UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
Instituto de Bioquímica y Microbiología
Facultad de Ciencias
EVALUACIÓN DE TRATAMIENTOS QUÍMICOS PARA EL CONTROL DE
Mycobacterium avium SUBSP. paratuberculosis (Map) EN PURINES DE LECHERÍA
Memoria de Título presentada como parte de
los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO.
SUSAN ELIZABETH STRAUCH STANGE
VALDIVIA – CHILE
2012
PROFESOR PATROCINANTE
__________________________________
Dr. Miguel Salgado A.
PROFESOR COPATROCINANTE
__________________________________
Dra. Bárbara Otto L.
PROFESORES INFORMANTES
__________________________________
Dr. Juan Kruze V.
__________________________________
Dr. Rafael Tamayo C.
FECHA DE APROBACIÓN: 4 de julio 2012.
ÍNDICE
Capítulos
Página
1. RESUMEN……………………………………………………………………
1
2. SUMMARY……………………………………………………………………
2
3. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….…
3
4. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………..
7
5. RESULTADOS………………………………………………………………
12
6. DISCUSIÓN………………………………………………………………….
17
7. REFERENCIAS………………………………………………………………
23
8. ANEXOS……………………………………………………………………...
25
9. AGRADECIMIENTOS……………………………………………………......
28
1
1. RESUMEN
El uso de purín de lechería como fertilizante orgánico es una práctica que ha adquirido
gran popularidad, debido a su gran contenido de materia orgánica y presencia de nutrientes para
praderas y cultivos; sin embargo puede contener altas cargas de agentes patógenos de riesgo en
salud animal y pública. Del que menos se conoce en relación a su persistencia en los diferentes
sistemas de manejo de purines, es sobre Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). En Chile
se practica el almacenamiento del purín en estructuras llamadas pozos purineros, en donde se ha
demostrado que Map puede persistir hasta 6 meses. Este hecho motiva la práctica de un manejo
complementario que disminuya la sobrevida de la bacteria en el purín.
El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de tratamientos químicos en la sobrevida
de Map en purines de lechería, a través del uso de compuestos alcalinos en base a cal (CaO,
Ca(OH)2) en concentraciones de 5 y 15% y compuestos ácidos (H2SO4) en concentraciones de 0,1
y 0,3% en función del tiempo de exposición.
Para esto se estableció un experimento en donde 28 muestras de purín fueron
contaminadas con Map a concentración de 106 bacterias/mL para luego ser sometidas a
tratamiento químico. El diseño experimental consistió en bloques al azar completos de 7
tratamientos y 4 repeticiones. Se evaluó cada 24, 48 y 72 h disminución de peso, pH y consistencia
del purín, concentración de Map y coliformes totales (CT) en el purín sometido a tratamiento
químico.
Los tratamientos en base a cal generaron un purín altamente alcalino (pH 12), redujeron la
sobrevida de Map y eliminaron los CT en el sustrato tratado químicamente. Se destaca el efecto de
CaO 15%, debido a que limitó completamente la viabilidad de Map en el sustrato obteniéndose a
las 48 h de tratamiento una concentración bacteriana bajo los límites de detección para el sistema
de cultivo utilizado (1-10 bacterias/mL). Los tratamientos ácidos no afectaron la sobrevida de
Map y CT en el purín en estudio, obteniéndose concentraciones bacterianas similares a las
muestras control.
Se podría sugerir la utilización de compuestos en base a cal como CaO en concentración
de 15% para el tratamiento de purines de lechería. Esto con el propósito por un lado, de
aprovechar las ventajas en relación a la aplicación de purines como fertilizante orgánico en las
praderas, y por otro lado, para limitar la diseminación hacia el medio ambiente de agentes
patógenos de riesgo para salud de los animales y el ser humano.
Palabras clave: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), coliformes totales (CT), purín, óxido
de calcio (CaO), hidróxido de calcio (Ca(OH)2), ácido sulfúrico (H2SO4).
El presente estudio fue financiado por Consorcio Lechero (código 501269-47).
2
2. SUMMARY
EVALUATION OF CHEMICAL TREATMENTS TO CONTROL
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) SURVIVAL
IN DAIRY CATTLE MANURE
The use of organic wastes such as manure is a practice that has became popular due to its
high content of organic matter and presence of essential nutrients for pastures and crops;
however it can contain pathogens that can be risky for both animals and public health. Among
pathogens that show a fecal-oral transmission, is about Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
(Map), of which less is known about their persistence in manure management systems. In Chile,
the system used for handling slurry is the storing in liquid form in lagoons, where it has been
shown that Map can persist up to 175 days. This motivates the practice of a complementary
management that can decrease the survival of the bacteria in dairy cattle manure.
The aim of this study was to evaluate the effect of chemical treatments on Map survival in
dairy manure through the use of compounds based on alkaline lime (CaO, Ca (OH)2) at
concentrations of 5 and 15%, and acidic compounds (H2SO4) in concentrations of 0,1 and 0,3%,
depending on exposure time.
The slurry samples were contaminated with Map at concentration of 106 bacteria/mL and
then chemically treated according to a randomized block design of 7 treatments for 4 reps. Every
24, 48 and 72 h were sampled and evaluated for weight, pH and consistency of the slurry samples,
as well as Map and TC concentration in the slurry subjected to chemical treatment.
Treatments based on lime generated a high alkaline slurry (pH 12), reduced the survival of
Map and eliminated TC in the liquid manure chemically challenged. It is outlined the effect of
CaO 15%, which limited the viability of Map at concentration under the detection limits for the
culture system used (1-10 bacteria/mL) in 48 h in the slurry. Acid treatments did not affect the
survival of Map and TC in the manure under analysis.
It can be suggested the use of compounds based on lime such as CaO at concentration of
15% for the treatment of dairy manure. The latter is important, from one side to take advantage
in relation to dairy manure application as fertilizer in the fields and the other to limit the spread of
pathogens in the environment that can be risky for both animals and public health.
Keywords: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map), total coliforms (TC), manure, slurry,
quicklime (CaO), slaked lime (Ca(OH)2), sulfuric acid (H2SO4).
The present study was funded by Consorcio Lechero (project code 501269-47).
3
3. INTRODUCCIÓN
La aplicación de abonos orgánicos sobre las praderas es una práctica tan antigua como el
inicio de la agricultura. Éstos corresponden a fertilizantes de origen orgánico, compuestos por
residuos derivados de la producción animal (purines, sangre, harina de huesos) y/o vegetal,
además de aquellos de origen humano (lodos provenientes de aguas servidas), que pueden ser
aplicados al suelo con el fin de proporcionar uno o más nutrientes a los cultivos vegetales. Entre
éstos, actualmente el purín es un importante fertilizante orgánico imprescindible para muchas
explotaciones agrícolas a lo largo de todo el mundo. Éste se define como la mezcla de heces y
orina de ganado, diluida con agua de lluvia o de limpieza, que puede contener restos de material
de cama normalmente utilizados en la crianza de animales, junto con residuos de alimento (Pain y
Menzi 2003).
El purín enriquece los suelos mejorando su estructura, capacidad amortiguadora y
actividad biológica, debido a que presenta un alto contenido de materia orgánica (MO) y
nutrientes esenciales para el desarrollo de praderas y cultivos. Entre éstos, se destacan elementos
como nitrógeno, fósforo y potasio, constituyendo el purín tras un adecuado sistema de manejo un
aporte importante a la hora de fertilizar, disminuyendo el requerimiento de uso de abonos
artificiales y reduciendo los costos asociados a la compra de éstos. Si bien los purines en el sur de
Chile se caracterizan por poseer un alto contenido de MO (68%), muestran niveles bajos en
cuanto a materia seca (MS), los cuales pueden alcanzar sólo un 4%. En cuanto a su
caracterización, también se demuestra que el purín posee un pH ligeramente básico, lo que puede
ser beneficioso para los suelos volcánicos del sur de nuestro país, los cuales tienden a presentar un
pH más ácido (Salazar y col 2007).
Sin embargo, también se describen ciertas desventajas en relación a la aplicación de este
preparado líquido sobre las praderas. El purín puede generar gases (H2S, NH3) y por consiguiente
malos olores en el ambiente; escurrir hacia cursos de aguas superficiales y/o lixiviarse en los
suelos, potenciando el fenómeno de eutrofización de las aguas (Pell 1997); además puede implicar
un alto costo para su transporte (Grewal y col 2006). Otra importante desventaja se relaciona con
la carga de agentes patógenos que éste puede contener, constituyendo un riesgo para la salud
tanto de animales como humanos. La transmisión indirecta de un agente infeccioso puede
efectuarse a través de la contaminación de las aguas, pasturas, alimento o siembras fertilizadas con
purines insuficientemente tratados (Sahlström 2006). Desde aquí vectores como insectos,
roedores o pájaros, son capaces de transportar los microorganismos hacia otros sectores,
contribuyendo con la diseminación de agentes infecciosos. Los patógenos presentes en el purín se
pueden agrupar en tres categorías: bacterias, virus y parásitos (incluidos protozoos y helmintos)
(Sahlström 2006). Entre las bacterias se destaca la presencia de Escherichia coli O157:H7, Listeria
monocytogenes, Salmonella spp. y Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map); mientras que dentro
de los parásitos se pueden encontrar Cryptosporidium parvum y Giardia spp (Pell 1997).
