Informe Final TO-06-2009 - INSN Instituto Nacional de Salud

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DEL NIÑO
DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR β-LACTAMASAS DE EXPECTRO
EXTENDIDO EN E. coli y K. pneumoniae AISLADAS EN EL INSTITUTO NACIONAL
DE SALUD DEL NIÑO
LIMA-PERU
2015
RESUMEN
El objetivo del estudio fue detectar y caracterizar molecularmente las β-lactamasas de espectro
extendido en E. coli y K. pneumoniae aisladas en el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN).
Se incluyeron un total de 1198 enterobacterias de muestras de pacientes hospitalizados y
comunitarios. Finalmente se consideraron para el análisis 724 Escherichia coli y 181 Klebsiella
pneumoniae de aislamientos consecutivos no repetidos; recuperados entre los meses de agosto
de 2012 a enero del 2013.
Las pruebas de sensibilidad se realizaron mediante la técnica de disco difusión, de acuerdo a
los criterios del "Clinical and Laboratory Standards Institute" (CLSI) (2013). El ensayo fenotípico
para la detección de BLEE se realizó utilizando el método de Jarlier. Detección de genes BLEE
se realizó mediante PCR, para las familias más ampliamente diseminadas.
El 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias fueron productoras de BLEE.
Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K. pneumoniae el
40,9% (74/181) fueron productores de BLEE. A través del método genotípico se analizaron tres
familias de genes productores de BLEE, Los genes involucrados fueron el gen blaCTX-M (91,1%:
256/281), el gen blaSHV (45,5%: 128/281) y el gen blaTEM (44,4%: 125/281).
En conclusión de los 905 aislamientos de E. coli y K. pneumoniae recuperadas en el INSN que
ingresaron al estudio, el 28,6 % de E. coli y el 40,9% de K. pneumoniae presentan producción
de BLEE indicando que este es el principal mecanismo de resistencia a los betalactamicos
presentado por E. coli y K. pneumoniae en el INSN, y refuerzan la necesidad de revisar las
medidas de control de la infección en la institución.
Palabras clave: β-lactamasas de espectro extendido, E. coli y K. pneumoniae.
6
INTRODUCCIÓN
Uno de los grupos de antibióticos más importantes, tanto histórica como clínicamente, es el
grupo de los ß-lactámicos. Este
incluye a las penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas ,
carbapenemas y monobactámicos, entre otros antibióticos 1.
La resistencia bioquímica a los antibióticos β-lactámicos se puede atribuir a cuatro mecanismos
diferentes: ya sea inactivación enzimática de la droga, alteración del sitio blanco, incapacidad
de la droga de alcanzar su sitio blanco debido a modificación de las porinas a nivel de la pared
celular y eflujo de la droga una vez que ingresa. El mecanismo más utilizado por los bacilos
Gram negativos para adquirir resistencia a penicilinas y β-lactámicos en general, ya sea que
esto ocurra de manera natural o adquirida, es la inactivación de las drogas por las enzimas βlactamasas, que abren el anillo de las penicilinas y demás β-lactámicos entre los átomos de C y
N para formar compuestos inactivos 2.
Las β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) son derivadas a partir de mutaciones
puntuales de las β-lactamasas de espectro ampliado (BLEA) TEM-1, TEM-2 y SHV-117, aunque
existen otras familias de BLEE, como las tipos CTX-M y PER que tienen orígenes diferentes y
una escasa relación estructural con las TEM y SHV3.
La movilización y estabilización de genes de resistencia a antibióticos ha sido conducida por los
mecanismos de transferencia horizontal de la información genética, principalmente a través de
la conjugación. La transferencia de ADN mediante conjugación, esta mediada por plásmidos
conjugativos, que contienen toda la información genética necesaria para promover su propia
transferencia4,5.
La aparición de bacterias productoras de BLEE tiene importantes repercusiones clínicas y
terapéuticas: a) la mayoría de los aislamientos tienen codificada la resistencia en plásmidos que
pueden ser transferidos a otros microorganismos, b) son causantes de brotes en instituciones
de salud, c) aumentan la morbimortalidad nosocomial y d) limitan las opciones terapéuticas,
incrementándose el uso de antibióticos costosos como el imipenem 6. Los microorganismos que
más comúnmente sintetizan BLEE son: Klebsiella spp. y E. coli, pero también se han detectado
7
en: Salmonella spp., Proteus spp., Citrobacter spp., Morganella morganni, Serratia marcescens,
Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginos y, Burkholderia cepacia 7.
En el caso de Perú, muy pocos estudios han reportado el problema de las BLEE. Una excepción son los estudios de Morales et al, quienes reportaron la presencia de BLEE tipo TEM-10 y
SHV-5 en aislamientos de K. pneumoniae y E. coli en dos hospitales generales de Lima8 y el
trabajo de Calderon et al., quienes identificaron cepas BLEE SHV-5 en K. pneumoniae y E.
cloacae en una UCI neonatal9.
Otro problema adicional relacionado con la detección de BLEE en el laboratorio es la presencia
de cepas de BGN que producen betalactamasas de tipo Amp C. Estas son enzimas de carácter
de Cefalosporinasas, clasificadas en el grupo 1 (Clase molecular C), estas no son inhibidas por
los inhibidores de betalactamasas (Ac. Clavulanico, sulbactan y tazobactan) originalmente
descritas como de origen cromosomal y con síntesis inducible, pero ahora parecen codificadas
por genes plasmidiales 3.
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) publicó unas directrices para detectar y
confirmar la producción de BLEE en K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli. La gran diversidad de
BLEE obliga a los laboratorios a estar preparados para detectar los diferentes tipos de
resistencia, lo que permitiría que se adopten rápidamente las medidas de control.
Los estudios epidemiológicos pueden comenzar a determinar las relaciones de los aislamientos
bacterianos con técnicas basadas en el fenotipo, como biotipificación y patrones de resistencia
a los antibióticos, pero estos métodos han sido reemplazados por técnicas moleculares.
Actualmente existen técnicas para la tipificación molecular de bacterias, como son electroforesis
en gel con campo pulsado (PFGE), PCR-RFLP y PCR-RT; estas técnicas son utilizadas en
epidemiología molecular y actualmente son consideradas como técnicas para la tipificación
molecular de microorganismos 1.
Se desconoce la prevalencia real de la BLEE sobre todo en poblaciones pediátricas. Por eso los
efectos de no identificar la producción de BLEE por bacilos gran negativos pueden resultar en
un fracaso del tratamiento, debido a una dosificación inapropiada de los antibióticos de espectro
8
extendido seguido de un incremento de la tasa de morbimortalidad y de los costos que implica
el tratamiento y la estancia hospitalaria.
Por este motivo se desarrolla esta investigación en el Instituto de Salud del Niño para poder
determinar los tipos de genes prevalentes a fin de dirigir más conscientemente el arsenal
terapéutico utilizado y prevenir la diseminación de los microorganismos multirresistentes en la
población pediátrica de nuestro hospital.
9
OBJETIVOS
General
Detectar y caracterizar molecularmente las β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y K.
pneumoniae aisladas en el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN).
Específicos
1. Caracterizar los genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y
K. pneumoniae provenientes de pacientes hospitalizados en el Instituto Nacional de
Salud del Niño.
2. Caracterizar los genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido en E. coli y
K. pneumoniae provenientes de pacientes de la comunidad en el Instituto Nacional de
Salud del Niño.
3. Evaluar el perfil de susceptibilidad antimicrobiana de los aislamientos considerados
probables productores de β-lactamasas de espectro extendido.
10
I.
MARCO TEÓRICO
IMPORTANCIA CLÍNICA DE LAS ENTEROBACTERIAS
Esta familia incluye especies que son patógenas y otras comensales, estables o transitorias
que pueden producir infecciones oportunistas. Estas infecciones pueden darse siempre que
existan factores predisponentes locales: lesiones sobre las barreras físicas constituidas por
la piel y las mucosas como heridas, quemaduras, catéteres o las fisiológicas del árbol
respiratorio (intubación), vía urinaria (sondas), vía genital (dispositivos intrauterinos); así
como factores generales inespecíficas principalmente fagocitosis y la respuesta inmune del
huésped que puede estar disminuida por una enfermedad de base.10
Las enterobacterias son el grupo de microorganismos que frecuentemente se aísla en los
laboratorios clínicos de microbiología, produciendo infecciones tanto en pacientes
inmunocompetentes como en inmunodeprimidos y pueden ser adquiridos en la comunidad
como en ambientes hospitalarios. Producen una gran variedad de enfermedades en el ser
humano, como el 30% de las septicemias, más del 70% de las infecciones del tracto urinario
(ITU) y las infecciones intestinales. Algunas enterobacterias son parte de la flora intestinal
normal, pueden producir infecciones oportunistas, entre los más frecuentes figuran:
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Serratia
marcescens. Mientras que otros géneros siempre se asocian a enfermedades, por presentar
factores moleculares de patogenicidad, pudiendo causar infecciones en personas
previamente sanas sin factores predisponentes, estas bacterias son: Shigella, Samonella,
Yersinia y Escherichia coli (especies patógenas). 11
La E. coli es el principal microorganismo anaerobio facultativo que reside en el intestino
grueso y forma parte de la flora normal, asimismo es aislado con mayor frecuencia como
agente causal de infecciones de las vías urinarias, heridas, neumonías, meningitis y
septicemia tanto en las infecciones comunitarias como las adquiridas en el ambiente
hospitalario. Las mujeres son más propensas a sufrir infecciones del tracto urinario a una
edad más temprana debido a diferencias en la estructura anatómica, la madurac ión sexual,
las alteraciones que se producen durante el embarazo y el parto. 12
El género Klebsiella recibió ese nombre en honor a Edwin Klebs y la especie que se aísla
con mayor frecuencia es la Klebsiella pneumoniae. Se encuentra en las heces de los
individuos sanos (5 a 10%) y es con frecuencia un invasor secundario del aparato
11
respiratorio de personas con enfermedad pulmonar crónica. Como otras enterobacterias
oportunistas, K. pneumoniae puede ocasionar infecciones en aproximadamente el 3% de
todas las neumonías bacterianas agudas y es el segundo patógeno más común del tracto
urinario. También puede causar infecciones de heridas. Es la segunda especie después de
E. coli causante de bacteriemia por gram negativos. Forman una cápsula y por esta razón
producen colonias grandes y húmedas, frecuentemente muy mucosas. 12
ANTIBIÓTICOS β-LACTÁMICOS
Los β-lactámicos son un grupo de antibióticos de origen natural o semisintético que se
caracterizan por poseer en su estructura un anillo β-lactámico tetragonal, esencial para su
actividad antibacteriana. Actúan inhibiendo la última etapa de la síntesis de la pared celular
bacteriana, impidiendo la transpeptidación y el entrecruzamiento de las cadenas de
peptidoglicano. Constituyen la familia más numerosa de antimicrobianos y la más utilizada
en la práctica clínica. Son compuestos de acción bactericida lenta, relativamente
independiente de la concentración plasmática, que presentan escasa toxicidad y poseen un
amplio margen terapéutico. Su espectro se ha ido ampliando a lo largo de los años por la
incorporación de nuevas moléculas con mayor actividad frente a los gram negativos; pero la
progresiva aparición de resistencias adquiridas ha limitado su uso empírico y su eficacia en
algunas situaciones. 13
CLASIFICACIÓN
El espectro de los β-lactámicos incluye bacterias gram positivas, gram negativas. No son
activos sobre el Micoplasma porque estos carecen de pared celular. 13,14
Se pueden clasificar en los siguientes grupos:
 Penicilinas: penicilina, amoxicilina, ticarcilina y piperacilina
 Cefalosporinas:
1ra generación: cefalotina, cefazolina, cefalexina, cefradina
2da generación: cefaclor, cefuroxima
3ra generación: cefpodoxima, cefoperazona, cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima
4ta generación: cefepime
12
5ta generación: ceftobiprol, ceftarolina
 Monobactámicos: aztreonam
 Carbapenémicos: imipenem y meropenem
PENICILINAS
El primer miembro de los β-lactámicos, la penicilina se obtuvo en 1928 de una cepa del
género Penicillium notatum. Están formadas por un núcleo químico común, denominado
ácido 6-aminopenicilánico
(6-APA o núcleo penam), constituido por 3 partes: Un anillo
betalactámico, un anillo tiazolidínico y una cadena lateral unida en posición 6.
