidad óptica a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm permite calcular la
concentración de ácido nucleico en la muestra. Una D.O. de 1 corresponde a
aproximadamente 50 μg/ml de ADN de doble cadena, 40 μg/ml de ADN de cadena
sencilla y ARN, Y alrededor de 20 μg/ml de ADN de cadena sencilla y ARN, Y
alrededor de 20 μg/rnl de oligonucleótidos de cadena sencilla.
La tasa entre las lecturas a 260 nm y 280 nm (D.O.26O/D.O.280)
proporciona un estimado de la pureza del ácido nucleico. Las preparaciones puras
de ADN o ARN tienen valores de D.O 260/D.O.280 de 1.8 y 2, respectivamente. Si
hay una contaminación con proteínas o fenol, este valor será significativamente
menor y no será posible la cuantificación exacta del ácido nucleico.
CUANTIFICACIÓN DE DNA POR ESPECTROFOTOMETRIA
1) Las muestras perfectamente homogéneas se bajan en la microcentrífuga.
2) Encender en el espectro la lámpara de luz UV, si es computarizada, utilizar
programa para ácidos nucleicos.
3) Ajustar a blanco el espectro, midiendo 1 ml de agua bidestilada en la celdilla
de cuarzo para el espectrofotómetro.
4) Colocar 5 μl del DNA a medir en la celdilla anterior, agitar perfectamente la
solución y leer la muestra.
5) Se repiten los pasos 3-5 para cada muestra.
6) Se utilizan las lecturas de densidad óptica (D.O.) a 260nm y 280nm, para
calcular la cantidad y pureza del ADN.
78
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
PARA CALCULAR LA CONCENTRACIÓN Y PUREZA, SE DEBEN TOMAR EN
CUENTA VARIOS ASPECTOS:
•
1ng/µl de DNA de doble hebra absorben 1 D.0. (260nm)
•
La relación de lecturas de D.0. 260nm/280nm nos proporciona una
estimación de la
pureza de los ácidos nucleicos. Preparaciones puras de
ADN tiene valores de 1.7 a 2.0.
.
FORMULA PARA CALCULAR LA CONCENTRACIÓN DEL ADN
CONCENTRACIÓN DE ADN = (D.O. 260nm) (Factor de dilución) (50)
•
El Factor de dilución en este caso es: 500/5 = 100
•
495 μl Agua + 5 μl muestra / 5 μl muestra
79
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
ANEXO 4
EQUIPO Y MATERIAL NECESARIO PARA LA PCR Y ANALISIS DE
PRODUCTO AMPLIFICADO
* Microcentrífuga
* Micropipetas
* Balanza analítica
* Termociclador
* Espectrofotómetro
* Tubos para microcentrífuga
* Puntillas
* Guantes y tapabocas estériles
* Fuente de poder
* Transiluminador de luz UV
* Congelador de -20ºC
* Cámaras de electroforesis
*Campana de flujo laminar
PROCEDIMIENTO
1.- En un tubo Eppendorf colocar la siguiente mezcla de reacción:
REACTIVOS
CONCENTRACION
VOLUMEN TOMADO DE
FINAL
LAS DILUCIONES
Buffer PCR
1X
1 μl
MgCl2
1.5mM
0.5 μl
dNTP’s
200 μM
0.2 μ l
iniciador 5´
15 pmol
1 μl
iniciador 3´
15 pmol
1 μl
control C3
3.75 pmol
1 μl
control C5
3.75 pmol
1 μl
Taq polimerasa
0.25 U
1 μl
ADN genómico
100 ng/μl
1 μl
Agua c.b.p
10 μ l
Aceite mineral
1 gota
Tabla 8. Concentraciones adecuadas de los reactivos en la RCP
80
Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
2.- Al agregar cada reactivo se debe microcentrifugar 10 segundos para asegurar
que todos los
reactivos se depositen en el fondo del tubo.
3.- Colocar la mezcla de reacción en el termociclador y someterlo a condiciones de
amplificación previamente programadas para cada ADN en especial.