4
Entre los agentes patógenos, cuya principal vía de transmisión es fecal-oral, del que menos
se conoce en relación a su persistencia en los diferentes sistemas de manejo de purines, es
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Bacteriológicamente Map se define como un bacilo
Gram positivo, ácido alcohol resistente e inmóvil, que en virtud a su inhabilidad para sintetizar
micobactina, es clasificado como parásito intracelular obligado, incapaz de replicarse fuera del
hospedero. Es el agente causal de la Paratuberculosis, enfermedad bacteriana de curso crónico
caracterizada por producir lesiones granulomatosas a nivel intestinal, pudiendo ocasionar diarrea,
pérdida de peso progresiva y caquexia en los animales afectados clínicamente. Si bien la presencia
de Map se ha registrado en especies no rumiantes como conejos y primates, es en especies
rumiantes en donde adquiere mayor relevancia especialmente en bovinos, ovinos y caprinos,
siendo responsable de grandes pérdidas económicas particularmente en los rebaños lecheros
(Manning y Collins 2001). La enfermedad se encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial y
de acuerdo con estudios locales, se estima que en nuestro país es una enfermedad de alta
prevalencia, en donde al menos el 40% de los rebaños del sur de Chile poseen el estatus de
infectado (van Schaik y col 2007). Un aspecto de mucha importancia ha sido el papel de Map en
salud pública, debido a su potencial rol zoonótico como agente causal de la Enfermedad de Crohn
en individuos susceptibles (Manning y Collins 2001).
Para controlar la diseminación de la infección por Map en los rebaños, existen importantes
variables que deben considerarse, entre las cuales destaca la capacidad de la bacteria para
sobrevivir por largos períodos fuera del hospedero. Al respecto, Lovell y col (1944) demostraron
que la bacteria puede sobrevivir hasta 246 días en el material fecal de bovinos y permanecer al
menos un año sobre la pradera, pero la exposición a ciertos factores ambientales como altas
temperaturas, radiación ultravioleta y pH bajo, pueden reducir la viabilidad de ésta (Katayama y
col 2001, Whittington y col 2004, Grewal y col 2006). En relación con el movimiento de Map en
el suelo agrícola, estudios realizados en Chile por Salgado y col (2011) demuestran que posterior a
la aplicación de purines contaminados con Map en un diseño experimental conformado por
columnas de suelo, la bacteria tiende a permanecer en los estratos superiores de éste y se mueve
de forma lenta a través de él. Esto reafirma que la permanencia de la bacteria en el pasto y en las
capas superficiales de la tierra representa un claro riesgo relacionado a la infección por Map en
animales en pastoreo y una potencial contaminación hacia otros lugares a través de su
escurrimiento en las aguas lluvias.
Esta información propone un nuevo desafío al manejo que implica la fertilización de las
praderas a través del uso de purines de lechería. Existen referencias científicas que describen
tratamientos físicos, químicos y biológicos, aplicados en plantas de tratamiento de aguas
contaminadas, que contribuyen a eliminar la carga patógena existente de igual forma en purines.
Entre éstos, se pretende encontrar aquel tratamiento que afecte en mayor medida la sobrevida de
Map en este abono orgánico (Sahlström 2006). En primer lugar, se destaca el compostaje, que es
un sistema de tratamiento de purines en forma sólida, cuyo principio de acción es la fermentación
del material a almacenar en forma de hileras o pilas, estáticas o aireadas, por un período variable
de tiempo (Grewal y col 2006). La aireación de este material promueve la actividad microbiana, la
cual puede aumentar la temperatura a más de 50°C, favoreciendo la inactivación de los
microorganismos patógenos (Sahlström 2006). En segundo lugar, la digestión anaerobia es un
5
excelente medio para convertir desechos biodegradables en productos útiles (Bagge 2009). Se
realiza en estructuras llamadas digestores, dentro de los cuales diferentes microorganismos
fermentan la materia orgánica bajo estado de anaerobiosis, produciendo energía en forma de
metano (Sahlström 2006). Los residuos obtenidos tras los procesos de digestión son utilizados
como fertilizantes sobre los suelos cultivables (Bagge 2009).
Sobre el principio de fermentación aplicado en estos dos tratamientos, estudios realizados
por Grewal y col (2006) demostraron que a temperaturas de 55˚C se logra disminuir la
persistencia de Map después de 3 días de tratamiento. La práctica de ambos tratamientos sobre
purines y otros desechos es imprescindible para muchos sistemas productivos en todo el mundo.
Ambos procedimientos presentan ciertas dificultades al querer integrarlos a los sistemas
agropecuarios en Chile, y principalmente a la producción lechera bovina. Esto se debe en primer
lugar, a que los purines son manejados en forma líquida, lo cual dificulta considerablemente la
práctica del sistema de compostaje de estos residuos, si no se invierte en un sistema de secado
para obtener un material sólido. En segundo lugar, la digestión anaerobia puede incurrir en
elevados costos asociados principalmente a la compra e instalación de biodigestores, lo que puede
representar un obstáculo en su aplicación para muchos productores lecheros.
En nuestro país, el manejo actual aplicado al purín de lechería, considera su
almacenamiento en forma líquida, el que se lleva a cabo en pozos purineros, los que corresponden
a estructuras similares a piscinas, diseñadas para el almacenamiento de purines en forma
transitoria, y que tienen además por objetivo la homogenización de éstos a través de sistemas de
agitación, para su ulterior riego sobre las praderas. Respecto al almacenamiento de purines de
lechería bovina contaminados con Map, Grewal y col (2006) demostraron que se requieren al
menos 175 días de acopio, para reducir de forma significativa la concentración de la bacteria
presente en el purín.
En respuesta a la problemática anterior, existe una gran gama de alternativas en cuanto al
uso de tratamientos químicos en desechos de la producción animal. Entre éstos, se encuentra la
utilización de compuestos en base a cal. Si bien éstos han sido largamente empleados como
neutralizadores de pH en suelos ácidos, también poseen la capacidad de inactivar diversos virus y
bacterias presentes en la materia orgánica (Haas y col 1995, Heinonen-Tanski y col 2005).
Aditivos químicos conocidos en base a cal, son el óxido de calcio y su derivado el hidróxido de
calcio, los cuales presentan ventajas en cuanto a su uso en purines, debido principalmente a que
demuestran ser solubles en agua, son de fácil manejo y bajo costo en relación a otras técnicas de
tratamiento de desechos orgánicos. Además, logran reducir la emanación de algunos gases
causantes de malos olores (Haas y col 1995).
No existe por el momento en nuestro país un sistema de tratamiento de purines que
entregue a los productores lecheros la alternativa de utilizar un método seguro para controlar la
diseminación de agentes infecciosos de transmisión fecal-oral como Map en rumiantes domésticos
dentro de los rebaños. Al mismo tiempo, se deben considerar aspectos prácticos en la aplicación
6
de dichos tratamientos en los sistemas productivos lecheros. Es decir, poder asociarlo al sistema
actual de almacenamiento de purines en forma líquida, reunir las condiciones económicas para su
puesta en marcha y permitir seguir utilizando los beneficios de la aplicación de purines como
fertilizantes orgánicos sobre los suelos cultivables. Es por esto que resulta de gran interés el uso
de tratamientos químicos en base a cal, considerando la aplicación de óxido e hidróxido de calcio
en los purines, debido a su facilidad de obtención en el mercado y a las ventajas que posee su
aplicación como neutralizadores de suelos ácidos, pero principalmente sobre su utilización como
compuesto químico reductor de poblaciones patógenas, entre ellas potencialmente Map, presentes
en los purines de lechería.
3.1 HIPÓTESIS
Tratamientos químicos en base a sales de calcio en purines de lechería bovina afectarían la
sobrevida de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) presente en éstos.
3.2 OBJETIVOS
3.2.1 Objetivo general
Evaluar el efecto del tratamiento químico en la sobrevida de Map en purines de lechería.
3.2.2 Objetivos específicos
ƒ Determinar el efecto del hidróxido de calcio sobre la sobrevida de Map y coliformes
totales en función del tiempo de exposición.
ƒ Determinar el efecto del óxido de calcio sobre la sobrevida de Map y coliformes totales en
función del tiempo de exposición.
