instituto potosino de investigación científica y tecnológica ac

INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIÓN
CIENTÍFICA Y TECNOLÓGICA A.C.
POSGRADO EN CIENCIAS EN BIOLOGIA MOLECULAR
ANÁLISIS PROTEÓMICO DE AMARANTO (Amaranthus
hypochondriacus) BAJO ESTRÉS POR SEQUÍA
Tesis que presenta
José Ángel Huerta Ocampo
Para obtener el grado de
Maestro en Ciencias en Biología Molecular
Directora de la Tesis
Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa
San Luis Potosí, SLP, Julio de 2008.
Créditos institucionales
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Proteómica y Expresión Génica de
la División de Biología Molecular del Institutio Potosino de Investigación Científica
y Tecnológica A.C., bajo la dirección de la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa.
Durante la realización de este trabajo el autor recibió una beca acedémica del
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (204127) y del Instituto Potosino de
Investigación Científica y Tecnológica A.C.
iii
Dedicatoria
A mi madre y hermano
v
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa
Al Dr. Antonio De León Rodríguez
A mis sinodales
Al Dr. Guillermo Mendoza Hernández de la Facultad de Medicina de la UNAM por
su colaboración en el análisis de espectrometría de masas.
A la Dra. Alicia Chagolla de la Unidad de Proteómica del CINVESTAV Unidad
Irapuato por las facilidades otorgadas para la digestión de proteínas.
A los compañeros del Laboratorio de Proteómica y Expresión Génica
A los compañeros de la mesa 6 de “La cabaña de Don Raúl”
A los amigos (IPICYT, Foreing Power, Base Lab, Los Bultos)
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada (204127)
Al Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica A.C.
vi
ÍNDICE GENERAL
Pag
ÍNDICE GENERAL ……………………………………………………………. vii
ÍNDICE DE TABLAS ……………………………………………………….....
ix
ÍNDICE DE FIGURAS..………………………………………………………..
x
LISTA DE ABREVIATURAS.....................................................................
xi
RESUMEN ……………………………………………………………………... xii
ABSTRACT …………………………………………………………………….
xiii
I. INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………. 1
1.1 El amaranto ………………………………………………………………………..
1
1.2 Sequía ……………………………………………………………………………...
2
1.3 Identificación de mecanismos de respuesta a sequía ………………………..
2
II. OBJETIVOS…………………………………………………………………. 5
2.1 Objetivo general …………………………………………………………………...
5
2.2 Objetivos particulares …………………………………………………………….
5
III. MATERIALES Y MÉTODOS ……………………………………………..
6
3.1 Cultivo de plantas de amaranto (Amaranthus hypochondriacus) y
tratamiento para generar estrés por sequía…………………………………………
6
3.2 Extracción de proteínas de amaranto……………………………………………
7
3.3 Rehidratación y Cuantificación de proteínas……………………………………
9
3.4 Electroforesis en doble dimensión (2-DE)…………….………………………...
11
3.4.1 Primera dimensión: Separación de proteínas por punto
isoeléctrico o Isoelectroenfoque……...................................................…
11
3.4.2 Segunda dimensión: separación de proteínas por peso molecular
en SDS-PAGE………………………………………………………………...
13
3.5 Tinción………………………………………………………………………………
13
3.5.1 Tinción con azul brillante de Coomassie…………………………….
13
3.5.2 Tinción con Sypro® Ruby……………………………………………..
14
3.6 Adquisición y análisis de imágenes……………………………………………...
14
3.7 Análisis estadístico………………………………………………………………...
15
vii
3.8 Espectrometría de masas…………………………………………………………
15
3.8.1 Digestión en gel………………………………………………………...
15
3.8.2 Extracción y purificación de péptidos………………………………..
16
3.8.3 Espectrometría de masas ……………………..……………………..
17
3.9 Análisis bioinformático…………………………………………………………….
17
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………… 18
4.1 Respuesta de las plantas de amaranto al estrés por sequía………………....
18
4.2 Métodos de extracción de proteínas de amaranto para electroforesis
bidimensional……………………………………………………………………….......
21
4.3 Análisis proteómico de amaranto (Amaranthus hypochondriacus) bajo
estrés por sequía……………………………………………………………………….
4.3.1
Análisis
proteómico
de
raíz
de
amaranto
24
(Amaranthus
hypochondriacus) bajo estrés por sequía………………………………….
24
4.3.1.1 Identificación de proteínas de raíz de amaranto en
respuesta a sequía………………………………………………….
25
4.3.1.2 Proteínas de raíz de amaranto sobreexpresadas en
respuesta a sequía………………………………………………….
27
4.3.1.3 Proteínas de raíz de amaranto reprimidas en respuesta
a sequía………………………………………………………………
32
4.3.2 Análisis proteómico de hoja de amaranto (Amaranthus
hypochondriacus) bajo estrés por sequía………………………………….
34
4.3.2.1 Identificación de proteínas de hoja de amaranto
mediante espectrometría de masas……………………………….
35
4.3.2.2 Proteínas de hoja de amaranto sobreexpresadas en
respuesta a sequía………………………………………………….
37
4.3.2.3 Proteínas de hoja de amaranto reprimidas en
respuesta a sequía………………………………………………….
40
V. CONCLUSIONES…………………………………………………………... 44
VI. REFERENCIAS…..………………………………………………………..
45
APÉNDICE……….…………………………………………………………….
51
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para la determinación de
proteínas totales mediante el método de Bradford……………………………....
10
Tabla 2. Programación del isoelectroenfoque en el equipo Ettan IPGphor II…
12
Tabla 3. Extracción de proteínas de amaranto utilizando diferentes
métodos……………………………………………………………………………….
22
Tabla 4. Proteínas de raíz de amaranto identificadas en respuesta a sequía
mediante espectrometría de masas ………………..………………………………
28
Tabla 5. Identificación de proteínas de hoja de amaranto en respuesta a
sequía mediante espectrometría de masas ………………..……………………...
39
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de cultivo en invernadero de plantas de amaranto…..….
6
Figura 2. Curva de calibración para cuantificación de proteínas por el método
de Bradford…….………………………………………….…………………………...
11
Figura 3. Fotografías que muestran la apariencia de las plantas de amaranto
control y sometidas a sequía al día 29 en invernadero…………………………...
18
Figura 4. Recuperación de plantas de amaranto al ser rehidratadas tras
someterse a estrés por sequía............................................................................
19
Figura 5. Determinación del Contenido Relativo de Agua en hojas de
amaranto………………………………………………………………………………
20
Figura 6. Patrones bidimensionales en geles 2-DE de proteínas de raíz de
amaranto utilizando diferentes métodos de extracción……………….….……...
23
Figura 7. Gel 2-DE de proteínas de raíz de amaranto……………………….….
25
Figura 8. Cambios en la concentración de proteínas de raíz de amaranto tras
ser sometidas a sequía………………………………………………………...
26
Figura 9. Histogramas que muestran las diferencias en la cantidad de las
proteínas de raíz de amaranto en las manchas seleccionadas para análisis
mediante espectrometría de masas……………………………………………….
27
Figura 10. Gel 2-DE de proteínas de hoja de amaranto………..………………
36
Figura 11. Histogramas que muestran las diferencias en la cantidad de las
proteínas de hoja de amaranto analizadas mediante espectrometría de
masas…………………………………………………………………………………
37
x
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura
CHAPS
DTT
(p/v)
SDS
(v/v)
Tris
PM
TEMED
2-DE
PSA
c.b.p.
TCA
PVPP
2-ME
G
g
BSA
IPG
SDS-PAGE
D.O.
UPLC
Significado
3-[(3-Cholamidopropil) dimetilamonio]-1-propanosulfonato
Ditiotreitol
Relación peso/volumen
Dodecil sulfato de sodio
Relación volumen/volumen
Hidroximetil-aminometano
Peso molecular
N,N,N',N'-Tetrametilendiamina
Electroforesis en doble dimensión
Persulfato de amonio
Cuanto baste para
Ácido tricloroacético
Polivinil-polipirrolidona
2-Mercaptoetanol
Gramos
Gravedad
Albúmina sérica bovina
Gradiente inmovilizado de pH
Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS
Densidad óptica
Ultra Performance Liquid Chromatography
xi
RESUMEN
La sequía es uno de los principales factores que limitan la productividad agrícola
mundial, las pérdidas originadas por sequía en cultivos de importancia económica
son superiores a las provocadas por cualquier otro factor biótico o abiótico. La
exposición de las plantas a ambientes con limitación de agua desencadena
cambios fisiológicos regidos por la expresión de diferentes grupos de genes y
proteínas cuya actividad ayuda a las plantas a tolerar condiciones ambientales
adversas. Es necesario identificar los genes y proteínas que controlan la respuesta
al estrés en cultivos de importancia económica para facilitar su mejoramiento
biotecnológico a fin de obtener cultivos tolerantes y mejores rendimientos de las
cosechas. El amaranto es un cultivo con gran potencial pues además de ser rico
en proteínas y compuestos nutracéuticos, puede crecer en condiciones de poca
agua y altas temperaturas, lo que lo convierte en un buen modelo para estudiar la
tolerancia a sequía y estrés salino. El empleo de las herramientas moleculares ha
contribuido al entendimiento de la percepción y transducción de señales en
respuesta al estrés. El estudio de los mecanismos de respuesta al estrés en
plantas mediante el enfoque proteómico es una herramienta más de la biología
molecular que puede contribuir a identificar genes y rutas metabólicas que son
cruciales para la tolerancia y la respuesta al estrés. En este trabajo se evaluó
mediante electroforesis bidimensional (2-DE) los patrones de proteínas en hoja y
raíz de plantas de amaranto sometidas a sequía. El análisis cuantitativo de los
geles 2-DE permitió detectar incrementos y disminuciones en la concentración de
proteínas tras el tratamiento aplicado, cuarenta y dos de estas proteínas se
analizaron mediante espectrometría de masas. Lo cual mostró que las proteínas
sobre-expresadas están relacionadas con la señalización en respuesta al estrés,
eliminación
de
especies
reactivas
de
oxígeno,
síntesis
de
osmolitos,
mantenimiento del correcto plegamiento y degradación de proteínas. Mientras que
las proteínas que disminuyeron su concentración están relacionadas con daño al
aparato fotosintético, disminución de la síntesis de lignina y disminución de la
actividad de la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico.
xii
ABSTRACT
Drought is one of the most important factors limiting the agricultural yield
worldwide, losses by drought on important crops are higher than those occurred by
any other biotic or abiotic stressing factor. Plant exposition to water limited
environments leads physiological changes governed by the expression of different
kinds of proteins and genes whose activity helps plants to tolerate adverse
environmental conditions. It is necessary to identify the proteins controlling stress
response on economical importance crops to facilitate its biotechnological
improvement to obtain higher yields and better tolerant crops. Amaranth is a
rediscovered crop with high potential, produces seeds with high content of proteins
and is rich in nutraceutic compounds. It can grow at high temperatures with little
quantity of water and is a good model for drought and salt stress studies. The
usage of molecular tools has contributed to understand the perception and signal
transduction in stress response. Proteomic analysis is a molecular biology tool that
offers a new approach to discovering genes and molecular pathways related to
stress responsiveness and tolerance. In this work, differential protein response in
amaranth roots and leaves under severe drought stress was evaluated by two
dimensional polyacrilamyde gel electrophoresis (2-DE). Quantitative analysis of the
2-DE gels spots made possible the identification of up and down-regulated proteins
in response to severe drought. Forty two protein spots were analyzed by mass
spectrometry. Identification of drought responsive proteins shows that up-regulated
proteins are related with signaling, elimination of reactive oxygen species,
osmolites synthesis and protein folding and degradation. Diminished responsive
proteins to severe drought stress were related to photosynthetic damage, decrease
in lignin synthesis and decrease in glucolysis and citric acid cycle activity.
xiii
I. INTRODUCCIÓN
1.1 El amaranto
El amaranto (Amaranthus hypochondriacus) es un pseudocereal de origen
americano que fue cultivado por las antiguas civilizaciones Mesoamericanas.