Las penicilinas constituyen el grupo de antibióticos más usados y mejor tolerados. Se
caracterizan por tener una buena distribución en el organismo, baja toxicidad y actividad
bactericida. La utilidad de esta penicilina natural, bencilpenicilina (penicilina G), está en
función de su espectro antibacteriano relativamente reducido; cocos gram positivos,
espiroquetas y algunos organismos gram negativos (Neisseria).13,15
6
1
CEFALOSPORINAS
En 1945 se aisló el primer antimicrobiano cefalosporínico de cultivos del hongo
Cephalosporium acremoniumal que se le denominó cefalosporina C. Las cefalosporinas son
fármacos estructuralmente similares a las penicilinas, cuya estructura básica está constituida
13
por un núcleo central llamado ácido 7-aminocefalosporínico (7-ACA o núcleo cefem)
constituido por la fusión de dos anillos: un anillo betalactámico y un anillo dihidrotiazínico. La
introducción de modificaciones en las cadenas laterales origina las diversas cefalosporinas.
Son antibióticos de amplio espectro, muy eficaces y poco tóxicos, pero que deben ser
cuidadosamente seleccionados para prevenir el desarrollo de resistencia bacteriana. 13,16
1
7
7-ACA
Dentro de este grupo también se incluye las cefamicinas (cefoxitin, cefotetan) que derivan de
especies de Streptomyces, la cefamicina resulta de la adición de un grupo metoxi a C7, lo
cual aumenta su actividad contra bacterias anaerobias. La más conocida es la cefoxitina
que deriva de la cefamicina C.
CARBAPENÉMICOS
Los carbapenémicos son los de mayor relevancia clínica. Difieren de las penicilinas por
presentar una sustitución de un átomo de carbono por uno de azufre en posición C1, y por la
adición de un doble enlace entre los átomos 2 y 3 del anillo pentagonal de la penicilina. Esto
les confiere mayor afinidad por las proteínas ligadoras de penicilina (PLP), mayor potencia y
un espectro antibacteriano más amplio.
Los
carbapenémicos derivan del antibiótico natural tienamicina producido por el
Streptomyces catleya descubierto en 1976, a partir del cual se ha desarrollado el imipenem,
meropenem, ertapenem y doripenem.
El primer
derivado que se utilizó, el imipenem, tiene un espectro bacteriano
excepcionalmente amplio; se une con extraordinaria afinidad a la PBP2, por ello su acción
14
antimicrobiana conduce a la producción de células bacterianas esféricas que se lisan con
rapidez y facilidad. 14,15-17
MONOBACTÁMICOS
Los
monobactámicos
fueron
descubiertos
el año 1981, éstos
son antibióticos
estructuralmente relacionados con los β-lactámicos, pero con una configuración monocíclica.
El término deriva de Monocyclic Bacterially produced Betalactam, lo que indica que los
primeros fueron de origen natural, obtenidos a partir de bacterias procedentes del suelo
tanto gram positivas (Nocardia), como gram negativas (Acetobacter, Chromobacterium y
Gluconobacter). Aunque estos compuestos tienen una débil actividad antibacteriana, la
simplicidad de su estructura permitió sintetizar su núcleo estructural, adicionándole diversos
radicales, lo que permitió obtener más de un millar de derivados semisintéticos y sintéticos
con disímiles propiedades farmacológicas.
El primer monobactámico introducido en la clínica fue el aztreonam, obtenido por síntesis. El
espectro de este antibiótico (bacterias gram negativas aerobias y anaerobias facultativas,
incluyendo enterobacterias, P. aeruginosa, Haemophilus y Neisseria) es similar a los
15
aminoglucósidos; pero, a diferencia de ellos, no es nefrotóxico ni ortotóxico es débilmente
inmunogénico y no se ha asociado a coagulopatías, por lo cual representa una alternativa a
los aminoglucósidos.
El aztreonam es muy estable a la hidrólisis de la β-lactamasa bacteriana y además presenta
una cierta especificidad por las PBP-3, proteína que interviene en la división bacteriana.15
INHIBIDORES DE LAS β-LACTAMASAS (IBL)
Los IBL deben atravesar los canales porínicos de la pared celular bacteriana y alcanzar
concentraciones adecuadas en el espacio periplásmico de los bacilos gram negativos,
donde se encuentra la β-lactamasa. Según su mecanismo de acción se distinguen dos tipos
de IBL:
 Inhibidores reversibles: Se unen a las β-lactamasas, pero no la destruyen y pueden
disociarse de ella, perdiendo eficacia a medida que su concentración disminuye.
 Inhibidores irreversibles: Se unen a la β-lactamasa, alterándola y destruyendo su
actividad en forma permanente, la enzima queda modificada químicamente de forma
definitiva, mientras que el IBL sufre un proceso de autodegradación.
El inhibidor se une a la β-lactamasa impidiendo que el β-lactámico sea destruido, dejando
al antibiótico activo y libre para que ejerza su efecto. Los IBL disponibles son ácido
clavulánico, sulbactam y tazobactam. 17
16
MECANISMO DE ACCIÓN DE LOS β-LACTÁMICOS
Los antibióticos β-lactámicos son agentes bactericidas que inhiben la síntesis de la pared
celular bacteriana e inducen un efecto autolítico. La destrucción de la pared celular
bacteriana se produce como consecuencia de la inhibición de la última etapa de la síntesis
del peptidoglicano. El peptidoglicano está constituido por largas cadenas de glúcidos,
formadas por la repetición de moléculas de ácido N-acetil murámico y N-acetilglucosamina.
El ácido murámico fija cadenas de péptidos que se unen entre sí para formar una malla. Los
β-lactámicos inhiben precisamente esta unión o transpeptidación, última etapa de la síntesis
de la pared celular. De este modo, la pared queda debilitada y puede romperse por la
presión osmótica intracelular. Para que actúe los betalactámicos es necesario que la
bacteria se halle en fase de multiplicación, donde se sintetiza la pared celular. Los βlactámicos también actúan activando una autolisina bacteriana endógena que destruye el
peptidoglicano.18,19
RESISTENCIA BACTERIANA
Las enterobacterias pueden generar resistencia bacteriana, capacidad que tienen los
microorganismos para evadir la acción de los antimicrobianos. Esta resistencia ha
aumentado en los últimos años, representando un problema de salud pública cada vez más
importante.
La era antibiótica moderna se inició hace más de 80 años con el descubrimiento de la
penicilina y otras sustancias similares, capaces de eliminar las bacterias. Tras los primeros y
extraordinarios resultados la humanidad concibió la idea de eliminar las enfermedades
infecciosas; pero la frecuente prescripción inadecuada, automedicación
y expendio de
antimicrobianos sin receta médica ha generado la selección de mutantes resistentes en el
ambiente hospitalario y en la comunidad, ocasionando fracaso terapéutico en el tratamiento
de diversas enfermedades infecciosas, siendo uno de los principales problemas en todo el
mundo, en particular en países de África, Asia y América Latina. 20,21
17
TIPOS DE RESISTENCIA
A. Resistencia Natural
También conocida como resistencia intrínseca, característica natural de determinados
grupos de bacterias, siendo especie o género específica, demuestra el espectro natural del
antibiótico. Esto puede ayudar a la identificación del microorganismo según el fenotipo
presentado en la prueba de sensibilidad. Ejemplo: Enterococcus resistente a cefalosporinas
y Klebsiella resistente a la ampicilina.19,20
B. Resistencia Adquirida
Las bacterias adquieren resistencia por diferentes mecanismos genéticos:
 Por mutación durante el proceso de replicación donde puede ocurrir errores que
modifican la secuencia de la codificación del ADN, consecuentemente, la alteración
de la información contenida en el ADN original.
 Por transferencia de ADN mediante la conjugación, transducción y transformación. 20
(Figura 1)
Figura 1. Principales mecanismos de intercambio genético bacteriano:
Transformación, Conjugación y Transducción.
