Composición Proteica y su Relación con las Variantes Genéticas A

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Ingeniería en Alimentos
Composición Proteica y su Relación con las Variantes
Genéticas A y B de κ-caseína y β-lactoglobulina en Leche de
Vacas Frisón Negro
Tesis presentada como parte de los
requisitos para optar al grado de
Licenciado en Ingeniería en Alimentos
Jaime Andrés Kramm Vásquez
Valdivia Chile 2003
PROFESOR PATROCINANTE
Agradecimientos
A mis padres por su amor, comprensión y estímulo durante mis años de estudio.
A !a profesora Luz H. Molina, por su constante orientación y apoyo.
A mis familiares, amigos y compañeros por su invaluable espíritu fraterno.
A todos aquéllos que de una u otra forma colaboraron en la realización de esta
tesis.
I
INDICE DE MATERIAS
Capítulo
Página
1
INTRODUCCION
1
2
REVISION BIBLIOGRAFICA
3
2.1
Composición básica de la leche
3
2.2
Proteínas
4
2.3
Estructura y característica de las proteínas de la leche
5
2.3.1
Caseína
8
2.3.1.1
Micela de caseína
9
2.3.1.2
Estabilidad de la caseína
10
2.3.2
Proteínas del suero
11
2.3.2.1
β-lactoglobulina
12
2.3.2.2
α-lactoalbúmina
13
2.4
Factores que influyen en la cantidad y composición de
proteínas de la leche
13
2.4.1
Factores fisiológicos
14
2.4.2
Factores alimentarios
15
2.4.3
Factores climáticos
16
2.4.4
Factores genéticos
16
2.4.5
Factores zootécnicos
17
2.5
Polimorfismo genético de las proteínas de la leche
18
2.5.1
Polimorfismo de κ-caseína
22
2.5.2
Polimorfismo de β-lactoglobulina
23
2.5.3
Efecto del polimorfismo de κ-caseína y β-lactoglobulina en
la leche
24
II
2.5.3.1
Producción de leche
24
2.5.3.2
Composición de la leche
25
2.5.3.3
Propiedades tecnológicas de la leche
29
2.6
Electroforesis de isoenfoque en la determinación de las
32
variantes genéticas
3
MATERIAL Y MÉTODO
34
3.1
Materiales
34
3.1.1
Obtención de muestras
34
3.1.2
Lugar del ensayo
34
3.1.3
Equipos utilizados
35
3.2
Muestras de leche y análisis
35
3.3
Metodología
36
3.3.1
Cuantificación de proteína total
36
3.3.2
Cuantificación de proteína del suero
37
3.3.3
Determinación del contenido de caseína
37
3.3.4
Determinación del número de caseína
38
3.3.5
Medición de la producción de leche
38
3.4
Preparación de muestras de leche para la determinación de
variantes genéticas
38
3.4.1
Separación de κ-caseína
38
3.4.2
Separación de β-lactoglobulina
38
3.4.3
Determinación cuantitativa de proteínas de las muestras
para electroforesis
38
3.5
Electroforesis de isoenfoque
39
3.5.1
Condiciones de la electroforesis
39
3.5.2
Estándares de proteínas
39
3.5.3
Preparación de las muestras
40
3.6
Densitometría
40
III
3.7
Análisis estadístico
40
4
PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
42
4.1
Identificación de variantes genéticas de κ-caseína y βlactoglobulina en leche de vacas Frisón Negro
42
4.1.1
Separación de κ-caseína y β-lactoglobulina
42
4.1.2
Electroforesis de κ-caseína y β-lactoglobulina
43
4.1.3
Expresión de las variantes genéticas de κ-caseína y β46
lactoglobulina
4.2
Variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina en
46
vacas Frisón Negro
4.3
Composición proteica y producción de leche en vacas
Frisón negro
48
4.4
Variantes genéticas, producción y composición de la leche
51
4.4.1
Variantes
genéticas
de
κ-caseína,
producción
y
composición proteica de la leche
4.4.1.1
Contenido de proteína total y variantes genéticas de κcaseína
4.4.1.2
53
53
Contenido de proteína del suero y variantes genéticas de κcaseína
54
4.4.1.3
Contenido de caseína y variantes genéticas de κ-caseína
55
4.4.1.4
Número de caseína y variantes genéticas de κ-caseína
56
4.4.1.5
Variantes genéticas de κ-caseína y producción de leche
57
4.4.2
Variantes genéticas de β-lactoglobulina, producción y
composición proteica de la leche
4.4.2.1
Contenido de proteína total y variantes genéticas de βlactoglobulina
4.4.2.2
57
Contenido de proteína del suero y variantes genéticas de β-
58
IV
lactoglobulina
4.4.2.3
59
Contenido de caseína y variantes genéticas de βlactoglobulina
4.4.2.4
Número
de
59
caseína
y
variantes
genéticas
de
β-
lactoglobulina
4.4.2.5
Variantes genéticas de β-lactoglobulina y producción de
leche
4.4.3
60
60
Interacción de variantes genéticas de κ-caseína y βlactoglobulina.
61
5
CONCLUSIONES
65
6
RESUMEN - SUMMARY
66
BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
68
76
V
INDICE DE CUADROS
Cuadro
Página
1
Composición promedio de la leche de vaca.
2
Distribución cuantitativa de los principales componentes
nitrogenados de la leche de vaca.
3
3
5
Composición aminoacídica (g/100g) de la proteína total,
caseína y proteína del suero de la leche.
6
4
Composición de la leche de vaca para diferentes razas.
17
5
Distribución y propiedades de las principales proteínas de
la leche.
6
Frecuencia alélica de las principales variantes genéticas de
κ-caseína y β-lactoglobulina para diferentes razas bovinas.
7
23
Valores promedio de contenido proteico para fenotipos de
κ-caseína.
9
21
Polimorfismo de variantes genéticas de κ-caseína y βlactoglobulina.
8
20
27
Resultados promedio de contenido proteico para fenotipos
de β-lactoglobulina.
29
10
Muestreos y análisis
36
11
Variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina
determinadas en la leche de vaca Frisón Negro.
12
45
Frecuencia de variantes genéticas obtenidas en las vacas
Frisón Negro del estudio.
47
13
Composición promedio de leche de vaca Frisón Negro.
49
14
Diferencias entre variantes genéticas de κ-caseína A y B,
en relación al contenido de proteínas. (Promedio ± Error
VI
estándar)
15
53
Diferencias entre fenotipos de β-lactoglobulina AA y AB, en
relación al contenido de proteínas. (Promedio ± Error
estándar)
16
58
Valores de producción de leche y contenido proteico para
combinaciones
de
variantes
de
κ-caseína
lactoglobulina. (Promedio ± Error estándar)
y
β62
VII
INDICE DE FIGURAS
Figura
1
Página
Electroforesis de isoenfoque para muestras de κ-caseína
en vacas Frisón Negro
2
43
Electroforesis de isoenfoque para muestras de βlactoglobulina en vacas Frisón Negro
44
VIII
INDICE DE ANEXOS
Anexos
Página
1
Encuesta de vacas Frisón Negro predio Sta. Rosa
77
2
Información de vacas Frisón Negro predio Sta. Rosa
78
3
Metodología de separación de proteína no caseínica según
McGann et al. citado por PINTO et al. (1998)
4
Separación de κ-caseína de las muestras de leche para
análisis electroforético
5
82
Curva de calibración para determinación proteica de
acuerdo al método propuesto por LOWRY (1951)
8
81
Determinación de proteínas de acuerdo al método de
LOWRY (1951)
7
80
Separación de β-lactoglobulina de las muestras de leche
para análisis electroforético
6
79
84
Protocolo de electroforesis de isoenfoque en geles de
poliacrilamida según CASANOVA (2001)
86
9
Concentración de κ-caseína en muestras semi-purificadas
88
10
Concentración de β-lactoglobulina en muestras preparadas
para electroforesis
11
Volumen de muestras preparadas de κ-caseína utilizadas
en cada electroforesis
12
90
92
Volumen de muestras preparadas de β-lactoglobulina
utilizadas en cada electroforesis
94
13
Identificación de las variantes genéticas de κ-caseína
96
14
Identificación de las variantes genéticas de β-lactoglobulina
98
15
Densitogramas obtenidos en β-lactoglobulina de leche de
IX
vacas Frisón Negro
16
100
Densitogramas obtenidos en κ-caseína de leche de vacas
102
Frisón Negro
17
Resultados de contenido proteico para leche de vacas
Frisón Negro
18
104
Valores F para análisis de varianzas en relación con la
producción y composición proteica de la leche de vacas
Frisón Negro
19
108
Interacción de variantes genéticas de κ-caseína y β–
lactoglobulina
e
intervalos
componentes en estudio.
de
significancia
para
112
1
1. INTRODUCCION
La constante evolución tecnológica y la creciente optimización de los procesos
productivos a nivel mundial, no han estado ajenos a la industria láctea. Ésta, se
ha desarrollado, intentando obtener mejor calidad y mayores rendimientos en la
elaboración de sus productos.
Así, en países industrializados, el uso eficiente de la leche como materia prima
esta supeditada a su composición proteica y de materia grasa, existiendo gran
interés en la manipulación de esta por medios biológicos para satisfacer los
requerimientos de la industria láctea. En el caso de la industria quesera, el pago
de leche por contenido de proteínas ya es una realidad, que va asociada a
características técnicas y económicas importantes.
El estudio de la leche a nivel composicional y su relación con el polimorfismo
genético de las proteínas, permite conocer la incidencia de este último factor,
expresado en diversas variantes genéticas, sobre la distribución de la
composición proteica y la aptitud tecnológica de la leche.
El interés en el estudio de las variantes genéticas en las proteínas κ caseína y β
lactoglobulina obedece a la incidencia significativa que tienen estas en las
propiedades de la leche. El incremento de las proteínas en la leche como
materia prima, puede ser comercialmente beneficiosa pues aumenta el
contenido de sólidos lácteos, permitiendo mejoras en el rendimiento en sectores
como la industria quesera.
El presente estudio tiene como objetivo general determinar el efecto de la
expresión de las variantes genéticas de κ caseína y β lactoglobulina sobre el
contenido proteico de la leche de 10 vacas Frisón Negro.
2
Los objetivos específicos del estudio son:
-
Identificar las variantes genéticas de κ caseína y
β lactoglobulina en la
leche de 10 vacas previamente caracterizada respecto a su edad y número
de partos.
-
Determinar el contenido de proteína total, caseína, proteínas del suero y
número de caseína en las muestras de leche.
-
Relacionar el contenido de proteína total, caseína, proteínas del suero y
número de caseína de la leche de vacas individuales, con la presencia de
una determinada variante genética.
3
2. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 Composición básica de la leche
Según ALAIS (1985), en la leche se pueden distinguir tres fases: la emulsión de
materia grasa en forma globular, la suspensión de caseína ligada a las sales
minerales y la solución o fase hídrica, que forma el medio más voluminoso.
La composición de la leche puede ser afectada por factores de variación como:
clima, aspectos genéticos, etapa fisiológica de la vaca, nivel de alimentación y
aspectos sanitarios de la mama, por lo tanto la proporción en la que se
encuentran los distintos componentes en la leche no será constante. (ALAIS,
1985; CASADO y GARCIA, 1985)
La composición media de la leche en sus elementos fundamentales, según lo
reportados por diversos autores, se presenta en el CUADRO 1.
CUADRO 1 Composición promedio de la leche de vaca.
Composición
(g/L)
Componente
1
2
3
Agua
905
866
871
Glúcidos
49
50
46
Lípidos
35
41
40
Proteínas
34
36
32,5
Sales
9
7
7
Sólidos totales
127
Sólidos no grasos
92
89
FUENTE: (1) ALAIS (1985); (2) FENNEMA (1993); (3) WALSTRA et al. (1999).
Como se aprecia en el cuadro anterior, existen variaciones en los componentes
de la leche en relación a los distintos autores. Los valores presentados para el
contenido de carbohidratos por ALAIS (1985) y FENNEMA (1993) son similares,
4
a diferencia de WALSTRA et al. (1999) que muestra un valor menor. Respecto
al contenido promedio de materia grasa, se puede apreciar que este varía entre
35 y 41 g/L. En cambio, el contenido de proteína varía entre 32,5 y 36 g/L. Las
diferencias en la composición según los distintos autores se originan debido a
las diversas razas utilizadas en los respectivos estudios.
Como lo muestra el CUADRO 1, entre los constituyentes de la leche se
encuentra el agua, lípidos, carbohidratos, sales y proteínas. Estas últimas de
especial relevancia en relación al tema tratado.
2.2 Proteínas
De acuerdo a FENNEMA (1993), la leche contiene entre 30 – 35 g/L de proteína
y corresponde al 95% del nitrógeno total de la leche.
En la leche, según ALAIS (1985), es posible distinguir tres grupos de proteínas:
caseína, proteínas del lactosuero y proteosas-peptonas.
La caseína representa el 80 % de las proteínas de la leche y está constituida
fundamentalmente por un grupo de proteínas, entre las que se encuentran: α S1,
α S2, β, κ caseínas. Se caracterizan por coagular bajo acción del cuajo o por
acidificación a pH cercano a 4,6. Estas proteínas, forman un complejo singular
hidratado que contiene fosfato de calcio denominado micela. Estos complejos
varían en tamaño desde 30 a 300 nm de diámetro (FENNEMA, 1993; CASADO
y GARCIA, 1985; ALAIS, 1985).
Las proteínas del suero comprenden un grupo más heterogéneo y complejo
desde el punto de vista composicional. Se caracterizan por no precipitar por
efecto de la acidificación, pero si cuando se aplica calor. Las principales
proteínas presentes en el suero son: α- lactoalbúmina, β- Lactoglobulina,
seroalbúminas, inmunoglobulinas y proteínas menores. Las proteínas menores,
5
agrupan un cierto número de proteínas que se encuentran en pequeña
cantidad, representando menos de un 5% de las proteínas del suero. Entre ellas
destacan la transferrina, lactolina y prote ínas de la membrana del glóbulo graso
(CASADO y GARCIA,1985; VEYSSEYRE, 1980).
En el CUADRO 2 se pueden apreciar las proporciones medias de las sustancias
nitrogenadas en la leche de vaca, apreciándose que las caseínas representan
una mayor proporción de las proteínas totales de la leche, a diferencia de las
proteínas del suero.
CUADRO 2
Distribución cuantitativa de los principales componentes
nitrogenados de la leche de vaca.
Proporciones medias
G/L
Relativas
Prótidos totales
32
100
Proteínas
Caseína isoeléctrica
25
78
100
- Caseína α S1
9,0
36
2,5
10
- Caseína α S2
8,5
34
- Caseína β
3,2
13
- Caseína κ
1,75
7
- Diversas
Proteínas del suero
5,4
17
100
- Albúminas
β-Lactoglobulina
2,7
50
1,2
22
α-Lactoalbúmina
0,25
5
Seroalbúmina
0,65
12
- Globulinas inmunes
0,6
10
- Proteosas-peptonas
Sustancias nitrogenadas no proteicas 1,6
5
FUENTE: ALAIS (1985).
2.3 Estructura y características de las proteínas de la leche
Las proteínas son polímeros de aminoácidos que pueden contener algunos
grupos químicos adicionales (AMIOT, 1991).
6
Los aminoácidos que componen las proteínas de la leche son 19, entre los
cuales algunos son hidrocarburos alifáticos y otros tienen grupos funcionales
adicionales (AMIOT, 1991).
Las propiedades de las proteínas dependen de las proporciones de
aminoácidos pertenecientes a diferentes categorías, según el tipo de cadena
lateral. Se pueden encontrar grupos alcohol, sulfhidrilo, básicos, ácidos, amido,
aromático. Estas funciones darán origen a las diversas propiedades
que
caracterizan y diferencian a las distintas proteínas (ALAIS, 1985; AMIOT, 1991).
En el CUADRO 3, se puede observar la composición de aminoácidos de las
proteínas de la leche.
CUADRO 3
Composición aminoacídica (g/100 g) de la proteína total,
caseína y proteínas del suero de la leche.
Proteínas del
Aminoácido
Proteína total
Caseína
suero
Alanina
3,7
3,1
5,5
Arginina
3,6
4,1
3,3
Acido aspártico
8,2
7,0
11,0
Cistina
0,8
0,3
3,0
Acido glutámico
22,8
23,4
15,5
Glicina
2,2
2,1
3,5
Histidina
2,8
3,0
2,4
Isoleucina
6,2
5,7
7,0
Leucina
10,4
10,5
11,8
Lisina
8,3
8,2
9,6
Metionina
2,9
3,0
2,4
Fenilalanina
5,3
5,1
4,2
Prolina
10,2
12,0
4,4
Serina
5,8
5,5
5,5
Treonina
4,8
4,4
8,5
Triptófano
1,5
1,5
2,1
Tirosina
5,4
6,1
4,2
Valina
6,8
7,0
7,5
FUENTE: BELITZ y GROSCH (1997).
7
La secuencia y la frecuencia de los aminoácidos en una cadena polipeptídica, el
número de cadenas por molécula y la disposición espacial de esta son
características de cada proteína y está supeditada a la información codificada
en los genes (AMIOT, 1991; STRYER, 1995).
Por otro lado, según la configuración que presente la molécula de proteína hay
numerosas posibilidades para enlaces secundarios y terciarios, tanto dentro de
una misma molécula como entre distintas moléculas proteicas. Lo anterior es
posible por la existencia de enlaces sulfurados y puentes de hidrógeno, que
permiten generar una conformación estructural regular (AMIOT, 1991).
Las proteínas tienen una estructura definida que está dividida en cuatro niveles:
-
Estructura primaria, viene dada por la secuencia de diferentes aminoácidos
la que es determinada genéticamente (WALSTRA et al., 1999; FOX y
McSWEENEY, 1998). Existen variantes genéticas de las caseínas en
algunas razas lecheras que se generan, por lo habitual, debido a la
sustitución de algunos aminoácidos en la secuencia de la estructura primaria
(BADUI, 1984)
-
Estructura secundaria, esta relacionada con el ordenamiento espacial de las
cadenas de aminoácidos. Aquí se puede encontrar estructuras como hélice
α y hojas plegadas β, que se estabilizan por puentes de hidrógeno ( ALAIS,
1985).