Formaba parte importante en la dieta básica de los aztecas junto con el maíz y el
frijol, y se cree que tras la conquista española el cultivo del amaranto fue prohibido
debido a que además de alimento se utilizaba en cultos religiosos; lo anterior
originó que pasara a ser un cultivo subutilizado, pero en 1979 la Academia
Nacional de Ciencias de los Estados Unidos y la FAO propusieron que debido a su
alta calidad nutricional el amaranto podría ser un grano con gran potencial para
ser explotado comercialmente (Nacional Academy of Science, 1984).
Las semillas de amaranto poseen alto contenido de proteína (13-17%) y su
composición de aminoácidos es cercana al balance óptimo requerido en la dieta
humana (Barba de la Rosa et al., 1992). Además, la semilla de amaranto es rica
en compuestos nutracéuticos (Silva Sánchez et al., 2008) y sus hojas poseen alto
contenido de minerales como el calcio, hierro, magnesio y fósforo; además de
vitaminas A y C (Barba de la Rosa et al. 2006).
El amaranto es una planta con metabolismo del tipo C4 y es una de las
pocas dicotiledóneas cuyo primer producto de la fotosíntesis contiene cuatro
carbonos. Lo que origina un incremento en la eficiencia del uso del CO2 bajo
diferentes condiciones de temperatura y humedad, esto lo convierte en una planta
bastante adaptable por lo que se considera un cultivo alternativo capaz de crecer
en lugares en donde cereales y otros cultivos de importancia económica no
pueden hacerlo (Paredes López et al., 1991). Es un cultivo muy resistente ya que
tolera suelos arenosos y con alto contenido de sales, es capaz de crecer en
condiciones de poca agua y altas temperaturas, lo que lo convierte en un buen
modelo para estudiar la tolerancia a sequía y estrés salino.
1
1.2 Sequía
La escasez de alimentos es unos de los problemas serios con los que ha de
enfrentarse la humanidad en este siglo. Los cereales como el arroz, trigo y maíz
proveen la mitad de las calorías consumidas por la población mundial. Se estima
que para satisfacer la creciente demanda de alimentos debido al rápido
crecimiento de la población mundial, la producción de granos deberá
incrementarse en un 50% hacia el año 2025 (Khush, 2001).
Gran parte de las tierras cultivadas se encuentran en condiciones no
óptimas para el crecimiento de los cultivos convencionales. Cerca del 70% del
potencial productivo se pierde debido a condiciones desfavorables como la sequía
y diferentes tipos de estrés biótico y abiótico.
La sequía es uno de los principales factores que limitan la productividad
agrícola mundial (Boyer, 1982). Las pérdidas originadas por sequía en cultivos de
importancia económica probablemente sean superiores a las provocadas por
cualquier factor biótico o abiótico.
1.3 Identificación de mecanismos de respuesta a sequía
Es necesario identificar los genes y proteínas que controlan la respuesta de
las plantas a la sequía, con el fin de facilitar el mejoramiento biotecnológico de
plantas (Salekdeh y Komatsu 2007) y obtener cultivos tolerantes, dando como
resultado mejores rendimientos de las cosechas.
Por tal razón, es importante el estudio de los mecanismos de respuesta al
estrés por sequía en cultivos de importancia económica (como el arroz, maíz,
trigo, etc.) y cultivos con gran potencial como el amaranto, que además de ser un
alimento con alto valor nutricional es capaz de manera natural de crecer en
ambientes con poco agua, lo que lo convierte en un buen modelo de estudio.
2
La exposición de las plantas a ambientes con limitación de agua
desencadena cambios fisiológicos como son: la modificación de la turgencia,
cambios en la fluidez y composición de las membranas, reducción de la actividad
fotosintética, acumulación de osmoprotectores, cambios en el metabolismo del
carbono, entre otros (Chávez et al., 2004).
El entendimiento de los mecanismos moleculares y fisiológicos básicos de
la percepción del estrés, la transducción de señales y los mecanismos de
tolerancia en plantas es actualmente uno de los retos de la biología (Valliyodan et
al., 2006).
El empleo de las herramientas de la genética ha contribuido al
entendimiento de la percepción y transducción de señales en respuesta al estrés.
Esto ha permitido identificar un importante número de genes inducidos por estrés
así como varios factores transcripcionales que regulan los sistemas de respuesta
en plantas inducidos por el estrés por sequía (Valliyodan et al., 2006).
El análisis de la expresión de RNA mensajero por varios métodos (SAGE,
Microarreglos, Hibridación sustractiva) se ha empleado para analizar la respuesta
al estrés en plantas. Sin embargo, algunos estudios han demostrado que no existe
una correlación directa entra la cantidad de RNA mensajero y la cantidad de
proteína sintetizada, ya que el RNA mensajero esta sujeto a varios mecanismos
de control transcripcional (Splicing alternativo, poliadenilación, edición) y las
proteínas sintetizadas a partir de estos mensajeros pueden experimentar diversas
modificaciones post-traduccionales como: fosforilaciones, glicosilaciones, cortes
proteolíticos (Graves et al., 2002); mismos que definirán el papel que juegue la
proteína en la célula bajo una condición o estrés determinado.
El estudio de los mecanismos de respuesta al estrés en plantas mediante el
enfoque proteómico es una herramienta más de la biología molecular que puede
3
contribuir a identificar genes y rutas metabólicas que son cruciales para la
tolerancia y la respuesta al estrés (Salekdeh y Komatsu 2007).
4
II. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Analizar mediante un enfoque proteómico la respuesta de amaranto
(Amaranthus hypochondriacus) al estrés por sequía.
2.2 Objetivos particulares
Obtener
extractos
de
proteínas
de
hoja
y
raíz
de
Amaranthus
hypochondriacus. Que sean compatibles con la separación mediante electroforesis
en doble dimensión (2-DE).
Analizar la respuesta de la raíz de amaranto (Amaranthus hypochondriacus)
a estrés por sequía mediante electroforesis en doble dimensión (2-DE) e identificar
proteínas diferencialmente expresadas mediante espectrometría de masas.
Analizar la respuesta a estrés por sequía en hoja de amaranto (Amaranthus
hypochondriacus), mediante electroforesis en doble dimensión (2-DE) e identificar
proteínas diferencialmente expresadas mediante espectrometría de masas.
5
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Cultivo de plantas de amaranto (Amaranthus hypochondriacus) y
tratamiento para generar estrés por sequía
Se germinaron semillas de Amaranthus hypochondriacus variedad Nutrisol
en una mezcla de sustrato comercial (Sunshine Premix 3, Sun Gro Horticulture
Inc. Bellevue, Washington. USA). Una vez germinadas, las plántulas fueron
trasplantadas el día 11 a bolsas de plástico de 15 x 25 cm que contenían el mismo
sustrato en donde se germinaron y fueron cultivadas 22 días más en invernadero,
se determinó el contenido de agua del suelo (Hydrosense, Campbell Scientific,
INC.) y este se mantuvo entre un 30-35%.
A partir de un lote de 60 plantas se formaron 3 grupos de 20 plantas. Para
provocar el estrés por sequía se dejó de suministrar agua a dos de los tres grupos
a partir del día 22 en invernadero (Figura 1). Al llegar al día 29 un grupo de plantas
sometidas a sequía se rehidrató.
Figura 1. Esquema de cultivo en invernadero de plantas de amaranto.
Se determinó el contenido relativo de agua (CRA) en hojas de los diferentes
grupos de plantas de acuerdo con el método reportado por Barrs y Weatherly
6
(Barrs y Weatherly, 1962). Para lo cual se determinaron los pesos: fresco (PF),
turgente (PT) y seco (PS) en hojas de 4 plantas de cada grupo seleccionadas al
azar y finalmente se calculó el contenido relativo de agua (CRA) utilizando la
siguiente fórmula:
CRA= [(PF-PS)/(PT-PS)] x 100
Se recolectaron muestras de hoja y raíz, se congelaron en nitrógeno líquido
y se almacenaron a -80°C.
3.2 Extracción de proteínas de amaranto
En el caso de las hojas de amaranto, la extracción de proteínas totales se
realizó por triplicado, mediante el método de extracción reportado por Saravanan y
Rose (2004) basado en precipitación con ácido tricloroacético y acetona (TCA-A),
con algunas modificaciones. Las hojas se molieron en nitrógeno líquido con la
ayuda de un molino para granos y se suspendieron en 3 volúmenes de acetona
fría con 10% de TCA, 1% de PVPP y 2% de 2-Mercaptoetanol.
La mezcla se homogenizó durante 15 minutos en hielo con la ayuda de un
sonicador (GE-505, Ultrasonic Procesor), una vez homogenizada se centrifugó a
2000g durante 2 minutos a 4°C (Super T21, Sorvall); el sobrenadante se dejó
precipitar durante toda la noche a -20°C. Se centrifugó a 13000 g durante 30
minutos a 4°C para obtener la pastilla de proteínas que se lavó varias veces en
acetona fría, se secó a temperatura ambiente hasta eliminar el exceso de acetona
y se almacenó a -80°C.
En el caso de las raíces se probaron 4 diferentes métodos a fin de
encontrar aquel que combinara la mejor relación entre rendimiento de proteínas y
ausencia de contaminantes que interfirieran con el isoelectroenfoque y la
resolución de la electroforesis bidimensional.
7
En todos los casos las raíces se molieron en nitrógeno líquido con la ayuda
de un molino para granos hasta obtener un polvo fino a partir del cual se realizó la
extracción de proteínas.
Extracción de proteínas de raíz de amaranto por el método TCA-C
Se mezclaron 5 gramos de raíz de amaranto molida con 15 mL de acetona
fría con 10% de TCA y 0.07% de β-mercaptoetanol. La mezcla se homogenizó
durante 15 minutos en hielo con la ayuda de un sonicador (GE-505, Ultrasonic
Procesor) una vez homogenizada se centrifugó a 2000 g durante 2 minutos a 4°C
(Super T21, Sorvall); el sobrenadante se dejó precipitar durante toda la noche a 20°C. Se centrifugó a 13000 g durante 30 minutos a 4°C para obtener una pastilla
de proteínas que se lavó 3 veces en acetona fría, se secó a temperatura ambiente
hasta eliminar el exceso de acetona y se almacenó a -80°C.