Fuente: (Adaptado de Moreno C, et al.2009)
18
MECANISMOS DE RESISTENCIA
Las bacterias pueden desarrollar mecanismos de resistencia que impiden al antibiótico
ejercer su mecanismo de acción, esto le permite gran capacidad de adaptación. Los
mecanismos de resistencia de las bacterias son fundamentalmente tres:
Modificaciones en el sitio blanco
Los antibióticos se ligan a sitios específicos en la bacteria. Si este sitio fuera alterado, el
antibiótico no puede ligarse y se torna ineficiente contra la bacteria. Esta alteración es físicoquímica, disminuye la afinidad de la droga por el lugar y hace que haya pérdida de la
actividad antimicrobiana. Existen diversas estrategias para alcanzar este objetivo como las
modificaciones en el gen que codifica el blanco del antibiótico, ejemplo alteraciones de las
PBP (proteína ligadora de penicilina) de Streptococcus pneumoniae que confiere resistencia
a penicilina e incluso a ceftriaxona; la adquisición de genes que codifiquen para sustitutos de
los blancos originales, como PBP2 en Staphylococcusspp. meticilinorresistentes o la
dihidrofolato reductasa alternativa en las cepas resistentes a trimetoprim.
Trastornos de la permeabilidad
A. Alteraciones de las membranas bacterianas
La alteración en la expresión de los canales de porinas modifica la penetración y la
consecuente acción de diferentes antibióticos. Se considera que los niveles de resistencia
alcanzados no suelen ser suficientes como para conferir resistencia absoluta a un
antibiótico. La ocurrencia simultánea de este mecanismo unido a otro, por ejemplo a la
hidrólisis enzimática, sí puede conferir altos niveles de resistencia y ocasionar fallos
terapéuticos.
B. Eflujo activo de antibióticos
Propiedad deexpulsar activamente los antibióticos fuera de la célula, contribuyendo a una
disminución de la concentración inadecuada de la droga y consecuentementesu acción noefectiva (bomba de eflujo), éste es un mecanismo inespecífico, que afecta a diferentes
grupos de antibióticos como β-lactámicos, quinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol.
19
Inactivación enzimática
Mecanismo bastante frecuente relacionado con la producción de diferentes enzimas. Ciertas
bacterias producen enzimas que neutralizan el antibiótico o sus efectos antimicrobianos.
Principal mecanismo de inactivación es la hidrólisis, como sucede con las β-lactamasas y
los β-lactámicos, pero también pueden ocurrir modificaciones no hidrolíticas tales como las
acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones inactivantes de aminoglucósidos. 21
β-LACTAMASAS
Las β-lactamasas son enzimas que inactivan los antibióticos β-lactámicos al hidrolizar el
anillo β-lactámico de los mismos. La mayoría de β-lactamasas inactivan ya sea penicilinas o
cefalosporinas; pero algunas son capaces de inactivar ambos tipos de antibióticos. La
mayoría de bacterias gram positivas secretan sus β-lactamasas, que inactivan los agentes
antimicrobianos β-lactámicos extracelularmente, en el medio que las rodea. En contraste, las
β-lactamasas de las bacterias gram negativas permanecen dentro de la célula e inactivan
los β-lactámicos en el espacio periplásmico, esto es, en el espacio entre la membrana
externa y la membrana citoplasmática.18
El número de β-lactamasas actualmente descrito es sumamente elevado, incrementándose
de
manera
continua,
se
han
caracterizado
más
de
1000
β-lactamasas
(http://www.lahey.org/studies/webt.htm), las familias de los genes más comunes dentro de
las enterobacterias son: blaTEM, blaSHV, blaCTX-M.22
CLASIFICACIÓN DE LAS β-LACTAMASAS
Actualmente se encuentran en uso dos esquemas de clasificación: la clasificación de Ambler
basada en la estructura molecular, distingue cuatro clases de β-lactamasas en función de
sus secuencias aminoacídicas. Las clases A, C y Dson serina β -lactamasas y la clase B
metalo-β-lactamasas dependientes de zinc. Por su parte, la clasificación de Bush-Jacoby,
modelo funcional, separa las β-lactamasas en función de los sustratos que hidroliza y de
sus perfiles de inhibición, distingue tres categorías y múltiples subgrupos: grupo 1 (clase C
de Ambler) cefalosporinasas, grupo 2 (clases A y D de Ambler) representan el mayor grupo
de β-lactamasas y el grupo 3 (clase B de Ambler) corresponden a las metalo-β-lactamasas.
20
La case A de Ambler y el grupo 2 de Bush comprenden a las BLEE, siendo descritas las
enzimas tipo TEM, SHV y CTX. La clase B de Ambler y el grupo 3 de Bush incluyen a las
metalo- β-lactamasas, que requieren del metal zinc como cofactor, los genes codificantes
están localizados en cromosomas o plásmidos. La clase C de Ambler y el grupo 1 de Bush,
incluye un grupo de β-lactamasas tipo AmpC encontradas en algunos
negativos. La case D de Ambler y grupo 2d de Bush, incluye
bacilos gram
BLEE tipo OXA, el
comportamiento de estas enzimas es variable y son difíciles de detectar por los métodos de
rutina en el laboratorio, estas enzimas resultan frecuentemente en gram negativos como
Acinetobacter spp.23 La clasificación de las β-lactamasas se resume en la Tabla 1.
21
Tabla 1. Clasificación de β -lactamasas de Bush, Jacoby
BushJacoby
Grupo
2009
Clase
molecular
Ambler
Sustrato
1
C
Cefalosporinas
1e
C
Cefalosporinas
2ª
A
Penicilinas
Si
2b
A
Penicilinas, cefalosporinas
Si
TEM-1,TEM-2,SHV-1
2be*
A
Cefalosporinas de espectro extendido,
monobactámicos
Si
TEM-3,SHV-2,CTX-M15,PER-1,VEB-1
2br
A
Penicilinas
2ber
A
Cefalosporinas de espectro extendido,
monobactámicos
2c
A
Carbenicilina
Si
2ce
A
Carbenicilina
Si
2d
D
Cloxacilina
2de
D
Cefalosporinas de espectro extendido,
2df
D
Carbapenémicos
2e
A
Cefalosporinas de espectro extendido
2f
A
Carbapenémicos
3ª
B
Carbapenémicos
Si
3b
B
Carbapenémicos
Si
Inhibidor
Enzima representativa
AC
Fuente: (Bush, Jacoby et al.2010)
EDTA
ACT-1,CMY-2,FOX-1,MIR-1
GC1, CMY-37
PC1
TEM-30,SHV-10
TEM-50
PSE-1,CARB-3
RTG-4
OXA-1,OXA-10
OXA-11,OXA-15
OXA-23,OXA-48
Si
CepA
KPC-2,IMI-1,SME-1
IMP-1,VIM-1,SME-1
L1,CAU-1,GOB-1,FEZ-1
23
AC: Acido Clavulánico (Inhibidor de β-lactamasas), * β-lactamasas de espectro extendido
22
β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
La presencia de mutaciones en los genes que codifican las β-lactamasas clásicas (blaTEM,blaTEM-2, blaSHV-1), dieron lugar a las llamadas β-lactamasas de espectro extendido (BLEE)
1
que pertenecen al subgrupo 2be de la clasificación de Bush y Jacoby.23
Las BLEE son enzimas codificadas por plásmidos, capaces de hidrolizar las penicilinas,
cefalosporinas de primera, segunda, tercera, cuarta generación y los monobactámicos, pero
no las cefamicinas (cefoxitina) ni carbapenémicos (imipenem, meropenem y ertapenem).
Pueden ser inhibidas por el ácido clavulánico u otros inhibidores de β-lactamasas como el
tazobactam y el sulbactam.
Las cepas productoras de BLEE, en su mayoría son enterobacterias, con mayor frecuencia
Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli, pero también se ha identificado en otras especies
de bacilos gram negativos como Pseudomonas aeruginosa. 24,25
A las BLEE tipo TEM y SHV se les ha unido las enzimas BLEE tipo CTX-M, detectado por
primera vez a finales de 1980 en los aislados clínicos de la familia Enterobacteriaceae en
Europa y Argentina. Desde mediados de la década de 1990 la aparición de enzimas CTX-M
se ha observado en varias partes del mundo, incluyendo Europa, América del Norte,
América del sur, Asia y África, estas enzimas actúan hidrolizando las oximino-cefalosporinas
preferentemente cefotaxima.9
Actualmente se han identificado al menos 223 β-lactamasas tipo TEM, 191 enzimas tipo
SHV y 166 enzimas tipo CTX-M (http://www.lahey.org/studies/webt.htm). Junto con las
variantes de BLEE tipo TEM y SHV las β-lactamasas tipo CTX-M son reconocidos como uno
de los más importantes BLEE adquiridos en la propagación de enterobacterias en todo el
mundo. La mayoría de las cepas productoras de enzimas tipo CTX-M han sido implicadas
en las infecciones nosocomiales y en infecciones adquiridas en la comunidad. 22,26
La aparición de las BLEE ha dificultado enormemente el tratamiento antibiótico de
numerosas infecciones bacterianas porque presentan resistencia a la gran mayoría de los
β-lactámicos y altas tasas de resistencias a los antimicrobianos de otras familias. Estas
bacterias resistentes pueden transmitir los genes de resistencia por transferencia horizontal,
intercambio de plásmidos, generando así un problema terapéutico.
2, 27-29
23
ELEMENTOS GÉNÉTICOS INVOLUCRADOS EN LA DISEMINACIÓN DE RESISTENCIA
Es importante tener un mejor conocimiento de los elementos génicos móviles que facilitan la
difusión de los genes bla y otros genes de resistencia asociados, porque el problema se
complica cuando ocurre la transmisión de genes que codifican estas enzimas a otras
enterobacterias.30
La resistencia se transmite entre bacterias de la misma especie y entre especies y géneros
diferentes, esta transferencia puede ser vertical (ocurre cuando un organismo recibe material
genético de sus ancestros, es decir de células madre a células hijas) y horizontal (proceso
en el que un organismo transfiere material genético a otra célula que no es descendiente
mediante bacteriófagos, plásmidos o transposones).