-
Estructura terciaria, se refiere al ordenamiento espacial de residuos de
aminoácidos alejados en la secuencia lineal que es asegurada vía enlaces
disulfuro entre restos de cisteína o enlaces hidrófobos por proyección hacia
el interior de cadenas hidrófobas de la proteína, como en el caso de la
caseína (ALAIS, 1985; STRYER, 1995; COULTATE, 1998).
8
-
Estructura cuaternaria, referida a proteínas que poseen más de una cadena
polipeptídica o subunidad. Estableciendo el ordenamiento espacial de las
subunidades y la naturaleza de sus interacciones (STRYER, 1995).
En cuanto a la estructura espacial de las proteínas, las caseínas presentan una
estructura laxa y sus cadenas peptídicas se enredan conservando espacios
para fijar el fosfato cálcico y permitir la entrada de las proteasas. Respecto a
las proteínas del suero, estas poseen una estructura circular compacta que
impide el ingreso de iones o enzimas en la estructura nativa. (ALAIS, 1985)
2.3.1 Caseína. Las caseínas son un complejo de proteínas fosforados
presentes en la leche como largas partículas coloidales o micelas que contienen
cantidades apreciables de calcio, fosfato y pequeñas cantidades de magnesio y
citrato. Sus diámetros fluctúan entre 30 – 300 nm, contienen un 92% de
proteínas, compuesta por α S1, α S2, β y κ- caseína y un 8% de constituyentes
inorgánicos, esencialmente fosfato cálcico. Constituye la parte nitrogenada más
característica de la leche y precipitan solo cuando se acidifica la leche a pH
igual a 4.6 (WEBB et al., 1980; ALAIS, 1985; FENNEMA, 1993).
La estructura primaria de todas las caseínas tiene residuos polares y apolares
distribuidos desuniformemente, lo que genera regiones hidrofílicas e hidrófobas
localizadas. Un alto contenido en aminoácidos apolares, en especial prolina,
establece una mínima estructura secundaria y terciaria para estas proteínas
(FOX y McSWEENEY, 1998).
La caseína puede ser precipitada por diversos agentes químicos como ácidos,
alcohol, enzima Lab o cuajo y metales pesados. Existen relaciones entre el
calor y el ácido en la precipitación de la caseína siendo esta inversamente
proporcional; a mayor acidez menor temperatura es requerida para la
coagulación. Por otro lado, el alcohol y la temperatura, por separado, actúan
9
como agentes deshidratantes de la caseína generando así la precipitación de
ésta (ALAIS, 1985).
Dado que la caseína presenta un carácter anfótero, puede formar sales o
caseinatos. Estos últimos son de gran interés ya que la caseína se encuentra
en la forma de caseinato cálcico, que a su vez adsorbe en sus micelas a las de
fosfato cálcico, formando el complejo conocido como fosfocaseinato cálcico
(CASADO y GARCIA, 1985).
Las características de las micelas de caseína tienen gran influencia en la
conducta de la leche y los productos lácteos durante el procesamiento
industrial, debido a lo anterior, las micelas han sido estudiadas en cuanto a su
estructura y propiedades permitiendo mejoras en los diversos procesos
tecnológicos. (FENNEMA,1993).
2.3.1.1 Micela de caseína. Un 95 % de las caseínas se encuentran en la leche
polimerizado en micelas esféricas de 30 a 300 nm de diámetro y el porcentaje
restante existe como monómero soluble (AMIOT, 1991; FOX y McSWEENEY,
1998).
Las micelas contienen fundamentalmente tres fracciones de caseína: α S, β y κ.
Para BADUI (1984), estas tres fracciones de polímeros forman complejos
micelares en presencia de iones de calcio encontrándose en una proporción de
5:3:1, respectivamente.
A su vez, WONG (1995), señalan que α S caseína comprende entre 50 - 55% de
la caseína total, respecto a β y κ-caseína estas representarían el 30% y 15% de
la caseína total.
La proporción de κ-caseína, varía inversamente con el tamaño de la micela y βcaseína esta en relación directa con él. Existiendo la posibilidad de que κ-
10
caseína sustituya en parte a β-caseína en la micela (BADUI, 1984; AMIOT,
1991).
La micela de caseína está formada por submicelas que están constituídas por
moléculas de α, β y κ-caseína. La asociación de estas moléculas se produce
por interacción hidrófoba de las partes no polares de las cadenas polipeptídicas,
dando origen a una submicela que posee un núcleo hidrófobo, lugar donde se
ubican las partes apolares de todas las caseínas; este núcleo esta rodeado de
una capa polar fuertemente cargada rica en agrupaciones fosfóricas de α y βcaseína. La κ-caseína poco fosforilada, muy polar e incapaz de fijar calcio se
ubica formando una especie de casquete (PRIMO, 1997; COULTATE, 1998).
Los enlaces entre las submicelas resulta de una interacción electrostática entre
los grupos fosfatos de α-caseína y β-caseína con los iones calcio, uniendo así
a las submicelas directamente o en cadenas en donde se incorpora fosfato y
citrato. La agregación de submicelas se producirá hasta que la superficie de la
micela se encuentre rodeada de κ-caseína, generando una repulsión estérica
(BELITZ y GROSCH, 1997; COULTATE, 1998).
La interacción de κ-caseína con las fracciones de α S y β-caseína, genera que
todo el complejo formado sea estable y no precipite en presencia de iones
calcio presentes en la leche en pequeña proporción (BADUI, 1984).
2.3.1.2 Estabilidad de la caseína. Ésta se debe esencialmente a cargas
electrostáticas y a la hidratación, además las caseínas poseen gran cantidad de
aminoácidos no polares que originan enlaces hidrófobos que favorecen la
estabilidad del complejo micelar (BADUI, 1984; AMIOT, 1991).
En la leche, la micela de caseína tiene carga neta negativa, ya que debido al pH
(6,7) predominan los grupos ácidos sobre los aminos. La existencia de cargas
11
eléctricas iguales genera repulsión y evita la coalescencia entre las micelas.
Basta neutralizar estas cargas con cargas positivas, iones H+ o cationes de
sales, para provocar la aglomeración de las micelas (VEYSSEYRE, 1980;
BADUI, 1984; AMIOT, 1991).
El fenómeno anterior se explica, por la existencia en abundancia de
aminoácidos diácidos (ac. glutámico y aspártico), fosfoserina y ácido siálico en
el caso de κ- caseína (VEYSSEYRE, 1980).
BELITZ y GROSCH (1997), mencionan que el ácido aspártico y el ácido
glutámico corresponden respectivamente, a un 7% y 23,4% de la caseína. Esto
puede ser observado en el CUADRO 3.
También, existe una estrecha afinidad entre el agua y las proteínas, explicado
sobre la base de la existencia de fuerzas electrostáticas opuestas entre las
micelas y los grupos polares de la molécula de agua. Esta agua ligada, reduce
la tensión superficial y se opone a fuerzas de cohesión (AMIOT, 1991).
2.3.2 Proteínas del suero. Estas proteínas presentan una estructura globular
compacta, con una distribución bastante uniforme de residuos no polares polares
cargados.
Razón
por
la
que
estas
proteínas
se
pliegan
intramolecularmente, ocultando los grupos hidrófobos de las cadenas
polipeptídicas (FENNEMA, 1993; WALSTRA et al., 1999).
Las proteínas del suero tienen una estructura compacta, son solubles en un
intervalo de pH muy amplio y en estado nativo no se asocian con las caseínas.
Son un grupo heterogéneo y existen ocho fracciones distintas, siendo las más
importantes: β-lactoglobulina, α-lactoalbúmina, inmunoglobulinas, albúmina
bovina y proteosa-peptona. Estas proteínas son termosensibles y se
12
desnaturalizan por acción del calor a temperaturas mayores a los tratamientos
de pasterización (BADUI, 1984; AMIOT, 1991).
Las proteínas del suero están estabilizadas principalmente por un mecanismo
de agua de hidratación. En general, estas proteínas son muy sensibles al calor
y en menor grado a la acción del ácido, debido al efecto deshidratante de estos
agentes (ALAIS, 1985).
Cuantitativamente, las proteínas del suero representan el 20% de las proteínas
totales y tienen un importante valor nutritivo, ya que posee más aminoácidos
esenciales que las caseínas. Además, estas proteínas no quedan retenidas en
los quesos normales, ya que no coagulan por acción del cuajo existiendo
interés por recuperarlas a escala industrial (AMIOT, 1991).
2.3.2.1 β -lactoglobulina. Es la proteína más abundante en el lactosuero de la
leche de vaca y la mayor fuente de grupos sulfhidrilos (-SH) de la leche. Se
caracteriza por ser una molécula muy compacta, dado su naturaleza
hidrofóbica, cuya cadena esta fuertemente plegada (VEYSSEYRE, 1980;
WALSTRA et al., 1999).
La β-lactoglobulina, no esta ligada a otras fracciones proteicas, pero al calentar
la leche forma un complejo con
κ-caseína. Este complejo es estable y se
produce mediante un puente disulfuro (ALAIS, 1985).
Esta proteína presenta polimorfismo genético, existiendo a lo menos cuatro
variantes distintas: A, B, C y D (AMIOT, 1991; BELITZ y GROSCH, 1997).
FOX y McSWEENEY (1998), también señalan que β-lactoglobulina presenta
cuatro variantes (A, B, C y D), existiendo una quinta variante detectada en
estudios con ganado lechero australiano.
13
Por su parte, EIGEL et al. (1984), mencionan que β-lactoglobulina presenta
siete variantes genéticas (A, B, C, D, E, F y G), de las cuales solo A, B, C y D
se presentan en ganados lecheros occidentales.
2.3.2.2 α -lactoalbúmina. Ésta es una proteína asociada al complejo lactosa
sintetasa y es la segunda en concentración luego de la β-lactoglobulina. Se
caracteriza por ser una molécula esférica y compacta, no posee grupos
sulfhidrilos libres aunque el contenido en cistina es elevado. Además, presenta
una gran proporción de triptófano ( WEBB et al., 1980; WALSTRA et al., 1999).
2.4
Factores que influyen en la cantidad y composición de proteínas de
la leche
La cantidad y composición de la leche sufre variaciones importantes en función
de diversos factores. Estos actúan sobre la composición, en conjunto, y no de
manera aislada (ALAIS, 1985; CASADO y GARCIA, 1985; WALSTRA et al.,
1999).
Según Mahieu; citado por CASADO y GARCIA (1985), dentro de los factores de
variación de la composición de la leche, el 36% de ellos están ligados al animal
y son caracteres hereditarios y alrededor del 60% se deben al medio en que
vive la vaca.
Para ALAIS (1985), los principales factores de variación son:
-
Factores fisiológicos: desarrollo durante la lactancia.
-
Factores alimentarios: aspectos relacionados a las raciones alimenticias.
-
Factores climáticos: estación, temperatura y humedad.
14
-
Factores genéticos: razas, herencia, selección.
-
Factores zootécnicos: condiciones de ordeño.
Estos factores pueden ser clasificados en dos grupos, unos dependientes del
animal (factores genéticos, fisiológicos) y otros no dependientes de él. En los
últimos se encuentran factores del medio que rodean al animal como:
alimentación, época de parto, clima y ordeño (CASADO y GARCIA, 1985).
Por su parte, KROEKER et al. (1985), menciona que los principales factores
que afectan el contenido de proteína total y caseína son: la estacionalidad, la
etapa de lactancia, edad de la vaca, recuento de células somáticas y las
variantes genéticas de las caseínas.
Por otro lado, Feagan citado por NG KWAI HANG et al. (1982), señala que los
factores que pueden influir en la composición de la leche son: raza del animal,
nutrición, manejo y estado sanitario.
Respecto de los distintos factores de variación y su efecto en el contenido y
composición de proteínas de la leche, diversos autores mencionan lo siguiente.
2.4.1 Factores fisiológicos. Los distintos periodos de la etapa de lactancia
tienen influencia sobre la cantidad y composición de la leche, verificándose una
modificación en la composición durante la lactancia. La concentración de grasas
y proteínas en la leche decrece durante el primer mes de lactancia, para luego ir
aumentando progresivamente hasta el final de ésta. Esto se debe a que la
producción de leche disminuye de manera significativa, generándose un
enriquecimiento de la leche (CASADO y GARCIA, 1985).
El ciclo de lactancia no se mantiene de manera invariable durante la vida del
animal, obteniéndose la máxima producción de leche entre el tercer y quinto
15
parto para luego decrecer lentamente según el animal. (ALAIS, 1985; CASADO
y GARCIA, 1985)
A su vez, NG KWAI HANG et al. (1982), señalan que factores como la edad de
la vaca y etapa de lactancia contribuyen significativamente en las variaciones
en la composición de proteína total, proteína del suero, caseína y la proporción
de caseína en la proteína de la leche.
KROEKER et al. (1985), señalan que durante los dos primeros meses de
lactancia, el porcentaje de α S-caseína decrece vertiginosamente con un
incremento recíproco del porcentaje de β-caseína. Posterior a este período,
estas dos fracciones proteicas se mantienen relativamente constantes.
Para autores como De Peters y Cant; citados por LATRILLE (1993), los
cambios en la composición de la leche por efecto del estado en la lactancia, son
mínimos.
2.4.2 Factores alimentarios. Según CASADO y GARCIA (1985), la síntesis de
proteínas en la glándula mamaria se realiza por el aporte de aminoácidos
provenientes básicamente de dos fuentes: aminoácidos provenientes de la dieta
no degradables y aminoácidos sintetizados por la flora microbiana del rumen.
Los aspectos fundamentales de la alimentación que influyen en el suministro de
aminoácidos en la glándula mamaria son: el tipo de proteína presente, la
energía disponible y la composición de la ración.
Dietas ricas en energía con un aporte de proteína y carbohidratos solubles
adecuado influyen positivamente sobre el contenido en proteínas sintetizadas
en la glándula mamaria, lo que explica las variaciones por el cambio de régimen
alimenticio (ALAIS, 1985; DE PETERS y FERGUSON, 1992).
16
2.4.3 Factores climáticos. Aquí existen una serie de factores variables que
actúan de manera conjunta como: estación, temperatura, alimentación, período
de lactancia.
ALAIS (1985) y CASADO y GARCIA (1985), mencionan que a mayor
temperatura se observan cambios en la composición de la leche y se verifica
una disminución de la cantidad de proteínas, lactosa y extracto seco total. Esto
también es ratificado por DE PETERS y FERGUSON (1992), los que señalan
que a altas temperaturas ambientales se reduce el contenido de proteína total
de la leche.
Así mismo, a un estado de lactancia constante la concentración de materia
grasa y proteína de la leche son mayores en invierno y menores en verano
presentándose la situación inversa para la producción diaria de leche (ALAIS,
1985; Coulon y Remond, citados por LATRILLE, 1993 ).
2.4.4 Factores genéticos. Es posible encontrar diferencias en la composición
de la leche entre razas bovinas existentes, y también hay diferencias entre
vacas individuales de una misma raza. Estas diferencias son preponderantes ya
que en relación con los proteínas y materia grasa de la leche, constituyen un
factor que predispone a favor de la determinación genética de estos caracteres
(ALAIS, 1985; BOLAND y HILL, 2001).
En el CUADRO 4, se puede apreciar la composición de la leche para diversas
razas de ganado lechero. Las variaciones existentes entre las razas y las
diferencias en cuanto a la relación proteína/grasa y N° de caseína, son más
favorables para la raza Montbeliarde que para las otras tres razas presentadas.
Interesante es lo que ocurre con la raza Holstein, la que posee el menor valor
de proteína por 100 g, pero presenta un N° de caseína cercano a la raza
17
Normanda, lo que permite inferir que gran parte de la proteína presente es
caseína.
CUADRO 4 Composición de la leche de vaca para diferentes razas.
Grasa
g/100g
Proteína
g/100g
Proteína/grasa
Frisona
3,79
3,06
0,81
Holstein
3,65
3,01
0,82
Normanda
4,10
3,31
0,81
Montbeliarde
3,60
3,15
0,86
FUENTE: Remond, citado por CASADO y GARCIA (1985).
N° de caseína
81,4
81,7
81,8
82,2
Además, dentro de cada familia de caseínas (α, β y κ) existen variantes
genéticas que se han asociado a la leche con mejores propiedades para su
elaboración. Es así, el caso de κ-caseína en la que existen dos variantes (A y
B) y donde la variante B ha sido asociada a una mayor producción de proteína
láctea. Esta variante esta presente con mayor frecuencia en la raza Jersey,
comparado con la
Holstein – Friesian (McLEAN et al., 1984; VAN
EENENNAAM y MEDRANO, 1991).
En relación a lo anterior, es posible gracias a técnicas de biología molecular,
seleccionar reproductores por alelos específicos permitiendo el aumento de la
frecuencia de estos, en razas en las que casi no están presentes (LATRILLE,
1993).
2.4.5 Factores zootécnicos. El ordeño es un factor que puede cambiar la
composición de la leche en un momento determinado, pero no la cantidad total
de cada componente producida a lo largo del día (CASADO y GARCIA, 1985).
Durante el ordeño, el contenido de materia grasa aumenta progresivamente,
pero a su vez disminuye los contenidos de proteínas, lactosa y sales minerales
(CASADO y GARCIA, 1985; WALSTRA et al., 1999).
18
Un ordeño completo es vital para el mantenimiento de una buena producción,
ya que tras un ordeño incompleto la leche que queda en la mama tiene un
efecto inhibidor sobre la secreción (ALAIS, 1985).
2.5 Polimorfismo genético de las proteínas de la leche
En los tejidos animales es posible encontrar proteínas semejantes entre sí por
su composición, peso molecular y propiedades. Estas representan varias
formas genéticas de una misma proteína, es decir, se trata de variantes cuya
síntesis esta comandada por un gen en particular. La existencia de estas
variantes para una misma proteína, dentro de una población, es lo que se
conoce como polimorfismo (ALAIS, 1985; LEHNINGER y NELSON, 1995).
La amplia heterogeneidad de las proteínas lácteas, se debe a que son producto
de genes autosomales, alélicos, codominantes, que transmiten el carácter
desde los padres por herencia mendeliana simple (Aschaffenburg citado por
GONZALEZ de LLANO 1990; FELMER y BUTENDIECK, 1998).