Extracción de proteínas de raíz de amaranto por el método TCA-A
Se mezclaron 5 gramos de raíz de amaranto molida con 15 mL de acetona
fría con 10% de TCA, 1% de PVPP y 2% de β-mercaptoetanol. La mezcla se
homogenizó durante 15 minutos en hielo con la ayuda de un sonicador (GE-505,
Ultrasonic Procesor), una vez homogenizada se centrifugó a 2000 g durante 2
minutos a 4°C (Super T21, Sorvall); el sobrenadante se dejó precipitar durante
toda la noche a -20°C. Se centrifugó a 13000 g durante 30 minutos a 4°C para
obtener una pastilla de proteínas que se lavó 1 vez con metanol y tres veces mas
en acetona fría, se secó a temperatura ambiente hasta eliminar el exceso de
acetona y se almacenó a -80°C.
Extracción de proteínas de raíz de amaranto por el método TCA-B
Se mezclaron 5 gramos de raíz con 15 mL de solución de extracción (tris 40
mM, 1% polivinilpolipirrolidona (PVPP), EDTA 10 mM, PMSF 1 mM) La mezcla se
8
homogenizó durante 15 minutos en hielo con la ayuda de un sonicador (GE-505,
Ultrasonic Procesor) y una vez homogenizada se centrifugó a 10000 g durante10
minutos a 4°C (Super T21, Sorvall); el sobrenadante se mezcló con 3 volúmenes
de acetona fría con 10% de TCA y 2% de β-mercaptoetanol y se dejo precipitar
durante toda la noche a -20°C. Se centrifugó, lavó y secó de la misma manera que
en el método TCA-A, y se almacenó a -80ºC.
Extracción de proteínas de raíz de amaranto por el método de extracciónliofilización
Se mezclaron 5 gramos de raíz con 15 mL de solución de extracción (tris 40
mM, 1% polivinilpolipirrolidona (PVPP), EDTA 10 mM, PMSF 1 mM) La mezcla se
homogenizó durante 15 minutos en hielo con la ayuda de un sonicador (GE-505,
Ultrasonic Procesor) y una vez homogenizada se centrifugó a 10000 g durante 10
minutos a 4°C (Super T21, Sorvall); se obtuvo el sobrenadante y se liofilizó
(Freezone 6®, LABCONCO).
3.3 Rehidratación y Cuantificación de proteínas
Las pastillas de proteínas de hoja y raíz se re-suspendieron en solución de
rehidratación (Urea 8 M, CHAPS 2%) con 0.5% de IPG buffer (Amersham) rango
de pH 4-7 y 0.56% de DTT.
La concentración de proteínas totales solubles se determinó mediante el
método de Bradford utilizando el kit comercial Protein Assay (Bio-Rad, Hércules,
CA, USA) y BSA como estándar.
Se preparó una solución stock de BSA (Sigma Aldrich) con una
concentración de 100 mg/mL. Esta se diluyó en solución de rehidratación (Urea 8
M, CHAPS 4%, Azul de bromofenol 0.02%, 0.56% de DTT y 0.5% de IPG buffer) a
una concentración de 2 mg/mL a partir de esta solución se prepararon diluciones
9
con las que se realizó una curva de calibración por duplicado como se muestra en
la Tabla 1.
Tabla
Preparación de la curva de calibración para la determinación de proteínas
1
totales mediante el método de Bradford.
Concentración de proteínas
Estándar
Solución de rehidratación + DTT e
totales
BSA 2
IPG buffer
mg/mL
mg/mL
(µL)
(µL)
1
0.0
0
100
2
0.2
10
90
3
0.4
20
80
4
0.6
30
70
5
0.8
40
60
6
1.0
50
50
7
1.2
60
40
8
1.4
70
30
La determinación de proteínas totales de estándares de la curva de
calibración (Figura 3) y de las muestras problema se realizó de la siguiente
manera: se preparó el reactivo de trabajo, diluyendo 1:5 el reactivo de Bradford en
agua Milli-Q.
Se agregaron 20 µL de cada estándar o muestra a 1 mL de reactivo de
trabajo, se mezcló y se incubó 5 minutos a temperatura ambiente, protegido de la
luz y se determinó la absorbancia a 595 nm dentro de los siguientes 30 minutos.
10
Figura
Curva de calibración para cuantificación de proteínas por el método de
2.
Bradford. La ecuación de la recta fue: Y=0.855X+0.022, r2=0.997.
3.4 Electroforesis en doble dimensión (2-DE)
3.4.1 Primera dimensión: Separación de proteínas por punto isoeléctrico o
Isoelectroenfoque
Para el isoelectroenfoque se utilizaron tiras de gradiente inmovilizado de pH
de 13 cm de largo (ImmobilineTM DryStrip, GE Healthcare, Uppsala, Suecia) con
diferentes rangos de pH (3-10, 4-7). Estas tiras se rehidrataron durante 16 horas a
temperatura ambiente con 250 µL de solución de rehidratación (Urea 8 M, CHAPS
2%, Azul de bromofenol 0.02%, DTT 0.56%, IPG buffer 0.5%) en una charola de
rehidratación (Amersham, Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) de la siguiente
manera:
Se depositaron 250 µL de solución de rehidratación con una cantidad
determinada de proteínas en la charola de rehidratación, por separado se retiró la
cubierta protectora de la tira de gel con IPG (gradiente inmovilizado de pH) y se
11
colocó la tira en la bandeja de rehidratación de tal manera que el gel de la tira
estuviese en contacto con la solución de rehidratación evitando la formación de
burbujas. Para evitar la evaporación de la solución de rehidratación se cubrió la
tira con 3 mL de aceite mineral (GE Healthcare, Upssala, Suecia). La rehidratación
se llevó a acabo a temperatura ambiente durante 16 horas.
Transcurrida la rehidratación las tiras se colocaron sobre los carriles de la
charola para isoelectroenfoque del equipo EttanTM IPGphorTM Isoelectric Focusisng
System (Amersham Biosciences) con el gel de la tira orientado hacia arriba y la
marca + impresa en la tira orientada hacia el ánodo. Cada carril se cubrió con 9
mL de aceite mineral (Plus One, Amersham Biosciences) se colocaron esponjas
de papel hidratadas con 125 µL de agua desionizada a cada extremo de la tira y
se colocaron los electrodos de manera que hicieran contacto con las esponjas y la
plataforma del equipo.
El isoelectroenfoque se llevó a cabo a 20°C y las condiciones de corrimiento
fueron programadas en la modalidad Volt-Hora como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Programación del isoelectroenfoque en el equipo Ettan IPGphor II.
Paso Modo de voltaje Voltaje máximo (V) Voltz-hora
(kVh)
1
Gradiente
150
0.15
2
Gradiente
500
0.01
3
Gradiente
4000
5.6
4
Constante
8000
15.2
Una vez que transcurrió el isoelectroenfoque se eliminó el exceso de aceite
mineral de las tiras de IPG y se prosiguió con la segunda dimensión o bien las
tiras de IPG se almacenaron a -20°C para continuar después con la separación
por peso molecular.
12
3.4.2 Segunda dimensión: separación de proteínas por peso molecular en
SDS-PAGE
Después de la separación por punto isoeléctrico, las tiras de IPG se
sumergieron en solución Buffer de Equilibrio con SDS (Tris 50 mM pH 8.8, Urea 6
M, Glicerol 30%, SDS 2%, Azul de bromofenol 0.002%) con DTT al 1% durante 15
minutos en agitación constante para posteriormente sumergirse durante 15
minutos más en la misma solución Buffer de Equilibrio pero ahora con 2.5% de
iodoacetamida en lugar de DTT. Las tiras se lavaron con buffer de electroforesis
(Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1%) y se transfirieron a un gel vertical para
SDS-PAGE al 13% (con una relación acrilamida:bis-acrilamida de 29:1) y se fijaron
con solución de sellado (ver solución O, apéndice).
Una vez gelificada la solución de sellado, se llenó la cámara de
electroforesis (HoefferTM SE600 RubyTM, Amersham Biosciences) con buffer de
electroforesis (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1%) y se agregaron 2 µL de
marcadores de peso molecular (BenchMarkTM Protein Ladder, Invitrogen) en el
carril lateral.
La electroforesis se llevó a cabo a 10 mA por gel durante 2 horas seguida
de 30 mA por gel hasta que el frente de corrimiento alcanzara el final del gel y se
saliera.
3.5 Tinción
3.5.1 Tinción con azul brillante de Coomassie
Los geles se sumergieron durante 30 minutos bajo agitación suave en
solución de fijado (metanol 50%, ácido acético 10%), una vez retirada la solución
de fijado se sumergieron durante toda la noche bajo agitación en solución de azul
13
brillante de Coomassie R-250 al 0.025% (ver apéndice) y se destiñeron mediante
varios lavados con solución de desteñido (metanol 50%, ácido acético 10%) hasta
observar los geles libres de tinción de fondo (fondo transparente), se lavaron
varias veces con agua Milli-Q hasta que los geles eliminaran el metanol de la
solución de desteñido y recuperaran su tamaño normal.
3.5.2 Tinción con Sypro® Ruby
Los geles se sumergieron durante 1 hora en solución de fijado para 2-DE
(Ver apéndice) bajo agitación suave, después se lavaron 3 veces con agua Milli-Q
durante 10 minutos bajo agitación. Una vez lavados, se sumergieron en Sypro ®
Ruby Protein Gel Stain (Molecular ProbesTM) y se agitaron durante toda la noche
protegidos de la luz.
Una vez teñidos los geles, se transfirieron a un contenedor con solución de
lavado (metanol 10%, ácido acético 7%) y se agitaron durante 30 minutos para
después someterlos a tres lavados de 5 minutos con agua Milli-Q.
3.6 Adquisición y análisis de imágenes
Los geles se escanearon en el equipo Gel Logic 100 Imaging System
(Kodak) y se analizaron con el programa PDQuestTM 2-D Analysis Softaware
v7.2.0 (Biorad). Al menos tres geles por condición (Riego normal y sequía) se
analizaron para raíz y hoja de amaranto.
Se realizó la detección de manchas, se obtuvieron los porcentajes del
volumen representado por cada mancha en los geles bidimensionales y se
determinó el peso molecular aparente con base en la posición de las manchas
respecto a los marcadores de peso molecular utilizados, se determinó el punto
isoeléctrico de cada una de ellas con base en la migración de las manchas de
proteínas en las tiras de gradiente de pH inmovilizado (pH 4-7 lineal).
14
3.7 Análisis estadístico
Se evaluó mediante electroforesis bidimensional la respuesta de proteínas
en hoja y raíz de plantas de amaranto sometidas a riego normal y sequía. El
análisis cuantitativo de los geles 2-DE se realizó por triplicado con la ayuda del
programa PDQuestTM 2-D Analysis Softaware v7.2.0 (Biorad), y permitió detectar
incrementos o disminuciones en la concentración de proteínas tras el tratamiento
aplicado.