ƒ Determinar el efecto del ácido sulfúrico sobre la sobrevida de Map y coliformes totales en
función del tiempo de exposición.
7
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 PURÍN
Para evaluar el efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de Map se colectó
una muestra de 5 L de purín proveniente de una lechería comercial bovina ubicada en las
cercanías de la ciudad de La Unión, Región de los Ríos. Las características físico-químicas y
bacteriológicas de este material se evaluaron de forma previa a la aplicación de los químicos.
4.1.1 Caracterización físico-química del purín natural
A partir de la muestra de purín natural se extrajeron 28 submuestras constituidas por 100
mL destinadas a contaminar con Map y tratar con los productos químicos. Cada submuestra de
purín natural fue caracterizada según peso, pH y consistencia, obteniéndose los siguientes
resultados para cada una de las 28 submuestras:
ƒ
ƒ
ƒ
Peso: 100 g
pH: 8
Consistencia: líquida
4.1.2 Caracterización bacteriológica del purín natural
Para determinar la eventual presencia y concentración de Map en el purín natural se
extrajeron 3 mL del material para su procesamiento en el sistema cultivo líquido BACTEC MGIT
960. Del mismo modo se utilizaron 0,5 mL de purín para la determinación y cuantificación de
coliformes totales a través del uso del medio de cultivo comercial Petrifilm (Cuadro 1).
Cuadro 1. Cuantificación bacteriológica (Map y CT) del purín natural.
Muestra
Purín natural
Concentración Map
(Bacterias/mL)
329
Concentración CT
(UFC/mL)
6.600
4.1.3 Contaminación experimental de las submuestras de purín con Map
Para evaluar el efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de Map en purines
de lechería, se contaminaron las submuestras de purín natural con la cepa ATCC 19698 de Map.
En forma previa, éstas cepas se cultivaron en medio líquido 7H9 suplementado con 10% OADC
y 2 g/mL de micobactina, se incubaron por 1 mes a 37° C en botellas de cultivo con 40 mL de
medio de cultivo para obtener un óptimo crecimiento. Tomando como referencia los datos de
Sung y col (2007) se estableció una absorbancia óptica de 0,6 nm como punto medio de la fase
exponencial de crecimiento en este sistema de cultivo. Se evaluó semanalmente el cultivo líquido
en un espectrofotómetro para verificar que las células obtenidas para los siguientes procesos se
encontraran en fase exponencial de crecimiento, esto con el objetivo de minimizar la cantidad de
células muertas que podrían dar imprecisiones a los futuros datos. Paralelamente, se sembraron
8
alícuotas del cultivo puro en tubos MGIT. Con los resultados de tiempo de detección (TTD)
entregados por el sistema de cultivo líquido BACTEC MGIT 960, previamente estandarizado por
Sung y col (2007), se permitió una estimación más precisa de la cuantificación de carga bacteriana.
Se obtuvo una concentración aproximada de 108 bacterias/mL en el cultivo puro de la cepa ATCC
de Map. A partir de éste se extrajo una alícuota para contaminar el purín con Map estimándose
una concentración mínima de 106 bacterias/mL en el purín ya contaminado.
4.2 PRODUCTOS QUÍMICOS
Para evaluar el efecto de los tratamientos químicos en la sobrevida de Map en el sustrato
purín se utilizaron 2 productos químicos de uso agrícola y disponibles en el mercado local
constituidos por óxido de calcio (CaO)1 e hidróxido de calcio (Ca(OH)2)2. Además, se consideró la
aplicación de un producto químico ácido representado por ácido sulfúrico (H2SO4)3.
Posteriormente, se determinaron las cantidades de cada compuesto a utilizar (Cuadro 2).
Cuadro 2. Descripción, concentración, porcentaje de disponibilidad y cantidad en gramos de los
productos químicos utilizados en 100 mL de purín.
Nombre
comercial
Soprocal 3
Soprocal 3
Quality Pro
Quality Pro
Ácido sulfúrico
Ácido sulfúrico
Compuesto
químico
CaO
CaO
Ca(OH)2
Ca(OH)2
H2SO4
H2SO4
Concentración
Disponibilidad
5%
15%
5%
15%
0,1%
0,3%
70%
70%
95%
95%
95-97%
95-97%
Cantidad utilizada en la mezcla (g/100
mL)
7,14
21,43
5,3
15,8
0,1
0,3
4.3 DISEÑO EXPERIMENTAL
Para evaluar el efecto de los diferentes tratamientos en la sobrevida de Map en purín
bovino de lechería se realizó un experimento de laboratorio representado en un diseño de bloques
al azar constituido por 7 tratamientos y 4 repeticiones, los que fueron sometidos a muestreo en 3
oportunidades (cada 24 h) para caracterización físico-química y bacteriológica.
Cada bloque estaba representado por 7 unidades experimentales correspondientes a las
submuestras de 100 mL purín contaminado con Map, las que fueron dispuestas en envases de
Soprocal 3. Copeval S.A. Chile
Quality Pro. Copeval S.A. Chile
3 Fluka. Sigma Aldrich Laborchemikalien Gmbh. Alemania
1
2
9
vidrio de 400 mL. Los 7 tratamientos fueron distribuidos de forma aleatoria en cada uno de los 4
bloques, de forma tal que cada tratamiento presentaba 4 repeticiones (Anexo 1).
A cada tratamiento se le asignó un número arábigo con el objetivo de facilitar el
procedimiento de asignación aleatoria de los químicos en los bloques (Cuadro 3).
Cuadro 3. Descripción de producto químico para cada tratamiento del bloque.
Tratamiento Descripción
1
Control
2
CaO 5%
3
CaO 15%
4
Ca(OH)2 5%
5
Ca(OH)2 15%
6
H2SO4 0,1%
7
H2SO4 0,3%
El número de muestras utilizadas para el estudio de las concentraciones de Map y CT fue
de 86, las que se determinaron de la siguiente forma: 7 tratamientos x 4 repeticiones x 3 tiempos
de muestreo (24, 48 y 72h) = 84 muestras + 1 muestra inicial purín sin contaminar (purín natural)
+ 1 muestra inicial purín inoculado con Map (purín contaminado) = 86.
La inclusión de coliformes totales para evaluar el efecto de los diferentes tratamientos, se
basó en el rol de éstos como bioindicadores de contaminación bacteriana en purín.
4.4 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS QUÍMICOS EN LA
SOBREVIDA DE Map
4.4.1 Detección de Map
Para evaluar el efecto de los compuestos químicos en la sobrevida de Map, las submuestras
de purín fueron procesadas de acuerdo a los protocolos para el cultivo de heces bovinas en el
sistema de cultivo líquido automatizado BACTEC MGIT 960 (Becton and Dickinson), según lo
indicado por el fabricante (Anexo 2).
4.4.1 Confirmación molecular
Los cultivos de las submuestras de purín informadas como positivas por el sistema
BACTEC MGIT se sometieron al proceso de extracción de ADN de acuerdo al protocolo
descrito por Salgado y col (2012) (Anexo 3), para luego ser confirmadas molecularmente
mediante la técnica de PCR tiempo real (Anexo 4).
10
4.4.3 Cuantificación de Map
Para estimar la concentración de Map en el purín se utilizaron los resultados de tiempo de
detección (TTD) entregados por el sistema de cultivo líquido BACTEC MGIT 960, previamente
estandarizado por Sung y col (2007) para la estimación de la cuantificación en UFC de Map. Éste
fue modificado por Salgado y col (2011) de acuerdo a las condiciones de laboratorio, para la
estimación del conteo bacteriano de Map. La cuantificación bacteriana del inóculo fue realizada de
acuerdo a la siguiente ecuación:
Log10 concentración bacteriana= span x e(-k xTTD) + plateau
Concentración bacteriana (log 10)
donde: “span” (8,034) es la diferencia entre el TTD a tiempo cero y el“plateau”, “e” es el logaritmo
natural, “k” (0,06852) es el grado de decaimiento de la concentración bacteriana (log10) y “plateau”
(0,9361) es el valor de la concentración bacteriana (log10) donde la curva alcanza el aplanamiento.
Las estimaciones para span, k, y plateau fueron obtenidos por aproximación de mínimos cuadrados
no lineales utilizando el software GraphPadPrism 4.03. Aunque ésta es una fórmula estándar, el
valor de TTD obtenidos desde el sistema de cultivo BACTEC MGIT 960 permite estimar la
concentración bacteriana de Map según los días de cultivo necesarios hasta la obtención de
resultados positivos (Figura 1).
10
8
6
4
2
0
0
20
40
60
TTD (días)
Figura 1. Relación entre la concentración bacteriana de la muestra y TTD obtenido a través del
sistema BACTEC MGIT 960.