Las variantes de una proteína se diferencia solo por mínimas variaciones en su
composición, a menudo se trata de la sustitución de uno o dos aminoácidos en
la cadena peptídica. En ocasiones existe una delección, o sea, ausencia de un
pedazo de la cadena. La existencia de estas variaciones genera leves
diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas como:
propiedades eléctricas, solubilidad y propiedades asociativas. Existen, por
ejemplo, diferencias en la carga neta de la molécula lo que permite identificar
las variantes vía técnicas de separación como la electroforesis (ALAIS, 1985;
LEHNINGER y NELSON, 1995).
Las variantes genéticas se designan por letras (A, B, C, D), pudiendo existir
individuos homocigotos y heterocigotos, los que pueden presentar una variante
19
(AA, BB) o una mezcla de ellas (AB, AC, BC), respectivamente. En las especies
bovinas la frecuencia con la que se presentan estas variantes esta influenciada
por la raza (ALAIS, 1985).
La existencia de formas genéticas determinadas, con propiedades distintas y en
proporción variable en la leche, puede ser la causa esencial de las diferencias
que se observan en el curso de los tratamientos industriales a los que se
somete la leche (ALAIS, 1985; Allmere et al. citados por JAKOB y PUHAN,
1995).
Según BELITZ y GROSCH (1997), algunas de las variantes genéticas
predominan en especies bovinas asociadas a algunas zonas geográficas, tal es
el caso de la variante C de α S1-caseína que se encuentra mayoritariamente en
la India asociada a la especie Bos indicus.
En relación a lo anterior, GONZALEZ de LLANO (1990) menciona que las
variante genéticas no aparecen aleatoriamente ni con la misma frecuencia, aun
cuando algunas son variantes universales, otras son exclusivas de ciertas
razas.
El CUADRO 5, presenta las principales proteínas de la leche, sus variantes y
algunas de sus propiedades relevantes como: peso molecular y punto
isoelectrico.
Como se puede apreciar, para cada proteína presente en la leche existen a lo
menos tres variantes genéticas identificadas, cada una con un punto
isoelectrico diferente. Además, el peso molecular entre las variantes genéticas
de cada proteína difiere en un pequeño rango debido principalmente a la
sustitución de algunos aminoácidos en la cadena primaria.
Existen ciertas diferencias entre autores, en cuanto al punto isoelectrico de las
variantes, que por lo general se deben a técnicas de determinación diferentes.
20
CUADRO 5 Distribución y propiedades de las principales proteínas de la
leche.
Variantes
genéticas
Peso
molecular
pI
Caseína
α S1 – caseína
Contenido
g/L
27,2
12 – 15
A
B
C
D
E
22.068
23.614
23.542
23.724
23.542
....
4,44 – 4,76 (2)
....
....
4,2 – 4,6(2)
α S2 – caseína
3–4
β - caseína
9 – 11
κ - caseína
2–4
A
B
C
D
A1
A2
A3
B
C
D
E
A
B
C
E
25.230
....
....
....
24.023
23.983
23.974
24.092
23.944
23.944
23.982
19.039
19.007
....
....
....
....
....
....
5,3(1)
4,83 – 5,07 (2)
....
....
....
....
....
5.66(4); 7,1(3)
5,88(4); 7,3(3)
3,7 – 4,2(1)
....
Proteínas del suero
β - lactoglobulina
2–4
A
B
C
D
E
F
G
A
B
C
18.363
18.277
18.286
18.276
18.205
18.243
18.223
14.147
14.175
....
5,13(1) ; 5,3(2)
5,13(2)
....
....
....
....
....
5,1(1)
....
....
Componente
α - lactoalbúmina
0,6 – 1,7
FUENTE: (1) ATHERTON y NEWLANDER (1977); (2) EIGEL et al. (1984); (3)
ADDEO et al. (1983); (4) Di LUCCIA et al. (1988).
En el CUADRO 6 es posible observar la frecuencia en la expresión de las
principales variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina, según diversos
autores, en distintas razas bovinas.
21
CUADRO 6 Frecuencia alélica de las principales variantes genéticas de κcaseína y β -lactoglobulina para diferentes razas bovinas.
κ-caseína
Raza
A
β-lactoglobulina
B
(4)
C
(4)
A
B
(4)
Ayrshire (NZ)
0,797
0,203
-
0,297
0,703(4)
Freisian (NZ)
0,826(4)
0,174(4)
-
0,487(4)
0,513(4)
Frisón (US)
0,850(2)
0,150(2)
-
0,500(2)
0,500(2)
Jersey (NZ)
0,519(4)
0,481(4)
-
0,316(4)
0,684(4)
Holstein (Canadá)
0,744(1)
0,256(1)
-
0,387(1)
0,613(1)
Holstein (Hungría)
0,704(5)
0,230(5)
0,066(5)
0,453(5)
0,547(5)
Holstein – Freisian (US)
0,750(3)
0,250(3)
-
-
-
FUENTE: (1) NG KWAI HANG et al. (1984); (2) Aschaffenburg citado por ALAIS
(1985); (3) GONZALEZ de LLANO (1990); (4) WINKELMAN y
WICKHAM (1997); (5) BARANYI et al. (1997).
En relación al cuadro anterior, es importante señalar, que las diferencias en las
frecuencias alélicas respecto a una raza en particular, se deben probablemente
a variaciones en el tamaño muestreal de la investigación, o bien, a causas
inherentes al animal como pureza de las razas o cruza de éstas que harán
variar la frecuencia (NG KWAI HANG, 1997).
Por su parte, WINKELMAN y WICKHAM (1997), estudiando las variantes
genéticas de las proteínas lácteas en ganado lechero Neozelandés,
encontraron que la variante A de κ-caseína predomina sobre el alelo B, y es
encontrado con mayor frecuencia en la raza Friesian. Además, para βlactoglobulina, establecieron que la variante B de esta proteína predominaba
sobre la variante A, presentándose con mayor frecuencia en la raza Ayrshire.
Asociaciones similares han sido dilucidadas por BARANYI et al. (1997), quienes
trabajaron con ganado lechero húngaro, reportando predominancia de la
variante A para κ-caseína y la variante B para β-lactoglobulina en la mayoría
22
de las razas estudiadas. La excepción fue la raza Friesian en la que se presentó
un ligero predominio de la variante B de κ-caseína.
DELACROIX - BUCHET et al. (1993), señalan que en estudios con ganado
lechero francés la variante C de κ - caseína esta presente solo en la raza
Tarentaise.
Por otro lado, ALAIS (1985), señala que una variante genética específica se
expresa con mayor frecuencia en algunas razas bovinas, por ejemplo, respecto
a β-caseína, el gen A es mucho mas frecuente en razas como: Ayshire,
Shorthorn y Friesian. En cambio, el gen C es muy poco frecuente y se
encuentra solo en algunas razas como Guernsey.
Buchberger citado por JAKOB y PUHAN (1995), señala que la variante C de β caseína esta presente en muy baja frecuencia (<0,06) y se encuentra en
ganados lecheros franceses como: Tarantaise y Normande. El mismo autor,
menciona que las variantes C y D de β-lactoglobulina no son frecuentes (<0.05)
encontrándose en ganado Simmental ruso y en ganado Montbeliarde francés.
2.5.1 Polimorfismo de κ caseína. Posee 169 residuos de aminoácidos y un
peso molecular estimado de 19.000 dalton (BELITZ y GROSCH, 1997).
La κ-caseína, difiere de las otras caseínas existentes, por tener dos residuos de
cisteína que pueden formar puentes disulfuro intermoleculares y 2/3 de la
molécula contiene grupos carbohidratos (WALSTRA et al., 1999).
Existe comúnmente 4 variantes genéticas de κ-caseína: A, B, C, E. Para el caso
de la especie Bos Taurus, predominan esencialmente dos variantes genéticas:
A y B. Las diferencias entre estas, se basan en la sustitución en la cadena
aminoacídica de treonina por isoleucina en la posición 136 y un residuo de
23
ácido aspártico por alanina en la posición 148 (GONZALEZ de LLANO , 1990;
BELITZ y GROSCH, 1997).
2.5.2 Polimorfismo de β lactoglobulina. β-lactoglobulina, se encuentra en el
suero y es una proteína de 162 aminoácidos con un peso molecular estimado
de 18.300 dalton. En condiciones de pH de la leche, forma un dímero, con dos
unidades monoméricas iguales (FOX y McSWEENEY, 1998).
Para β-lactoglobulina existen 4 variantes genéticas: A, B, C y D. Teniendo
sustituciones en las posiciones 45, 59, 64, 118, 158 (BELITZ y GROSCH,
1997).
En el CUADRO 7, se pueden apreciar los lugares en los que se encuentran las
sustituciones aminoacídicas en la estructura primaria de las proteínas κ-caseína
y β-lactoglobulina.
Como se puede apreciar en el cuadro siguiente, las variantes originadas para
ambas proteínas se deben a la sustitución de uno o mas aminoácidos en la
estructura primaria, a diferencia de α S-caseínas y β-caseínas que presentan
delecciones en sus respectivas estructuras.
Polimorfismo de variantes genéticas de κ-caseína y β lactoglobulina.
Proteína
Variante
Posición de las sustituciones
κ-caseína
136
148
A
Thr
Asp
B
Ile
Ala
β-lactoglobulina
45
59
64
118
158
A
Asp
Val
B
Glu
Gln
Gly
Ala
Glu
C
His
D
Gln
FUENTE: BELITZ y GROSCH (1997).
CUADRO 7
24
2.5.3 Efecto del polimorfismo de κ-caseína y β -lactoglobulina en la leche.
Según JAKOB (1994), en diferentes estudios realizados se ha investigado la
relación entre el polimorfismo genético de las proteínas de la leche y las
características de producción lechera, la composición de la leche y las
propiedades tecnológicas de ésta. Razón por la que, las variantes genéticas de
las proteínas han adquirido interés para la industria láctea, debido a la
asociación de estas con la aptitud quesera de la leche.
2.5.3.1 Producción de leche. Para el caso de κ-caseína, autores como
BOVENHUIS et al. (1992) y GONYON et al. (1987), han reportado que vacas
Holstein con κ-caseína AA fueron asociadas con una mayor producción de
leche que el fenotipo BB, desplazando a una posición intermedia al fenotipo AB.
Respecto al mismo tema, Ozbeyaz et al. citado por NG KWAI HANG (1997),
señalan que para leche de vacas Jersey con presencia del alelo A de κ-caseína
se verificó la mayor producción de leche, en contraposición a lo expuesto por
Kim y Ng Kwai Hang et al. citados por NG KWAI HANG (1997), quienes
descubrieron que vacas con fenotipos AB producían más leche que vacas
homocigotas de la misma raza.
NG KWAI HANG et al. (1986), señalan a pesar de estudios anteriores
contradictorios, que la producción y composición de la leche puede ser
influe nciada por las variantes genéticas de las proteínas lácteas, estableciendo
que el fenotipo AB de κ-caseína presenta una mayor producción. En el mismo
estudio, los autores establecen que las producciones diarias para ganado
Holstein fueron superiores para κ-caseína AB con 21,44 kg., en comparación
con 20,88 kg. y 20,83 kg. para κ-caseína AA y BB, respectivamente.
Por su parte, Kim citado por NG KWAI HANG (1997), trabajando con vacas de
la raza Canadienne de segunda lactancia, estableció que aquellas que
25
presentaban fenotipo AB de κ-caseína produjeron 4659 kg. de leche, a
diferencia de los fenotipos AA y BB que presentaron 4141 kg. y 4033 kg.,
respectivamente. Todo esto comprendido en un período de tiempo de 305 días
de lactancia.
WINKELMAN y WICKHAM (1997), en trabajos con 3761 vacas Friesian y 1328
vacas Jersey, señalan que el fenotipo BB de κ-caseína presenta una
producción mayor que la del fenotipo AA, pero la magnitud de la diferencia entre
fenotipos es mayor para la raza Friesian.
Al contrario, McLEAN et al. (1984), reportan que no existen diferencias en la
producción de leche para los diferentes fenotipos de κ-caseína. Esto también es
confirmado por HAENLEIN et al. (1987) y LIN et al. (1986).
En lo referente a β-lactoglobulina, para NG KWAI HANG et al. (1984) y
McLEAN et al. (1984), no existen asociaciones entre las variantes de ésta
proteína con la producción de leche en vacas de razas Holstein, Friesian y
Jersey. Pero NG KWAI HANG et al. (1986), en estudios con 2045 vacas
Holstein, señalan que vacas que poseen la variante A de β-lactoglobulina son
altamente productoras.
Distinto es lo expuesto por Janicki, citado por NG KWAI HANG (1997), quien
menciona que la variante B fue asociada a una producción de leche más alta.
BOVENHUIS et al. (1992), pudieron establecer que vacas de primera lactancia,
presentando el fenotipo AA para β-lactoglobulina produjeron 93 kg. más de
leche que vacas con fenotipo BB.
2.5.3.2 Composición de la leche. Respecto a la composición de la leche y su
relación con las variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina, hay
26
concordancia en que leches con alelo B de κ-caseína poseen mayor contenido
de materia grasa, proteína y caseína. Al respecto, DELACROIX – BUCHET et
al. (1993) y IKONEN et al. (2001), señalan que el alelo B de κ-caseína fue
asociada
con un mayor contenido de proteína, en comparación con las
variantes A,C y E.
AMIGO et al. (2001), realizando estudios con 174 vacas Fleckvieh españolas,
encontraron que leche de fenotipo AB para κ-caseína tiene un contenido más
alto de proteína que las leches con fenotipo AA.
NG KWAI HANG et al. (1986), utilizando datos diarios de producción de 2045
vacas Holstein Friesian, durante dos años, establecieron que leches que
contenían κ-caseína B presentaban un contenido de materia grasa mayor, que
aquellas que presentaban κ-caseína A.
Además, NG KWAI HANG et al. (1986), mencionan que leches de vacas con κcaseína fenotipo BB, contienen 0,07% y 0,10% más proteína y caseína, que
leches de vacas con fenotipo AA. La proporción de caseína en la leche,
indicada como el número de caseína, también se ve favorecida por el fenotipo
BB (GONYON et al., 1987; ALEANDRI et al., 1990; BOVENHUIS et al., 1992).
En el CUADRO 8, se puede observar los contenidos promedios de proteína
reportados por NG KWAI HANG et al. (1986), para cada fenotipo de κ-caseína,
en estudios con vacas Holstein – Friesian.
Respecto al CUADRO 8, los valores promedio por componentes para los
respectivos fenotipos fueron: 3,37% proteína total, 0,71% proteína del suero,
2,65% caseína y un número de caseína igual a 78,91 para κ- caseína AA. Para
κ- caseína BB los valores registrados fueron: 3,44% proteína total, 0,69%
proteína del suero, 2,75% caseína y número de caseína igual a 80,06.
27
CUADRO 8 Valores promedio de contenido proteico para fenotipos de κcaseína.
Fenotipo
% Proteína
% Caseína
total
% Proteína del
N° de caseína
suero
AA
3,37
2,65
0,71
78,91
AB
3,37
2,67
0,70
79,32
BB
3,44
2,75
0,69
80,06
FUENTE: NG KWAI HANG et al. (1986).
En relación al cuadro anterior, el fenotipo BB es asociado con mayores %
proteínas, % caseína y un menor % proteína del suero, resultando un número
de caseína más alto.
En otras investigaciones, DELACROIX – BUCHET et al. (1993) y MARIANI et
al. (1995), determinaron contenidos más altos de caseína en leches de vacas
con presencia del fenotipo BB.
DELACROIX – BUCHET et al. (1993), mencionan también que leches con el
fenotipo BB de κ-caseína fueron asociadas con contenidos mayores de κcaseína.
Por el contrario, McLEAN et al. (1984), trabajando con ganado Jersey y Frisón
no encontraron diferencias en el contenido de proteínas de leches que
presentaron la variante A o B de κ-caseína. La diferencia de esta investigación
con las anteriores radica en que fue realizada en un período 4 meses utilizando
un número de vacas menor. Las conclusiones establecidas por McLEAN et al.
(1984), también fueron informadas por HAENLEIN et al. (1987).
Sin embargo, NG KWAI HANG et al. (1990), señalan que los resultados
obtenidos en diversos estudios son contradictorios y a veces no comparables,
debido a diferencias en el tamaño de la población, raza de las vacas,
28
frecuencias de expresión de las variantes genéticas y formas de expresión de
las características en estudio, es decir, datos de producción y composición de la
leche recopilados diariamente o por lactancia.
Referente a las variantes de β-lactoglobulina y su influencia en la composición
de la leche, desde el descubrimiento realizado por ASCHAFFENBURG y
DREWRY (1957), quienes señalaron que la leche de vacas que contienen
fenotipo AA de β-lactoglobulina presentan un contenido proteico mayor, que los
fenotipos AB o BB, numerosos estudios han ratificado lo mismo.
Es así como, McLEAN et al. (1984), NG KWAI HANG et al. (1984), NG KWAI
HANG et al. (1986) y NG KWAI HANG et al. (1990), coinciden en que leches
que presentan el fenotipo AA de β-lactoglobulina tienen un porcentaje mayor de
proteína total y proteína del suero. A su vez, manifiestan que leches que
contienen el fenotipo BB presentan concentraciones de caseína y número de
caseína significativamente mayores, que aquellas con fenotipos AA o AB.
Para JAKOB (1994), leches que presentan β-lactoglobulina BB tienen entre
9,5% y 14% menos proteína del suero, que leches con β-lactoglobulina AA. En
consecuencia, porcentajes más altos de caseína resultan en números de
caseína entre 2% a 3% mayores, para leches con β-lactoglobulina BB que para
el fenotipo AA.
En el CUADRO 9 se puede apreciar el efecto de las variantes de βlactoglobulina sobre la composición de las proteínas de la leche según la
investigación realizada por NG KWAI HANG et al. (1986).
Respecto al CUADRO 9, leches con β-lactoglobulina AA presentaron un valor
para proteína total de 3,41%, siendo mayor que el valor obtenido para el
fenotipo BB. Según NG KWAI HANG (1997), el mayor contenido de proteína se
debe a mayores cantidades de proteína del suero (0,76), lo que a su vez se
29
relaciona con una baja concentración de caseína. Leches con fenotipo BB de βlactoglobulina contienen 0,65% de proteína del suero y 2,72% de caseína, con
un número de caseína mayor al fenotipo AA.