PLÁSMIDOS
Los plásmidos son moléculas extra-cromosomales de ADN de doble cadena que presentan
la capacidad de replicación. Pueden ser transferidos por conjugación mediante el pili que
asocia la bacteria donadora y receptora. La transferencia puede darse entre bacterias de la
misma especie o entre distintas especies y géneros. Esto los convierte en excelentes
herramientas para la diseminación de resistencias. En general los plásmidos, codifican para
más de un mecanismo de resistencia. Esto determina que en un evento de transferencia, la
bacteria receptora adquiera todos los mecanismos de resistencia que se presenta en dicho
plásmido.30,31
TRANSPOSONES
Los transposones conocidos como genes saltarines son fragmentos de ADN capaces de
movilizarse de un lugar a otro en el ADN, por transposición. A diferencia de los plásmidos los
transposones no son autoreplicantes, deben mantenerse dentro de una estructura para
replicarse. Existen diversos tipos de transposones, pero las dos principales características
que los diferencian de otros elementos génicos móviles son la presencia de secuencias
repetidas e invertidas en sus extremos y la presencia de repeticiones directas que flanquean
el transposon. Por ejemplo un transposón puede desprenderse de un plásmido e integrarse
al cromosoma bacteriano y viceversa. Este mecanismo da la posibilidad, por ejemplo, que
mecanismos de resistencia cromosómica que no son transferibles pasen a un plásmido y a
través de este a otra bacteria. 30,32
24
INTEGRONES
Los integrones fueron descritos por primera vez por Stokes y Hall en 1989, son estructuras
genéticas capaces de capturar y movilizar genes de resistencia a los antibióticos. No
presentan autonomía de movimiento, se encuentran frecuentemente como parte de
transposones que pueden localizarse en el cromosoma o plásmidos conjugativos, que sirven
como vehículos para su transmisión. Estas estructuras son responsables de la diseminación
horizontal de la resistencia bacteriana. Constan de tres regiones, dos invariables y una
central variable, que porta el cassette. Existen clases de integrones según la secuencia de
la integrasa (int), los más estudiados son las clases 1,2 y 3. Por la diversidad de integrasas
se ha realizado una nueva clasificación: Integrones de resistencia a antibióticos e integrones
presentes en el cromosoma bacteriano.30, 32-34
CASSETTES
Los cassettes constituyen un grupo diverso de pequeños elementos móviles que incluyen un
gen que puede codificar resistencia a los antimicrobianos.
Los cassettes génicos pueden existir tanto en su forma libre circular o integrada a un sitio.
Solamente cuando están integrados los cassettes génicos son considerados formalmente
parte de un integrón.
Codifican genes de resistencia a múltiples antibióticos como los -lactámicos y los
aminoglucósidos
también genes
relacionados
a la
resistencia a trimetoprima y
32,34
cloranfenicol.
25
DETECCIÓN FENOTÍPICA DE β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
Método de screening para detección de BLEE según CLSI*2013
En esta prueba se busca la disminución de los halos de inhibición en los discos de
screening: cefpodoxima (10 µg), ceftazidima (30 µg), aztreonam (30 µg), cefotaxima (30 µg)
y ceftriaxona (30 µg) que permitan sospechar la presencia de BLEE en E. coli y K.
pneumoniae, K. oxytoca y P. mirabilis. Se considera sospechoso de BLEE, cuando la cepa
presenta halos de inhibición iguales o inferiores a los diámetros referidos en la Tabla 2, para
al menos uno de los antibióticos.35
Tabla 2. Diámetros críticos de screening para la detección de β-lactamasas de
espectro extendido CLSI* 2013
E. coli, K.oxytoca y K. pneumoniae
Cefpodoxima
10 mg
<=17 mm
Ceftazidima
30 mg
<=22 mm
Aztreonam
30 mg
<=27 mm
Cefotaxima
30 mg
<=27 mm
Ceftriaxona
30 mg
<=25 mm
P. mirabilis
Cefpodoxima
10 mg
<=22 mm
Ceftazidima
30 mg
<=22 mm
Cefotaxima
30 mg
<=27 mm
*Clinical and Laboratory Standards Institute
Prueba confirmatoria BLEE-CLSI (Método Americano)
Este método confirmatorio emplea discos de ceftazidima (30 µg) y cefotaxima (30 µg) con y
sin ácido clavulánico (10 µg), este último es un inhibidor de las BLEE. Una diferencia mayor
o igual a 5 mm de los diámetros de los halos de inhibición entre los discos de ceftazidimaácido clavulánico (30/10 µg) y ceftazidima solo o cefotaxima-ácido clavulánico (30/10 µg) y
cefotaxima es interpretada como resultado positivo.35
26
Prueba confirmatoria BLEE – Método de Jarlier (Comité de la Sociedad Francesa de
Microbiología)
Conocido como prueba de sinergia del doble disco porque está basado en la sinergia entre
las cefalosporinas de espectro extendido o los monobactámicos y el disco de
amoxicilina/ácido clavulánico (20/10 µg).
Los discos de ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg) ycefepime (30 µg) se disponen a 20
mm del disco de amoxicilina/ácido clavulánico (distancia de centro a centro de los discos). Si
una imagen de sinergia aparece entre el disco amoxicilina/clavulánico y cualquiera de los
cuatro antibióticos probados se toma como evidencia de la producción de BLEE, de lo
contrario se le considera prueba negativa.36,37
DETECCIÓN GENOTÍPICA DE β-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO
Para ello se puede emplear la amplificación del gen codificante por Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR). El método de amplificación de DNA a través de la técnica de PCR,
consiste en el diseño de indicadores (primers) que son secuencias de oligonucleótidos. Los
“primers” pueden ser desarrollados para hibridizar en regiones especificas de DNA molde,
siendo estas amplificadas por la enzima Taq polimerasa, generando un producto
denominado amplicón. Este producto es visualizado en gel de agarosa después de ser
sometido a electroforesis. La técnica de PCR permite la detección de genes específicos
responsables de la producción de las BLEE conforme lo descrito en diversos estudios.38,39
27
MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio observacional sobre la presencia de enterobacterias productoras de
BLEE en muestras de pacientes del Instituto Nacional de Salud del Niño (Lima, Perú) entre
los meses de agosto de 2012 a enero del 2013.
TIPO DE INVESTIGACIÓN
Se realizó un estudio descriptivo, prospectivo, de corte transversal.
POBLACIÓN
Fueron consideradas las muestras con solicitud de cultivos que llegaron al laboratorio de
microbiología del Instituto Nacional de Salud del Niño durante el periodo de estudio.
MUESTRA
Se incluyeron un total de 1198 enterobacterias de muestras de pacientes hospitalizados y
comunitarios. Finalmente se consideraron para el análisis 724 Escherichia coli y 181
Klebsiella pneumoniae de aislamientos consecutivos no repetidos.
PLAN DE PROCEDIMIENTOS
Estudio Microbiológico
Aislamiento primario
Los aislamientos E. coli y K. pneumoniae fueron obtenidas según procedimiento estándar de
cultivos, procedentes de los diferentes servicios que llegaron al laboratorio de microbiología
del INSN. El personal calificado realizó el aislamiento primario, la diferenciación bioquímica
para la identificación bacteriana y la susceptibilidad antibiótica como parte de la rutina de
diagnóstico.
Identificación bacteriana
Para la reactivación de los aislados, se sembraron por dispersión y agotamiento en el medio
MacConkey, incubándolos a 35 °C por 18 a 24 horas, luego se procedió a la identificación
con las pruebas bioquímicas convencionales Triple Sugar Iron (TSI), Lisina Hierro Agar
28
(LIA), Sulfuro Indol Movilidad (SIM) y Citrato de Simons. Fueron conservadas en caldo
tripticasa de soya (TSB) con glicerol al 20%y almacenadas en criobox a – 20ºC hasta su
procesamiento.
Detección de fenotipo BLEE
La determinación de la producción de BLEE se realizó mediante
el método de Jarlier
(método de sinergia del doble disco), se utilizó una placa de Agar MuellerHinton (MH) y se
inoculó con una suspensión bacteriana de 0,5McFarland, sobre ella se colocaron discos de
susceptibilidad antimicrobiana (Oxoid): ceftazidima (30 µg), cefotaxima (30 µg) y cefepime
(30 µg) a 20 mm de centro a centro de un disco central de amoxicilina/ácido clavulánico
(20/10 µg) (Figura 2), esta placa se incubó a 35°C por 18-24h, posteriormente se realizó la
lectura. La presencia de BLEE se manifestó por el efecto sinérgico entre el inhibidor y los
discos de antimicrobianos. 37
Adicionalmente se realizó pruebas de susceptibilidad mediante el método de Kirby Bauer,
siguiendo los lineamientos del CLSI 2013, para ello se utilizaron discos de ciprofloxacina (5
µg), nitrofurantoina (300 µg), gentamicina (10 µg), amikacina (30 µg), cefoxitina (30 µg),
sulfametoxazol/trimetoprim (23,75/1,25 µg), cloranfenicol (30 µg), imipenem (10 µg) y
meropenem (10 µg).35
Control de calidad de discos
Antes de realizar la prueba de susceptibilidad de disco difusión se realizó el control de los
discos utilizando una cepa de E. coli ATCC 25922, presentando halos de inhibición cuyos
valores ingresaban en el rango establecido por el CLSI 2013. También se realizó un control
del método para la detección de BLEE utilizando una cepa de K. pneumoniae ATCC 700603
productora de BLEE.
29
Figura 2.Representación esquemática de las distancias entre discos por el método de Jarlier (20
mm de centro a centro), sustratos y el inhibidor para la detección fenotípica de aislamientos
productores de -lactamasas. CAZ: ceftazidima; CTX: cefotaxima; FEP: cefepime; AMC:
amoxicilina/ácido clavulánico.
FEP
30mg
20 mm
20 mm
AMC
20/10mg
CAZ
30mg
20 mm
CTX
30mg
Detección genotípica de las β-lactamasas de espectro extendido
Se realizó en el Laboratorio de Epidemiologia Molecular y Genética del Instituto de Medicina
Tropical “Daniel A. Carrión” de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Mayor
de San Marcos.
Obtención de DNA total
A partir de cultivos de 24 horas de los microorganismos en estudio, se resuspendió de 3 a 4
colonias en 200 μL de agua Milli-Q estéril. Se sometieron a ebullición durante 15 minutos y
se centrifugó durante 2 minutos a una velocidad de 12 000 r.p.m. para descartar los restos
celulares. Se conservó el sobrenadante a -20C.