4.5 EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LOS TRATAMIENTOS QUÍMICOS EN LA
SOBREVIDA DE CT
4.5.1 Detección de CT
Para determinar el efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de CT, las
submuestras de purín fueron procesadas a través de la utilización del medio de cultivo comercial
Petrifilm (3M). Cada submuestra de purín tratada con compuestos químicos fue agitada con el
instrumento vortex para homogenizar su contenido. Se sembró 1 mL de la submuestra a dilución
11
10-2 (diluciones seriadas), con el objeto de mejorar la lectura. La muestra sembrada se incubó a
37°C por 24 h para su lectura.
4.5.2 Cuantificación de CT
Para estimar la concentración de coliformes totales en el purín se realizó la lectura a través
del conteo de las colonias que crecieron en el medio de cultivo Petrifilm (3M). Los resultados
fueron expresados en UFC por mL de muestra. La no detección de coliformes se informó como
< 100 UFC/mL de muestra.
4.6 ANÁLISIS DE DATOS
Para la evaluación del efecto del tratamiento químico en la sobrevida de Map se utilizó
ANOVA para determinar diferencias significativas entre los diferentes tratamientos químicos en
la sobrevida de Map. Debido a que los datos no mostraron homocedasticidad y no se
distribuyeron normalmente, se utilizó la prueba de ANOVA de Kruskal-Wallis, seguido de la
prueba de comparaciones múltiple de Dunn.
Para determinar diferencias entre la carga de Map entre alguno de los tratamientos y el
control, se realizó la prueba de T.
Todos los análisis se realizaron usando el programa Statistix 8.0.
12
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL PURÍN POST-TRATAMIENTO
QUÍMICO
5.1.1 Peso y consistencia del purín
Las muestras de purín contaminadas con Map presentaron una disminución de peso a las
72 h de estudio. La mayor disminución de peso se registró para las muestras de purín tratado con
CaO y Ca(OH)2 al 15%, observándose una consistencia de tipo pastosa-granulada (Cuadro 1).
Cuadro 1. Peso en gramos y consistencia física de las submuestras de purín distribuidas en los 7
tratamientos a las 24, 48 y 72 h.
Submuestra
2
13
18
24
5
12
20
27
3
14
16
28
6
10
19
26
7
11
15
22
4
8
17
23
1
9
21
25
Tratamiento
Control
Control
Control
Control
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
24 h
48 h
72 h
Peso (g) Peso (g) Peso (g)
80,9
65,6
57,9
93,3
80,1
72,7
89,4
71,7
63,8
86,1
68,8
59,8
95,5
81,5
73,4
96,5
77,8
70
91,4
74,6
68,2
89,8
68
60,7
102,1
85,7
79,8
105
89,6
84,7
103,1
85,3
79,8
103,7
87,2
82,4
87,4
67,8
58,7
92,9
76,7
69,8
97,9
78
69,9
86,6
68,6
59,7
95,9
74,3
67,2
98,9
76
69,3
94,8
72,5
67,2
87,1
63,6
57
88,1
74,8
67,5
84,2
69,4
61,6
91,3
78,3
72,1
90,9
75,9
69,2
81,8
65,3
57,5
82,4
64,8
57,3
90,1
77,8
70,7
85,6
56,4
58,4
Consistencia
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Pastosa-granulada
Pastosa-granulada
Pastosa-granulada
Pastosa-granulada
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Pastosa-granulada
Pastosa-granulada
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
Líquida
13
5.1.2 pH del purín
Las muestras de purín contaminado con Map tratadas con ácido no mostraron diferencias
de pH con respecto a las muestras control. En forma paralela, los tratamientos químicos alcalinos
generaron un purín altamente básico a lo largo del estudio (Cuadro 2).
Cuadro 2. Resultados de medición de pH de las submuestras distribuidas en los 7 tratamientos a
las 24, 48 y 72 h.
Submuestra
2
13
18
24
5
12
20
27
3
14
16
28
6
10
19
26
7
11
15
22
4
8
17
23
1
9
21
25
Tratamiento 24 h 48 h 72 h
Control
8
8
8
Control
8
8
8
Control
8
8
8
Control
8
8
8
CaO 5%
12
12
12
CaO 5%
12
12
12
CaO 5%
12
12
12
CaO 5%
12
12
12
CaO 15%
12
12
12
CaO 15%
12
12
12
CaO 15%
12
12
12
CaO 15%
12
12
12
Ca(OH)2 5% 12
12
12
Ca(OH)2 5% 12
12
12
Ca(OH)2 5% 12
12
12
Ca(OH)2 5% 12
12
12
Ca(OH)2 15% 12
12
12
Ca(OH)2 15% 12
12
12
Ca(OH)2 15% 12
12
12
Ca(OH)2 15% 12
12
12
H2SO4 0,1%
8
8
8
H2SO4 0,1%
8
8
8
8
8
8
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
8
8
8
H2SO4 0,3%
8
8
8
H2SO4 0,3%
8
8
8
H2SO4 0,3%
8
8
8
H2SO4 0,3%
8
8
8
14
5.2 CARACTERIZACIÓN BACTERIOLÓGICA DEL PURÍN POST-TRATAMIENTO
QUÍMICO
5.2.1 Cuantificación de Map
La cuantificación bacteriana de Map según TTD y bacterias/mL en el purín contaminado
con Map previo al desafío químico fue de 10,65 días y 64.383 bacterias/mL respectivamente.
Posteriormente, el efecto del tratamiento químico sobre la sobrevida de Map en el purín mostró
diferencias en cuanto a dinámica de control. Se observó que el CaO al 15% controló en mayor
magnitud la sobrevida de Map en el purín y limitó su crecimiento hasta las 72 h; mientras que al
5% la sobrevida de Map resultó ser mayor. Si bien el Ca(OH)2 15% limitó en gran medida el
crecimiento bacteriano, las concentraciones de Map en estas muestras son mayores a las
presentadas con CaO. En cuanto a las muestras de purín tratadas con H2SO4, no mostraron efecto
alguno en la sobrevida de Map, siendo ésta muy cercana a la de las muestras control (Cuadro 3).
Cuadro 3. Estimación de la cuantificación de Map (bacterias/mL) a partir del TTD a las 24, 48 y
72 h por tratamiento en purín contaminado con Map.
Submuestra
Tratamiento
2
13
18
24
5
12
20
27
3
14
16
28
6
10
19
26
7
11
15
22
4
8
17
23
1
9
21
25
Control
Control
Control
Control
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
TTD
24 h
10,56
10,64
8,31
10,73
14,44
21,73
19,06
16,77
27,19
17,64
16,52
19,23
17,44
26,23
28,85
38,69
45,65
10,19
10,44
10,73
10,85
11,23
10,31
11,06
6,69
Bacterias/mL
24 h
68.034
64.778
303.566
61.320
8.376
561
1.296
3.036
0
152
0
0
2.162
3.360
1.223
2.334
185
112
32
19
85.660
73.265
61.320
57.025
45.485
79.442
50.291
1.037.433
TTD
48 h
12,16
12,41
12,16
12,16
19,74
12,16
21,62
21,74
24,03
20,45
20,53
40,87
24,24
12,83
12,28
10,69
12,2
12,66
12,28
12,24
12,16
Bacterias/mL
48 h
26.799
23.378
26.799
26.799
0
1.031
26.799
579
0
0
0
0
559
305
822
0
0
802
27
290
18.682
25.091
62.831
26.216
20.441
25.091
25.646
26.799
TTD
72 h
11,98
10,98
11,98
10,73
11,36
36,86
23,77
32,61
27,44
21,74
29,82
19,77
35,27
10,9
10,98
10,94
11,07
11,02
10,69
11,32
12,02
Bacterias/mL
72 h
29.611
52.746
29.611
61.320
0
42.158
38
325
63
0
145
0
559
95
0
0
1.021
45
0
0
55.335
52.756
54.023
49.993
51.502
62.831
43.152
28.958
15
5.2.2 Cuantificación de CT
En relación a la sobrevida de coliformes para cada tratamiento, se destaca que los
tratamientos ácidos no afectaron la viabilidad de CT a lo largo del experimento en las submuestras
de purín, observación que coincide con las submuestras control. Por el contrario, los tratamientos
básicos sí mostraron un significativo efecto sobre la sobrevida de estas bacterias eliminando su
presencia en las submuestras incluso hasta el tercer muestreo a las 72 h (Cuadro 4).
Cuadro 4. Cuantificación de CT en UFC/mL de las submuestras distribuidas en los 7
tratamientos a las 24, 48 y 72 h.