CUADRO 9 Resultados promedio de contenido proteico para fenotipos de
β-lactoglobulina.
% Proteína
% Proteína
N° de
Fenotipo
% Caseína
total
del suero
caseína
AA
3,41
2,66
0,76
77,95
AB
3,41
2,71
0,71
79,46
BB
3,37
2,72
0,65
80,86
FUENTE: Ng Kwai Hang, citado por JAKOB y PUHAN (1995).
Para van den Berg et al. y Reichardt et al., citados por NG KWAI HANG (1997),
contenidos más elevados de caseína se encuentran en leches con βlactoglobulina fenotipo BB.
En síntesis, la presencia del fenotipo BB de ambas proteínas (κ- caseína y βlactoglobulina), afectan el contenido proteico de la leche verificándose un
aumento del % de caseína y una disminución del % proteína del suero. Lo
anterior se expresa en un número de caseína mayor.
2.5.3.3 Propiedades tecnológicas de la leche. Los componentes de la leche,
especialmente el contenido de proteína, tienen una influencia preponderante en
las propiedades tecnológicas de la misma y por supuesto, un valor económico
para la industria láctea. La variación de estos componentes y de las
propiedades tecnológicas están influenciadas por las variantes genéticas de las
proteínas de la leche. Debido a lo anterior, en los últimos tiempos se ha
investigado la influencia que tienen estas variantes genéticas en las
30
propiedades tecnológicas y los beneficios que generaría en relación al
procesamiento industrial. (JAKOB, 1994; Lundén et al., citado por JAKOB y
PUHAN, 1995)
Para DELACROIX - BUCHET et al. (1993) y DALGLEISH (1995), el tiempo de
coagulación para leches que contienen la variante B de κ-caseína es más corto,
que aquellas que presentan la variante A. Lo que estaría asociado al tamaño de
la micela y a la presencia de iones Ca+2 libres. Teniendo una real incidencia en
la formación de la cuajada.
Por su parte, HORNE y MUIR (1994), señalan que leches de vaca frisona
homocigotas para κ-caseína B tienen un tiempo de coagulación “visual” más
corto que para la variante A, generando a su vez geles de una consistencia más
firme. Lo anterior también es ratificado por autores como Mayer et al. citados
por JAKOB y PUHAN (1995), estableciendo que leches de κ-caseína BB
generan cuajadas más firmes y en menor tiempo.
SCHAAR et al. (1985), menciona que la presencia de la variante B de κcaseína en las leches estudiadas tiene un efecto significativo sobre el contenido
de citrato y el tiempo de coagulación, al mismo tiempo la variante B de βlactoglobulina tiene un efecto significativo sobre el número de caseína y el
contenido de materia seca en quesos.
Macheboeuf et al. citados por CREAMER y HARRIS (1997), determinaron que
leches con κ-caseína BB tienen un tiempo de coagulación más corto y una
mayor firmeza del gel, que κ-caseína AA. Ubicando al fenotipo AB en una
posición intermedia.
Según FITZGERALD y HILL (1997), múltiples variedades de queso como:
Edam, Gouda, Cheddar, Camembert y Mozarrella provenientes de leches con
κ-caseína BB presentan rendimientos de 1% a 10% superiores, que aquellos
31
provenientes de leches con κ-caseína AA. Esto debido a que existe mayor
retención de materia grasa y una cuajada más firme. Además, éstos autores
señalan que el suero de queso proveniente de leches con κ-caseína BB tienen
niveles bajos de materia grasa y finos de cuajada.
En otro aspecto, McLEAN et al. (1984), señalan que en estudios con leches de
vacas Frisón y Jersey, la estabilidad térmica natural y la estabilidad térmica
máxima de la leche es influenciada positivamente por la variante B de κcaseína.
Además, Schulte-Coerne et al. citados por JAKOB (1994), confirman que
leches con la variante B de κ-caseína tienen una mejor estabilidad térmica.
Para leches con κ-caseína BB el tiempo de coagulación térmica a 140 °C es de
un 40% a un 90% mayor que para κ-caseína AA. Las mismas relaciones
también fueron válidas para los fenotipos de β-lactoglobulina.
Otros autores como HILL et al. (1997), señalan que la presencia en la leche de
la combinación de fenotipos AA y BB de β-lactoglobulina y κ-caseína,
respectivamente, presentó una mayor estabilidad térmica seguida de la
combinación AA-AA, BB-BB y BB-AA. Estas diferencias, en la propiedades de
coagulación térmica, influenciarán en las propiedades y manufactura de los
productos lácteos.
En relación a estudios en productos fermentados, Bo y Pitotti citados por
FITZGERALD y HILL (1997), reportan que en yoghurt elaborado con leche que
contiene κ-caseína BB se obtiene una menor separación de suero. Y para el
caso de β-lactoglobulina una mayor sinéresis se logra con leches que contienen
β-lactoglobulina AA, a diferencia del fenotipo BB.
32
2.6 Electroforesis de isoenfoque en la determinación de las variantes
genéticas
Muchas moléculas biológicas poseen carga eléctrica, por lo que migrarán al
aplicar un campo eléctrico. La magnitud de esta migración depende de la
molécula, del pH y de la composición del medio (PLUMMER, 1981).
Esta técnica se basa en el movimiento de una partícula con cierta carga
eléctrica, suspendida en un medio, bajo la acción de un campo eléctrico. La
partícula se moverá con velocidad constante, proporcional a la carga, debido a
la acción del campo eléctrico y la fricción, producto de la viscosidad del medio
(FREIFELDER, 1982; ALAIS, 1985).
Las proteínas tienen carácter anfotérico, poseen grupos cargados positivos y
negativos, y su carga depende del pH. Existirá un pH en el cual la proteína tiene
carga neta cero, denominado punto isoelectrico (pI). En éste punto, la proteína
no migrará por la acción de un campo eléctrico. Al aplicar una mezcla de
proteínas, en un gradiente de pH, estas se movili zarán hasta un punto del
mismo en el que no tendrán carga, deteniéndose. Es decir, cada molécula
migrará dentro del gradiente de pH, hasta el punto correspondiente a su propio
punto isoelectrico. Este método de separación de acuerdo al punto isoelectrico
en un gradiente de pH se conoce como electroforesis de isoenfoque
(FREIFELDER, 1982).
La electroforesis de isoenfoque es una técnica en la que los componentes
anfotéricos son fraccionados de acuerdo a su pI a través de un gradiente de pH
estable (Righetti et al. citados por HAMES, 1998).
El gradiente de pH es establecido con una solución de componentes anfotéricos
que tienen puntos isoeléctricos muy cercanos, dentro de un rango de pH. Estos
componentes anfotéricos, descritos como una mezcla de polianfolitos de bajo
peso molecular, se conocen como anfolitos (FREIFELDER, 1982).
33
El gradiente se genera y se mantiene mediante el paso de una corriente
eléctrica. Después de cierto tiempo de aplicación al campo eléctrico, los
anfolitos migran, y
se establece gradualmente el gradiente de pH
(FREIFELDER, 1982; Righetti et al. citados por HAMES, 1998).
Righetti et al. citados por HAMES (1998), señala que la electroforesis de
isoenfoque presenta ventajas como: trabajar con un parámetro fisicoquímico
intrínseco de la proteina, como es su pI. Y permite una buena resolución de
proteínas en las que su pI difiere en solo 0.01 unidades de pH.
34
3. MATERIAL Y METODO
3.1 Materiales
3.1.1 Obtención de muestras. Muestras de leche, de diez vacas raza Frisón
Negro, se obtuvieron desde el predio Santa Rosa de la Universidad Austral de
Chile durante el período Septiembre – Diciembre de 2001.
Las diez vacas en estudio fueron seleccionadas de manera que presentaran
características similares como: primera lactancia, igual edad, información de la
progenie, libres de mastitis y sometidas a un régimen alimenticio similar. La
información fue recolectada con una encuesta presentada en el ANEXO 1. Los
detalles de la información recopilada puede observarse en el ANEXO 2.
Se realizó un muestreo por mes, desarrollado en dos etapas cada uno,
completando cuatro muestreos durante este período. Las muestras se
recolectaron en el ordeño matinal bajo los procedimientos establecidos por la
Norma Chilena 1011/1 (CHILE, INSTITUTO NACIONAL DE NORMALIZACIÓN,
1998).
En todos los muestreos se efectuó California Mastitis Test, para verificar el
estado sanitario de las vacas en estudio.
3.1.2 Lugar del ensayo. Las muestras de leche se transportaron al Instituto de
Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) de la Universidad Austral de
Chile. Los análisis se realizaron en el laboratorio de Química de Docencia y en
el laboratorio Kjeldahl del ICYTAL.
35
3.1.3 Equipos utilizados. Los principales equipos utilizados en las actividades
fueron los siguientes.
Cuantificación de proteínas.
-
Block digestor Selecta.
-
Unidad de destilación Selecta.
-
Tubos de digestión Kjeldahl.
Preparación de muestras.
-
Centrífuga IEC Centra MP 4.
-
Centrífuga Beckman J2 – HS.
-
Espectofotómetro Spectronic Genesys 5.
Corrida de electroforesis.
-
Cámara de electroforesis Karl-Heinz Müller KG. (cámaras con capacidad
para doce tubos)
-
Fuente de poder Karl-Heinz Müller KG (0 - 1500 Volt).
3.2 Muestras de leche y análisis
La cantidad de muestreos y las variables a analizar, en relación a la actividad,
pueden observarse en el CUADRO 10.
Se contemplan cuatro muestreos matinales durante el período Septiembre –
Diciembre, correspondiente a la estación primavera. Durante este período, a las
muestras de leche, se les determinó la presencia de las variantes genéticas A o
36
B para κ-caseína y β-lactoglobulina. Además, se analizó el contenido proteico
total, proteína del suero y caseína. Empleando la información anterior, también
fue posible calcular el número de caseína, para las muestras de leche en
estudio.
Cabe señalar, que en cada muestreo se preparó una leche mezcla
correspondiente a las leches de las vacas en estudio, la que fue sometida
también a los análisis antes mencionados.
CUADRO 10 Muestreos y análisis.
Estación
Muestreo
1
Proteínas
Variantes
2
•
κ-caseína.
•
A, B
3
•
β-lactoglobulina. •
A, B
Primavera
4
Respuesta estudiada
• Contenido proteína
total.
• Contenido
de
caseína.
• Contenido
de
proteína del suero.
• N° de caseína.
• Prod. leche AM.
3.3 Metodología
3.3.1 Cuantificación de proteína total. Las muestras de leche fueron
sometidas a análisis en duplicado por el método Semi Micro Kjeldahl FIL/IDF
20B: 1993, desarrollado por la Federación Internacional de Lechería.
El método consiste en la digestión de la muestra, usando un aparato de bloque
de digestión, con una mezcla de ácido sulfúrico concentrado y peróxido de
hidrógeno y sulfato de potasio, junto con un catalizador, para convertir el
nitrógeno orgánico presente en sulfato de amonio. La adición de un exceso de
hidróxido de sodio a la digestión fría libera amoníaco. Se destila el amoníaco
usando una unidad de destilación por arrastre de vapor y el destilado se recoge
dentro de un exceso de solución de ácido bórico y luego se titula con ácido
sulfúrico.
37
Este método determina el contenido de nitrógeno de la leche, a partir del
amonio producido.
3.3.2 Cuantificación de proteínas del suero. Esta se determinó según la
metodología desarrollada por Rowland presentada por FOX y McSWEENEY
(1998).
Las muestras de leche fueron tratadas para obtener el suero, según técnica de
McGann et al. citado por PINTO et al. (1998) (ANEXO 3).
Se separa la proteína no caseínica, precipitando la caseína en su punto
isoeléctrico, sin dilución significativa de la fracción proteica no caseínica. Esto
se obtiene agregando en volúmenes iguales ácido acético y acetato de sodio y
en una cantidad no superior al 6% del volumen de la leche, lo que compensa la
contracción en el volumen de leche debido a la separación de caseína y grasa
en el precipitado, por lo que a este filtrado se le denomina suero no diluído.
Una vez realizada la separación, al suero se le determinó el contenido de
nitrógeno, lo que se realizó en duplicado según el método Semi Micro Kjeldahl
FIL – IDF 20B: 1993, recomendado por la Federación Internacional de Lechería.
3.3.3
Determinación del contenido de caseína. El contenido para cada
muestra de leche, se determinó sustrayendo el contenido de proteína total
menos el contenido de proteína del suero, según el procedimiento utilizado por
Rowland citado por FOX y McSWEENEY (1998).
38
3.3.4
Determinación del número de caseína. Se refiere al calculo de la
proporción del contenido de caseína sobre el contenido de proteína total
(KROEKER et al, 1985; SCHAAR et al, 1985).
3.3.5 Medición de la producción de leche. Esta se realizó para cada vaca, en
cada uno de los muestreos matinales realizados. La determinación se efectuó
una vez recolectada la leche en los tarros lecheros utilizados, contando para
ello con una regla de medición.
3.4 Preparación de muestras de leche para la determinación de variantes
genéticas
3.4.1 Separación de κ caseína. Se separó κ-caseína de la leche de cada una
de las 10 vacas individuales en estudio. Lo anterior, se realizó según el método
descrito por McKENZIE y WAKE (1961). Esta técnica comprende una serie de
etapas que permiten la purificación completa de la κ-caseína desde la caseína
micelar. La metodología se redujo en etapas, hasta el punto en el que se logra
la separación de κ-caseína de a S-caseína y ß-caseína (ANEXO 4).
3.4.2 Separación de β lactoglobulina. Se realizó a partir de la leche de cada
una de las diez vacas en estudio, según el procedimiento utilizado por LOWE et
al. (1995), descrito en el ANEXO 5.
3.4.3 Determinación cuantitativa de proteínas de las muestras para
electroforesis. Las muestras una vez preparadas, se les cuantificó la proteína
39
que contenían mediante la metodología sugerida por LOWRY et al. (1951)
(ANEXO 6). Para los efectos prácticos se construyó una curva de calibración los
detalles pueden apreciarse en el ANEXO 7.
3.5 Electroforesis de isoenfoque. Las variantes genéticas de κ-caseína y βlactoglobulina
fueron
determinadas
utilizando
electroforesis
de
isoelectroenfoque según el método utilizado por CASANOVA (2001) (ANEXO
8).
3.5.1 Condiciones de la electroforesis. La electroforesis de isoenfoque fue
realizada bajo refrigeración, usando un sistema de electroforesis vertical en
tubos, conectada a una fuente de poder eléctrica (400 volt)
El anfolito utilizado en la preparación de los geles fue Ampholine (Bio Rad) con
un rango de pH comprendido entre 3 y 10.
3.5.2 Estándares de proteínas. Estándares de β-lactoglobulina liofilizados
(Sigma), variante A y B, fueron utilizados para identificar las variantes de las
muestras en análisis de las respectivas corridas. Estos estándares fueron
preparados a una concentración de 1 mg/ml. disolviéndolos en una solución de
urea 7 M con 0.1% de 2 – mercaptoetanol. También fueron utilizados
estándares de κ caseína de vacas puras congelados y purificados por
CASANOVA (2001). Una masa de 10 µg de cada estándar fue aplicada para las
corridas electroforéticas.
40
3.5.3 Preparación de las muestras. Las muestras de κ-caseína semipurificadas fueron diluídas 5 veces en una solución de urea 7 M con 0.1% de 2
– mercaptoetanol, de ésta se extrajo un volumen que contuviera 10 µg de
proteína, que fue aplicada en la electroforesis. Para el caso de β-lactoglobulina,
las muestras fueron diluídas 10 veces en la misma solución, aplicándose un
volumen para la electroforesis que contuviera 10 µg de proteína.
3.6 Densitometría
La densitometría de las bandas proteicas teñidas se efectuó, según el
procedimiento desarrollado por De JONG (1975). Para esto se utilizó el equipo
Pye Unicam SP 8-100 UV/VIS con una longitud de onda de 590 nm.
3.7 Análisis estadísticos
Para el análisis de datos se utilizó el paquete estadístico Statgraphics plus 2.0.
Se efectuó un análisis de varianza multifactorial, para determinar si el efecto de
los factores estudiados (muestreo, variantes de κ-caseína y β-lactoglobulina)
generaban diferencias significativas en la producción de leche por ordeño y en
los contenido de proteina total, proteína del suero, caseína y número de
caseína. Además, se incorporó la evaluación de la interacción entre factores
estudiados.
El análisis se realizó incorporando una variable a la vez, es decir, se efectuó un
análisis de varianza multifactorial para proteína total, proteína del suero,
caseína, número de caseína y producción de leche por ordeño AM.
Luego, para verificar las diferencias significativas entre los promedios de
contenidos proteicos de la leche respecto de las variantes de κ-caseína y β-
41
lactoglobulina, se realizó una prueba de rango múltiple (Tukey) al 95% de
confianza.
42
4 PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 Identificación de variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina en
leche de vacas Frisón Negro
La identificación de variantes genéticas de κ-caseína y β-lactoglobulina se
realizó mediante electroforesis de isoenfoque, previa separación de ambas
proteínas en las distintas muestras de leche.
4.1.1 Separación de κ-caseína y β -lactoglobulina. El procedimiento de
McKENZIE y WAKE (1961), para la obtención de κ-caseína, se aplicó hasta la
etapa en la que se adiciona cloruro de calcio, a fin de separar las caseínas
sensibles al ion calcio. Con esto se separa el complejo micelar y se obtiene la
κ-caseína.
La concentración de κ-caseína obtenida en cada preparación se presenta en el
ANEXO 9.
Los resultados de cantidad de proteína obtenida en las preparaciones de βlactoglobulina, según la metodología de LOWE et al. (1995), se presentan en el
ANEXO 10.
Las diferencias encontradas en el contenido de κ-caseína y β-lactoglobulina en
los distintos muestreos, se pueden originar por las metodologías de separación
de ambas proteínas, considerando que κ-caseína corresponde sólo a un 13%
de las caseínas y β-lactoglobulina representa un 50% de las proteínas del
suero.