30
Detección de la presencia de genes codificantes de BLEE tipo CTX-M
Primer utilizados en la amplificación por PCR del gen blaCTX-M
Secuencia de Primer (5’
3’)
Target
Primer
blaCTX-M
CTX-M-F
TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA
CTX-M-R
CGATATCGTTGGTGGTGCCAT
Tamaño de
producto
593pb
Primers utilizados en la amplificación por PCR de los genes blaSHV y blaTEM
Target
blaSHV
blaTEM
Primer
Secuencia de Primer (5’
3’)
Tamaño de
producto
SHV-F
CGCCTGTGTATTATCTCCCT
SHV-R
CGAGTAGTCCACCAGATCCT
TEM-F
CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC
TEM-R
CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
294bp
800bp
31
Amplificación por PCR del gen blaCTX-M
Mezcla de reacción:
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
Buffer 10x (libre de MgCl2)
VOLUMEN
2,50mL
MgCl2
50 mM
1,00mL
dNTPs
10 mM
0,75mL
CTX-M-F
10mM
0,50mL
CTX-M-R
10 mM
0,50mL
DNA*
2,50mL
Agua milliQ estéril
16,80mL
Taq
5U/mL
0,20mL
El ADN bacteriano se agrega en el área de extracción
Parámetros de amplificación
Protocolo PCR
Tº C
Tiempo
Denaturación inicial
94º C
7 minutos
Denaturación
94º C
50 segundos
Hibridación
52º C
50 segundos
Extensión
72º C
1 minuto
Extensión final
72º C
5 minuto
35 ciclos
32
Amplificación por PCR genes blaSHV y blaTEM
Mezcla de reacción:
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
Buffer 10x (libre de MgCl2)
VOLUMEN
2,50mL
MgCl2
50 mM
1,00mL
dNTPs
10 mM
0,75mL
SHV-F
10mM
1,00mL
SHV-R
10 mM
1,00mL
TEM-F
10mM
1,00mL
TEM-R
10 mM
1,00mL
DNA*
2,00mL
Agua milliQ estéril
14,55mL
Taq
5U/mL
0,20mL
El ADN bacteriano se agrega en el área de extracción
Parámetros de amplificación
Protocolo PCR
Tº C
Tiempo
Denaturación inicial
94º C
5 minutos
Denaturación
94º C
40 segundos
Hibridación
62º C
40 segundos
Extensión
72º C
1 minuto
Extensión final
72º C
5 minuto
35 ciclos
33
Electroforesis
Los productos de amplificación fueron resueltos por electroforesis en agarosa al 1,5% en
buffer TAE 1X, por calor. Para cargar en cada pocillo se mezcló 9 μL de cada producto con 1
μL de buffer de muestra y se sembró todo el volumen en el gel. El Ladder se agrega en una
canaleta para compararlo a la migración de los productos obtenidos.
Las condiciones de corrida: tiempo: 45 minutos, voltaje: 100V, buffer de corrida: TAE 1X
Coloración
Terminada la corrida los geles son teñidos con bromuro de etidio (0,5μg/mL) por 10 minutos,
luego se decolora en agua PCR y posteriormente son colocadas al transiluminador para su
lectura e interpretación.
ANÁLISIS DE DATOS
Se realizó un estudio descriptivo univariado de cada una de las muestras en estudio,
clasificándolas en productoras o no productoras de β-lactamasas de acuerdo a la familia de
genes involucrados. Para la determinación de los porcentajes de resistencia y sensibilidad
antimicrobiana de las distintas especies de enterobacterias en estudio, los datos obtenidos
fueron introducidos en Microsoft Excel 2010 y en el programa WHONET (World Health
Organization Net Versión 5.6), programa estadístico utilizado por la Organización
Panamericana de la Salud para la vigilancia de la resistencia bacteriana, que permitió
analizar datos epidemiológicos y las características del germen en estudio.
34
RESULTADOS
Descripción general de la muestra estudiada
Se identificaron un total de 1198 enterobacterias provenientes de las diferentes muestras
con solicitud de cultivos. El 63,5% (761/1198) de las muestras provenían de pacientes de
comunidad y el 36,5% (437/1198) de muestras provenientes de pacientes hospitalizados. De
los comunitarios el 64,9% (494/761) fueron E. coli y el 8,8% (66/761) fueron K. pneumoniae.
De los hospitalizados el 52,6% (230/437) fueron E. coli y el 26,3% (115/437) fueron K.
pneumoniae.
Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de BLEE
El 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias fueron productoras de
BLEE. Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K.
pneumoniae el 40,9% (74/181) fueron productores de BLEE.
BLEE en los aislamientos comunitarios
De los aislamientos recuperados de muestras comunitarias; el 27,3% (135/494) fueron E.
coli productoras de BLEE y el 28,7% (19/66) fueron K. pneumoniae productora de BLEE.
Además el 3,7% (5/135) de las E. coli productoras de BLEE también producían
β–
lactamasa tipo AmpC y el 5,2% (1/19) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también
producían β–lactamasa tipo AmpC.
De los aislamientos comunitarios, estos provenían de Consultorio Externo 77,2% (E. coli
104/154; K. pneumoniae 15/154); Emergencia 12,4% (E. coli 19/154); Servicio bajo tarifario
diferenciado 10,4% (E. coli 12/154; K. pneumoniae 4/154). Todos los aislamientos
comunitarios fueron recuperados de muestras de orina.
Las Enterobacterias productoras de BLEE aisladas de muestras comunitarias, categorizadas
de acuerdo al grupo etario y género, se observó lo siguiente: 50,6% (78/154) lactantes;
14,3% (22/154) prescolares; 29,9% (46/154) escolares y 5,2% (7/154) adolescente. En
cuanto al género, en las enterobacterias productoras de BLEE en el sexo femenino (63%:
97/154) fue superior al del sexo masculino (37%: 57/154).
35
Lactantes: 1mes -2años; Pre-escolares: 3 - 5años; Escolares: 6 -12 años; Adolescentes: 13 - 18años
BLEE en los aislamientos hospitalizados
De los aislamientos de muestras hospitalarias; el 31,3% (72/230) fueron E. coli productores
de BLEE y el 47,8% (55/115) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el 4,1%
(3/72) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo AmpC y el
7,2% (4/55) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también producían β–lactamasa
tipo AmpC
De los aislamientos hospitalarios, estos provenían de los servicios de: Cardiología 7,8% (E.
coli 4/127; K. pneumoniae 6/127); Cirugía 5,5% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 3/127);
Gastroenterología 3,1% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 3/127); Ginecología 1,6% (E. coli
2/127); Hematología 0,8% (K. pneumoniae 1/127); Infectología 1,6% (E. coli 1/127; K.
pneumoniae 1/127); Medicina A 3,9% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 3/127); Medicina B
7,0% (E. coli 7/127; K. pneumoniae 2/127); Medicina C 6,3% (E. coli 6/127; K. pneumoniae
2/127); Medicina D 3,1% (E. coli 1/127; K. pneumoniae 3/127); Neurocirugía 8,6% (E. coli
7/127; K. pneumoniae 4/127); Nefrología 8,6% (E. coli 5/127; K. pneumoniae 6/127);
Neonatología 3,1% (K. pneumoniae 4/127); Neumología 0,8% (E. coli 1/127); Neurología
36
5,5% (E. coli 5/127; K. pneumoniae 2/127); Quemados 3,9% (E. coli 3/127; K. pneumoniae
2/127); Traumatología 5,5% (E. coli 7/127); UCI 11,0% (E. coli 7/127; K. pneumoniae 7/127);
UPO 2,3% (K. pneumoniae 3/127); Urología 8,6% (E. coli 8/127; K. pneumoniae 3/127).
De los aislamientos hospitalarios fueron recuperados de muestras de: Absceso 1,6% (E. coli
1/127; K. pneumoniae 1/127); Catéter 6,3% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 6/127); LCR 0,8%
(K. pneumoniae 1/127); Herida 3,9% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 1/127); Lavado
Broncoalbeolar 0,8% (K. pneumoniae 1/127); Orina 66,1% (E. coli 57/127; K. pneumoniae
27/127); Ótica1,6% (K. pneumoniae 2/127); piel de quemado 3,1% (E. coli 2/127; K.
pneumoniae 2/127); Sangre 6,3% (E. coli 2/127; K. pneumoniae 6/127); Aspirado traqueal
9,4% (E. coli 4/127; K. pneumoniae 8/127).
Las Enterobacterias productoras de BLEE aisladas de muestras hospitalarias, categorizadas
de acuerdo al grupo etario y género, se observó lo siguiente: 64,6% (82/127) lactantes;
37
11,8% (15/127) prescolares; 14,2% (18/127) escolares y 9,4% (12/127) adolescente. En
cuanto al género, en las enterobacterias productoras de BLEE en el sexo femenino (48%:
61/127) y en el sexo masculino (52%: 66/127) fueron prácticamente iguales.
Lactantes: 1mes -2años; Pre-escolares: 3 - 5años; Escolares: 6 -12 años; Adolescentes: 13 - 18años
Análisis de la susceptibilidad antimicrobiana
E. coli productores de BLEE en los aislamientos comunitarios
En el grupo de las quinolonas, la ciprofloxacina presento una resistencia de 77,8%, la más
alta de todas, además 9,6% de los aislamientos presentaron una sensibilidad límite
pudiendo mutar a resistentes durante el tratamiento antibiótico. La evaluación del grupo de
los aminoglucósidos se realizó con gentamicina y amikacina, donde se mostró una alta tasa
de resistencia con el 57,8% para gentamicina y por el contrario se mostró una baja tasa de
resistencia para amikacina de 6,7%, presentando una alta sensibilidad con 80,0%.
La resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol fue alta con el 71,1%. La resistencia al
cloranfenicol fue de 23,7% con una buena sensibilidad de 74,1%. Nitrofurantoina presento
un bajo nivel de resistencia con 10,4% y una muy alta sensibilidad con 85,9%. La resistencia
cefoxitina fue de solo el 5,9%. Todos los aislados eran sensibles a los carbapenémicos.
38
Dentro de las cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como
resistentes, el 38,5% y 2,2% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y cefepime
respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013.
E. coli productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios
La resistencia más alta se presentó frente a ciprofloxacina con 81,9%, además 6,9%
presentaron una sensibilidad límite. Trimetoprim-sulfametoxazol también presento una
resistencia alta con el 66,7%. La evaluación del grupo de los aminoglucósidos se realizó con
gentamicina y amikacina, donde se mostró una resistencia de 58,3% para gentamicina y
una resistencia de 4,2% para amikacina, pero con una sensibilidad de 87,5%.
La resistencia al cloranfenicol
fue de 16,7% con una buena sensibilidad de 80,6%. La
Nitrofurantoina presento una resistencia muy baja con 8,3% y una alta sensibilidad con
83.3%. La resistencia frente a cefoxitina fue de 8,3%. Todos los aislados eran sensibles a
los carbapenémicos.
Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como
resistentes, el 29,2%, 4,2% y 2,8% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima, cefepime y
cefotexima respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013.
39
K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos comunitarios
Trimetoprim-sulfametoxazol presento la más alta resistencia con 89,5%. Ciprofloxacina
presento una resistencia de 63,2%; además 15,8% presentaron una sensibilidad límite. En
cuanto a los aminoglucósidos, la gentamicina mostró una resistencia de 63,2%, amikacina
no presento resistencia alguna, pero una sensibilidad del 100,0%.