ETAPAS DE LA RCP
Etapa
Temp
Tiempo Inicial
Desnaturalización
94°C
20 seg.
Alineación
65°C
50 seg.
Extensión
72°C
20 seg.
Enfriamiento
4°C
5 min
Ciclos 30
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LESIÓN
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ANEXO 5
GEL DE POLIACRILAMIDA AL 6%
SOL. STOCK DE POLIACRILAMlDA 20% (19:1)
-
19 gr Acrilamida
-
1 gr Bis-acrilamida
-
Aforado en 100 ml
MATERIALES y EQUIPO:
-
Cámara de electroforesis
-
pinzas
-
par de vidrios para gel
-
pipetas
-
par de separadores de los vidrios
-
puntas para pipetas
-
peine para pozos del gel
-
guantes y bata
-
empaque
PREPARACIÓN DE 50 ml POLlACRILAMIDA al 9%
REACTIVOS
Sol Acrilamida-Bis 20% (19:1)
μl
CONC. FINAL
225
9%
5
0.1 %
500
0.1%
Temed 100%
50
0.1%
Agua Destilada Aforar a 50 ml
-
-
TBE 10X
Persulfato de Amonio 10%
Tabla 9. Lista de Reactivos y cantidades necesarias para preparar solución de Poliacrilamida al 9%.
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PREPARACION DEL GEL
El primer paso es montar el molde para el gel, se limpian previamente los
vidrios cuidando que no queden restos de poliacrilamida del gel anterior, se pone el
empaque a uno de los vidrios y los separadores, se pone el segundo vidrio
cuidando la posición de los separadores en los extremos, cuando estén bien se
ponen las pinzas que unen los vidrios, una vez puestas todas, se aplica la
preparación de 50 ml de poliacrilamida al 9%, cuidando que no queden burbujas,
una vez hecho esto se pone el peine. Se deja polimerizar aproximadamente 152Omin y se acomoda en la cámara de electroforesis.
ELECTROFORESIS DE LAS MUESTRAS
Antes del corrimiento electroforético de las muestras, se precorre el gel por
15 min. que ayuda a eliminar fracción de monómeros de acrilamida no polimerizada
así como todos los iones. A las muestras a ser aplicadas en el gel, se les pone jugo
azul aprox. 1.5 μl por cada 10 μl; el volumen a aplicar en el pozo puede variar de 5
μl a 25 μl con una nitidez aceptable.
El tiempo de corrimiento varía según el objetivo (sólo ver amplificado ó
diferencias pequeñas entre bandas), la longitud de nuestro gel y la concentración de
poliacrilamida del gel, mientras menos concentración corren más rápido las
muestras, a mayor concentración corren más lento. Un corrimiento de 4 horas a
200V , nos proporciona buena separación en el gel que preparamos.
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TINCIÓN CON NITRATO DE PLATA (AgNO3)
1. Sumergir el gel en solución fijadora durante 20 min. Manteniendo en agitación y
eliminar.
2. Agregar solución de AgNO3 (recién preparada) al gel
durante 7 min.
manteniendo en agitación. Eliminar.
3. Realizar 2 lavados con solución reveladora usada.
4. Realizar un lavado con agua desionizada.
5. Agregar solución reveladora hasta aparición de bandas. Eliminar.
6. Agregar solución fijadora durante 10 min. Y eliminar.
7. Adicionar agua desionizada para facilitar la recolección del gel. Ponerlo en una
bolsa de plástico para su interpretación.
SOLUCION FIJADORA
•
Etanol 10%
•
Acido acético Glacial 0.5%
•
Aforar a 1000 ml con H2O desionizada.
SOLUCION AgNO3
•
AgNO3 al 0.1%
•
Aforar a 250 ml con solución fijadora
SOLUCION REVELADORA
•
NaOH al 3%
•
Formaldehído al 0.5 %
•
Afora a 1000 ml. con H2O desionizada.