43
4.1.2 Electroforesis de κ-caseína y β -lactoglobulina. Para identificar las
variantes genéticas de las proteínas, se realizaron electroforesis separadas
para κ-caseína y β-lactoglobulina, en cada una de estas se incorporaron los
estándares de proteína respectivos, debido a las diferentes condiciones de la
electroforesis.
Los volúmenes de muestra utilizados en cada ensayo son presentados en el
ANEXO 11 y ANEXO 12, para κ-caseína y β-lactoglobulina, respectivamente.
Los resultados obtenidos para la electroforesis realizada con muestras de κcaseína son presentados en las FIGURA 1.
FIGURA 1. Electroforesis de isoenfoque para muestras de κcaseína en vacas Frisón Negro.
1. St. κ-CN 4052-2 (B), 2. St. κ-CN 3971-1 (A), 3. 546, 4. 560, 5. 579, 6. 591, 7. 596, 8. 633, 9.
636, 10. 639, 11. 642, 12. 644.
Como se puede observar en la FIGURA 1, para κ-caseína, se identificó la
presencia de la variante A y B, pero no se encontraron ambas variantes en una
misma muestra de leche. Además, no fue posible determinar si se trataba de un
fenotipo específico (AA o BB) debido a la baja resolución ofrecida por el método
44
de electroforesis para esta proteína en particular. Lo anterior, se debe
probablemente a que se trabajó con muestras parcialmente purificadas.
Una vez realizada la electroforesis y los procedimientos de tinción, se determinó
la distancia de migración de las proteínas en el gel, estas mediciones se
realizaron desde el polo positivo. Luego, para el caso de κ-caseína, se
compararon las lecturas con la medición de los estándares de κ-caseína A y B
obtenidos por CASANOVA (2001). En cuanto a β-lactoglobulina, las lecturas
registradas se cotejaron con las mediciones de los estándares comerciales de
las variantes A y B.
En la FIGURA 2, se puede apreciar las variantes genéticas identificadas para
las muestras de β-lactoglobulina.
FIGURA 2. Electroforesis de isoenfoque para muestras de β -lactoglobulina
en vacas Frisón Negro.
1. St. β-Lg Sigma B, 2. St. β-Lg Sigma A, 3. 546, 4. 560, 5. 579, 6. 591, 7. 596, 8. 633, 9. 636,
10. 639, 11. 642, 12. 644.
45
En la identificación de β-lactoglobulina, se encontraron las variantes genéticas A
y B, detectándose ambas variantes genéticas en algunas de las muestras de
leche. También se observa una tercera banda que probablemente corresponde
a a-lactoalbúmina.
El CUADRO 11, presenta en resumen las variantes de κ-caseína y βlactoglobulina identificadas para las muestras de leche estudiadas.
CUADRO 11
Variantes genéticas de
κ-caseína y β-lactoglobulina
determinadas en leche de vaca Frisón Negro.
Variante
Muestra
κ-caseína
β-lactoglobulina
546
B
AyB
560
A
A
579
A
AyB
591
B
AyB
596
B
AyB
633
B
AyB
636
B
AyB
639
B
A
642
B
A
644
B
AyB
Como se puede apreciar, en cada una de las muestras de κ-caseína se
identificó la variante A o B de esta proteína. En el caso de β-lactoglobulina, se
identificó en 7 de las muestras la presencia de las variantes A y B mientras que
en las 3 restantes se registró la variante A.
Las distancias de migración registradas para las muestras de β-lactoglobulina y
κ-caseína se presentan en el ANEXO 13 y ANEXO 14, respectivamente. Las
46
diferencias de migración registradas entre ensayos, se pueden originar por
pequeñas fluctuaciones de voltaje o de la fuerza iónica del medio.
4.1.3 Expresión de las variantes genéticas de κ-caseína y β -lactoglobulina.
Los ANEXOS 15 y 16, presentan las densitometrías realizadas a las muestras
correspondientes a β-lactoglobulina y κ-caseína, respectivamente.
En cuanto a la expresión de las variantes genéticas para β-lactoglobulina en las
muestras que se identificaron ambas variantes, se logró apreciar que la
proporción de la expresión de la variante A es mayor que la variante B cuando
ambas se encuentran presentes.
Con relación a κ-caseína, se detectaron las variantes genéticas A o B, no
detectándose la presencia de ambas en las muestras ensayadas. Además, en
todas las muestras el densitómetro solo registró un solo pico debido a la baja
resolución de las bandas, lo que no hizo posible determinar a cabalidad si se
trataba de fenotipos AA o BB.
4.2 Variantes genéticas de κ-caseína y β -lactoglobulina en vacas Frisón
negro
En el CUADRO 12, se resume la frecuencia de las variantes genéticas
identificadas en la leche de vacas Frisón Negro. Se observa que en las vacas
estudiadas la variante A de β-lactoglobulina está presente en un 65% y la
variante B en un 35%. Por otro lado, la variante B de κ-caseína está presente
en un 80% de la muestra en estudio, la variante A se presentó solo en un 20%.
En relación a lo anterior, los valores de frecuencia obtenidos para las variantes
genéticas son diferentes a los encontrados en estudios previos. Investigaciones
47
realizadas por FELMER y BUTENDIECK (1998), mencionan que las variantes A
y B de κ-caseína se presentan en el ganado Frisón Negro Chileno con una
frecuencia de 82,4% y 17,6%, respectivamente. Además, los mismos autores
señalan que la frecuencia para el ganado Frisón Negro Danés respecto a las
variantes de κ-caseína sería de 85% para la variante A y 15% para la variante
B.
CUADRO 12 Frecuencia de variantes genéticas obtenidas en las vacas
Frisón Negro del estudio.
Proteína
Variante
A
B
N° de vacas
κ-caseína
0,2
0,8
10
β-lactoglobulina
0,65
0,35
10
Referente a β-lactoglobulina, los valores obtenidos en el estudio difieren de los
resultados presentados por McLEAN et al. (1984), quienes en un estudio con
vacas Friesian determinaron que la variante B de esta proteína esta presente en
un 61,4%, mientras que la variante A lo hace en un 38,6%. Valores idénticos
son mencionados por NG KWAI HANG (1984), en estudios con vacas Holstein Friesian.
Por otro lado, WINKELMAN y WICKHAM (1997), en estudios con vacas de raza
Friesian y cruzas de la misma raza, señalan que la frecuencia de expresión de
la variante A de β-lactoglobulina es de 48,7%; y 51,3% para la variante B. Para
HILL (1993), en estudios con vacas Friesian, la presencia de la variante B de βlactoglobulina corresponde a un 55%, mientras que la variante A esta presente
en un 45%.
Las diferencias entre los valores obtenidos y los establecidos en estudios
anteriores pueden originarse fundamentalmente, por variaciones en el tamaño
48
de las muestras de ganado empleadas en los estudios, utilización de diferentes
razas, o bien, por diferencias en las técnicas de identificación (JAKOB, 1995;
NG KWAI HANG, 1997).
Es así como VAN EENENNAAM y MEDRANO (1991), en estudios con ganado
Holstein establecen que la frecuencia para las variantes A y B de κ-caseína es
de 82% y 18% respectivamente, pero utilizando 1152 vacas Holstein. A su vez,
investigaciones realizadas por NG KWAI HANG et al. (1984), señalan que la
frecuencia para estas misma variantes es de 74,4% para A y 25,6% para B,
utilizando en este caso 2045 vacas Holstein. Se puede apreciar, que las
diferencias en el tamaño de muestreo, genera estimaciones de frecuencias
distintas para las variantes genéticas estudiadas, y puede ser posible por
aleatoriedad que al tener una muestra pequeña se seleccionen vacas con la
presencia mayoritaria de una variante específica. Lo anterior, no excluye la
posibilidad de que la pureza de las razas estudiadas por estos autores sea
diferente, incidiendo también en la frecuencia de la expresión de una
determinada variante genética.
4.3 Composición proteica y producción de leche en vacas Frisón Negro
Los valores de producción y composición proteica de leche de vacas Frisón
Negro pueden ser apreciados en el ANEXO 17.
Los valores promedio correspondientes al porcentaje de proteína total, proteína
del suero, caseína, número de caseína y producción de leche de las vacas en
estudio durante el período pueden ser apreciados en el CUADRO 13.
El valor promedio calculado para el porcentaje de proteína total fue de 3,09 ±
0,18% de proteína. Referente a proteína del suero y caseína el valor promedio
49
para ambos componentes fue de 0,72 ± 0,05% de proteína y 2,36 ± 0,16% de
caseína. El N° de caseína promedio registrado fue de 76,44 ± 1,56.
La producción de leche promedio, para los cuatro muestreos, corresponde a
10,86 ± 2,24 kg de leche por ordeño.
CUADRO 13 Composición promedio de leche de vaca Frisón Negro.
Componentes
n
Promedio ± desv. estándar
Producción de
leche/ordeño mat.
80
10,86 ± 2,24 kg
% Proteína total
80
3,09 ± 0,18%
% Proteína del suero
80
0,72 ± 0,05%
% Caseína
80
2,36 ± 0,16%
N° Caseína
80
76,44 ± 1,56
n: número de muestras.
LAVIN (1996), estableció un contenido proteico para vacas Frisón Negro, de
primera lactancia, correspondiente a 2,96% de proteína. El valor estimado para
el presente estudio es superior al antes mencionado y se encuentra dentro de
los rangos señalados por WALSTRA et al. (1999). La diferencia, en cuanto al
valor de proteína estimado, se debería a que los estudios se han realizado en
distintas estaciones del año y con un número de vacas diferente.
El porcentaje de proteína total determinado es inferior al de otras razas, como
Holstein y Jersey. Es así como NG KWAI HANG et al. (1990), señala un 3,17%
de proteína para estudios con vacas Holstein. A su vez, McLEAN et al. (1984),
menciona un porcentaje de proteina total para vacas Jersey y Holstein de
3.93% y 3.09% de proteína, respectivamente.
Asimismo, CERBULIS y FARRELL (1975), encontraron valores de proteína total
para vacas Holstein, correspondiente a 3,07 ± 0,43% de proteína y 4,07 ±
0,49% de proteína para vacas Jersey.
50
Referente al porcentaje de proteína del suero, el valor estimado en la
investigación es mayor al encontrado por NG KWAI HANG et al. (1986), en
estudios con vacas Holstein. Estos autores determinaron un porcentaje de
0,699% de proteína del suero en 1908 vacas Holstein - Freisian.
En cuanto al porcentaje de caseína presentado en el CUADRO 13, este es
inferior al estimado en otras razas, McLEAN et al. (1984), trabajando con vacas
Holstein - Friesian estimaron 2,39 ± 0,12% de caseína en 238 vacas. Mientras
que para 263 vacas Jersey registraron 3,07 ± 0,15% de caseína.
Para CERBULIS y FARRELL (1975), el porcentaje promedio de caseína en
muestras individuales es de 2,89%, pudiendo existir variaciones entre 1,53% y
4,15% de caseína. Además, indican que los porcentajes promedio varían
dependiendo de la raza desde 2,53% para Holstein hasta 3,39% para Jersey.
Respecto al número de caseína promedio obtenido en el estudio, es posible
establecer que existen diferencias con otras razas de ganado lechero . Así, NG
KWAI HANG et al. (1986), en estudios con vacas Holstein informaron un
promedio 79,42.
A su vez, CERBULIS y FARRELL (1975), mencionan un número de caseína
promedio de 77,9 con variaciones entre 64,3 y 83,7. Indican también que para
leche de vacas de una misma raza, es posible encontrar números de caseína
dispares.
Los resultados encontrados en el estudio difieren de los reportados por los
autores antes mencionados. Las diferencias existentes en relación al contenido
proteico y producción de leche, pueden originarse debido a un tamaño de
muestra menor y a la utilización de una raza distinta de las empleadas en
investigaciones previas.
51
4.4 Variantes genéticas, producción y composición de la leche
El análisis de varianza, permitió determinar si el efecto de las variantes de κcaseína y β-lactoglobulina originaba diferencias significativas en la producción
de leche, porcentaje de proteína total, porcentaje de proteína del suero,
porcentaje de caseína y número de caseína (ANEXO 18).
Así, el análisis realizado permitió establecer que existen diferencias
significativas en la producción de leche por ordeño AM, respecto a las variantes
de β-lactoglobulina estudiadas, al 95 % de confianza. Además, existen
diferencias en el contenido de proteína del suero y proteína total para la leche
con las variantes A y A-B de β-lactoglobulina.
Lo anterior, concuerda con lo reportado por NG KWAI HANG et al. (1986),
quienes señalan que las variantes de κ-caseína y β-lactoglobulina tienen
efectos en la producción lechera de vacas Holstein.
Por el contrario, McLEAN et al. (1984), mencionan la no existencia de efectos
por parte de las variantes genéticas de las proteínas lácteas sobre la
producción de leche. Lo mismo sostienen NG KWAI HANG et al. (1990), que
en estudio con vacas Holstein de distintas lactancias , señalan que las variantes
de κ-caseína y β-lactoglobulina no tienen efecto sobre la producción de leche
de las vacas.
Las diferencias entre estudios se deben a la heterogeneidad existente en las
características de los rebaños estudiados (etapa lactancia, edad, número de
partos), así como también, del número de vacas utilizado en cada caso.
En cuanto a κ-caseína, el análisis de varianza establece que existen diferencias
significativas (p<0,05) en los porcentajes de proteína total, caseína y número de
caseína para las leche que presentan las variantes A y B de κ-caseína.
52
Al respecto, NG KWAI HANG et al. (1986), informan que las variantes de κcaseína tienen efecto significativo sobre los porcentajes de proteína total,
caseína y número de caseína. En estudios posteriores, NG KWAI HANG et al.
(1990), ratifican que los fenotipos de κ-caseína influencian la composición
proteica de la leche.
VAN EENENNAAM y MEDRANO (1991), en estudios con ganado lechero
californiano, mencionan que las variantes genéticas de κ-caseína tiene un
efecto significativo sobre el porcentaje de proteína total de la leche.
Similares resultados han obtenido DELACROIX – BUCHET et al. (1993) y
RAHALI y MÉNARD (1991), quienes señalan que el efecto de las variantes
genéticas de κ-caseína originan diferencias en la composición proteica de la
leche.
El análisis de varianza efectuado, también evaluó la interacción de los factores
estudiados, siendo estadísticamente significativa la interacción de las variantes
de κ-caseína y β-lactoglobulina, al 95% de confianza. (ANEXO 18)
Resultados diferentes establecen VAN EENENNAM y MEDRANO (1991),
quienes no encontraron interacción entre las variantes de β-lactoglobulina y κcaseína al realizar estudios en ganado lechero californiano.
Resultados similares a los anteriores fueron encontrados por ROZZI et al.
(1989), en estudios con ganado Holstein Friesian italiano, quienes no pudieron
establecer la existencia de interacciones significativas entre las variantes de κcaseína y β-lactoglobulina respecto a la producción de leche y el contenido de
proteína.
53
4.4.1 Variantes genéticas de κ-caseína, producción y composición proteica
de la leche. La prueba de comparación múltiple permitió establecer la
diferencia existente entre los promedios en el % proteína total, % proteína del
suero, % caseína y número de caseína para las distintas variantes encontradas
de κ-caseína y β-lactoglobulina.
En el CUADRO 14, es posible apreciar la incidencia de las variantes genéticas
de κ-caseína en los componentes en estudio.
CUADRO 14 Diferencias entre variantes genéticas de κ-caseína A y B, en
relación al contenido de proteínas. (Promedio ± Error
estándar)
κ-caseína A
κ-caseína B
Características
Promedio ± E.E
Promedio ± E.E
n = 16
n = 64
a
Producción de
*11,35±0,46
10,49±0,27ª
leche/ordeño AM (kg)
% proteína total
3,01±0,03a
3,10±0,02b
% proteína del suero
0,729±0,009a
0,715±0,005ª
a
% caseína
2,29±0,03
2,38±0,02b
N° caseína
75,87±0,33a
76,86±0,19b
*Promedios para un componente con letras distintas, denotan diferencias
significativas.
4.4.1.1 Contenido de proteína total y variantes genéticas de κ-caseína. El
CUADRO 14, presenta los promedios del % proteína total y el error estándar
para los fenotipos de κ-caseína encontrados en el estudio.
En términos cuantitativos, es posible establecer que las variantes B y A de κcaseína tienen un promedio de 3,10% y 3,01% proteína total, respectivamente.
Las prueba de comparación de promedios respecto al % proteína total para las
variantes de κ-caseína encontrados, permitió determinar que leches de vacas
con la variante B de κ-caseína presenta un % proteína total significativamente
54
mayor a la variante A. La variante B presentó un 0,09% más de proteína total
que la variante A (95% de confianza).
Lo anterior concuerda con lo expuesto por NG KWAI HANG et al. (1986) y NG
KWAI HANG et al. (1990), estos autores indican que el fenotipo BB de κcaseína presenta mayor % de proteína que los fenotipos AA y AB.
A su vez, RAHALI y MÉNARD (1991), mencionan que las leches de vacas que
contienen el fenotipo BB de κ-caseína presentan un contenido proteico mayor
(0,12% más) al del estimado para el fenotipo AA.
Por otro lado, JAKOB (1994), señala que leche de vacas con el fenotipo BB de
κ-caseína presentan % proteína mayores que los fenotipos AA y AB.
Si bien, no se pudo determinar un fenotipo específico como lo ha n hecho
estudios previos, se puede apreciar que la presencia de la variante B de κcaseína en la leche de vacas Frisón Negro presenta un contenido de proteína
mayor.
4.4.1.2 Contenido de proteínas del suero y variantes genéticas de κcaseína. Los valores promedios de proteínas del suero estimados para la
variante A y B de κ-caseína corresponden a 0,729% y 0,715%, respectivamente
(CUADRO 14).
La prueba de comparación permitió ratificar que no existen diferencias
significativas en el % de proteína del suero para leche de vacas con las
variantes A y B de κ-caseína (95% de confianza).
Lo mismo es mencionado por NG KWAI HANG et al. (1986), RAHALI y
MÉNARD (1991), quienes no encontraron diferencias significativas entre %
proteína del suero para leche de vacas con distintos fenotipos de κ-caseína.