La resistencia al cloranfenicol fue de 26,3%, a nitrofurantoina una resistencia de 42,1%. La
resistencia frente a cefoxitina fue de 10,5%. Todos los aislados eran sensibles a los
carbapenémicos.
Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como
resistentes, el 5,3% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y también el 5,3% a
cefepime, según los puntos de corte CLSI 2013.
K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios
La mayor resistencia se observo en trimetoprim-sulfametoxazol con 92,7%. En quinolonas ,
ciprofloxacina presento una resistencia de 50,9%, una sensibilidad límite de 14,5% y una
sensibilidad de solo 5,5%. En cuanto a los aminoglucósidos, la gentamicina mostró una
resistencia de 74,5% y amikacina una resistencia de solo el 9,1%.
La resistencia a nitrofurantoina fue de 41,8%, a cloranfenicol una resistencia de 14,5%. La
resistencia frente a cefoxitina fue de 9,1%. Todos los aislados eran sensibles a los
carbapenémicos.
Entre el grupo de cefalosporinas, aunque todas deben ser interpretadas y reportadas como
resistentes, el 10,9% y
1,8% de aislamientos eran sensibles a ceftazidima y cefepime
respectivamente, según los puntos de corte CLSI 2013.
40
Análisis genotípico mediante el PCR
Se analizaron tres familias de genes productores de BLEE, estas fueron: SHV (45,5%:
128/281), CTX (91,1%: 256/281) y TEM (44,4%: 125/281).
E. coli productores de BLEE en los aislamientos comunitarios
En las E. coli comunitarias se observo que el 22,2% (30/135) eran productores de BLEE tipo
SHV, el 91,9% (124/135) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 40,7% (55/135)
presentaron BLEE tipo TEM.
Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo genes BLEE: el 5,9% (8/135)
presentaron solo SHV, el 50,4% (68/135) CTX y el 2,2% (3/135) TEM. También se pudo
observar combinaciones de genes BLEE, el 3,0% (4/135) presentaron SHV y CTX, el 25,2%
(34/135) presentaron CTX y TEM; y en el 13,3% (18/135) se observaron los tres genes,
SHV, CTX y TEM.
41
E. coli productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios
En las E. coli hospitalarias se observo que el 33,3% (24/72) eran productores de BLEE tipo
SHV, el 94,4% (68/72) fueron productores de BLEE tipo CTX y el 56,9% (41/72) presentaron
BLEE tipo TEM.
Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo genes BLEE: el 1,4% (1/72)
presentaron solo SHV, el 33,3% (24/72) CTX y el 1,4% (1/72) TEM. También se pudo
observar combinaciones de genes BLEE, el 8,3% (6/72) presentaron SHV y CTX, el 2,8%
(2/72) presentaron SHV y TEM, el 31,9% (23/72) presentaron CTX y TEM; y en el 20,8%
(15/72) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM.
42
K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos comunitarios
En las K. pneumoniae comunitarios se observo que todas eran productoras de BLEE tipo
SHV es decir el 100,0% (19/19), el 84,2% (16/19) fueron productores de BLEE tipo CTX y el
63,2% (12/19) presentaron BLEE tipo TEM.
Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo gen BLEE: el 5,3% (1/19)
presentaron solo SHV. También se observó combinaciones de genes BLEE, el 31,6% (6/19)
presentaron SHV y CTX, el 10,5% (2/19) presentaron SHV y TEM y en el 52,6% (10/19) se
observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM.
K. pneumoniae productores de BLEE en los aislamientos hospitalarios
En las K. pneumoniae hospitalarios se observo que todas eran productoras de BLEE tipo
SHV es decir el 100,0% (55/55), el 87,2% (48/55) fueron productores de BLEE tipo CTX y el
30,9% (17/55) presentaron BLEE tipo TEM.
Dentro de los aislamientos que presentaron solo un tipo gen BLEE: el 10,9% (6/55)
presentaron solo SHV. También se observó combinaciones de genes BLEE, el 58,2%
(32/55) presentaron SHV y CTX, el 1,8% (1/55) presentaron SHV y TEM y en el 29,1%
(16/55) se observaron los tres genes, SHV, CTX y TEM.
43
44
DISCUSIÓN
De acuerdo con los resultados encontrados en la presente investigación se evidencia la
presencia de enterobacterias productoras de BLEE en muestras recuperadas de pacientes
hospitalizados y comunitarios, siendo un motivo de preocupación, la presencia de cepas
resistentes de enterobacterias en estos aislamientos indicaría la presencia de genes de
resistencia que se encuentran localizados en plásmidos altamente transmis ibles, la
propagación de estos genes entre bacterias de igual o diferentes especies es preocupante
ya que hay pocas alternativas terapéuticas; además se asocia con casi el doble de la
mortalidad en comparación con las no productoras de BLEE. 40,41
El resultado del presente estudio indicó una frecuencia de el 31% de los aislamientos de E.
coli y K. pneumoniae fueron productoras de BLEE. De las E. coli el 28,6% fueron
productores de BLEE y de las K. pneumoniae el 40,9% fueron productores de BLEE.
De los aislamientos de muestras hospitalarias, el 31,3% de las E. coli y el 47,8% de K.
pneumoniae fueron productoras de BLEE, estudios anteriores en Perú mostraron una
frecuencia de 2,9% y 44,4% para E. coli y K. pneumoniae, respectivamente.8 En el Instituto
de Enfermedades Neoplásicas en
2005 se reporto una frecuencia de 40,78% en
aislamientos de E. coli y K. pneumoniae.42 En 2012 la publicación de Garcia et al. muestra
que el 75,1% y el 76,8% de E. coli y K. pneumoniae respectivamente, eran productores de
BLEE.43
La mayoría de estudios de prevalencia de BLEE en el Perú están realizados en aislamientos
hospitalarios, no existen datos referidos a aislamientos comunitarios y su resistencia a los
antibióticos. En nuestro estudio observamos que para E. coli el 27,3% y el 28,7% de K.
pneumoniae eran productores de BLEE, todos estos a partir de aislamientos recuperados de
cultivos de orina.
El estudio de Colquechagua et al, en muestras fecales en el Instituto de Salud del Niño,
mostro que el 64,2% eran portadores de enterobacterias productoras de BLEE y de estas el
86% eran E. coli.44 En otro estudio de portadores se observa con el avance del tiempo un
incremento de la resistencia según lo reportado por: Pallechi et al. en Perú-Bolivia donde
detectaron enterobacterias productoras de BLEE en 0,1% (4/3208) de las muestras fecales
45
de niños sanos de cuatro centros urbanos de América Latina, la caracterización molecular
reveló la presencia del gen -lactamasa tipo blaCTX-M en los cuatro aislados. El año 2005 en
la misma población de niños sanos de Perú-Bolivia reveló el incremento de portadores
fecales de Escherichia coli, en comparación al 2002 (0,1% el año 2002 y 1,7% en el
2005).45,46
Estos estudios son realizados a partir de portadores sanos, sin haber datos de la frecuenc ia
de productores de BLEE como causante de infecciones en la comunidad en el Perú.
En una publicación de 2013 de Salles et al muestra que en América latina se observa que
más de un cuarto de aislamientos de E. coli (27%) y más de un tercio de K. pneumoniae
(38%) fueron BLEE positivo. La prevalencia de Productores de BLEE en E. coli y Klebsiella
spp. asociado con infecciones adquiridas en la comunidad, en particular, fue 29%.47
En el presente estudio la frecuencia de enterobacterias productoras de BLEE fue alta en el
grupo de los lactantes, este dato indicaría que la colonización con bacterias productoras de
BLEE ocurre a temprana edad, por ende las infecciones que presenten serán por bacterias
productoras de BLEE, esto puede deberse al uso cada vez mayor de los antibióticos en la
comunidad o en previas hospitalizaciones, dando lugar a una presión selectiva a favor de las
bacterias que han adquirido resistencia. En un estudio realizado en Guinea-Bissau muestra
que los niños que compartían la cama tenían un mayor riesgo de ser colonizados con cepas
productores de BLEE, lo que indica que el contacto directo y el hacinamiento pueden ser
importantes en la propagación de las BLEE.48
Los genes BLEE se encuentra predominantemente en Klebsiella spp. y E. coli, pero también
se han descrito en otros géneros de Enterobacteriaceae incluyendo especies de Citrobacter,
Serratia, Proteus, Salmonella, y Enterobacter.49,50 Hasta fines del siglo pasado, las
enterobacterias albergaban variables de BLEE tipo TEM (Temoneira) y SHV (sulfhidrilo
variable) eran frecuentes e los aislamientos nosocomiales, y CTX-M (cefotaximasa) era rara
vez aislado.50-52 Sin embargo, en los primeros años de este siglo, América Latina se convirtió
en el primer continente donde variantes CTX-M comenzaron a desplazar TEM y SHV
variantes como el tipo más común de BLEE, principalmente en E. coli.51 Las BLEE de tipo
CTX-M comparten sólo el 40% de homología con TEM o SHV enzimas y se consideran no
relacionada.50 Es importante mencionar que en los últimos años se ha descrito el incremento
46
de enterobacterias productoras de BLEE de la familia CTX-M, La BLEE tipo CTX-M tiene
principalmente actividad sobre la cefotaxima y no sobre la ceftazidima; aunque en los
últimos años la emergencia de variantes de CTX-M (CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-27 y
CTX-M-19) están mejorando su actividad frente a ceftazidima. 53
Un dato importante de nuestro estudio, que puede ser considerado una limitación del mismo,
es que no se estudiaron las variantes alélicas de los genes de BLEE tipo SHV y TEM, ya
que de estos las variantes alélicas SHV-1, TEM-1 y TEM-2 son consideradas betalactamsas
de espectro ampliado y no de espectro extendido (BLEE), esto podría hacer que
sobredimensionemos la frecuencia de estos genes como productores de BLEE. En el caso
de CTX-M, todas sus variantes son productoras de BLEE.