Submuestra
Tratamiento
2
13
18
24
5
12
20
27
3
14
16
28
6
10
19
26
7
11
15
22
4
8
17
23
1
9
21
25
Control
Control
Control
Control
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 5%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
CaO 15%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 5%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
Ca(OH)2 15%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,1%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
H2SO4 0,3%
24 h
(UFC/mL)
9600
7500
4000
6000
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
14400
9600
8000
6400
12800
9600
8000
4800
48 h
(UFC/mL)
8000
4800
7000
10400
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
6400
6000
7200
5200
8000
7600
9600
7600
72 h
(UFC/mL)
4300
4000
5200
5600
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
< 100
5200
6000
5600
6400
8000
6800
6000
9200
16
5.3 ANÁLISIS DE DATOS
5.3.1 Efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de Map
Los resultados de la cuantificación de Map en las submuestras de purín contaminado y
tratado químicamente fueron analizados estadísticamente a través de la prueba Kruskal Wallis,
mostrando una diferencia altamente significativa (P=0,0000) entre los tratamientos químicos
utilizados en el purín contaminado con Map. La prueba de Dunn usada como prueba de
comparaciones múltiples, indicó que la diferencia estadística entre tratamiento se justifica dada la
diferencia entre las medias de los recuentos bacterianos entre los tratamientos CaO 15% y
Ca(OH)2 15% versus H 2SO4 0,3% y control. A las 24 h y 48 h de tratamiento químico el CaO
15% muestra diferencia estadística versus el control y los restantes tratamientos químicos.
Mientras que a las 72 h sólo las submuestras control y las tratadas con ácido indican recuentos
bacterianos homogéneos, siendo éstos estadísticamente diferentes a los tratamientos con CaO y
Ca(OH)2, los que presentan resultados similares entre si. En relación con la carga de Map entre
tratamientos en base a CaO y Ca(OH)2 al 5 y 15% y el control, el análisis estadístico informa que
la diferencia de los recuentos bacterianos de ambos tratamientos versus las cargas de Map
obtenidas en el tratamiento control fueron estadísticamente diferentes (P ≤ 0,05).
5.3.2 Efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de CT
Los resultados del análisis de varianza al cual fueron sometidos los datos de los resultados
del estudio de tratamiento químico de purín, mostraron una diferencia altamente significativa
(P=0,0000) entre los tratamientos químicos utilizados en el purín con CT. La prueba de Dunn
usada como prueba de comparaciones múltiples, indicó que la diferencia estadística entre
tratamiento se justifica dada la diferencia entre las medias de los recuentos bacterianos entre los
tratamientos CaO 5 y 15% además de Ca(OH)2 5 y 15% versus H2SO4 0,3% y control.
17
6. DISCUSIÓN
En el presente estudio se determinó la viabilidad de Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (Map) en purín bovino de lechería, después del tratamiento con compuestos
químicos tales como CaO, Ca(OH)2 y H2S04. El purín usado en el desafío provenía de un predio
bovino lechero representativo de la región de Los Ríos. El análisis bacteriológico de éste antes de
su contaminación artificial con Map, evidenció presencia natural de la bacteria. Las muestras de
purín han demostrado ser un método útil y eficiente para determinar el estatus de infección del
rebaño, en donde la concentración de Map por mL del sustrato sugeriría una tasa alta de infección
del rebaño (Lombard y col 2006). Lo anterior no fue sorpresivo al considerar que las estimaciones
más bien conservadoras de la tasa de infección de Map a nivel de rebaño alcanzarían un 40% en el
sur de Chile (Van Schaik y col 2007). Con el objeto de garantizar un efecto objetivo de los
diferentes tratamientos químicos sobre la persistencia y viabilidad de Map, el purín fue
posteriormente contaminado de forma artificial con altas cargas de la micobacteria para forzar una
situación extrema. Si bien el inóculo de Map con el cual se contaminó el purín tenía una
concentración mínima estimada de 100 millones de bacterias/mL, se obtuvo menor carga en el
purín contaminado final después de su cultivo. Esto se podría deber primero a que la bacteria en
el purín experimentaría una disminución de su viabilidad por la presencia de inhibidores naturales,
para luego sufrir la acción de los decontaminantes y antibióticos utilizados en su cultivo. A pesar
de que la concentración bacteriana aumentó sólo 149 veces en el purín contaminado
artificialmente en relación al natural, se considera en vista de los resultados, que esta cantidad de
bacterias fue suficiente para apreciar de forma clara y consistente el efecto de los tratamientos
químicos en la sobrevida de Map. Además, se debe observar que los purines en nuestro país se
caracterizan por poseer un bajo porcentaje de MS (4%), lo que demuestra su alta dilución
principalmente en aguas lluvias y en aquellas provenientes de la limpieza de salas de ordeña y
patios de alimentación. Esto explicaría el menor recuento bacteriano obtenido en el purín final,
ajustándose eventualmente a las cargas de Map que se podrían encontrar en los purines
procedente de rebaños lecheros infectados.
Se consideró importante la evaluación de las características fisicoquímicas del purín antes y
después de la aplicación del tratamiento, con el objetivo de poder evaluarlos en su aplicación
práctica junto a su efecto en la sobrevida de Map. En relación a la consistencia del purín, se
observó cierto grado de solidificación en la totalidad de las submuestras tratadas con óxido de
calcio y en la mitad de las réplicas desafiadas con hidróxido de calcio al 15%, clasificándose dicha
consistencia como pastosa-granulada (Cuadro 1). Burton y Turner (2003), definen CaO como un
agente solidificante y deshidratador. Esto se debería a la reacción química entre este compuesto y
el agua presente en el purín, desde la cual el CaO extrae una molécula de H2 para la formación de
Ca(OH)2 1. Esta consistencia más sólida del purín podría solucionar algunos problemas actuales en
relación al uso de fertilizantes orgánicos, ya que aplicar un abono con mayor contenido de MS y
1
Fuente: http://agtgroup.cl/mining/doc/OverviewLimeSlakingProcess.pdf (consultado en enero 2012)
18
por ende más sólido, se traduciría en una fertilización más práctica y eficiente. Es decir, se lograría
minimizar la pérdida de nutrientes desde el purín al disminuir su escurrimiento hacia cursos de
aguas superficiales y al limitar la lixiviación. Se destaca también una menor pérdida de nitrógeno al
reducir su volatilización producida al fertilizar a través de sistemas de regadío de purines a altas
presiones. Por otro lado, se ha descrito que Map puede contaminar otras áreas a través de su
aerosolinización en la interfase agua-aire que se produce al propulsar estos purines a la pradera,
escenario que se ve agravado si los vientos favorecen dicha diseminación sobre la vegetación
expuesta a pastoreo de animales (Whittington y col 2005, Rowe y Grant 2006). El esparcimiento
de un purín más sólido y de mayor peso podría limitar el movimiento de patógenos, entre éstos
Map, y evitar también la contaminación de aquellas áreas destinadas a vivienda y recreación de
adultos y niños.
Dentro de las características fisicoquímicas del purín resulta relevante el análisis de los
valores de pH del purín en estudio, los que fueron consistentes con lo descrito por Salazar y col
(2007), en donde caracteriza a los purines del sur de Chile como ligeramente alcalinos (pH 7,7).
Los tratamientos químicos en base a cal aplicados al purín, formaron una mezcla altamente básica
que se mantuvo durante el período de estudio (Cuadro 2). Esta situación de extrema alcalinidad
del medio se propone como deseable de acuerdo con estudios de De Benedictus y col (2007), en
donde estos compuestos ejercen su efecto desinfectante al producir desnaturalización de las
proteínas que conforman la estructura de los microorganismos. Por otro lado, Katayama y col
(2001) proponen que la pared celular de Map expuesta a una fuerte alcalinización podría sufrir
cambios químicos por ejemplo, saponificación.
Por otra parte, la adición de compuestos alcalinos a los purines genera la liberación de
grandes cantidades de NH3, lo que se considera otra forma de desinfección asociada a pH elevado
en los purines (Burton y Turner 2003). Este compuesto es conocido por ser tóxico para humanos,
animales, plantas y microorganismos, e incluso se ha demostrado que tratamientos de purines y
desechos en base a NH3, resultan ser eficientes para inactivar ciertos virus, bacterias y parásitos
(Katayama y col 2001). En este sentido podría ser este compuesto el que ejerce efecto germicida
en el purín. Si bien este gas escapa al ambiente, podría afectar en alguna medida la persistencia de
Map en el purín, al actuar conjuntamente con los compuestos alcalinos adicionados.