55
Por el contrario, JAKOB (1994), señala que en gran parte de las razas lecheras
estudiadas, el contenido de proteína del suero de leches con κ-caseína AB y BB
es menor que el fenotipo AA.
4.4.1.3 Contenido de caseína y variantes genéticas de κ-caseína. El valor
promedio de % caseína para la variante A de κ-caseína corresponde a 2,29% y
para la variante B es 2,38% de caseína.
El análisis realizado establece que el % caseína de leches con la variante B de
κ-caseína es significativamente mayor (95% confianza), que aquellas que
contienen la variante A. La variante B de κ-caseína presentó 0,09% más
caseína que la variante A.
Asociaciones similares, aunque trabajando con fenotipos, han sido reportadas
por NG KWAI HANG et al. (1986), los que señalan que leches que presentaban
el fenotipo BB de κ-caseína presentaban 0,10% más de caseína, que aquellas
que presentaban el fenotipo AA. Para RAHALI y MÉNARD (1991), en base a
estudios con ganado lechero francés, mencionan que el fenotipo BB de κcaseína es significativamente mayor que los otros fenotipos. Estos autores
informan valores de 2,55%, 2,65% y 2,72% para los fenotipos AA, AB y BB,
respectivamente.
A su vez, Rampilli et al. citado por JAKOB (1994), determinó que leches
provenientes de vacas Holstein que presentan el fenotipo BB de κ-caseína,
tienen un % caseína significativamente mayor que los fenotipos AA y AB.
Al contrario, investigaciones realizadas por McLEAN et al. (1984), establecen
que no existen diferencias significativas entre los porcentajes de caseína de
leches que contengan, ya sea, el fenotipo AA, AB o BB.
56
El porcentaje de caseína significativamente mayor, registrado para κ-caseína B,
explica también el incremento en el porcentaje de proteína total presentado
previamente.
4.4.1.4 Número de caseína y variantes genéticas de κ-caseína. La variante A
de κ-caseína presentó un número de caseína de 75,87, para la variante B el
valor estimado es de 76,86 (CUADRO 14).
La prueba de comparación ratifica que existen diferencias significativas (95%
confianza), entre los números de caseína para leches que contienen las
variantes A y B de κ-caseína. Siendo el contenido para la variante B
significativamente mayor.
Este resultado concuerda con lo señalado por NG KWAI HANG et al. (1986) y
RAHALI y MÉNARD (1991), quienes señalan que el número de caseína para
leches de vacas que presentaban el fenotipo BB es significativamente mayor
que los fenotipos AA y AB. Resultados similares han sido presentados también
por DELACROIX -BUCHET et al. (1993).
Sin embargo, SCHAAR et al. (1985), en estudios realizados con vacas Friesian,
mencionan que no se encontraron diferencias significativas respecto al número
de caseína en leches que contenían fenotipos AA y BB de κ-caseína.
El resultado obtenido permite inferir que la presencia de la variante B de κcaseína, efectivamente incrementa el contenido de caseína, hecho que se ve
reflejado en un número de caseína también mayor para esta variante.
57
4.4.1.5 Variantes genéticas de κ-caseína y producción de leche. El
promedio estimado para la variante B de κ-caseína es 10,49 kg/ordeño AM y
para la variante A asciende a 11,35 kg/ordeño AM (CUADRO 14).
Se determinó que no existen diferencias significativas en la producción
promedio de leche por ordeño respecto a las variantes encontradas en el
estudio (95% de confianza).
Resultados similares han sido reportados por McLEAN et al. (1984) y NG KWAI
HANG et al. (1990), quienes no detectaron diferencias significativas entre las
producciones de leche para los distintos fenotipos de κ-caseína presentes en
las leches.
Un resultado distinto es el que obtuvo NG KWAI HANG et al. (1986), quienes,
trabajando con datos recolectados diariamente, señalan que leches de vacas
que presentan el fenotipo AB de κ-caseína presenta una producción de leche
mayor que las leche de vacas que presentan el fenotipo AA o BB.
4.4.2 Variantes genéticas de ß-lactoglobulina, producción y composición
proteica de la leche. Las pruebas de comparación permitieron verificar la
existencia de diferencias significativas en la producción de leche, % proteína
total, % proteína del suero, % caseína y número de caseína para las fenotipos
AA y AB encontrados en las leches de las vacas en estudio.
En el CUADRO 15, se puede apreciar los promedios del contenido de proteína
total, proteína del suero, caseína, número de caseína y producción de leche
AM, respecto a los fenotipos de ß-lactoglobulina identificados en leche de vacas
Frisón Negro.
58
CUADRO 15 Diferencias entre fenotipos de ß-lactoglobulina AA y AB, en
relación al contenido de proteínas. (Promedio ± Error
estándar)
Característica
ß-lactoglobulina AA
? -lactoglobulina AB
Promedio ± E.E
Promedio ± E.E
n = 24
n = 56
a
Producción de
9,64±0,40
12,20±0,35b
leche/ordeño AM (kg)
% proteína total
3,10±0,03b
3,01±0,03ª
b
% proteína del suero
0,739±0,008
0,705±0,007ª
a
% caseína
2,36±0,03
2,31±0,02ª
a
N° caseína
76,14±0,28
76,59±0,25ª
*Promedios para un componente con letras distintas denotan diferencias
significativas.
4.4.2.1
Contenido de proteína total y variantes genéticas de ß-
lactoglobulina. Los valores estimados para los fenotipos AA y AB fueron
3,10% y 3,01% de proteína , respectivamente. (CUADRO 15)
La prueba de comparación establece que existen diferencias significativas en
los porcentajes de proteína total en las leches que contienen los fenotipos AA y
AB de ß-lactoglobulina con un 95% de confianza.
Esto no concuerda con lo señalado por VAN EENENNAAM y MEDRANO
(1991), quienes no establecieron diferencias significativas en el porcentaje de
proteína de vacas Holstein, en el estado de California.
También, McLEAN et al. (1984), en estudios con ganado lechero Friesian y
Jersey, establece que no existen diferencias significativas respecto del
porcentaje de proteína total para leche de vacas con los fenotipos AA, AB y BB
de ß-lactoglobulina.
Diferencias entre los resultados obtenidos y los planteados por los autores
antes mencionados se deberán principalmente a las distintas razas utilizadas en
los diversos estudios.
59
4.4.2.2 Contenido de proteínas del suero y variantes genéticas de ßlactoglobulina. El porcentaje de proteína del suero obtenido para el fenotipo
AA, corresponde a 0,739% de proteína. Para el fenotipo AB, el valor promedio
es menor y corresponde a 0,705% de proteína (CUADRO 15).
El análisis estadístico indicó que existen diferencias significativas (95% de
confianza) entre los fenotipos de ß-lactoglobulina encontrados en el estudio.
Estos resultados concuerdan con lo señalado por otros autores como, NG KWAI
HANG et al. (1986), quienes informan que un porcentaje de proteína del suero
mayor se verificó en la leche que presentaba el fenotipo AA de ß-lactoglobulina.
Asimismo, Mariani citado por JAKOB (1994), en investigaciones con ganado
Holstein - Friesian determinó que el fenotipo AA de ß-lactoglobulina presentaba
un % proteína del suero significativamente mayor que los fenotipos AB y BB.
4.4.2.3 Contenido de caseína y variantes genéticas de ß-lactoglobulina. El
porcentaje promedio de caseína para leches de vacas que presentaban el
fenotipo AA corresponde a 2,36%; para el fenotipo AB se determinó un valor de
2,31% de caseína (CUADRO 15).
No se establecieron diferencias significativas entre porcentajes de caseína para
los fenotipos AA y AB de ß-lactoglobulina.
Lo anterior concuerda con lo señalado por CERBULIS y FARREL (1975),
quienes no encontraron diferencias significativas en el porcentaje de caseína en
leches que presentaban los fenotipos AA, AB ó BB de ß-lactoglobulina
A su vez, Aaltonen y Antila citados por JAKOB (1994), al estudiar diversos
ganados lecheros mencionan que no existen diferencias significativas en los
60
porcentajes de caseína respecto a los fenotipos de ß-lactoglobulina presentes
en la leche.
Sin embargo, McLEAN et al. (1984) y SCHAAR et al. (1985), señalan que el
fenotipo
BB
de
ß-lactoglobulina
tiene
un
porcentaje
de
caseína
significativamente mayor que los fenotipos AA y AB.
4.4.2.4 Número de caseína y variantes genéticas de ß-lactoglobulina. Los
valores obtenidos para los fenotipos AA y AB fueron 76,14 y 76,59,
respectivamente (CUADRO 15).
La comparación estadística estableció que no existen diferencias significativas
(95% de confianza), entre los números de caseína para leches con fenotipos AA
y AB.
Lo anterior no concuerda con lo reportado por RAHALI y MÉNARD (1991),
quienes indican que leches de vacas que presentan el fenotipo AA de ßlactoglobulina, tienen un número de caseína significativamente menor que
aquellas que presentan los fenotipos AB y BB.
A su vez, NG KWAI HANG et al. (1986), obtuvieron números de caseína para el
fenotipo BB y AB correspondientes a 80,86 y 79,46, respectivamente. Para el
fenotipo AA obtuvieron un valor significativamente menor correspondiente a
77,95.
4.4.2.5 Variantes genéticas de ß-lactoglobulina y producción de leche. La
producción promedio para el fenotipo AA de ß-lactoglobulina es de 9,64
kg/ordeño matinal mientras que para el fenotipo AB es de 12,20 kg/ordeño
matinal (CUADRO 15).
61
La prueba de comparación estadística, señala que hay diferencias significativas
en los valores de producción de leche por ordeño matinal, para los fenotipos AA
y AB de ß-lactoglobulina. Las vacas con el fenotipo AB presentaron una
producción de leche matinal promedio superior a las vacas que tenían el
fenotipo AA en 2,56 kg/ordeño matinal.
Investigaciones previas realizadas por NG KWAI HANG et al. (1986), señalan
que la producción de leche de vacas Holstein-Friesian es afectada por las
variantes de ß-lactoglobulina, pero encontraron que el fenotipo AA presentaba
una mayor producción de leche respecto de los fenotipos AB y BB.
Por el contrario, Janicki citado por NG KWAI HANG (1997), alude que la
variante B de ß-lactoglobulina está asociada a una mayor producción de leche,
esto en investigaciones realizadas con ganado Holstein-Friesian polaco.
Respecto a la investigación reali zada, con la identificación de dos fenotipos es
posible observar que la variante B de ß-lactoglobulina está asociada a una
mayor producción, lo que se ratifica al considerar las pruebas estadísticas
realizadas. Las disimilitudes entre esta investigación y anteriores, se deben a
diferencias respecto de la raza utilizada en el estudio, estación del año y el
tamaño muestreal utilizado, entre otros.
4.4.3 Interacción de variantes genéticas de κ-caseína y ß-lactoglobulina.
Mediante la incorporación de la interacción de los factores en el análisis de
varianza multifactorial, fue posible establecer que el contenido proteico es más
favorecido por la presencia de ciertas variantes de κ-caseína y ß-lactoglobulina
combinadas.
En el CUADRO 16, se observan los valores promedio de contenido proteico
para cada combinación de variantes, además se aprecia la existencia de
62
diferencias significativas entre ciertas combinaciones de variantes, al 95% de
confianza (ANEXO 19).
En relación al contenido de proteína total, es posible apreciar que la leche con
presencia de la variantes A y AB de κ-caseína y ß-lactoglobulina, presentó un
contenido promedio de 2,89% que es significativamente menor a las restantes
interacciones de variantes genéticas estudiadas.
CUADRO 16 Valores de producción de leche y contenido proteico para
combinaciones de variantes de κ-caseína y ß-lactoglobulina.
(Promedio ± Error estándar)
κ-caseína A
κ-caseína B
ß-Lg AA
ß-Lg AB
ß-Lg AA
ß-Lg AB
n= 8
n=8
n = 16
n = 48
Producción de
leche/ordeño AM (kg)
9,28±0,65a
13,42±0,65 b
9,99±0,46ª
10,99±0,27ª
% proteína total
3,14±0,05b
2,89±0,05ª
3,06±0,03b
3,13±0,02b
% proteína del suero
0,789±0,013c
0,669±0,013ª
0,690±0,009 a
0,741±0,005 b
% caseína
2,35±0,04a b
2,22±0,04ª
2,37±0,03b
2,39±0,02b
N° caseína
74,88±0,46 a
76,87±0,46 bc
77,41±0,33c
76,31±0,19 b
Característica
*Promedios para un componente con letras distintas denotan diferencias
significativas.
En cuanto al contenido de proteína del suero, la combinación de variantes de κcaseína y ß-lactoglobulina, A/AA respectivamente, presentó un promedio
significativamente
mayor
(0,789%)
a
lo
estimado
para
las
restantes
combinaciones en estudio. La combinación de variantes A/AB y B/AA
presentaron los valores más bajos de proteína del suero, mostrando la
combinación de variantes B/AB un contenido de proteína intermedio.
63
Referente al contenido de caseína, los mayores valores promedios se
registraron para las combinaciones que contenían la variante B de κ-caseína,
registrándose valores promedios de 2,39% y 2,37%, para las combinaciones de
variantes B/AB y B/AA de κ-caseína y ß-lactoglobulina, respectivamente. Las
otras
combinaciones
estudiadas
presentaron
contenidos
de
caseína
significativamente menores.
Para el número de caseína, el mayor valor promedio (77,41) fue logrado por la
leche que contenía la combinación de variantes B/AA de κ-caseína y ßlactoglobulina, respectivamente. Por el contrario, un valor significativamente
menor fue registrado para la combinación de variantes A/AA.
Pocos autores han encontrado interacción de las variantes genéticas de κcaseína y ß-lactoglobulina sobre algunos de los componentes antes analizados.
Sin embargo, HILL et al. (1997), en estudios con ganado Lechero Neozelandés,
señalan que la leche de vacas que presentan la combinación de variantes
AA/AA de κ-caseína y ß-lactoglobulina tienen un contenido significativamente
mayor de proteínas del suero, en comparación con otras combinaciones de
variantes de las mismas proteínas. Además, mencionan que la leche de vacas
que presentan la combinación BB/BB de κ-caseína y ß-lactoglobulina contiene
significativamente
un
número
de
caseína
mayor
que
las
restantes
combinaciones de variantes.
Por otro lado, Mayer et al. citados por JAKOB y PUHAN (1995), al estudiar la
presencia de las variantes de ß-caseína, κ-caseína y ß-lactoglobulina (ß Cn/ κ
Cn/ ß Lg) en leche de ganado austríaco, mencionan la existencia de una
interacción altamente significativa entre las variantes de estas tres proteínas
para los contenidos de proteína total, caseína y proteína del suero. Es así como
la combinación de variantes A2A2/BB/BB presentó un número de caseína mayor
que la combinación A2B/AA/AA. Estos autores atribuyen la interacción a la
64
existencia de un efecto epistático entre los locus de los genes de las proteínas
antes señaladas.
Las diferencias entre los resultados obtenidos en el presente estudio y lo
señalado por los autores antes mencionados, se deben esencialmente a la raza
estudiada en cada investigación, el número de vacas en estudio, así como
también, al diseño experimental y al modelo empleado en el análisis estadístico
de los datos.
65
5. CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos se puede concluir que:
§
Se identificaron, las variantes genéticas A y B de κ-caseína y ßlactoglobulina en la leche de vacas Frisón Negro.
§
El contenido promedio de proteína total, caseína y proteína del suero en la
leche de vacas Frisón Negro, fue de 3,09, 2,36 y 0,72, respectivamente.
§
La leche de vacas con la variante B de κ-caseína presentó un contenido
significativamente mayor de proteína total, caseína y número de caseína,
respecto de la variante A.
§
La leche de vacas con la variante A de ß-lactoglobulina presentó un
contenido mayor de proteína total y proteína del suero, respecto de la leche
de vacas que contenían las variantes A y B, conjuntamente.
§
El contenido de proteína total se ve afectado por la interacción de κ-caseína
y ß-lactoglobulina, estableciéndose que el contenido es menor en presencia
de las variantes A y AB de κ-caseína y ß-lactoglobulina, respectivamente.
Respecto al contenido de caseína, este no es afectado por las variantes de
ß-lactoglobulina, pero es mayor cuando está presente la variante B de κcaseína en combinación con A o AB de ß-lactoglobulina. Para el número de
caseína se verifica que la presencia de las variantes B y A de κ-caseína y ßlactoglobulina presentan un número de caseína significativamente mayor.
66
6. RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de la expresión de
las variantes genéticas de κ caseína y β lactoglobulina sobre el contenido
proteico de la leche de 10 vacas Frisón Negro.
Las muestras de leche se obtuvieron de vacas raza Frisón Negro, desde el
predio Santa Rosa de la Universidad Austral de Chile durante el período
Septiembre – Diciembre de 2001.
A las muestras de leche se les determinó el contenido proteico total, proteína
del suero y caseína. A su vez, se realizó la separación de κ-caseína y βlactoglobulina de las muestras de leche según los métodos establecidos por
McKENZIE y WAKE (1961) y LOWE et al. (1995), respectivamente.
Una vez realizada la separación, se determinó la presencia de las variantes de
κ-caseína y β-lactoglobulina, según el método de electroforesis de
isoelectroenfoque utilizado por CASANOVA (2001).
Se obtuvo, para la leche de vaca Frisón Negro, un contenido promedio de
proteína total, proteína del suero, caseína y número de caseína de 3,09%,
0,72%, 2,36% y 76,44, respectivamente.
En la electroforesis, se estableció que las muestras de leche presentaban las
variantes A y B de κ-caseína y β-lactoglobulina. Identificándose en algunas
muestras de leche la presencia conjunta de las variantes A y B de βlactoglobulina, existiendo en este caso una mayor proporción de expresión para
la variante A.
Se concluyó que el contenido de proteína total, caseína y número de caseína
son afectados significativamente por la variante B de κ-caseína; respecto al
contenido de proteínas del suero, se estableció que es afectado por las
variantes de β-lactoglobulina. Además, se estableció que existe una interacción
significativa entre las variantes de κ-caseína y β-lactoglobulina influenciando el
contenido proteico de las leches que presentan una determinada variante
genética.