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ANEXO 6. SECUENCIA NUCLEOTÍDICA DEL VPH-18
BASE COUNT 2365 a 1497 c 1680 g 2315 t
ORIGIN
1 attaatactt ttaacaattg tagtatataa aaaagggagt aACCGAAAAC GGTcgggACC
E2 bind -> E2 bind ->
61 GAAAACGGTg tatataaaag atgTGAgaaa cacaccacaa tactATGgcg cgctttgagg
E6 orf start -> E6 cds ->
|-> mRNA start site from
P(105) promoter
HPV18
I-C-5
SEP 94
121 atccaacacg gcgaccctac aagctacctg atctgtgcac ggaactgaac acttcactgc
181 aagacataga aataacctgt gtatattgca agacagtatt ggaacttaca gaggtatttg
241 aatttgcatt taaagattta tttgtggtgt atagagacag tataccccat gctgcatgcc
301 ataaatgtat agatttttat tctagaatta gagaattaag acattattca gactctgtgt
361 atggagacac attggaaaaa ctaactaaca ctgggttata caatttatta ataaggtgcc
421 tgcggtgcca gaaaccgttg aatccagcag aaaaacttag acaccttaat gaaaaacgac
481 gatttcacaa catagctggg cactaTAGag gccagtgcca ttcgtgctgc aaccgagcac
E7 orf start ->
541 gacaggaacg actccaacga cgcagagaaa cacaagtaTA AtattaagtA TGcatggacc
<- E6 end -> E7 cds
601 taaggcaaca ttgcaagaca ttgtattgca tttagagccc caaaatgaaa ttccggttga
661 ccttctatgt cacgagcaat taagcgactc agaggaagaa aacgatgaaa tagatggagt
721 taatcatcaa catttaccag cccgacgagc cgaaccacaa cgtcacacaa tgttgtgtat
781 gtgttgtaag tgtgaagcca gaattgagct agtagtagaa agctcagcag acgaccttcg
841 agcattccag cagctgtttc tgaacaccct gtcctttgtg tgtccgtggt gtgcatccca
901 gcagTAAgca acaATGgctg atccagaagg tacagacggg gagggcacgg gttgtaacgg
<- E7 end
E1 orf start -> -> E1 cds
961 ctggttttat gtacaagcta ttgtagacaa aaaaacagga gatgtaatat cagatgacga
1021 ggacgaaaat gcaacagaca cagggtcgga tatggtagat tttattgata cacaaggaac
1081 attttgtgaa caggcagagc tagagacagc acaggcattg ttccatgcgc aggaggtcca
1141 caatgatgca caagtgttgc atgttttaaa acgaaagttt gcaggaggca gcacagaaaa
1201 cagtccatta ggggagcggc tggaggtgga tacagagtta agtccacggt tacaagaaat
1261 atctttaaat agtgggcaga aaaaggcaaa aaggcggctg tttacaatat cagatagtgg
1321 ctatggctgt tctgaagtgg aagcaacaca gattcaggta actacaaatg gcgaacatgg
1381 cggcaatgta tgtagtggcg gcagtacgga ggctatagac aacgggggca cagagggcaa
1441 caacagcagt gtagacggta caagtgacaa tagcaatata gaaaatgtaa atccacaatg
1501 taccatagca caattaaaag acttgttaaa agtaaacaat aaacaaggag ctatgttagc
1561 agtatttaaa gacacatatg ggctatcatt tacagattta gttagaaatt ttaaaagtga
1621 taaaaccacg tgtacagatt gggttacagc tatatttgga gtaaacccaa caatagcaga
1681 aggatttaaa acactaatac agccatttat attatatgcc catattcaat gtctagactg
1741 taaatgggga gtattaatat tagccctgtt gcgttacaaa tgtggtaaga gtagactaac
1801 agttgctaaa ggtttaagta cgttgttaca cgtacctgaa acttgtatgt taattcaacc
1861 accaaaattg cgaagtagtg ttgcagcact atattggtat agaacaggaa tatcaaatat