Para conocer si las diferencias cuantitativas observadas como cambio en la
intensidad de las manchas en los geles de hoja y raíz sometidos a sequía, en
comparación con las plantas sometidas a riego normal eran significativas, se
realizó un análisis de varianza de una vía (One Way ANOVA) con un límite de
confianza del 95% utilizando el programa Statgraphics Plus v 5.0 (el efecto del
tratamiento fue significativo cuando p <0.05).
3.8 Espectrometría de masas
Se seleccionaron 20 manchas de raíz y 21 manchas de hoja que mostraron
diferencias cuantitativas, además de una mancha que solo apareció en las hojas
sometidas a sequía.
Las manchas seleccionadas se cortaron de los geles con puntas para
micropipeta estériles y se almacenaron a -20°C para su posterior digestión en gel
con tripsina, extracción y purificación de péptidos y análisis mediante
espectrometría de masas.
3.8.1 Digestión en gel
Las manchas de proteínas en gel se cortaron en pedacitos de
aproximadamente 1 mm con la ayuda de un bisturí, se lavaron dos veces en 50 µL
15
de agua Milli-Q y dos veces más en 50 µL de acetonitrilo al 50%. (10 minutos por
cada lavado). Una vez lavados se retiró todo el líquido y se lavaron los pedazos
de gel en 50 µL de acetonitrilo al 100% en agitación constante durante 10 minutos.
Se retiró el acetonitrilo y se agregaron 25 µL de NH4HCO3 100 mM a los 5 minutos
se agregaron 25 µL de acetonitrilo al 100% y se incubó a temperatura ambiente
durante 15 minutos en agitación y se retiró todo el líquido posible.
Para reducir y alquilar las proteínas, se rehidrataron los pedazos de gel en
50 µL de DTT 10 mM se incubaron a 56°C por 45 minutos en agitación, se dejó
enfriar los tubos a temperatura ambiente, se removió el líquido y se agregaron 50
µL de Iodoacetamida (10 mg/mL) y se incubó 30 minutos en la oscuridad.
Se removió la solución y se lavaron los pedazos de gel con 100 µL de
NH4HCO3 100 mM/acetonitrilo al 100% en partes iguales y se incubaron 15
minutos. Se lavó una vez más con acetonitrilo al 100% durante 15 minutos y se
retiró todo el líquido posible.
Para la digestión con tripsina se rehidrataron los pedazos de gel
perfectamente secos con 15 µL de solución de digestión (ver apéndice) y se
incubaron en hielo durante 45 minutos, se retiró el líquido remanente y se
reemplazó con 20 µL de NH4HCO3 50 mM y se incubó toda la noche a 37°C.
3.8.2 Extracción y purificación de péptidos
Se colocó el sobrenadante de la digestión con tripsina en tubos de 0.6mL
previamente enjuagados con ácido trifluoroacético (TFA) al 1% o ácido fórmico al
5%. Se agregaron 25 µL de agua al tubo de la digestión y se agitó durante 10
minutos, se centrifugó y se recuperó el sobrenadante. Este paso se repitió dos
veces más agregando una solución de acetonitrilo al 50%/ácido fórmico al 5% y se
colectaron todos los sobrenadantes. Los sobrenadantes se concentraron hasta un
16
volumen de 10–15 µL y se agregó ácido fórmico al 50% hasta obtener una
concentración final del 5%.
3.8.3 Espectrometría de masas
Los péptidos se separaron mediante Cromatografía de Líquidos de Ultra
Presión UPLC (Nano-Aquity, Waters), se sometieron a ionización en electrospray y
se analizaron en un espectrómetro de masas (3200 QTRAP, Applied Biosystems)
para obtener los tamaños de los péptidos.
3.9 Análisis bioinformático
Los datos obtenidos de la espectrometría de masas se utilizaron para
descubrir la identidad de las proteínas con la ayuda del servidor MASCOT v2.2
(Matrix Sciene, London, UK; http://www.matrixscience.com/).
La búsqueda se realizó contra la base de datos no redundante del NCBI,
utilizando los datos de los péptidos analizados. La búsqueda se realizó ingresando
las masas monoisotópicas de los péptidos utilizando los siguientes parámetros:
Protein Mass: Unrestricted; Peptide Mass Tolerance: ± 1.2 Da; Fragment Mass
Tolerance: ± 0.6 Da; Max Missed Cleavages: 1.
Se utilizó como categoría taxonómica el subreino viridiplantae; las
búsquedas
tomaban
en
cuenta
las
posibles
modificaciones
siguientes:
carboxiamidometilacion de las cisteínas y oxidación de las metioninas.
17
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Respuesta de las plantas de amaranto al estrés por sequía
Al llegar al día 29 el contenido de agua del suelo de los 2 grupos sometidos
a sequía fue del 3% y las plantas mostraban pérdida de la turgencia y
enrollamiento de las hojas (Figura 3).
Figura 3.
Fotografías que muestran la apariencia de plantas de amaranto control
(izquierda) y sometidas a sequía (derecha) al día 29 en invernadero.
Un grupo de plantas sometidas a sequía se rehidrató y se observó que al
transcurrir dos y media horas, las hojas se desenrollaban y las plantas
recuperaban la turgencia, mientras que a las cinco horas las plantas se
observaban recuperadas por completo (Figura 4).
18
Figura 4.
Recuperación de plantas de amaranto al ser rehidratadas tras
someterse a estrés por sequía.
Se considera que las plantas tolerantes a sequía son aquellas capaces de
mantener constante el contenido de agua de sus tejidos o de sobrevivir a la
reducción drástica de este en condiciones adversas o bien son capaces de
recuperarse completamente de los efectos de la sequía al ser rehidratadas
(Cabuslay et al., 1999).
El contenido relativo de agua (CRA) ha sido considerado como un indicador
de la tolerancia a la desecación en cultivos como la soya y el trigo (Villalobos et
al., 1990). Se estima que el CRA es un determinante principal de la actividad
metabólica y de la sobrevivencia foliar y se considera este parámetro como una
perspectiva más confiable que las mediciones termodinámicas p.ej. potencial
hídrico, para analizar las respuestas fisiológicas a la desecación (Villalobos et al.,
1990).
En este trabajo se observó que las plantas de amaranto sometidas a sequía
progresiva se mantenían turgentes aún con niveles de contenido de agua del
suelo del 5-7%. En el último día del tratamiento el contenido de agua del suelo de
19
las plantas sometidas a sequía fue del 3% y las plantas mostraban pérdida de la
turgencia y enrollamiento de las hojas. Un grupo de plantas sometidas a sequía se
rehidrató y se observó que al transcurrir dos y media horas, las hojas se
desenrollaban y las plantas recuperaban la turgencia, mientras que a las cinco
horas las plantas se observaban recuperadas por completo.
Al determinar el CRA en hojas de amaranto (Figura 5); se observó que las
plantas sometidas a sequía presentaron un CRA de 45.39 (± 7.12), esto es
indicativo de que el grado de estrés al que se sometieron fue severo. Mientras que
las plantas control presentaron un CRA de 95.14% (± 0.43) indicativo de su buen
estado de hidratación. En el caso de las plantas rehidratadas tras someterse a
sequía, su CRA se incrementó a niveles del 90.20% (± 2.0) adquiriendo una a
apariencia indistinguible de las plantas control.
Figura 5.
Determinación del Contenido Relativo de Agua en hojas de amaranto.
(n=4)
20
Al comparar la respuesta en cultivos de frijol susceptibles y tolerantes a
déficit de agua, Montalvo-Hernández et al., (2008) observaron que al someter
ambas variedades a sequía severa (CRA menor del 50%), la variedad susceptible
alcanzaba su punto de marchitez permanente ya que al ser rehidratadas estas
plantas no eran capaces de recuperarse, mientras que la variedad tolerante si lo
hizo. Esta característica observada en este trabajo en las plantas de amaranto es
importante ya que es distintiva de plantas tolerantes a sequía.
4.2 Métodos de extracción de proteínas de amaranto para electroforesis
bidimensional
La extracción de proteínas es quizá el proceso más importante cuando se
pretende hacer un análisis proteómico basado en geles bidimensionales (Görg et
al., 2004). Existen diferentes protocolos para extracción de proteínas de plantas
reportados en la literatura, todos con ventajas y desventajas, sin embargo, la
mejor elección para realizar un análisis proteómico basado en geles 2-DE de
plantas que no han sido analizadas mediante este enfoque es desarrollar un
método específico y optimizarlo en lugar de utilizar un protocolo optimizado para
otro tipo de planta con diferentes concentraciones de compuestos que puedan
interferir en la extracción de proteínas y en la resolución de los patrones
bidimensionales obtenidos (Gómez Vidal et al., 2008).
En el caso del amaranto se sabe que esta planta contiene altos niveles de
compuestos que pueden interferir con la extracción de proteínas y resolución de la
2-DE. Sus hojas contienen altos niveles de colorantes (Gins et al., 1998), sales de
oxalato de calcio, fenoles y polifenoles (Siener et al., 2006). En el caso de las
raíces de amaranto estas también contienen pigmentos que deben eliminarse.
En cuanto a la extracción de proteínas de hoja de amaranto se obtuvo un
rendimiento de 0.76 mg/gramo de tejido fresco (Tabla 3). Se utilizó este método ya
que en el laboratorio ya se habían probado algunos métodos y este resultó ser el
21
mejor en cuanto a rendimiento de proteínas y calidad de los geles bidimensionales
(Briones Cerecero et al., 2008).
Tabla 3. Extracción de proteínas de amaranto utilizando diferentes métodos.
Tejido
Hoja
Raíz
Rendimiento (mg de proteína/g tejido fresco)
Método
Método
Método
Método ExtracciónTCA –C
TCA-A
TCA-B
Liofilización
Nd
0.76
Nd
Nd
0.14
0.08
1.6
2.73
Los valores corresponden al promedio obtenido al realizar tres determinaciones. Nd= No determinado.
En lo que respecta a la extracción de proteínas de raíz de amaranto (Tabla
3), se obtuvo el mayor rendimiento con el método de extracción-liofilización, sin
embargo la calidad de la muestra no fue aceptable para la electroforesis
bidimensional, debido a que al liofilizar la muestra se concentran los
contaminantes y se incrementa la concentración de sales en la muestra, lo que
interfiere con la resolución del isoelectroenfoque de tal manera que al realizar la
segunda dimensión aparecen barridos horizontales y verticales; además no se
realizó correctamente la separación por punto isoeléctrico a lo largo de las tiras de
IPG (Figura 6a). Por lo que no se recomienda utilizar este método si se pretende
utilizar las proteínas extraídas para realizar geles 2-DE.
En el caso de los métodos TCA-C y TCA-A, siendo este último una
modificación del método TCA-C, los rendimientos obtenidos fueron bastante
modestos, sin embargo la calidad de la muestra permitió obtener geles
bidimensionales de calidad aceptable, detectándose 279 y 258 manchas
respectivamente, se observan mínimos barridos verticales y horizontales (Figuras
5b y 5c). Se puede observar que los patrones de proteínas obtenidos con los
diferentes métodos son bastante similares, observándose algunas proteínas que
se extraen diferencialmente dependiendo del método utilizado.