El efecto de los tratamientos químicos sobre la viabilidad de Map mostró diferencias en
cuanto a compuesto, concentración y tiempo de exposición. El tratamiento ácido no afectó la
persistencia de la micobacteria, observándose iguales recuentos bacterianos entre el purín tratado
con ácido y las submuestras control (Cuadro 3). El pH ácido parece no afectar la sobrevida de la
bacteria demostrándose que en condiciones de terreno el pH ácido del suelo tiende incluso a
retener a Map favoreciendo su permanencia en las capas superficiales del suelo (Salgado y col
2011). En general, el efecto de los tratamientos alcalinos sobre la viabilidad de Map afectó la
sobrevida de la micobacteria posterior al desafío, produciéndose también un pH altamente básico
en el purín. Sin embargo, a diferencia de los coliformes, Map presentó mayor resistencia frente a
estos tratamientos, ya que necesitó de mayores concentraciones de compuesto químico para
evidenciar una disminución significativa y/o eliminación de las cargas de la bacteria presente en el
19
purín (Cuadro 3 y Cuadro 4). Esta diferencia puede radicar en las características morfológicas de
la pared celular de Map compuesta por una rica y gruesa capa de células lipídicas (60% lípidos),
además de la presencia de ácidos micólicos, peptidoglicanos y arabinoglicanos unidos de forma
covalente, que le confieren a la bacteria la propiedad de ser ácido-alcohol resistente, gran
hidrofobicidad y resistencia a la acción de compuestos químicos (Katayama y col 2001) y procesos
físicos (Grewal y col 2006). La gruesa pared es considerada como una ventaja en cuanto a
sobrevida de Map, pero al mismo tiempo implica un lento crecimiento bacteriano debido a que
restringe el ingreso de nutrientes a través de la pared. Todas estas características distinguen a Map
de otras bacterias y micobacterias (Rowe y Grant 2006).
Si bien el tratamiento en base a Ca(OH)2, no mostró ser el método más efectivo para
disminuir la viabilidad de Map en el purín, si logró un buen control del crecimiento microbiano
reduciendo de forma significativa la carga de la bacteria presente en el purín durante las primeras
24 h en comparación a las submuestras control de purín natural contaminado con Map (P ≤ 0,05).
Este efecto se mantuvo a las 48 h, sin embargo a las 72 h de estudio este tratamiento disminuyó
en forma considerable su eficiencia, ya que no mostró mayor control sobre la proliferación de la
micobacteria, obteniéndose concentraciones similares de Map entre las submuestras tratadas con
este químico y las control (Cuadro 3). Su rapidez, empero la corta duración de su efecto, podría
deberse a que Ca(OH)2 actúa de forma rápida al diluirse fácilmente en medio líquido quedando
disponible de forma inmediata para ejercer su efecto alcalinizante. Se describe también que este
químico es capaz de secuestrar dióxido de carbono y formar carbonato de calcio (CaCO3),
compuesto de limitado uso debido a su lenta capacidad de reacción, baja solubilidad en agua y que
tiende a decantar (Burton y Turner 2003). Si bien el Ca(OH)2 limitó en gran medida la sobrevida
de la bacteria, su eficacia fue menor en comparación a lo observado en el tratamiento con CaO
15% en el sentido de que éste requirió tan sólo 48 h para eliminar totalmente las cargas de Map del
purín. E incluso el mismo agente químico en menor concentración (5%) demostró también poder
controlar la persistencia de Map en el purín en relación a las submuestras control (P ≤ 0,05). Esto
se explicaría a que el CaO es un compuesto inestable, que al reaccionar junto a una molécula de
agua, libera energía en forma de calor lo que se conoce como reacción exotérmica; y es esta
interacción la que conlleva finalmente a la formación de Ca(OH)2 1. Esto es consistente con lo
estudiado por Maguire y col (2006), al demostrar que el CaO es más eficiente en reducir la
población bacteriana presente en estiércol de ave en comparación con Ca(OH)2, ambos en una
concentración de 5%, efecto fundamentado también debido a la reacción exotérmica producida
por el óxido al entrar en contacto con la humedad del material y que antecede a la formación de
Ca(OH)2 . Esto podría indicar que la utilización de CaO es más segura en cuanto a eliminar Map
presente en el purín a diferencia de su derivado, ya que su efecto bactericida implicaría en forma
conjunta el alza en la temperatura del sustrato debido a la reacción exotérmica y la elevación de
pH de éste a niveles altamente alcalinos.
1
Fuente: http://agtgroup.cl/mining/doc/OverviewLimeSlakingProcess.pdf (consultado en enero 2012)
20
Sin embargo, es interesante analizar que algunas submuestras tratadas con CaO y en las
cuales el químico ya en forma temprana parecía haber eliminado a Map completamente del purín,
se observó una reaparición de la bacteria al final del tratamiento, no obstante la concentración de
ésta fue baja (Cuadro 3). El hecho de que no se pudo detectar la presencia de la bacteria por 48
horas, sugiere que hubo muerte de Map en magnitud importante o bien que algunas células
bacterianas resistieron estando su número por debajo del límite de detección del sistema de
cultivo usado. Otra explicación posible sería que algunas bacterias sobrevivieron al tratamiento
químico, pero no eran posibles de cultivar debido a condiciones fisicoquímicas severas y/o
competición microbiana (Grewal y col 2006). La confirmación de Map viables se debería hacer
demostrando ARN detectable. Demostrar la viabilidad de la bacteria es insuficiente para evaluar el
riesgo de que Map sea reintroducido a las poblaciones de animales susceptibles a través de purín
contaminado en las praderas. Existen estudios acerca de la sobrevida de Map en leche destinada a
consumo humano después de haber sido tratada con pasteurización, indicando que la bacteria
puede tolerar temperaturas más altas que 60°C. De lo anterior, se desprende la necesidad de
revisar los límites de detección de Map con los sistemas convencionales de diagnóstico, lo que
sería un factor limitante en estudios como el presente que evalúan la sobrevida de la bacteria
después de algún tipo de tratamiento para eliminar o disminuir su concertación (Stabel 2000).
Otra corriente explicativa sugiere que algunas cepas podrían haber resistido el efecto del
químico durante dos días de tratamiento sin ser detectadas dado por ciertas tácticas de
persistencia de Map frente a condiciones medioambientales adversas. Se ha descrito que en
circunstancias de estrés ambiental caracterizadas por privación de nutrientes e hipoxia, la
micobacteria puede sobrevivir por largo tiempo en el suelo, ambientes acuáticos y hospederos
(Lamont y col 2012), gracias al desarrollo de un estado de no replicación e inactividad atribuido a
bacterias no formadoras de esporas conocido como “Dormancy”. Este mecanismo de
persistencia en el ambiente es reversible y está programado genéticamente a través de la expresión
de ciertos genes que codificaban para proteínas específicas y que protegerían a Map frente a
condiciones ambientales adversas de estrés nutricional y/o oxidativo (Whittington y col 2004).
Otro mecanismo de resistencia utilizado por Map es la posibilidad de interactuar y/o ser ingerida
por parte de microorganismos ambientales, como protozoos y microbios que son ubicuitarios en
el ambiente, y que podrían brindar protección frente a la acción de desinfectantes químicos
(Whittington y col 2005). Por otro lado, Lamont y col (2012) lograron aislar y caracterizar
estructuras morfológicas similares a esporas obtenidas a través del cultivo de Map en agar de
esporulación, en donde se demostró que la bacteria fue capaz de crecer y esporular. También se
observó que estas formas esporuladas de Map lograron resistir la acción de temperaturas de hasta
70˚C, presencia de lisozima y proteinasa K. Estos resultados indicarían que factores ambientales
que involucran limitaciones nutricionales y de humedad, temperatura, hipoxia y/o competencia
microbiana podrían ser causa suficiente para generar la esporulación de Map. En este sentido,
estos factores en forma conjunta o individual, pueden haberse generado en el purín tratado con
CaO 15%, lo que podría explicar la reaparición de Map a las 72 h de estudio en la mitad de las
réplicas tratadas con este químico.
21
El efecto de los tratamientos químicos en el purín fue evaluado sobre coliformes totales
como bioreferencia del efecto germinicida. Los coliformes totales corresponden a un grupo de
enterobacterias integradas por Escherichia coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp, y Citrobacter spp, las
cuales se presentan en elevado número en el material fecal de humanos y animales, a pesar de que
no todos son de origen fecal (Campos 1999). Las dos primeras son comúnmente utilizadas como
indicadores de contaminación fecal en la evaluación de calidad de aguas, debido a que el análisis
de agentes patógenos de riesgo para la salud humana es de alto costo y difícil de practicar
(Campos 1999). De igual forma se ha descrito su utilización como bioindicadores en estudios
sobre tratamientos de aguas servidas a través de procesos térmicos de digestión aerobia y
anaerobia. Su presencia en el purín ha servido de la misma forma para evaluar los tratamientos
químicos en la sobrevida de Map. El aislamiento y cuantificación de coliformes totales se realizó
en medio de cultivo comercial Petrifilm, el que presenta las ventajas de no requerir preparación,
reducir los tiempos de incubación y el espacio en estufas de incubación. Además no es necesaria la
confirmación de colonias y permite informar un recuento de coliformes totales en UFC,
características que confirman su función bioindicadora.