1921 tagtgaagta atgggagaca cacctgagtg gatacaaaga cttactatta tacaacatgg
1981 aatagatgat agcaattttg atttgtcaga aatggtacaa tgggcatttg ataatgagct
2041 gacagatgaa agcgatatgg catttgaata tgccttatta gcagacagca acagcaatgc
2101 agctgccttt ttaaaaagca attgccaagc taaatattta aaagattgtg ccacaatgtg
2161 caaacattat aggcgagccc aaaaacgaca aatgaatatg tcacagtgga tacgatttag
2221 atgttcaaaa atagatgaag ggggagattg gagaccaata gtgcaattcc tgcgatacca
2281 acaaatagag tttataacat ttttaggagc cttaaaatca tttttaaaag gaacccccaa
2341 aaaaaattgt ttagtatttt gtggaccagc aaatacagga aaatcatatt ttggaatgag
2401 ttttatacac tttatacaag gagcagtaat atcatttgtg aattccacta gtcatttttg
2461 gttggaaccg ttaacagata ctaaggtggc catgttagat gatgcaacga ccacgtgttg
2521 gacatacttt gatacctata tgagaaatgc gttagatggc aatccaataa gtattgatag
2581 aaagcacaaa ccattaatac aactaaaatg tcctccaata ctactaacca caaatataca
|-> mRNA start site from P(2598) promoter
2641 tccagcaaag gataatagat ggccatattt agaaagtaga ataacagtat ttgaatttcc
2701 aaatgcattt ccatttgata aaaatggcaa tccagtatat gaaataaatg acaaaaattg
2761 gaaatgtttt tttgaaagga catggtccag atTAGatttg cacgaggaag aggaagATGc
E2 orf start -> E2 cds ->
2821 agacaccgaa ggaaaccctt tcggaacgtt taagtgcgtt gcaggacaaa atcatagacc
2881 actaTGAaaa tgacagtaaa gacatagaca gccaaataca gtattggcaa ctaatacgtt
<- E1 end
2941 gggaaaatgc aatattcttt gcagcaaggg aacatggcat acagacatta aaccaccagg
3001 tggtgccagc ctataacatt tcaaaaagta aagcacataa agctattgaa ctgcaaatgg
|-> mRNA start site from
P(3036) promoter
3061 ccctacaagg ccttgcacaa agtcgataca aaaccgagga ttggacactg caagacacat
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LESIÓN
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3121
3181
3241
3301
3361
gcgaggaact
aagtatattt
attatatgac
tgtattatgt
aatatgggaa
atggaataca
tgatggcaac
tgatgcagga
aaaggaaggg
cacaggtacg
gaacctactc
aaagacaatt
acatgggaca
tacaacacgt
tgggaagtac
actgctttaa
gtatgaccta
aaaccgctac
tttatataga
attttgggaa
aaaaggtggc
tgtagcatgg
ctgtgtaagt
atttaaaagt
taatgTAAtt
caaacagtac
gacagtgtgt
cacaggggat
gaatgtgaaa
gattgtaATG
tcagcttgtt
caccgcaaag
ggagaagcag
caacaaaaga
cagaaacagt
aaacagctac
acctacggcc
cattgtggac
cggaaactct
ttaaaatgtt
tatatcatcc
aacataccat
tgtacaaata
atcacttatt
acctggcatt
agtgaaacac
ttggtgggat
tttttatttt
tttgccatct
aataacgtcc
actattgcat
gtattgtaca
gtctgtatgt
cctgccacag
atacatgcta
ttgtatattt
HPV18
I-C-6
SEP 94
E4 orf start -> E4 cds ->
3421 actctatgtg cagtaccagt gacgacacgg tatccgctac
3481 agcacacccc ctcaccgtat tccagcaccg tgtccgtggg
3541 agacgtcggc tgctacacga cctggacact gtggactcgc
3601 ctgtcaaccc acttctcggt gcagctacac ctacaggcaa
3661 gtagtggtaa cactacgcct aTAAtacatt taaaaggtga
<- E4 end
3721 tacggtacag attgcgaaaa catagcgacc actatagaga