Dentro de los genotipos aislados en el presente estudio, las BLEE de tipo CTX-M (91,1%)
fueron las más frecuentes seguido por SHV (45,5%) y TEM (44,4%), resultados que difieren
de los publicado por Arce et al, en un estudio realizado en 2011 en dos Hospitales de
Chiclayo-Perú, donde se evaluó la presencia de genes tipo TEM y SHV encontrándose
60,61% y 12,12% respectivamente y con ambos genes 27,27%, analizando un total de 66
aislamientos de E. coli.54
Luego, el mismo Arce en un estudio publicado en 2014 en un Hospital de Chiclayo, donde
se analizaron 50 aislamientos de E. coli, los resultaron mostraron que el gen mayormente
encontrado fue SHV con 44%, seguido de CTX-M con 20% y TEM con 16%, cabe
mencionar que esta investigación se realizó en aislamientos hospitalarios, dentro de este
mismo grupo bacteriano, E. coli hospitalarios, nuestros resultados indican a CTX-M (94,4%)
como el más frecuente, seguido de TEM (56,9%) y SHV (33,3%). Además mencionan que el
4% de los aislamientos presentaron los tres tipos de genes BLEE, en nuestra investigación
el 21% presentaron los tres tipos de genes, el 43% presentaron dos tipos de genes, siendo
la combinación más frecuente la de CTX-M + TEM con 32%.55
En cuanto a los resultados genotípicos de K. pneumniae hospitalarios, como se esperaba
todos estos presentaron genes tipo SHV (100%), que es una característica de resistencia
natural de este género que presentan el gen SHV-1 que las hace resistentes a ampicilina, en
cuanto a los otros genes se evidencio CTX-M en 87% y TEM en 30% de los aislamientos.
47
Referente a los resultados de los aislamientos comunitarios, las mayoría de estudios
realizados muestran un predominio de genes tipo CTX-M presente en E. coli, en nuestra
investigación las E. coli comunitarias el gen CTX-M en 91% de los casos, seguido de TEM
en el 40% y SHV en el 22% de los aislamientos, sobre K. pneumoniae el 84% fueron CTXM, el 63% TEM y nuevamente al igual que en los aislamientos hospitalarios SHV en 100%
por la razón que ya se detallo anteriormente.
Otros estudios realizados en Perú han evidenciado la presencia de genes SHV, TEM y CTXM, pero como reportes aislados sin determinar la frecuencia de estos genes.9,56,57
La resistencia acompañante no tuvo diferencias significativas entre los aislamientos
hospitalarios y comunitarios, en cuanto a E. coli se observa alta resistencia acompañante a
las fluoroquinolonas, sulfametoxazol/trimetoprim, gentamicina y una resistencia menor a
cloranfenicol, nitrofurantoina, una resitencia minima para amikacina, siendo sensibles a los
carbapenémicos.
En
K.
pneuminiae
se
evidenció
también
alta
resistencia
acompañante
a
sulfametoxazol/trimetoprim, Gentamicina, fluoroquinolonas y una resistencia menor a
nitrofurantoina, Cloranfenicol, una resistencia minina frente amikacina, siendo sensibles a
los carbapenémicos. Llama la atención la resistencia de más del 40% a nitrofurantoina en K.
pnemoniae, ya que este era una buena alternativa frente a las infecciones urinarias. Esto es
alarmante, porque no se dispone de muchas alternativas terapéuticas, en caso de infección
por alguno de estos microorganismos se puede administrar como tratamiento amikacina y
en infecciones complicadas los carbapenémicos.
Cabe destacar que en ocho E. coli y en cinco K. pneumoniae productoras de BLEE al
interpretar el antibiograma se observó
la disminución del halo del disco de cefoxitina
(≤18mm) lo que sugirió la presencia de -lactamasa tipo AmpC, comprobándose mediante
el método de Hodge y utilizando el disco de ácido fenil borónico (AFB), inhibidor de las
lactamasas tipo AmpC.
También queremos mencionar que las infecciones por E. coli con BLEE han experimentado
importantes cambios epidemiológicos en los últimos tiempos y actualmente la atención se
centra en el aumento de infecciones y colonizaciones en pacientes procedentes de la
48
comunidad y la mayor incidencia de las CTX-M. En cuanto a las medidas de control de la
diseminación de las BLEE y la actuación frente a pacientes colonizados por E. coli con
BLEE no es muy claro, pero es incuestionable la necesidad de implementar un uso correcto
y responsable de los antibióticos para evitar la expansión de cepas resistentes.3
Según las recomendaciones del CLSI desde el año 2010 no se debería buscar
enterobacterias productoras de BLEE, solo se debe
informar los puntos de corte
35
obtenidos, pero con los resultados obtenidos en el presente trabajo se demuestra que esto
representaría una falla en el tratamiento, debido a que las bacterias productoras de BLEE
pueden presentar halos de inhibición sensibles para ceftazidima según el punto de corte
del CLSI 2013, pero ser productoras de BLEE. Por lo tanto se debe continuar con la
búsqueda, reporte e informe de BLEE en las pruebas de rutina, si es BLEE positivo informar
resistentes a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactámicos independientemente
de las zonas de inhibición obtenidas, si es BLEE negativo informar según el punto de corte
CLSI 2013.
Las infecciones causadas por bacterias productoras de β-lactamasas de espectro extendido
representan un reto para el equipo de salud por la limitada disponibilidad de opciones de
tratamiento, esto obliga a la prevención de estas infecciones mediante la restricción del uso
de agentes antimicrobianos, junto con la aplicación de medidas inmediatas de control de
infecciones. Para controlar o reducir la elevada tasa de portadores de estos organismos, se
deben tomar medidas efectivas como prohibir la venta de antibióticos sin receta médica y
concientizar en la población los peligros de tomar antibióticos sin consulta médica.
49
CONCLUSIONES
 En el presente estudio se demostró la presencia de bacterias productoras de BLEE
en 31% (281/905) de los aislamientos de ambas enterobacterias.
 Del total de E. coli el 28,6% (207/724) fueron productores de BLEE y de las K.
pneumoniae el 40,9% (74/181) fueron productores de BLEE.
 De los aislamientos comunitarias; el 27,3% (135/494) fueron E. coli productoras de
BLEE y el 28,7% (19/66) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el
3,7% (5/135) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa
tipo AmpC y el 5,2% (1/19) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también
producían β–lactamasa tipo AmpC.
 De los aislamientos hospitalarios; el 31,3% (72/230) fueron E. coli productores de
BLEE y el 47,8% (55/115) fueron K. pneumoniae productora de BLEE. Además el
4,1% (3/72) de las E. coli productoras de BLEE también producían β–lactamasa tipo
AmpC y el 7,2% (4/55) de las K. pneumoniae productoras de BLEE también
producían β–lactamasa tipo AmpC
 En la mayoría
de las enterobacterias productoras de BLEE, se observó
la
resistencia a las fluoroquinolonas, gentamicina y sulfametoxazol/trimetoprim. Todos
los aislados resultaron ser resistentes a los carbapenémicos.
 La mayoría de las muestras correspondían a los lactantes, de los aislamientos
comunitarios el 50,6% (78/154) eran productores de BLEE y de los aislamientos
hospitalarios el 64,6% (82/127) fueron productores de BLEE.
 En cuanto al género, masculino o femenino, no hubo diferencias significativas.
 De las enterobacterias productoras de BLEE aisladas los genes productores de
BLEE fueron: SHV (45,5%: 128/281), CTX (91,1%: 256/281) y TEM (44,4%:
125/281).
50
RECOMENDACIONES
 Es necesario el secuenciamiento de los genes productores de BLEE.


Evaluar los otros mecanismos de resistencia a betalactamicos diferentes a las BLEE:
o
Otras betalactamasas (AmpC)
o
Perdida de porinas
Evaluación de la clonalidad mediante el método estandarizado “Electroforesis de
Campo Pulsado” (P.F.G.E.).
 Implementar un sistema de vigilancia de la resistencia a antibióticos, que permita
detectar la aparición de enterobacterias productoras de BLEE.
 Continuar con la búsqueda de mecanismos de resistencia en el laboratorio de
microbiología.
51
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Organización Mundial de la Salud. Movilizar la voluntad política para contener la
resistencia a los antimicrobianos. Bulletin of theWorldHealth Organization.2011;
89:168–169.
2. Muzaheed Y, Adams J, Shivannavar C, Paterson D, Gaddad S. Faecal carriage of
CTX-M-15
producing
Klebsiella
pneumoniaein
patients
with
acute
gastroenteritis. Indian J Med Res. 2009; 129:599-602.
3. García A, García E, Hernández A, Ruiz J, Yague G,
Herrero J, Gómez J.
Bacteriemias por Escherichia coli productor de β-lactamasas de espectro
extendido
(BLEE):
significación
clínica
y
perspectivas
actuales.
Rev.Esp.Quimioter.2011; 24(2):57-66.
4. Mosquito S, Ruiz J, Bauer J, Ochoa T. Mecanismos moleculares de resistencia
antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea. Rev Perú MedExp Salud
Publica.2011; 28(4): 648-56.
5. Perozo M, Armindo J, Castellano G, Maribel J. Detección de -lactamasas de
Espectro Extendido en cepas de la familia Enterobacteriaceae. Kasmera. 2009;
37(1):25-37.
6. Pitout JD, Nordmann P, Laupland KB, Poirel L. Emergence of Enterobacteriaceae
producing extended-spectrum lactamasas (ESBLs) in the community. J.
Antimicrob Chemother.2005; 56(1):52-9.
7. Farinas M, Martinez L. Infecciones causadas por bacterias gramnegativas
multirresistentes: enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii y otros bacilos gram negativos no fermentadores. Enferm Infecc
Microbiol Clin. 2013; 31(6):402-409.
8. Morales J, Reyes K, Monteghirfo M, Roque M, Irey J. Presencia de β-lactamasas de
espectro extendido en dos hospitales de Lima, Perú. An Fac Med Lima 2005;
66(1): 24-32
9. Calderón R, Sacsaquispe R, Pasterán F, Galas M, Soto J, Riveros J, et al.
Caracterización molecular de Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae
productoras de ß-lactamasas de Espectro Extendido tipo SHV-5 en una Unidad
52
de Cuidados Intensivos neonatal de Lima. Rev peru med exp salud publica 2003;
20 (3): 121-27
10. Almirante B. Infecciones por enterobacterias. Medicine. 2002; 08 (64): 3385-97.
11. Koneman E, Allen S, Dowell V, Janda W, Winn W, Procop G, et. al. Diagnóstico
Microbiológico. 6ta Edición, Argentina, Editorial Médica Panamericana S.A. 2008.
pp: 180-182.