22
Figura 6.
Patrones bidimensionales de geles 2-DE de proteínas de raíz de
amaranto utilizando diferentes métodos de extracción. a) Método
Extracción-Liofilización; b) Método TCA-C; c) Método TCA-A y d)
Método TCA-B.
Los bajos rendimientos obtenidos en raíz de amaranto con estos dos
métodos contrastan con lo reportado por Saravanan y Rose (2004), quienes
reportan rendimientos superiores utilizando estos métodos en raíz de tomate.
Estas diferencias probablemente se deban a que comparada con la raíz de
tomate, la raíz de amaranto es una estructura más recalcitrante al contener mayor
cantidad de pigmentos y otros contaminantes, además de ser más fibrosa y por
tanto fue menor la cantidad de proteínas extraídas utilizando estos dos métodos
basados en extracción directa con TCA y acetona.
23
En lo que respecta al método TCA-B, el rendimiento obtenido fue menor
comparado con el método de Precipitación-Liofilización y superior a los obtenidos
mediante precipitación directa con TCA y acetona (métodos TCA-C y TCA-A), pero
a diferencia del método de Precipitación-Liofilización, que acarrea muchos
contaminantes, con el método TCA-B fue posible obtener geles 2-DE como el que
se muestra en la Figura 5d, para este gel se detectaron 392 manchas; utilizando
una menor cantidad de material biológico, lo que representa una clara ventaja
cuando el material biológico es una limitante, además se puede observar que con
este se método se logran extraer proteínas que no se extraen con los métodos
basados en la extracción directa con TCA y acetona.
4.3 Análisis proteómico de amaranto (Amaranthus hypochondriacus) bajo
estrés por sequía
Se evaluó mediante electroforesis bidimensional la respuesta de proteínas
en hoja y raíz de plantas de amaranto sometidas a sequía progresiva durante 7
días. El análisis cuantitativo de los geles 2-DE se realizó por triplicado con la
ayuda del programa PDQuestTM 2-D Analysis Softaware v7.2.0 (Biorad), y permitió
detectar incrementos o disminuciones en la concentración de proteínas tras el
tratamiento aplicado, la identificación de las proteínas se realizó mediante
espectrometría de masas.
4.3.1
Análisis
proteómico
de
raíz
de
amaranto
(Amaranthus
hypochondriacus) bajo estrés por sequía
Los efectos del tratamiento de sequía sobre los patrones de proteínas en
raíces de amaranto se analizaron mediante 2-DE. El análisis por triplicado de los
geles para las condiciones de sequía y riego normal mostró alrededor de 400
manchas de proteína reproduciblemente detectadas en todos los geles (Figura 7).
24
20 manchas de cuyo cambio en concentración fue significativo se
seleccionaron para su análisis mediante espectrometría de masas (Figura 7). La
Figura 8 muestra el cambio en la intensidad de las manchas seleccionadas entre
la condición control y sequía. La Figura 9 muestra el cambio en la concentración
de las manchas seleccionadas.
Figura 7.
Gel 2-DE de proteínas de raíz de amaranto. Las flechas indican las 20
manchas diferenciales analizadas mediante espectrometría de masas.
4.3.1.1 Identificación de proteínas de raíz de amaranto en respuesta a sequía
De las 20 manchas de proteínas diferencialmente expresadas en respuesta
a sequía y analizadas por espectrometría de masas (Tabla 4), en cinco de los
casos (manchas 9,14,15,17 y 18) no fue posible la identificación, esto debido a
que no se obtuvo un buen match al realizar la búsqueda de los péptidos contra la
base de datos no redundante del NCBI.
25
Figura 8.
Cambios en la concentración de proteínas de raíz de amaranto tras ser
sometidas a sequía. (A, C y E) raíces control. (B, D y F) raíces
sometidas al tratamiento de sequía.
Entre las 15 manchas de proteína que se logró identificar, 10 fueron
manchas que se sobre expresaron y entre estas se encontraron: 5 proteínas
pequeñas de choque térmico (Small Heat Shock Proteins “sHSPs”), Dos diferentes
proteínas de unión a RNA ricas en glicina (putative glycine-rich RNA binding
proteins), una superoxido dismutasa (SOD Cu-Zn), la nucleósido difosfato cinasa 1
(NDPK 1) y el precursor de una chaperonina de 21 kilodaltones (CPN 21).
Las 5 manchas de proteínas disminuidas en respuesta a sequía
correspondieron a: Dos diferentes S-adenosil metionina sintetasas, isoflavona
reductasa, adenosina cinasa y la ácido caféico 3-O metiltransferasa (COMT).
26
Figura 9.
Histogramas que muestran las diferencias en la cantidad de las
proteínas de raíz de amaranto en las manchas seleccionadas para
análisis mediante espectrometría de masas.
4.3.1.2 Proteínas de raíz de amaranto sobre expresadas en respuesta a
sequía.
Proteínas pequeñas de choque térmico (Manchas 6, 7, 8 10 y 16)
El estrés abiótico origina disfunción de las proteínas celulares, de ahí que
sea importante para las células mantener sus proteínas en su conformación
funcional y prevenir su agregación bajo condiciones de estrés. Las proteínas de
choqué térmico son componentes clave que contribuyen a mantener la
homeostasis celular. Estas proteínas son responsables del plegamiento correcto,
ensamblaje, translocación y degradación de otras proteínas; también participan en
la estabilización de las membranas y el re-plegamiento de proteínas bajo
condiciones de estrés (Wang et al., 2004).
27
Tabla 4.
Proteínas de raíz de amaranto identificadas en respuesta a sequía mediante
espectrometría de masas.
No.a
Factor de
inducciónb
Score‡
1↑
1.35*
109
2↓
0.39*
3↓
No. de
accesoc
Masa
(kDa) / pI
Expd
Masa
(kDa) / pI
Teóricoe
Fuente
Precursor de Chaperonina 21
gi|7331143
22.6 / 5.43
26.5 / 6.85
Lycopersicon esculentum
401
S-adenosilmetionina sintetasa 2
gi|127046
43.4 / 5.66
43.2 / 5.57
Dianthus caryophillus
0.49*
506
S-adenosilmetionina sintetasa
gi|71000465
43.1 / 5.97
42.9 / 5.60
Beta vulgaris
4↑
4.68*
45
Proteína de unión a RNA rica en
glicina 1. Putativa
gi|6911142
15.4 / 6.54
14.1 / 8.71
Catharanthus roseus
5↑
2.10*
52
Proteína de unión a RNA rica en
glicina 2. Putativa
gi|6911146
18.8 / 6.33
16.2 / 7.82
Catharanthus roseus
6↑
2.79*
122
Proteína citosólica
térmico clase 1.
choque
gi|37704425
16.8 / 5.65
15.3 / 5.82
Nicotiana tabacum
7↑
1.81*
93
Proteína de choque térmico de clase
I 17.5 kDa.
gi|38639431
16.2 / 5.64
17.5/5.31
Carica papaya
8↑
2.40*
95
Proteína se choque térmico de bajo
peso molecular.
gi|159138945
19.6 / 6.04
18.3 / 6.34
Gossypium hirsutum
9↑
2.28*
---
No identificada
---
17.7 / 4.90
---
10 ↑
1.31*
138
Proteína pequeña de choque térmico
gi|16930753
17.5 / 5.47
17.9 / 5.82
Retama raetam
11 ↓
0.66*
48
Isoflavona reductasa putativa
gi|18410820
32.5 / 5.46
33.7 / 5.66
Arabidopsis thaliana
12 ↓
0.73*
92
Adenosina cinasa 1
gi|15232763
38.5 / 5.11
37.8/ 5.29
Arabidopsis thaliana
13 ↓
0.60*
119
Ácido caféico 3-O- metiltransferasa
gi|3176967
36.8 / 6.14
38.6 / 5.70
14 ↑
1.66*
---
No identificada
---
17.4 / 4.84
---
Mesembryanthemum
crystallinum
---
15 ↓
0.49*
---
No identificada
---
10.3 / 4.32
---
16 ↑
2.00*
50
Proteína de choque térmico de 17.6
kDa clase I (HSP17.6A-CI)
gi|15218934
16.8 / 6.11
17.7 / 6.85
17 ↑
1.89*
---
No identificada
---
15.9 / 4.44
---
---
18 ↑
2.25*
---
No identificada
---
17.3 / 6.73
---
---
19 ↑
1.33*
56
Superóxido dismutasa [Cu-Zn]
gi|3334334
15.6 / 5.41
15.2 / 5.46
20 ↑
1.45*
153
Nucleósido difosfato cinasa 1
gi|400404
12.6 / 6.55
16.3 / 6.42
Proteína identificada
de
---
--Arabidopsis thaliana
Mesembryanthenum
crystallinum
Spinacia oleracea
a = Los números corresponden a los del gel 2-D de la figura 7. ↑= proteínas que incrementan su concentración y ↓=
proteínas que disminuyen su concentración tras el tratamiento de sequía. b= Es la media del porcentaje de volumen de una
mancha en la condición de sequía / la media del porcentaje del volumen de una mancha en la condición normal. *= El
efecto del tratamiento es significativo, P <0.05 NI= No identificada. c= Número de acceso a la base de datos del NCBI. d=
Corresponden al peso molecular y punto isoeléctrico aparentes de las manchas en los geles 2-D analizados. e=
Corresponden al peso molecular y punto isoeléctrico teórico de las mismas proteínas en otros organismos. ‡= Valores de
score para las proteínas identificadas en Mascot. Un valor debajo de 44 indica que la identificación es solo tentativa (p<
0.05).
28
Las sHSPs son proteínas de bajo peso molecular (12-40 kDa) y comparten
un dominio C-terminal altamente conservado denominado alpha-cristallin domain
(Van Montfort et al., 2001), por sí solas no son capaces de re-plegar proteínas no
nativas, mas sin embargo, tienen la capacidad unirse a ellas y estabilizarlas,
evitando su agregación y facilitando así que sean re-plegadas por chaperonas
dependientes de ATP (Wang et al., 2004). Se sabe estas proteínas, se expresan
en plantas no sólo en respuesta a estrés por alta temperatura, sino también en
respuesta a otro tipo de factores como sequía, estrés salino y osmótico, frío y
estrés oxidativo.
Al estudiar la respuesta de las plantas al estrés por sequía empleando un
enfoque proteómico varios autores (Vincent et al., 2007; Hajheidari et al., 2005,
Yoshimura et al., 2008) han reportado la sobreexpresión de este tipo de proteínas,
solo en un caso (Gazanchian et al., 2007) se ha reportado además de su
sobreexpresión, la aparición de una proteína pequeña de choque térmico tras
someter a la planta a sequía. En el caso de las raíces de amaranto sometidas a
sequía se encontró que 5 de las manchas sobre expresadas identificadas
corresponden a sHSPs. En conjunto estos resultados sugieren que la
sobreexpresión de estas proteínas pudiera utilizarse como estrategia en
programas de mejoramiento de la tolerancia a estrés abiótico en plantas.