3781 ggacaggtgc aggcaatgaa aaaacaggaa tactgactgt
3841 aaagaacaaa atttttaaat actgttgcaa ttccagatag
3901 acatgacaat gTAAtacata tgctgtagta ccaatATGtt
<- E2 end E5 cds ->
E5 orf start ->
3961 gcttttgtgt atgcatgtat gtgtgctgcc atgtcccgct
4021 gtgcgtatgc atgggtattg gtatttgtgt atattgtggt
4081 cattcacagt atatgtattt tgttttttat tgcccatgtt
4141 tattgtcttt acagTAAttg taTAGgttgt tttatacagt
<- E5 end
L2 orf start ->
4201 tgttttatac cttttatgct ttttgtattt ttgtaataaa
L2 cds ->
4261 cgcacgacgc aaacgggctt cggtaactga cttatataaa
4321 atgtccacct gatgttgttc ctaaggtgga gggcaccacg
4381 atggtcaagc cttggtatat ttttgggtgg acttggcata
4441 gggtcgtaca gggtacattc cattgggtgg gcgttccaat
4501 tacacgtccc ccagtggtta ttgaacctgt gggccccaca
4561 aatagaggac tccagtgtgg ttacatcagg tgcacctagg
4621 tgggtttgat ataacatctg cgggtacaac tacacctgcg
4681 gtctacctct gtgtctattt ccacaaccaa ttttaccaat
4741 cattattgaa gttccacaaa ctggggaggt ggcaggtaat
4801 atctggaaca catgggtatg aggaaatacc tttacaaaca
4861 ggaggaaccc attagtagta ccccattgcc tactgtgcgg
4921 ttacagtagg gcctaccaac aagtgtcagt ggctaaccct
4981 ctctttaatt acatatgaca acccggcctt tgagcctgtg
5041 tcctcgtagt gatgttcctg attcagattt tatggatatt
5101 tttaacatcc aggcgtggga ctgttcgctt tagtagatta
5161 tacccgcagc ggtacacaaa taggtgctag ggttcacttt
5221 tgcaccttcc ccagaatata ttgaactgca gcctttagta
5281 cttgtttgat atatatgcag atgacatgga ccctgcagtg
5341 tacctccttt gcatttttta aatattcgcc cactatatct
5401 tgtaacggtc ccttTAAcct cctcttgggA TGtgcctgta
L1 orf start -> L1 cds ->
5461 attaccatct actacctctg tatggcccat tgtatcaccc
5521 gtatattggt atacatggta cacattatta tttgtggcca
5581 gaaacgtaaa cgtgttccct atttttttgc agatggcttt
|-> mRNA start site from P(5600) promoter
<- L2 end
5641 ccgtatatct tccacctcct tctgtggcaa gagttgtaaa
5701 ccacaagcat attttatcat gctggcagct ctagattatt
5761 ttagggttcc tgcaggtggt ggcaataagc aggatattcc
5821 atagagtatt tagggtgcag ttacctgacc caaataaatt
5881 tttataatcc tgaaacacaa cgtttagtgt gggcctgtgc
5941 gtcagccttt aggtgttggc cttagtgggc atccatttta
6001 aaagttccca tgccgccacg tctaatgttt ctgaggacgt
6061 attataagca gacacagtta tgtattttgg gctgtgcccc
6121 ctaaaggcac tgcttgtaaa tcgcgtcctt tatcacaggg
6181 ttaaaaacac agttttggaa gatggtgata tggtagatac
6241 ttagtacatt gcaagatact aaatgtgagg taccattgga
6301 aatatcctga ttatttacaa atgtctgcag atccttatgg
6361 tacggcgtga gcagcttttt gctaggcatt tttggaatag
6421 ctgtgcctca atccttatat attaaaggca caggtatgcc
6481 tgtattctcc ctctccaagt ggctctattg ttacctctga
6541 catattggtt acataaggca cagggtcata acaatggtgt
6601 ttgttactgt ggtagatacc actcccagta ccaatttaac
agtATGgtat cccaccgtgc
acatgtaaac
ttagcagata
ggtactggca
acagtggtgg
gacccatcta
cctacgttta