67
SUMMARY
The present wo rk had as objective to determine the effect of the expression of
the genetic variants of κ-casein and β-lactoglobulin on the milk protein
composition in milk from 10 Frisón Negro cows.
The samples of milk were obtained of Frisón Negro cows, from the “Santa Rosa”
farm of the “Universidad Austral de Chile” during the period September December of 2001.
To the samples of milk they were determined total protein, whey protein and
casein. In turn, was carried out the κ-casein and β-lactoglobulin separation of
the samples of milk according to the methods settled down by McKENZIE and
WAKE (1961) and LOWE et al. (1995), respectively.
Once carried out the separation, was determined the presence of the genetics
variants of κ-casein and β-lactoglobulin, according to the method of isoelectric
focusing used by CASANOVA (2001).
It was obtained, for the cow milk Frisón Negro, a content average of total
protein, whey proteins, casein and number of casein of 3,09%, 0,72%, 2,36%
and 76,44, respectively.
In the electrophoresis, settled down that the samples of milk presented the A
and B variants of κ-casein and β-lactoglobulina. Being identified in some
samples the combined presence of the A and B variants of β-lactoglobulina,
existing in this case a bigger expression proportion for the A variant.
The content of total protein, casein and casein number are affected significantly
by the B variant of κ-casein; regarding the content of whey proteins settled down
that it is affected by the β-lactoglobulin variants. Also, settled down that a
significant interaction exists between the κ-casein and β-lactoglobulin variants
influencing the protein composition of the milk that present a certain genetic
variant.
68
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76
ANEXOS
77
ANEXO 1
Encuesta de vacas Frisón Negro Predio Sta. Rosa.
Número predial: ___________________
Nombre de la vaca:________________
Fecha de parto:_____________
Edad de parto:______________
Número de partos:___________
Producción de leche:_________
Producción de grasa:_________
Meses de lactancia:__________
Alimentación:__________________________________________________
_____________________________________________________________
Observaciones:________________________________________________
_____________________________________________________________
78
ANEXO 2
Información vacas Frisón Negro predio Sta. Rosa.
Fechas de
N° de
Meses de
parto
lactancias lactancia
Vaca
Edad
% HF
546
3 años
46,75
19/03/01
1
6
560
3 años
27,75
31/03/01
1
6
579
3 años
25,0
23/03/01
1
6
591
3 años
43,5
20/03/01
1
6
596
3 años
34,38
10/04/01
1
5
633
3 años
56,25
23/03/01
1
6
636
3 años
12,5
01/03/01
1
6
639
3 años
7,5
17/03/01
1
6
642
3 años
0
28/03/01
1
6
644
3 años
100
29/03/01
1
6
Alimentación
§
§
Pradera.
Suplemento:
Concentrado
y sales
minerales.
79
ANEXO 3
Metodología de separación de proteína no caseínica según McGann et al.
citado por PINTO et al. (1998)
Separación de la proteína no caseínica (PNC):
-
Transferir 100 ml de leche en un matraz cónico limpio y seco.
-
Llevar a 40 °C y agregar 3 ml de ácido acético 33.3 % p/v y colocar a baño
María.
-
Después de 10 minutos agregar 3 ml de acetato de sodio 3.33 N, mezclar y
esperar 3 minutos.
-
Filtrar a través de filtro plegado (Whatmann n° 40) y recibir el filtrado en
matraz cónico seco.
80
ANEXO 4
Separación de κ - caseína de las muestras de leche para análisis
electroforético.
Preparación de κ caseína para electroforesis de isoelectroenfoque en
relación a lo descrito por McKENZIE Y WAKE (1961), modificado:
-
Precipitar la caseína de 950 mL de leche descremada por adición de HCl 0,1
N hasta obtener un pH de 4,5.
-
Centrifugar a 4000 r.p.m. por 15 min.
-
El precipitado se filtra a través de filtro Whatman N° 2 u otra forma
equivalente.
-
La caseína obtenida se lava 4 veces con agua destilada.
-
La caseína lavada se purifica con una re-precipitación isoeléctrica,
disolviéndola con NaOH diluido. (0,05 M)
-
Agregar HCl hasta obtener un pH de 4,7.
-
Se centrifuga a 4000 r.p.m. por 15 min.
-
Se disuelve 20 g de caseína ácida con NaOH 1N hasta pH 7,0 – 7,5 y se
completa con agua destilada hasta obtener un volumen aproximado de 300
mL.
-
Se enfría a 2 °C y se agrega 30 mL de CaCl2 4M ajustado a pH 6,5 – 7,0 con
NaOH 1N.
-
Se agita continuamente durante 1h. Las caseínas sensibles al calcio
precipitarán por calentamiento a 35 °C.
-
El precipitado se remueve a temperatura ambiente por centrifugación a 5500
r.p.m. por 60 min. Obteniéndose en el sobrenadante la κ - caseína.
81
ANEXO 5
Separación de β lactoglobulina de las muestras de leche para análisis
electroforético.
Preparación de β lactoglobulina para electroforesis de isoelectroenfoque según
LOWE et al. (1995):
-
Preparar el suero ajustando las muestras de leche a pH 4,6 con HCl 1M.
-
Luego, centrifugar a 13.000 r.p.m. por un tiempo de 5 min.
-
El sobrenadante es diluido 10 veces en buffer muestra.
82
ANEXO 6
Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951)
Principio.
La determinación se basa en el desarrollo de color debido a la reacción
de los enlaces peptídicos de las proteínas y cobre alcalino del reactivo y la
reducción del fosfomolibdato – fosfotungsteno del reactivo Folin – Ciocalteau,
por los aminoácidos aromáticos.
Equipos y materiales.
-
espectofotómetro
-
pipetas 0.5 y 1.0 ml
-
Jeringa Hamilton 100 µl
-
Solución A: Na 2 CO3 2% P/V disuelto en NaOH 0.1 N
-
Solución B: CuSO4 x 5 H2O al 1% P/V y Tartrato de Na y K al 2% P/V.
-
Solución C: mezclar solución A y B en proporción 50:1
-
Solución E: reactivo Folin – Ciocalteau 1N.
A una cantidad de κ caseína, se le adiciona solución A y B las cuales
reaccionan con los enlaces peptídicos. Al agregar reactivo Folin – Ciocalteau se
desarrolla color azul al reaccionar con los aminoácidos aromáticos. La
intensidad del color se mide en un espectofotómetro a 750 nm.
Determinación.
-
Se mide 0,6 ml de κ caseína diluida en agua (1 ml en 3 ml)
83
Continuación ANEXO 6.
-
Se agrega 3ml de solución C y 0.3 ml de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.
-
Se deja 30 min. a temperatura ambiente.
-
Se mide la absorbancia a 750 nm.
Blanco: 0,6 ml de agua.
Se expresan los resultados en % de proteína en la muestra original.
Referencia CASANOVA (2001).
84
ANEXO 7
Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método
propuesto por LOWRY et al. (1951).
Curva estándar.
-
Solución patrón: seroalbúmina de bovino (BSA) 2 mg/ml.
-
Medir de la solución de BSA 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µl (20, 40, 60, 80, 100 y
120 µg de proteína) en tubos de ensayo, agregar agua hasta completar 0.6
ml.
-
Se agrega a cada tubo 3 ml de solución C y se deja a temperatura ambiente
10 min.
-
Se agrega 0.3 ml de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.
-
Se deja 30 min. a temperatura ambiente.
-
Se mide la absorbancia a 750 nm.
-
Se grafica µg de proteína v/s D.O 750 nm.
D.O. 750 nm.
µL solución BSA (2 mg/mL)
µg de proteína
10
1° y 2°
muestreo
3° y 4°
muestreo
20
0,077
0,103
20
40
0,182
0,157
30
60
0,270
0,275
40
80
0,334
0,340
50
100
0,417
0,419
60
120
0,474
0,485
85
Continuación ANEXO 7.
Para efectuar las determinaciones correspondientes a los cuatro muestreo se
construyeron dos curvas de calibración. Una se utilizó para el muestreo 1 y 2, y
la restante para el muestreo 3 y 4.
Muestreo 1 y 2:
0.6
0.5
D.O.
0.4
0.3
0.2
y = 0.0039x + 0.0169
R2 = 0.9911
0.1
0.0
0
20
40
60
80
100
120
140
ug proteína/0.6 mL
Muestreo 3 y 4:
0.6
0.5
D.O.
0.4
0.3
0.2
y = 0.0039x + 0.0204
R2 = 0.9919
0.1
0.0
0
20
40
Referencia CASANOVA (2001)
60
80
100
ug proteína/0.6 mL
120
140
86
ANEXO 8
Protocolo de electroforesis de isoenfoque en geles de poliacrilamida,
según CASANOVA (2001).
Preparación de la muestra
La proteína separada se disuelve en urea 7 M que contenga 0,1% de 2mercaptoetanol, obteniendo en la aplicación para la corrida de 10 µg de
proteína,
Preparación del gel
5 mL Acrilamida (40% acrilamida, 0,6 % bisacrilamida)
1 mL TEMED (1,75 % en agua)
2,5 mL Persulfato (0,37 % en agua)
0,5 mL Anfolito
11 mL agua,
Buffer electrodos
•
Anodo: H2SO4 (0,2%)
•
Cátodo: NaOH (0,02 N)
Ambas soluciones deben estar a temperatura de refrigeración al momento de
utilizar,
Corrida de geles
•
Precorrida,
200 volts por 15 min,
300 volts por 30 min,
400 volts por 60 min,
Luego de la pre-corrida, se aplicaron las muestras en cada tubo.
87
•
Corrida,
400 volts por 13 h, en refrigeración
Tinción de geles
•
Los geles fueron fijados por 30 min, en solución fijadora, empleando ácido
tricloroacético 15%,
•
Luego, se sumergieron en solución de desteñido por 30 min, La solución es
preparada de la siguiente forma:
500 mL etanol,
160 mL ácido acético,
completando hasta 2 litros con agua destilada,
•
Acto seguido, los geles se tiñen por 30 min, en solución de tinción a 60 °C,
La solución de tinción es preparada utilizando 0,23 g de Coomassie Brilliant
Blue G-250 la que se disuelve en 200 mL de solución de desteñido,
•
Finalmente, los geles se colocan en solución de desteñido.
88
ANEXO 9
Concentración de κ- caseína en muestras semi-purificadas.
Muestra
Muestreo
D.O
µg/0,6 mL
µg/mL
Dilución
Proteína
636
1
0,083
16,95
28,25
100
2824,79
2
0,089
18,49
30,81
100
3081,20
3
0,061
10,41
17,35
100
1735,04
4
0,114
24,0
40,0
100
4000,00
1
0,070
13,62
22,69
100
2269,23
2
0,084
17,20
28,68
100
2867,52
3
0,124
26,26
43,77
100
4377,73
4
0,055
8,87
14,78
100
1478,63
1
0,068
13,10
21,83
100
2183,76
2
0,075
14,89
24,83
100
2482,91
3
0,095
18,91
31,52
100
3152,31
4
0,088
17,33
28,89
100
2888,89
1
0,059
10,79
17,99
100
1799,14
2
0,067
12,85
21,41
100
2141,02
3
0,083
15,87
26,45
100
2645,23
4
0,075
14,00
23,33
100
2333,33
1
0,069
13,74
22,90
100
2289,75
2
0,084
17,52
29,20
100
2919,55
3
0,099
20,34
33,89
100
3389,24
4
0,088
17,57
29,28
100
2928,21
1
0,072
14,13
23,55
100
2354,70
2
0,082
16,69
27,82
100
2782,05
3
0,106
21,70
36,17
100
3617,12
4
0,089
17,59
29,31
100
2931,62
644
546
591
633
642
89
Continuación ANEXO 9
Muestra
Muestreo
D.O
µg/0,6 mL
µg/mL
Dilución
Proteína
639
1
0,051
8,74
14,57
100
1457,26
2
0,074
14,64
24,40
100
2440,17
3
0,086
16,63
27,72
100
2772,00
4
0,101
20,66
34,40
100
3444,44
1
0,059
10,79
17,99
100
1799,14
2
0,064
12,07
20,12
100
2012,82
3
0,099
19,92
33,21
100
3321,33
4
0,095
19,12
31,88
100
3188,03
1
0,053
9,25
15,42
100
1542,73
2
0,057
10,28
17,13
100
1713,67
3
0,089
17,39
28,98
100
2898,77
4
0,090
17,84
29,74
100
2974,35
1
0,049
8,23
13,71
100
1371,79
2
0,059
10,79
17,99
100
1799,14
3
0,075
13,84
23,07
100
2307,18
4
0,097
19,64
32,73
100
3273,50
1
A.L
-
-
-
A.L
2
0,095
20,03
33,37
100
3337,61
3
0,083
15,87
26,45
100
2645,23
4
0,066
11,69
19,49
100
1948,72
1
0,078
15,67
26,11
100
2611,11
2
A.L
-
-
100
A.L
3
0,101
20,44
34,06
100
3405,85
4
0,076
14,26
23,76
100
2376,06
579
560
596
LM 1
LM 2
A.L: Accidente de laboratorio.
90
ANEXO 10
Concentración de β - lactoglobulina en muestras preparadas para
electroforesis.
Muestra
Muestreo
D.O.
µg/0,6 mL
µg/mL
Dilución
Proteína
636
1
0,076
15,15
25,25
100
2525,64
2
0,097
20,53
34,23
100
3423,07
3
0,078
14,76
24,61
100
2461,53
4
0,097
19,64
32,73
100
3273,50
1
0,075
14,89
24,82
100
2482,90
2
0,104
22,33
37,22
100
3722,22
3
0,098
19,89
33,16
100
3316,23
4
0,092
18,35
30,59
100
3059,82
1
0,060
11,05
18,41
100
1841,88
2
0,063
11,82
19,70
100
1970,08
3
0,076
14,25
23,76
100
2376,06
4
0,113
23,74
39,57
100
3957,26
1
0,079
15,92
26,53
100
2653,84
2
0,104
22,33
37,22
100
3722,22
3
0,098
19,89
33,16
100
3316,23
4
0,089
17,59
29,31
100
2931,62
1
0,087
17,97
29,95
100
2995,72
2
0,106
22,84
38,07
100
3807,69
3
0,077
14,51
24,18
100
2418,80
4
0,092
18,37
30,59
100
3059,82
1
0,067
12,84
21,41
100
2141,02
2
0,103
22,07
36,79
100
3679,48
3
0,065
11,43
19,05
100
1905,98
4
0,078
14,76
24,61
100
2461,53
644
546
591
633
642
91
Continuación ANEXO 10
Muestra
Muestreo
D.O.
µg/0,6 mL
µg/mL
Dilución
Proteína
639
1
0,083
16,94
28,24
100
2824,78
2
0,103
22,07
36,79
100
3679,48
3
0,096
19,38
32,30
100
3230,76
4
0,109
22,71
37,86
100
3786,32
1
0,065
12,33
20,55
100
2055,55
2
0,099
21,05
35,08
100
3508,54
3
0,076
14,25
23,76
100
2376,06
4
0,092
18,35
30,59
100
3059,82
1
0,081
16,43
27,39
100
2739,31
2
0,092
19,25
32,09
100
3209,40
3
0,084
16,30
27,17
100
2717,94
4
0,093
18,61
31,02
100
3102,56
1
0,063
11,82
19,70
100
1970,08
2
0,119
26,17
43,63
100
4363,24
3
0,083
16,05
26,75
100
2675,21
4
0,092
18,35
30,59
100
3059,82
1
0,089
18,48
30,81
100
3081,19
2
0,114
24,89
41,49
100
4149,57
3
0,095
19,12
31,88
100
3188,03
4
0,099
20,15
33,59
100
3358,97
1
0,081
16,43
27,39
100
2739,32
2
0,102
21,82
36,37
100
3636,75
3
0,104
21,44
35,73
100
3572,65
4
0,097
19,64
32,73
100
3273,50
579
560
596
LM 1
LM 2
92
ANEXO 11
Volumen de muestras preparadas de κ- caseína utilizadas en cada
electroforesis.
Muestra
Muestreo
Proteína total
µg/mL
V. electroforesis (µL)
636
1
2824,79
564,958
18
2
3081,20
616,240
16
3
1735,04
347,008
29
4
4000,00
800,00
13
1
2269,23
453,846
22
2
2867,52
573,504
17
3
4377,73
875,546
11
4
1478,63
295,726
34
1
2183,76
436,752
23
2
2482,91
496,582
20
3
3152,31
630,462
16
4
2888,89
577,778
17
1
1799,14
359,828
28
2
2141,02
428,204
23
3
2645,23
529,046
19
4
2333,33
466,666
21
1
2289,75
457,950
22
2
2919,55
583,910
17
3
3389,24
677,848
15
4
2928,21
585,642
17
1
2354,70
470,940
21
2
2782,05
556,410
18
3
3617,12
723,424
14
4
2931,62
586,324
17
644
546
591
633
642
93
Continuación ANEXO 11.
Muestra
Muestreo
Proteína total
µg/mL
V. electroforesis (µL)
639
1
1457,26
291,452
34
2
2440,17
488,034
20
3
2772,00
554,400
18
4
3444,44
688,888
14
1
1799,14
359,828
28
2
2012,82
402,564
25
3
3321,33
664,266
15
4
3188,03
637,606
16
1
1542,73
308,546
32
2
1713,67
342,734
29
3
2898,77
579,754
17
4
2974,35
594,870
17
1
1371,79
274,358
36
2
1799,14
359,828
28
3
2307,18
461,436
22
4
3273,50
654,700
15
1
A.L
-
-
2
3337,61
667,522
15
3
2645,23
529,046
19
4
1948,72
389,744
26
1
2611,11
522,222
19
2
A.L
-
-
3
3405,85
681,170
15
4
2376,06
475,212
21
579
560
596
LM 1
LM 2
94
ANEXO 12
Volumen de muestras preparadas de β - lactoglobulina utilizadas en cada
electroforesis.