Precursor de chaperonina 21 (mancha 1)
La chaperonina 21 actúa como una co-chaperonina estabilizando y
protegiendo proteínas fundamentales para el correcto funcionamiento del
cloroplasto en situaciones de estrés. En plantas se requiere la acción concertada
de dos proteínas CPN 60 (groEL) y CPN 21 (groES) para conseguir el plegamiento
correcto de proteínas del cloroplasto como la RUBISCO (Wang et al., 2004).
Boscariol Camargo et al. (2007) reportaron la sobre expresión de la
chaperonina 21 en raíces de lima Rangpur (Citrus limonia Osbeck) sometidas a
29
sequía, Jorge et al., (2006) reportaron la inducción de la expresión de la CPN 21
en respuesta a estrés por sequía en hojas de encino. Esta proteína es un
homólogo funcional de la chaperonina 10 (CPN 10) y consiste de 2 dominios tipo
chaperonina (CPN like) fusionados en tándem (Hirohashi et al., 1999),
En
Arabidopsis thaliana, se ha detectado la expresión de CPN 21 en hojas, raíces y
tallos, mientras que la expresión de CPN 10 solo se ha detectado en hojas y tallos.
Esto sugiere que esta chaperonina esta involucrada en la regulación de la
actividad de las subunidades de la chaperonina 60 en raíces (Boscariol Camargo
et al. 2007).
Proteínas putativas de unión a RNA ricas en glicina (manchas 4 y 5)
Las proteínas de unión a RNA ricas en glicina (Glycine-rich RNA-binding
proteins) juegan un papel importante en la regulación post-transcripcional de la
expresión genética, incluyendo el procesamiento del RNA. Se sabe que este tipo
de proteínas son inducidas en respuesta a diversos estímulos, por ejemplo altas
concentraciones de cloruro de sodio y ácido abscisico incrementando sus niveles
de expresión de 4 a 7 veces respectivamente (Aneeta et al., 2002). Otros autores
han encontrado que este tipo de proteínas contribuyen a incrementar la tolerancia
al congelamiento (Kim et al., 2005) y pueden llevar a cabo funciones de chaperona
durante la adaptación al estrés por frío (Kim y Kang, 2006).
Superoxido dismutasa (Cu-Zn SOD) (mancha 19)
Las superóxido dismutasas (EC 1.15.1.1) son un grupo de metaloenzimas
que catalizan la conversión del anión superóxido en peróxido de hidrógeno que es
una molécula menos tóxica (Alsher et al., 2002). La reacción catalizada es la
siguiente:
2 O-2 + 2H+ Æ H2O2 + O2
30
Estas enzimas alteran su actividad bajo diferentes condiciones ambientales
(Bowler et al., 1992), se clasifican de acuerdo a los cofactores metálicos con los
que se unen dando lugar a tres clases de enzimas; FeSOD, MnSOD y Cu-ZnSOD.
Los cloroplastos generalmente contienen Cu-ZnSOD y en algunos casos
contienen FeSOD (Van Camp et al., 1994). Las MnSOD se encuentran en
mitocondrias y peroxisomas y las Cu-ZnSOD se localizan en el cloroplasto, el
citosol y posiblemente en el espacio extracelular (Qureshi et al., 2007).
En este trabajo se encontró un incremento en la concentración de SOD en
respuesta a sequía en raíces de amaranto, esto concuerda con lo reportado para
caña de azúcar (Hajheidari et al., 2005), Arroz (Salekdeh et al., 2002; Ali y
Komatsu, 2006) y Elymus elongatum (Gazanchian et al., 2007). Este tipo proteínas
se han empleado como candidatos para mejorar de la tolerancia a sequía de los
cultivos a través de ingeniería genética (McKersie et al., 1996; Wang et al., 2005;
Tang et al., 2006).
Nucleósido difosfato cinasa 1 (mancha 20)
Las nucleósido difosfato cinasas (EC 2.7.4.6) son enzimas que transfieren
grupos fosfato de los nucleósidos trifosfatados (NTPs) a nucleósidos difosfatados
(NDPs) por esta razón se les cataloga como proteínas de housekeeping ya que
utilizan principalmente el ATP, para mantener los niveles CTP, UTP y GTP de la
célula (Escobar Galvis et al., 2001).
Su expresión se incrementa en respuesta a sequía y estrés salino.
(Salekdeh y Komatsu 2007). Esta clase de enzimas juegan un papel importante en
la respuesta a hormonas, estrés por calor, estrés por sequía, participan en la
señalización mediada por peróxido de hidrógeno de las MAPK, señalización en
respuesta a la luz UV-B, crecimiento y desarrollo (Escobar-Galvis et al., 2001). Se
cree que su papel en la regulación de estas funciones posiblemente se debe a su
actividad de fosfotransferasa.
31
Moon et al., (2003) mostraron que la actividad de una NDPK de Arabidopsis
thaliana (AtNDPK2) está asociada con la señalización de peróxido de hidrógeno
mediada por MAPK en plantas y encontraron que al sobre expresar esta proteína
en Arabidopsis thaliana disminuye la acumulación de especies reactivas de
oxígeno (ROS), incrementando la tolerancia de esta planta a múltiples tipos de
estrés abiótico.
4.3.1.3 Proteínas de raíz de amaranto reprimidas en respuesta a sequía.
S-adenosilmetionina sintetasas (manchas 2 y 3)
Las S-adenosilmetinonina sintetasas (SAMSs EC 2.5.1.6) catalizan la
siguiente reacción:
La S-adenosil metionina producida en esta reacción es un donador de
grupos metilo que participa en reacciones de transmetilación esenciales para la
síntesis de lípidos, ácido nucléicos y proteínas. También participa en la biosíntesis
de fenilpropanoides, etileno, poliaminas, nicotinamida y monolignoles (Yang y
Hoffman 1984).
(COMT), (mancha 13)
La ácido caféico 3-O metiltransferasa (COMT, EC 2.1.1.68) es una enzima
que participa en la síntesis de fenilpropanoides relacionados con la síntesis de
lignina catalizando la siguiente reacción de metilación:
S-adenosil
metionina
+
3,4
dihidroxi-trans-cinamato
Æ
S-adenosil
homocisteina + 3-metoxi-4- hidroxi-trans-cinamato.
32
Isoflavona reductasa putativa (mancha 11)
La biosíntesis de lignanos e isoflavonoides involucra la participación de
reductasas dependientes de NADPH, isoflavona reductasa (IFR), pinoresinollacriresinol-reductasa (PLR) y fenil-cumaran-bencil-eceter reductasa (PCBER);
que en conjunto son conocidas como “reductasas parecidas a IFR” (IFR-like)
(Shoji et al., 2002). Los isoflavonoides juegan un papel importante en la defensa
de las plantas, las isoflavona reductasas (EC 1.3.1.-) reconocen específicamente
isoflavonoides y cataliza su reducción en presencia de NADPH.
Adenosina cinasa (mancha 12)
La adenosina cinasa (ADK, EC 2.7.1.20) cataliza la formación de AMP a
partir ATP y adenosina.
La reacción es la siguiente:
ATP + adenosina ↔ ADP + AMP
Esta es la principal ruta para la reutilización de la adenosina en las plantas
(Moffatt et al., 2000). En hojas de espinaca los niveles de transcritos y proteína de
la ADK se incrementan en respuesta a estrés salino (Weretilnyk et al., 2001). Su
disminución en raíces bajo sequía probablemente este relacionada con la
disminución en la reutilización de adenosina para la síntesis de SAM.
Incrementos en la abundancia o actividad de la SAMS se han asociado con
el incremento en la lignificación y la síntesis de glicin-betaina bajo condiciones de
estrés salino (Sánchez-Aguayo et al., 2004). Empleando un enfoque proteómico,
Parker et al. (2006) encontraron la represión de dos diferentes SAMS en hoja de
arroz sometidas a estrés salino. Yang et al. (2006), han encontrado su incremento
en respuesta a estrés por frío.
33
En lo que respecta a estrés por sequía, utilizando un enfoque proteómico,
Vincent et al. (2005) encontraron que en hojas de maíz en crecimiento dos
isoformas de COMT se acumulaban a medida que se alejaban del punto de
inserción de la hoja, mientras que en plantas sometidas a déficit de agua (sequía),
observaron una menor cantidad de estas proteínas en todas las secciones de las
hojas y que además esta cantidad era menor a medida que se alejaban del punto
de inserción.
Además de la disminución en la concentración de las dos COMT
identificadas, estos autores observaron el mismo comportamiento en diferentes
proteínas relacionadas con la síntesis de fenilpropanoides y lignina, entre ellas tres
isoformas de la SAMS y una proteína tipo isoflavona reductasa, el ensayo de
actividad de la COMT y la cuantificación de los derivados de la tioacidolisis de la
lignina comprobaron que la disminución de estas proteínas estaba relacionada con
la disminución en el crecimiento debida a la sequía.
En las plantas de amaranto sometidas a sequía se observó que el tamaño
de las raíces y de la planta en general fue afectado por el estrés severo. La
disminución de la concentración de algunas de las proteínas identificadas en este
trabajo (dos diferentes SAMS, COMT, Isoflavona reductasa y ADK) nos sugiere
que en respuesta al estrés severo se detiene el crecimiento de las raíces y se
afecta la producción de lignina.
4.3.2
Análisis
proteómico
de
hoja
de
amaranto
(Amaranthus
hypochondriacus) bajo estrés por sequía
Los efectos del tratamiento de sequía sobre los patrones de proteínas en
las hojas de amaranto se analizaron mediante 2-DE. El análisis por triplicado de
los geles para las condiciones control y sequía mostró alrededor de 315 manchas
de proteína reproduciblemente detectadas en todos los geles. 20 manchas de hoja
cuyo cambio en concentración fue significativo, 1 mancha que solo apareció en
34
sequía y 1 mancha que fue la mas abundante en el gel y que presumiblemente se
trata de la proteína ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa / oxigenasa (RUBISCO), se
analizaron mediante espectrometría de masas (Figura 10).
La Figura 11 muestra el cambio en la concentración de las manchas
seleccionadas.
4.3.2.1
Identificación
de
proteínas
de
hoja
de
amaranto
mediante
espectrometría de masas.
De las 22 manchas de proteínas analizadas por espectrometría de masas
(Tabla 5), en cinco de los casos (manchas 5, 8, 9,17 y 22) no fue posible la
identificación debido a que no se obtuvo un buen match al realizar la búsqueda de
los péptidos contra la base de datos no redundante del NCBI.
Entre las 17 manchas de proteína que se logró identificar; 6 fueron
manchas que se sobre expresaron y entre estas se encontraron: Dos manchas
identificadas como la subunidad beta de la chaperonina de 60 kDa (CPN 60 beta),
la subunidad alfa de la chaperonina de 60 kDa (CPN 60 alfa), S-adenosil
metionina sintetasa (SAMS), proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP 70) y
una enzima conjugadora de ubiquitina (ubiquitin-conjugating enzyme family
protein-like protein).