12. Hernández E. Escherichia coli productores de BLEE aislados de urocultivo:
Implicaciones en el diagnóstico y tratamiento de la infección urinaria.[Tesis
doctorado]. Madrid: Universidad Complutense de Madrid; 2010.
13. Suárez C, Gudiol F. Antibióticos betalactámicos. Enferm Infecc Microbiol Clin.
2009; 27(02): 116-29.
14. Sacsaquispe C.R. Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad
antimicrobiana por el método de disco difusión/Elaboración: Rosa Sacsaquispe
Contreras y Jorge Velasquez Pomar. Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de
Salud, 2002.
15. Seija V, Vignoli R. Principales grupos de antibióticos: En: Universidad de la
República.Temas
de Bacteriologíay Virología médica. 2ª Edición.pp.631-637.
Disponible en: http:www.higiene.edu.uy/cefa/.
16. Navarro F, Miró E, Mirelis B. Lectura interpretada del antibiograma de
enterobacterias. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010; 28(9): 638-645.
17. Alvarado J. Antibióticos y Quimioterápicos. 2da Edición, Perú, AMP Ediciones
Apuntes Médicos del Perú.2006; pp: 34-36.
18. Vignoli R, Seija V. Principales mecanismos de resistencia antibiótica: En:
Universidad de la República. Temas de Bacteriología y Virología médica. 2ª
Edición.pp.640-662. Disponible en: http:www.higiene.edu.uy/cefa/.
19. Coyle M. Manual de Pruebas de Susceptibilidad. Departments of Laboratory
Medicine and Microbiology. University of Washington.2005.
20. Rossi F, Andreazzi D. Resistencia Bacteriana, Interpretando el Antibiograma.
Sao Paulo-Rio de Janeiro.2006.
21. Rodriguez J. Resistencia a los antibióticos: la evolución en acción. Dendra
Médica. Revista de Humanidades.2011;10(1):56-64.
53
22. Lahey Clinic. ß-Lactamase Classification and Amino Acid Sequences for TEM,
SHV and OXA Extended-Spectrum and Inhibitor Resistant Enzymes. Burlington,
MA: Lahey Clinic Foundation; 2013.
23. Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases.
Antimicrob Agents Chemother.2009; 54(3):969-76.
24. Lee JH, Bae IK. New definitions of extended-spectrum β-lactamase conferring
worldwide emerging antibiotic resistance. Med. Res. Rev. 2012; 32 (1):216-32.
25. Livermore DM. Defining an extended-spectrum beta-lactamase. Clin Microbiol
Infect. 2008; 14Suppl 1:3-10.
26. Casabonne C, Perez J, Balagué C, Fernández L. Diversidad de β-lactamasas en
aislamientos clínicos de enterobacterias. Acta BioquímClín Latinoam.2012;
446(3):405-12.
27. Díaz M, Ramón J, Martínez L, Rodríguez J, Pascual A, Grupo de estudio de infección
hospitalaria (GEIH). Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de βlactamasas de espectro extendido en hospitales españoles: segundo estudio
multicéntrico (proyecto GEIH-BLEE 2006).Enfermedades Infecciosas Microbiología
Clínica. 2009; 27(9):503-510.
28. Alvarez E, Zayas A, Castillo I, Gonzales L, Contreras R. Detección de aislados
clínicos de Escherichia coli y Klebsiella spp. productoras de β-lactamasas de
espectro extendido mediante el sistema DIRAMIC.Revista CENIC Ciencias
Biológicas. 2010; 41(3):195-199.
29. Martinez L. Asociación de BLEE con otros mecanismos de resistencia. Enferm
Infecc Microbiol Clin. 2007; 25 Supl. 2: 38-47.
30. Navarro F, Miro E. Entorno genético de las BLEE: implicaciones en la
transmisión. EnferInfeccMicrobiolClin. 2007; 25 Supl. 2:11-7.
31. Diestra K, Juan C, Curiao T, Moya B, Miro E, Oteo J, et al. Caracterización del
entorno genético de genes blaBLEEy plásmidos asociados en cepas circulantes
de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae en España.[Tesis doctoral].
España:
Universidad
Autónoma
de
Barcelona.
Facultad
de
Biociencies.
Departamento de Genética y de Microbiología. 2010.
32. Coque M. Papel de los integrones en la resistencia a los agentes
antimicrobianos. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2005; 23(5):251-3.
54
33. Di Conza J, Gutkind G. Integrones: los coleccionistas de genes. Revista
Argentina de Microbiología.2010; 42:50944-101.
34. Gonzales G, Mella S, Zemelman R, Bello H, Dominguez Y. Integrones y cassettes
génicos de resistencia: estructura y rol frente a los antibacterianos.2004;
132:619-626.
35. Clinical
and
Laboratory
Standard
Institute.
Performance
Standards
for
Antimicrobial Susceptibility Testing. Twenty-third Informational Supplement
M100-S23. Wayne, Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standard Institute; 2013.
36. Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Philippon A. Extended broad-spectrum betalactamases conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in
Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect
Dis. 1988; 10(4):867-78.
37. Lezameta L, Gonzales E, Tamariz J. Comparación de cuatro métodos fenotípicos
para la detección de beta-lactamasas de espectro extendido. Rev. Perú Med Exp
Salud Pública. 2010; 27(3): 345-51.
38. Tofteland S, Haldorsen B, Dahl KH, Simonsen GS, Steinbakk M, Walsh T, et al.
Effects of Phenotype and Genotype on Methods for Detection of ExtendedSpectrum-β-Lactamase-Producing Clinical Isolates of Escherichia coli and
Klebsiella pneumoniae in Norway. J. Clin. Microbiol, 2007; 45(1):199–205.
39. Pitout J, Hossain A, Hanson D. Phenotypic and Molecular Detection of CTX-M-βLactamases Produced by Escherichia coli and Klebsiella spp. J. Clin. Microbiol,
2004; 42(12):5715-5721.
40. Pallecchi L, Malossi M, Mantella A, Gotuzzo E, Trigoso C, Bartolini A, el al. Detection
of CTX-M-Type β-lactamase genes in fecal Escherichia coli Isolates from
Healthy Children in Bolivia and Peru. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 2004;
48(12):4556-4561.
41. Schwaber MJ, Carmeli Y. Mortality and delay in effective therapy associated with
beta-lactamases
in
Enterobacteriaceae
bacteremia
spread
spectrum
production: a systematic review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother.
2007; 60: 913-920.
42. Cuéllar L, Vicente W, Silva M. Cepas de E. coli y Klebsiella spp. Productoras de
betalactamasas de espectro extendido en aislamientos clínicos de infecciones
55
intrahospitalarias en un Hospital Oncológico, en Perú. XII Congreso de la
Asociación Panamericana de Infectología. 15 al 18 Mayo – 2005. Caracas,
Venezuela
43. García C, Horna G, Linares E, Ramírez R, Tapia E, Velásquez J, et al. Antimicrobial
Drug Resistance in Peru Emerg Infect Dis. 2012 Mar; 18(3): 520–521.
44. Colquechagua F, Sevilla C, Gonzales E. Enterobacterias productoras de
Betalactamasas de espectro extendido en muestras fecales en el Instituto
Nacional de Salud del Niño, Perú. Rev Peru Med Exp Salud Pública.
2015;32(1):26-32.
45. Luvsansharav UO, Hirai I, Nakata A, Imura K, Yamauchi K, et al. Prevalence and
risk factors associated with fecal carriage of CTX-M beta-lactamase
Enterobacteriaceae that produce in rural communities of Thailand. J Antimicrob
Chemother. 2012; 67: 1769-1774.
46. Pallecchi L, Bartolini A, Fiorelli C, Mantella A, Di Maggio T, Gamboa H, et al. Rapid
Dissemination and Diversity of CTX-M Extended-Spectrum β-Lactamase Genes
in Commensal Escherichia coli Isolates from Healthy Children from LowResource Settings in Latin America. Antimicrob. Agents Chemother. 2007;
51(8):2720.
47. Salles MJ, Zurita J, Mejía C, Villegas MV, Latin America Working Group on Bacterial
Resistance. Resistant Gram-negative infections in the outpatient setting in Latin
America. Epidemiol Infect. 2013 Dec; 141(12): 2459–2472.
48. Isendahl J, Turlej-Rogacka A, Manjuba C, Rodrigues A, Giske CG, et al. Fecal
Carriage of ESBL-Producing E. coli and K. pneumoniae in Children in GuineaBissau: A Hospital-Based Cross-Sectional Study. PlosOne. 2012; 7(12):e51981.
49. Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the
21st century:
characterization, epidemiology, and detection of this important resistance
threat. Clinical Microbiology Reviews 2001; 14: 933–951.
50. Minarini LA, et al. Prevalence of community-occurring extended spectrum betalactamase-producing Enterobacteriaceae in Brazil. Current Microbiology 2007;
54: 335–341.
51. Cantón R, Coque TM. The CTX-M beta-lactamase pandemic. Current Opinion in
Microbiology 2006; 9: 466–475.
56
52. Mattar S, Martinez P. Emergence of antimicrobial resistance to extendedspectrum-β-lactamases (ESBL): detection, clinic impact and epidemiology.
Infectio 2007; 11: 23–35.
53. Cantón R, González-Alba JM, Galán JC. CTX-M enzymes: origin and diffusion.
Frontiers in Microbiology. 2012; 3: 110.
54. Arce Z, Alarcón E, Limo J, Llontop J, Valle J. Detección de genes SHV y TEM en
cepas de Escherichia coli productoras de β-lactamasas de espectro extendido
procedentes de dos centros hospitalarios de Chiclayo-Perú: enero- agosto
2011. Rev. cuerpo méd. HNAAA 5(3) 2012
55. Arce Z, Llontop J, Alarcón E, López E. Detección de los genes SHV, TEM Y CTX-M
en cepas de Escherichia coli ß-lactamasas de espectro extendido procedentes
de un Hospital de Chiclayo- Perú. Rev. cuerpo méd. HNAAA 7(3) 2014
56. Del Pozo L, Silva N, Valencia A, Soto J, Riveros JC, Sacsaquispe R,et al. Estudio de
un brote intrahospitalario por Salmonella typhimurium productora de betalactamasa de espectro extendido SHV-5. An Fac Med Lima 2006; 67(4): 318-26
57. Gonzales E, Sevilla R, León S. β-lactamasas de espectro extendido tipo CTX-M
en aislamientos de Shigella flexneri de pacientes pediátricos con diarrea aguda
[carta]. Rev Peru Med Exp Salud Publica. 2013;30(3):527-8.
57