Los tratamientos alcalinos en base a CaO y Ca(OH)2 mostraron ser muy efectivos al
eliminar los coliformes totales presentes en el purín, destacando su acción rápida y letal sobre
estas bacterias, no observándose crecimiento posterior de colonias (Cuadro 4). Esto es consistente
con lo planteado por Heinonen-Tanski (2005), cuyo estudio demuestra que en purines de ganado
(2,9% MS) incluso una baja dosis de 7,5 g/L de Ca(OH)2 disminuye la carga de coliformes hasta
bajo los límites de detección (10 UFC/g) en sólo 24 h.
En el caso de los tratamientos con H2SO4, su inclusión se justificó como tratamiento
control ácido sobre CT y Map. El tratamiento ácido no mostró efecto alguno en la sobrevida de
coliformes totales, indicando ser ineficiente para el control de estos patógenos en purines (Cuadro
4). Sólo se describe el uso de H2SO4 en forma granulada en la crianza de aves como enmienda del
desecho derivado de esta producción, para disminuir los niveles de amonio emanados debido a su
acción reductora de poblaciones microbianas.
22
6.1 CONCLUSIONES
Se demostró que los tratamientos en base a cal generaron un purín altamente alcalino (pH
12), redujeron las cargas de Map y eliminaron los coliformes totales presentes en el purín de
lechería. El tratamiento en base a CaO al 15% mostró un efecto significativo en la sobrevida de
Map en comparación a las submuestras control y disminuyó la concentración de la bacteria hasta
bajo los niveles de detección para el sistema de cultivo utilizado (1-10 bacterias/mL).
Se podría sugerir entonces la utilización de compuestos en base a cal como óxido de calcio
en concentración del 15% para el tratamiento de purines de lechería. Esto con el propósito por un
lado, de aprovechar las ventajas en relación a la aplicación de purines como fertilizante orgánico
en las praderas y por otro lado, para limitar la diseminación hacia el medio ambiente de agentes
patógenos de riesgo para salud de los animales y el ser humano.
Aunque a nivel experimental, el presente estudio muestra evidencia interesante en relación
con el control de bacterias patógenas de transmisión fecal-oral como Map en purín de lechería
bovina, el tratamiento químico en base a cal podría disminuir o detener la diseminación y
sobrevida de la bacteria en purines y desde ahí al medio ambiente pratense. Esta información
debería tenerse en cuenta para futuros planes de manejo y control de la infección en poblaciones
animales susceptibles.
23
7. REFERENCIAS
Bagge E. 2009. Hygiene Aspects of the Biogas Process with Emphasis on Spore-Forming
Bacteria. Doctoral Thesis, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Swedish University
of Agricultural Sciences, Sweden.
Burton CH, C Turner. 2003. Treatment strategies for sustainable agriculture. In: Burton CH,
Turner C (eds). 2ª ed. Silsoe Research Institute, Bedford, UK, Pp 189-205.
Campos C. 1999. Indicadores de contaminación fecal en la reutilización de aguas residuales para
riego agrícola. Tesis doctoral, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona, España.
De Benedictis P, MS Beato, I Capua. 2007. Inactivation of avian influenza viruses by chemical
agents and physical conditions: a review. Zoonoses Public Health 54, 51-68.
Grewal SK, S Rajeev, S Sreevatsan, FC Michel. 2006. Persistente of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis and other zoonotic pathogens during simulated composting, manure packing, and
liquid storage of dairy manure. Appl Environm Microbiol 72, 565-574.
Haas B, R Böhm, D Strauch. 1995. Inactivation of viruses in liquid manure. Rev sci tech Off int Epiz
14, 435-445.
Heinonen-Tanski H, Antola S, Weppling K. 2005. Hydrated lime and Velox rapidly reduce enteric
micro-organisms in manure. In: Bernal P, Moral R, Clemente R, Paredes C (eds). Sustainable
Organic Waste Management for Environmental Protection and Food Safety. Murcia, España Pp 33-36.
Katayama N, C Tanaka, T Fujita, T Suzuki, S Watanabe, S Suzuki. 2001. Effect of silage
fermentation and ammonia treatment on activity of M. avium subsp. paratuberculosis. Grass Sci 47,
296-299.
Lamont EA, JP Bannantine, A Armién, DS Ariyakumar, S Sreevatsan. 2012. Identification and
Characterization of a Spore-Like Morphotype in Chronically Starved Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis Cultures. XI Congreso Paratuberculosis, Sydney, Australia, Pp 257-258.
Lombard JE, BA Wagner, RL Smith, BJ MCluskey, BN Harris, JB Payeur, FB Garry, MD Salman.
2006. Evaluation of environmental sampling and culture to determine Mycobacterium avium
subspecies paratuberculosis distribution and herd infection status on US dairy operations. J Dairy Sci
89, 4163-4171.
Lovell R, M Levi, J Francis. 1944. Studies on the survival of Johne’s bacilli. J Comp Pathol 54, 120129.
24
Maguire RO, D Hesterberg, A Gernat, K Anderson, M Wineland, J Grimes. 2006. Liming Poultry
Manures to Decrease Soluble Phosphorus and Suppress the Bacteria Population. J Environ Qual
35, 849-857.
Manning EJ, MT Collins. 2001. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: pathogen, pathogenesis
and diagnosis. Rev Sci Tech Off Int Epizoot 20, 133-150.
Pain B, H Menzi. 2003. Glossary of terms on livestock manure management. In: Pain B, Menzi H
(eds). Ramiran. Swiss College of Agriculture, Zollikofen Switzerland, Pp 1-5.
Pell AN. 1997. Manure and microbes: public and animal health problem?. J Dairy Sci 80, 26732681.
Rowe RT, IR Grant. 2006. Mycobacterium avium ssp. Paratuberculosis and its potential survival tactics.
Letters in Applied Microbiology 42, 305-311.
Sahlström L. 2006. Recycled Biowaste as a Source of Infection. Doctoral thesis, Faculty of
Veterinary Medicine and Animal Science, Swedish University of Agricultural Sciences, Sweden.
Salazar F, JC Dumont, D Chadwick, R Saldaña, M Santana. 2007. Caracterización de purines de
lecherías en el Sur de Chile. Agricultura Técnica Chile 67, 155-162.
Salgado M, MT Collins, F Salazar, J Kruze, G Bölske, R. Söderlund, R Juste, IA Sevilla, F Biet, F
Troncoso, M Alfaro. 2011. Fate of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis after Application of
Contaminated Dairy Cattle Manure to Agricultural Soils. Applied and Environmental Microbiology 77,
2122-2129.
Salgado M, P Castillo, P Zamorano. 2012. Accurate estimation of the analytical sensitivity o an
automated broth culture and a Real-Time PCR system on the detection and confirmation of
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). Proceedings 11th International Colloquium on
Paratuberculosis, Sidney, Australia, Pp 66-67.
Stabel J R. 2000. Johne’s disease and milk: do consumers need to worry? J Dairy Sci 83, 1659-1663.
Sung JS, JH Han, EJB Manning, MT Collins.2007. Rapid and Reliable Method for Quantification
of Mycobacterium paratuberculosisby Use of the BACTEC MGIT 960 System. J Clin Microbiol 45,
1941-1948.
Van Schaik G, F Haro, A Mella, J Kruze. 2007. Bayesian analysis to validate a commercial ELISA
to detect paratuberculosis in dairy herds of southern Chile. Preventiva Veterinary Medicine, Chile.
Whittington RJ, DJ Marshall, PJ Nicholls, IB Marsh, LA Reddacliff. 2004. Survival and Dormancy
of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis in the Environment. Applied and Environmental
Microbiology 70, 2989-3004.
Whittington RJ, IB Marsh, LA Reddacliff. 2005. Survival of Mycobacterium avium subsp.
Paratuberculosis in Dam Water and Sediment. Applied and Environmental Microbiology 70, 5304-5308.