Muestra
Muestreo
Proteína total
µg/mL
V. electroforesis (µL)
636
1
2525,64
252,564
40
2
3423,07
342,307
29
3
2461,53
246,153
41
4
3273,50
327,350
31
1
2482,90
248,290
40
2
3722,22
372,222
27
3
3316,23
331,623
30
4
3059,82
305,982
33
1
1841,88
184,188
54
2
1970,08
197,008
51
3
2376,06
237,606
42
4
3957,26
395,726
25
1
2653,84
265,384
38
2
3722,22
372,222
27
3
3316,23
331,623
30
4
2931,62
293,162
34
1
2995,72
299,572
33
2
3807,69
380,769
26
3
2418,80
241,880
41
4
3059,82
305,982
33
1
2141,02
214,102
47
2
3679,48
367,948
27
3
1905,98
190,598
52
4
2461,53
246,153
41
644
546
591
633
642
95
Continuación ANEXO 12.
Muestra
Muestreo
Proteína total
µg/mL
V. electroforesis (µL)
639
1
2824,78
282,478
35
2
3679,48
367,948
27
3
3230,76
323,076
31
4
3786,32
378,632
26
1
2055,55
205,555
49
2
3508,54
350,854
29
3
2376,06
237,606
42
4
3059,82
305,982
33
1
2739,31
273,931
37
2
3209,40
320,940
31
3
2717,94
271,794
37
4
3102,56
310,256
32
1
1970,08
197,008
51
2
4363,24
436,324
23
3
2675,21
267,521
37
4
3059,82
305,982
33
1
3081,19
308,119
32
2
4149,57
414,957
24
3
3188,03
318,803
31
4
3358,97
335,897
30
1
2739,32
273,932
37
2
3636,75
363,675
27
3
3572,65
357,265
28
4
3273,50
327,350
31
579
560
596
LM 1
LM 2
96
ANEXO 13
Identificación de las variantes genéticas de κ- caseína.
Muestreo
Vaca
1
644
639
Distancia
migración
muestra (mm)
N.O
30,1
633
591
30,0
29,7
546
29,7
560
27,4
642
29,5
596
29,1
579
27,3
636
28,7
LM 1
LM 2
644
639
A.L
N.O
N.O
25,1
633
591
25,7
24
546
560
642
23,2
22,7
21,35
596
579
636
LM 1
23,7
A.L
N.O
21,7
23,5
A.L
2
LM 2
Estándar
κ- caseína
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (3971)
B (4052 – 2)
A (3971)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
B (4052 – 2)
Distancia
migración
estándar (mm)
27,7
25,1
27,7
30,1
29,2
30,1
29,2
30,1
25,1
30,1
25,1
30,1
25,1
30,1
25,1
30,1
25,1
23,0
23,48
20,30
23,0
23,48
20,3
23,0
23
23,0
20,3
23
23
-
-
Variante
N.O
B
B
B
B
A
B
B
A
B
A.L
N.O
N.O
B
B
B
B
A
A
B
A.L
N.O
AyB
(dfuso)
A.L.
97
Continuación ANEXO 13
Muestreo
Vaca
3
644
Distancia
migración
muestra (mm)
33,1
639
31,1
633
31,5
591
32,0
546
33,0
560
30,5
642
31,0
596
33,0
579
30,5
636
33,0
LM 1
LM 2
644
N.O
N.O
35,2
639
36,0
633
34,9
591
34,5
546
34,2
560
33,1
642
34,6
596
35,3
579
33,5
636
34,9
LM 1
35,0
39,1
25,9
31,3
4
LM 2
Estándar
κ- caseína
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (comercial)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
B (4052 – 2)
A (4052 – 2)
N.O: No observado. (no visualizado en el gel, luego de teñido y desteñido)
A.L: Accidente de laboratorio.
Distancia
migración
estándar (mm)
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
32,0
29,5
35,0
34,3
35,0
34,3
35,0
34,3
34,9
33,8
34,9
33,8
35,0
34,3
34,9
33,8
35,0
34,3
35,0
34,3
34,9
33,8
35,0
34,3
35,0
34,3
Variante
B
B
B
B
B
A
B
B
A
B
N.O
N.O
B
B
B
B
B
A
B
B
A
B
AyB
(difuso)
AyB
(difuso)
98
ANEXO 14
Identificación de las variantes genéticas de ß - lactoglobulina.
Muestreo
Vaca
Distancia
migración
muestra (mm)
644
15,8 – 17,1
639
14,6
633
15,4 – 16,1
591
15,5 – 18,1
546
13,4 – 16,7
560
15,7
642
13
596
14,2 – 16,86
579
15,5 – 17,5
636
17,1 – 19,1
LM 1
15,8 – 16,5
LM 2
15,1
644
15,2 – 16,5
639
N.O
1
2
633
15,3
591
15,4 (difuso)
546
15,0 – 16,5
560
15,2
642
15,4
596
15,5 – 17,5
579
14,48 (difuso)
636
14,48 – 16,8
Estándar
β - lactoglobulina
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
(comercial)
Distancia
migración
estándar (mm)
17,8
15,1
16,6
15,26
16,6
15,26
16,6
15,26
16,4
13,4
17,8
15,1
16,6
15,26
16,4
13,4
17,8
15,1
17,8
15,1
17,8
15,1
17,8
15,1
15,26
16,6
17,8
15,1
17,8
15,1
17,8
15,1
16,6
15,26
17,8
15,1
17,8
15,1
16,6
15,26
14,28
Variante
AyB
A
AyB
AyB
AyB
A
A
AyB
AyB
AyB
AyB
A
AyB
N.O
AyB
A
AyB
A
A
AyB
A
AyB
99
Distancia
migración estándar
(mm)
B (comercial)
17,40
644
15,90 – 17,86
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
639
16,04
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
633
15,38 – 17,78
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
591
15,40 – 17,82
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
546
15,60 – 17,76
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,4
560
15,7
A
(comercial)
15,48
3
B (comercial)
17,40
642
15,38
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
596
15,42 – 18
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
579
16 – 18,38
A (comercial)
15,48
B (comercial)
17,40
636
15,40 – 18,24
A (comercial)
15,48
B (comercial)
18,18
LM 1
16,24 – 17,62
A (comercial)
16,10
B (comercial)
18,18
LM 2
16,48
A (comercial)
16,10
B (comercial)
17,80
644
15,12 – 16,30
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
639
16,0
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
633
15,70 – 17,22
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
591
15,72 – 17,86
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
546
15,70 – 17,5
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
560
15,46
4
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
642
16,0
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
596
15,64 – 17,48
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
579
16,34 – 18,1
A (comercial)
15,76
B (comercial)
17,80
636
14,70 – 16,10
A (comercial)
15,76
B (comercial)
18,18
LM 1
16,32 – 17,90
A (comercial)
16,10
LM 2
N.O
N.O: No observado. (no visualizado en el gel, luego de teñido y desteñido)
A.L: Accidente de laboratorio.
Muestreo
Vaca
Distancia
migración
muestra (mm)
Estándar
β - lactoglobulina
Variante
AyB
A
AyB
AyB
AyB
A
A
AyB
AyB
AyB
AyB
AyB
AyB
A
AyB
AyB
AyB
A
A
AyB
AyB
AyB
AyB
N.O
100
ANEXO 15
Densitogramas obtenidos en ß – lactoglobulina de leche de vacas Frisón
negro.
636
560
579
ß-Lg A y B
ß-Lg A
ß-Lg A y B
(1,66 : 1)
-
(1,02 : 1)
591
596
633
ß-Lg A y B
ß-Lg A y B
ß-Lg A y B
(1,15 : 1)
(2,89 : 1)
(5,4 : 1)
101
Continuación ANEXO 15.
642
644
546
ß-Lg A
ß-Lg A y B
ß-Lg A y B
-
(5 : 1)
(0,92 : 1)
102
ANEXO 16
Densitogramas obtenidos en κ- caseína de leche de vacas Frisón Negro.
579
591
639
κ-CN A
κ-CN B
κ-CN B
560
546
644
κ-CN A
κ-CN B
κ-CN B
103
Continuación ANEXO 16.
636
633
642
κ-CN B
κ-CN B
κ-CN B
596
St. 4052-2
St. 3971-1
κ-CN B
κ-CN B
κ-CN A
104
ANEXO 17
Resultados de contenido proteico para leche de vacas Frisón Negro.
1° Muestreo:
Muestra
% Prot. total
% Prot. Suero
% caseína
N° de caseína
636
2,89
0,699
2,19
75,81
636
644
2,96
2,91
0,699
0,686
2,26
2,22
76,39
76,43
644
546
2,96
2,90
0,669
0,802
2,29
2,10
77,40
72,34
546
2,97
0,803
2,17
72,96
591
591
2,80
2,79
0,753
0,734
2,05
2,06
73,11
73,69
633
633
2,90
2,89
0,775
0,774
2,13
2,12
73,28
73,22
642
642
3,02
3,02
0,665
0,664
2,36
2,36
77,98
78,01
639
639
3,23
3,03
0,695
0,693
2,54
2,34
78,48
77,13
579
579
2,86
2,87
0,658
0,666
2,20
2,20
76,99
76,79
560
560
3,13
3,09
0,722
0,735
2,41
2,36
76,93
76,21
596
596
3,05
3,06
0,669
0,673
2,38
2,39
78,07
78,01
LM 1
LM 1
3,26
3,19
0,752
0,759
2,51
2,43
76,93
76,21
LM 2
LM 2
3,19
3,17
0,673
0,692
2,52
2,48
78,90
78,17
105
Continuación ANEXO 17.
2° Muestreo:
Muestra
% Prot. Total
% Prot. Suero
% caseína
N° de caseína
636
636
3,35
3,17
0,802
0,772
2,55
2,40
76,06
75,65
644
3,25
0,801
2,45
75,35
644
546
3,27
3,38
0,713
0,798
2,56
2,58
78,20
76,39
546
591
3,25
3,16
0,772
0,787
2,48
2,37
76,25
75,09
591
3,17
0,770
2,40
75,71
633
633
3,58
3,49
0,775
0,764
2,81
2,73
78,35
78,11
642
642
3,12
3,19
0,713
0,706
2,41
2,48
77,15
77,87
639
639
3,26
3,29
0,712
0,713
2,55
2,58
78,16
78,33
579
579
2,89
2,83
0,659
0,659
2,23
2,17
77,20
76,71
560
560
3,07
3,19
0,806
0,797
2,26
2,39
73,75
75,02
596
596
2,97
3,14
0,678
0,688
2,29
2,45
77,17
78,09
LM 1
LM 1
3,18
3,11
0,758
0,738
2,42
2,37
76,16
76,27
LM 2
LM 2
3,18
3,21
0,743
0,745
2,44
2,47
76,64
76,79
106
Continuación ANEXO 17.
3° Muestreo:
Muestra
% Prot. Total
% Prot. Suero
% caseína
N° de caseína
636
636
3,27
3,30
0,693
0,699
2,58
2,60
78,81
78,82
644
3,09
0,713
2,38
76,93
644
546
3,11
3,16
0,719
0,745
2,39
2,42
76,88
76,42
546
591
3,17
3,04
0,745
0,759
2,43
2,67
76,50
77,87
591
3,07
0,763
2,68
77,82
633
633
3,43
3,44
0,759
0,763
2,67
2,68
77,87
77,82
642
642
2,97
2,92
0,691
0,686
2,28
2,23
76,73
76,51
639
639
2,86
2,93
0,661
0,677
2,20
2,25
76,89
76,89
579
579
2,86
2,86
0,690
0,689
2,17
2,17
75,87
75,91
560
560
3,18
3,23
0,802
0,807
2,38
2,42
74,78
75,02
596
596
2,81
2,87
0,637
0,642
2,17
2,23
77,33
77,63
LM 1
LM 1
3,24
3,20
0,709
0,719
2,53
2,48
78,12
77,53
LM 2
LM 2
3,00
3,03
0,725
0,722
2,28
2,31
75,83
76,17
107
Continuación ANEXO 17.
4° Muestreo:
Muestra
% Prot. Total
% Prot. Suero
% caseína
N° de caseína
636
636
3,35
3,32
0,721
0,743
2,63
2,58
78,48
77,62
644
3,04
0,749
2,29
75,36
644
546
3,06
3,22
0,766
0,762
2,29
2,46
74,97
76,34
546
591
3,26
3,15
0,753
0,824
2,51
2,33
76,90
73,84
591
3,16
0,822
2,34
73,99
633
633
3,40
3,45
0,764
0,779
2,64
2,67
77,53
77,42
642
642
2,99
2,94
0,682
0,677
2,31
2,26
77,19
76,97
639
639
3,09
3,04
0,702
0,698
2,39
2,34
77,28
77,04
579
579
2,99
2,98
0,675
0,654
2,32
2,33
77,42
78,05
560
560
3,10
3,15
0,820
0,827
2,28
2,32
73,55
73,75
596
596
3,03
2,98
0,699
0,695
2,33
2,29
76,93
76,68
LM 1
LM 1
3,09
3,10
0,726
0,737
2,36
2,36
76,50
76,23
LM 2
LM 2
3,19
3,24
0,734
0,739
2,46
2,50
76,99
77,19
108
ANEXO 18
Valores F para análisis de varianzas en relación con la producción y
composición proteica de leche de vacas Frisón Negro.
§
Tabla resumen.
Composición
Factores
gl
Producción
% Proteína
% Proteína
de leche
total
del suero
% Caseína
Número de
caseína
A: Muestreo
3
1,07
1,99
2,13
1,19
0,31
B: κ Caseína
1
2,60
4,05
*
1,63
6,44
*
6,85
C: β lactoglobulina
1
22,99
4,96
*
10,22
1,92
1,38
AxB
3
3,88
2,17
1,47
2,00
1,31
AxC
3
0,35
1,44
0,67
2,30
2,61
BxC
1
8,65*
18,01
62,04
4,53
*
16,74
AxBxC
3
1,75
1,60
1,19
1,62
1,42
*
*
*
Interacciones:
*
denota efecto significativo (p<0.05)
*
*
*
109
Continuación ANEXO 18.
•
Resultados Statgraphics 2.0.
Análisis de Varianza para Proteína total.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados gl Cuadrado medio
F
Valor p
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Efectos principales
A: Muestreo
0,106806
3
0,0356019
1,99
0,1247
B: Variantes ?
0,072463
1
0,072463
4,05
0,0485
C: Variantes ß
0,088838
1
0,088838
4,96
0,0295
INTERACCIONES
AB
AC
BC
ABC
0,116556
0,0776057
0,322588
0,0858807
3
3
1
3
0,0388519
0,0258686
0,322588
0,0286269
2,17
1,44
18,01
1,60
0,1003
0,2383
0,0001
0,1986
RESIDUAL
1,1465
64
0,0179141
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------TOTAL (Corregido)
2,60259
79
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Valor p<0,05 indica que el factor tiene un efecto estadísticamente significativo al 95% de
confianza.
Análisis de Varianza para Proteínas del suero.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados gl Cuadrado medio
F
Valor p
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Efectos principales
A: Muestreo
0,00913309
3
0,00304436
2,13
0,1047
B: Variantes ?
0,00232408
1
0,00232408
1,63
0,2065
C: Variantes ß
0,0145778
1
0,0145778
10,22
0,0022
INTERACCIONES
AB
AC
BC
ABC
0,00630197
0,00285623
0,0885371
0,00508373
3
3
1
3
0,00210066
0,000952078
0,0885371
0,00169458
1,47
0,67
62,04
1,19
0,2305
0,5753
0,0000
0,3216
RESIDUAL
0,0913272
64
0,00142699
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------TOTAL (Corregido)
0,210615
79
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Valor p<0,05 indica que el factor tiene un efecto estadísticamente significativo al 95% de
confianza.
110
Continuación ANEXO 18.
Análisis de Varianza para Caseína.
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados gl
Cuadrado medio
F
Valor p
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Efectos principales
A: Muestreo
0,0574671
3
0,0191557
1,19
0,3212
B: Variantes ?
0,103835
1
0,103835
6,44
0,0136
C: Variantes ß
0,0308814
1
0,0308814
1,92
0,1711
INTERACCIONES
AB
AC
BC
ABC
0,0969264
0,111117
0,073047
0,0783889
3
3
1
3
0,0323088
0,037039
0,073047
0,0261296
2,00
2,30
4,53
1,62
0,1222
0,0859
0,0371
0,1932
RESIDUAL
1,03158
64
0,0161184
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TOTAL (Corregido)
2,09488
79
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Valor p<0,05 indica que el factor tiene un efecto estadísticamente significativo al 95% de
confianza.
Análisis de Varianza para N° caseína.
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados gl Cuadrado medio
F
Valor p
----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Efectos principales
A: Muestreo
1.58367
3
0.52789
0.31
0.8198
B: Variantes ?
11.7513
1
11.7513
6.85
0.0111
C: Variantes ß
2.36519
1
2.36519
1.38
0.2448
INTERACCIONES
AB
AC
BC
ABC
6.76078
13.4605
28.7293
7.32512
3
3
1
3
2.25359
4.48684
28.7293
2.44171
1.31
2.61
16.74
1.42
0.2779
0.0587
0.0001
0.2443
RESIDUAL
109.842
64
1.71628
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------TOTAL (Corregido)
192.271
79
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------Valor p<0,05 indica que el factor tiene un efecto estadísticamente significativo al 95% de
confianza.
111
Continuación ANEXO 18.
Análisis de Varianza para prod. leche
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Fuente
Suma de cuadrados gl Cuadrado medio F
Valor p
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Efectos principales
A :Muestreo
10.972
3
3.65732
1.07
0.3680
B: variantes ?
8.8752
1
8.8752
2.60
0.1120
C: variantes ß
78.5511
1
78.5511
22.99 0.0000
INTERACCIONES
AB
AC
BC
ABC
39.7276
3.6
29.56
17.9778
3
3
1
3
13.2425
1.2
29.56
5.99261
3.88
0.35
8.65
1.75
0.0131
0.7884
0.0045
0.1650
RESIDUAL
218.685
64
3.41695
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------TOTAL (Corregido)
392.941
79
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Valor p<0,05 indica que el factor tiene un efecto estadísticamente significativo al 95% de
confianza.
112
ANEXO 19
Interacción de variantes genéticas de κ- caseína y ß – lactoglobulina e
intervalos de significancia para componentes en estudio.
§
Proteína total.
§
Proteínas del Suero.
113
Continuación ANEXO 19.
§
Caseína.
§
Número de caseína.
114
Continuación ANEXO 19.
§
Producción de leche por ordeño AM.