gttttggata
cctgcatttt
gtatttgttg
tttgcttctt
cgtgtagcag
gagtttctta
gacactacat
atccgtctac
ggtcaacggg
tatcatgata
tctgccacgg
cctgtaccat
tctgcctctt
tacacgggtc
aatctggtac
aaatattgca
gtggtacagg
atgttggtcc
ttgttacatt
ctggcacgtc
tcacaccttc
ctgatccgtc
gtacccctac
ctggtacggg
gtccccgcct
cacgtccatc
taacatttga
ataggcctgc
caactatgtt
taagtcctat
aggacaatga
cgcgttctac
cctatagtaa
ctgatattac
acggcccctg cctctacaca
ttatattatt ttattcctaa
gtggcggccT AGtgacaata
taccgatgat
aactgttggt
taaggtttct
tggtttacct
tggagtggaa
taataaatta
tagggacaat
tgctattggg
cgattgcccc
tggatatggt
tatttgtcag
ggattccatg
agcaggtact
tgcttcacct
ctcccagttg
ttgctggcat
aatatgtgct
tatgtgactc
aatccatatt
gcataccaat
gatactagta
attggccgtg
gatgacactg
gtgtctgtag
gaacactggg
cctttagaac
gccatggact
tctatttgta
tttttttgct
atgggtgaca
ggcagctgtg
tttaataaac
aatcaattat
tctacacagt
HPV18
I-C-7
SEP 94
86
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LESIÓN
Alma Rosa G. Fernández Salinas. 2007
6661 ctcctgtacc
6721 aatatgattt
6781 cctatattca
6841 ccccaactac
6901 aaaaggatgc
6961 tggatttaaa
7021 tggttcaggc
7081 ctgccactac
<- L1 end
7141 tgtgtgtgta
7201 tgtatgattg
7261 gttggtatgt
7321 ctagtgagta
7381 tgtcctgtat
7441 ctccattttg
E2 bind ->
7501 caatacagta
7561 ttgaacaatt
7621 tgtccaggtg
7681 tgcttttagg
7741 caactacttt
7801 tgtgcataca
E2 bind ->
tgggcaatat
gcagtttatt
tagtatgaat
tagtttggtg
tgcaccggct
ggaaaagttt
tggattgcgt
gtcttctaaa
gatgctacca
tttcagttgt
agcagtattt
gatacatatc
gaaaataagg
tctttagact
cgcaagccca
cctgccaagc
aatttaagca
gtactattac
tagaggattg
gttttgtaca
atccctatga
tagatcaata
ccataggccc
gtgtgcgtgt
gtatagcaga
tttaactgca
gaactttggt
atctgttgct
taagttaaag
tccccttgga
tcgcaaacgt
acgtgccagg
catgttgagg
gatgttatgt
gttccccccc
attacctgtc
ttttggaatg
cgtaaatttt
tctgctccat
aagTAAtatg
tatatatata
cattgtatgg
ggcattaaat
acaactgtat
ttcaagttat
ctgtgcaACC
catctattgt
tatgtatggt
aaaatatgtt
ttgtgtttgt
aaaactgcac
GATTTCGGTt
tgtgtttgta
tgttgttgta
ttgtggttct
ggtatgggtg
accttacagc
gcctttggct
tgtcctgtgt
tgttgtatgt
gtgtgttatg
ttgcttgttg
atccatttta
tatgtctgtg
ttgtgtttgt
tactatattt
tggttgcgcc
ggctatatat
tcctacaatc
gttttctgca
cgctggcact
ggcgcgcctc
cgctacaaca
cacatatttt
catgtccaac
tagtttatgc
attgcaaact
tttggcgcat
attgcttgca
agtttgtttt
attctgtcta
aACCGAAATA
ttaatctttt
ataaggcgca
taactatatc
tacttaagct
cccttaacat
GGTtgggcag
gggcactgct
cctggtatta
cactccctaa
aattgcatac
gaactataat
cacatactat
cctacatatt
gtcattttcc
gtaataaaac
ttggcttgta
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Identificación de Virus de PAPILOMA HUMANO tipo 18 en pacientes con CÁNCER CERVICO-UTERINO, LESIÓN INTRAEPITELIAL CERVICAL y SIN
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