Las 10 manchas de proteínas disminuidas en respuesta a sequía, tres
manchas correspondieron a la subunidad grande de la RUBISCO, dos a la
subunidad de 23 kDa del OEC (oxigen evolving complex), subunidad 2 del
complejo hierro-azufre del citocromo B6-F, una proteína hipotética que tendría
actividad de nucleósido difosfato cinasa, fructosa bifosfato aldolasa citoplásmica,
ascorbato peroxidasa citosólica y un precursor de malato deshidrogenasa
mitocondrial.
35
Figura 10.
Gel 2-DE de proteínas de hoja de amaranto. Los recuadros muestran cambios en la concentración de
proteínas de hoja de amaranto tras ser sometidas a sequía. En el lado izquierdo de cada recuadro se
muestra la condición control y el número de las manchas analizadas, mientras que en e lado derecho
se muestran los geles de hojas de plantas sometidas a sequía.
36
Figura 11.
Histogramas que muestran las diferencias en la cantidad de las
proteínas de hoja de amaranto analizadas mediante espectrometría
de masas.
La mancha que solo apareció tras la sequía (mancha 14) se identificó como:
una proteína hipotética con posible actividad de proteína de choque térmico de 70
kDa.
4.3.2.2 Proteínas de hoja de amaranto sobre expresadas en respuesta a
sequía.
Subunidad alfa y beta de la chaperonina de 60 kDa (manchas 3,6 y 7)
Las chaperoninas de los cloroplastos contienen dos tipos de subunidades
(CPN alfa y CPN beta) las cuales son idénticas en solo aprox. 50% de sus
aminoácidos, su caracterización funcional es limitada, pero se sabe que son
importantes en el ensamblaje de de proteínas como la Rubisco (Boston et al.,
1996).
37
S-adenosilmetionina sintetasa (SAMS) (mancha 18)
La S-adenosilmetinonina sintetasa (SAMS, EC 2.5.1.6) cataliza la formación
a partir de L-metionina y ATP de la S-adenosil metionina, que es un donador de
grupos metilo que participa en numerosas reacciones de transmetilación (Yang y
Hoffman, 1984). El incremento en la actividad o abundancia de la SAMS está
asociado con el incremento de la lignificación y la síntesis del glicin-betaina
durante estrés salino (Sánchez Aguayo et al., 2004).
Proteínas de choque térmico de 70 kDa (HSP 70) (manchas 13 y 14)
Las HSP 70 previenen la agregación y asisten en el re-plegamiento de
proteínas no nativas bajo condiciones normales y estrés; facilitan la degradación
proteolítica de proteínas inestables marcándolas para que se dirijan hacia los
lisosomas
o
proteasomas.
Algunas
de
estas
proteínas
se
expresan
constitutivamente, mientras que otras se expresan solo bajo condiciones de estrés
(Hartl, 1996).
Enzima conjugadora de ubiquitina (mancha 4)
La enzima conjugadora de ubiquitina, E2 o Enzima acarreadora de
ubiquitina (EC 6.3.2.19) realiza el segundo paso en las reacciones de
ubiquitinación que marcan proteínas para ser degradas vía proteasoma.
El mecanismo general es el siguiente: Una enzima E1 activa una molécula
de ubiquitina uniéndola a una cisteína de su sitio activo, esta ubiquitina activada se
transfiere a una cisteína en la E2, una vez conjugada con la ubiquitina activada la
E2 se une a una ubiquitina ligasa (E3) estas proteínas transfieren la ubiquitina de
E2 a al grupo amino de una lisina en la proteína blanco (Nandi et al., 2006).
38
Tabla 5.
Identificación de proteínas de hoja de amaranto en respuesta a sequía
mediante espectrometría de masas.
Mancha
a
no.
Factor de
b
inducción
1↓
‡
Score
Proteína identificada
c
Masa (kDa)
/ pI
d
Exp
Masa (kDa) / pI
e
Teórico
Fuente
339
Subunidad grande de RUBISCO¶
gi|1346961
52 / 6.27
52.6 / 6.14
Amaranthus tricolor
277
Subunidad grande de RUBISCO
¶
gi|1346961
52 / 6.52
52.6 / 6.14
Amaranthus tricolor
54
Subunidad beta de la chaperonina 60
(CPN 60-Beta)
gi|1762130
62 / 5.20
63.3 / 5.72
Solanum tuberosum
74
Enzima conjugadora de ubiquitina (ubiquitinconjugating enzyme family protein-like
protein)
gi|76160962
16.3 / 6.28
16.5 / 6.20
Solanum tuberosum
--
No identificada
---
19.9 / 5.75
---
---
0.47*
2↓
No. de acceso
0.41*
3↑
6.35*
4↑
2.18*
5↓
0.42*
6↑
174
Subunidad alfa de la chaperonina 60
(CPN-60 alfa)
gi|1710807
62 / 4.73
61.9 / 5.15
53
Subunidad beta de la chaperonina 60
(CPN 60-Beta)
gi|1762130
60 / 5.20
63 /5.72
Solanum tuberosum
---
No identificada
---
---
---
---
---
No identificada
---
---
---
---
Pisum sativum
8.00*
7↑
10.42*
8↑
1.73*
9↓
10 ↓
0.57*
0.37*
11 ↓
130
Subunidad de 23 kDa del OEC
gi|148535011
24.4 / 5.47
21.5 / 5.94
Salicornia veneta
145
Subunidad 2 del complejo Hierro-Azufre del
citocromo B6-F
gi|146454654
18 / 5.40
16.6 /6.04
Sonneratia alba
223
Proteína hipotética OsJ_018983:
(nucleósido difosfato cinasa)
gi|125595441
15.8 / 6.45
21.5 / 8.38
335
Proteína de choque térmico 70
(HSP70)
Proteína hipotética
(proteína de choque térmico 70 kDa)
Fructosa bifosfato aldolasa citoplásmica
Precursor de Malato deshidrogenasa
mitocondrial.
0.48*
12 ↓
gi|1143427
75 / 4.76
75.4 / 5.15
Oryza sativa
(japonica cultivargroup)
Cucumis sativus
gi|147805297
75 /4.83
69.1 / 5.11
Vitis vinifera
gi|113624
gi|126896
38.7 / 6.58
34.6 / 6.51
38.5 / 5.96
36.2 / 8.88
Spinacia oleracea
Citrullus lanatus
---
15.6 / 6.52
---
gi|48928010
46/ 5.69
43.2 / 5.52
Solanum brevidens
gi|559005
27 / 5.83
27.4 / 5.43
Nicotiana tabacum
gi|148535011
23 / 5.83
21.5 / 5.94
Salicornia veneta
gi|7240502
52 / 6.38
51.7 / 6.12
Achlys triphylla
---
16.6 / 4.43
---
0.50*
13 ↑
4.20*
14
15 ↓
16 ↓
58
* solo en sequía
0.48*
107
260
0.43*
17 ↑
18 ↑
--3.00*
2.02*
19 ↓
No identificada
391
S-adenosil metionina sintetasa
223
Ascorbato peroxidasa
---
0.54*
20 ↓
155
Subunidad de 23 kDa del OEC
21 ↓
0.50*
0.67
351
Subunidad grande de RUBISCO¶
22 ↑
1.50*
---
No identificada
---
a = Los números corresponden a los del gel 2-D de la figura 10. ↑= proteínas que incrementan su concentración y ↓=
proteínas que disminuyen su concentración tras el tratamiento de sequía. b= Es la media del porcentaje de volumen de una
mancha en la condición de sequía / la media del porcentaje del volumen de una mancha en la condición normal. *= El
efecto del tratamiento es significativo, P <0.05, NI= No identificada. c= Número de acceso a la base de datos del NCBI. d=
Corresponden al peso molecular y punto isoeléctrico aparentes de las manchas en los geles 2-D analizados. e=
Corresponden al peso molecular y punto isoeléctrico teórico de las mismas proteínas en otros organismos. ‡= Valores de
score para las proteínas identificadas en Mascot. Un valor debajo de 44 indica que la identificación es solo tentativa (p<
0.05). ¶= Ribulosa-1,5- bifosfato carboxilasa oxigenasa.
39
4.3.2.3 Proteínas de hoja de amaranto reprimidas en respuesta a sequía.
Subunidad grande de la RUBISCO (manchas 1,2 y 21)
La enzima ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco, E.C.
4.1.1.39) juega un papel central en la fotosíntesis en plantas ya que realiza en la
fijación de CO2, además de su actividad de carboxilasa, actúa como una
oxigenasa en una reacción que implica la competencia entre el O2 y el CO2 por
reaccionar con la ribulosa-1,5-bifosfato (Ogren y Bowes, 1971), así mientras la
fotosíntesis comienza por la actividad de carboxilasa de la Rubisco, su actividad
de oxigenasa cataliza la primera reacción de la fotorespiración. El balance entre
estas reacciones esta determinado por las propiedades de la Rubisco y la cantidad
de oxígeno y dióxido de carbono. La cantidad de Rubisco en hojas es controlada
por su tasa de síntesis y degradación. Incluso bajo condiciones de estrés por
sequía en etapas tempranas, esta proteína se mantiene relativamente estable en
forma de holoenzima y tiene una vida media de varios días (Webber et al., 1994).
Sin embargo, bajo condiciones de sequía se ha detectado un rápido decremento
de transcritos de la subunidad pequeña de la rubisco en tomate (Bartholomew et
al., 1991), arabidopsis (Williams et al., 1994) y arroz (Vu et al., 1999), lo que indica
un decremento en su síntesis. Cohen et al., (2006) reportaron que bajo
condiciones de estrés oxidativo existe una disminución en la síntesis de la
subunidad grande de la rubisco sin que se afecten los niveles de RNA mensajero.
Subunidad de 23 kDa del OEC (Oxygen Evolving Complex) (manchas 10 y 20)
El OEC es un complejo enzimático también conocido como water-splitting
complex, esta formado por 3 subunidades (33, 23 y 16 kDa) y realiza la fotooxidación del agua durante las reacciones luminosas de la fotosíntesis liberando
oxígeno. Se ha demostrado que el déficit de agua (sequía) daña este complejo.
(Skotnica et al., 2000).
40
Subunidad 2 del complejo Hierro-Azufre del citocromo b6/f (mancha 11)
La plastoquinona-plastocianina oxidoreductasa (EC 1.10.99.1) forma parte
del complejo citocromo b6/f presente en cianobacterias y cloroplastos, cataliza la
oxido reducción del plastoquinol y el citocromo f. Este complejo esta compuesto
por el citocromo b6, el citocromo f y las subunidades Rieske o proteínas hierroazufre (Madueño et al., 1992).
Bajo condiciones favorables los electrones que fluyen a través de la cadena
transportadora de electrones se consumen en el ciclo de Calvin, minimizando el
flujo de electrones al O2. Bajo condiciones en las que el ciclo de Calvin se inhibe
(sequía o bajas concentraciones de CO2), el transporte de electrones es reprimido
para minimizar el flujo de electrones al O2. El punto más probable de regulación es
el complejo citocromob6/f (Golding y Johnson 2003).