25
8. ANEXOS
ANEXO 1
DISEÑO DE BLOQUES AL AZAR
Tratamiento
Descripción
1
Control
2
CaO 5%
3
CaO 15%
4
Ca(OH)2 5%
5
Ca(OH)2 15%
6
H2SO4 0,1%
7
H2SO4 0,3%
ANEXO 2
El sistema de cultivo considera un protocolo de 3 días de acuerdo a la siguiente
descripción:
ƒ
Día 1. Recepción de la muestra y su codificación
En una cámara de flujo laminar, se pesaron 3 g del purín contaminado en estudio, se
adicionaron a un tubo de centrifugación de 50 mL estéril que contiene 17,5 mL de agua
destilada estéril y se dejó reposar por 30 min. Desde esta suspensión bacteriana, se tomó una
alícuota de 2,5 mL y se transfirió de forma aséptica a un tubo de 50 mL que contenía una
26
solución de 2,5 mL de extracto de levadura1 al 15% y 0,2 mL de piruvato de sodio2 al 2%. El
tubo se agitó en instrumento vortex durante 10 s y se incubó por 90 min a 35-37°C. El objetivo
de este primer paso fue germinar esporas bacterianas y levaduras que conforman la flora
contaminante de la muestra. Con el objeto de lograr la descontaminación de la flora
contaminante de la muestra, se vertió la solución anterior (5,2 mL) a un tubo estéril que
contenía 25 mL de solución estéril de infusión cerebro-corazón 3 al 0,9%, cloruro de hexadecil
piridinio (HPC)4 y 0,3 mL de una solución estéril de verde malaquita5 al 5%. Se agitó el tubo
brevemente y se incubó durante 18-24 horas a 35-37°C.
ƒ
Día 2.
Con el objeto de concentrar la carga bacteriana de la muestra, se agitó el tubo del día 1
brevemente en instrumento vortex y se centrifugó por 30 min a 900 g. De forma rápida y suave se
eliminó el sobrenadante dejando el sedimento café-negruzco en el fondo del tubo.
Posteriormente, se adicionó 1 mL de una infusión antibiótica (VAN cocktail) al sedimento, la que
fue preparada con 40 µL de Caldo de solución de Vancomicina HCL6, 40 µL de Caldo de solución
de Ácido Nalixídico7 y 25 µL Caldo de solución de Anfotericina B8 mezclados en 10 mL de Caldo
Cerebro Corazón. El sedimento fue homogenizado con la solución antibiótica realizando un
enjuague por aspiración y eliminación del contenido con la puntilla de la pipeta automática. La
suspensión se incubó durante 12-18 h a 35-37°C para producir una descontaminación adicional.
De forma paralela, se preparó un cóctel de aditivo nutritivo y antibacteriano (yema de huevo9,
micobactina J, VAN cocktail) para suplementar cada tubo MGIT con 1,5 mL de éste. Los tubos
de medio MGIT ParaTB suplementados se dejaron en la cámara de seguridad durante la noche
(18-24h) a temperatura ambiente para permitir que la yema de huevo se equilibre con el medio de
cultivo.
ƒ
Día 3. Siembra de las muestras de materia fecal
Se mezcló la suspensión de cada muestra preparada el día 2 y se inoculó 0,1 mL en cada
tubo MGIT medio Para TB10. Cada tubo MGIT inoculado fue introducido en el equipo MGIT
960 e incubado a 37°C por 49 días o hasta que el instrumento muestre señales positivas.
ANEXO 3
Brevemente, éste consiste en que los tubos MGIT fueron invertidos tres veces con la
finalidad de mezclar el contenido, para luego someterlos por un par de segundos a agitación con
11
BD Bacto® Yeast Extract, Becton, Dickinson and Company, USA.
Sodium pyruvate, SIGMA-ALDRICH®, Japón.
3 BD BBL Brain Heart Infusion, Becton, Dickinson and Company, USA.
4 Hexadecylpyridinium chloride monohtdrate, SIGMA-ALDRICH®, Japón.
5
Verde de malaquita oxalato, Merck Egaa, Alemania.
6 Vancomycin hydrochloride, SIGMA-ALDRICH®, China.
7 Nalidixic Acid, SIGMA-ALDRICH®, Italia.
8 Amphotericin B, SIGMA-ALDRICH®, Israel.
9
BD Difco Egg Yolk Enrichment 50%, Becton, Dickinson and Company, USA.
10
DB BACTEC MGIT Para TB Medium, Becton, Dickinson and Company, USA.
2
27
el instrumento vortex. Desde el medio del tubo se transfirió en forma aséptica una alícuota de 200
µl a un tubo Eppendorf de 1,5 mL, el cual se centrifugó a 5000 g durante 5 min. El sobrenadante
obtenido de cada tubo se desechó, y éste se secó apoyando la boca del tubo sobre un papel
secante para remover el líquido remanente. El sedimento fue disuelto con 500 µl de solución
buffer (2 mM EDTA, 400 mM NaCl, 10 mM Tris-HCL pH 8.0, 0.6% SDS) y 2 µl de proteinasa
K1 (10 µg/µL) realizando un enjuague mediante breve aspiración y eliminación del contenido con
la puntilla de la pipeta automática. Después el contenido se transfirió a un tubo de agitación “bead
beating”, que contenía 200 µL de esferas de zirconia-silica2. Los tubos fueron incubados a 56ºC
por 2 h. Luego éstos fueron agitados a 3.200 rpm por 60 s en el instrumento de disrupción
mecánica para la ruptura de pared celular, tras lo cual se dejaron reposar en hielo por 10 min. Se
realizó una centrifugación a 5000 g por 30 s con el objetivo de remover la espuma y esferas de las
paredes internas del tubo. Posteriormente, las muestras se agitaron por un par de segundos en el
instrumento vortex para asegurar que ningún trozo de ADN adherido a partículas pequeñas, se
pierda cuando el lisado haya sido transferido. Todo el contenido del tubo de “bead beating” fue
extraído y colocado en tubos Eppendorf de centrifugación de 1,5 mL, y se añadió 500 µL de
etanol al 100%. Los tubos se dejaron reposar por 2 min, para luego ser sometidos nuevamente a
agitación con vortex por 5 s y se centrifugaron a 16.000 g por 7 min. El sedimento resultante fue
lavado en 200 µL de etanol al 70% se centrifugó por 16.000 g por 7 min. Se eliminó el
sobrenadante y el tubo se dejó secar a temperatura ambiente por 10 min para luego agregar 50 µl
de agua estéril destilada. Finalmente, el tubo fue colocado en una platina termorregulada a 100°C
durante por 5 min y se centrifugó a 16.000 g por 30 s. Del sobrenadante se tomaron 25 µL a un
nuevo tubo Eppendorf y se almacenó como templado de ADN a -20°C hasta su procesamiento
en la PCR.
ANEXO 4
Para la confirmación del cultivo positivo, se utilizó un sistema de PCR en tiempo real,
cuyo blanco fue el gen IS900. La mezcla de PCR para cada reacción (20 μL), está compuesta por
5 μL ADN templado, 10 μL del MasterMix del kit TaqMan Universal3, 0,5 μL (0,1 μM) de sonda,
0,5 μL (0,2 μM) cebador (F) y 0,5 μL (0,2 μM) de cebador (R) y 3,5 μL de agua, con el objetivo de
obtener un “amplicon” de 63 nucleótidos del gen IS900. La reacción de PCR se llevó a cabo en el
termociclador LightCycler (ROCHE) 2.0 bajo las siguientes condiciones estándar: un ciclo a 95 °C
por 10 min (denaturación), 45 ciclos (amplificación) con dos pasos de 95 °C por 10 s, 60 °C por
30 s y 72 °C por 1 s, con posterior enfriamiento a 40°C por 30 s. Se incluyeron controles
negativos y positivos (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ATCC 19698) en la PCR, como
también controles positivos y negativos durante el proceso de extracción del ADN.
Proteinasa K, US Biological, USA.
Beads. Bio Spec Products, USA.
3 Kit LightCycler® 480 Probes Master, ROCHE, Alemania.
1
2
28
9. AGRADECIMIENTOS
A Consorcio Lechero chileno por el apoyo económico brindado para la realización de este
estudio.
A INIA Remehue por su activa colaboración y apoyo entregado durante la ejecución de
este proyecto. En especial a Marta Alfaro y Francisco Salazar, por su profesionalismo y constante
ayuda.
A mi profesor patrocinante, Dr. Miguel Salgado, quien dedicó parte importante de su
tiempo a la entrega de conocimientos sobre nuestra profesión, la ciencia y la vida. Gracias por su
constante apoyo, buena voluntad, carisma, profesionalismo y entusiasmo, los que generaron en mi
gran motivación a la hora de trabajar en este interesante y novedoso estudio. Sus enseñazas son
una valiosa herramienta para la vida.
A mis padres, por darme la oportunidad de ser Médico Veterinario y apoyarme siempre,
como bien se dice: “en las buenas y en las malas!”. A mis hermanas y toda mi familia, quienes
fueron pieza fundamental en mi crecimiento y también en la realización de esta memoria de título.
A mis buenos amigos Brigitte, Constanza, Paola y Gonzalo, por su incondicional apoyo,
buenos consejos, amistad y compañerismo.
A mis amigas y camaradas de la Corporación Estudiantil “Mädchenschaft Amankay
Valdivia” por haberme acompañado y apoyado en este camino a través de la universidad; fueron,
son y seguirán siendo una parte muy importante en mi vida.