Nucleósido difosfato cinasa hipotética (mancha 12)
Las nucleósido difosfato cinasas (NDPKs, EC 2.7.4.6) son enzimas que
transfieren grupos fosfato de los nucleósidos trifosfatados (NTPs) a nucleósidos
difosfatados (NDPs), por lo que se les ha catalogado como proteínas de
housekeeping ya que utilizan principalmente el ATP para mantener los niveles
CTP, UTP y GTP de la célula. Se cree tienen actividad de fosfotransferasa
(Escobar Galvis et al., 2001).
Fructosa bifosfato aldolasa citoplásmica, (mancha 15)
La fructosa-1,6-bifosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) es una enzima importante
para la glucólisis que mediante una reacción reversible, rompe la fructosa-1,6bifosfato en dos moléculas de tres carbonos: Dihidroxiacetona-fosfato y
gliceraldehido-3-fosfato.
41
Precursor de malato deshidrogenasa mitocondrial (mancha 16)
La malato deshidrogenasa es una enzima (EC 1.1.1.37) del ciclo del ácido
cítrico que cataliza la conversión reversible de malato a oxalacetato en presencia
de NAD+.
Malato + NAD+ ↔ Oxalacetato + NADH + H+
La disminución en la concentración de su precursor quizá este relacionada
con mantener altos los niveles de malato, que se sabe es un osmolito que se
acumula en respuesta a diferentes tipos de estrés.
Ascorbato peroxidasa citosólica (cAPX) (mancha 19)
Las ascorbato peroxidasas (EC 1.11.1.11) son enzimas que utilizan ácido
ascórbico como donador de hidrógeno para degradar el peróxido de hidrógeno. La
reacción es la siguiente:
Ascorbato + H2O2 Æ dehidroascorbato + 2H2O.
Empleando el enfoque proteómico se han encontrado incrementos en la
concentración de APX y otras peroxidasas bajo diferentes condiciones estresantes
como: ozono (Agrawal et al., 2002), sequía (Hajheidari et al., 2005) y estrés salino
(Yan et al., 2005). Sin embargo, la ascorbato peroxidasa es altamente sensible a
la inactivación por ROS y con frecuencia es insuficiente para proteger el aparato
fotosintético de la fotoinhibición durante el estrés severo (Shikanai et al., 1998).
Se ha observado que la disminución de la concentración y actividad de la
APX es un requisito para la inducción de la senescencia (Hossain et al., 2006). En
hojas de amaranto sometidas a estrés severo (CRA<50%) en este trabajo, la
concentración de APX se encuentra disminuida y si bien las hojas muestran
42
enrollamiento y pérdida de la turgencia aún son capaces de recuperarse tras la
rehidratación (figura 2).
43
CONCLUSIONES
Los métodos TCA-A y TCA-B probados para la extracción de proteínas
amaranto,
muestran
rendimientos
aceptables
y
permiten
obtener
geles
bidimensionales de buena calidad para el análisis de proteínas de hoja y raíz de
amaranto respectivamente.
La identificación de las proteínas sobre-expresadas y disminuidas muestra
que en las hojas amaranto sometido a estrés severo existe daño y disminución de
la actividad del aparato fotosintético y en respuesta se sintetizan proteínas
involucradas en mantener la estabilidad del aparato fotosintético y el correcto
plegamiento de las proteínas, la degradación de proteínas desnaturalizadas y la
síntesis de osmolitos.
En el caso de las raíces se observa el incremento de proteínas que se han
relacionado con la señalización en respuesta a sequía, la síntesis de proteínas
involucradas en mantener el correcto plegamiento de otras proteínas y proteínas
encargadas de proteger a las células de las especies reactivas de oxígeno. Por
otra parte, la disminución de proteínas relacionadas con las reacciones de
transmetilación y la síntesis de lignina indican que la detención del crecimiento y la
disminución en la lignificación son respuestas adaptativas al estrés severo en
raíces.
Las plantas sometidas a estrés severo por sequía (CRA < 50%) presentan
pérdida de la turgencia y enrollamiento de las hojas, también se detecta una
disminución en la cantidad de ascorbato peroxidasa, que se ha relacionado con la
inducción de senescencia. La recuperación de las plantas de amaranto tras su
rehidratación nos indica que la tolerancia a sequía en amaranto está relacionada
con su rápida recuperación, rasgo que es característico de plantas tolerantes a
sequía.
44
REFERENCIAS
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50
APÉNDICE
A. Solución de rehidratación sin IPG buffer*
(Urea 8M, CHAPS 2%, Azul de bromofenol 0.02%)
Componente
Urea
CHAPS
Azul de bromofenol al 1%
Agua Milli-Q
Concentración final
8M
2% (p/v)
0.002% (v/v)
Cantidad
12 g
0.5 g
50 µL
c.b.p. 25 mL
† Esta solución puede almacenarse en alícuotas a -20°C hasta su uso. Antes de usar añadir 0.56%
(p/v) de DTT y 0.5% (v/v) de IPG buffer. Es posible utilizar otros detergentes (Tritón X-100, NP-40,
otros) en lugar de CHAPS.
B. Azul de bromofenol al 1%
Componente
Azul de bromofenol
Tris-base
Agua Milli-Q
Concentración final
1% (p/v)
50 mM
Cantidad
100 mg
60 mg
c.b.p. 10 mL
C. Buffer de equilibrio con SDS*
(Tris 50mM pH 8.8, Urea 6M, Glicerol 30%, SDS 2%, Azul de bromofenol 0.002%)
Componente
Tris 1.5 M pH 8.8
Urea
Glicerol
SDS
Azul de bromofenol al 1%
Agua Milli-Q
Concentración final
50 mM
6M
30% (v/v)
2% (p/v)
0.002% (p/v)
Cantidad
10 mL
72.07 g
60 mL
4.0 g
400 µL
c.b.p. 200 mL
* Esta solución debe almacenarse a -20°C hasta su uso. Antes de usar añadir 1% (p/v) de DTT o
2.5% (p/v) de Iodacetamida por cada mililitro de solución de equilibrio según sea el caso.
D. Tris 1.5M pH 8.8
Componente
Tris-base (PM 121.1)
Agua Milli-Q
HCl (PM 36.46)
Agua Milli-Q
Concentración final
1.5M
Cantidad
181.65 g
750 mL
Ajustar a pH 8.8
c.b.p. 1 L
51
E. Tris 0.5M pH 6.8
Componente
Tris-base (PM 121.1)
Agua Milli-Q
HCl (PM 36.46)
Agua Milli-Q
Concentración final
0.5M
Cantidad
60.55 g
750 mL
Ajustar a pH 6.8
c.b.p. 1 L
F. Solución de Acrilamida al 30% (29:1)*
Acrilamida
N,N´-bis-metilen-acrilamida
Agua Milli-Q
145 g
5g
c.b.p. 500 mL
Filtrar y almacenar a 4°C en la oscuridad.
• Precaución: la acrilamida es un potente neurotóxico, evite inhalarla y el contacto directo
con piel y mucosas. Manéjela siempre con guantes.
G. SDS al 10%
Componente
SDS
Agua Milli-Q
Concentración final
10% (p/v)
Cantidad
5g
c.b.p. 50 mL
H. Persulfato de amonio al 10%
Componente
Persulfato de amonio
Agua Milli-Q
Concentración final
10% (p/v)
c.b.p.
Cantidad
0.1g
1.0 mL
I. Buffer de electroforesis
(Tris 25mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1%)
Componente
Tris –base (PM 121.1)
Glicina (PM 75.07)
SDS (PM 288.38)
Agua Milli-Q
Concentración final
25 mM
192 mM
0.1% (p/v)
Cantidad
30.275 g
144.134 g
10 g
c.b.p. 10 L
J. Gel de poliacrilamida desnaturalizante al 13% (separador) para 2-DE de tiras de IPG de
13cm
Componente
Solución de acrilamida al 30% (29:1)
Agua Milli-Q
Tris 1.5 M pH 8.8
SDS al 10%
PSA al 10%
TEMED
Cantidad
14.15 mL
10.098 mL
8.25 mL
330 µL
165 µL
16.5 µL
52
K. Gel de poliacrilamida desnaturalizante al 4% (concentrador) para 2-DE de tiras de IPG
de13 cm
Componente
Solución de acrilamida al 30% (29:1)
Agua Milli-Q
Tris 0.5 M pH 6.8
SDS al 10%
PSA al 10%
TEMED
Cantidad
0.792 mL
3.618 mL
1.5 mL
60 µL
30 µL
3 µL
L. Solución fijado y desteñido para tinción con Azul de Coomassie
Componente
Metanol
Ácido acético
Agua Milli-Q
Concentración final
50% (v/v)
10% (v/v)
Cantidad
500 mL
100 mL
c.b.p. 1L
M. Solución de lavado para tinción con Sypro ® Ruby
Componente
Metanol
Ácido acético
Agua Milli-Q
Concentración final
10% (v/v)
7% (v/v)
Cantidad
100 mL
70 mL
c.b.p. 1L
N. Solución para precipitación de proteínas
Componente
TCA
PVPP
2-ME
Acetona
Concentración final
10% (p/v)
1% (p/v)
2% (v/v)
Cantidad
1 mL
0.1 g
200 µL
c.b.p. 10 mL
Ñ. Solución de Azul de Coomasie R-250 al 0.025%
Componente
Concentración final
Cantidad
Azul de Coomassie R-250
0.025% (p/v)
250 mg
Metanol
40% (v/v)
400 mL
Ácido acético
10% (v/v)
100 mL
Agua Milli-Q
c.b.p.1L
Disolver el colorante en metanol, agregar el ácido acético y el agua, filtrar y proteger de la luz.
O. Solución de sellado
Componente
Buffer
de
(apéndice I)
electroforesis
Agarosa
Azul de bromofenol al 1%
Concentración final
(Tris 25mM, Glicina 192 mM,
SDS 0.1%)
Cantidad
100mL
0.5% (p/v)
0.002% (p/v)
0.5 g
200 µL
53
P. Solución de fijado para tinción con Sypro ® Ruby
Componente
Concentración final
Metanol
40% (v/v)
TCA
10% (v/v)
Agua Milli-Q
Cantidad
40 mL
10 mL
c.b.p. 100 mL
Q. Solución de digestión con tripsina
Componente
Tripsina (0.1 µg/µL)
Bicarbonato
de
NH4HCO3 50 mM
amonio
Cantidad
5µL
45µL
Bicarbonato de amonio 100 mM
Componente
Bicarbonato
NH4HCO3
Agua Milli-Q
de
amonio
Concentración final
100 mM
Cantidad
79 mg
c.b.p.10 mL
Stock DTT 1M
Componente
DTT
Agua Milli-Q
Concentración final
1M
Cantidad
15.43 mg
c.b.p.100µL
Iodoacetamida 55 mM
Componente
Iodoacetamida
Agua Milli-Q
Concentración final
55 mM
Cantidad
10 mg
c.b.p.1 mL
TFA 10%
Componente
Ácido trifluoroacético 99.5%
Agua Milli-Q
Concentración final
10% (v/v)
Cantidad
1 mL
c.b.p.10 mL
54